CN115181749B - 一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1及其应用，属于分子生物技术领域；本发明一方面提供了调控小叶杨根部发育基因PsPRE1以及其编码蛋白，另一方面提供了调控小叶杨根部发育基因PsPRE1的用途。本发明提供了一种重要的并且可能具有普适性的根部发育调控基因资源，小叶杨根部发育的促进为以后相关研究提供素材，同时也为植物根部发育调控机制研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1及其应用，属于植物基因工程技术领域。
背景技术
杨树属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus)，染色体数一般为2n＝38，包含白杨组(Leuce)、黑杨组(Aigeiros)、青杨组(Tacamahaca)、大叶杨组(Leucoides)和小叶杨组(Turanga)，共5个组，约30多个物种。
长期以来，杨属植物作为生物能源，被广泛应用于木材生产、环境保护和生态绿化等各个方面，不仅在迅速恢复植被、防止水土流失和修复盐碱土地等方面具有潜在应用价值，而且也可作为木本纤维能源植物，用于生物质能开发利用。
小叶杨(Populus simonii)属青杨派，是我国北方地区的主要乡土树种，具有耐瘠薄、抗逆性强、适应性广、易繁殖、寿命长和杂交可配性好等特点，但其生长期短，成材时间长，满足不了生态防护及工业用材的需求。
通过培育根系发育良好的杨树新品种，提高木材产量，是杨树产业化可持续发展亟待解决的重要问题。
因此，提供一种调控小叶杨根部发育的基因PsPRE1及其应用，有助于了解和深入研究杨树根部发育的生长机理，为后续遗传育种，创制优良性状杨树，打下良好的基础，同时，对培育生长性状优良的木本植物品种和提高木材产量也具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控小叶杨根部发育的基因PsPRE1及其应用，并利用其表达载体转化杨树，以期促进林木分子育种技术的发展，为优良树种的培育或筛选提供技术手段，同时为探索杨树根部发育的分子机理奠定基础。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
本发明基于对杨树杂交子代数量性状QTL(数量性状基因)定位结果的分析，鉴定出一个与根干重性状相关的基因PRE1，即调控小叶杨根部发育的基因PsPRE1，其编码区核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1的PsPRE1 CDS全长273bp，编码90个氨基酸和1个终止密码子。
所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育中的应用。
所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育的应用，其特征在于：使植物包含基因PsPRE1或使植物过表达基因PsPRE1。
所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育的应用，其特征在于：构建含有基因PsPRE1的植物过表达载体，将其异源转化到银腺杨84K(Populus alba×Populus glandulosa)，筛选获得转基因阳性植株，通过阳性植株和野生型植株表型分析，获得促进根部发育的转基因植株。
所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)采集来自于北京市海淀区中国林业科学研究院温室中培养的小叶杨扦插苗，进行RNA提取，反转录成cDNA，克隆出PsPRE1的CDS序列，再将其连接pMD19-T载体进行测序，鉴定正确后构建过表达载体，异源转化到84K杨树中；
2)利用潮霉素抗性和PCR技术对PsPRE1基因异源转化84K杨树进行阳性植株筛选，得到转基因阳性植株，并对其进行RNA提取和表型统计，获得促进根部发育的转基因植株。
对转基因84K杨树和野生型84K杨树进行表型观察发现，过表达转基因植株在对照和100mM培养基中株高、地上部分鲜重、总根数、最大根长和根鲜重均高于野生型，说明PsPRE1基因的过表达促进了转基因84K杨树的根部发育。
以上研究结果证明，调控小叶杨根部发育基因PsPRE1对杨树根部发育具有一定的促进作用，其在林木分子育种及优良品种选育中具有重要应用价值。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
本发明以小叶杨通辽1号(P.simonii‘Tongliao1’)为材料，从中筛选鉴定出了PsPRE1基因，基于其过表达的表型鉴定表明，其促进根部发育的能力，说明PsPRE1基因能够正向调节植物的根部发育，为筛选优势根部发育基因提供了新的选择，在林木基因工程领域有重要应用价值。
下面通过具体实施方式和附图对本发明作进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1-1为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树株系阳性植株检测；
图1-2为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树株系阳性植株表达量分析；
图2-1为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的表型差异分析；
图2-2为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的株高统计；
图2-3为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的地上部分鲜重统计；
图2-4为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的总根数统计；
图2-5为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的最大根长统计；
图2-6为本发明实施例1中过表达PsPRE1转基因84K杨树植株的根鲜重统计。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，以下实施例中未进行详细说明的操作可参照分子克隆，相关试剂盒使用说明的操作实现。
除非特别说明，下面实施例中所涉及的试剂均为市场上可购的常规试剂，所用的方法均为本技术领域常用的方法。
实施例1：
一、小叶杨PsPRE1基因的克隆
以小叶杨通辽1号为材料，通辽1号(P.simonii‘Tongliao1’)是从内蒙古通辽市小叶杨天然林选择的优树，使用天根多糖多酚总RNA试剂盒，对小叶杨叶片进行RNA提取(小叶杨总RNA)，方法如下：
(1)将约0.1克左右大小的小叶杨叶片组织用液氮进行冷冻，放入液氮预冷过的研钵中进行研磨，研磨过程中始终保持叶片组织样品处于冷冻状态，待组织样品研磨成粉末状后，转移至1.5毫升离心管中，然后，加入500微升裂解液+10微升β-巯基乙醇)的2毫升灭菌的离心管中，然后用涡轮振荡器将组织与试剂充分混匀；
(2)12000转，离心2分钟，弃上清；
(3)将上清移至过滤柱上，12000转，离心2分钟，小心吸取上清至新的离心管中；
(4)加入0.4倍(200微升)无水乙醇，混匀，移入吸附柱中，12000转，离心15秒，弃液体；
(5)向吸附柱中加入80微升DNA酶工作液，室温静置15分钟；(DNA酶:10微升DNA酶储存液+70微升缓冲液)
(6)向吸附柱中加入350微升去蛋白液，12000转，离心15秒，弃液体；
(7)向吸附柱中加入500微升漂洗液，12000转，离心15秒，弃液体；
(8)重复(7)；
(9)12000转，离心2分钟，移入新的离心管中，晾干，加入30微升无RNA污染超纯水溶解沉淀，室温静置2分钟，12000转，离心1分钟，即得到植物总RNA提取液；
每个样品取2.0微克RNA，通过使用天根反转录试剂反转录为cDNA，实验耗材均无RNA污染，反应均在冰上进行；反转录步骤如下：
1)gDNA去除反应(10微升体系)见下表1：
表1
反应条件：42℃，反应3分钟；
2)上一步反应产物作为模板进行反应(20微升体系)见下表2：
表2
3)将1)加入2)，反应条件：42℃，反应15分钟；95℃，反应3分钟，使用时稀释10微升cDNA+190微升超纯水，即为使用模板cDNA；
参考已发表小叶杨基因组序列，使用Primer3软件设计引物(扩增子包含起始密码子及终止密码子)，进行基因全长扩增；其中，PsPRE1 ORF正向引物PsPRE1-ORF-F如序列表中SEQ ID NO.1所示(表3)，反向引物PsPRE1-ORF-R如SEQ ID NO.2(表4)所示；
表3
表4
| 名称 | 序列2(SEQ ID NO.2) |
| PsPRE1-ORF-R | TTACATAATTAAACTCCTTATTATCTCAGC |
表5
表6
以小叶杨cDNA为模板，用相应引物进行PCR扩增，PCR反应体系(20微升体系)见下表7：
表7
反应条件见下表8：
表8
对目的片段进行切胶回收，采用美国OMEGA生物技术公司胶回收试剂盒，对PCR扩增的PsPRE1目的片段进行切胶回收，具体操作步骤如下：
1)将目的片段条带切胶于1.5毫升灭菌离心管中，加入600微升结合液，50℃至胶融化；
2)将已融化的液体移入过滤柱中，12500转，离心2分钟，弃废液；
3)加入600微升洗脱液，12500转，离心30分钟，弃废液；
4)重复(3)，弃废液；
5)空离心过滤柱12500转，2分钟；
6)将过滤柱转入另一个1.5毫升的离心管中，加入30微升灭菌去离子水，室温静置5分钟，12500转，离心2分钟，可重复洗脱一次；
7)0.1％琼脂糖凝胶电泳检测后，-20℃保存；
连接到pMD19-T后进行测序，获得基因全长cDNA序列为273bp，命名为PsPRE1基因，序列如序列表SEQ ID NO.5所示(表9)，其所编译表达蛋白序列如SEQ ID NO.6所示(表10)；
表9
表10
二、PsPRE1基因植物表达载体构建
1.过量表达载体的构建
使用Gateway方法进行过表达载体构建，通过PCR扩增得到的带有Gateway标签的PsPRE1的胶回收产物，正向引物PsPRE1-OE-F如序列表中SEQ ID NO.3所示(表5)，反向引物PsPRE1-OE-R如SEQ ID NO.4(表6)所示，首先通过BP反应(赛默飞，上海，中国)将其构建pDONR222中间载体上，BP反应体系见表11，得到重组质粒pDONR222-PsPRE1，随后，利用LR反应(赛默飞，上海，中国)将PsPRE1构建到pMDC32载体上，得到pMDC32-PsPRE1；
BP反应体系(5微升体系)见下表11：
表11
反应条件：25℃，反应2.5小时；
连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体转化步骤如下：
1、在冰盒上取5微升连接产物加入50微升北京全式金生物技术有限公司生产的大肠杆菌感受态DH5α中，用移液器轻轻混匀，冰浴30分钟；
2、将转化菌液放置42℃热激90秒，取出冰浴5分钟；
3、加入300微升LB液体培养基，37℃，180转，摇1小时；
4、室温，4000转，离心5分钟，弃上清，将剩余菌液重悬；
5、将混匀的转化菌体全部涂到含有50mg/L Kan的LB固体平板上，晾干，封口倒置于37℃恒温箱中，培养12～14小时；
随机挑取抗性平板上长出的单菌落若干，加入300微升含Kan(50mg/L)的LB液体培养基，37℃，180转，振荡培养4～5小时后，以菌液作模板进行PCR检测阳性克隆；
PCR反应体系(20微升体系)见下表12：
表12
反应条件见下表13：
表13
反应结束后，取5微升PCR扩增产物，使用0.1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统紫外光下拍照，条带和扩增引物大小相同可视为阳性克隆，挑选3～5个PCR阳性克隆，委托北京擎科生物科技有限公司进行测序，确认成功构建到中间载体上；依据测序结果，将目标菌种加入等体积50％的无菌甘油，震荡摇匀，在液氮预冻后转移至-80℃冰箱保存，或通过扩大培养，提取并保存pDNOR222-PsPRE1质粒；
pDNOR222-PsPRE1质粒基因片段进行酶切LR连接反应；
酶切反应体系(10微升体系)见下表14：
表14
反应条件：37℃，3小时；
pDNOR222-PsPRE1质粒进行LR反应连接，LR反应体系(5微升体系)见下表15：
表15
反应条件：25℃，反应2.5小时；
连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，进行测序，结果正确的单菌落即为pMDC32-PsPRE1质粒，最终克隆得到的小叶杨根部发育相关基因PsPRE1的过表达载体pMDC32-PsPRE1；
三、PsPRE1基因的遗传转化与检测
1.PsPRE1基因的遗传转化
通过电击法，将所构建的过量表达载体(pMDC32-PsPRE1)转入农杆菌GV3101中，通过农杆菌介导的遗传转化转入杨树，转化步骤如下：用于遗传转化的84K杨愈伤在培养温度为23-25℃、光照为16/8小时(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下培养，含有目的表达载体的农杆菌在OD600＝0.6～0.8时侵染愈伤，浸染后的愈伤，放在不定芽诱导培养基(L&M，Lloyd&McCown Woody Plant Basal Medium with Vitamins)基本培养基上，在温度为22±2℃的黑暗条件下共培养3天，共培养后的叶片转移至含有添加0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤(6-benzyl aminopurine)(6-BA)和0.05mg/L萘乙酸(naphthaleneacetic acid)(NAA))、3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的L&M上，在培养温度为23-25℃、光照为16/8h(白天/黑夜)、光照强度为50μM m-2s-1的条件下，诱导和筛选抗性不定芽，经过30～45天的诱导培养，将抗性不定芽转移至含有3mg/L潮霉素(hygromycin B)和200mg/L特美汀(Timentin)的生根培养基中(1/2Murashige and Skoog(MS)基本培养基添加0.05mg/L IBA和0.02mg/L NAA)，直至诱导生根，提取已生根植株叶片DNA进行PCR验证；
2.过表达转基因植株检测
获得抗性的PsPRE1基因过表达84K杨和野生型植株，提取基因组DNA，利用PCR扩增表达载体上抗性基因，能够扩增得到清晰条带，即为转基因植株；如图1-1所示，为本发明实施例1中野生型84K杨与过量表达PsPRE1的转基因杨树阳性植株检测图，最终得到4个过表达转基因株系，选取转基因植株的叶片，以野生型为对照，提取总RNA并反转录，进行PsPRE1基因定量分析，以确定转基因植株目的基因表达量，最终共获得4个过表达PsPRE1转基因阳性株系，分别将其命名为OE#3，OE#9，OE#14和OE#15；定量引物为PsPRE1-RT-F(SEQ IDNO.7)，见下表16；PsPRE1-RT-R(SEQ ID NO.8)，见下表17；
表16
| 名称 | 序列7(SEQ ID NO.7) |
| PsPRE1-RT-F | AGCAGAAGGTCAAGGCAGTC |
表17
| 名称 | 序列8(SEQ ID NO.8) |
| PsPRE1-RT-F | AGTCATCAACCTCCCTGTGC |
用RT-PCR检测转基因杨树中PsPRE1基因的表达水平。结果表明，4个过表达PsPRE1基因的转基因株系中的基因表达水平均高于野生型对照植株，相对表达水平(Relativeexpression)是对照的1.79-2175.4倍(如图1-2所示)。
四、PsPRE1转基因植株表型观察
将过表达84K杨转基因株系设置3个以上生物学重复，同时设置野生型84K杨树作为对照，培养地点为中国林业科学研究院组培室，选取生长状态一致的过表达株系，在1/2MS培养基中加入100mM NaCl，以未添加NaCl的1/2MS培养基作为对照(Control)，在30天后测量株高、地上部分鲜重、总根数、最大根长和根鲜重；如图2-1至图2-6所示，为本发明实施例1中野生型84K杨树(WT)与过量表达的转基因84K杨根表型比较图，在正常条件下，过表达PsPRE1转基因84K杨株系OE14和OE15株高、地上部分鲜重、总根数、最大根长和根鲜重均高于WT；在盐处理下，过表达株系OE14和OE15的株高、地上部分鲜重、总根数、最大根长和根鲜重也高于WT。
本发明提供了一种重要的并且可能具有普适性的根部发育调控基因资源，小叶杨根部发育的促进为以后相关研究提供素材，同时也为植物根部发育调控机制研究奠定基础。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明专利的保护范围之内。
序列表
<110> 中国林业科学研究院林业研究所
<120> 一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-ORF-F)
<400> 1
atgtctagca gaaggtcaag gcagtctagt g 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-ORF-R)
<400> 2
ttacataatt aaactcctta ttatctcagc 30
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-OE-F)
<400> 3
ggggacaact ttgtacaaaa aagttggaat gtctagcaga aggtcaaggc agtctagtg 59
<210> 4
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-OE-R)
<400> 4
ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggtattaca taattaaact ccttattatc 60
tcagc 65
<210> 5
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1基因序列)
<400> 5
atgtctagca gaaggtcaag gcagtctagt gttccaagga tcactgatga tcagatcatc 60
gaccttgtct ccaaattacg ccagcttctc cctgagatta gtcaaaggcg ctccgataag 120
gtatcagctt ccaaggtcct acaagagact tgcaattata tcaggaactt gcacagggag 180
gttgatgact taagtgagcg attgtctcag cttttggcaa caattgatgc tgatagtcct 240
gaagctgaga taataaggag tttaattatg taa 273
<210> 6
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(PsPRE1蛋白序列)
<400> 6
Met Ser Ser Arg Arg Ser Arg Gln Ser Ser Val Pro Arg Ile Thr Asp
1 5 10 15
Asp Gln Ile Ile Asp Leu Val Ser Lys Leu Arg Gln Leu Leu Pro Glu
20 25 30
Ile Ser Gln Arg Arg Ser Asp Lys Val Ser Ala Ser Lys Val Leu Gln
35 40 45
Glu Thr Cys Asn Tyr Ile Arg Asn Leu His Arg Glu Val Asp Asp Leu
50 55 60
Ser Glu Arg Leu Ser Gln Leu Leu Ala Thr Ile Asp Ala Asp Ser Pro
65 70 75 80
Glu Ala Glu Ile Ile Arg Ser Leu Ile Met
85 90
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-RT-F)
<400> 7
agcagaaggt caaggcagtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(PsPRE1-RT-F)
<400> 8
agtcatcaac ctccctgtgc 20
Claims (3)
1.一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述的杨树为84K杨树。
2.如权利要求1所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育中的应用，其特征在于：构建含有基因PsPRE1的植物过表达载体，将其异源转化到84K杨树，筛选获得转基因阳性植株，通过阳性植株和野生型植株表型分析，获得了促进根部发育的转基因植株。
3.如权利要求1所述调控小叶杨根部发育基因PsPRE1在促进杨树根部发育中的应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）采集小叶杨扦插苗，进行RNA提取，反转录成cDNA，克隆出PsPRE1的CDS序列，再将其连接pMD19-T载体进行测序，鉴定正确后，构建过表达载体，异源转化到84K杨树中；
（2）利用潮霉素抗性和PCR技术对PsPRE1基因异源转化84K杨树进行阳性植株筛选，得到转基因阳性植株，并对其进行RNA提取及表达量分析和表型统计。
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| CN202210729390.0A Active CN115181749B (zh) | 2022-06-24 | 2022-06-24 | 一种调控小叶杨根部发育基因PsPRE1及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115181749B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101824078A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-09-08 | 中国科学院植物研究所 | 一种控制植物生长的蛋白及其编码基因与应用 |
| CN109679965A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-04-26 | 中国林业科学研究院林业研究所 | 一种调控杨树叶型发育基因及其应用 |
| CN110551736A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-10 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种与中山杉根发育相关的ThHAM1基因及其应用 |
-
2022
- 2022-06-24 CN CN202210729390.0A patent/CN115181749B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101824078A (zh) * | 2009-12-11 | 2010-09-08 | 中国科学院植物研究所 | 一种控制植物生长的蛋白及其编码基因与应用 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "Accession NO.XP_034888872.1", transcription factor PRE1 [Populus alba];NCBI;genbank database;features * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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