CN115948422A - 一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用 - Google Patents

一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用 Download PDF

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CN115948422A CN202310012827.3A CN202310012827A CN115948422A CN 115948422 A CN115948422 A CN 115948422A CN 202310012827 A CN202310012827 A CN 202310012827A CN 115948422 A CN115948422 A CN 115948422A
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recombinant vector
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段会军
王楠
闫小翠
董安忆
钟源
杨倩
邢悦
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本发明提供了一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用，属于基因工程技术领域。本发明克服了现有技术中缺少玉米抗旱基因的问题，在玉米中发现ZmDnaJ基因，分离克隆该基因，并首次在玉米中过量表达了ZmDnaJ基因，证实了玉米ZmDnaJ基因具有可提高植物耐旱性的功能，为培育耐旱转基因植物提供了新思路。对农作物抗旱育种及生产应用具有重要的指导意义，具有广阔的应用前景。

Description

一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用。
背景技术
玉蜀黍(学名：Zeamays L.)是禾本科、玉蜀黍属植物，俗称玉米。玉米原产于中美洲和南美洲，在全世界热带和温带地区广泛种植。其营养价值较高，是优良的粮食作物；也是食品、医疗卫生、轻工业、化工业等不可或缺的原料之一。
玉米对耐旱胁迫十分敏感，干旱导致玉米品质和产量降低。因此，研究抗旱相关基因，明确抗旱分子机制，提高玉米抗旱性非常重要。随着分子生物学技术的发展，将抗旱基因转入玉米中，使其在玉米中高效表达，从而提高玉米对逆境环境的适应性，提高玉米产量及品质已经成为目前研究的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用，以解决现有技术中缺少玉米抗旱基因的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了上述植物耐旱性相关基因ZmDnaJ编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的应用，通过过表达ZmDnaJ来提高植物的耐旱性。
优选的，所述过表达ZmDnaJ的方法包括以下步骤：
将克隆的ZmDnaJ构建至基因过表达载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至农杆菌中；
将农杆菌接种至作物，实现基因的过表达。
优选的，所述作物为玉米。
本发明还提供了一种检测上述植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的扩增引物，所述引物的上游5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了上述检测植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的扩增引物在作物性状相关研究中的应用，用于作物的抗旱性状辅助育种。
本发明还提供了一种过表达上述植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的重组载体，所述重组载体包括初始表达载体和基因ZmDnaJ。
优选的，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明还提供了上述过表达植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的重组载体在提高植物耐旱性中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明在玉米中发现ZmDnaJ基因，分离克隆该基因，并首次在玉米中过量表达了ZmDnaJ基因，证实了玉米ZmDnaJ基因具有可提高植物耐旱性的功能，为培育耐旱转基因植物提供了新思路。对农作物抗旱育种及生产应用具有重要的指导意义，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为农杆菌侵染及共培养玉米以及组培转基因玉米的照片；
图2为荧光定量检测各株系过表达玉米基因表达量结果；
图3为各株系玉米苗期干旱处理后存活率鉴定结果；
图4为各株系玉米苗期抗旱性鉴定结果；
图5为过表达植株叶片失水速率测定结果；
图6为过表达植株叶片ABA含量测定结果；
图7为过表达植株生物量测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1基因克隆及载体构建
取三叶期玉米幼苗叶片，液氮速冻研磨，使用全能型植物RNA提取试剂盒(OminiPlant RNAKit，康为世纪，北京，中国)提取总RNA。使用EasyScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。
ZmDnaJ基因：序列为AAACAAGCTGAAATATCTGCAGAAAAATAACCGGCCAGC CCTGGAGCTGCTTCTCGGCTCTTCCAACATCCCGTACCTGCCACCGTTCAGTTCAGTCTTCAGTTATCCGCTGCCACTGCCAGGCGACCAACAAGTGACCGTGGATCAGGCATGCCTGCGCTTCTCGTGAACACCGTCTCGGTCTCCCCCGCCGCCTCAAGGCTAGGCTCCTCGCGGCCCGCCACGGCACGGCGAGCAGCAAGCGCCCGCCACGGCCACAGGTGCCGAGCCGAAGCATCCGGCAGCTCGTGGGTGTCGGACTACGACCTGTACGAGCTGCTGGGCGTGGAGCGGTCCTCGCCGCAGTCGGAGATCAAGGCGGCGTACCGGTCGCTGCAGAAGCGGTGCCACCCGGACGTGGCCGGCGCCGCCGGCGGCCACGACATGGCCGTCGTCCTCAACGAGGTGTACGCGCTGCTCTCCGACCCGGACGCGCGCCTGGCCTACGACCAGGAGCAGGCGCGCCGCTCCGAGTTCGCCGGCTACACGGGCCGCCCGCTATACTCCTCCTGGGTCGGCGCCGAGTCCGAGCGCCGGGCGGTGTTCGTCGACGAGGTGCGCTGCGTCGGCTGCCTCAAGTGCGCGCTCCACGCGTCCCGGACCTTCGCCGTCGAGTCCGTCTACGGCCGCGCCCGCGCCGTCGCACAGTGGGCCGACGACGAGGACAGGATCGTCGACGCCATCAACACCTGCCCCGTCGACTGCATCTCGTACGTAAACTCACTCTTCGTCGTCCATGCGCATCCCATGCATCGTCATCGGCGATCGGTCTTCTGATTATTCCCCACGGCCGGCCGTCCAGGATGGTGGAGAGGTCGGACCTGGCGGCTCTCGAGTTCTTGATGTCCAAGCAACCGCGCGGCAGAGTCCGCGTCTCCGAAGGCAACGCGGTGGGAGCTCGCGCGCCCAACATCTTCAACGAAGTCGCCAAGTTCAAGAAAAGGTTCGATGAGATGAAGCAGAAATCTGCGGCCAGAGAATTCCAGGTGATCGCTCACTGTTTCTGTCTTCTCCGTTGTTCGTCTGAAACTGACACGACCGAACGCTGCCTGCGCAGGAGTCGGAGGCGGCACGGCAGTCGAGGACTTCAGCAGTCCACGCCATCAGATCCATGTCGAACTGGTGGTACTGGCGGCCATTCGGGTTCGGGCCATCGGCCCCGGTCACCATTGTCCTCGCTTCGCGCCTCCTGCCGCCGCCGCCGGCGGCACCCGCTGACCCCGTGACGGAGAGGCTCCAAGAAGCAGCCGCCGCCCGGCGCAAGACGGGAGGCGCGGCCACGGCGCACGCAGGGCGCGAAGACTACTGGACCCCGCAGCTGAACCTGCCGTCGTCAGCTTCTCCGCCGAGCATTCACCAGAGGGGAAGGGGCACTCCCACTCCCCAAGGCCACGGCCGCAGGCGAGGAGCAGCCGGTGAAGCGACCGTCGCCGGGAGGAAGGGCATAAGCATCGACCTGACGGCGCCGCTGCTATTGGGGATCGTCGCGGCGGGGTTCGTGAGTTACAACGGGGAGCAGGTGGCCGGAGGTGGCAGCGGCATTCAGGAGCATGTTGGCGGCGCCATCGCTCTTGGAGTCGTCAACAGCTTTGAAATGAAGGTCGTTCTGGCCGGGGTGACTTGGTCCATCATCGGCGCAGCCATTGCCGGTGTGATTCAGGTACTCGGAAGAAGGGAAGAGGACATTTGGAAATGAAGATACTTGTCGAATCCGTGTGTGTGTATATACACAGAAAATTGTGTACATATGTAATCCTGCACAAATATGGGTGGCTGGCTGTTTTATAGAATCACTTGGGGTAGCTCATGCGGGCCTAGAAAAGGTAGAAAAAGTCGGAACTCCTTGTCACCCTACATCCCAAAAGAATTTGCAGTTCTAACATAATAATTTGCGGTGCT，如SEQ IDNO.1所示
ZmDnaJ基因编码蛋白质的氨基酸序列为：MPALLVNTVSVSPAASRLGSSRPATARR AASARHGHRCRAEASGSSWVSDYDLYELLGVERSSPQSEIKAAYRSLQKRCHPDVAGAAGGHDMAVVLNEVYALLSDPDARLAYDQEQARRSEFAGYTGRPLYSSWVGAESERRAVFVDEVRCVGCLKCALHASRTFAVESVYGRARAVAQWADDEDRIVDAINTCPVDCISMVERSDLAALEFLMSKQPRGRVRVSEGNAVGARAPNIFNEVAKFKKRFDEMKQKSAAREFQESEAARQSRTSAVHAIRSMSNWWYWRPFGFGPSAPVTIVLASRLLPPPPAAPADPVTERLQEAAAARRKTGGAATAHAGREDYWTPQLNLPSSASPPSIHQRGRGTPTPQGHGRRRGAAGEATVAGRKGISIDLTAPLLLGIVAAGFVSYNGEQVAGGGSGIQEHVGGAIALGVVNSFEMKVVLAGVTWSIIGAAIAGVIQVLGRREEDIWK，如SEQ ID NO.2所示。
用NCBI网站Primeblast设计ZmDnaJ基因的扩增引物，具体序列如表1所示：
表1双构建子叶植物表达载体引物设计
Figure BDA0004039698590000031
按下表2所示反应体系加样，进行扩增。温度循环程序为：95℃3min；95℃30s，58℃30s，72℃90s，30个循环；72℃5min；4℃保持。
表2PCR扩增反应体系
Figure BDA0004039698590000032
对PCR产物进行回收。将回收产物进行双酶切，按表3反应体系进行加样。将酶切体系混匀，置于37℃水浴锅中，酶切1～2h，酶切产物加入上样缓冲液后，直接电泳，回收酶切产物，按下表4进行酶切片段连接。
表3双酶切加样体系
Figure BDA0004039698590000041
表4连接反应体系
Figure BDA0004039698590000042
连接产物转化大肠杆菌，并进行菌落PCR检测。提取重组质粒经限制性内切酶双酶切鉴定之后，重组质粒菌液送测序公司进行DNA的序列测序鉴定，得到测序正确的质粒(序列为：CACATACAAATGGACGAACGGATAAACCTTTTCACGCCCTTTTAAATATCCGTTATTCTAATAAACGCTCTTTTCTCTTAGGTTTACCCGCCAATATATCCTGTCAAACACTGATAGTTTAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCCAAGCTCAAGCTGCTCTAGCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTACGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCCATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTGTTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTCTGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTCCGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGCCCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCTTTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATTAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGTGTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAGTAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTGTCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTATTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAATTATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTTTTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCATGCCTGCGCTTCTCGTGAACACCGTCTCGGTCTCCCCCGCCGCCTCAAGGCTAGGCTCCTCGCGGCCCGCCACGGCACGGCGAGCAGCAAGCGCCCGCCACGGCCACAGGTGCCGAGCCGAAGCATCCGGCAGCTCGTGGGTGTCGGACTACGACCTGTACGAGCTGCTGGGCGTGGAGCGGTCCTCGCCGCAGTCGGAGATCAAGGCGGCGTACCGGTCGCTGCAGAAGCGGTGCCACCCGGACGTGGCCGGCGCCGCCGGCGGCCACGACATGGCCGTCGTCCTCAACGAGGTGTACGCGCTGCTCTCCGACCCGGACGCGCGCCTGGCCTACGACCAGGAGCAGGCGCGCCGCTCCGAGTTCGCCGGCTACACGGGCCGCCCGCTATACTCCTCCTGGGTCGGCGCCGAGTCCGAGCGCCGGGCGGTGTTCGTCGACGAGGTGCGCTGCGTCGGCTGCCTCAAGTGCGCGCTCCACGCGTCCCGGACCTTCGCCGTCGAGTCCGTCTACGGCCGCGCCCGCGCCGTCGCACAGTGGGCCGACGACGAGGACAGGATCGTCGACGCCATCAACACCTGCCCCGTCGACTGCATCTCGATGGTGGAGAGGTCGGACCTGGCGGCTCTCGAGTTCTTGATGTCCAAGCAACCGCGCGGCAGAGTCCGCGTCTCCGAAGGCAACGCGGTGGGAGCTCGCGCGCCCAACATCTTCAACGAAGTCGCCAAGTTCAAGAAAAGGTTCGATGAGATGAAGCAGAAATCTGCGGCCAGAGAATTCCAGGAGTCGGAGGCGGCACGGCAGTCGAGGACTTCAGCAGTCCACGCCATCAGATCCATGTCGAACTGGTGGTACTGGCGGCCATTCGGGTTCGGGCCATCGGCCCCGGTCACCATTGTCCTCGCTTCGCGCCTCCTGCCGCCGCCGCCGGCGGCACCCGCTGACCCCGTGACGGAGAGGCTCCAAGAAGCAGCCGCCGCCCGGCGCAAGACGGGAGGCGCGGCCACGGCGCACGCAGGGCGCGAAGACTACTGGACCCCGCAGCTGAACCTGCCGTCGTCAGCTTCTCCGCCGAGCATTCACCAGAGGGGAAGGGGCACTCCCACTCCCCAAGGCCACGGCCGCAGGCGAGGAGCAGCCGGTGAAGCGACCGTCGCCGGGAGGAAGGGCATAAGCATCGACCTGACGGCGCCGCTGCTATTGGGGATCGTCGCGGCGGGGTTCGTGAGTTACAACGGGGAGCAGGTGGCCGGAGGTGGCAGCGGCATTCAGGAGCATGTTGGCGGCGCCATCGCTCTTGGAGTCGTCAACAGCTTTGAAATGAAGGTCGTTCTGGCCGGGGTGACTTGGTCCATCATCGGCGCAGCCATTGCCGGTGTGATTCAGGTACTCGGAAGAAGGGAAGAGGACATTTGGAAATGAGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGCTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGT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ATTCCACGGCGTCGGTGCCTGGTTGTTCTTGATTTTCCATGCCGCCTCCTTTAGCCGCTAAAATTCATCTACTCATTTATTCATTTGCTCATTTACTCTGGTAGCTGCGCGATGTATTCAGATAGCAGCTCGGTAATGGTCTTGCCTTGGCGTACCGCGTACATCTTCAGCTTGGTGTGATCCTCCGCCGGCAACTGAAAGTTGACCCGCTTCATGGCTGGCGTGTCTGCCAGGCTGGCCAACGTTGCAGCCTTGCTGCTGCGTGCGCTCGGACGGCCGGCACTTAGCGTGTTTGTGCTTTTGCTCATTTTCTCTTTACCTCATTAACTCAAATGAGTTTTGATTTAATTTCAGCGGCCAGCGCCTGGACCTCGCGGGCAGCGTCGCCCTCGGGTTCTGATTCAAGAACGGTTGTGCCGGCGGCGGCAGTGCCTGGGTAGCTCACGCGCTGCGTGATACGGGACTCAAGAATGGGCAGCTCGTACCCGGCCAGCGCCTCGGCAACCTCACCGCCGATGCGCGTGCCTTTGATCGCCCGCGACACGACAAAGGCCGCTTGTAGCCTTCCATCCGTGACCTCAATGCGCTGCTTAACCAGCTCCACCAGGTCGGCGGTGGCCCATATGTCGTAAGGGCTTGGCTGCACCGGAATCAGCACGAAGTCGGCTGCCTTGATCGCGGACACAGCCAAGTCCGCCGCCTGGGGCGCTCCGTCGATCACTACGAAGTCGCGCCGGCCGATGGCCTTCACGTCGCGGTCAATCGTCGGGCGGTCGATGCCGACAACGGTTAGCGGTTGATCTTCCCGCACGGCCGCCCAATCGCGGGCACTGCCCTGGGGATCGGAATCGACTAACAGAACATCGGCCCCGGCGAGTTGCAGGGCGCGGGCTAGATGGGTTGCGATGGTCGTCTTGCCTGACCCGCCTTTCTGGTTAAGTACAGCGATAACCTTCATGCGTTCCCCTTGCGTATTTGTTTATTTACTCATCGCATCATATACGCAGCGACCGCATGACGCAAGCTGTTTTACTCAAATACACATCACCTTTTTAGACGGCGGCGCTCGGTTTCTTCAGCGGCCAAGCTGGCCGGCCAGGCCGCCAGCTTGGCATCAGACAAACCGGCCAGGATTTCATGCAGCCGCACGGTTGAGACGTGCGCGGGCGGCTCGAACACGTACCCGGCCGCGATCATCTCCGCCTCGATCTCTTCGGTAATGAAAAACGGTTCGTCCTGGCCGTCCTGGTGCGGTTTCATGCTTGTTCCTCTTGGCGTTCATTCTCGGCGGCCGCCAGGGCGTCGGCCTCGGTCAATGCGTCCTCACGGAAGGCACCGCGCCGCCTGGCCTCGGTGGGCGTCACTTCCTCGCTGCGCTCAAGTGCGCGGTACAGGGTCGAGCGATGCACGCCAAGCAGTGCAGCCGCCTCTTTCACGGTGCGGCCTTCCTGGTCGATCAGCTCGCGGGCGTGCGCGATCTGTGCCGGGGTGAGGGTAGGGCGGGGGCCAAACTTCACGCCTCGGGCCTTGGCGGCCTCGCGCCCGCTCCGGGTGCGGTCGATGATTAGGGAACGCTCGAACTCGGCAATGCCGGCGAACACGGTCAACACCATGCGGCCGGCCGGCGTGGTGGTGTCGGCCCACGGCTCTGCCAGGCTACGCAGGCCCGCGCCGGCCTCCTGGATGCGCTCGGCAATGTCCAGTAGGTCGCGGGTGCTGCGGGCCAGGCGGTCTAGCCTGGTCACTGTCACAACGTCGCCAGGGCGTAGGTGGTCAAGCATCCTGGCCAGCTCCGGGCGGTCGCGCCTGGTGCCGGTGATCTTCTCGGAAAACAGCTTGGTGCAGCCGGCCGCGTGCAGTTCGGCCCGTTGGTTGGTCAAGTCCTGGTCGTCGGTGCTGACGCGGGCATAGCCCAGCAGGCCAGCGGCGGCGCTCTTGTTCATGGCGTAATGTCTCCGGTTCTAGTCGCAAGTATTCTACTTTATGCGACTAAAACACGCGACAAGAAAACGCCAGGAAAAGGGCAGGGCGGCAGCCTGTCGCGTAACTTAGGACTTGTGCGACATGTCGTTTTCAGAAGACGGCTGCACTGAACGTCAGAAGCCGACTGCACTATAGCAGCGGAGGGGTTGGATCAAAGTACTTTGATCCCGAGGGGAACCCTGTGGTTGGCATG，如SEQ ID NO.5所示)，用于于下一步玉米过表达转化。
实施例2玉米遗传转化
采用农杆菌介导法将含ZmDnaJ的过表达载体转化玉米KN5585自交系，方法如下：
将玉米外壳去掉，进行消毒及取幼胚，挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.2的农杆菌重悬液，在幼胚中加入制备好的农杆菌菌液，进行侵染。将侵染完成的幼胚通过植物组织培养得到转基因玉米植株，农杆菌侵染及共培养玉米、组培中得到的愈伤组织、分化出的幼苗以及生根的转基因玉米的照片如图1所示。
实施例3目的基因检测
采用实施例2得到的转基因玉米植株，进行总RNA提取及反转录：
(1)RNA提取中使用的塑料制品均用NaOH浸泡10min并用蒸馏水清洗干净，经高温高压灭菌30min，烘干备用；非塑料制品180℃烘烤6h后放-70℃备用。
(2)使用液氮研磨方法提取总RNA。叶片迅速剪碎后，放入经液氮预冷的研钵中，速加液氮并立即快速研磨两次。
(3)使用全能型植物RNA提取试剂盒(OminiPlant RNAKit，康为世纪，北京，中国)提取总RNA。
(4)取溶解的RNA样品，用核酸蛋白测定仪测定总RNA的浓度，检测其纯度，并用1％的琼脂糖凝胶快速检测其质量。
(5)使用EasyScript一步法gDNA去除及cDNA合成试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)，以总RNA为模板进行cDNA的合成。20μL反应体系如表5所示。反应条件为42℃15min，85℃5s，4℃保持。
表5反转录反应体系
Figure BDA0004039698590000101
转基因玉米ZmDnaJ表达量检测：(1)设计qRT-PCR引物如表6所示，以cDNA为模板，按反应体系加样表7，进行qRT-RCR反应，94℃30s，循环程序为；94℃5s；60℃30s；72℃20s；30个循环。(2)利用软件LC96和2-△△CT算法，计算分析转基因玉米中ZmDnaJ的相对表达量。
表6qRT-PCR引物设计
Figure BDA0004039698590000102
表7荧光定量反应体系
Figure BDA0004039698590000103
(3)荧光定量检测各株系过表达玉米基因表达量结果如表8和图2所示。
表8荧光定量数据结果
Figure BDA0004039698590000104
Figure BDA0004039698590000111
结果显示，经过qRT-PCR检测，目的基因在转基因玉米中高表达，且OE5、OE13和OE14表达量最高，因此挑选纯合转基因株系OE5、OE13和OE14用于后续研究。
实施例4纯和株系耐旱性分析
将实施例3得到的OE5、OE13和OE14和野生型KN5585(WT)播种在营养土和蛭石比例为1:1的土壤中，放置于培养室培养。对照组及实验组在三叶期前正常浇水，三叶期以后，对照组正常浇水，隔一天对土壤含水量进行测定，使水分保持在70％左右；对照组采用人为不浇水处理，同样每隔一天进行土壤含水量测定，当土壤含水量为20％左右界定为干旱处理。干旱2个星期后，复水观察各株系的存活率及其他相关指标，其中各株系玉米苗期干旱处理后存活率鉴定结果如图3所示；各株系玉米苗期抗旱性鉴定结果照片如图4所示，其中；对三个过表达株系及野生型进行离体叶片失水速率检测，通过电子天平对离体叶片进行称量，每隔半小时对重量进行称重记录，最后通过计算得到测定结果如图5所示；采用HPLC-UV外标法对三个过表达株系及野生型进行脱落酸(ABA)含量检测，测定结果如图6所示；对单株植物的生物量进行统计，测定结果如图7所示。
存活率结果如表9所示：
表9存活率结果
Figure BDA0004039698590000112
对结果进行分析：
由图3～4可知，在正常浇水条件下，OE5、OE13、OE14和野生型KN5585(WT)差异不显著。三叶期以后，干旱胁迫处理14天后，我们可以观察到野生型干枯萎蔫，存活率显著低于三个过表达株系；而过表达株系在干旱胁迫后叶子依旧嫩绿，强壮，表明过表达ZmDnaJ基因显著提高了玉米植株耐旱性。
由图5可知，各株系在前4个小时前失水速率无明显差别，而在4.5小时后野生型失水速率显著高于过表达株系，表明ZmDnaJ基因过表达后可以有效减少蒸腾作用，从而锁住水分，抵御干旱胁迫。
由图6可知，在正常浇水条件下，ABA含量无显著差异；而干旱胁迫后，野生型及过表达株系ABA含量都有增加，且过表达株系比野生型ABA含量增加更加显著。
由图7可知，干旱胁迫以后，过表达株系茎的重量及根重都显著高于野生型。
由以上实施例可知，本发明提供了植物耐旱性相关基因ZmDnaJ及其扩增引物、重组载体和应用，所述ZmDnaJ基因可提高植物的耐旱性，为培育抗干旱转基因植物提供了新思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物耐旱性相关基因ZmDnaJ，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的应用，其特征在于，通过过表达ZmDnaJ来提高植物的耐旱性。
4.根据权利要求3所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的应用，其特征在于，所述过表达ZmDnaJ的方法包括以下步骤：
将克隆的ZmDnaJ构建至基因过表达载体中，得到重组载体；
将所得重组载体转化至农杆菌中；
将农杆菌接种至作物，实现基因的过表达。
5.根据权利要求3或4所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的应用，其特征在于，所述作物为玉米。
6.一种检测权利要求1所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的扩增引物，其特征在于，所述引物的上游5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物5’端到3’端的序列如SEQID NO.4所示。
7.权利要求6所述的检测植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的扩增引物在作物性状相关研究中的应用，其特征在于，用于作物的抗旱性状辅助育种。
8.一种过表达权利要求1所述的植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括初始表达载体和基因ZmDnaJ。
9.根据权利要求8所述的过表达植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的重组载体，其特征在于，所述重组载体的序列如SEQ ID NO.5所示。
10.权利要求8或9所述的过表达植物耐旱性相关基因ZmDnaJ的重组载体在提高植物耐旱性中的应用。
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