WO2007119639A1 - リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

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WO2007119639A1
WO2007119639A1 PCT/JP2007/057363 JP2007057363W WO2007119639A1 WO 2007119639 A1 WO2007119639 A1 WO 2007119639A1 JP 2007057363 W JP2007057363 W JP 2007057363W WO 2007119639 A1 WO2007119639 A1 WO 2007119639A1
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plant
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Eiichiro Ono
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Suntory Limited
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Definitions

  • the present invention relates to a gene of an enzyme having an activity of transferring a methyl group to lignan, a plant having a lignan composition converted using the methylase, and the like. More specifically, the present invention relates to an enzyme gene having an activity of synthesizing a methylated lignan, preferably an enzyme gene having an activity of synthesizing a methyl lignan derived from sesame, and use thereof.
  • sesame sesame is an annual herbaceous plant belonging to the family Pedaliaceae.
  • the origin of sesame is said to be Central Africa.
  • Sesame is the oldest cultivated oil plant with a history of about 6 000 years and has been cultivated all over the world. Sesame has been a valuable food since ancient times and has been known as a representative of healthy food.
  • sesame seeds, oils obtained from sesame seeds, and extracts from sesame seeds are used (see, for example, Sesame seeds and its functionality, Mitsuo Namiki: Maruzen Buranet (1998)).
  • About 50% of the components contained in sesame seeds are lipids and about 20% are proteins.
  • the main component of lipids contained in sesame is triglyceride mainly composed of oleic acid and linoleic acid. Sesame also contains vitamins B1, B2, E, etc. Secondary metabolites of plants collectively referred to as lignans (eg sesamin opi sesamorin, etc.) Strength S, other than the above components, are contained in sesame, and these have strong antioxidant properties (eg, For example, see B ioch emi cal Sy st ema ticsana Ecology 1 3, 1 33-139 (1985)).
  • Phytoch em istry Re v. 2257—288 (20 03) is a biosynthesis of pinoresinol synthesized by polymerization of coniferyl alcohol. It has been shown to be the first lignan in growth and to synthesize various lignans from pinoresinol via individual biosynthetic pathways in individual plant species. A delicate protein that contributes to the synthesis of pinoresinol has been reported in Rengiyo (for example, see Science 2 75, 3 6 2— 3 6 6 (1 9 9 7), etc.). In addition, forget-to-do pinoresinol and laricilidinol reductase genes (for example, J. B iol.
  • L arreatridentata a rareeatricin hydroxylase gene has been cloned from L arreatridentata (see, for example, Proc. N at. A ca d. Sc, USA, 1 00: 1 0 64 1 (2 0 0 3), etc.) .
  • piperitol was synthesized by the action of piperitol synthase on pinoresinol, and then sesamin was synthesized by the action of sesamin synthase on this piperitol.
  • CYP81Q1 a cytochrome P450 protein cloned from sesame, synthesizes sesamin from pinoresinol via piperitol alone (International Publication WO2005 / 030944; see FIG. 1). .
  • sesaminol glycosides sesaminole 2, 1 O- ⁇ -D-darcopyranoside; , And sesaminol 2, 1 ⁇ — — D—glucoviranosyl (1— 2) — O— (—) 3— D— darco biranosyl (1— 6)) — ⁇ 1 D— darcopyranoside
  • pinoresinol glycoside Pinolezinol 4, 1 ⁇ — — D-Dalcoviranosyl (1-6) — j8-D-Darkopyranoside; Pinole Dinol 4, 1 —D—Darcobyranosyl (1— 2) — — D—Glucopyranoside; Pinoresinol 4, 1—O—; 3—D—D—Darcopyranosy
  • the pinoresinol glycoside and sesaminomonoglycoside contained in sesame (see, for example, Katsuzaki, H. et al., Biosci. Biotec. Bioch em. 56, 2087-2088 (1992), etc.) Because it exhibits strong acid resistance in the water-soluble region, it is expected to be applied differently from fat-soluble antioxidants (eg, tocopherol).
  • fat-soluble antioxidants eg, tocopherol
  • lignan glycosides are expected to be used as foods for preventing arteriosclerosis (for example, T. Osawa: Anticarcinogenesisadradiation protection 2: p. 327, P lenm Press). , See New Yo).
  • Methylated lignans are known as lignan derivatives other than lidanan glycosides. Similarly to lignan glycosides, methylated lignans are lignans having a methoxy structure, in which the phenolic hydroxyl group, which is a functional group that exhibits acid resistance, is protected by a methyl group.
  • methylated lignans are lignans having a methoxy structure, in which the phenolic hydroxyl group, which is a functional group that exhibits acid resistance, is protected by a methyl group.
  • the furofuran-type sesame lignans there is a report of sesangoline in which the hydroxyl group at the 2 'position of cobsin opi sesaminol in which the hydroxyl group at position 4 of piperitol is methylated is methylated (Py toch em istry). 47, 583— 591 (1998); and J. Org. C he m. 27, 3232—
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and includes the following enzyme having lignan methyl group transfer activity, polynucleotide encoding the same, vector, cell, transformant, and the like containing the enzyme. provide.
  • SEQ ID NO: 1 or 3 consisting of a base sequence complementary to part or all of the base sequence
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and Z or added, and has the activity of transferring a methyl group to a lignan
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein.
  • SEQ ID NO: 1 hybridizes to a polynucleotide consisting of a part or all of the base sequence of 1 or 3 and a complementary base sequence under the conditions of 5 XSSC and 50 ° C, and lignans
  • polynucleotide according to (1) above which comprises a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3.
  • polynucleotide according to (1) above which comprises a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the polynucleotide according to any one of (1) to (6) above which is DNA.
  • a method for producing the protein comprising culturing or growing the host cell according to (12) above, and collecting a protein having an activity of transferring a methyl group to lidanenan from the host cell.
  • the lignan composition to be produced is modified or the same as the plant body.
  • a polynucleotide comprising the fragment of the polynucleotide described in (1) to (9) above or a complementary sequence thereof.
  • the polypeptide (lignan methylase) of the present invention is used, for example, the amount of lignan and methylated lignan can be artificially adjusted in a living organism (particularly, a plant).
  • physical properties can be modified in vitro and in vivo by methylating lignans using these recombinant enzymes.
  • the polynucleotide of the present invention it is possible to artificially produce methylated lidanan that has not been identified in nature so far.
  • the methylated lignan synthesized using the polypeptide of the present invention can be effectively used as a starting material or an intermediate for a novel physiologically functional substance.
  • Z or microorganisms can be created.
  • Figure 1 shows the structure and metabolic pathway of sesame lignan.
  • Fig. 2 _ 2 A shows the results of gene expression analysis by RT-PCR according to the sesame (S. indicum cv. Mase gold) of S i OMT 1 and S i OMT2.
  • Fig. 2-2B shows the results of gene expression analysis of S r OM T 1 by R T-P C R for each sesame (S. radiatum) organ.
  • Figure 3-3 A is an A280 nm chromatogram of the enzyme reaction between S i OMT 1 and pinoresinol expressed in E. coli.
  • Figure 3-3B is an A280nm chromatogram of the enzyme reaction mixture of Si OMT 1 and piperitol expressed in E. coli.
  • Fig. 4-13C is an A280nm chromatogram of the enzyme reaction solution of Si OMT2 and pinoresinol expressed in E. coli.
  • Figure 4-3 3D is the A280mn chromatogram of the enzyme reaction solution of SioMT2 and piperitol expressed in E. coli.
  • Figure 5-3E is the A280nm chromatogram of the enzyme reaction solution of Sr OMT 1 and pinoresinol expressed in E. coli.
  • Figure 5-3F is an A280nm chromatogram of the enzyme reaction mixture of SrOMT1 and piperitol expressed in E. coli.
  • Figure 6-4A is an LC-MS chromatogram of methylated pinoresinol produced by S i OMT 1.
  • Figure 7-4B shows methylated piperitol (cobsin) produced by S i OMT l This is an LC-MS chromatogram.
  • Figure 8 shows the results of genomic Southern hybridization using a full-length probe of the S i OMT1 gene.
  • Figure 9-6A is the A280nm chromatogram of the standard caffeic acid.
  • Fig. 9-6 B is the A280nm chromatogram of the enzyme reaction solution of Si OMT1 and caffeic acid expressed in E. coli.
  • Fig. 9-16C is an A280nm chromatogram of the enzyme reaction solution of SrOMT1 and pinoredinol expressed in E. coli.
  • Figure 10-6D is an LC-MS chromatogram of methylated caffeic acid (ferulic acid) produced by Si OMT1.
  • the present inventors have found a novel methyl ich enzyme that uses lignans, particularly pinoresinol and / or piperitol as the main substrate, and found that the methyl zyme enzyme methylates pinoresinol. So far, dimethylated pinoresinol, udesmin, has been identified, but no monomethylated pinoresinol has been found.
  • the present inventors searched for partial sequences of a sesame methylase-like gene from an EST database consisting of 5000 clones derived from sesame seeds by homology search.
  • Si OMTl and S i OMT2 Two types of methylase-like genes (hereinafter referred to as Si OMTl and S i OMT2) was obtained. These Si OMT genes were strongly expressed in seeds.
  • S i OMT2 Two types of methylase-like genes. These full-length nucleotide sequences were obtained by the RACE method and expressed in E. coli. After the obtained recombinant protein was reacted with sesaminol or pinoresinol, the enzyme activity was measured using HPLC analysis, LC-MS analysis, and TOF-MSZMS analysis.
  • Si OMT1 has an activity of catalyzing the reaction of methylating piperitol to produce cobucine. Furthermore, it was clarified that Si OMT1 has an activity of catalyzing a reaction in which pinoresinol is methylated to produce monomethylated pinoresinol. This methylated lignan is considered to be an intermediate of udesmin, a derivative of pinoresinol.
  • the S r OMT1 homolog Sr OMT1 gene was cloned by PCR from the African sesame Sesammn radiatum, S r OMT1 Was confirmed to have the same methylation activity as S i OMT1.
  • Lignan is a compound obtained by polymerizing (8,8, one bond) a dipropanoid compound having a C 6 C 3 skeleton mainly through these 8-8 positions. Lignans are thought to contribute to the defense mechanism of plants (see Phy toch istry Re v. 2, 371-390 (2, 003)).
  • Typical lignans include (+)-sesamin, (+)-sesaminol, (+)-sesamolin, (+)-pinoresinol, (+)-piperitol and (+)-sesamemori in sesame.
  • Nonore included in Forsythiainte rme dia (+) —Pinolezinol, (1) One Arctigenin Opi (1) One Matai Resin Nore; Included in Da phn etangutica (1) One Pinoresinol oppi (1) -Larisi Resinol; included in Lima (L i num usitatiss imum) (+) — Sequosolarisin Resinore.
  • Z enhancers are commercially available (trade name: Sesamin, distributor: Suntory Ltd.).
  • lignans other than sesamin for example, sesaminol, sesamolin, etc.
  • have also been reported to have physiological activity see, for example, Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, 7 6: 805-813 (2002).
  • lidanan or a derivative thereof is useful as a physiologically active substance having various physiological activities or an intermediate thereof.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to part or all of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and has an activity of transferring a methyl group to lidanenan.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • base sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and is used as a sequence of deoxyliponucleotides (abbreviated as A, G, C and T). Indicated.
  • the polynucleotides of the invention may exist in the form of R NA (eg, mR NA), or in the form of DNA (eg, c D NA or genomic D NA).
  • DNA can be double-stranded or single-stranded.
  • Single-stranded DNA or RNA can be the coding strand (also known as the sense strand) or it can be the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • oligonucleotide is intended to be a combination of several to several tens of nucleotides (for example, 2 to 60), and is used interchangeably with “polynucleotide”. Oligonucleotides are short dinucleotides (dimers) W
  • trinucleotide It is called trinucleotide (trimer), and the long one is expressed by the number of nucleotides polymerized, such as 30mer or 100mer. Oligonucleotides can be produced as longer polynucleotide fragments or synthesized.
  • the term “part of a polynucleotide” means a fragment of the polynucleotide, eg, at least 12 nt (nucleotide), preferably about 15 nt, and more preferably at least about 20 nt, More preferably, a fragment length of at least about 3 Ont, and even more preferably at least about 4 Ont is contemplated.
  • a “fragment having a length of at least 12 n′t” is intended to be a fragment containing, for example, 12 or more consecutive bases from the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Since the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is provided by referring to the present specification, a person skilled in the art can easily prepare a DNA fragment based on SEQ ID NO: 1. For example, 'restriction endonuclease cleavage or ultrasonic shearing can easily be used to create fragments of various sizes. Alternatively, such fragments can be made synthetically.
  • the polynucleotide of the present invention encodes a polypeptide having a rydanan methylation activity.
  • Such a polynucleotide typically comprises a polynucleotide containing a polynucleotide consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or 3; or a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • a preferred polynucleotide of the present invention is a polynucleotide that encodes a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, or a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • one or more nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 or 3 (for example, 1 to 30, 1 to 20, 1 ⁇ : L 0, 1 to several (eg, 6), 1 to 5, 1 to 3, 1 to 2 bases deleted, inserted, substituted, and / or added mutations It may be a body.
  • Variants can be coding or non-coding regions or both. Can be mutated. Mutations in the coding region can generate conservative or non-conservative amino acid deletions, insertions, substitutions or additions.
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide that codes for a polypeptide having lignan methylation activity, and is under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 Polynucleotides that hybridize in
  • Hydration is well known, such as the method described in S amb rook et al., Molecular C 1 oning, AL aboratory Manu al, 2 d E d., C old Spr. Harbour Laboratory (1 989). It can be done by the method. Usually, the higher the temperature and the lower the salt concentration, the higher the stringency (harder to hybridize), and a more homologous polynucleotide can be obtained.
  • the appropriate hybridization temperature varies depending on the base sequence and the length of the base sequence. For example, when a DNA fragment consisting of 18 bases encoding 6 amino acids is used as a probe, a temperature of 50 ° C. or lower is preferable.
  • stringent hyperprecipitation conditions means a hybridization solution (50% formamide, 5 XSSC (15 OmlV ⁇ Na C1, 15 mM trisodium citrate), After incubation at 42 ° C for a while in 5 OmM sodium phosphate (pH 7.6), 5 X Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 g / 1 denatured sheared salmon sperm DNA At 6 5 is intended to wash the filter in 0.1 XS SC.
  • At least about 15 nucleotides (nt) of the reference polynucleotide and more preferably at least about 20 nt, even more preferably at least about 3 O nt, and even more
  • a polynucleotide (either DNA or RNA) that is preferably hybridized to about 30-70 nt is contemplated.
  • the present invention is at least 80% identical to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, more preferably at least 85%, 90%, 92%, 95.
  • a polynucleotide comprising a base sequence that is 96%, 97%, 98% or 99% identical is provided.
  • Any specific nucleic acid molecule for example, at least 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 Or whether it is 99% identical or not is known computer programs (eg, Bestiitrogr am (Wisconsin Sequence Analysis package, Verssion 8 for Unix (registered trademark), Genetics Computer Gr) up, Un iversity Re search Park, 575 Science Drive, Madison, WI 5371 1) B estfit uses the local homology algorithm of S mith and Waterman.
  • the identity between the reference (QUERY) sequence (sequence according to the invention) and the subject sequence (also referred to as global sequence alignment) is determined by the algorithm of Brut 1 ag et al. (Comp. Ap p. B iosci. 6: 237-245 (1990))).
  • this book includes a prolific rigonucleotide consisting of a fragment of the above-mentioned polynucleotide or a compensatory sequence thereof.
  • the oligonucleotide of the present invention is lignan methi. Even if it does not encode a glycated polypeptide, one skilled in the art will readily understand that the polynucleotide of the present invention can be used to produce the polypeptide of the present invention as a primer for the polymerase chain reaction (PCR). To do.
  • oligonucleotides of the present invention that do not code lignan methylated polypeptides include: (1) Lignan methylenoylase genes in a cDNA library or alleles or splicing modifications thereof. (2) In situ hybridization to metaphase chromosomal spreads (eg “FI SH”) (Ve) to provide the exact chromosomal location of the lignan methylenolate enzyme gene rma et al., Hum an and nr omo s ome s: A Manu alof Basic Techniqes, P erg amon Press, New York (1 988)); and (3) Lignans in specific tissues Northern blot analysis to detect methylase mRNA expression.
  • FI SH metaphase chromosomal spreads
  • the polynucleotide or oligonucleotide of the present invention can be used as a tool for gene expression manipulation by antisense RNA mechanism. With antisense RNA technology, a decrease in the gene product derived from the endogenous gene is observed. By introducing the oligonucleotide of the present invention, the content of the polypeptide having lignan methylation activity can be reduced, and as a result, the methyl lignan content or content ratio in the plant can be controlled (increased or decreased). Can do.
  • the polynucleotide or oligonucleotide of the present invention may contain a sequence such as an untranslated region (UTR) sequence or a vector sequence (including an expression vector sequence).
  • Examples of the method for obtaining the polynucleotide or oligonucleotide of the present efforts include various known methods for isolating a DNA fragment containing the polynucleotide or oligonucleotide of the present invention.
  • a probe that specifically hybridizes with the base sequence of the polynucleotide of the present invention and screening a genomic DNA library or cDNA library, the polynucleotide or oligonucleotide of the present invention can be obtained. can do.
  • Such a probe may be a polynucleotide (oligonucleotide) that specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the polynucleotide of the present invention or its complementary sequence.
  • polynucleotides selected by such hybridization include natural polynucleotides (eg, polynucleotides derived from plants such as sesame plants and bryophytes), and are polynucleotides derived from plants other than plants. You may do it.
  • natural polynucleotides eg, polynucleotides derived from plants such as sesame plants and bryophytes
  • polynucleotides derived from plants other than plants You may do it.
  • Another method for obtaining the polynucleotide of the present invention is a method using PCR.
  • This PCR amplification method includes, for example, a step of preparing a primer using a sequence (or its phase-trapping sequence) on the 5 'side and / or 3' side of cDNA of the polynucleotide of the present invention, these primers
  • the method includes PCR amplification using genomic DNA (or c DNA) as a template, and using this method, a large amount of DNA fragments containing the polynucleotide of the present invention can be obtained. can do.
  • the source for obtaining the polynucleotide of the present invention is not particularly limited and is preferably a biological material containing force piperitol or pinoresinol.
  • biological material is intended to be a biological sample (a tissue sample or cell sample obtained from an organism). In the embodiments to be described later, sesame is used, but the present invention is not limited to this.
  • polynucleotide of the present invention By using the polynucleotide of the present invention, it is possible to synthesize a polypeptide having a redanan methylation activity in a transformant or a cell. By using the polynucleotide of the present invention, an organism expressing a polypeptide having lignan methylation activity can be easily detected by detecting hybridizing nucleotides.
  • the oligonucleotide of the present invention can be used as a hybridization probe for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide having lignan methylation activity or as a primer for amplifying the polynucleotide, whereby An organism or tissue expressing an active polypeptide can be easily detected. Still further, the oligonucleotide can be used as an antisense oligonucleotide to suppress the expression of a polypeptide having lignan methylation activity in the organism or its tissue or cell.
  • the present invention also provides a protein (polypeptide) encoded by the above-described polynucleotide of the present invention.
  • a polypeptide is typically a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • a “fragment” of a polypeptide is intended to be a partial fragment of the polypeptide.
  • the polypeptides of the present invention may also be isolated from natural sources or chemically synthesized.
  • Polypeptides of the present invention may comprise natural purified products, products of chemical synthesis procedures, and prokaryotic or eukaryotic hosts (eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells). Including products produced by recombinant technology. Depending on the host used in the silk and thread production procedure, the polypeptides of the invention can be glycosylated or non-glycosylated. In addition, the polypeptides of the present invention may also include an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.
  • prokaryotic or eukaryotic hosts eg, bacterial cells, yeast cells, higher plant cells, insect cells, and mammalian cells.
  • the polypeptides of the invention can be glycosylated or non-glycosylated.
  • the polypeptides of the present invention may also include an initiating modified methionine residue in some cases as a result of host-mediated processes.
  • the present invention also provides a polypeptide having lignan methylation activity.
  • lignan methylotrophic activity is intended to mean the activity of methylating lignans, that is, the activity of transferring a methyl group to lignans. That is, in the present specification, “methylase” and “methyltransferase” are used interchangeably.
  • “Lignane methylation activity” can be measured or confirmed by reacting SAM, which is a methyl group donor, with lignan, which is a substrate, and lignan methyl ich enzyme, and analyzing the reaction product by HPLC or LC-MS analysis. it can.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, and includes a polypeptide having lignan methylation activity.
  • Such a variant has one or more (for example, 1 to 30 pieces, 1 to 20 pieces, 1 to 10 pieces, 1 to several pieces (6 pieces) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4. ), 1 ⁇ 3 or 1 to 2 amino acids (amino acid residues) are amino acid sequences with deletions, substitutions, insertions, and Z or additions, and include proteins having an activity of transferring a methyl group to a lignan. “Deletions, substitutions, insertions and / or additions” include inversions, repeats, and type substitutions (eg, replacement of one hydrophilic residue with another, but usually strongly hydrophilic residues). Are not substituted with strongly hydrophobic residues). In particular, “neutral” amino acid substitutions in a polypeptide generally have little effect on the activity of the polypeptide.
  • any base of a polynucleotide encoding a polypeptide can be mutated.
  • a deletion mutant or an addition mutant can be prepared by designing a primer corresponding to an arbitrary site of a polynucleotide encoding a polypeptide.
  • Preferred variants have conservative or non-conservative amino acid substitutions, deletions, or additions. Silent substitution, addition, and deletion are preferred, and conservative substitution is particularly preferred. These do not alter the polypeptide activity of the invention.
  • Conservative substitutions include substitution of one amino acid with another amino acid within the aliphatic amino acids A 1 a, V a 1, L eu. And I 1 e; hydroxyl residue S er And Thr exchange, acidic residues A sp and G 1 u exchange, substitution mid residues A sn and G 1 n substitution, basic residues Lys and Arg exchange, and aromatic residues Substitution between P he and T yr.
  • the polypeptide of the present invention may be a polypeptide in which an amino acid is bound to a peptide, but is not limited thereto, and may be a complex polypeptide containing a structure other than a polypeptide.
  • examples of the “structure other than the polypeptide” include sugar chains and isoprenoid groups, but are not particularly limited.
  • polypeptide of the present invention may contain an additional polypeptide.
  • attached polypeptides include, for example, epitope-labeled polypeptides such as His, My c, and F 1 ag.
  • polypeptide of the present invention may be in a state in which a polypeptide encoding the polypeptide of the present invention is introduced into a host cell and the polypeptide is expressed in the cell, or a cell, tissue, etc. It may be isolated and purified from.
  • polypeptides of the present invention may be recombinantly produced or chemically synthesized as described in detail below (eg, Houghten, RA, Proc. Natl. Acad. Sci). USA 82: 5131-5135 (1985); see U.S. Pat. No. 4,631,211, etc.).
  • the polypeptide of the present invention can catalyze the methyl ⁇ reaction of lignans (particularly pinoresinol or piperitol).
  • the present invention further includes a method for controlling (increasing or decreasing) the amount of lignan and methylated lignan in an organism (preferably a plant) by using the polypeptide or polynucleotide of the present invention and the controlled method.
  • Organism preferably planted Stuff
  • the present invention provides a vector used to produce a polypeptide having lignan methylation activity.
  • the vector of the present invention may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described polynucleotide of the present invention.
  • a recombinant expression vector in which a cDNA of a polynucleotide encoding a polypeptide having rhidanane methylation activity is inserted can be mentioned.
  • a method for producing a recombinant expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, a phage, or a cosmid.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of host cell, an appropriate promoter sequence is selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids is used as an expression vector. Use it.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, promoter, terminator, and / or replication origin, etc.) depending on the type of host to be introduced.
  • an expression control region for example, promoter, terminator, and / or replication origin, etc.
  • promoters for bacterial expression vectors ⁇ promoting promoters (eg, trc promoter, ta. Promoter, 1 ac promoter, etc.) are used, and as yeast promoters, for example, daricelaldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter PH 05 promoter and the like, and examples of the promoter for filamentous fungi include amylase, trp C and the like.
  • promoters for animal cell hosts include viral promoters (for example, sV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • the recombinant expression vector used for plant transformation is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide of the present invention in the plant.
  • Such vectors include, for example, vectors having a promoter that constitutively expresses the polynucleotide in plant cells (eg, cauliflower mosaic virus 35S promoter), or external And a vector having a promoter that is inducibly activated by various stimuli.
  • the expression vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme and / or ligase. Transformation of the host with the expression vector can also be performed according to a conventional technique.
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • selectable markers include the dihydrofolate reductase gene or neomycin resistance gene for eukaryotic cell culture, and the tetracytalin resistance gene or ampicillin resistance gene for culture in E. coli and other bacteria.
  • the polypeptide of the present invention may be expressed as a fusion polypeptide (eg, a fusion polypeptide with GFP), and the fluorescence of GFP may be used as a marker.
  • a fusion polypeptide eg, a fusion polypeptide with GFP
  • the present invention provides a transformant or a cell into which a polynucleotide encoding the above-mentioned polypeptide having lignan methylation activity has been introduced.
  • the term “transformant” is intended to include living organisms as well as tissues or organs.
  • a method for producing a transformant or a cell is not particularly limited, and examples thereof include a method for transformation by introducing the above-described recombinant vector into a host.
  • the host cell used here is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as E.
  • coli Esscherichiaco 1 i
  • yeast budding yeast S acchar omy cescerevislae, fission yeast S chizosacchar omy cesp omb e
  • nematode C aenorhabditise 1 egans
  • X enopus 1 aevis oocytes and the like.
  • Suitable culture media and conditions for the above host cells are well known in the art.
  • the organism to be transformed is not particularly limited, and examples thereof include various microorganisms, plants and animals exemplified in the host cell.
  • the transformant or cell of the present invention is characterized in that the thread and composition of lignan opino or methylated rydanan naturally present in these transformants or cells is modified.
  • the transformant or cell of the present invention is preferably a plant or a progeny thereof, or a tissue derived therefrom, and particularly preferably sesame, forsythia or flax. Such a transformant or cell can increase or decrease the content of methyl lignan in an organism producing lignan by using the method for controlling methylated lidanan content of the present invention.
  • the transformant of the present invention may be a plant transformant.
  • the plant transformant of this embodiment is obtained by introducing a recombinant vector containing the polynucleotide of the present invention into a plant so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • the recombinant expression vector used for transformation of the plant body is not particularly limited as long as it is a vector capable of expressing the polynucleotide of the present invention in the plant.
  • a vector having a promoter that constitutively expresses a polynucleotide in plant cells for example, the cauliflower mosaic virus 35 S promoter
  • a vector having a promoter for example, the cauliflower mosaic virus 35 S promoter
  • Plants to be transformed in the present invention include whole plants, plant organs (eg leaves, petals, stems, roots, seeds, etc.), plant tissues (eg epidermis, phloem, soft tissues, xylem, vascular bundles, It means any one of: a palisade tissue, a spongy tissue, etc.) or a plant culture cell, or various forms of plant cells- '(eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, etc.
  • the plant used for transformation is not particularly limited and may be any plant belonging to the monocotyledonous plant class or the dicotyledonous plant class.
  • transformation methods known to those skilled in the art for example, agrobacterium tellurium method, gene gun, PEG method, electoral position method, etc.
  • a method involving agrobacterium and a method for directly introducing it into plant cells are well known.
  • the constructed plant expression vector is introduced into an appropriate agrobacterium (eg, Agrobacterium tumefaciens) Strains can be infected into sterile cultured leaf pieces according to the leaf disk method (Hirofumi Uchimiya, Plant Gene Manipulation Manual (1 990) pages 27-31, Kodansha Scientific, Tokyo, etc.) to obtain transformants.
  • the method of Nage 1 et al. (Mi cribio 1. L et t., 67, 325 (1 990)) can be used, which involves first introducing an expression vector into an agglutacterum, for example. Then, the transformed agro nocterum is introduced into a plant cell or a plant tissue by the method described in Plant Molecular Biology Manual (SB Gelvin, Ac admic Pres Publishers). Where: “planting “Physical tissue” includes callus obtained by culturing plant cells.When transformation is performed using the agrobacterium method, a binary vector (such as pBI 121 or pPZP 202) can be used.
  • a binary vector such as pBI 121 or pPZP 202
  • an electro-poration method and a gene gun method are known as a method for directly introducing a gene into a plant cell or plant tissue.
  • a gene gun a plant body, a plant organ, or a plant tissue itself may be used as it is, or it may be used after preparing a section, or a protoplast may be prepared and used.
  • the sample prepared in this way can be processed using a gene introduction device (for example, PDS-1000 (BIO-RAD)).
  • Treatment conditions vary depending on the plant or sample, but are usually performed at a pressure of about 450 to 2000 p si and a distance of about 4 to 12 cm.
  • the cell or plant tissue into which the gene has been introduced is first selected for drug resistance such as hygromycin resistance, and then regenerated into a plant by a conventional method. Plant regeneration from transformed cells can be performed by methods known to those skilled in the art depending on the type of plant cell.
  • transformation is performed by introducing a recombinant vector into the cultured cells using a gene gun, an electroporation method, or the like.
  • Callus, shoots, hairy roots, etc. obtained as a result of transformation can be used directly in cell culture, tissue culture or organ culture.
  • the plant body can be used by administration of an appropriate concentration of plant hormones (auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid, ethylene, brassinolide, etc.) using a conventionally known plant tissue culture method. It is possible to play back.
  • Whether or not a gene has been introduced into a plant can be confirmed by PCR, Southern hybridization, Northern hybridization, or the like. For example, prepare DNA from the transformed product, design DNA-specific primers, and perform PCR.
  • the present invention also includes a plant body into which the polynucleotide of the present invention has been introduced so that it can be expressed, or a progeny of the plant body having the same properties as the plant body, or yarns and weaves derived therefrom. .
  • transformation methods for various plants have already been reported.
  • Examples of the transformed plant of the present invention include sesame, rice, tobacco, barley, wheat, rapeseed, potato, tomato, poplar, banana, eucalyptus, sweet potato, tides, alfa alpha, norepin, tomokoshi, and power.
  • sesame can be used to produce the transformant of the present invention.
  • T As am izu: T ransfo rma ti on ofses ame lantsusing MA T vectorsyst em: introductionoffattyac iddesaturasegene s. S es ame N ews 1 etter 16: 22 ⁇ 25 (2002 )
  • methylated rydanan (piperitol and / or pinoresinol) can be produced in a low-cost and environmentally-friendly production process in order to produce methylated rydanan in the sesame. Can be produced.
  • tapaco can be suitably used as the transformant of the present invention.
  • Tobacco along with petunia, is a representative plant that can be transformed easily, and can be regenerated from one cell (protoplast) with the cell wall removed to one individual plant. Since one regenerated plant does not fall into a chimera unlike one plant derived from multiple cells, a transformant can be produced efficiently.
  • a preferable method for transformation of tobacco is the leaf disk method. This method is easy to operate and can be used to obtain a number of independent transformants from one leaf section. Methods for transformation are described in, for example, “Guideline for Neoplastic Chemistry 3 Separation / Analysis of Nucleic Acids and Genetic Experiment Method Chemistry”
  • lignan methylase By using the transformed tobacco thus obtained, lignan methylase can be produced by a low-cost and environmentally-friendly production process.
  • rice can be suitably used as the transformant of the present invention. If transformed rice is used, it is possible to produce a redanan methyltransferase in the rice by a production process that is low in cost and low in the environment.
  • the transformant of the present invention is an organism containing lignan (particularly pinoresinol or piperitol)
  • the methylated lignan can be produced by introducing the polynucleotide, regardless of the species.
  • the present invention can provide an inexpensive food or industrial product by preparing a large amount of methylated rydanan.
  • a polypeptide that catalyzes a lignan methylation reaction can be provided at low cost and under a low environmental load.
  • the cells according to the present invention may be various bacterial hosts.
  • the cell according to the present embodiment is obtained by introducing a recombinant vector containing the polynucleotide according to the present invention into the cell so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed.
  • the methylolated lignan can be produced by introducing the polynucleotide, regardless of the species.
  • the present invention can provide an inexpensive food or industrial product by preparing a large amount of methyl lignan.
  • the present invention provides a method for producing the polypeptides of the present invention.
  • a method for producing a polypeptide of the present invention it is possible to provide a polypeptide that catalyzes a redanane methylation reaction under conditions of low cost and low environmental load. Further, if the method for producing a polypeptide of the present invention is used, a polypeptide that catalyzes a lignan methylation reaction can be easily produced.
  • a vector containing a polynucleotide that codes for the polypeptide of the present invention can be used.
  • the polypeptide production method of the present invention comprises the above vector as a cell-free protein synthesis system. It is preferable to use it. When using a cell-free protein synthesis system, various commercially available kits may be used. Preferably, the polypeptide production method of this embodiment includes a step of incubating the vector and the cell-free protein synthesis solution.
  • the polypeptide production method of the present embodiment can also use a recombinant expression system.
  • the polynucleotide of the present invention is incorporated into a recombinant expression vector, introduced into a host so that it can be expressed by a known method, and the polypeptide obtained by being translated in the host is used.
  • a method of purification can be employed.
  • the thread-reversible expression vector may or may not be a plasmid as long as the target polynucleotide can be introduced into the host.
  • the method for producing the polypeptide of the present embodiment includes a step of introducing the vector into a host.
  • Prokaryotes or eukaryotes can be used as the host.
  • bacteria belonging to the genus Escherichia for example, Escherichiaco 1 i
  • bacteria belonging to the genus Bacillus for example, Bacillus ub tilis
  • Bacillus ub tilis for example, Bacillus ub tilis
  • a lower eukaryote for example, a eukaryotic microorganism such as a yeast or a filamentous fungus
  • a yeast a microorganism of the genus Saccharomyces (for example, Sacchar omy cescerevisiae) and the like
  • filamentous fungi include microorganisms belonging to the genus As pergillus (for example, Aspergi 1 1 stakeyzae, As pergi 1 1 usniger, etc.) and microorganisms belonging to the genus Penici 1 1 i um.
  • Animal cells or plant cells can also be used as a host, and examples of animal cells include mice, hamsters, monkeys, and human cells. It is. In addition, insect cells may be used as a (e.g., silkworm cells or adult silkworms) tossed host.
  • animal cells include mice, hamsters, monkeys, and human cells. It is.
  • insect cells may be used as a (e.g., silkworm cells or adult silkworms) tossed host.
  • the host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be suitably used. Specifically, for example, bacteria such as E. coli (E scherichiaco 1 i), yeast (budding yeast S accharomy cescerevisiae, force, fission yeast S cizosacchar omy cespombe), nematode (C aenorhabditiselegans), african enamel ( X enopuslaevis) oocytes, etc. Absent. Suitable culture media and conditions for the above host cells are well known in the art.
  • the expression vector when introducing a foreign polynucleotide into a host, preferably incorporates a promoter that functions in the host so as to express the foreign polynucleotide.
  • the method for purifying the recombinantly produced polypeptide varies depending on the host used and the nature of the polypeptide, but it is possible to purify the target polypeptide relatively easily by using a tag or the like.
  • the method for producing a polypeptide according to this embodiment preferably further includes a step of purifying the polypeptide from an extract of cells or tissues containing the polypeptide of the present efforts.
  • the step of purifying a polypeptide is performed by preparing a cell extract from cells or tissues using a well-known method (for example, a method in which cells or tissues are disrupted and then centrifuged to collect a soluble fraction).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the polypeptide of the present invention can be purified from cells or tissues that naturally express the polypeptide of the present invention, or can be prepared by chemical synthesis.
  • the method for producing the mutant polypeptide is not particularly limited. For example, site-directed mutagenesis (see, for example, Hasimo to- Gotoh, Gene 152, 271-275 (1995)), and point mutations are introduced into nucleotide sequences using PCR.
  • a mutant polypeptide can be prepared by using a method for preparing a peptide, or a known method for preparing a mutant polypeptide such as a method for preparing a mutant strain by transposon insertion. Commercially available kits may be used to produce mutant polypeptides.
  • the method for producing a polypeptide of the present invention has at least an amino acid sequence of a polypeptide having lignan methylation activity, or a rydanan methylation activity.
  • W 200
  • the present invention provides methods for producing methylated lignans using organisms or cells that express the polypeptides of the present invention.
  • the organism may be a natural unmodified organism or a transformant using a recombinant expression system.
  • the methylated lignan production method of the present invention can efficiently produce lignans (particularly, pinoresinol or piperitol).
  • the method for producing methylated lignan of the present invention comprises producing a methyl hydridanan using an organism transformed with a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or a tissue thereof.
  • the organism is the above-described transformant plant or bacterium, particularly preferably Escherichia coli, sesame, forsythia or flax.
  • the method for producing methylated lidanan of the present invention includes a step of introducing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into the organism.
  • the step of introducing the polynucleotide into the living body the above-described various gene introduction methods may be used.
  • the organism is different in composition between methylated lignan produced before transformation and methyl iridanane produced after transformation. Specifically, the content of lignans and methyl ichylidanans obtained from the above organisms increases. It is preferable that the method for producing methylated lignan according to this aspect of the present embodiment further includes a step of extracting methylated lignan from the living body.
  • the method for producing methylated lidanan of the present invention includes a step of introducing the oligonucleotide of the present invention as an antisense oligonucleotide into an organism that naturally expresses the polypeptide of the present invention.
  • the step of introducing the oligonucleotide into the organism the above-described antisense RNA technology may be used.
  • the menu according to this embodiment Preferably, the method for producing a tilated lignan further includes the step of identifying an organism that naturally expresses the polypeptide of the present invention using the antibody or oligonucleotide described above.
  • the method for producing methylated lignan according to this aspect of the present embodiment preferably further includes a step of extracting methyl lignan from the organism.
  • the composition of the organism differs between the methylated lignan produced before the introduction of the oligonucleotide and the methylated lignan produced after the introduction. Specifically, the content of lignans and methylated lignans obtained from the organisms is reduced.
  • the present invention provides foods and industrial products produced using the methylated lignan obtained by the above-described method for producing methylated lignan.
  • the food described in this section uses methylated rydanan extracted from the above-mentioned transformed plant even if it is the seed, fruit, cut ear, tuber, and Z or tuberous root of the above-mentioned transformed plant. Food (eg, sesame, forget-me-not or flax, or processed foods thereof).
  • the food or industrial product according to the present invention may contain a desired amount of lignan (particularly pinoresinol or piperitol).
  • a methyl lignan extract extracted from the transformed plant force of the present invention having an increased methylated lidananan content as described above is provided as a food having a high methylated lignan content.
  • the extracted methyl potato lignans not only the extracted methyl potato lignans but also the seeds, fruits, cut ears, tubers, and / or tuberous roots of the above transformed plants are also provided as foods rich in methylated lignans.
  • the target for altering the methyl lignan yarn formation is not particularly limited, and can be any organism other than plants, such as animals, bacteria, or yeasts.
  • the polypeptide or polynucleotide of the present invention can be produced from industrial products (eg, films, biodegradable plastics, functional fibers, lubricants, or detergents). It can be used as a raw material for industrial products such as
  • sesame lignan methyl polypolypeptide is described as an example.
  • the present invention should not be limited only to sesame-derived polypeptides or polynucleotides, but to those skilled in the art that it relates to all polypeptides having lignan methylation activity and uses thereof. It is obvious.
  • the lignan methyltransferase may be derived from any plant, animal or microorganism, and the amount of lignan can be controlled as long as it has lignan methylase activity.
  • the present invention relates to a plant, its progeny, or a tissue thereof in which the amount of lignan produced by introducing a polynucleotide encoding lignan methylating enzyme, and the form thereof may be cut flowers. If the lignan methyl ich polypeptide of the present invention is used, the production of methylated rydanan can be promoted or suppressed. In addition, if a conventional method is used, the polynucleotide is introduced into a plant and the polynucleotide is expressed constitutively or tissue-specifically to increase the expression of the target polypeptide. Those skilled in the art will readily understand that the expression of the target polypeptide can be suppressed by using the method, the simultaneous suppression method, the RNA i method, and the like.
  • Example 1 Example 1
  • a pBK-CMV phagemid (Stratagene) was prepared according to a method recommended by the manufacturer using a cDNA excision library derived from sesame seeds described in a publicly known document (International Publication WO 2005/030944) using a Rapid Excision kit (Stratagene). Cut out and infected with E. coli. E. coli colonies containing this sesame seed-derived EST are randomly 5000 clones were picked up and colony PCR was performed using the M13RV primer (SEQ ID NO: 5) and M4 (-20) primer (SEQ ID NO: 6) under the following conditions.
  • SEQ ID NO: 6 M4-20: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT
  • PCR products were subjected to agarose gel electrophoresis, and ESTs contained in pBK-CMV were confirmed to be specifically amplified by ethidombu mouth amide staining did.
  • the enzyme reaction was terminated. Using this enzyme reaction mixture 11, a direct sequence reaction was performed under the following conditions.
  • Sequence reaction solution is enzyme reaction solution 1 ⁇ 1, 5x B lg Dye S equencing Buffer ver.3.1 (A p 1 ied B iosystems) 3 ⁇ 1, B ig Dye S equencing RR ver.3.1 (A pplied B iosystems) 2 ⁇ 1, 1.6 mol / ⁇ 1 M13R V primer 1 ⁇ 1 and sterilized water 13 ⁇ 1
  • the sequence reaction was 96 ° C for 1 minute followed by 25 cycles of 96 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, and 60 ° C for 4 minutes.
  • the sequence reaction solution was generated using Dye EX 96 (QIAGEN) according to the method recommended by the industry, and the base sequence was determined using Sequencer mo del 3 100 (Applied Biosystems). did.
  • the PCR reaction solution consists of cDNA 1 ⁇ 1, 1 ⁇ ⁇ - ⁇ aqbuffer (Taka Ra), 0.2 mM dNTP s, each primer 0.2 pmo 1 ⁇ 1, Ex—T aqpol ymer rase 1.25 U . After 5 minutes at 94 ° C, 94 cycles of reaction at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, 72 minutes for 32 minutes followed by PCR amplification followed by holding at 72 for 5 minutes.
  • S i OMT1-FW SEQ ID NO: 7
  • S i OMT1-RV SEQ ID NO: 8
  • S i OMT2-FW SEQ ID NO: 9
  • S i OMT2-RV SEQ ID NO: 10.
  • the PCR reaction of the gene serving as an internal standard was performed simultaneously. Specifically, using the S 18 S rRNA—F primer (SEQ ID NO: 11) and S i 18 S rRNA—R primer (SEQ ID NO: 12), the sesame 18 S ribosoma l RNA gene (a The PCR reaction was performed with the following session number: AF 169853).
  • Sequence number 8 S i OMT1-RV: 5'-AAAATTC AGACTTATAACGA TACCAAA
  • SEQ ID NO: 9 S i OMT2-FW: 5 C -TT AG AAAAACTCA AT TCGTC TAAT
  • Sequence number 10 S i OMT2-RV: 5 CT AC AT CC AC G AC GG AAT W 200
  • SEQ ID NO: 11 S i 18 S r RNA-FW: 5,-t a t g c t t g t c t c a a a g a t t a a
  • SEQ ID NO: 12 S i 18 S r RNA- RV: 5 '— a a c a t c t a a g g g c a t c a c a g a
  • both Si OMT genes (S i OMT1 and S i OMT2) were confirmed to be strongly expressed in the seed (Fig. 2-2A). That is, it was confirmed that both Si OMT gene expression regions and methylated lignan accumulation regions matched.
  • SEQ ID NO: 13 GR-S i OMT1-RV: 5'-ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa
  • SEQ ID NO: 14 S i OMT1-NE
  • S T-RV 5'-gcaaatccacttcataaaaat
  • SEQ ID NO: 15 GR-S i OMT 2-RV: 5'-cctcgggttccgctctttctgctcccagaa
  • SEQ ID NO: 16 S i OMT2-NEST-RV: 5'-atcaatttgggaaattacaaa
  • the EST clone contains the 3 'end of the predicted ORF Therefore, 3 ′ RACE was performed using the primers of SEQ ID NOs: 17 and 18.
  • SEQ ID NO: 17 GR-S i OMT 2-FW: 5'-gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt
  • SEQ ID NO: 18 S i OMT 2-NE ST-FW: 5'-aacgtcgttctgggagcagaaaga
  • the base sequence of the amplified fragment obtained by the RACE method was determined by the primer walking method, and the base sequence information including the full-length open reading frames of the S i OMT1 and S i OMT2 genes was obtained (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 19)
  • S i OMT 1 showed 74% sequence identity with Catharanthsus roseus Caffeic acid-O-methyltransferase (COMT) (AAK20170), and S i OMT 2 was found in Rosa hybrida (AAM23004). It showed 57% sequence identity with Orcinol'O-methyltransferase (OOMT).
  • OOMT Orcinol'O-methyltransferase
  • Sequence number 21 Sall-SiOMTl-RV 5'-attgcgacttatgaaattccatgatccaaatatt Sequence number 22: BamHI-SiOMT2-FW: 5 ' ⁇ aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaatctt
  • PCR reaction solution (25 ⁇ 1) is sesame seed cDNA as template, each primer 0.2 ⁇ 1 / ⁇ 1, 1 XKOD plusbuffer (TOYO BO), 0.2 mM dNTPs, 1 mM Mg S0 4 1 U KOD luspo 1 yme rase. After reacting at 94 ° C for 5 minutes, PCR was amplified by 30 cycles of reactions at 94 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 2 minutes, and then held at 72 ° C for 3 minutes.
  • PCR product obtained was inserted into the multicloning site of pCR4Blunt-TOPO vector (Invitrogen) according to the method recommended by the manufacturer, and S i OMTlZpCR4Blunt-TOPO (p S OMB2 / p CR4 Blunt-TOPO (referred to as pSP B2679).
  • Bacteria were collected by centrifugation for 1 minute. Suspend the cells in 10 ml buffer (30 mM Tris_HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 50 ⁇ APSMF), and then sonicate to destroy E. coli. Subsequently, the mixture was centrifuged at 15 °, 00 00 r 1) 111 at 4 °° for 10 minutes, and the obtained supernatant was used as a crude enzyme solution for the following activity measurement.
  • sesame lignan used as the substrate for the enzyme reaction was dissolved in a small amount of DMSO and then dissolved in 70% ethanol to prepare a substrate solution (lmg / ml).
  • a substrate solution for example, sesame danane can be obtained by extraction and purification from sesame according to a known method (Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry 6 7: 1 6 9 3 (1 9 9 3)).
  • the enzyme reaction was stopped by adding 100% acetonitrile (250 1) containing 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) to the reaction tube.
  • the reaction tube is vigorously stirred with a Portex mixer, then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and the resulting supernatant is filtered (pore size 0.45 mm, 4 mm M i 1 1 ex — After cleaning with LH, M i 1 1 ipore), the supernatant was analyzed using liquid high-speed chromatography (HPLC).
  • HPLC liquid high-speed chromatography
  • Liquid chromatography (Lc 1 2010 c (Shimadzu Corporation) was performed using a C-30 column (Nomura Chemical C30-UG-5, 4.6 mm ⁇ 15 Omm).
  • As the mobile phase 90% acetonitrile containing 0.1% TFA as solution A and 0.1% TFA as solution B was used.
  • the linear concentration gradient solution 80%: solution B 20% ⁇ solution 10%: solution B 90%
  • eluted for 20 minutes flow rate 0.6 ml / min
  • the compound contained in the sample was detected by measuring the absorption of 28 On m.
  • Each peak of the compound is 190 ⁇ using SPD-10AV (Shimadzu Corporation)! A spectrum of ⁇ 400 nm was measured, and substances with two absorption maxima (230 nm and 280 nm) characteristic of lignan were searched. Under these conditions, the pinoresinol standard is detected at about 11.8 minutes, the piperitol standard is about 15.5 minutes, and the sesaminol standard is about 16.8 minutes.
  • peak A is detected at approximately 8.3 minutes and peak B is detected at approximately 11.3 minutes ( Figures 3-5).
  • MS conditions of ion mode ES, Co neoltage 15V, Collision 2 eV, MS scan in the range of 100 to 800 (m / ⁇ , 30 minutes), PDA in the range of 210 to 400 nm (30 minutes) was measured.
  • peak A was ionic ion molecular weight 373 (m / z) and peak B was ammonium ion molecular weight 371 (m / z) (Fig. 6-4A). Fig. 7_4B). Therefore, these peaks were identified as monomethylated with pinoresinol (ammonium ion addition molecular weight 359) and monomethylated with piperitol (ammonium ion addition molecular weight 374), respectively.
  • S i OMT1 is an enzyme having the activity of monomethylating pinomaresinol and piperitol, which are sesame lignans.
  • the obtained approximately 1.1 kb PCR product was inserted into the multiple cloning site of pCR2-TOPO vector (Invitrogen) according to the method recommended by the manufacturer, and SrSiOMT1 / pCR2- TOPO (p S PB2910) was obtained.
  • SrOMT1 contained in pSPB2910 was determined by the primer walking method (SEQ ID NOs: 3 and 4). SrOMT1 showed 89% sequence identity with SiOMT1 in terms of amino acid sequence. For sequence identity, the C l u s t a l W a i g nme n t program (Mc V e c t o r v e r. 7.2.2 (, Syman t c c o r p o r a t i o n)) 3 ⁇ 4r was used with default settings. This high sequence identity strongly supports that SrOMT1 is a counterpart gene of SiOMT1.
  • RT-PCR was performed in the same manner as in Example 2, and Sr OMT1 seed-specific gene expression was confirmed (FIGS. 2-2B).
  • Sr OMTl / pQE 30 (pSPB2911), an E. coli expression vector for S r OMT1, was constructed in the same manner as in Example 4, and a recombinant protein was prepared in the same manner as in Example 5. Activity and product analyzes were performed.
  • Sr OMTl like S i OMTl, showed methinoreich activity against pinoresinol opipiperitol (Fig. 5). In addition, S i OMT1 showed no methylation activity against sesaminol.
  • SrOMTl is a force promoter gene of Si OMT1, and that this enzyme gene is conserved among sesame species.
  • Genomic DNA was extracted from leaves of S. nd i c urn (Mase gold varieties) using Nu c len Phy t o p u r e f o r P l ant Ex t r a c t i onKit (Amersham) according to the manufacturer's recommended method.
  • the extracted genomic DNA was digested with EcoR I, Hindi I I, Xho I or Xba I, and then separated by electrophoresis using agarose gel.
  • This agarose gel was hydrolyzed with 0.25 M HC 1 for 15 minutes, then denatured with a solution of 1.5 M Na C 1 /0.5 M NaOH (30 minutes), and 1.5 M Na C 1 Tris-HC1 (pH 7.5) containing was neutralized with denaturing solution (20 minutes). Next, the genomic DNA in the agarose gel was transferred to a membrane (Hy b i bnd d-N, Amersham) in 20 X SSC solution.
  • Genomic DNA transcribed onto membrane is bound to the membrane by UV irradiation, 7% SDS, 50% formamide, 5 XSSC, 2% blocking reagent, 0.1% lauroyl sarcosine, 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 7.0) ) was prehybridized at 42 ° C for 1 hour using a hybridization buffer solution (high SDS buffer solution: Roche).
  • PCR was performed using a primer pair of SEQ ID NO: 20 (B g 12-S i OM T1-FW) and SEQ ID NO: 21 (S a 1 I—S i OMT1-RV), respectively. ⁇
  • SEQ ID NO: 20 B g 12-S i OM T1-FW
  • SEQ ID NO: 21 S a 1 I—S i OMT1-RV
  • PCR reaction solution was 1 ng of p S PB2678 plasmid, 1 XPCR buffer (Takara Bio), 2.5 mM DIG—dNTP mix (PCR DIG labeling Mix, Roche), 0.2 pmo 1 primer 1 U r T aqpol yme rase (Takarapaio).
  • the PCR reaction was 30 cycles of 95 for 30 seconds, 53 for 30 seconds, and 72 for 2 minutes.
  • a PCR product purified using Sephadex G-50 column and Fine (Boehringer) was used as a hybridization probe. After thermal denaturation of this probe, 15 ⁇ 1 was added to the pre-hybridization solution and incubated at 42 ° C.
  • the membrane was washed under highly stringent conditions (twice for 30 minutes at 65 ° C using a solution containing 0.2 X SSC and 0.1% SDS). Hybridization signals were detected using a D I G labeling & detection kit (Roche) according to the manufacturer's instructions.
  • S i OMT1 and Sr OMT1 show the highest sequence identity with COMT among known proteins by database search. This suggests that sesame methylase also has COMT activity.
  • Si OMT1 and Sr OMT1 were both standard products in the reaction solution with caffeic acid.
  • a peak C (retention time of about 7.3 minutes) with the same retention time as that of ferulic acid was generated (Fig. 9-6A-6C)).
  • caffeic acid is dissolved at a retention time of about 3.9 minutes.
  • the polypeptides and polynucleotides of the present invention are useful for the production of methino ray lignans.
  • the transformant or cell into which the polynucleotide of the present invention has been introduced so that it can be expressed is extremely useful for producing methylated lignans or products using the same in the food field and various industrial fields.
  • the transformant is a plant body, the plant body itself can be used as food, which is very useful in the agricultural field.
  • polypeptides and polynucleotides of the present invention are not limited to sesame. Therefore, it is possible to establish a production system for specific lignan molecular species, and as a result, it is possible to expand the production of specific rydanan opi-methylated rydanan. Therefore, the present invention can be widely used in agriculture, food industry, pharmaceutical industry and related industries.

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Abstract

本発明はリグナンにメチル基を転移する活性を有する酵素の遺伝子、当該メチル化酵素を利用してリグナン組成が変換された植物などに関する。更に詳しくは、本発明は、メチル化リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、好ましくはゴマ由来のメチル化リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、及びその利用に関する。

Description

明 細 書
リグナンメチル化酵素をコ^"ドする遺伝子
技術分野
本発明はリグナンにメチル基を転移する活性を有する酵素の遺伝子、 当該メチル 化酵素を利用してリグナン組成が変換された植物などに関する。 更に詳しくは、 本 発明は、 メチル化リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、 好ましくはゴマ由 来のメチルイ匕リグナンを合成する活性を有する酵素遺伝子、 及びその利用に関する。 背景技術
ゴマ属ゴマ （Sesamxmi indicum) は、 ゴマ科 （Pedaliaceae) に属する 1年生 の草本植物である。 ゴマの原産地は、 中央アフリカといわれている。 ゴマは、 約 6 000年の歴史を有する最古の栽培油糧植物とされ、 世界中で栽培されてきた。 ゴ マは、 古来から貴重な食品であり、 健康に良い食品の代表として知られている。 特 に、 ゴマ種子、 ゴマ種子から得た油、 ゴマ種子からの抽出物が利用されている （例 えば、 ゴマその科学と機能性、 並木満夫編：丸善ブラネット社 （1998) 参照） 。 ゴマ種子に含まれる成分は、 その約 50%が脂質であり、 約 20%が蛋白質である。 ゴマに含まれる脂質の主要成分は、 ォレイン酸およびリノール酸を主体とするトリ グリセリ ドである。 ゴマはまた、 ビタミン B l、 B 2、 Eなどをさらに含む。 リグ ナンと総称される植物の二次代謝物 （例えば、 セサミンおょぴセサモリンなど） 力 S、 上記の成分以外にゴマに含まれており、 これらは強い抗酸化性を有している （例え ば、 B i o c h emi c a l Sy s t ema t i c s a n a E c o l o g y 1 3， 1 33- 139 (1985) 参照） 。
リグナンの生合成については、 例えば、 L i g n a n s ： b i o s yn t h e s i s a n d f un c t i o n, C omp r e h e n s i v e n a t u r a l p r o d u c t s c h em i s t r y, 1 : 640— 713 (1 999) ； P hy t o c h em i s t r y Re v. 2257— 288 (2003) などに 記載されている。
例えば、 Phy t o c h em i s t r y Re v. 2257— 288 (20 03) には、 コニフェリルアルコールが重合して合成されるピノレジノールが生合 成上の最初のリグナンであること、 そしてピノレジノールから個々の植物種におい て特有な生合成経路を経由して多様なリグナンが合成されることが示されている。 このピノレジノールの合成に寄与するデリジェントタンパク質がレンギヨゥなどに おいて報告されている （例えば、 S c i e n c e 2 7 5， 3 6 2— 3 6 6 (1 9 9 7) 等参照） 。 さらに、 レンギヨウのピノレジノール一ラリシレジノール 還元酵素遺伝子 （例えば、 J . B i o l . C h e m. , 2 7 1 ： 2 9 4 7 3 (1 9 9 6) 、 特表 2 0 0 1— 5 0 7 9 3 1号公報等参照） 、 Th u j a p l i c a t aのピノレジノールーラリシレジノール還元酵素遺伝子 （例えば、 J . B i o l . C h e m. ， 2 74 : 6 1 8 (1 9 9 9) 等参照） ならびに組換えセコイソラリシ レシノールデヒドロゲナーゼおよびその使用方法 （例えば、 J . B i o l . C h e m. ， 2 7 6 (1 6) : 1 2 6 1 4— 2 3 (2 0 0 1) 、 特表 2 0 0 2— 5 1 2 7 9 0号公報等参照） が報告されている。 さらに、 L a r r e a t r i d e n t a t aから、 ラレアトリシン水酸化酵素遺伝子がクローニングされている （例えば、 P r o c . N a t . A c a d. S c に USA, 1 00 : 1 0 64 1 (2 0 0 3) 等参照） 。
ゴマリダナンの生合成についてはピノレジノールにピペリ トール合成酵素が作用 することによってピペリ トールが合成され、 次いで、 このピペリ トールにセサミン 合成酵素が作用することによってセサミンが合成されるとされていた。 しかしなが ら、 ゴマからクローニングされたチトクローム P450タンパク質である CYP81Q1 は単独でピノレジノールからピペリ トールを経て、 セサミンを合成することが明ら かにされた （国際公開公報 WO2005/030944；図 1参照） 。
近年、 リグナンだけでなく リグナンの配糖体もまた注目されている。 上記したリ ダナン分子のうちのいくつかは、 配糖体として植物中に存在することが知られてい る。 例えば、 ゴマ種子中には、 セサミノール配糖体 （セサミノーノレ 2， 一 O— β— D—ダルコピラノシド；セサミノール 2， 一 Ο— 一 D—ダルコピラノシル （1一 2) —0— j3—D—ダルコピラノシド；およびセサミノール 2， 一 Ο— — D—グ ルコビラノシル （1— 2) — O— (― )3— D—ダルコビラノシル （1— 6) ) — β 一 D—ダルコピラノシド） ） 、 およびピノレジノール配糖体 （ピノレジノール 4， 一 Ο— — D—ダルコビラノシル （1— 6) — j8—D—ダルコピラノシド； ピノレ ジノール 4， 一 —D—ダルコビラノシル （1— 2) — — D—グルコピラノ シド； ピノレジノール 4， 一O— ;3—D—ダルコピラノシル （1— 6) -0- (β 一 D—ダルコビラノシル （1— 6) ) jS— D—ダルコピラノシド；およびピノレジ ノールジー O— j3— D—ダルコピラノシド） ） などが存在し、 レンギヨウには、 ( + ) —ピノレジノール一 4， 一O— 一Dダルコシドおよび （一） 一マタイレジ ノール一 4一 O—ダルコシドが、 アマには、 セコラリシレジノールジグルコシドお ょぴピノレジノールジダルコシドなどが存在する （例えば、 生薬学雑誌、 第 32 卷、 第 194頁 （1 978) ； Te t r a h e d r o n, 14 : 649 (200 3) ； Ph y t o c h emi s t r y, 58 : 587 (2001) 等参照） 。
ゴマに含まれるピノレジノ一ル配糖体およびセサミノ一ル配糖体 （例えば、 K a t s u z a k i , H. ら、 B i o s c i . B i o t e c . B i o c h em. 56， 2087— 2088 (1992) 等参照） は、 水溶性領域で強い抗酸ィ匕性を示すの で、 脂溶性抗酸化剤 （例えば、 トコフエロール） とは異なる応用が期待されている。 また、 リグナン配糖体について以下のような作用機構が提唱されている ： リグナン 配糖体は、 抗酸化性を示す官能基であるフエノール性水酸基が自身の有する糖によ つて保護されているが、 体内へ摂取された後に、 腸内細菌の有する j3—ダルコシダ ーゼの作用によって加水分解され、 ァグリコン部分である脂溶性のリグナンが生成 される。 このァグリコンが腸内に吸収されて血液を経由して各種臓器に運ばれて、 臓器の生体膜などにおける酸化障害を防ぐ。 このような作用機構に基づいて、 リグ ナン配糖体は動脈硬化予防食品としての応用が期待されている （例えば、 T. O s aw a ： An t i c a r c i n o g e n e s i s a d r a d i a t i o n p r o t e c t i o n 2 : p. 327, P l e n m P r e s s, New Y o参照） 。
リダナン配糖体以外のリグナン派生体としてメチル化リグナンが知られている。 メチル化リグナンもリグナン配糖体同様に抗酸ィ匕性を示す官能基であるフエノール 性水酸基がメチル基によって保護されており、 それによりメ トキシ構造を有するリ グナンである。 フロフラン型のゴマリグナンの中にはピペリ トールの 4位の水酸 基がメチル化されたコブシンおょぴセサミノールの 2 '位の水酸基がメチル化され たセサンゴリンが報告されている （Py t o c h em i s t r y 47， 583— 591 (1998) ；および J. O r g. C h e m. 27， 3232— 323
5 (1 962) 参照） （図 1) 。 しかしながらこれらの合成反応を触媒する酵素 は不明であり、 フロフラン型リグナンをメチル化する酵素およびそれをコードする 遺伝子はこれまでに精製されたり単離された報告はない。
なお、 メチル基転移反応を触媒するという特定の機能を有するタンパク質は、 異 なる植物種においてもそのアミノ酸配列が類似しているということが知られている (例えば、 P l a n t C e l l 14， 505- 519 (2002) 参照） 。 発明の開示
植物の二次代謝物などの生合成経路を改変することによって、 有用な物質の生成 および Zまたは有用な植物の育種が行われている。 このような技術は、 代謝工学と 呼ばれている。 このような技術を用いれば、 任意の化合物を大量生産すること、 お よび Zまたは不要な物質の生産を抑制することが可能になる。 従って、 リグナン代 謝経路に関与する遺伝子を用いてリグナンおよびその代謝物の合成を遺伝子工学的 に行うことは、 上述したようなこれらの物質の有用性に鑑みて産業上有用である。 しかし、 リグナン、 特にゴマリダナンに代表されるフロフラン型リグナンの生合成 に関与する遺伝子に関する知見は、 前述のように限られており、 さらに、 メチル化 フロフラン型リダナンの生成を触媒するメチノレ化酵素は見出されていないので、 さ らなる遺伝子の取得が望まれていた。
本発明は、 上記状況に鑑みてなされたもので、 下記に示す、 リグナンメチル基転 移活性を有する酵素、 それをコードするポリヌクレオチド、 それを含有するべクタ 一 ·細胞 ·形質転換体などを提供する。
( 1 ) 以下の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号： 1又は 3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌ クレオチド；
(b)配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなる ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつリグナン にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及 び
(d)配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換、 挿入及ぴ Z又は付加したアミノ酸配列からなり、 かつリグナンにメ チル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド。
(2) 配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列、 または当該アミノ酸配列に対して 1又 は数個のアミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換によって修飾さ れているアミノ酸配列を有し、 かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタ ンパク質をコードする上記 (1) に記載のポリヌクレオチド。
( 3 ) 配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなる ポリヌクレオチドとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつリダナンに メチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記 （1) に記載のポリ ヌクレオチド。
( 4 ) 配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相捕的な塩基配列からなる ポリヌクレオチドに対して、 5 X S S C、 50 °Cの条件下でハイブリダイズし、 か つリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする上記 （ 1 ) に記載のポリヌクレオチド。
(5) 配列番号： 1又は 3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する上記 (1) に記載のポリヌクレオチド。
(6) 配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチドを含有する上記 （1) に記載のポリヌクレオチド。
(7) DNAである、 上記 （1) 〜 （6) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 (8) フロフラン型リグナンに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク質 をコードする上記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(9) ピノレジノール及び/又はピペリ トールに対してメチル基を転移する活性を 有するタンパク質をコードする上記 （8に記載のポリヌクレオチド。
(10) 上記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされる タンパク質。
(11) 上記 (1) 〜 （9) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するべク
(12) 上記 （11) に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
(13) 上記 （12に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、 当該宿主細胞からリ ダナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする 該タンパク質の製造方法。
(14) 上記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された植 物体 （例えば、 ゴマ、 レンギヨゥ又はアマ） もしくは当該植物体と同一の性質を有 する該植物体の子孫となる植物体、 又はそれら植物体の組織。
(15) 上記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてリグナ ンにメチル基を転移する方法。
(16) 上記 （1) 〜 （9) のいずれかに記載のポリヌクレオチドを植物体に導入 し、 発現させることによって、 産生するリグナン組成が改変された当該植物体もし くは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
(17) 上記 （1) 〜 （9) に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその 相補配列からなるポリヌクレオチド。 本発明のポリペプチド （リグナンメチル化酵素） を利用すれば、 例えば、 生物 (特に、 植物） においてリグナンおよびメチル化リグナンの量を人為的に調節する ことができるという効果を奏する。 また、 これらの組換え酵素を用いてリグナンを メチル化することによって、 インビトロおよびインビボにおいて物性 （溶解度、 動 物の吸収効率など） を改変することもできる。 また、 本発明のポリヌクレオチドを 利用することによって、 これまでに自然界において未同定であったメチル化リダナ ンを人工的に生産することも可能となる。 また、 本発明のポリペプチドを利用して 合成されるメチル化リグナンは、 新規生理機能物質の出発物質又は中間体として有 効に利用することができる。
本発明のリグナンメチル化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現さ せることによって、 ピノレジノールからモノメチル化ピノレジノールを、 および z またはピペリ トールからコプシンを人工的に生産することが可能となる。 また、 本 発明のリグナンメチルイヒ酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させる ことによつで、 リダナンとメチル化リグナンとの量を人為的に制御した植物および
Zまたは微生物を作出することができる。
また、 コブシンまたはメチルイ匕ピノレジノールを生産する植物において、 本発明 のリグナンメチル化酵素の発現を抑制することによって、 ァグリコンを遊離させて、 リグナン （特に、 ピペリ トールおよび zまたはピノレジノール） の量を増加させる こともできる。
さらに、 本発明のリグナンメチルイ匕酵素を用いれば、 新規メチルイ匕リダナンであ るモノメチノレイ匕ピノレジノールをピノレジノールから人工的に生産することができ る。 図面の簡単な説明
図 1はゴマリグナンの構造と代謝経路図である。
図 2 _ 2 Aは、 S i OMT 1および S i OMT2のゴマ (S.indicum cv. 真瀬金)器 官別の R T— P C Rによる遺伝子発現解析の結果である。 図 2— 2 Bは、 S r OM T 1 のゴマ (S.radiatum)器官別の R T— P C Rによる遺伝子発現解析の結果である。 図 3— 3 Aは、 大腸菌で発現させた S i OMT 1 とピノレジノールとの酵素反応 - 液の A280nm のクロマトグラムである。 図 3— 3 Bは、 大腸菌で発現させた S i OMT 1とピペリ トールとの酵素反応液の A280nmのクロマトグラムである。
図 4一 3Cは、 大腸菌で発現させた S i OMT2 とピノレジノールとの酵素反応 液の A280nmのクロマトグラムである。 図 4一 3Dは、 大腸菌で発現させた S i O MT2とピペリ トールとの酵素反応液の A280mnのクロマトグラムである。
図 5— 3Eは、 大腸菌で発現させた S r OMT 1 とピノレジノールとの酵素反応 液の A280nmのクロマトグラムである。 図 5— 3Fは、 大腸菌で発現させた S r O MT 1とピペリ トールとの酵素反応液の A280nmのクロマトグラムである。
図 6— 4Aは S i OMT 1 により生成されたメチル化ピノレジノールの L C一 M Sのクロマトグラムである。
図 7—4Bは S i OMT l により生成されたメチル化ピペリ トール （コブシン） の LC—MSのクロマトグラムである。
図 8は S i OMT1遺伝子の完全長プローブを用いたゲノミックサザンハイプリ ダイゼーションの結果である。
図 9— 6Aは、 標準品のカフェ酸の A280nm のクロマトグラムである。 図 9— 6 Bは、 大腸菌で発現させた S i OMT1 とカフェ酸との酵素反応液の A280nm の クロマトグラムである。 図 9一 6Cは、 大腸菌で発現させた S r OMT1 とピノレ ジノールとの酵素反応液の A280nmのクロマトグラムである。
図 10— 6Dは S i OMT1 により生成されたメチル化カフェ酸 （フェルラー 酸） の LC—MSのクロマトグラムである。 発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、 リグナン、 特に、 ピノレジノールおよび/またはピペリ トールを 主な基質にする新規メチルイヒ酵素を見出すとともに、 そのメチルイ匕酵素がピノレジ ノールをメチル化することを見出した。 これまでに、 ジメチル化ピノレジノールで あるュデスミンは同定されているがモノメチル化ピノレジノールは見出されていな い。
本発明者らは、 ゴマ種子由来の 5000クローンからなる ESTデータベースから 相同性検索によりゴマメチル化酵素様遺伝子の部分配列を探索し、 その結果 2種 類のメチル化酵素様遺伝子 （以下 S i OMTl および S i OMT2) を得た。 これ らの S i OMT遺伝子は種子において強く発現していた。 これらの完全長塩基配列 を RACE法で取得し、 大腸菌において発現させた。 得られた組換えタンパク質を セサミノールまたはピノレジノールと反応させた後、 HPLC分析、 LC一 MS分 祈、 および TOF— MSZMS分析を用いて酵素活性を測定した。 その結果、 S i OMT1がピペリ トールをメチル化しコブシンを生成する反応を触媒する活性を有 することが明らかとなった。 さらに S i OMT1 はピノレジノールをメチルイヒしモ ノメチル化ピノレジノールを生成する反応を触媒する活性を有することが明らかと なった。 このメチル化リグナンはピノレジノール派生体であるュデスミンの中間体 であると考えられる。 アフリカゴマである Sesammn radiatumから P C Rにより S i OMT1 ホモログである S r OMT1遺伝子をクローニングし、 S r OMT1 は S i OMT1と同様のメチル化活性を有することを確認した。
なお、 「リグナン」 は、 C6C3骨格を有するフエエルプロパノイド化合物 2分 子が、 主としてこれらの 8— 8， 位を介して重合 （8， 8， 一結合） した化合物で ある。 リグナンは、 植物における生体防御機構に寄与していると考えられている (Phy t o c h em i s t r y Re v. 2， 371— 390 (2, 003) 参照） 。
代表的なリグナンとしては、 ゴマに含まれる （+) —セサミン、 （+) —セサミ ノール、 （+) —セサモリン、 （+ ) —ピノレジノール、 （+) —ピペリ トールお よび (+) ーセサモリノーノレ； レンギヨゥ （F o r s y t h i a i n t e rme d i a) に含まれる （+ ) —ピノレジノール、 （一） 一アルクチゲニンおょぴ (一） 一マタイレジノーノレ； ソシマ （Da p hn e t a n g u t i c a) に含ま れる （一） 一ピノレジノールおょぴ （一） ーラリシレジノール；アマ （L i num u s i t a t i s s imum) に含まれる （+) —セコィソラリシレジノーノレなど が挙げられる。 これらのリグナンの分子構造は多様である （Wo o d R e s e a r c 90, 27— 1 10 (2, 003) 等参照） 。 （+) —ピノレジノール に代表されるゴマリダナン類は最も幅広い植物種で同定されているフロブラン型の リグナン類に分類される。 ゴマリグナンの 1つであるセサミンは、 多彩な生理活性 作用を有しており、 コレステロール代謝、 肝機能および免疫機能の改善に有効であ る （例えば、 ゴマその科学と機能性、 並木満夫編：丸善ブラネット社 （1998)'参 照） 。 セサミンをゴマ種子またはゴマの絞り粕から分離精製する方法がすでに実用 化されており （例えば、 特開 2001— 139579公報、 特開平 10— 7676 号公報等） 、 セサミンを主成分とするアルコール分解促進作用を有する肝機能改善
Z増強剤が市販されている （商品名 ：セサミン、 発売元：サントリー株式会社） 。 またセサミン以外の他のリグナン (例えば、 セサミノール、 セサモリンなど) もま た生理活性作用を有することが報告されている （例えば、 日本農芸化学会誌、 7 6 ： 805-813 (2002) 参照） 。 このように、 リダナン又はその誘導体は. 種々の生理活性を有する生理活性物質あるいはその中間体として有用である。
以下、 本発明のリグナンメチルイ匕活性を有するポリぺプチドをコードするポリヌ クレオチド、 当該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質、 およびこれらの利 用について詳述する。 '
( 1 ) ポリヌクレオチド
まず、 本努明は、 以下の（a)〜（ のいずれかに記載のポリヌクレオチドを提供す る。
(a)配列番号： 1又は 3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌ クレオチド；
(b)配列番号： 2又は 4のァミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌ クレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からなる ポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつリダナン にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及 ぴ
( 配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列において、 1 もしくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換、 揷入及び/又は付加したアミノ酸配列からなり、 かつリグナンにメ チル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有す るポリヌクレオチド。
本明細書中、 用語 「ポリヌクレオチド」 は、 「遺伝子」 、 「核酸」 または 「核酸 分子」 と交換可能に使用され、 ヌクレオチドの重合体が意図される。 本明細書中、 用語 「塩基配列」 は、 「核酸配列」 または 「ヌクレオチド配列」 と交換可能に使用 され、 デォキシリポヌクレオチド （A、 G、 Cおよび Tと省略される） の配列とし て示される。
本発明のポリヌクレオチドは、 R NA (例えば、 mR NA) の形態、 または D N Aの形態 （例えば、 c D NAまたはゲノム D NA) で存在し得る。 D NAは、 二本 鎖または一本鎖であり得る。 一本鎖 D NAまたは R NAは、 コード鎖 （センス鎖と しても知られる） であり得るか、 またはそれは、 非コード鎖 （アンチセンス鎖とし ても知られる） であり得る。
本明細書中、 用語 「オリゴヌクレオチド」 は、 ヌクレオチドが数個ないし数十個 (例えば、 2〜6 0個） 結合したものが意図され、 「ポリヌクレオチド」 と交換可 能に使用される。 オリゴヌクレオチドは、 短いものはジヌクレオチド （二量体） 、 W
トリヌクレオチド （三量体） といわれ、 長いものは 30マーまたは 100マーとい うように重合しているヌクレオチドの数で表される。 オリゴヌクレオチドは、 より 長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、 化合合成されてもよレ、。 本明細書中、 用語 「ポリヌクレオチドの一部」 は、 そのポリヌクレオチドのフラ グメントを意味し、 例えば、 少なくとも 12 n t (ヌクレオチド） 、 好ましくは約 15 n t、 そしてより好ましくは少なくとも約 20 n t、 なおより好ましくは少な くとも約 3 O n t、 そしてさらにより好ましくは少なくとも約 4 On tの長さのフ ラグメントが意図される。 「少なくとも 12 n'tの長さのフラグメント」 は、 例え ば、 配列番号 1に示される塩基配列からの 12以上の連続した塩基を含むフラグメ ントが意図される。 本明細書を参照すれば配列番号 1に示される塩基配列が提供さ れるので、 当業者は， 配列番号 1に基づく DNAフラグメントを容易に作製するこ とができる。 例えば、 '制限ェンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、 種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。 あるいは、 こ のようなフラグメントは、 合成的に作製され得る。 適切なフラグメント （オリゴヌ クレオチド) 力、、 Ap p l i e d B i o s y s t erns I n c o r p o r a t e d (AB I , 850 L i n c o l n C e n t e r D r. , F o s t e r C i t y, CA 94404) 392型シンセサイザーなどによって合成される。 本発明のポリヌクレオチドは、 リダナンメチル化活性を有するポリぺプチドをコ ードする。 そのようなポリヌクレオチドは、 典型的には、 配列番号： 1又は 3の塩 基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；あるいは配列番 号： 2又は 4のァミノ酸酉己列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを 含有するポリヌクレオチドである。 本発明の好ましいポリヌクレオチドは、 配列番 号： 1又は 3の塩基配列を有するポリヌクレオチド、 あるいは配列番号： 2又は 4 のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、 それがコードするポリペプチドがリグナンメチル 化活性を有する限り、 配列番号 1又は 3の塩基配列において 1または複数個 （例 えば、 1〜30個、 1〜20個、 1〜： L 0個、 1〜数個 （例えば、 6個） 、 1〜5 個、 1〜3個、 1〜2個など） の塩基が欠失、 挿入、 置換、 及び/または付加され た変異体であってもよい。 変異体は、 コードもしくは非コード領域、 またはその両 方において変異され得る。 コード領域における変異は、 保存的または非保存的なァ ミノ酸の欠失、 揷入、 置換、 または付加を生成し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、 リグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコ ードするポリヌクレオチドであって、 配列番号： 1または 3の塩基配列と相補的な 塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジヱントな条件下でハイプリダイズ するポリヌクレオチドを含む。
ハイプリダイゼーションは、 S amb r o o kら、 Mo l e c u l a r C 1 o n i n g, A L a b o r a t o r y Ma nu a l , 2 d E d. ， C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y (1 989) に記載されてい る方法のような周知の方法で行うことができる。 通常、 温度が高いほど、 塩濃度が 低いほどストリンジエンシーは高くなり （ハイブリダィズし難くなる） 、 より相同 なポリヌクレオチドを取得することができる。 適切なハイブリダイゼーション温度 は、 塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、 例えば、 アミノ酸 6個をコー ドする 18塩基からなる DNAフラグメントをプローブとして用いる場合、 50°C 以下の温度が好ましい。
本明細書中、 用語 「ストリンジヱントなハイプリダイゼーシヨン条件」 は、 ハイ ブリダィゼーシヨン溶液 （50%ホルムアミ ド、 5 XSSC (15 OmlV^Na C 1、 1 5 mMのクェン酸三ナトリウム） 、 5 OmMのリン酸ナトリウム （pH7. 6 ) 、 5 Xデンハート液、 10 %硫酸デキストラン、 および 20 g / 1の変性 剪断サケ精子 DNAを含む） 中にて 42°Cで一晚インキュベーションした後、 約 6 5でにて0. 1 XS SC中でフィルターを洗浄することが意図される。 ポリヌクレ ォチドの 「一部」 にハイブリダィズするポリヌクレオチドによって、 参照ポリヌク レオチドの少なくとも約 1 5ヌクレオチド (n t) 、 そしてより好ましくは少なく とも約 20n t、 さらにより好ましくは少なくとも約 3 O n t、 そしてさらにより 好ましくは約 30〜 70 n tにハイプリダイズするポリヌクレオチド （D N Aまた は RNAのいずれか） が意図される。
さらに、 本発明は、 配列番号： 1または 3の塩基配列と少なくとも 80 %同一、 より好ましくは少なくとも 85 %、 90 %、 92%、 95。 96 %、 97 %、 9 8%または 99%同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。 任意の特定の核酸分子が、 例えば、 配列番号： 1または 3に示される塩基配列に 対して、 少なくとも 80%、 85%、 90%、 92%、 95%、 96%、 97%、 98%、 または 99%同一であるか否かは、 公知のコンピュータープログラム （例 、 B e s t i i t r o g r am (W i s c o n s i n S e q u e n c e An a l y s i s P a c k a g e, Ve r s i o n 8 f o r Un i x (登 録商標) ， Ge n e t i c s C omp u t e r Gr o up, Un i v e r s i t y Re s e a r c h P a r k, 575 S c i e n c e D r i v e, Ma d i s o n, WI 5371 1) を使用して決定され得る。 B e s t f i tは、 S m i t hおよび Wa t e r ma nの局所的相同性アルゴリズムを用いて、 2つの配 列間の最も良好な相同性セグメントを見出す （Ad v a n c e s i n Ap 1 i e d Ma t h ema t i c s 2 : 482〜489 (1 981) ) 。 B e s t f i tまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、 特定の配列が、 本努明に従 う参照配列に対して、 例えば、 95%同一であるか否かを決定する場合は、 同一性 のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、 そして参照配列における ヌクレオチド数全体の 5%までの相同性におけるギャップが許容されるように、 パ ラメ一ターが設定される。
特定の実施形態では、 参照 （QUERY) 配列 （本発明に係る配列） と対象配列 との間の同一性 （全体的な配列整列ともいわれる） は、 B r u t 1 a gらのァルゴ リズム （Comp. Ap p. B i o s c i . 6 : 237〜 245 (1990) ) に 基づく FAS TDBコンピュータープログラムを使用して決定される。 ％同一性を 計算するために、 D N A配列の F A S T D B整列において使用される好ましいパラ メーターは： Ma t r i x =U n i t a r y、 k一 t u p l e = 4、 Mi s m a t c h P e n a l t y=l J o i n i n g P e n a l t y = 30s Ra n d o m i z a t i o n Gr o u p L e n g t h = 0 Cu t o f f S c o r e = l、 Ga p P e n a l t y = 5. Ga p S i z e P e n a l t y = 0. 05. Wi n d ow S i z e=500または対象塩基配列の長さ （どちらかより短い 力) である ο
また、 本宪明は、 上記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相捕配列から なる才リゴヌクレオチドを包含する。 本発明のオリゴヌクレオチドがリグナンメチ ル化ポリペプチドをコードしない場合でさえ、 当業者は、 本発明のポリヌクレオチ ドが、 ポリメラーゼ連鎖反応 （PCR) のプライマーとして本発明のポリペプチド を作製するために使用され得ることを 易に理解する。 リグナンメチル化ポリぺプ チドをコ一ドしない本発明のオリゴヌクレオチドの他の用途としては、 以下が挙げ られる ： （1) cDNAライブラリ一中のリグナンメチノレ化酵素遗伝子またはその 対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離； （2) リグナンメチノレイ匕酵素遣 伝子の正確な染色体位置を提供するための、 分裂中期染色体スプレツドへのインサ イチュハイプリダイゼーシヨン （例えば、 「F I SH」 ） （Ve rmaら， Hum a n し n r omo s ome s : A Ma nu a l o f B a s i c Te c h n i q e s , P e r g amon P r e s s, New Yo r k (1 988) に 記载される） ；および （3) 特定の組織におけるリグナンメチル化酵素 mRN A発 現を検出するためのノーザンブロット分析。
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、 アンチセンス RNAメ 力ニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。 アン チセンス RN A技術によって、 内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察さ れる。 本発明のオリゴヌクレオチドを導入することによって、 リグナンメチル化活 性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、 その結果、 植物中のメチルイ匕リグナ ン含量または含量比を制御 （増加または減少） させることができる。 本発明のポリ ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、 非翻訳領域 （UTR) の配列やべクタ 一配列 （発現ベクター配列を含む） などの配列を含むものであってもよい。
本努明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、 本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む DN A断片を単離する 種々の公知の方法が挙げられる。 例えば、 本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の —部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、 ゲノム DNAライブラリ —または cDNAライブラリーをスクリーニングすれば、 本発明のポリヌクレオチ ドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。 このようなプローブとして は、 本発明のポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に 特異的にハイブリダィズするポリヌクレオチド （オリゴヌクレオチド） であればよ い。 このようなハイプリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとして は、 天然のポリヌクレオチド （例えば、 ゴマ科植物やコケ科植物などの植物由来の ポリヌクレオチド） が挙げられるが、 植物以外に由来するポリヌクレオチドであつ てもよい。
本発明のポ'リヌクレオチドを取得する別の方法として、 P C Rを用いる方法が挙 げられる。 この P C R増幅方法は、 例えば、 本発明のポリヌクレオチドの c D NA の 5， 側および/または 3 ' 側の配列 （またはその相捕配列） を利用してプライマ 一を調製する工程、 これらのプライマーを用いてゲノム D NA (または c D NA) 等をテンプレートにして P C R増幅する工程を包含することを特徴としており、 本 方法を使用すれば、 本発明のポリヌクレオチドを含む D N A断片を大量に取得する ことができる。
本発明のポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、 特に限定されない 力 ピペリ トールまたはピノレジノールを含む生物材料であることが好ましい。 本 明細書中、 用語 「生物材料」 は、 生物学的サンプル （生物体から得られた組織サン プルまたは細胞サンプル） が意図される。 後述する実施例においては、 ゴマを用い ているが、 これに限定されない。
本発明のポリヌクレオチドを使用すれば、 形質転換体または細胞においてリダナ ンメチル化活性を有するポリぺプチドを合成することができる。 本発明のポリヌク レオチドを用いれば、 ハイブリダイズするボリヌクレオチドを検出することによつ て、 リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出する ことができる。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 リグナンメチル化活性を有するポリぺプチドを コードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーシヨンプローブまたは当 該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、 リ ダナンメチル化活性を有するポリべプチドを発現する生物または組織を容易に検出 することができる。 なおさらに、 上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌ クレオチドとして使用して、 上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるリグ ナンメチル化活性を有するポリぺプチドの発現を抑制することができる。 ( 2 ) ポリペプチド
本発明は、 上記した本発明のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質 （ポリ ペプチド） をも提供する。 そのようなポリペプチドは、 典型的には、 配列番号： 2 又は 4のァミノ酸配列からなるタンパク質である。
本明細書中、 用語 「ポリペプチド」 は、 「ペプチド」 または 「タンパク質」 と交 換可能に使用される。 また、 ポリペプチドの 「フラグメント」 は、 当該ポリべプチ ドの部分断片が意図される。 本発明のポリペプチドはまた、 天然供給源より単離さ れても、 化学合成されてもよい。
本発明のポリペプチドは、 天然の精製産物、 化学合成手順の産物'、 および原核生 物宿主または真核生物宿主 （例えば、 細菌細胞、 酵母細胞、 高等植物細胞、 昆虫細 胞、 および哺乳動物細胞を含む） 力 ら組換え技術によって産生された産物を含む。 糸且換え産生手順において用いられる宿主に依存して、 本発明のポリペプチドは、 グ リコシル化され得るか、 または非グリコシル化され得る。 さ ¾に、 本発明のポリべ プチドはまた、 いくつかの場合、 宿主媒介プロセスの結果として、 開始の改変メチ ォニン残基を含み得る。
また、 本発明は、 リグナンメチル化活性を有するポリペプチドを提供する。 本明 細書中、 「リグナンメチルイ匕活性」 は、 リグナンをメチルイ匕する活性、 すなわち、 リグナンにメチル基を転移する活性が意図される。 すなわち.、 本明細書中、 「メチ ル化酵素」 と 「メチル基転移酵素」 とは、 相互交換可能に使用される。 「リグナン メチル化活性」 は、 メチル基供与体である SAMと基質であるリグナンとをリグナ ンメチルイヒ酵素と反応させ、 その反応生成物を HPLCまたは LC-MS分析するこ とで測定又は確認することができる。 一般的なメチルイヒ酵素活性測定法は公知文献 に記載のとおりである （公知文献： To uin, V., et al. (2003) Plant Mol. Biol. 52， 495-509.,Gang, D. R., et al. (2002) Plant Cell 14, 505-519,)。
また、 本発明のポリペプチドは、 配列番号： 2または 4 のアミノ酸配列からな るポリペプチドの変異体であって、 かつリグナンメチル化活性を有するポリぺプチ ドを含む。
このような変異体は、 配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列において、 1 もしくは 複数個 （例えば、 1〜3 0個、 1〜2 0個、 1〜1 0個、 1〜数個 （6個） 、 1〜 3個、 1〜 2個など） のアミノ酸 （アミノ酸残基） が欠失、 置換、 挿入及び Z又は 付加したアミノ酸配列からなり、 かつリグナンにメチル基を転移する活性を有する タンパク質を含む。 「欠失、 置換、 揷入及び 又は付加」 には、 逆転、 反復、 およ ぴタイプ置換 （例えば、 親水性の残基の別の残基への置換、 しかし通常は強く親水 性の残基を強く疎水性の残基には置換しない） が含まれる。 特に、 ポリペプチドに おける 「中性」 アミノ酸置換は、 一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響 しない。
ポリぺプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、 このポリぺプチドの構 造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、 当該分野にお いて周知である。 さらに、 人為的に改変させるだけではく、 天然のタンパク質にお いて、 当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在するこ ともまた周知である。
当業者は、 周知技術を使用してポリぺプチドのァミノ酸配列において 1または数 個のアミノ酸を容易に変異させることができる。 例えば、 公知の点変異導入法に従 えば、 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させること ができる。 また、 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応 するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。 さらに、 本明細書中に記載される方法を用いれば、 作製した変異体が所望の活性を 有するか否かを容易に決定し得る。
好ましい変異体は、 保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、 欠失、 または添加を 有する。 好ましくは、 サイレント置換、 添加、 および欠失であり、 特に好ましくは、 保存性置換である。 これらは、 本発明のポリペプチド活性を変化させない。
代表的に保存性置換と見られるのは、 脂肪族アミノ酸 A 1 a、 V a 1 、 L e u . および I 1 eの中での 1つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換； ヒドロキシル残基 S e rおよび T h rの交換、 酸性残基 A s pおよび G 1 uの交換、 了ミド残基 A s nおよび G 1 nの間の置換、 塩基性残基 L y sおよび A r gの交換、 ならびに芳香 族残基 P h e、 T y rの間の置換である。
上記に詳細に示されるように、 どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントであ りそうか （すなわち、 機能に対して有意に有害な効果を有しそうにない力） に関す るさらなるガイダンスは、 B o w 1 e , j . J". り 「 D e c i p h e r i n g t h e Me s s a g e i n P r o t e i n S e q u e n c e s ■ T o 1 e r a n c e t o Am i n o Ac i d Sub s t i t u t i o n s」 ， S c i e n c e 247 ： 1 306-1310 ( 1 990 ) に記載されている。 このような変異ポリペプチドは、 上述したように、 公知の変異ポリペプチド作製 法により人為的に導入された変異を有するポリべプチドに限定されるものではなく、 天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
本発明のポリぺプチドは、 ァミノ酸がぺプチド結合しているポリぺプチドであれ ばよいが、 これに限定されるものではなく、 ポリペプチド以外の構造を含む複合ポ リペプチドであってもよい。 本明細書中で使用される場合、 「ポリペプチド以外の 構造」 としては、 糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、 特に限定さ れない。
また、 本発明のポリペプチドは、 付加的なポリペプチドを含むものであってもよ レヽ。 付カ[1的なポリペプチドとしては、 例えば、 H i sや My c、 F 1 a g等のェピ トープ標識ポリペプチドが挙げられる。
また、 本宪明のポリペプチドは、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ ォチドを宿主細胞に導入して、 そのポリぺプチドを細胞内発現させた状態であって もよいし、 細胞、 組織などから単離精製されてもよい。
本発明のポリペプチドは、 下記で詳述されるように組換え生成されても、 化学合 成されてもよい （例えば、 Ho u g h t e n, R. A. ， P r o c. Na t l . A c a d. S c i . USA 82 : 5131— 5135 (1985) ；米国特許第 4， 631， 21 1号等参照） 。
本発明のポリペプチドは、 リグナン （特に、 ピノレジノールまたはピペリ トー ル） のメチルイ匕反応を触媒することができる。
( 3 ) 本発明のポリぺプチドまたはポリヌクレオチドの利用
本発明はさらに、 本発明のポリべプチドまたはポリヌクレオチドを用いることに よって生物 （好ましくは、 植物） 中のリグナンおよびメチル化リグナンの量を制御 (増加または減少） するための方法および当該制御された生物 （好ましくは、 植 物） を提供する
(A) ベクター
本発明は、 リグナンメチル化活性を有するポリべプチドを生成するために使用さ れるベクターを提供する。 本発明のベクターは、 インビトロ翻訳に用いるベクタ^" であっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
本発明のベクターは、 上述した本発明のポリヌクレオチドを含むものであれば、 特に限定されない。 例えば、 リダナンメチル化活性を有するポリべプチドをコ一ド するポリヌクレオチドの c D NAが揷入された組換え発現ベクターなどが挙げられ る。 組換え発現ベクターの作製方法としては、 プラスミ ド、 ファージ、 またはコス ミ ドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、 宿主細胞中で発現可能なベクターが 適宜選択され得る。 すなわち、 宿主細胞の種類に応じて、 確実に本発明のポリヌク レオチドを発現させるために適宜プロモータ一配列を選択し、 これと本発明のポリ ヌクレオチドを各種プラスミ ド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用い ればよい。
本発明の発現ベクターは、 導入されるべき宿主の種類に依存して、 発現制御領域 (例えば、 プロモーター、 ターミネータ一、 および/または複製起点等） を含有す る。 細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、 †貫用的なプロモーター （例えば. t r cプロモーター、 t a 。プロモーター、 1 a cプロモーター等） が使用され、 酵母用プロモーターとしては、 例えば、 ダリセルアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナ ーゼプロモーター、 P H 0 5プロモーター等が挙げられ、 糸状菌用プロモーターと しては、 例えば、 アミラーゼ、 t r p C等が挙げられる。 また動物細胞宿主用プロ モーターとしては、 ウィルス性プロモーター （例えば、 s V 4 0初期プロモーター. S V 4 0後期プロモーター等） が挙げられる。 植物体の形質転換に用いられる組换 え発現ベクターは、 当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可 能なベクターであれば特に限定されない。 このようなベクターとしては、 例えば、 植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター （例えば、 カリ フラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター) を有するベクター、 または外的 な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクタ が挙げられる。 発現ベクターの作製は、 制限酵素および/またはリガーゼ等を用いる慣用的な手 法に従って行うことができる。 発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、 慣用的 な手法に従つて行うことができる。
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、 培養、 栽培または飼育した後、 培養物等から慣用的な手法 （例えば、 濾過、 遠心分離、 細胞の破碎、 ゲル濾過クロ マトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー等） に従えば、 目的タンパク質を 回収、 精製することができる。
発現ベクターは、 少なくとも 1つの選択マーカーを含むことが好ましい。 このよ うなマーカーとしては、 真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ遣 伝子またはネオマイシン耐性遺伝子、 および E. c o l iおよび他の細菌における 培養についてはテトラサイタリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げ られる。
上記選択マーカーを用いれば、 本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入され たか否か、 さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができ る。 あるいは、 本発明のポリペプチドを融合ポリペプチド （例えば、 GFPとの融 合ポリペプチド） として発現させ、 GFPの蛍光をマーカーとして用いてもよい。
(B) 形質転換体または細胞
本宪明は、 上述したリグナンメチル化活性を有するポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。 本明細書中、 用語 「形質転換体」 は、 組織または器官だけでなく、 生物個体を含むことが意図される。 形質転換体または細胞の作製方法 （生産方法） は特に限定されないが、 例えば、 上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。 ここで 用いられる宿主細胞は、 特に限定されるものではなく、 従来公知の各種細胞を好適 に用いることができる。 具体的には、 例えば、 大腸菌 （E s c h e r i c h i a c o 1 i ) 等の細菌、 酵母 （出芽酵母 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s l a e、 分裂酵母 S c h i z o s a c c h a r omy c e s p omb e) 、 線 虫 （C a e n o r h a b d i t i s e 1 e g a n s ) アフリカッメガエノレ （X e n o p u s 1 a e v i s ) の卵母細胞等を挙げることができる。 上記の宿主細 胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。 また、 形質転換の対 象となる生物も特に限定されるもので.はなく、 上記宿主細胞で例示した各種微生物、 植物または動物が挙げられる。
本発明の形質転換体または細胞は、 これらの形質転換体または細胞が天然に有す るリグナンぉょぴノまたはメチル化リダナンの糸且成が改変されていることを特@ [と する。 本発明の形質転換体または細胞は、 植物もしくはその子孫、 またはこれら由 来の組織であることが好ましく、 ゴマ、 レンギヨゥまたはアマであることが特に好 ましい。 このような形質転換体または細胞は、 本発明のメチル化リダナン含有量を 制御する方法を用いることによって、 リグナンを産生する生物中のメチルイヒリグナ ンの含有量を増加または減少させることができる。
本発明の形質転換体は、 植物形質転換体であり得る。 本実施形態の植物形質転換 体は、 本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、 当該ポリヌクレオチド によってコードされるポリべプチドが発現され得るように植物中に導入することに よって取得される。
組換え発現ベクターを用いる場合、 植物体の形質転換に用いられる組換え発現べ クタ一は、 当該植物内で本発明のポリヌクレオチドを発現させることが可能なベタ ターであれば特に限定されない。 このようなベクターとしては、 例えば、 植物細胞 内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター （例えば、 カリフラワー モザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター） を有するベクター、 または外的な刺激に よって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、 植物体全体、 植物器官 （例えば葉、 花弁、 茎、 根、 種子など） 、 植物組織 （例えば表皮、 師部、 柔組織、 木部、 維管束、 柵状組織、 海綿状組織など） または植物培養細胞、 あるいは種々の形態の植物細胞-' (例えば、 懸濁培養細胞） 、 プロトプラスト、 葉の切片、 カルスなどのいずれをも 意味する。 形質転換に用いられる植物としては、 特に限定されず、 単子葉植物綱ま たは双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
植物への遺伝子の導入には、 当業者に公知の形質転換方法 （例えば、 ァグロバタ テリゥム法、 遺伝子銃、 P E G法、 エレクト口ポレーシヨン法など） が用いられる。 例えば、 ァグロパクテリゥムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知で ある。'ァグロパクテリゥム法を用いる場合は、 構築した植物用発現ベクターを適当 なァグロパクテリゥム （例えば、 ァグロパクテリゥム .チュメファシエンス （Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s に導入し、 この株をリーフ ディスク法 （内宮博文著、 植物遺伝子操作マニュアル （1 990) 27〜31頁、 講談社サイエンティフィック、 東京） などに従って無菌培養葉片に感染させ、 形質 転^ f 物を得ることができる。 また、 Na g e 1らの方法 （Mi c r i b i o 1. L e t t. 、 67、 325 (1 990) ) が用いられ得る。 この方法は、 まず、 例 えば発現ベクターをァグロパクテリゥムに導入し、 次いで、 形質転換されたァグロ ノ クテリゥムを P l a n tMo l e c u l a r B i o l o g y Ma nu a l (S. B. Ge l v i nり、 Ac a d em i c P r e s s Pu l i s h e r s) に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。 ここで、 「植 物組織」 とは、 植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。 ァグロバクテリウ ム法を用いて形質転換を行う場合には、 バイナリーベクター （pB I 121または p PZP 202など） を使用することができる。
また、 遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、 エレクト 口ポレーシヨン法、 遺伝子銃法が知られている。 遺伝子銃を用いる場合は、 植物体、 植物器官、 植物組織自体をそのまま使用してもよく、 切片を調製した後に使用して もよく、 プロトプラストを調製して使用してもよい。 このように調製した試料を遣 伝子導入装置 （例えば PDS— 1000 (B I O— RAD社） など） を用いて処理 することができる。 処理条件は植物または試料によって異なるが、 通常は 450〜 2000 p s i程度の圧力、 4〜 12 c m程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、 まずハイグロマイシン耐性などの薬 剤耐性で選択され、 次いで定法によって植物体に再生される。 形質転換細胞から植 物体の再生は、 植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能であ る。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、 形質転換は、 組換えベクターを遺伝子 銃、 エレクト口ポレーション法などで培養細胞に導入する。 形質転換の結果得られ るカルスやシュート、 毛状根などは、 そのまま細胞培養、 組織培養または器官培養 に用いることが可能であり、 また従来知られている植物組織培養法を用い、 適当な 濃度の植物ホルモン （オーキシン、 サイトカイニン、 ジベレリン、 アブシジン酸、 エチレン、 ブラシノライドなど） の投与などによって植物体に再生させることがで さる。
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、 PCR法、 サザンハイブリダィゼー ション法、 ノ一ザンハイプリダイゼーション法などによって行うことができる。 例 えば、 形質転^ It物から DN Aを調製し、 DN A特異的プライマーを設計して PC Rを行う。
本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転^ if物体が一旦取得 されれば、 当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。 また、 当該植物体またはその子孫、 あるいはこれらのクローンから、 例えば、 種子、 果実、 切穂、 塊茎、 塊根、 株、 カルス、 プロトプラストなどを得て、 それらを基に 当該植物体を量産することができる。 したがって、 本発明には、 本発明のポリヌク レオチドが発現可能に導入された植物体、 もしくは、 当該植物体と同一の性質を有 する当該植物体の子孫、 またはこれら由来の糸且織も含まれる。
また、 種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。 本発明の形質転 換体植物としては、 例えば、 ゴマ、 イネ、 タバコ、 ォォムギ、 コムギ、 ナタネ、 ポ テト、 トマト、 ポプラ、 バナナ、 ユーカリ、 サツマィモ、 タイズ、 アルフアルファ、 ノレ一ピン、 トゥモロコシ、 力リフラワー、 バラ、 キク、 カーネーション、 キンギヨ ソゥ、 シクラメン、 ラン、 トルコギキヨウ、 フリージア、 ガーベラ、 グラジオラス、 カスミソゥ、 カランコェ、 ユリ、 ペラノレゴニゥム、 ゼラニゥム、 ペチュニア、 トレ ユア、 チューリップ、 レンギヨゥ、 シロイヌナズナ、 アマ、 およびミヤコグサなど が挙げられるがこれらに限定されない。
好ましい実施形態において、 ゴマを使用して、 本発明の形質転換体を作製するこ とができる。 ゴマの形質転換体の作製方法としては、 例えば、 T. As am i z u : T r a n s f o rma t i on o f s e s ame l a n t s u s i n g MA T v e c t o r s y s t em : i n t r o d u c t i o n o f f a t t y a c i d d e s a t u r a s e g e n e s. S e s ame N e w s 1 e t t e r 16 : 22〜 25 (2002) に記載されるような公知の方法 が挙げられる。
このようにして得た形質転換ゴマを用いれば、 当該ゴマ内でメチル化リダナンを 生産するため、 低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでメチル化リグナン （ピ ペリ トール、 および/またはピノレジノール） を生産することができる。
他の好ましい実施形態において、 本発明の形質転換体として、 タパコを好適に用 いることができる。 タバコは、 ペチュニアなどとともに、 形質転換が容易な代表的 植物であり、 細胞壁を取り除いた細胞の 1個 （プロトプラスト） から、 植物 1個体 への再生が可能である。 この再生された植物 1個体は、 多細胞に由来する 1個体と は異なりキメラ状に陥らないため、 形質転換体の作製を効率よく行うことができる。 タバコの形質転換に好ましい方法としては、 リーフディスク法が挙げられる。 こ の方法は、 操作が容易であり、 かつ 1枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換 体を得ることができる方法である。 形質転換の方法はたとえば 「新生物化学実験の 手引き 3 核酸の分離 ·分析と遺伝子実験法 化学同人 1 9 9 6年」 に記載され ている。
このようにして得た形質転換タバコを用いれば、 低コストかつ環境に低負荷な生 産プロセスでリグナンメチル化酵素を生産することができる。
別の好ましい実施形態において、 本発明の形質転換体として、 イネを好適に用い ることもできる。 形質転換イネを用いれば、 当該イネ内で低コストかつ環境に低負 荷な生産プロセスでリダナンメチル化酵素を生産することができる。
本発明の形質転換体は、 リグナン （特に、 ピノレジノールまたはピペリ トール） を含む生物であれば、 生物種を問わず、 上記ポリヌクレオチドを導入することで当 該メチル化リグナンを生産することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現べクタ一 が導入された形質転換体を用いれば、 植物などの生物に内在するリグナンをメチル 化する反応を触媒することができるので.、 低コストかつ環境に対して低負荷な生産 プロセスでメチル化リグナンの大量調製が可能になる。 さらに本発明は、 メチル化 リダナンを大量調製することによつて安価な食品または工業製品を提供することが できる。
本発明の形質転換体を用いれば、 リグナンメチル化反応を触媒するポリぺプチド を低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
一実施形態において、 本発明に係る細胞は、 種々の細菌宿主であり得る。 本実施 形態に係る細胞は、 本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、 当該 ポリヌクレオチドによってコードされるポリぺプチドが発現され得るように細胞中 に導入することによって取得される。
当業者は、 本明細書中の記載に従えば、 リグナンメチル化活性を有するポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、 細 菌から高等植物までの広範な生物にリグナンメチノレ化能を付与することができると いうことを容易に理解する。
本発明の細胞は、 リグナン （特に、 ピノレジノールまたはピペリ トール） を含む 生物であれば、 生物種を問わず、 上記ポリヌクレオチドを導入することで当該メチ ノレ化リグナンを生産することができる。
本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター が導入された細胞を用いれば、 当該細胞内でリダナンメチル化反応を触媒すること ができるので、 低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでメチルイ匕リグナ ンの大量調製が可能になる。 さらに本発明は、 メチルイ匕リグナンを大量調製するこ とによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
本発明に係る細胞を用いれば、 リダナンメチルイ匕反応を触媒するポリぺプチドを 低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
(C) ポリペプチドの生産方法
本発明は、 本発明のポリペプチドを生産する方法を提供する。 本発明のポリぺプ チドの生産方法を用いれば、 リダナンメチル化反応を触媒するポリべプチドを低コ ストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。 また、 本発明 のポリぺプチドの生産方法を用いれば、 リグナンメチル化反応を触媒するポリぺプ チドを容易に生産することが可能となる。
本発明のポリぺプチドの生産方法では、 本発明のポリぺプチドをコ一ドするポリ ヌクレオチドを含むベクターを用いることができる。
本発明のポリぺプチドの生産方法は、 上記べクターを無細胞タンパク質合成系に 用いることが好ましい。 無細胞タンパク質合成系を用いる場合、 種々の市販のキッ トを用いればよい。 好ましくは、 本実施形態のポリペプチドの生産方法は、 上記べ クタ一と無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
また、 本実施形態のポリペプチドの生産方法は、 耝換え発現系を用いることもで きる。 組換え発現系を用いる場合、 本発明のポリヌクレオチドを組換え発現べクタ 一に組み込んだ後、 公知の方法により発現可能に宿主に導入し、 宿主内で翻訳され て得られる上記ポリぺプチドを精製するという方法などを採用することができる。 糸且換え発現ベクターは、 プラスミドであってもなくてもよく、 宿主に目的ポリヌク レオチドを導入することができればよい。 好ましくは、 本実施形態のポリペプチド の生産方法は、 上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
宿主としては、 原核生物または真核生物を用いることができる。 原核生物宿主と しては、 例えば、 E s c h e r i c h i a属に属する細菌 （例えば、 大腸菌 （E s c h e r i c h i a c o 1 i ) など） 、 例えば、 B a c i l l u s属に属する細 菌 （例えば、 B a c i l l u s s ub t i l i sなどを用いることができる。 真 核生物宿主としては、 下等真核生物 （例えば、 酵母または糸状菌などの真核生物微 生物） を用いることができる。 酵母としては、 S a c c h a r omy c e s属微生 物 (例えば、 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a eなど) 力 S挙げら れ、 糸状菌としては、 As p e r g i l l u s属微生物 （例えば、 A s p e r g i 1 1 u s o r y z a e、 As p e r g i 1 1 u s n i g e rなど) 、 P e n i c i 1 1 i um属微生物が挙げられる。 また、 動物細胞または植物細胞が宿主とし て使用され得る。 動物細胞としては、 マウス、 ハムスター、 サル、 ヒト等の細胞が 挙げられる。 さらに、 昆虫細胞 （例えば、 カイコ細胞、 またはカイコの成虫） もま た宿主として使用され得る。
上記の宿主細胞は、 特に限定されるものではなく、 従来公知の各種細胞を好適に 用いることができる。 具体的には、 例えば、 大腸菌 （E s c h e r i c h i a c o 1 i) 等の細菌、 酵母 （出芽酵母 S a c c h a r omy c e s c e r e v i s i a e、 力、裂酵母 S c i z o s a c c h a r omy c e s p o m b e ) 、 線虫 (C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s) 、 アフリカッメガエノレ （X e n o p u s l a e v i s) の卵母細胞等を挙げることができるが、 特に限定され ない。 上記の宿主細胞のための適切な培養培地およぴ条件は当分野で周知である。 このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、 発現ベクターは、 外来 ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであ ることが好ましい。 組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、 用いた 宿主、 ポリペプチドの性質によって異なるが、 タグの利用等によって比較的容易に 目的のポリぺプチドを精製することが可能である。
本実施形態に係るポリぺプチドの生産方法は、 本努明のポリべプチドを含む細胞 または組織の抽出液から当該ポリぺプチドを精製する工程をさらに包含することが 好ましい。 ポリペプチドを精製する工程は、 周知の方法.（例えば、 細胞または組織 を破壌した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法） で細胞や組織から細胞抽 出液を調製した後、 この細胞抽出液から周知の方法 （例えば、 硫安沈殿またはエタ ノール沈殿、 酸抽出、 陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、 ホスホセ ルロースクロマトグラフィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、 およびレクチ ンクロマトグラフィー） によって精製する工程が好ましいが、 これらに限定されな レ、。 最も好ましくは、 高速液体クロマトグラフィー （ 「HPLC」 ） が精製のため に用いられる。
本発明のポリぺプチドは、 本発明のポリぺプチドを天然に発現する細胞または組 織から当該ポリペプチドを精製することもできるし、 化学合成によつて調製するこ ともできる。
変異ポリペプチドを作製する方法についても、 特に限定されない。 例えば、 部位- 特異的変異誘発法 （例えば、 Ha s h imo t o— Go t oh, Ge n e 152, 271 -275 (1995) 参照） 、 P C R法を利用して塩基配列に点変異を導入 し変異ポリぺプチドを作製する方法、 またはトランスポゾンの揷入による突然変異 株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、 変異ポリぺ プチドを作製することができる。 変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用 してもよい。
このように、 本発明のポリペプチドの生産方法は、 少なくとも、 リグナンメチル 化活性を有するポリぺプチドのァミノ酸配列、 またはリダナンメチル化活性を有す W 200
るポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術 を用いればよいといえる。
(D) メチル化リグナン生産方法
これまで、 リグナンおょぴメチル化リグナンの生産はゴマからの抽出により行わ れているので、 大量生産ができない等の問題点を有していたが、 本発明に従えば、 リグナンおよぴメチル化リダナンを低コストで大量生産できる。
本発明は、 本発明のポリぺプチドを発現する生物体または細胞を用いてメチル化 リグナンを生産する方法を提供する。 上記生物体は、 天然の未改変生物体であって も組換え発現系を用いた形質転換体であってもよレ、。 本発明のメチル化リグナン生 産方法は、 リグナン （特に、 ピノレジノーノレまたはピペリ トール） を効率よく生産 することができる。
一実施形態において、 本発明のメチル化リグナン生産方法は、 本発明のポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用い てメチルイヒリダナンを生産することを特徴とする。 好ましくは、 上記生物体は、 上 述した形質転換体植物または細菌であり、 特に好ましくは、 大腸菌、 ゴマ、 レンギ ョゥまたはアマである。
本発明のメチル化リダナン生産方法は、 本発明のポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。 ポリヌクレオチドを上記生 物体に導入する工程としては、 上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。 本 実施形態のこの局面において、 上記生物体は形質転換される前に産生したメチル化 リグナンと形質転換後に産生するメチルイ匕リダナンとの間でその組成が異なる。 具 体的には、 上記生物体から得られるリグナンおよぴメチルイヒリダナンは、 その含有 率が増加する。 本実施形態のこの局面に係るメチル化リグナン生産方法は、 上記生 物体からメチル化リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。 また、 本発明のメチル化リダナン生産方法は、 本発明のポリぺプチドを天然に発 現する生物体に、 本発明のオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチド として導入する工程を包含する。 オリゴヌクレオチドを上記生物体に導入する工程 としては、 上述したアンチセンス RNA技術を用いればよい。 本実施形態に係るメ チル化リグナン生産方法は、 上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発 明のポリペプチドを天然に発現する生物体を同定する工程をさらに包含することが 好ましい。 本実施形態のこの局面に係るメチル化リグナン生産方法は、 上記生物体 からメチルイ匕リグナンを抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
本実施形態において、 上記生物体は上記オリゴヌクレオチドを導入される前に産 生したメチル化リグナンと導入後に産生するメチル化リグナンとの間でその組成が 異なる。 具体的には、 上記生物体から得られるリグナンおよびメチル化リグナンは、 その含有率が減少する。
(E) 食品および工業製品
本発明は、 上述のメチル化リグナン生産方法により得られたメチル化リグナンを 用いて製造される食品および工業製品を提供する。 本項で記載する食品は、 上述し た形質転換植物体の種子、 果実、 切穂、 塊茎、 および Zまたは塊根であっても、 上 述した形質転換植物体から抽出されたメチル化リダナンを用いて製造された食品 (例えば、 ゴマ、 レンギヨゥまたはアマ、 あるいはこれらの加工食品） であっても よい。 本発明に係る食品または工業製品は、 所望する量のリグナン （特に、 ピノレ ジノールまたはピペリ トール） を含有することができる。
例えば、 上述のようにメチル化リダナンの含量が増加した本発明の形質転換植物 力 ら抽出されたメチルイ匕リグナン抽出液は、 メチル化リグナンの含量が高い食品と して提供される。 また、 抽出したメチルイ匕リグナンに限らず、 上記形質転換植物体 の種子、 果実、 切穂、 塊茎、 および/または塊根等もまた、 メチル化リグナンを多 く含む食品として提供される。 メチルイ匕リグナン糸且成を改変する対象は特に限定さ れるものではなく、 植物以外にも動物、 細菌、 または酵母等のあらゆる生物を対象 とすることが可能である。
また、 リグナンおよぴメチルイヒリダナンの独特な物性に基づいて、 本発明のポリ ペプチドまたはポリヌクレオチドは、 工業製品 （例えば、 フィルム、 生分解性ブラ スティック、 機能性繊維、 潤滑油、 または洗剤のような工業製品） の原料に利用さ れ得る。
本明細書において、 ゴマのリグナンメチルイヒポリべプチドを一例として記載され ているが、 本発明は、 ゴマ由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドにのみ限定 されるべきではなく、 リグナンメチル化活性を有する全てのポリペプチド、 および その利用に関するものであることが、 当業者には明白である。 リグナンメチル化酵 素は、 植物、 動物または微生物のいずれ由来でもよく、 リグナンメチル化酵素活性 を有していればリグナン量を制御することができる。 さらに本発明は、 リグナンメ チル化酵素をコードするポリヌクレオチドを導入することによって作製されたリグ ナン量が調節された植物、 その子孫またはこれらの組織に関し、 その形態は切り花 であってもよい。 本発明のリグナンメチルイヒポリペプチドを用いれば、 メチル化リ ダナンの生成を促進または抑制することができる。 また、 慣用的な手法を用いれば、 植物に上記ポリヌクレオチドを導入して当該ポリヌクレオチドを構成的あるいは組 織特異的に発現させて、 目的のポリペプチドの発現を増加させること、 ならびに、 アンチセンス法、 同時サプレツション法および RNA i法などを用いることによつ て目的のポリペプチドの発現を抑制することができるということを、 当業者は容易 に理解する。 実 施 例
本発明は、 以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、 これに限定される べきではない。
実施例において用いる分子生物学的手法は、 他で詳述しない限り、 国際公開 WO 2004/018682号公報 （PCTZJ P03Z10500) または Mo 1 e c u 1 a r C l o n i g (S amb r o o kら、 Co l d S p r i n g H a r b o u r La b o r a t o r y P r e s s, 1989) に記載の方法に従 つ 1。 〔実施例 1 ： ゴマ種子の EST解析〕
公知文献 （国際公開公報 WO 2005/030944) に記載のゴマ種子由来の c DNAフ ァージライブラリ一を Rapid Excisionキット （Stratagene社） を用いて製造業者 が推奨する方法に従って pBK-CMVファージミド (Stratagene社)に切り出し、 大 腸菌に感染させた。 このゴマ種子由来 E S Tを含む大腸菌コロニーをランダムに 5000 クローンをピックアップし、 M13RVプライマー （配列番号 5) および M4 (-20) プライマー （配列番号 6) を用いて以下の条件でコロニー P CRを行った。 1 XE x-T a q b u f f e r (T a k a R a) 0. 2 mM dNTP s、 プ ライマー各 0. 2 p m o I / μ 1 ^ E x— T a q p o l yme r a s e 1. 2 5Uからなる混合液に大腸菌コロニーをけん濁し、 94°Cで 5分間の後、 94°Cで 1分間、 5 5でで 1分間、 7 2 °Cで 2分間の反応を 3 0サイクノレ行って P C R增 幅した後、 7 2°Cで 7分間保持した。 配列番号 5： M13RV ： 5'-CAGGAAACAGCATTGAC
配列番号 6： M4-20： 5'-GTAAAACGACGGCCAGT これらの; P CR産物をァガロースゲル電気泳動に供し、 p BK— CMVに含まれ る E S Tが特異的に増幅されていることをェチジゥムブ口マイド染色により確認し た。 これら 5000種の P CR産物 4 μ 1を lOunitの Exonucleasel (US B社） と 2unitの Shrimp Alkaline phosphatase (U S B社） と混合し、 37°Cで 30分保持 し、 80°Cで 20分保持し酵素反応を終了させた。 この酵素反応液 1 1を用いて以 下の条件でダイレクトシークェンス反応を行った。 シークェンス反応液は酵素反応 液 1μ 1、 5x B l g Dy e S e q u e n c i n g B u f f e r ver.3.1 (A p 1 i e d B i o s y s t e m s ) 3μ 1、 B i g D y e S e q u e n c i n g RR ver.3.1 (A p p l i e d B i o s y s t e m s ) 2μ 1、 1.6 mol/μ 1 M13R Vプライマー 1μ 1、 滅菌水 13μ 1からなる。 シークェンス反応は 96°C1分間に 続いて 96°C10秒間、 50°C5秒間、 60°C4分間の反応を 25サイクル行った。 シー クエンス反応液は D y e E X 9 6 (QIAGEN社)を用いて業奢が推奨する方法で生 成し、 S e q u e n c e r mo d e l 3 1 0 0 (Ap p l i e d B i o s y s t e m s社） を用いて塩基配列を決定した。
得られた 5000種の塩基配列は B l a s t xを用いて相同検索を行い、 その中か らメチル化酵素遺伝子と相同性を有する 2種類のゴマメチル化酵素 (Sesamum indicum O-methyltransferase; 以下 SiOMT)の部分配列を同定した。 B l a s t X解析の条件は以下のとおりである。 プログラム： B 1 a s t X v e r . 2. 2. W
9、 データベース ： n r、 遺伝コード： s t a n d a r d (1) 、 フイノレタ ： LO W c omp l e x i t y Ex p e c t ： 10 Wo r d s i z e : 3、 マト リクス ： B LOSUM62、 G a p C o s t s : Ex i s t e n c e 1 1、 E x t e n s i o n 1。
〔実施例 2： ゴマメチル化酵素遺伝子の発現解析〕
EST解析により得られた二種類の S i OMT1および S i OMT2 の遺伝子発現 パターンを解析するために、 公知文献 （国際公開公報 WO 2005/030944) に記載の ゴマの器官別 c D N Aに対して以下の条件で R T— P C Rを行った。
PCR反応液は、 cDNA 1 μ 1、 1 ΧΕ χ-Τ a q b u f f e r (T a k a R a) 、 0. 2mM dNTP s、 プライマー各 0. 2 p m o 1 μ 1、 Ex— T a q p o l yme r a s e 1. 25Uからなる。 94°Cで 5分間の後、 9 4 °Cで 1分間、 55 °Cで 1分間、 72 で 2分間の反応を 32サイクル行つて P C R増幅した後、 72 で 5分間保持した。 S i OMT1および S i OMT2特異的 プライマーとして S i OMT1-FW (配列番号 7) と S i OMT1-RV (配列番号 8) および S i OMT2-FW (配列番号 9) と S i OMT2-RV (配列番号 10) を 用いた。 S i OMT遺伝子の発現量と内在性遺伝子の発現量とを比較するために、 内部標準となる遺伝子の PC R反応を同時に行った。 具体的には、 S i 18 S r R NA—Fプライマー （配列番号 11) および S i 1 8 S r RNA— Rプライマー (配列番号 12) を用いてゴマの 18 S r i b o s oma l RNA遺伝子 （ァ クセッション番号： AF 169853) の PCR反応を行った。 配列番号 7： S i OMT1-FW： 5 '-Τ T G C C C C AT G T C AT T C A AG A T
配列番号 8 : S i OMT1-RV： 5 '-AAAATTC AGACTTATAACGA TACCAAA
配列番号 9 : S i OMT2-FW： 5 C-T T AG A A A A A C T C A AT T C G T C TAAT
配列番号 10 : S i OMT2-RV： 5 C T AC AT C C AC G AC GG AAT W 200
CCAAA
配列番号 11 : S i 1 8 S r RNA-FW : 5， - t a t g c t t g t c t c a a a g a t t a a
配列番号 12 : S i 18 S r RNA- RV : 5' — a a c a t c t a a g g g c a t c a c a g a
PCR産物を電気泳動し、 ェチジゥムブ口マイド染色を行った結果、 両 S i OM T遺伝子 （S i OMT1及び S i OMT2) ともに種子において強い発現が確 さ れた （図 2—2A) 。 すなわち、 両 S i OMT遺伝子発現領域とメチル化リグナン が蓄積する領域が一致することを確認した。
〔実施例 3 :ゴマメチル化酵素遺伝子のクローニング〕
両 ESTクローンが推定 ORFの 5， 領域を含んでいなかつたため、 5， Ra p i d Amp l i i i c a t i o n o f cDNA En d (以下、 5 ' RAC E) 法を使用して、 それぞれの S i OMT遺伝子の 5， 領域を増幅した。 具体的に は、 Ge n e Ra c e r k i t (I nv i t r o g e n社） を製造業者の推奨 する方法に従って使用して、 以下のプライマー （配列番号 13〜： L6) を用いて、 各々の 5， 領域を増幅した。 配列番号 13： GR-S i OMT1-RV： 5' -ccggcccactgttcgggtcctaacgggaaa 配列番号 14： S i OMT1-NE S T-RV： 5'-gcaaatccacttcataaaaat
配列番号 15： GR-S i OMT 2-RV： 5'-cctcgggttccgctctttctgctcccagaa 配列番号 16 : S i OMT2-NEST-RV： 5'-atcaatttgggaaattacaaa S i OMT2 に関しては E S Tクローンが推定 ORFの 3 '末端を含んでいなか つたため、 配列番号 17および 18のプライマーを用いて 3' RACEを行った。 配列番号 17 ： GR-S i OMT 2-FW： 5'-gaagatcgccccatgagcatgaaacccttt 配列番号 18 ： S i OMT 2-NE ST-FW： 5'-aacgtcgttctgggagcagaaaga R A C E法によって得られた增幅断片の塩基配列を、 プライマーウォーキング法 によって決定し、 S i OMT1および S i OMT2遺伝子の完全長オープンリーデ イングフレームを含む塩基配列情報を得た （配列番号 1および配列番号 19) 。
S i OMT1 と S i OMT 2はお互いにアミノ酸配列で 29%の配列同一性を示 した。 配列同一性について、 C l u s t a l W a l i g nme n tプログラム (M a c Ve c t o r v e r . 7. 2. 2 (S yma n t e c c o r p o r a t i o n) ) をデフォルト設定で使用した。 得られた S i OMT遺伝子の完全長 c DN A配列を B l a s t x解析 （h t t p ： /w w. n c b i . n 1 m. · n i . g o v/B LAST/) によって相 同性を有する既知タンパク質を検索した。 B l a s t X解析の条件は以下のとおり である。
プログラム： B l a s t x v e r . 2. 2. 9、 データベース ·· n r、 遣伝コー ド： s t a n d a r d (1) 、 フィノレタ： L OW c omp l e x i t y^ Ex p e c t : 10、 Wo r d s i z e : 3、 マトリクス ： BLOS UM 62、 Ga
Co s t s ： Ex i s t e n c e 1 1、 Ex t e n s i o n 1。
B 1 a s t x解析の結果、 S i OMT 1は、 Catharanthsus roseus Caffeic acid-O-methyltransferase (COMT) (AAK20170) と 74%の配列同一性を示 し 、 S i O M T 2 は、 Rosa hybrida ( AAM23004 ) の Orcinol'O- methyltransferase (OOMT) と 57%の配列同一性を示した。 このように、 両 S i OMT と既知のメチル化酵素との配列同一性はいずれも高いとは言えない。 従つ て、 得られた両 S i OMT遺伝子の機能を推定することはできなかった。 すなわち、 得られた両 S i OMT遺伝子は、 これまでに単離されていないリグナンメチルイ匕酵 素である可能性が非常に高い。
〔実施例 4：大腸菌発現ベクターの構築〕
S i OMT 1に対して配列番号 20および 21 のプライマー対を使用して、 cD NAの開始メチォニンコ.ドン （ATG) の上流に B g 1 I I部位を、 終始コドンの 下流に S a 1 I部位を有するフラグメントを PCR増幅した。
一方、 S i OMT2 に対して配列番号 22および 23のプライマー対を使用して cDN Aの開始メチォニンコドン （ATG) の上流に B amH I部位を、 終始コド ンの下流に X ho I部位を有するフラグメントを PCR増幅した。 PCRに用いた プライマーを以下に示す。 配 列 番 号 20 ： Bgl2-SiOMTl-FW ： 5'- aaaacatgtatggcggatcagtccgaggaagaagaggcttt
配列番号 21： Sall-SiOMTl-RV 5'-attgcgacttatgaaattccatgatccaaatatt 配 列 番 号 22 ： BamHI-SiOMT2-FW ： 5'· aaaggatccatggcgatggttaaccaaaagcaaaatctt
配列番号 23： XhoI-SiOMT2-RV： 5'-aaactcgagttaaggatatatctcgatgatagatctcaa
PCR反応液 （25 μ 1) は、 テンプレートとしてのゴマ種子 c DNA、 各プラ イマ一 0. 2 ρπιο 1/^ 1、 1 XKOD p l u s b u f f e r (TOYO BO) 、 0. 2mM dNTP s、 1 mM Mg S04、 1 U KOD l u s p o 1 yme r a s eからなる。 94 °Cで 5分間反応させた後、. 94°C1分間、 5 5°C1分間、 72 °C 2分間の反応を 30サイクル行って P CR増幅した後、 72°C で 3分間保持した。 得られた各 PCR産物を、 製造者が推奨する方法に従って p C R4 B l un t— TOPO v e c t o r (I nv i t r o g e n) のマルチク ローニング部位に挿入して、 S i OMTlZpCR4 B l un t -TOPO (p S PB2678 と称する） 、 S i OMT2/p CR4 B l un t -TOPO (p S P B2679と称する） を得た。
p S PB2678および、 p S P B2679に含まれる S i OMT塩基配列を解析して. 正しく PCRが行われたことを確認した。 これらのプラスミドを PCRプライマー に付加した制限酵素サイトで消化して得られる完全長 S i OMTを含む約 1. Ik bの DNA断片を、 大腸菌発現ベクターである p QE30 ベクター （Q I AGE N) の B a mH I /S a 1 Iサイトに揷入して、 S i OMT l/p QE30 (p S PB2690 と称する） 、 S i OMT2/p QE30 (p S PB2686 と称する） を得た, 〔実施例 5 ：組換えタンパク質の詾製〕
上記において作製した大腸菌発現ベクター p S PB2690および p S PB2686を用 いて大腸菌株 JM1 0 9 (TOYOBO) を形質転換し、 最終濃度 20 g /m l のアンピシリンを含む LB培地中にて 3 7°Cでー晚前培養した。 前培養液の一部を アンピシリン 50 / gZm 1、 カザミノ酸 0. 5%を含む M9培地 （1 0m 1 ) に 添加して、 Α6。。=0· 6〜1. 0に達するまで振盪培養した。 次いで、 培養液に 最終濃度 0. 5πιΜの I PTG ( I s o p r o p y l -i3 -D- t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e) を加え、 さらに 30 °Cで一晚振蘯培養した後、 30 00 r p mにて 4 °Cで 1 0分間遠心分離を行って集菌した。 菌体を 1 0m lの緩衝 液 （3 0mM T r i s _HC l (pH 7. 5) 、 2mM M g C 12、 0.5mM EDTA, 50μΜ APSMF) に懸濁した後に超音波処理を行って大腸菌を破碎し、 次いで、 1 5， 0 00 r 1) 111にて4°〇で1 0分間遠心分離を行い、 得られた上清を 粗酵素液として以下の活性測定に用いた。
〔実施例 6：ゴマリダナンメチル化酵素による生成物の分析〕
酵素反応の基質に用いるゴマリグナンは少量の DMSOに溶解した後に 70%ェ タノールに溶解して基質溶液 (lmg/m l ) を調製した。 ゴマリダナンは、 例え ば、 公知の方法 （日本農芸化学会誌 6 7 : 1 6 9 3 (1 9 9 3) ) に従ってゴマ から抽出および精製して得ることができる。 基質溶液 1 0 μ 1、 大腸菌で発現させ た S i OMTの上記粗酵素液 200 μ 1および 1 OmM S— Ad e n o s y 1 - L-Mathianine (SAM) 1 0 β lを反応チューブ中で混合した後、 30°Cで 2 時間反応させた。
0. 1 %トリフルォロ酢酸 （T F A) を含む 1 00 %ァセトニトリル (250 1 ) を反応チューブに添加することによって、 酵素反応を停止させた。 反応チュー プをポルテックスミキサーで激しく攪拌した後、 1 5， 000 r pmにて 4°Cで 5 分間遠心分離し、 得られた上清をフィルタ （ポアサイズ 0. 45mm、 4mm M i 1 1 e x— LH、 M i 1 1 i p o r e) を用いて清浄ィ匕した後、 液体高速クロマ トグラフィー （以下 HPLC) を用いてこの上清を分析した。 リグナンおよびその メチル化リダナンの分析条件は以下の通りである
C— 30カラム （野村ィ匕学 C 30— UG— 5、 4. 6mmX 15 Omm) を用い て液体クロマトグラフィー （L c一 2010 c (島津製作所） ) を行った。 移動相 には、 A液として、 0. 1%TFA、 B液として、 .0. 1 %T F Aを含む 90 %ァ セトニトリルを用いた。 A液 80%： B液 20%の混合液を用いてカラムを平衡化 した （20分間） 後、 直線濃度勾配 （A液 80%： B液 20%→ 液10%： B液 90 %) を用いて 20分間にわたって溶出 （流速 0. 6m l/分） し、 さらに A液 10%： B液 90%を用いて 7分間溶出した。 28 On mの吸収を測定して、 サン プル中に含有される化合物を検出した。 化合物の各ピークを、 SPD— 10AV (島津製作所） を用いて 190 ηπ！〜 400 nmのスペク トルを測定し、 リグナン に特徴的な 2つの吸収極大 （230 nmおよび 280 nm) を有する物質を探索し た。 この条件下で、 ピノレジノール標準品は約 11.8分、 ピペリ トール標準品は約 15.5分、 セサミノール標準品は約 16.8分に検出される。
S i OMT1組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中において、 リグナ ンのスペク トルを有する保持時間 14.0分のピーク Aが新たに得られた （図 3— 3 A) 。 また、 S i OMT1組換えタンパク質とピペリ トールとの反応液中において、 リグナンのスぺク トルを有する保持時間約 17.7 分のピーク Bが新たに得られた (図 3— 3B) 。
S i OMT2組換えタンパク質とピノレジノールまたはピペリ トールとの反応液 中において、 新たな生成物は認められなかった （図 4—3C〜3D) 。 また、 S i OMT1および S i OMT 2のセサミノールに対するリグナンメチル化活性は認め られなかった。
次に、 LC— MS分析によって、 S i OMTl により生成した新規リダナンの分 子量を決定した （液体クロマトグラフィー （LC) ： Wa t e r s 2795 (ゥ オーターズ社） 、 質量分析器： QUATRO mi c r o (マイクロマス社） ) 。 ダイアイオン HP— 20樹脂 （三菱化学） を lm 1充填したカラムを 50%ァセト ン 5 mlで洗浄した後、 水 10m 1を用いて平衡ィ匕した。 S i OMTl により生成 したメチル化リグナンを含む酵素反応液をカラムにロードし、 5mlの水を用いて 不純物を洗浄した後、 80%アセトン 2m 1を用いて溶出した。 ェパポレーターを 用いて溶出液を乾固させた後、 1%ギ酸を含む 90%ァセトニトリル （100 μ 1) 中に溶解させて LC— MS分析試料とした。 LC条件を以下に示す。
De v e l o s i l C 30—UG— 3カラム （野村化学、 3. 0 X 150 m m) を用い、 移動相は、 A液として水を、 B液として 100%ァセトニトリルを、 C液として 1 °/0ギ酸を、 D液として 10 OmM酢酸アンモニゥム水溶液を用いた。 10分間にわたる直線濃度勾配 （A液 60%： B液 30%： C液 5%： D液 5%→ A液 10%： B液 80%： C液 5%： D液 5%) を用いて溶出し、 その後、 A液 1 0%： B液 80%： C液 5%： D液 5%を用いて 5分間溶出した （流速：常時 0. 2 ml/分） 。 アンモニゥム付加イオンとしてシグナルを検出した。
この条件下で、 ピーク Aは約 8.3分、 ピーク Bは約 11.3分に検出される （図 3 〜 5) 。 イオンモード ES十、 Co n e o l t a g e 15V、 Co l l i s i o n 2 eVの MS条件を用いて、 100〜800 (m/ ζ , 30分） の範囲で MSスキャンし、 210〜400 nm (30分） の範囲の PDAを測定した。
上記条件下での L C一 M S分析の結果、 ピーク Aはアンモニゥムイオン付加分子 量 373 (m/z) 、 ピーク Bはアンモニゥムイオン付加分子量 371 (m/ z ) であ つた （図 6— 4A、 図 7_4B) 。 従って、 これらのピークは、 それぞれピノレジ ノール (アンモニゥムイオン付加分子量 359) のモノメチルイ匕されたもの、 およ びピペリ トール (アンモニゥムイオン付加分子量 374) のモノメチル化されたも のであると同定した。
以上の結果から S i OMT1 はゴマリグナンであるピノレジノールおよびピペリ トールに対してモノメチル化する活性を有する酵素であることが明らかになった。
〔実施例 7：ゴマリダナンメチル化酵素ホモログ遺伝子の単離〕
リダナンメチル化活性を有する酵素遺伝子がゴマ種間において機能的および構造 的に保存されているかどうかを明らかにするために、 栽培ゴマ品種である S e s a mum i n d i c umとは細胞遺伝学的に異なるアフリカゴマ （S e s amum r a d i a t um) から、 S i OMTl のカウンターパート遺伝子 （S r OMT 1) を単離することを試みた。 S. r a d i a t u mはアフリカに現存するゴマ植物であり、 細胞遺伝学解析 によれば染色体数は 2 n = 64ときれており、 栽培ゴマ品種である S . i n d i e urn (2n = 26) とは遺伝的に異なる系統である （参考文献、 並木満夫、 小林貞 作 「ゴマの科学」 朝倉書店） 。 しかし、 S. r a d i a t um種子においても多様 なリグナンが蓄積していることが知られている （参考文献、 B e d i g i a n, D. bs B i o c h em i c a l S y s t ema t i c s a n d E c o l o g y 13 : 133— 139 (1985) ) 。 従って、 S. r a d i a t umのゲノム中 には S. i n d i 0 11111の3 i OMT1 に対応する遺伝子が含まれていることが期 待される。
S. r a d i a t u m種子の c D N Aを用いて Bgl2_S i OMTl-FW (配列番 号 20 および） Sall-S i OMT1-RV (配列番号 21) のプライマー対を用いて、 PCRにより S r OMT1の増幅を試みた。
S. r a d i a t um種子の c DNA 1μ 1、 l XEx-Ta q b u f f e r (T a k a R a) 、 0. 2 mM dNTP s、 プライマー各 0. 2 p m o 1 / μ E x-T a q p o l yme r a s e 1. 25 Uからなる。 94°Cで 5分間 の後、 94°〇で1分間、 55でで 1分間、 72 °Cで 2分間の反応を 30サイクル 行って P C R増幅した後、 72 で 5分間保持した。 得られた約 1. 1 k bの P C R産物を、 製造者が推奨する方法に従って p CR 2— TOP O v e c t o r (I n v i t r o g e n社） のマルチクローニングサイトに挿入し、 S r S i OMT1 /p CR 2 -TOPO (p S PB2910) を得た。
プライマーウォーキング法によって、 p S PB2910 に含まれる S r OMT1 の 塩基配列 （およびアミノ酸配列） を決定した （配列番号 3および 4) 。 S r OMT 1は、 S i OMT1に対してアミノ酸配列で 89%の配列同一性を示した。 配列同一 性について、 C l u s t a l W a l i g nme n tプログラム （Ma c V e c t o r v e r . 7. 2. 2 (,S yma n t e c c o r p o r a t i o n) ) ¾r デフォルト設定で使用した。 この高い配列同一性は S r OMT 1が S i OMT1の カウンターパート遺伝子であることを強く支持する。
実施例 2と同様の方法で RT— PCRを行い、 S r OMT1の種子に特異的な遺 伝子発現を確認した （図 2— 2B) 。 実施例 4と同様に S r OMT1 の大腸菌発現ベクターである S r OMTl/pQE 30 (p SPB2911) を構築し、 実施例 5と同様に耝換えタンパク質を調製し、 実 施例 6と同様にその活性および生成物の分析を行った。
S r OMTl は S i OMTl と同様に、 ピノレジノールおょぴピペリ トールに対 してメチノレイヒ活性を示した （図 5) 。 また、 S i OMT1 はセサミノールに対して メチル化活性を示さなかった。 以上の結果より、 S rOMTl は S i OMT1 の力 ゥンターパ一ト遺伝子であり、 本酵素遺伝子がゴマ種間で保存されていることが示 された。 · 〔実施例 8 ： S i OMT1のゲノミックサザン解析〕
ゴマゲノム内における S i OMT1遺伝子のコピー数を明らかにするために、 ゲ ノミックサザン解析を実施した。 Nu c l e o n Phy t o p u r e f o r P l a n t Ex t r a c t i on K i t (アマシャム社） を製造業者が推奨す る方法に従って用いて、 S. i n d i c urn (真瀬金品種） の葉からゲノム DNA を抽出した。 抽出したゲノム DN A を、 E c oR I、 H i n d i I I， X h o Iまたは Xb a Iで消化した後、 ァガロースゲルを用いた電気泳動にて分離し た。 このァガロースゲルを 0. 25M HC 1を用いて 15分間加水分解した後、 1. 5M Na C 1 /0. 5M N a OHの溶液を用いて変性させ （ 30分間） 、 1. 5M N a C 1を含む T r i s一 HC 1 ( p H 7. 5) を添加することによつ て変性溶液で中和した （20分間） 。 次いで、 ァガロースゲル内のゲノム DNAを、 20 X S S C溶液中にてメンブレン (Hy b r i b o n d— N、 アマシャム社) に 転写した。 メンプレンに転写したゲノム DNAを UV照射によりメンプレンに結合 させ、 7%SDS、 50%ホルムアミ ド、 5 XSSC、 2%ブロッキング試薬、 0. 1%ラウロイルサルコシン、 5 OmMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 0) から なるハイブリダィゼーシヨン緩衝液 （高 SD S緩衝液： ロシュ社） を用いて、 4 2 °Cで 1時間プレハイブリダイゼーションを行つた。
P S P B 2678をテンプレートとして、 それぞれ配列番号 20 (B g 12-S i OM T1-FW) および配列番号 21 (S a 1 I— S i OMT1-RV) のプライマー対 • を用いる PCRによって、 D I G標識ィ匕ハイプリダイゼーシヨンプローブを作製し た。 PCR反応液は、 p S PB2678 プラスミ ド 1 n g、 1 XPCR緩衝液 （タカ ラバイオ社） 、 2. 5mM D I G— dNTP mi x t u r e (PCR D I G l a b e l i n g Mi x、 ロシュ社） 、 0. 2 p m o 1の各プライマ 、 1 U r T a q p o l yme r a s e (タカラパイォ社） からなる。 P CR反応を、 9 5でで 30秒間、 53でで 30秒間、 72 で 2分間の反応を 30サイクル行つた。 S e p h a d e x G— 50カラム一 F i n e (ベーリンガー社） を用いて精製し た PCR産物をハイブリダィゼーシヨンプローブとして用いた。 このプローブを熱 変性した後、 プレハイプリダイゼーション液に 15 μ 1添加して、 42°Cでー晚ィ ンキュベートした。
ハイブリダィゼーシヨン後、 高ストリンジェントな条件 （0. 2 X S S Cおよび 0. 1%SDSを含む溶液を用いて 65°Cで 30分間を 2回） によってメンブレン を洗浄した。 D I Gラベリング&デテクションキット （ロシュ社） を製造業者の指 示書に従って用いて、 ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
サザン解析の結果、 いずれの制限酵素消化画分においても二本以上のバンドが検 出されたので、 S i OMT1 と極めて相同性の高い遺伝子が少なくとも 1つ以上ゴ マゲノム内にコードされていることが示された (図 8) 。 さらに言えば、 ゴマグノ ム中には S i OMT1 と機能的に重複もしくは類似した酵素遺伝子が複数存在する ことが期待される。 〔実施例 9： ゴマリグナンメチル化酵素の C OMT活性の測定〕
実施例 3に示すようにデータベース検索により S i OMT1および S r OMT1は 既知のタンパク質の中では COMTと最も高レ、配列同一性を示す。 このことはゴマ メチル化酵素が C OMT活性をも有していることを示唆する。
実施例 5および実施例 7で発現させた S i OMT1 および S r OMT1 のカフェ 酸に対するメチルイ匕活性を検討した。 0.4m g /m 1カフェ酸 10 μ し 大腸菌で発 現させた S i ΟΜΤの粗酵素液 200 μ 1および 1 OmM SAM 10 μ 1を反 応チューブ中で混合した後、 30°Cで 1時間反応させた後、 実施例 6 と同様の方 法で H P L C分析に供した。
その結果、 S i OMT1および S r OMT1共にカフヱ酸との反応液中に標準品 フェルラー酸と保持時間が一致するピーク C (保持時間約 7.3分） が生成した （図 9一 6A〜6 C) ) 。 本 H P L C分析条件下ではカフェ酸は保持時間約 3.9分に溶 出される。
実施例 6と同様の条件で L C— M S分析を行ったところピーク Cはアンモニゥム イオン付加分子量 195 (m/ z ) であった （図 1 0—6D) 。 従って、 ピーク Cは、 カフヱ酸 （アンモニゥムイオン付加分子量 181 (m/ z ) ) がモノメチル化されて 生成するフェルラー酸であることが確認された。 これにより二種のリグナンメチル 化酵素は共に C OMT活性をも有していることが明らかとなった。 産業上の利用可能性
以上のように、 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、 メチノレイ匕リグ ナンの生産に有用である。 また、 本発明のポリヌクレオチドを発現可能に導入した 形質転換体または細胞は、.食品分野、 各種工業分野において、 メチル化リグナン、 またはこれを用いる製品を生産する上で、 極めて有用である。 上記形質転換体が植 物体である場合、 植物体自体を食品として用いることができるので農業分野等にお いて非常に有用である。
さらに、 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、 本発明者らが見出し た他の酵素 （ピペリ トールおよびセサミンを合成する酵素である S i P 1 8 9 ) と 組み合わせることによって、 ゴマに限ることなく、 特定のリグナン分子種の生産系 の確立が可能となり、 その結果、 特定のリダナンおょぴメチル化リダナンの生産量 を拡大することができる。 従って、 本発明は、 '農業、 食品産業、 医薬品産業および これらの関連産業にわたる広範な利用が可能である。

Claims

請求の範囲
1 . 以下の（a)〜（d)のいずれかに記載のポリヌクレオチド：
(a)配列番号： 1又は 3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリ ヌクレオチド；
(b)配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
(c)配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からな るポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつリグ ナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチ ド；及び
(d)配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列において、 1もしくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換、 挿入及び Z又は付加したアミノ酸配列からなり、 かつリダナン にメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを 含有するポリヌクレオチド。
2 . 配列番号： 2又は 4のァミノ酸配列、 または当該アミノ酸配列に対して 1 又は数個のアミノ酸の付加、 欠失及び z又は他のアミノ酸による置換によって修 飾されているアミノ酸配列を有し、 かつリグナンにメチル基を転移する活性を有 するタンパク質をコードする前記請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
3 . 配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からな るポリヌクレオチドとストリジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつリダナ ンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする請求項 1に記載の ポリヌクレオチド。
4 . 配列番号： 1又は 3の塩基配列の一部又は全部と相補的な塩基配列からな るポリヌクレオチドに対して、 5 X S S C、 5 0 °Cの条件下でハイブリダイズし. かつリグナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする前記請 求項 1に記载のポリヌクレオチド。
5 . 配列番号： 1又は 3の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する前記 請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
6 . 配列番号： 2又は 4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリ ヌクレオチドを含有する前記請求項 1に記載のポリヌクレオチド。
7 . DNAである、 前記請求項 1〜6のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
8 . フロフラン型リダナンに対してメチル基を転移する活性を有するタンパク 質をコードする前記請求項 1〜 7のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
9 . ピノレジノール及び/又はピペリ トールに対してメチル基を転移する活性 を有するタンパク質をコードする前記請求項 8に記載のポリヌクレオチド。
1 0 . 前記請求項 1〜9のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされる タンパク質。
1 1 . 前記請求項 1〜 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するべク ター。
1 2 . 請求項 1 1に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
1 3 . 請求項 1 2に記載の宿主細胞を培養し又は生育させ、 当該宿主細胞から リダナンにメチル基を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴と する該タンパク質の製造方法。
1 4 . 請求項 1〜9のいずれかに記載のポリヌクレオチドが導入された植物体 もしくは当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体、 又はそ れら植物体の組織。
1 5 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを用いてリダナンに メチル基を転移する方法。
1 6 . 請求項 1〜 9のいずれかに記載のポリヌクレオチドを植物体に導入し、 発現させることによって、 産生するリダナン組成が改変された当該植物体もしく は当該植物体と同一の性質を有する該植物体の子孫となる植物体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009084439A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Suntory Holdings Limited リグナン水酸化酵素

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5502347B2 (ja) * 2009-03-12 2014-05-28 サントリーホールディングス株式会社 リグナンメチル化酵素をコードする遺伝子およびその用途
US8435778B2 (en) 2010-05-13 2013-05-07 Suntory Holdings Limited Gene encoding lignan methyltransferase and use thereof
CN113480555B (zh) * 2021-08-11 2022-10-18 西北农林科技大学 一种含3,7-二氧杂双环[3,3,0]辛烷结构的木脂素类化合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040049802A1 (en) * 2001-03-23 2004-03-11 Dixon Richard A. Method for modifying lignin composition and increasing in vivo digestibility of forages
WO2008069878A2 (en) * 2006-10-27 2008-06-12 Ceres, Inc. Modulating lignin in plants

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] SCHROEDER G., WEHINGER E., SCHROEDER J., XP003018824, Database accession no. (Q8W013) *
DATABASE GENBANK [online] SUH M.C.: "Comparative analysis of Expressed Sequence Tags between Sesamum indicum and Arabidopsis thaliana developing seeds", XP003018823, Database accession no. (BU668664) *
DATABASE GENBANK [online] WANG J. ET AL.: "Nucleotide Sequences of Two cDNAs Encoding Caffeic Acid O-methyltransferases (Accession Nos. AF154917 and AF154918) from Sweet Basil (Ocimum basilicum). (PGR99-105)", XP003018822, Database accession no. (AF154918) *
KRANZ K. ET AL.: "Beta-peltatin 6-O-methyltransferase from suspension cultures of Linum nodiflorum", PHYTOCHEMISTRY, vol. 64, no. 2, 2003, pages 453 - 458, XP004448661 *
PLANT PHYSIOL., vol. 120, no. 4, 1999, pages 1205 *
See also references of EP1997896A4 *
UMEZAWA T. ET AL.: "Lignan no Ichi Sentakuteki Methyl-ka o Shokubai suru Shinki O-methyltransferase (A novel O-methyltransferase catalyzing a regioselective methylation of lignan)", DAI 49 KAI PROCEEDINGS OF THE LIGNIN SYMPOSIUM, DAI 49 KAI LIGNIN SYMPOSIUM JIMUKYOKU HAKKO, 20 October 2004 (2004-10-20), pages 33 - 36, XP003018825 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009084439A1 (ja) * 2007-12-28 2009-07-09 Suntory Holdings Limited リグナン水酸化酵素
US8288613B2 (en) 2007-12-28 2012-10-16 Suntory Holdings Limited Lignan hydroxylase
JP5638807B2 (ja) * 2007-12-28 2014-12-10 サントリーホールディングス株式会社 リグナン水酸化酵素

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