CN116083441A - 葡萄VvHAK5基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种葡萄VvHAK5基因及其应用，属于基因工程技术领域。本发明的葡萄VvHAK5基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的VvHAK5基因在根中表达量最高，缺钾条件下在根和茎中表达量显著上调。采用酵母系统检测VvHAK5基因编码蛋白的钾转运活性，结果证实其能够在外界钾离子浓度偏低时发挥功能。通过构建VvHAK5过量表达载体，转化烟草并获得VvHAK5转基因烟草，发现过量表达VvHAK5基因可提高烟草的钾离子含量。本发明鉴定和证实了葡萄VvHAK5基因在钾离子转运中的功能，为其在葡萄中的应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种葡萄VvHAK5基因及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
钾是植物中需求量最多的阳离子，能够参与植物各种生命活动，包括：生长发育、胁迫响应、蛋白合成、酶的激活、光合作用、渗透调节等。由于钾离子容易在土壤中被固定，其他元素(如：Na+、NH4 +等)也会干扰钾离子的有效吸收，导致缺钾现象常常发生。植物短期缺钾会导致叶片黄化，根系生长停滞；长时间缺钾则会直接影响植株生长，导致叶片坏死，植株矮小，产量和品质降低。因此，钾对植物至关重要。
在分子水平上，植物主要通过钾离子转运蛋白和通道蛋白调控钾离子的吸收和转运。已有研究表明，植物体内的钾离子转运蛋白主要分为HAK/KUP/KT家族、HKT家族和CPA家族，钾离子通道蛋白主要分为Shaker家族和TPK家族。其中，HAK/KUP/KT家族广泛存在于高等植物中，是成员数量最多的一类钾离子转运蛋白，蛋白结构含多个保守的跨膜结构域，可定位于不同的细胞器膜以发挥功能。拟南芥AtHAK5是最早被鉴定的HAK蛋白，研究表明外界钾离子浓度偏低时，AtHAK5能够被诱导，促进钾离子的高效吸收和转运，维持细胞内的钾离子水平，保证根系和植株的正常生长。一些其他的HAK家族蛋白也相继被鉴定和研究，如拟南芥AtKUP7(Han et al.,2016)、水稻OsHAK5(Yang et al.,2014)、玉米ZmHAK1/ZmHAK5(Qin et al.,2019)等。可见，HAK钾离子转运蛋白在植物钾离子的高效利用中发挥着关键作用。
葡萄是重要的钾质果树，对钾的需求量极高，生产上常需施用大量钾肥以维持葡萄对钾的需求。从葡萄中鉴定钾离子转运蛋白，有助于从分子水平上解析其钾离子转运机制，提高对钾素的利用效率，缓解生产上由于钾肥施用不足导致的缺钾胁迫，提高葡萄的产量和品质。
发明内容
本发明的目的是提供能够促进钾离子转运的葡萄VvHAK5基因。
本发明还提供了葡萄VvHAK5基因在植物种质资源改良中的应用以及在促进植物钾离子吸收或转运中的应用。
为了实现以上目的，本发明提供的葡萄VvHAK5基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的葡萄VvHAK5基因为葡萄中的一个钾离子转运蛋白基因，其编码序列(CDS)长度为2448bp，编码815个氨基酸，通过实时荧光定量检测该基因的表达情况，结果显示其在根中表达量最高，缺钾条件下在根和茎中表达量显著上调，表明该基因能够被缺钾诱导。采用酵母系统检测VvHAK5基因编码蛋白的钾转运活性，结果证实其能够在外界钾离子浓度偏低时发挥功能，证明VvHAK5是一个钾离子转运蛋白。通过构建VvHAK5瞬时表达载体，在本氏烟草中表达，观察亚细胞定位，表明VvHAK5定位于细胞膜。通过构建VvHAK5过量表达载体，转化烟草并获得VvHAK5转基因烟草，发现过量表达VvHAK5基因可提高烟草的钾离子含量。本发明鉴定和证实了葡萄VvHAK5基因在钾离子转运中的功能，为其在葡萄中的应用奠定了基础。
进一步地，所述葡萄VvHAK5基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用包括如下步骤的方法克隆得到葡萄VvHAK5基因：从葡萄组织中提取总RNA，并将提取得到的总RNA反转录得到cDNA第I链；通过PCR扩增反应获得葡萄VvHAK5基因的编码区片段，将得到葡萄VvHAK5基因的编码区片段连接载体后，导入感受态细胞中，经菌落PCR验证为阳性克隆后进行测序，得到植物表达载体。所采用的载体优选为pSAK277载体，所采用的感受态细胞优选为大肠杆菌DH5α感受态细胞。
进一步地，用于PCR扩增葡萄VvHAK5基因的特异性引物如下：
VvHAK5-F：5'-TAGTGGATCCAAAGAATTCATGGATGAGGAAGAGATGGA-3'；
VvHAK5-R：5'-CGAGAAGCTTTTTGAATTCTCATATCTCATATGTCATTCC-3'。
本发明的葡萄VvHAK5基因的应用所采用的技术方案为：
上述的葡萄VvHAK5基因在植物种质资源改良中的应用。上述的葡萄VvHAK5基因在植物种质资源改良中应用的目的是促进植物钾离子的转运和吸收。
进一步地，所述植物为双子叶植物，例如为葡萄或烟草。通过构建VvHAK5过量表达载体，转化烟草并获得VvHAK5转基因烟草，发现过量表达VvHAK5基因可提高烟草的钾离子含量。
上述的葡萄VvHAK5基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用。
进一步地，上述葡萄VvHAK5基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，包括以下步骤：利用基因工程手段在植物中过量表达葡萄VvHAK5基因。例如，采用农杆菌介导法将葡萄VvHAK5基因转入到植物中，获得葡萄VvHAK5基因过量表达的植株。具体地，将葡萄VvHAK5基因构建到植物表达载体上，转化农杆菌，然后转化目标植物，获得转基因稳定遗传植株。
进一步地，所述植物为双子叶植物，例如为葡萄或烟草。
附图说明
图1为葡萄VvHAK5基因的克隆与序列分析结果示意图；其中，图1A为VvHAK5的琼脂糖凝胶电泳图，M：Marker；图1B为SMART在线分析VvHAK5蛋白保守结构域结果图，K_trans：钾转运跨膜结构域；图1C为葡萄、拟南芥和水稻中的所有HAK家族蛋白进化树示意图；
图2为葡萄VvHAK5实时荧光定量分析结果示意图；图2A为VvHAK5在不同葡萄组织中的表达量比较图；图2B为根缺钾处理过程中VvHAK5在不同时间点的表达量的比较图；图2C为茎缺钾处理过程中VvHAK5在不同时间点的表达量的比较图；
图3为R5421酵母系统检测VvHAK5的钾离子转运活性结果图；
图4为葡萄VvHAK5亚细胞定位结果图；
图5为转基因烟草与野生型烟草的生长状况及钾离子含量比较结果图，其中图5A为转基因烟草与野生型烟草的生长状况比较图，图5B为转基因烟草与野生型烟草钾离子含量比较图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
以下实施例1是对本发明的葡萄VvHAK5基因的克隆，实施例2是实施例1中构建的pSAK277-VvHAK5表达载体转化烟草的方法。
实施例1葡萄VvHAK5基因的克隆
从‘巨峰’葡萄的叶片中克隆获取VvHAK5基因，具体方法包括以下步骤：
1)用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取葡萄叶片中的总RNA，用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Vazyme，南京)反转录成cDNA第I链。
2)以cDNA第I链为模板，以VvHAK5-F和VvHAK5-R为引物，通过PCR扩增反应从cDNA第I链中克隆VvHAK5基因编码区片段。引物VvHAK5-F和VvHAK5-R的序列如下：
VvHAK5-F：5'-TAGTGGATCCAAAGAATTCATGGATGAGGAAGAGATGGA-3'；
VvHAK5-R：5'-CGAGAAGCTTTTTGAATTCTCATATCTCATATGTCATTCC-3'。
PCR反应体系为：25μL 2×Takara PrimerSTAR Max DNA Polymerase，1μL cDNA模板，2μL正向和反向引物，20μL ddH2O。
PCR扩增程序为：98℃10sec，55℃10sec，72℃15sec(以上反应进行35个循环)。
3)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并采用市售无缝克隆试剂盒(碧云天，上海)与酶切后的pSAK277载体连接，体系为：10-100ng纯化的目的基因，50-100ng线性化载体，10μL 2×seamless cloning mix，用ddH2O补足至20μL。转化大肠杆菌DH5α感受态后，送测序公司测序验证，得到pSAK277-VvHAK5表达载体。
本实施例中扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后检测到的条带大小如图1A所示，测序结果表明：葡萄VvHAK5基因编码区(CDS)全长2448bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码的蛋白质为：
MDEEEMERREAATDEGTDTAIEADENKLKERKVSWAKLRRVDSLNLEAGRVSTAGGHTSKVDWRRTLNLAFQSIGVVYGDIGTSPLYVFSSTFTDHKIENTDDILGVLSLVIYTIVLVPLLKYVLIVLRANDNGDGGTFALYSLICRYARVSLIPNDQPEDRQLSNYKLDTPSNQLRRAQKIKEKLENSRTSKVVLFIVTILGTSMVIGDGVLTPCISVLSAVSGISSLGKDAIVGISVAILILLFSAQRFGTDKVGIAFAPVILLWFTFISGIGLYNLFKYNVGVLRAFNPKYAVDYFKRNGKKGWISLGGVVLCITGTEAMFADLGHFNIRAIQISFSGIVFPALLAAYSGQAAYLTKFPGEVEHTFYSSIPDPLYWPTFVVAVAAAIIASQAMISGAFAIISQSLSLCCFPRVKVVHTSAKYEGQVYIPEVNYLLMVACVIVCVGFKTTEKIGNAYGIAVVAVMVITTCMVTLIMLVIWKTSIWWIALFLVVFSSIEVVYLSSVLYKFKQGGFLPLAFSFVLMAVMGIWHYVHKERYMFELRNKVSSDYIKDLAANPRINRVPGIGLLYSELVQGIPPIFPHFIANVPSIHSVLVFVSIKNIPISKVALEERFLFRHVEPRDYRMFRCVVRYGYKDVIEGSKEFERQLVENLKEFIRHEGYISEARAVEQMAEPVNLQHSTILVKDGKAGRSGRSSTVHMEEVLQQNPPRVSSGSIQSIHVGCKSTNSSSRMVTGPIQGAEEEMQIVQTAQEKGVVYLLGEAEVVAEEKSSLFKQIVVNYAYSFLRKNCRQGEKVLEIPRTRLLRVGMTYEI。
实施例2 pSAK277-VvHAK5表达载体转化烟草
将实施例1中构建的pSAK277-VvHAK5表达载体转入GV3101农杆菌中，并进行PCR验证，保存阳性克隆的农杆菌菌株；然后采用叶盘法(Horsh et al.1985)转化K326烟草，具体转化过程包括：
1)将实施例1中构建的pSAK277-VvHAK5表达载体转入GV3101农杆菌中，并进行PCR验证，保存阳性克隆的农杆菌菌株；
2)菌体活化：将保存的农杆菌在含抗生素的LB平板上划线，30℃培养2-3d，再用接种环挑取单克隆在同样的平板上划线，继续培养3d。
3)侵染：刮取平板上的菌斑用MS培养基摇散，调整OD600＝0.6-0.8。切取烟草叶片，放入菌液中侵染10min。
4)共培养：侵染完成后清洗干净叶片，放入MS共培培养基(MS+2mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA)中培养3d。
5)筛选培养：共培养后的叶片用无菌水清洗后，平铺至MS筛选培养基(MS共培培养基+50mg/L Kan+500mg/L Cef)，继续培养直至长出不定芽。
6)生根培养：当不定芽长大后转移至生根培养基(MS+0.3mg/L NAA+50mg/LKan+500mg/L Cef)中直至长根，然后提取叶片DNA进行PCR阳性鉴定。鉴定为阳性的植株经过炼苗后种植于培养基质中，直至收获T0代种子。
7)将采收的T0代种子播种，植株长大后进行阳性鉴定，之后收获T1代种子；再播种T1代种子，经鉴定获得T1代转基因阳性植株，收获其种子进行播种最终获取T2代转基因阳性植株。
实验例1
用SMART工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析VvHAK5蛋白的保守结构域，结果如图1B所示。保守结构域分析表明VvHAK5蛋白含有一个典型的钾转运跨膜结构域。
HAK是植物中的高亲和性钾离子转运蛋白家族，能够定位于细胞的膜系统上参与钾离子的吸收和转运过程。通过BLAST比对在Ensembl Plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)中鉴定葡萄、拟南芥和水稻中的全部HAK家族蛋白序列，用ClustaX软件进行多序列比对，再用MEGA 5.0软件构建系统发育进化树，用在线iTOL工具(http://itol.embl.de/)进行进化树的美化，得到的葡萄、拟南芥和水稻中所有HAK家族蛋白进化树见图1C。通过将VvHAK5与葡萄、拟南芥、水稻中的所有HAK家族蛋白进行进化树分析，可知这些HAK蛋白可明显分为5个大类(Cluster)，VvHAK5属于ClusterⅠ，与水稻和拟南芥中的HAK5亲缘关系最近。
实验例2
通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测：
1)VvHAK5基因在葡萄的根、茎、叶、花和卷须等不同组织中的相对表达量；根、茎、叶、花、卷须便随着葡萄成年树生长季取样，样品经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中备用。
2)VvHAK5基因在葡萄根和叶在缺钾处理过程中的相对表达量；缺钾处理采用葡萄带有5片叶的组培苗。将B5培养基中的KNO3含量由正常的25mM降为0.01mM，其他组分不变；对照(CK)采用正常B5培养基。分别于处理后1d、4d和8d后取样，根和茎分别取样，样品经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中用于后续检测基因表达量。葡萄组培苗取葡萄成年树的茎段扦插获得，长期保存于实验室中。
本实验例中葡萄成年树材料取自河南科技大学(洛阳)葡萄资源圃，品种为‘巨峰’；实时荧光定量的引物通过NCBI上的primer-BLAST程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)合成，引物序列如下：
VvHAK5-q F：5'-TACAGAATGTTCCGCTGCGT-3'；
VvHAK5-q R：5'-TGGAGGTTCACTGGTTCAGC-3'。
qPCR反应体系为：5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix(TransGen，北京)，100ng cDNA模板(实施例1反转录得到)和1μM正反引物，用水补足10μL总体系。qPCR反应在CFX96 Touch real-time PCR仪器(Bio-Rad Laboratories，加州，美国)上进行。qPCR反应具体程序参考试剂盒说明书。每个样品4个重复。Ubiquitin作为内参基因，引物序列如下：
Ubiquitin F：5'-GGTGTTTCCAGTGGCGGACG-3'；
Ubiquitin R：5'-TCCTCCCCTCAGCTACGGGGTAT-3'。
基因相对表达量用2-ΔΔCT法计算。
通过检测VvHAK5基因在葡萄不同组织中的表达情况，结果表明VvHAK5基因在根中的表达量最高，其次是花，在茎、叶和卷须中的表达量较低(图2A)，这与其调控根中的钾离子转运的功能可能有关。
通过检测在缺钾处理过程中的表达情况，结果表明，VvHAK5基因的相对表达量在根中缺钾处理4d和8d均显著上调(图2B)，在茎中缺钾处理4d显著上调(图2C)，表明该基因能够受缺钾诱导，可能参与钾离子的吸收或转运过程。图2B和2C中，星号表示与对照(CK)相比的差异显著性(**P＜0.01，***P＜0.001)。
实验例3
为验证VvHAK5蛋白是钾离子转运蛋白，利用R5421酿酒酵母菌株检测其钾转运活性。R5421酿酒酵母菌株体内的钾离子转运子基因突变，不能正常转运钾离子，因此外界钾离子浓度偏低时不能正常生长，是研究钾离子转运蛋白的常用菌株。
将实施例1中纯化得到的VvHAK5基因编码区片段与酵母表达载体pRS416连接(连接方法同实施例1)，之后转化R5421酿酒酵母菌株，同时转化空载pRS416。将转化VvHAK5的R5421、转化空载的R5421和未转化的R5421酿酒酵母菌株分别在含不同浓度钾离子(100mM、5mM、0.5mM)的AP培养基(酷来搏科技，北京)上生长，分别稀释10倍、100倍和1000倍点斑，通过观察酵母菌斑生长状况确定VvHAK5的钾转运活性，结果如图3所示。
结果显示，通过将VvHAK5在R5421中表达后，随着钾离子浓度的降低，没有表达VvHAK5的R5421酿酒酵母菌株的生长明显被抑制，而转化了VvHAK5的酵母生长良好，从而证明VvHAK5具有钾离子转运活性。
实验例4
将VvHAK5编码区全长去掉终止密码子，连接101LYFP载体。将空载体和VvHAK5-101LYFP载体分别活化，用清洗液(10mM MES和10mM MgCl2)悬浮菌体，调整OD600为VvHAK5-101LYFP/101LYFP空载＝0.7:0.5，静置2-3h后用于注射。用一次性无菌注射器吸取菌液，注射于本氏烟草叶片背面。将烟草置于光照培养箱中培养2-3d后观察荧光。用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8，德国)在不同视野下观察荧光信号，结果见图4(标尺＝50μm，第二列表示膜标记基因mCherry荧光信号)。
通过检测VvHAK5的亚细胞定位(图4)，结果显示对照组(YFP空载，第一行)荧光信号分布在整个细胞，实验组(第二行)VvHAK5-101LYFP荧光信号集中在细胞膜上(第一列)，膜标记基因信号(mCherry)也集中在细胞膜上(第二列)，两者重叠场(第三列)基本重合，证明VvHAK5蛋白定位于细胞膜，这与其功能也是吻合的。
实验例5
将实施例2获取的T2代转基因阳性烟草植株(VvHAK5-OE)与野生型烟草植株(WT)在相同条件下(25±2℃，相对湿度65％，16h光照/8h黑暗，光照强度100μmol m-2s-1)进行培养，然后：
1)比较3周苗龄的转基因植株和野生型植株表型，结果如图5A所示，由图5A可以看出，正常状况下烟草转基因植株生长状况与野生型植株基本类似(图5A)。
2)比较野生型和转基因烟草叶片中的钾离子含量：
将野生型和转基因烟草叶片经高温(200℃)消化后，取0.1g粉末，用原子吸收分光光度计测定钾离子含量，根据标准曲线求得各个样品中的钾离子含量，结果用单位鲜重样品所含的钾毫克数(mg/g FW)表示。野生型和转基因系各取6个生物学重复，结果如图5B所示(图5B中，星号*表示P<0.05水平上差异显著。)，野生型烟草叶片中的钾离子含量为48.35mg/g FW(鲜重)，转基因烟草叶片中的钾离子含量为52.61mg/g FW(鲜重)。
结果表明转基因烟草叶片中的钾离子含量显著高于野生型，证明VvHAK5基因可提高钾离子吸收效率。
Claims (7)
1.葡萄VvHAK5基因，其特征在于：所述葡萄VvHAK5基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的葡萄VvHAK5基因，其特征在于：所述葡萄VvHAK5基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的葡萄VvHAK5基因在植物种质资源改良中的应用。
4.根据权利要求3所述的葡萄VvHAK5基因在植物种质资源改良中的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
5.如权利要求1或2所述的葡萄VvHAK5基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用。
6.根据权利要求5所述的葡萄VvHAK5基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：包括以下步骤：利用基因工程手段在植物中过量表达葡萄VvHAK5基因。
7.根据权利要求5或6所述的葡萄VvHAK5基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
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