CN116584382A - 过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用，属于植物生理代谢技术领域，本发明利用外源过氧化氢处理葡萄组培苗，分析其钾离子含量变化，发现过氧化氢处理6 h、24 h和72 h后，葡萄植株体内的钾离子含量均显著高于对照（未加过氧化氢），证明过氧化氢可用于促进葡萄植株钾离子吸收，提高植株体内的钾离子含量。本发明提供了一种提高葡萄钾离子含量的技术，该技术有望应用于葡萄生产中，助力葡萄品质提升和产业发展。
Description
技术领域
本发明属于植物生理代谢技术领域，具体涉及过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用。
背景技术
葡萄是重要的“钾质果树”，对钾的需求量极高。提高葡萄的钾离子含量对其产量、品质、抗逆性等均有重要作用。过氧化氢（H2O2）是植物内源产生的一种活性氧，前人研究发现其与钾离子的吸收有关。提高葡萄钾离子含量，有望助力葡萄品质提升和产业发展。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的一在于提供过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用，目的二在于提供一种以过氧化氢为主要成分的葡萄植株钾离子吸收促进剂，目的三在于提供一种提高葡萄植株内钾离子含量的方法。本发明利用外源过氧化氢处理葡萄组培苗，通过分析钾离子含量变化，证明过氧化氢可用于促进葡萄植株钾离子吸收，提高植株体内的钾离子含量。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用。
优选地，在葡萄组织培养过程中，采用过氧化氢处理组培苗。更进一步地，所述处理，是将葡萄组培苗转移到含有过氧化氢的培养基中进行处理。所述过氧化氢的终浓度优选为10 mM，处理时间优选为6-72 h。
进一步地，所述提高葡萄植株钾离子含量包括：促进钾离子转运、改变离子稳态、升高类黄酮含量。
一种葡萄植株钾离子吸收促进剂，包括过氧化氢。
一种提高葡萄植株内钾离子含量的方法，采用外源过氧化氢处理葡萄组培苗。
作为对上述方法的进一步优化，具体包括以下步骤：
步骤一、培养组培苗：取自然生长的葡萄茎段，经消毒后，插入MS培养基中，于培养室中自然培养生长两个月，获取组培苗；
步骤二、取步骤一中有3-5片真叶且生长状况一致的组培苗转移到低钾培养基中进行低钾处理；所述低钾培养基的配方为：1.5 mM MgSO4、1.25 mM H3PO4、2.99 mM Ca(NO3)2、0.1 mM MnSO4、5 μM KI、0.1 μM CuSO4、0.1 mM H3BO5、0.1 μM CoCl、0.03 mMZnSO4、10 μM Na2MO4、0.1 mM FeSO4、0.1 mM Na2EDTA、肌醇50 mg/L、3-吡啶甲酸1 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、泛酸钙1 mg/L、硫胺素1 mg/L、生物素0.01 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、苯丙氨酸10 mg/L、甘氨酸2 mg/L、蔗糖30 g/L和琼脂15 g/L，加入KCl母液配成低钾培养基使所述低钾培养基中KCl含量为100 μM；
步骤三、向步骤二所述低钾培养基中加入过氧化氢，将经低钾处理的组培苗转移到含有过氧化氢的低钾培养基中处理6-72 h，取样检测。
作为对上述方法的进一步优化，步骤三中，所述过氧化氢的终浓度为10 mM。
有益效果：本发明利用外源过氧化氢处理葡萄组培苗，分析其钾离子含量变化，发现过氧化氢处理6 h、24 h和72 h后，葡萄植株体内的钾离子含量均显著高于对照（未加过氧化氢），证明过氧化氢可用于促进葡萄植株钾离子吸收，提高植株体内的钾离子含量。通过对照和处理样品的转录组测序，筛选和分析差异表达基因，发现过氧化氢处理后三个钾离子转运蛋白的表达显著提高；此外，大量离子转运相关的基因差异表达；类黄酮代谢途径在差异基因中显著富集，大量基因上调表达，且类黄酮含量在过氧化氢处理后显著提高。说明过氧化氢可通过影响钾离子转运、离子稳态和调控类黄酮代谢，提高葡萄植株体内的钾离子含量。本发明提供了一种提高葡萄钾离子含量的技术，该技术有望应用于葡萄生产中，助力葡萄品质提升和产业发展。
附图说明
图1是对照和过氧化氢（H2O2）处理不同时间葡萄组培苗钾离子含量对比图。
图2是差异表达基因统计结果图；图中，A. 基于测序数据进行PCA分析结果；B. 各个比较中上调和下调的差异表达基因数据统计；C-D. 上调（C）和下调（D）的差异表达基因韦恩图展示结果。
图3是GO富集分析及离子相关基因表达情况图；图中，A. GO富集分析中与离子相关的通路富集结果；B. 与离子转运相关的基因表达情况；C. 三个钾离子转运蛋白基因表达情况。
图4是GSEA富集分析结果图。
图5是WGCNA分析（A）和相关模块KEGG分析（B）图。
图6是葡萄中类黄酮代谢途径及其相关基因的表达情况图；图中，右上角为图例，热图表示归一化处理后的FPKM值，从左到右表示六个样品：C6、C24、C72、H6、H24、H72。
图7是过氧化氢处理与对照组葡萄植株类黄酮含量测定。
图8是过氧化氢处理提高葡萄植株钾离子含量的分子机制模式图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
二、材料和方法
1、植物材料
本研究所用植物材料为‘无核白’葡萄组培苗。组培苗的培养方法为：取田间自然生长的一年生‘无核白’葡萄茎段，剪成2 cm左右的茎段，用0.1%升汞消毒8 min，再用无菌水清洗3-5次。在超净工作台内，将消毒后的茎段插入MS固体培养基中，于培养室自然培养生长两个月左右即可用于后续实验。
2、低钾处理
取自然生长两个月左右、有3-5片真叶、生长状况一致的组培苗用于处理。进行低钾处理时，将MS中的大量元素配方调整，其他元素不变。具体培养基配方为：1.5 mM MgSO4、1.25 mM H3PO4、2.99 mM Ca(NO3)2、0.1 mM MnSO4、5 μM KI、0.1 μM CuSO4、0.1 mM H3BO5、0.1 μM CoCl、0.03 mM ZnSO4、10 μM Na2MO4、0.1 mM FeSO4、0.1 mM Na2EDTA、肌醇50 mg/L、3-吡啶甲酸1 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、泛酸钙1 mg/L、硫胺素1 mg/L、生物素0.01 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、苯丙氨酸10 mg/L、甘氨酸2 mg/L、蔗糖30 g/L、琼脂15 g/L。用KCl配成2 M母液，加入KCl母液配成低钾（KCl含量为100 μM）培养基。进行处理时，将正常生长的组培苗转移到低钾培养基中即可。
3、过氧化氢处理
将30%过氧化氢母液过滤灭菌后，加入到上述缺钾培养基中，使得过氧化氢终浓度为10 mM。进行过氧化氢处理时，将葡萄组培苗直接转移到含过氧化氢的培养基中即可。分别在处理6 h、24 h和72 h后取样，将植株从培养基中整个取出，冲洗干净根部的培养基，经液氮速冻后置于-80℃冰箱中。
4、钾离子含量测定
进行钾离子含量测定的样品首先置于烘箱中，200℃烘干，直至质量不变（约6 h左右）。烘干后的样品用研钵磨成粉末。称取100 mg粉末置于10 mL离心管中，加入5 mL超纯水，100℃煮沸3 h，过滤后取滤液。滤液稀释两倍后用于钾离子含量测定。测定采用火焰原子吸收分光光度计，按照操作说明测定即可。读出吸光度，根据标准曲线换算成钾离子含量，乘以稀释倍数后即为样品中的钾离子含量。
5、转录组测序
将之前保存在-80℃冰箱中的样品送公司进行转录组测序。测序的样品共18个，包括对照6 h、24 h和72 h（在低钾培养基中生长的、没有加过氧化氢的样品，分别用C6、C24和C72表示）以及过氧化氢处理6 h、24 h和72 h（在低钾培养基中生长的、加过氧化氢处理的样品，分别用H6、H24和H72表示），每个样品三个生物学重复。转录组测序工作由测序公司完成，建库测序流程包括：总RNA样本检测、mRNA富集、双链DNA合成、末端修复、加A和接头、片段选择和PCR扩增、文库检测和Illumina测序。具体过程以公司实际操作为准。根据测序结果，基于FPKM法计算基因在不同样品中的表达量，用DESeq2鉴定差异表达基因，对差异表达基因进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的富集分析。
6、WGCNA（权重基因共表达网络分析）
基于转录组测序结果，用R包进行WGCNA分析，将表达模式相似的基因进行聚类，根据聚类将所有基因分成不同的表达模块（module），并将不同模块与性状数据（本研究为测定的钾离子含量指标）进行关联分析，计算相关系数r值和显著性p值，从中筛选出相关系数r值最高、且显著性p值较小的模块，该模块内的基因与所研究的性状之间的关系可能较密切。
三、结果
结果1、过氧化氢（H2O2）处理后葡萄植株体内钾离子含量升高。
将葡萄组培苗转移到低钾培养基内，之后用10 mM过氧化氢处理葡萄组培苗，测定处理后不同时间植株体内的钾离子含量，结果表明处理6 h、24 h和72 h后植株体内的钾离子含量都显著高于对照（图1）（正常生长、未加过氧化氢），表明低钾条件下用10 mM过氧化氢处理可促进葡萄植株对钾离子的吸收，提高钾离子含量。
结果2.通过转录组测序筛选到大量差异表达基因。
为研究过氧化氢提高葡萄钾离子含量的分子机制，我们分别对处理组和对照组样品进行了转录组测序。每个样品三个生物学重复，共测定了6组样品（分别用C6、C24、C72、H6、H24、H72表示；C表示Control，H表示H2O2）。用测序数据就行PCA（主成分分析）分析，结果表明三个重复较为紧密的聚在一起，证明样品重复性较好（图2A）。通过将处理和对照进行比较，筛选到大量上调（Up）或下调（Down）的差异表达基因（图2B）。将这些基因进行韦恩图分析，发现256个基因在过氧化氢处理6 h、24 h和72 h后均上调表达（图2C），125个基因在过氧化氢处理6 h、24 h和72 h后均下调表达（图2D）。
结果3. GO富集分析表明过氧化氢诱导离子转运相关基因差异表达。
对差异表达基因进行GO富集分析，结果表明大量与离子转运或离子结合相关的通路不同程度地富集，如：“ion transport”、“iron ion binding”、“cation binding”等（图3A）。与离子转运相关的基因在过氧化氢处理后差异表达，包括：氮、磷、硫酸根、钙离子、锌离子等（图3B）。并且，三个钾离子转运蛋白（K+transporter）基因在过氧化氢处理后显著上调（图3C）。该结果表明过氧化氢可诱导离子转运相关基因差异表达，改变植株体内的离子稳态，影响钾离子的积累。
结果4. KEGG富集分析表明类黄酮代谢途径显著富集。
基于KEGG富集分析结果，将其用GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）分析方法进行分析，如图4，结果显示类黄酮代谢以及与其直接相关的苯丙氨酸代谢途径显著富集，表明过氧化氢提高葡萄钾离子吸收可能与类黄酮代谢途径有关。
结果5. WGCNA分析表明类黄酮代谢相关基因与过氧化氢提高钾离子吸收显著相关。
WGCNA分析可鉴定出与性状密切相关的基因模块，筛选出可能影响性状的基因集。通过将图1中的数据与转录组测序数据进行联合分析，从而鉴定出与过氧化氢提高钾离子吸收显著相关的基因集。图5A显示MEgreenyellow模块相关性最高（r=0.909，p=1.8e-07），将该模块中的基因进行KEGG富集分析，结果显示类黄酮生物合成和苯丙氨酸代谢是排名前二的通路（图5B），与图4结果一起，进一步证明了类黄酮代谢途径与过氧化氢提高钾离子吸收的紧密联系。
结果6.过氧化氢处理激活了类黄酮代谢途径相关基因。
结果4和结果5均证明了类黄酮代谢在过氧化氢提高钾离子吸收中的重要作用。为深入分析相关基因的具体表达情况，我们将类黄酮代谢通路中的所有基因进行了分析，结果发现绝大多数基因均在过氧化氢处理后显著上调（图6），表明过氧化氢处理后激活了类黄酮代谢途径相关基因的表达。
结果7.过氧化氢处理提高了葡萄植株体内的类黄酮含量。
通过测定处理组与对照组类黄酮含量，与基因表达结果相一致，过氧化氢处理后葡萄植株体内的类黄酮含量高于对照，尤其是在处理24 h和72 h后（图7）。
过氧化氢处理提高葡萄植株钾离子含量的分子机制模式如图8所示。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.过氧化氢在提高葡萄植株钾离子含量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在葡萄组织培养过程中，采用过氧化氢处理组培苗。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述处理，是将葡萄组培苗转移到含有过氧化氢的培养基中进行处理。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述过氧化氢的终浓度为10 mM，处理时间为6-72 h。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高葡萄植株钾离子含量包括：促进钾离子转运、改变离子稳态、升高类黄酮含量。
6.一种葡萄植株钾离子吸收促进剂，其特征在于：包括过氧化氢。
7.一种提高葡萄植株内钾离子含量的方法，其特征在于：采用外源过氧化氢处理葡萄组培苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、培养组培苗：获取自然生长的葡萄茎段，经消毒后，插入MS培养基中，于培养室中自然培养生长两个月，获取组培苗；
步骤二、取步骤一中有3-5片真叶且生长状况一致的组培苗转移到低钾培养基中进行低钾处理；所述低钾培养基的配方为：1.5 mM MgSO4、1.25 mM H3PO4、2.99 mM Ca(NO3)2、0.1mM MnSO4、5 μM KI、0.1 μM CuSO4、0.1 mM H3BO5、0.1 μM CoCl、0.03 mM ZnSO4、10 μMNa2MO4、0.1 mM FeSO4、0.1 mM Na2EDTA、肌醇50 mg/L、3-吡啶甲酸1 mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、泛酸钙1 mg/L、硫胺素1 mg/L、生物素0.01 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、苯丙氨酸10mg/L、甘氨酸2 mg/L、蔗糖30 g/L和琼脂15 g/L，加入KCl母液配成低钾培养基使所述低钾培养基中KCl含量为100 μM；
步骤三、向步骤二所述低钾培养基中加入过氧化氢，将经低钾处理的组培苗转移到含有过氧化氢的低钾培养基中处理6-72 h，取样检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤三中，所述过氧化氢的终浓度为10mM。
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