CN114317552A

CN114317552A - 一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用

Info

Publication number: CN114317552A
Application number: CN202111583784.1A
Authority: CN
Inventors: 胡建军; 葛晓兰; 张磊; 杜久军; 魏涵天; 项晓冬
Original assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forestry of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明公开了一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用，属于分子生物技术领域；本发明一方面提供了调控胡杨耐盐性的基因PeERF1以及其编码蛋白，另一方面提供了调控胡杨耐盐性的基因PeERF1的用途。本发明提供了一种重要的并且可能具有普适性的耐盐性基因资源，胡杨盐胁迫的耐受性为以后相关研究提供素材，同时也为植物抗逆性研究奠定基础。

Description

一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用

技术领域

本发明涉及一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

杨树属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)、染色体数一般为2n＝38，包含白杨组(Leuce)、黑杨组(Aigeiros)、青杨组(Tacamahaca)、大叶杨组(Leucoides)和胡杨组(Turanga)，共5个组，约30多个物种。长期以来，杨属植物作为生物能源，被广泛应用于木材生产、环境保护和生态绿化等各个方面，不仅对迅速恢复植被、防止水土流失和修复盐碱土地等具有潜在应用价值，而且也可作为木本纤维能源植物用于生物质能开发利用。胡杨(Populus euphratica Oliver)是广泛分布于我国西北地区的重要树种，具有良好的耐旱耐盐能力，能够适应沙漠戈壁地区的恶劣环境。胡杨对于维护沙漠地区的生态平衡，具有非常重要的作用，也是研究植物抗逆尤其是耐盐胁迫机理的重要模式树种。

随着环境的不断恶化，一系列的非生物胁迫如干旱、高盐及低温，是植物无法逃避的生存危机。研究植物抗逆性，特别是粮食作物的抗逆性的作用机制已成为研究热点。虽然已从多种植物中克隆出许多抗逆基因，但植物对干旱和高盐等逆境胁迫的耐性，受多个基因的控制，植物的抗逆反应是一个众多基因参与的系统调控过程，植物的抗逆性往往是由多基因调控的数量性状。一个关键的转录因子可以调控许多功能基因的表达。

与传统的通过导入或改良个别基因功能来提高抗性相比，研究转录因子在植物抗逆性中的作用，更有效、便捷。大量研究表明，许多转录因子参与调控植物对各种生物及非生物胁迫的应答与防御反应，人们对其作用机理的探索也日渐深入。

因此，提供一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用，有助于了解和深入研究胡杨抗逆的生长机理，为后续遗传育种构建优良性状杨树打下良好的基础，进而提高胡杨的利用效率，对于非生物胁迫尤其是盐胁迫方面的响应及其分子机制和研究抗逆新品种，具有重要的现实意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用，并利用其表达载体转化杨树，以期促进林木分子育种技术的发展，为优良树种的培育或筛选提供技术手段，同时为探索杨树耐盐性的分子机理奠定基础。

本发明基于对杨树AP2/ERF1家族成员的分析研究，鉴定出一个可以调控胡杨耐盐性优势表达基因PeERF1，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

优选地，所述调控胡杨耐盐性优势表达基因PeERF1的PeERF1CDS全长663bp，编码221个氨基酸和1个终止密码子。

所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性的应用。

所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性的应用，其特征在于：使植物包含基因PeERF1或使植物过表达基因PeERF1和抑制表达基因PeERF1。

所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性的应用，其特征在于：构建含有基因PeERF1的植物过表达载体，将其异源转化到84K杨树，筛选获得转基因阳性植株，通过阳性植株和野生型植株表型及耐盐性分析，获得了耐盐性的转基因植株。

所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：

1)采集来自于北京市海淀区中国林业科学研究院组培室中培养的胡杨组培苗，进行RNA提取，反转录成cDNA，克隆出PeERF1的CDS序列，再将其连接pMDC32载体进行测序，鉴定正确后构建过表达载体和抑制表达载体，异源转化到84K杨树中；

2)利用潮霉素抗性和PCR技术对PeERF1基因异源转化84K杨树进行了阳性植株筛选，得到转基因阳性植株，并对其进行了RNA提取和表型统计，对其转基因植株进行盐处理，验证其抗盐性，获得耐盐性的转基因植株。

对转基因84K杨树和野生型84K杨树进行表型观察和耐盐性处理发现，在盐胁迫处理后，过表达转基因植株株高、根长和鲜重均较野生型高，说明PeERF1基因的过表达提高了转基因84K杨树的耐盐性，抑制表达则抑制转基因84K杨树耐盐性。

以上研究结果证明，PeERF1对杨树具有一定的盐耐受性，其在林木分子育种及优良品种选育中具有重要应用价值。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

本发明以银腺杨84K(Populus alba×P.glandulosa)为材料，筛选鉴定出了PeERF1基因，基于其过表达和抑制植株的表型鉴定表明，其在盐处理下下能够提高耐盐胁迫能力，说明PeERF1基因能够正向调节植物的耐盐性，为筛选优势抗逆基因提供了新的选择，在林木基因工程领域有重要应用价值。

下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1-1为本发明实施例1中过表达PeERF1转基因84K杨树株系阳性植株检测；

图1-2为本发明实施例1中抑制表达PeERF1转基因84K杨树株系阳性植株检测；

图2-1为本发明实施例1中过表达PeERF1转基因84K杨树植株的表达量检测；

图2-2为本发明实施例1中抑制表达PeERF1转基因84K杨树植株的表达量检测；

图3-1为本发明实施例1中盐处理后过表达和抑制表达84K杨树转基因表型统计；

图3-2为本发明实施例1中盐处理后过表达和抑制表达84K杨树转基因株系株高统计；

图3-3为本发明实施例1中盐处理后过表达和抑制表达84K杨树转基因株系鲜重统计；

图3-4为本发明实施例1中盐处理后过表达和抑制表达84K杨树转基因根长统计；

图4-1为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树过氧化物酶(POD)含量；

图4-2为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树超氧化物歧化酶(SOD)含量；

图4-3为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树丙二醛(MDA)含量；

图4-4为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树植物可溶性糖含量；

图4-5为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树叶绿素含量；

图4-6为本发明实施例1中盐处理后转基因株系84K杨树相对电导率含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。

除非特别说明，下面实施例中所涉及的试剂均为市场上可购的常规试剂，所用的方法均为本技术领域常用的方法。

实施例1：

一、胡杨PeERF1基因的克隆

以胡杨(P.euphratica)为材料，使用天根多糖多酚总RNA试剂盒，对胡杨叶片进行RNA提取(胡杨总RNA)，方法如下：

(1)将约0.1克左右大小的胡杨叶片组织用液氮进行冷冻，放入液氮预冷过的研钵中进行研磨，研磨过程中始终保持叶片组织样品处于冷冻状态，待组织样品研磨成粉末状后，转移至1.5毫升离心管中，然后，加入500微升裂解液+10微升β-巯基乙醇)的2毫升灭菌的离心管中，然后用涡轮振荡器将组织与试剂充分混匀；

(2)12000转，离心2分钟，弃上清；

(3)将上清移至过滤柱上，12000转，离心2分钟，小心吸取上清至新的离心管中；

(4)加入0.4倍(200微升)无水乙醇，混匀，移入吸附柱中，12000转，离心15秒，弃液体；

(5)向吸附柱中加入80微升DNA酶工作液，室温静置15分钟；(DNA酶:10微升DNA酶储存液+70微升缓冲液)

(6)向吸附柱中加入350微升去蛋白液，12000转，离心15秒，弃液体；

(7)向吸附柱中加入500微升漂洗液，12000转，离心15秒，弃液体；

(8)重复(7)；

(9)12000转，离心2分钟，移入新的离心管中，晾干，加入30微升无RNA污染超纯水溶解沉淀，室温静置2分钟，12000转，离心1分钟，即得到植物总RNA提取液；

每个样品取2.0微克RNA，通过使用天根反转录试剂反转录为cDNA，实验耗材均无RNA污染，反应均在冰上进行；反转录步骤如下：

1)gDNA去除反应(10微升体系)见下表1：

表1

反应条件：42℃，反应3分钟；

2)上一步反应产物作为模板进行反应(20微升体系)见下表2：

表2

3)将1)加入2)，反应条件：42℃，反应15分钟；95℃，反应3分钟，使用时稀释10微升cDNA+190微升超纯水，即为使用模板cDNA；

参考已发表胡杨基因组序列，使用Primer3软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增(引物中引入GATEWAY接头)；其中，PeERF1 ORF正向引物PeERF1-CDS-F如序列表中SEQ ID NO.1所示(表3)，反向引物PeERF1-CDS-R如SEQ ID NO.2(表4)所示；SRDX-PeERF1-CDS-F如序列表中SEQ ID NO.3所示(表5)，反向引物SRDX-PeERF1-CDS-R如SEQ ID NO.4(表6)所示；

表3

表4

表5

表6

以胡杨cDNA为模板，用相应引物进行PCR扩增，PCR反应体系(20微升体系)见下表7：

表7

反应条件见下表8：

表8

对目的片段进行切胶回收，采用美国OMEGA生物技术公司胶回收试剂盒，对PCR扩增的PeuERF1目的片段进行切胶回收，具体操作步骤如下：

1)将目的片段条带切胶于1.5毫升灭菌离心管中，加入600微升结合液，50℃至胶融化；

2)将已融化的液体移入过滤柱中，12500转，离心2分钟，弃废液；

3)加入600微升洗脱液，12500转，离心30分钟，弃废液；

4)重复(3)，弃废液；

5)空离心过滤柱12500转，2分钟；

6)将过滤柱转入另一个1.5毫升的离心管中，加入30微升灭菌去离子水，室温静置5分钟，12500转，离心2分钟，可重复洗脱一次；

7)0.1％琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃保存；

获得基因全长cDNA序列为663bp，命名为PeERF1基因，序列如序列表SEQ ID NO.5所示(表9)，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.6所示(表10)；

表9

表10

二、PeERF1基因植物表达载体构建

1.过量表达和抑制表达载体的构建

使用Gateway方法进行过表达载体构建，通过PCR扩增得到的带有Gateway标签的PeERF1的胶回收产物，首先通过BP反应(赛默飞，上海，中国)将其构建pDONR222中间载体上，BP反应体系见表11，随后，利用LR反应(赛默飞，上海，中国)将PeERF1构建到pMDC32载体上，分别得到PeERF1和SRDX-PeERF1；

BP反应体系(5微升体系)见下表11：

表11

反应条件：16℃，反应1小时；

连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体转化步骤如下：

1、在冰盒上取5微升连接产物加入50微升北京全式金生物技术有限公司生产的大肠杆菌感受态DH5α中，用移液器轻轻混匀，冰浴30分钟；

2、将转化菌液放置42℃热激90S，取出冰浴5分钟；

3、加入300微升LB液体培养基，37℃，180转，摇1小时；

4、室温，4000转，离心5分钟，弃上清，将剩余菌液重悬；

5、将混匀的转化菌体全部涂到含有50mg/L Kan的LB固体平板上，晾干，封口倒置于37℃恒温箱中，培养12～14h；

随机挑取抗性平板上长出的单菌落若干，加入300微升含Kan(50mg/L)的LB液体培养基，37℃，180转，振荡培养4～5h后，以菌液作模板进行PCR检测阳性克隆；

PCR反应体系(20微升体系)见下表12：

表12

反应条件见下表14：

表14

反应结束后，取5微升PCR扩增产物，使用0.1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统紫外光下拍照，条带和扩增引物大小相同可视为阳性克隆，挑选3～5个PCR阳性克隆，委托北京擎科生物科技有限公司进行测序，确认成功构建到中间载体上；依据测序结果，将目标菌种加入等体积50％的无菌甘油，震荡摇匀，在液氮预冻后转移至-80℃冰箱保存，或通过扩大培养，提取并保存pDNOR222-PeERF1质粒；

pDNOR222-PeuERF1质粒基因片段进行酶切LR连接反应；

酶切反应体系(10微升体系)见下表15：

表15

反应条件：37℃，3小时；

pDNOR222-PeERF1质粒进行LR反应连接，LR反应体系(5微升体系)见下表16：

表16

反应条件：25℃，反应2.5小时；

连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，进行测序，结果正确的单菌落即为pMDC32-PeERF1和pMDC32-SRDX-PeERF1质粒，最终克隆得到的胡杨盐响应相关基因PeERF1的过表达载体PeERF1和抑制表达载体SRDX-PeERF1；

三、PeERF1基因的遗传转化与检测

1.PeERF1基因的遗传转化

通过电击法，将所构建的过量表达载体(PMDC32-PeERF1)和抑制表达载体(PMDC32-SRDX-PeERF1)转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导的遗传转化转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的84K杨愈伤在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下培养，含有目的表达载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染愈伤，浸染后的愈伤，放在不定芽诱导培养基(L&M，Lloyd&McCown Woody Plant BasalMedium with Vitamins)基本培养基上，在温度为22±2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶片转移至含有添加0.5mg/l 6-苄基氨基嘌呤(6-benzyl aminopurine)(6-BA)和0.05mg/l萘乙酸(naphthaleneacetic acid)(NAA))、3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的L&M上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下，诱导和筛选抗性不定芽，经过30～45天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的生根培养基中(1/2Murashige and Skoog(MS)基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导生根，提取已生根植株叶片DNA进行PCR验证；

2.过表达和抑制表达转基因植株检测

获得抗性的PeERF1基因过表达、抑制表达84K杨和野生型植株，提取基因组DNA，利用PCR扩增表达载体上抗性基因，能够扩增得到清晰条带，即为转基因植株；如图1-1和图1-2所示，分别为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达和抑制表达PeERF1的转基因杨树阳性植株检测图；选取转基因植株的叶片，以野生型为对照，提取总RNA并反转录，进行PeERF1基因定量分析，以确定转基因植株目的基因表达量，最终共获得11个过表达PeuERF1转基因阳性株系，分别将其命名为OE-1，OE-2，OE-3，OE-4，OE-5，OE-6，OE-7，OE-8，OE-9，OE-10，OE-11。10个抑制表达SRDX-PeERF1转基因阳性株系，分别将其命名为SE-1，SE-2，SE-3，SE-4，SE-5，SE-6，SE-7，SE-8，SE-9，SE-10；定量引物为PeERF1-RT-F(SEQ ID NO.7)，见下表17；PeERF1-RT-R(SEQ ID NO.8)，见下表18；

表17

名称	序列7(SEQ ID NO.1)
		PeERF1-RT-F	TGGCGTAAGGGTTTGGTTAG

表18

用RT-PCR检测转基因杨树中PeERF1基因的表达水平。结果表明，11个过表达PeERF1基因的转基因株系中的基因表达水平均显著高于野生型对照植株，相对表达水平是对照的7.51-85.63倍(如图2-1所示)。10个显性抑制表达SRDX-PeERF1基因的转基因株系中的表达水平均显著高于野生型对照植株，相对表达水平是对照的1.05-25.39倍(如图2-2所示)。

四、PeERF1转基因植株表型观察

将过表达和抑制表达转基因株系84K杨树设置30个以上生物学重复，同时设置野生型84K杨树(WT)作为对照间种，培养地点为中国林业科学研究院杨树组培室，选取生长状态一致的过表达和抑制表达转基因株系，分别移入含有0mM、50mM、75mM和100mM NaCl处理30天，第30天时观察各转基因杨树及对照的生长状态，统计各处理间转基因的株高、根长和鲜重；如图3-1至图3-4所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树与过量表达和抑制表达的转基因杨树株高表型比较图，在正常条件下，过表达PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的1.1、1.05和1.11倍；SRDX-PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的0.87、0.99和0.88倍；在50mM NaCl条件下，过表达PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的1.36、1.2和2.1倍；SRDX-PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的0.93、0.72和0.81倍；在75mM NaCl条件下，过表达PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的1.35、1.45和2.11倍；SRDX-PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的0.92、0.69和0.9倍；在100mm NaCl条件下，过表达PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的1.15、1.47和3.1倍；SRDX-PeERF1转基因杨树的株高、根长和鲜重分别是WT的0.64、0.39和0.8倍；因此，综合表型和统计数据，初步推测胡杨PeERF1基因在一定程度上具有提高植物耐盐性的作用；

五、PeERF1转基因相关生理指标的检测

将培养一个月的转基因杨树组培苗移至土盆中，培养一个月进行150mM NaCl处理24小时，水处理为对照；根据索莱宝生物科技有限公司过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、植物可溶性糖含量和丙二醛(MDA)测试盒说明书，测定转基因杨树POD、SOD和MDA含量，叶绿素含量用乙醇法测定；测定结果见图4-1至图4-6所示，在盐胁迫条件下，过表达PeERF1基因的植株的POD和SOD活性显著高于野生型植株，而抑制表达SRDX-PeERF1基因的植株的POD和SOD活性显著低于野生型植株。这些结果说明，在盐胁迫条件下PeERF1可以通过提高POD和SOD活性，降低植物体内活性氧物质的积累，从而提高其抗逆能力。

本研究测定了盐胁迫条件下不同株系中MDA含量和相对电导率来进一步评估其耐盐胁迫能力，过表达PeERF1基因杨树在盐胁迫下受到的损伤显著低于野生型植株，而抑制表达SRDX-PeERF1基因杨树的损伤显著高于野生型植株。盐胁迫条件下不同株系叶绿素含量的测定结果显示，过表达PeERF1基因杨树在盐胁迫下叶绿素含量显著低于野生型植株，而抑制表达SRDX-PeERF1基因杨树的叶绿素含量显著高于野生型植株。

以上结果表明盐胁迫下过表达转基因84K杨树在盐胁迫下受到损伤均显著高于野生型杨树，抑制表达转基因84K杨树在盐胁迫下受到损伤均显著低于野生型，表明PeERF1基因具有一定的耐盐性。

虽然以上对本发明目的构思和实施例作了详尽说明，但本领域普通技术人员可以认识到，在没有脱离权利要求限定范围的前提条件下，仍然可以对本发明作出各种改进和变换，而这种改进和变换仍然应当属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业研究所

<120> 一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1及其应用

<141> 2021-12-23

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> PeERF1-CDS-F

<400> 1

ggggacaact ttgtacaaaa aagttggaat ggatggctcc ttctttc 47

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> PeERF1-CDS-R

<400> 2

ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggtatcagc aaggactcac agc 53

<210> 3

<211> 77

<212> DNA

<213> SRDX-PeERF1-CDS-R

<400> 3

ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggtatcaca aacggagttc tagatcgcaa 60

ggactcacag catcttc 77

<210> 4

<211> 663

<212> DNA

<213> PeERF1

<400> 4

atggatggct ccttctttca ctcttcaaat tctgattttt catccgaatc ttgttttgaa 60

tcgccagatt ttttccatgg cctatctttt aaccaaagtt ctctcccctt caatgaaaac 120

gactccgacg aaatgcttct ttttgggcta atctcggagg ccactcaaga gacgtcaaaa 180

gcaacttcct ataatggaat tattaaggaa gaagaggtta gctccgtggc cgaagaagat 240

cccaacaagg aaaagtccta cagaggtgtt aggaggcggc catggggcaa attcgctgca 300

gagataaggg attccacaag gcatggcgta agggtttggt taggcacatt tgatagtgca 360

gaggcagctg ctttggccta tgaccaagct gctttttcaa tgagaggaac tggggcgaca 420

ctgaatttcc cagttgaaag agtgagggag tcactgaagg atatgaagtg tactgaccaa 480

gaggatgggt gctcgcctgt ggtggctcta aagaggaagc actccctgag aaggaaattg 540

ggaagcagaa gcaagagaga gagtaacgtt aggatagaga atgtgatggt tttggaagat 600

ttaggtgctg attatctgga acaactattg aattcatctg aagatgctgt gagtccttgc 660

tga 663

<210> 5

<211> 220

<212> PRT

<213> PeERF1(蛋白序列)

<400> 5

Met Asp Gly Ser Phe Phe His Ser Ser Asn Ser Asp Phe Ser Ser Glu

1 5 10 15

Ser Cys Phe Glu Ser Pro Asp Phe Phe His Gly Leu Ser Phe Asn Gln

20 25 30

Ser Ser Leu Pro Phe Asn Glu Asn Asp Ser Asp Glu Met Leu Leu Phe

35 40 45

Gly Leu Ile Ser Glu Ala Thr Gln Glu Thr Ser Lys Ala Thr Ser Tyr

50 55 60

Asn Gly Ile Ile Lys Glu Glu Glu Val Ser Ser Val Ala Glu Glu Asp

65 70 75 80

Pro Asn Lys Glu Lys Ser Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Pro Trp Gly

85 90 95

Lys Phe Ala Ala Glu Ile Arg Asp Ser Thr Arg His Gly Val Arg Val

100 105 110

Trp Leu Gly Thr Phe Asp Ser Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Asp

115 120 125

Gln Ala Ala Phe Ser Met Arg Gly Thr Gly Ala Thr Leu Asn Phe Pro

130 135 140

Val Glu Arg Val Arg Glu Ser Leu Lys Asp Met Lys Cys Thr Asp Gln

145 150 155 160

Glu Asp Gly Cys Ser Pro Val Val Ala Leu Lys Arg Lys His Ser Leu

165 170 175

Arg Arg Lys Leu Gly Ser Arg Ser Lys Arg Glu Ser Asn Val Arg Ile

180 185 190

Glu Asn Val Met Val Leu Glu Asp Leu Gly Ala Asp Tyr Leu Glu Gln

195 200 205

Leu Leu Asn Ser Ser Glu Asp Ala Val Ser Pro Cys

210 215 220

Claims

1.一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.调控胡杨耐盐性的基因PeERF1的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.一种调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性中的应用。

4.如权利要求3所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性中的应用，其特征在于：使胡杨包含基因PeERF1或使胡杨过表达基因PeERF1和抑制表达基因PeERF1。

5.如权利要求3所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性中的应用，其特征在于：构建含有基因PeERF1的植物过表达载体，将其异源转化到84K杨树，筛选获得转基因阳性植株，通过阳性植株和野生型植株表型及耐盐性分析，获得了耐盐性的转基因植株。

6.如权利要求3所述调控胡杨耐盐性的基因PeERF1在提高杨树耐盐性中的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)采集胡杨组培苗，进行RNA提取，反转录成cDNA，克隆出PeERF1的CDS序列，再将其连接pMDC32载体进行测序，鉴定正确后，构建过表达载体和抑制表达载体，异源转化到84K杨树中；

(2)利用潮霉素抗性和PCR技术对PeERF1基因异源转化84K杨树进行阳性植株筛选，得到转基因阳性植株，并对其进行RNA提取和表型统计，对其转基因植株进行盐处理，验证其抗盐性，获得耐盐性的转基因植株。