CN117947085A - 葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运、植物种质资源改良中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运、植物种质资源改良中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明从‘巨峰’葡萄中克隆了VvSAP8基因，亚细胞定位显示其在细胞核和细胞质基质中均有定位。RT‑qPCR分析表明VvSAP8在葡萄根中高表达，且受缺钾处理诱导。将该基因在拟南芥中过表达，发现转基因拟南芥在缺钾条件下根系的生长情况明显好于野生型，表明该基因可提高缺钾耐受性。酵母单杂交和双荧光素酶报告实验表明该基因能够与钾离子转运蛋白VvHAK5启动子互作，激活其表达，表明VvSAP8基因能够调控钾离子转运。本发明证实了葡萄VvSAP8基因在提高缺钾耐受性和调控钾离子转运中的功能。
Description
技术领域
本发明涉及葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运、植物种质资源改良中的应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
钾是植物需求量最多的阳离子之一，也是肥料三元素(氮磷钾)之一，能够参与植物各种生命活动，包括：生长发育、胁迫响应、蛋白合成、酶的激活、光合作用、渗透调节等，几乎参与了植物生长发育的整个过程，是重要的品质元素。由于钾离子容易在土壤中被固定，其他元素(如：Na+、NH4 +等)也会干扰钾离子的有效吸收，导致缺钾现象常常发生。植物短期缺钾会导致叶片黄化，根系生长停滞；长时间缺钾则会直接影响植株生长，导致叶片坏死，植株矮小，产量和品质降低。
植物钾离子吸收和转运主要由两种功能蛋白控制，分别是钾离子转运蛋白和钾离子通道蛋白。其中，HAK(High affinity K+transporter)家族是研究的较多的钾离子转运蛋白家族。公开日为2023年05月09日、申请公布号为CN116083441A的中国发明专利公开了一种葡萄VvHAK5基因及其应用，具体公开了从葡萄中克隆到了VvHAK5基因，并证明了其在钾离子转运中的功能。
作为重要的“钾质果树”，葡萄对钾元素的需求量极大，而钾肥的价格普遍偏高，大多葡萄园区钾肥的供应远远不足，造成葡萄栽培区缺钾现象非常普遍。因此，发掘重要的调控基因提高葡萄对缺钾的耐受性，具有重要的研究价值和应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，以解决现有技术中葡萄对缺钾条件耐受性较差的问题。
本发明的第二个目的是提供葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，以解决现有技术中葡萄对缺钾条件耐受性较差的问题。
为了实现上述目的，本发明中葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用所采用的技术方案是：
葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，所述葡萄VvSAP8基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用为开拓性发明。本发明从‘巨峰’葡萄中克隆出葡萄VvSAP8基因，其编码序列(CDS)长度为519bp，编码172氨基酸，通过亚细胞定位显示其在细胞核和细胞质基质中均有定位。实时荧光定量PCR分析表明VvSAP8在葡萄根中高表达，且受缺钾处理诱导。将该基因在拟南芥中超表达，发现转基因拟南芥在缺钾条件下根系的生长情况明显好于野生型，表明该基因可提高缺钾耐受性。酵母单杂交实验和双荧光素酶报告实验表明该基因能够与钾离子转运蛋白VvHAK5启动子互作，激活其表达，表明VvSAP8基因能够调控钾离子转运。本发明鉴定和证实了葡萄VvSAP8基因在提高缺钾耐受性和调控钾离子转运中的功能，为其在葡萄中的应用奠定了基础。
作为进一步地改进，利用基因工程的手段在植物中过表达VvSAP8基因，促进植物钾离子吸收或转运。
具体地，采用农杆菌介导法将葡萄VvSAP8基因转入到植物中，获得葡萄VvSAP8基因过量表达的植株。具体地，将葡萄VvSAP8基因构建到植物表达载体上，转化农杆菌，然后转化目标植物，获得转基因稳定遗传植株。
作为进一步地改进，所述植物为双子叶植物。
作为进一步地改进，所述双子叶植物为葡萄、拟南芥。
为了实现上述目的，本发明中葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用所采用的技术方案是：
葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，所述葡萄VvSAP8基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述技术方案的有益效果在于：本发明的葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用为开拓性发明，上述的葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中应用的目的是促进植物钾离子的转运和吸收。
作为进一步地改进，所述植物种质资源改良为提高植物的缺钾耐受性。
作为进一步地改进，所述植物为双子叶植物。
作为进一步地改进，所述双子叶植物为葡萄、拟南芥。
附图说明
图1为本发明实施例1和2中葡萄VvSAP8基因克隆与序列分析图(其中，A为VvSAP8基因克隆胶图；B为VvSAP8与其他物种中的同源基因蛋白序列对比图；C为水稻、拟南芥和葡萄中的SAP家族基因进化树分析)；
图2为本发明实施例3中VvSAP8亚细胞定位结果图；
图3为本发明实施例4中VvSAP8基因表达分析图(其中，A-C为缺钾处理不同时间VvSAP8在根(A)、茎(B)和叶(C)中的相对表达量；D为VvSAP8在‘巨峰’葡萄不同组织中的相对表达量)；
图4为本发明实施例5中VvSAP8超表达系拟南芥缺钾耐受性分析(其中，A-B为三个VvSAP8超表达系和野生型(WT)拟南芥在含不同浓度钾离子的培养基上的生长情况(A)和根长测量结果(B)，星号表示与WT相比差异显著(**代表0.001<P<0.01，***代表P<0.001))；
图5为本发明实施例6中VvSAP8能够与VvHAK5的启动子互作结果(其中，A为VvHAK5启动子序列示意图，本实施例中用到的启动子序列记作：pro-VvHAK5；B为酵母单杂交实验结果；C为双荧光素酶报告实验载体示意图；D为双荧光素酶报告实验结果，LUC：萤火虫荧光素酶活性，REN：海肾荧光素酶活性，星号(**)表示在0.001<P<0.01水平上差异显著)。
具体实施方式
本发明前期从葡萄中克隆到了VvHAK5基因，证明了其在钾离子转运中的功能，利用其启动子进行酵母单杂交筛库，筛选到了一个调控VvHAK5基因表达的蛋白，通过序列分析发现其为A20/AN1型锌指蛋白VvSAP8。SAP(Stress-Associated Protein)家族蛋白属于锌指蛋白(ZFP，zinc-finger protein)，因为主要与胁迫有关而被命名。SAP蛋白通常含有两个保守结构域，分别是位于N端的A20锌指结构域和C端的AN1锌指结构域，因此也常被称作A20/AN1型锌指蛋白。SAP蛋白广泛存在于高等植物中，是多种非生物胁迫的调控蛋白，而其在缺钾和钾离子转运中的功能还未见报道。以此为基础，本发明从葡萄中克隆VvSAP8基因，研究了其在缺钾处理过程中的表达情况，分析了其亚细胞定位，证实了其通过调控VvHAK5基因调控钾离子转运，并通过异源转化拟南芥证明其可提高植株对缺钾的耐受性。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明之外，各实施例、实验例及对比例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell DW，Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实验材料：
本发明实施例中国所用植物材料包括：‘巨峰’葡萄成年树、‘无核白’和‘巨峰’葡萄组培苗、拟南芥种子和本氏烟草。在‘巨峰’葡萄成年树开花期分别采集其根、茎、叶、花和卷须，经液氮速冻后保存于-80℃冰箱中用于后续实验。
下述实施例中使用的引物序列如下表1所示。
表1引物序列
本发明葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运、植物种质资源改良中的应用的具体实施例：
实施例1葡萄VvSAP8基因的克隆
本实施例从‘巨峰’葡萄的叶片中克隆获取VvSAP8基因，具体实施操作如下：
1、以‘巨峰’葡萄叶片为材料，用植物多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)从中提取RNA，再用HiScript First Strand cDNA Synthesis Kit(诺唯赞)将RNA反转录成cDNA。
2、利用葡萄参考基因组数据中该基因的序列(序列号：Vitvi13g01755)设计正反向引物(引物序列见表1)，引物前端加上同源臂(载体pSAK277酶切位点处的一段15bp序列)。
以cDNA为模板，用高保真酶克隆VvSAP8基因编码区全长，反应体系(50μL)为：25μL高保真酶、1μLcDNA、2μL正向引物、2μL反向引物和20μL ddH2O。PCR扩增的程序如表2所示。
表2PCR扩增的程序
3、PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测条带大小。用胶回收试剂盒(聚合酶，北京)回收目标条带。采用市售无缝克隆试剂盒(碧云天，上海)与酶切后的pSAK277载体连接(注意酶切位点应与引物上的同源臂一致)，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑选阳性克隆菌液送测序公司测序。测序成功后摇菌，用质粒提取试剂盒(聚合酶，北京)提取其质粒，经酶切后跑胶检测条带是否正确，即为构建好的超表达载体：VvSAP8-pSAK277。
本实施例中从‘巨峰’葡萄中克隆得到了VvSAP8基因编码区序列(如图1的图1A所示)，全长519bp，编码172个氨基酸，葡萄VvSAP8基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，葡萄VvSAP8基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2葡萄VvSAP8基因的序列分析
本实施例对葡萄VvSAP8基因的序列进行分析，具体实施操作如下：
在Ensembl Plants数据库(http://plants.ensembl.org/index.html)中通过BLAST筛选出葡萄、拟南芥和水稻中的全部SAP家族蛋白序列，用ClustaX软件进行多序列比对，再用MEGA5.0构建系统发育进化树。在NCBI数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用VvSAP8蛋白序列进行Blast，筛选其他物种中的同源蛋白，用ClustaX软件进行多序列比对，用GENEDOC软件展示比对结果。
将其与其他物种中的同源基因进行比对，可见明显的A20 Zinc Finger和AN1Zinc Finger结构域(如图1的图1B所示)，证明克隆得到的VvSAP8属于A20/AN1家族锌指蛋白。将其与葡萄、拟南芥和水稻中的所有SAP家族基因进行进化树分析，结果表明VvSAP8与水稻中的OsSAP8、OsSAP4以及拟南芥中的AtSAP2亲缘关系较近(如图1的图1C所示)。
实施例3亚细胞定位
本实施例对VvSAP8蛋白的亚细胞定位进行分析，具体实施操作如下：
将实施例1克隆获得的VvSAP8编码区序列去掉终止密码子，按照实施例1的载体构建方法与101LYFP载体连接(引物序列见表1)。将空载体101LYFP、构建好的VvSAP8-101LYFP载体和核定位对照载体(mCherry)分别活化，用清洗液(10mM MES和10mM MgCl2)悬浮菌体，调整OD600为VvSAP8-101LYFP/mCherry:101LYFP空载＝0.7:0.5，静置2-3h后用于注射。用一次性无菌注射器吸取菌液，注射于本氏烟草叶片背面。将烟草置于光照培养箱中培养2-3d后观察荧光。用激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP8，德国)在不同视野下观察荧光信号。
检测结果如图2所示，通过观察YFP荧光，发现VvSAP8除定位于细胞核外，在细胞质基质中也有明显定位。
实施例4缺钾处理及实时荧光定量PCR分析
本实施例对VvSAP8基因表达进行分析，具体实施操作如下：
1、缺钾处理：
用含5-7片叶的‘无核白’葡萄组培苗进行缺钾处理，将组培苗转移至MS缺钾培养基(酷来搏，北京)中，分别于0h、6h、12h、24h、48h和72h后取样，根、茎和叶分别取样。样品经过液氮速冻后保存于-80℃冰箱中，用于后续实时荧光定量PCR实验。
2、实时荧光定量PCR：
用上述保存的‘巨峰’葡萄不同组织样品和‘无核白’葡萄缺钾处理后不同时间点的样品，用实施例1中的方法提取其总RNA，再反转录为cDNA。通过实时荧光定量PCR检测VvSAP8基因在这些样品中的相对表达量。实时荧光定量PCR的引物通过NCBI上的primer-BLAST程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计合成(引物序列见表1)。
实时荧光定量PCR反应体系为：5μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix(TransGen，北京)，100ng cDNA，1μM正向引物，1μM反向引物，用水补足至10μL。
反应在CFX96 Touch real-time PCR(Bio-Rad Laboratories，美国)上进行。反应具体程序参考试剂盒说明书和仪器默认设定。每个样品4个重复。Ubiquitin作为内参基因(引物序列见表1)。基因相对表达量用2-ΔΔCT法计算。
用实时荧光定量检测VvSAP8基因的表达量，结果如图3所示。由图中可以看出，在缺钾处理条件下，在根中，VvSAP8在处理72小时表达量最高(图3A)；在茎中，处理12小时表达量最高(图3B)；在叶中，处理48小时表达量最高(图3C)。检测不同组织中该基因的表达情况，发现其在根中表达量最高(图3D)。
实施例5拟南芥遗传转化和转基因拟南芥缺钾耐受性分析
本实施例为深入证明VvSAP8基因的功能，在双子叶模式生物拟南芥中过表达VvSAP8基因，并对转基因拟南芥进行缺钾耐受性分析，具体实施操作如下：
1、拟南芥遗传转化：
用浸花法和根癌农杆菌介导的遗传转化法将上述构建好的VvSAP8-pSAK277载体在拟南芥中进行遗传转化。具体方法为：将质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞：每100μL感受态加0.1μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟；加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃200rpm振荡培养2～3小时；离心收集菌，留取100μL左右轻轻吹打重悬菌块涂布于含卡那霉素的LB平板上，28℃培养箱培养2-3天；随机挑选1个单菌落，做菌落PCR，鉴定正确的农杆菌单克隆做标记待用。进行转化前，在MS培养基中播种野生型拟南芥实生苗，萌发后7-10天，选取健壮、生长一致的移栽到事先用花无缺浸过的培养土中，其上覆盖保鲜膜，苗活后揭去。用无菌枪头挑取上述做标记的农杆菌阳性单克隆接种到1.5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养24小时。按1％比例将小摇的农杆菌培养物接种加入100mL含有抗生素的LB液体培养基中，30℃振荡培养到OD600＝1.0左右。离心收集菌体，用转化缓冲液吹打均匀，重悬至OD600＝1.0左右。将正在抽苔开花的拟南芥植株提前一天浇足水，小盆倒置，将所有的花序倒置入悬浮好的菌液中约30秒。7天后按上述方法重复转化一次。2-3周后，尽量少浇营养液，加速衰老，成熟种子(T0代)收在纸袋中，干燥器中放置7天。收集的种子继续按照上述方法培养栽植，取叶片提取DNA，用卡那霉素抗性基因NPTⅡ上设计的正反向引物(见表1)鉴定转基因植株的阳性，用上述所述的实时荧光定量PCR法检测VvSAP8基因在超表达系和野生型中的表达量。阳性植株收获其T3代种子用于后续实验。
2、转基因拟南芥缺钾耐受性分析：
将上述获得的转基因拟南芥(共三个系：#1、#2和#19)和野生型播种于MS培养基中，萌发后10天，移栽长势一致的植株至含不同浓度KCl(1mM、500μM和200μM)的缺钾MS培养基(酷来搏，北京)中。培养皿直立放置于培养室中，观察植株根系生长情况，9天后测量根长，并拍照记录。检测结果如图4所示。
通过比较VvSAP8基因超表达系和野生型(WT)拟南芥在含不同浓度钾离子的培养基上的生长情况，发现钾离子浓度较高(1mM)时，野生型和超表达系长势一致，根长没有显著差异；而随着钾离子浓度的降低(500μM和200μM)，三个超表达系(#1、#2、#19)根系的生长情况明显好于WT(图4A)，根长显著高于WT(图4B)，证明超表达VvSAP8可提高拟南芥对缺钾的耐受性。
实施例6VvSAP8与VvHAK5的启动子互作分析
1、酵母单杂交实验
扩增VvHAK5(序列号：Vitvi01g00239)基因启动子上一段545bp的序列(记作：pro-VvHAK5)(引物序列见表1)，按照上述载体构建的方法与pAbAi载体连接，构成Bait载体；同时扩增VvSAP8基因编码区序列(引物序列见表1)与pGADT7载体连接，构成Prey载体。将Bait和Prey载体共同转化至Y1HGold酵母感受态中(以pGADT7空载作为阴性对照，以p53作为阳性对照)，用Matchmaker Gold Y1H Library Screening System(Clontech，美国)试剂盒，按照试剂盒说明进行酵母单杂交实验。最后观察酵母菌斑在SD/-Leu/-Ura和SD/-Leu/-Ura+不同浓度AbA的培养基上的生长情况，拍照记录。检测结果如图5所示。
2、双荧光素酶报告实验
扩增上述pro-VvHAK5序列与pGreenⅡ0800-Luc载体连接(引物序列见表1)，得到Reporter载体。将上述构建好的VvSAP8-pSAK277载体作为Effector载体(空载体pSAK277作为对照)。构建好的载体分别转化含有pSoup的农杆菌GV3101感受态中。农杆菌经活化后，用清洗液(10mM MES和10mM MgCl2)悬浮菌体，将Reporter和Effector等量混合悬浮于清洗液中，静置2-3h后，用一次性无菌注射器吸取菌液，注射于本氏烟草叶片背面。用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega Corporation，美国)试剂盒根据说明书进行双荧光素酶报告实验，比较对照(pSAK277+Reporter)和实验组(VvSAP8-pSAK277+Reporter)的LUC/REN的比值。检测结果如图5所示。
VvHAK5是发明人团队已证实的HAK家族钾离子转运蛋白。选择其启动子区域ATG上游545bp的一段序列(图5A)构建Bait载体，通过酵母单杂交实验表明：与阳性对照(pGADT7-p53+p53-pAbAi)类似，在VvSAP8存在时，酵母细胞能够在含有200ng/mL AbA的SD培养基上生长；而不存在VvSAP8时，酵母细胞在含有200ng/mL AbA的SD培养基上不能成长(图5B)，证明VvSAP8能够与VvHAK5的启动子互作。进一步利用双荧光素酶报告实验，将VvHAK5启动子序列(pro-VvHAK5)连接LUC形成Reporter，35S启动子驱动VvSAP8形成Effector(图5C)，检测LUC/REN值发现，VvSAP8存在时显著高于对照(图5D)，证明VvSAP8能够激活VvHAK5的表达。
最后说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：所述葡萄VvSAP8基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：利用基因工程的手段在植物中过表达VvSAP8基因，促进植物钾离子吸收或转运。
3.根据权利要求1或2所述的葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
4.根据权利要求3所述的葡萄VvSAP8基因在促进植物钾离子吸收或转运中的应用，其特征在于：所述双子叶植物为葡萄、拟南芥。
5.一种葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，其特征在于：所述葡萄VvSAP8基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求5所述的葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，其特征在于：所述植物种质资源改良为提高植物的缺钾耐受性。
7.根据权利要求5或6所述的葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物。
8.根据权利要求7所述的葡萄VvSAP8基因在植物种质资源改良中的应用，其特征在于：所述双子叶植物为葡萄、拟南芥。
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