CN114717247B - 木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合成上的应用 - Google Patents

木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合成上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种木薯转录因子的编码基因，其为转录因子MebHLH72基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或者其为转录因子MebHLH114基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。采用本发明的MebHLH72基因和MebHLH114基因的片段构建沉默系统能够有效沉默目标基因，而且能够有效调控植株内亚麻苦苷合成关键基因的表达，调控植株内亚麻苦苷的合成，调节氰苷含量，例如将其转染木薯后，氰苷合成关键基因的相对表达呈现一定程度的下降，木薯叶片内亚麻苦苷的合成明显被抑制，但对百脉根苷的合成无明显影响，亚麻苦苷含量显著下降，百脉根苷含量无显著差异，氰苷含量也明显下降。

Description

木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合 成上的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合成上的应用。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz，Cassava)为大戟科木薯属多年生植物，与甘薯、马铃薯并称世界三大薯类作物，是目前淀粉和生物能源生产的重要原料，也是全球约10亿人口的主要粮食。木薯中存在亚麻苦苷(Linamarin)和百脉根苷(Lotaustralin)2种生氰糖苷(Cyanogenic Glycosides，CGs)，其中亚麻苦苷占95％左右，是主要生氰糖苷。在木薯中,生氰糖苷先在地上部分合成，随后运送到根部贮存。生氰糖苷本身不呈现毒性，在蒸煮或加工过程中，亚麻苦苷酶会降解部分CGs产生不稳定的丙酮氰醇，进而产生的氢氰酸(HCN)和醛、酮等小分子化合物，少部分CGs会稳定的存在于木薯食品中，若加工后食品中CGs残留量较高，摄入人体内后，在β-葡糖糖苷酶的作用下会分解成HCN，容易引起呼吸中枢及血管运动中枢麻痹，甚至导致死亡。在非洲和南美地区，长期食用CGs高含量的木薯食品，会引发热带神经性共济失调症(TAN)，在儿童和生育期妇女中还可能引发永久性下肢瘫痪症(konzo)。木薯叶片、块根及其制品中CGs的存在，给木薯“食用化”带来不可忽视的安全隐患。
氰苷是一类广泛存在于植物中的次生代谢产物，其生物合成是在细胞色素P450单加氧酶(CYP)中的CYP79酶家族催化芳香族或脂肪族氨基酸转换成相应的醛肟.与植物的防御和抗逆境胁迫相关。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合成上的应用。
本发明的第一个方面是提供一种木薯转录因子的编码基因，其为转录因子MebHLH72基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；或者其为转录因子MebHLH114基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第二个方面是提供一种木薯转录因子，其为转录因子MebHLH72，由如SEQID NO：1所示核苷酸序列编码而成；或者其为转录因子MebHLH114，由如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列编码而成。
本发明的第三个方面是提供一种基因片段，其为转录因子MebHLH72基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者其为转录因子MebHLH114基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的第四个方面是提供给含有本发明第一个方面所述的编码基因或者本发明第三个方面所述基因片段的重组载体或宿主菌。
本发明的第五个方面是提供一种VIGS沉默系统，其为含核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示基因片段的pCsCMV-NC载体(参照Tuo et al.,2021)，或者其为含核苷酸序列如SEQID NO：4所示基因片段的pCsCMV-NC载体。
本发明的第六个方面是提供核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的转录因子MebHLH72基因、核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因片段、含转录因子MebHLH72基因或核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示基因片段的重组载体或宿主菌、或者含SEQ ID NO：3所示基因片段的pCsCMV-NC载体构建的VIGS沉默系统在沉默MebHLH72基因中的应用；或者核苷酸序列如SEQID NO：2所示的转录因子MebHLH114基因、核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的基因片段、含转录因子MebHLH114基因或核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因片段的重组载体或宿主菌、或者含SEQ ID NO：4所示基因片段的pCsCMV-NC载体构建的VIGS沉默系统在沉默MebHLH114基因中的应用。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的编码基因、本发明第三个方面所述的基因片段、本发明第四个方面所述的重组载体或宿主菌、或者本发明第五个方面所述的VIGS沉默系统在调控植物叶片氰苷(cyanogenic glycosides)含量中的应用。
其中，本发明第一个方面所述的编码基因、本发明第三个方面所述的基因片段、本发明第四个方面所述的重组载体或宿主菌、或者本发明第五个方面所述的VIGS沉默系统能显著抑制亚麻苦苷合成，但对百脉根苷合成无明显影响。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的编码基因、本发明第三个方面所述的基因片段、本发明第四个方面所述的重组载体或宿主菌、或者本发明第五个方面所述的VIGS沉默系统在调控植物内亚麻苦苷含量中的应用。
其中，本发明第一个方面所述的编码基因、本发明第三个方面所述的基因片段、本发明第四个方面所述的重组载体或宿主菌、或者本发明第五个方面所述的VIGS沉默系统能显著抑制亚麻苦苷合成，但对百脉根苷合成无明显影响。
本发明的第九个方面是提供如本发明第一个方面所述的编码基因、本发明第三个方面所述的基因片段、本发明第四个方面所述的重组载体或宿主菌、或者本发明第五个方面所述的VIGS沉默系统在调控MeCYP79D1基因(Manes.13G094200)、和/或MeCYP79D2基因(Manes.12G133500)、和/或MeCYP71E基因(Manes.12G132900)表达中的应用。其中MeCYP79D1基因、和/或MeCYP79D2基因、和/或MeCYP71E基因的序列已在phytozome木薯数据库公开(网址：https://phytozome-next.jgi.doe.gov/report/gene/Mesculenta_v7_1)，登记号分别为Manes.13G094200、Manes.12G133500和Manes.12G132900。
本发明的转录因子MebHLH72基因和MebHLH114基因的亚细胞定位分别定位于细胞核和细胞质中，采用其片段构建沉默系统能够有效沉默目标基因，而且能够有效调控植株内亚麻苦苷合成关键基因的表达，调控植株内亚麻苦苷的合成，调节氰苷含量，例如将其片段转染木薯后，氰苷合成关键基因MeCYP79D1、MeCYP79D2及MeCYP71E的相对表达呈现一定程度的下降，木薯叶片内亚麻苦苷的合成明显被抑制，但对百脉根苷的合成无明显影响，亚麻苦苷含量显著下降，百脉根苷含量无显著差异，氰苷含量也明显下降。本发明为木薯“可食化”奠定了良好的基础，也为调控其他植物内的亚麻苦苷含量等提供了研究思路和技术依据。
附图说明
图1为转录因子MebHLH72基因及MebHLH114基因PCR电泳结果。其中，M:DL2000marker,1:MebHLH72基因,2:MebHLH114基因。
图2为转录因子MebHLH72基因及MebHLH114基因亚细胞定位结果。
图3为沉默MebHLH72基因及MebHLH114基因后40天木薯叶片表型。其中，SC9-Mock：未注射SC9木薯叶片；CsCMV-NC：注射空菌CsCMV-NC后SC9木薯叶片；CsCMV-ChlD：沉默MeChlD后SC9木薯叶片(阳性对照)；CsCMV-bHLH72：沉默MebHLH72后SC9木薯叶片；CsCMV-bHLH114：沉默MebHLH114后SC9木薯叶片。
图4为MebHLH72基因在MebHLH72基因沉默植株中的相对表达情况(左)以及MebHLH114基因在MebHLH114基因沉默植株中的相对表达情况(右)。
图5为MebHLH72基因沉默植株及MebHLH114基因沉默植株中3种氰苷合成关键基因的相对表达情况。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
一、木薯转录因子MebHLH72基因、MebHLH114基因的获得
1、木薯转录因子MebHLH72基因的获得
以木薯块根cDNA为模板，采用表1中的引物，通过PCR方法扩增获得的含有碱基序列714bp的片段(电泳图如图1所示)，其序列如SEQ ID No：1所示。PCR反应体系为2×PhantaMax Master Mix 25μl：cDNA 1μl，10μM引物F 0.5μl，10μM引物R 0.5μl，ddH2O，23μl。其反应程序为：95℃，5min；95℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，进行35个循环；72℃，10min。
2、木薯转录因子MebHLH114基因的获得
以木薯块根cDNA为模板，采用表1中的引物，通过PCR方法扩增获得的含有碱基序列540bp的片段(电泳图如图1所示)，其序列如SEQ ID No：2所示。PCR反应体系为2×PhantaMax Master Mix 25μl：cDNA 1μl，10μM引物F 0.5μl，10μM引物R 0.5μl，ddH2O 23μl。其反应程序为：95℃，5min；95℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，进行35个循环；72℃，10min。
表1木薯MebHLH72基因及MebHLH114基因的全长扩增引物
二、木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114的亚细胞定位
根据MebHLH72和MebHLH114基因CDS序列设计引物(表2)，以阳性克隆质粒为模板进行扩增，扩增产物经切胶回收纯化后使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接pNC-Green-SubN表达载体中，构建植物表达载体pNC-Green-SubN-MebHLH72和pNC-Green-SubN-MebHLH114，然后转化大肠杆菌感受态细胞，37℃过夜培养。挑菌摇菌后进行菌液PCR鉴定，将阳性菌液送至北京擎科生物科技有限公司测序。经测序比对分析后，选取正确的阳性克隆质粒转化农杆菌GV3101-psoup感受态细胞，使用瞬时转化法分别将pNC-Green-SubN-MebHLH72、pNC-Green-SubN-MebHLH114和空载pNC-Green-SubN(对照)转入烟草叶片中。3天后使用激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8，徕卡)观察荧光信号在烟草叶片细胞中的分布情况。结果如图2所示，MebHLH72定位在细胞核中，而MebHLH114定位在细胞质。
表2 MebHLH72及MebHLH114的亚细胞定位引物
注：小写字母为接头序列，大写字母为基因引物。
三、病毒诱导基因沉默(VIGS)及qRT-PCR验证
通过VIGS-Tool在线软件筛选300bp MebHLH72、MebHLH114和300bp MeChlD的特异性片段，300bp MebHLH72、MebHLH114和300bp MeChlD DNA片段分别如SEQ ID NO：3-5所示。用PrimerPrimer5.0设计特异性扩增引物，并引物两端加20bp NC载体的通用接头序列。其扩增引物见表3之后进行序列扩增、回收。
使用Nimble Cloing Mix试剂将其连接到pCsCMV-NC载体中。先将PCR回收产物与pCsCMV-NC空载质粒混合，加入5ul Mix，用移液枪吹打10-20次，充分混匀，50℃反应30-60min后，将2-5ul反应产物转化大肠杆菌感受态DH5α，后挑取单克隆进行培养、菌液PCR鉴定、阳性克隆测序，若最终测序结果比对正确则表示载体构建完成，得到含MebHLH72基因片段的pCsCMV-MebHLH72载体、含MebHLH114基因片段的pCsCMV-MebHLH114载体和含ChlD300基因片段的pCsCMV-ChlD300重组载体。构建好的重组载体需要转化到GV3101-pSoup-p19农杆菌感受态中，经PCR检测正确后，将菌液在28℃培养箱中扩大培养，OD600值达到08-1.0后，于5000rpm离心10min收集菌体，用含有10mM MES、10mM MgCl2和20mM乙酰丁香酮液体清洗2遍，离心收集菌体，使用含有10mM MES、10mM MgCl2和20mM乙酰丁香酮液体重悬农杆菌至OD600至0.8左右，黑暗静置2-3小时。使用注射器将菌液注入木薯叶片背面，置于室温生长40天后(其表型如图3)，pCsCMV-ChlD300作为阳性对照(pCsCMV-ChlD300载体转染植株)，其叶片会变黄。与对照相比，CsCMV-bHLH72沉默植株(pCsCMV-MebHLH72载体转染植株)和CsCMV-bHLH114沉默植株(pCsCMV-MebHLH114载体转染植株)新生叶片颜色变黄，叶片出现褶皱，且叶片出现斑点。
提取叶片总RNA，经过反转录后获得cDNA，利用测序引物CsCMV-F:TGGGCGCTAATTAGTTTACTGCA，CsCMV-R:GGTCAAGACGGCTCAACTCTTCA检测正确后，以MeActin为内参基因，使用MebHLH72和MebHLH114定量引物(表4)，通过实时荧光定量PCR检测沉默株系中MebHLH72和MebHLH114的表达情况。qRT-PCR采用TaKaRa公司生产的SYBR试剂盒(RR820A)，按说明在Thermo Fisher Scientific公司生产的Real-time Thermal Cycler上操作。反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s，55℃10s，72℃20s，40个循环。每个样品重复3次，相对表达量按ΔΔCT法进行计算。沉默株系中MebHLH72和MebHLH114的相对表达情况如图4所示，具体的沉默效率见表5。可见MebHLH72和MebHLH114基因的沉默效果均较为显著，MebHLH72在该基因的沉默株中的相对表达与对照相比为0.38，沉默效率达62％；MebHLH114在该基因的沉默株中的相对表达与对照相比为0.26，沉默效率达74％。
表3 MeChlD、MebHLH72及MebHLH114的VIGS沉默引物
注：小写字母为接头序列，大写字母为基因引物。
表4木薯MebHLH72及MebHLH114的实时荧光定量PCR引物
表5木薯MebHLH72及MebHLH114沉默株系中目标基因相对表达情况
注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。
四、沉默植株叶片内氰苷含量测定及氰苷合成关键基因表达分析
1、叶片内百脉根苷、亚麻苦苷和氰苷含量测定
称取新鲜的木薯叶片1-3g，用液氮粉碎后，称取0.1g粉末，加入1mL预冷(4-8℃)的0.025mol/L硫酸溶液，在4℃条件下转速10000r/min离心10min，收集上清液。取1mL上清液用0.22μm PTFE水系微孔滤膜过滤，用于高效液相色谱分析。每个样品设置3个重复。色谱条件如下：Waters Atlantic C18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，柱温25℃，采用二元梯度洗脱，流动相A为含0.1％甲酸(v/v)的80％乙腈/水(V/V)，B为0.1％(v/v)甲酸水溶液。起始时A为2％，B为98％；到5min时，A和B分别为8％和92％，15min时，A和B都为50％；25min时，A为100％，保持2min，到30min时A变化为2％，B为98％；平衡柱子5min，进下一个样。流速0.6mL/min；漂移管温度95℃，雾化温度80℃，气流速度：2.0L/min；增益为3；进样量10μL。植株叶片内百脉根苷、亚麻苦苷和氰苷含量如表6所示，可见沉默MebHLH72和MebHLH114后，叶片中百脉根苷含量无显著差异，而亚麻苦苷含量则显著下降。
表6木薯MebHLH72及MebHLH114沉默株系叶片氰苷含量测定
注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。
2、叶片内氰苷合成关键基因表达分析
为进一步明确转录因子MebHLH72和MebHLH114对亚麻苦苷合成的影响，对沉默株系中氰苷合成关键基因MeCYP79D1、MeCYP79D2及MeCYP71E的相对表达情况进行分析。以MeActin为内参基因，使用表7的引物，通过实时荧光定量PCR分别检测沉默株系中氰苷合成关键基因MeCYP79D1、MeCYP79D2及MeCYP71E的相对表达情况。qRT-PCR采用TaKaRa公司生产的SYBR试剂盒(RR820A)，按说明在Thermo Fisher Scientific公司生产的Real-timeThermal Cycler上操作。反应程序为95℃预变性30s；95℃10s，55℃10s，72℃20s，40个循环。每个样品重复3次，相对表达量按ΔΔCT法进行计算。结果如图5和表8所示，3个基因在沉默株中表达均呈现一定程度的下降，MeCYP79D1基因、MeCYP79D2基因和MeCYP71E基因在MebHLH72沉默株中的相对表达与对照相比分别为0.34、0.37和0.17，其中MeCYP71E的表达下降最明显；MeCYP79D1、MeCYP79D2和MeCYP71E在MebHLH114沉默株中的相对表达与对照相比分别为0.48、0.67和0.16，其中MeCYP71E的表达下降最明显。该结果表明木薯转录因子MebHLH72及MebHLH114可能通过调控氰苷合成关键基因MeCYP79D1、MeCYP79D2和MeCYP71E的表达进而影响氰苷生物合成。
表7 3个氰苷合成关键基因的实时荧光定量PCR引物
表8木薯MebHLH72及MebHLH114沉默株系叶片氰苷合成关键基因的相对表达情况
注：同一行内标以不同大写字母的值在0.01水平上差异显著。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所
<120> 木薯转录因子MebHLH72、MebHLH114及其在抑制亚麻仁苦苷合成上的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
atgcagcccg ataactcccc ggaaaattct cacttgtacc ggtttctcgc tgagaacggc 60
gttttcaacg tcggaccata cggtttcccg gcaatgcaaa gcttgtgtag ttcttcctcg 120
tcgtcttacc ataattaccc cttggaaggg tctgtaatta cggatatgac accacaggat 180
agagctcttg ctgctttgaa gaatcataaa gaagctgaga agagaaggag agagagaatt 240
aactctcatc ttgataagct caggaatcta cttccttgca actctaagac agacaaagct 300
tcacttcttg caaaagtagt tcaacgagtg agagaactca agcaacagac ctcacaaatt 360
ccagggctcg aaaccttccc atcagaaacc gatgagatca ctgtactttc cggcgagtgt 420
tcaagcgatg gacagttgat cttcaaggca tctttgtgct gtgaagaccg ctctgacctt 480
ttgcctgacc tcattgagat acttaaatct ctgcatttga agactctgag agctgaaatg 540
gtaacaattg gaggaagaat caggaacgtc cttatagtcg ctgctgagaa agatcacagt 600
attgaatcag tacatttctt gcaaactgca ctgaaatctt tacttgaaag atcaaattct 660
agtgataggt ctaaaaggag aagggtatta gatcataaac taataatcca atga 714
<210> 2
<211> 540
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
atgaagaaaa gcatcagtga gtcatcgaga cctgatcgaa agactgtaga gaggaatcga 60
agaattcaca tgaagggttt atgcttcaaa ctggcttctc tcatcccttc tcatcacttt 120
aaacattcta aggacatgct atctcagcaa ggtcaactag accacgctgc ggcttacata 180
aagcacctga aagaaagaat agagaaatta aagaagataa aggaacaggc aatggtgatc 240
tcaggagcta ataataataa aataatgatg ggattgagat tgccaattgt tgaacttcga 300
gacttgggtt caagcataga agtggttttg attagtgggt tgaagaagaa cttcatgatg 360
tacgaagtta ttaccattat tgaagaagaa ggagctgagg ttgtcagcgt cagcttttca 420
acagtgggtg ataaagtgtt ccatacaatc catgctcagg tcaaaatctg tagagttggt 480
gtggagactt caagggtatg tcagagattg caggaattga ttgactggag ttgcatatga 540
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
atgcagcccg ataactcccc ggaaaattct cacttgtacc ggtttctcgc tgagaacggc 60
gttttcaacg tcggaccata cggtttcccg gcaatgcaaa gcttgtgtag ttcttcctcg 120
tcgtcttacc ataattaccc cttggaaggg tctgtaatta cggatatgac accacaggat 180
agagctcttg ctgctttgaa gaatcataaa gaagctgaga agagaaggag agagagaatt 240
aactctcatc ttgataagct caggaatcta cttccttgca actctaagac agacaaagct 300
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
actggcttct ctcatccctt ctcatcactt taaacattct aaggacatgc tatctcagca 60
aggtcaacta gaccacgctg cggcttacat aaagcacctg aaagaaagaa tagagaaatt 120
aaagaagata aaggaacagg caatggtgat ctcaggagct aataataata aaataatgat 180
gggattgaga ttgccaattg ttgaacttcg agacttgggt tcaagcatag aagtggtttt 240
gattagtggg ttgaagaaga acttcatgat gtacgaagtt attaccatta ttgaagaaga 300
<210> 5
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
gctataaaaa ctgccttgtt gcttggtgct attgatcgtg agattggagg gattgctatc 60
tctggaaggc gaggaacagc caagacagta atggcacgtg gactacatgc cattttgcct 120
cccattgatg tagttgttgg ttcaatagca aatgctgatc cagcttgccc tgaggagtgg 180
gaagatggtt tagctgcacg agtagaatat gattccagtg gtagtattaa gactcaagtt 240
gttagatctc cttttgttca gattcccctg ggagtcacag aggacagact cattgggtct 300

Claims (7)

1.一种基因片段，其特征在于，其为转录因子MebHLH72基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；或者其为转录因子MebHLH114基因的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种VIGS沉默系统，其特征在于，其为含核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示基因片段的pCsCMV-NC载体，或者其为含核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示基因片段的pCsCMV-NC载体。
3.核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示的基因片段、含核苷酸序列如SEQ ID NO：3 所示基因片段的重组载体或宿主菌、或者含SEQ ID NO：3所示基因片段的pCsCMV-NC载体构建的VIGS沉默系统在沉默MebHLH72基因中的应用；所述MebHLH72基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示；
或者
核苷酸序列如SEQ ID NO：4 所示的基因片段、含核苷酸序列如SEQ ID NO：4 所示基因片段的重组载体或宿主菌、或者含SEQ ID NO：4所示基因片段的pCsCMV-NC载体构建的VIGS沉默系统在沉默MebHLH114基因中的应用；所述MebHLH114基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求1所述的基因片段或者权利要求2所述的VIGS沉默系统在下调木薯内氰苷含量中的应用。
5.权利要求1所述的基因片段或者权利要求2所述的VIGS沉默系统在下调木薯内亚麻苦苷含量中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的基因片段或者权利要求2所述的VIGS沉默系统能显著抑制亚麻苦苷合成，但对百脉根苷合成无明显影响。
7.权利要求1所述的基因片段或者权利要求2所述的VIGS沉默系统在下调MeCYP79D1基因、和/或MeCYP79D2基因、和/或MeCYP71E基因表达中的应用。
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