CN115927406B - 一种南果梨PuAOX1a基因、过表达载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种南果梨PuAOX1a基因、过表达载体及应用，属于分子生物学基因工程技术领域。为解决现有技术仍未能将南果梨香气相关AOX基因应用于果实香气含量提升的问题，本发明提供了一种南果梨PuAOX1a基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还构建了一种包括所述南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，通过农杆菌介导转化法将此载体转入南果梨果实，经鉴定证明南果梨PuAOX1a基因能够促进南果梨果实酯类香气成分的积累，提高南果梨的果实香气。本发明为增加果实香气含量提供了理论依据与技术手段，具有很大的应用价值。

Description

一种南果梨PuAOX1a基因、过表达载体及应用

技术领域

本发明属于分子生物学基因工程技术领域，尤其涉及一种南果梨PuAOX1a基因、过表达载体及应用。

背景技术

南果梨属于蔷薇科梨属，是辽宁省极具地方特色的秋子梨品种。适度后熟的南果梨呈黄色、汁液丰富、香气浓郁，具备很高的营养价值及药用价值，素有“梨中之王”的美称，深受广大栽培者与消费者的喜爱。

香气是客观反映果实的风味、成熟度和品质的一个重要指标。刚采摘的南果梨香气成分含量较低、口感较差。果实香气形成过程中，可通过增强呼吸作用，为香气物质合成提供物质和能量，促进香气合成。经适度后熟后，果实汁液丰富，香气诱人，以酯类香气成分为主，具有果香味。

南果梨是呼吸跃变型果实，果实成熟过程中主要以交替呼吸途径为主，交替氧化酶(AOX,Alternativeoxidase)是交替呼吸途径的末端氧化酶，是一种双铁羧基蛋白，是核基因编码的多基因家族，分为两个亚家族AOX1和AOX2。AOX基因随着植物生长发育而差异性表达，对该基因进行功能研究，阐明其香气调控机理，能够在分子水平调控南果梨香气合成的机理提供理论基础。但现有技术仍未能将南果梨香气相关AOX基因应用于果实香气含量的提升。

发明内容

为解决现有技术仍未能将南果梨香气相关AOX基因应用于果实香气含量提升的问题，本发明提供了一种南果梨PuAOX1a基因、过表达载体及应用。

本发明的技术方案：

一种南果梨PuAOX1a基因，所述南果梨PuAOX1a基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步的，所述南果梨PuAOX1a基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，所述过表达载体包括所述的南果梨PuAOX1a基因。

进一步的，所述过表达载体为在植物表达载体pRI101-CaMV35S中插入所述的南果梨PuAOX1a基因构建而成。

进一步的，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：

步骤1、以南果梨总RNA为模板反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，利用PuAOX1a引物组进行PCR扩增，得到南果梨PuAOX1a基因；

步骤2、将步骤1得到的南果梨PuAOX1a基因与植物表达载体pRI101-CaMV35S连接，得到过表达载体pRI101-PuAOX1a。

进一步的，所述PuAOX1a引物组包括引物PuAOX1a-F和引物PuAOX1a-R；

所述引物PuAOX1a-F的核苷酸序列为：5＇－ATGGTCTTCACTCCTTTACTT－3＇；

所述引物PuAOX1a-R的核苷酸序列为：5＇－TCAACCTATTCTTGAGTTATCT－3＇。

一种南果梨PuAOX1a基因在提高果实香气中的应用，所述果实为南果梨果实、西洋梨或金冠苹果。

一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体在提高果实香气中的应用，所述果实为南果梨果实、西洋梨或金冠苹果。

进一步的，将携带南果梨PuAOX1a基因的过表达载体pRI101-PuAOX1a转入农杆菌中，采用农杆菌介导法瞬时侵染南果梨果实。

进一步的，所述农杆菌介导法瞬时侵染是将含有过表达载体pRI101-PuAOX1a的农杆菌注射入南果梨果实中。

本发明的有益效果：

本发明利用植物基因工程技术，通过基因表达分析、基因克隆及序列分析技术，从南果梨中分离鉴定得到南果梨香气相关的PuAOX1a基因的序列信息，并构建了一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，通过农杆菌介导转化法将含有南果梨PuAOX1a基因的过表达载体转入南果梨果实，经鉴定证明南果梨PuAOX1a基因能够促进南果梨果实中酯类香气物质的积累，提高南果梨的果实香气，为增加果实香气含量提供了理论依据与技术手段，具有很大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中PuAOX1a基因cDNA序列的扩增结果照片，其中M为DL2000；

图2为实施例2中过表达载体PRI101-PuAOX1a的PCR电泳检测结果照片；

图3为实施例2中大肠杆菌PRI101-PuAOX1a的PCR电泳检测结果照片；

图4为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中表型分析对比图；

图5为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中PuAOX1a基因表达量对比图；

图6为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中酯类香气物质含量对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

本实施例提供了南果梨香气相关PuAOX1a基因的克隆方法。

以南果梨(Pyrus ussuriensis Maxim.)果实为试验材料进行RNA提取。

采用CTAB法(Lietal.,2013)，提取南果梨果实中的总RNA。以所得总RNA为模板用反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser)反转录得到cDNA。

以反转录得到的cDNA为模板，利用PuAOX1a引物组进行PCR扩增。

PuAOX1a引物组包括引物PuAOX1a-F和引物PuAOX1a-R；

引物PuAOX1a-F的核苷酸序列为：5＇－ATGGTCTTCACTCCTTTACTT－3＇；

引物PuAOX1a-R的核苷酸序列为：5＇－TCAACCTATTCTTGAGTTATCT－3＇。

本实施例中PCR扩增的反应体系为：2×ExTaq^TMMix 25.0μL、PuAOX1a-F 2.5μL、PuAOX1a-R 2.5μL、cDNA 1μL、ddH₂O 19μL，共50.0μL。

PCR扩增程序为：95℃，3min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min20s，返回第二步(95℃，30s)进行35个循环；72℃，5min，4℃保存。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，产生的特异条带产物即为目的片段，也就是南果梨香气相关PuAOX1a基因。用凝胶回收PCR产物后进行测序，结果表明，扩增得到的基因全长1278bp，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2

本实施例提供了一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体及其构建方法。

任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用于构建南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，本实施例优先选用的植物表达载体是PRI101-CaMV35S，选用限制性内切酶NdeI和SacI，购自宝生物工程(大连)有限公司。

扩增含有目的基因PuAOX1a基因的-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)；双酶切PRI101-CaMV35S质粒，回收载体大片段和目的基因小片段，用无缝克隆试剂盒(Seamless Cloning Kit)连接，得到过表达载体PRI101-PuAOX1a，过表达载体PRI101-PuAOX1a的PCR扩增电泳检测结果如图2所示。

用所得过表达载体PRI101-PuAOX1a转化大肠杆菌感受态Trans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)，扩增鉴定后即可摇菌保存菌液，获得携带表达载体PRI101-PuAOX1a的大肠杆菌，其PCR电泳检测结果如图3所示。选取扩增验证正确的菌液，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

用携带过表达载体PRI101-PuAOX1a的大肠杆菌质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到的含有过表达载体PRI101-PuAOX1a的农杆菌用于侵染南果梨果实。

实施例3

本实施例将实施例2得到的含有过表达载体PRI101-PuAOX1a的农杆菌用于南果梨的侵染，验证南果梨PuAOX1a基因的功能。

本实施例以盛花期后135d的南果梨果实为试验材料，采用农杆菌介导法瞬时侵染南果梨果实，具体方法为：

挑取含有目的基因南果梨PuAOX1a基因的阳性单克隆农杆菌菌落接种于5mLYEP液体培养基中。YEP液体培养基中含有5μL100mg/mLRif和5μL50mg/mLKana，混匀后置于28℃培养箱中培养12h。吸取培养的菌液200μL加入至300mLYEP液体培养基中，混匀后置于28℃培养箱中，180rpm培养至OD₆₀₀＝0.4左右。

将菌液转移至50mL离心管中，置于离心机中，10000g离心5min。加入适量无菌水洗菌后离心。收集农杆菌细胞，并加入悬浮液悬浮农杆菌细胞，悬浮液中含有1mL1MMES-KOH、1mL1MMgCl₂、100μL100mM乙酰丁香酮(ACE,Acetosyringone)；加水定容至100mL。农杆菌细胞和悬浮液充分混合后调至OD₆₀₀＝0.5，室温避光静置2-3h后用注射器推入南果梨果肉内，单次注射量为0.2ml。

对比例1

本对比例将仅含有表达载体PRI101-CaMV35S的农杆菌用于南果梨的转化。

用表达载体PRI101-CaMV35S转化大肠杆菌感受态Trans1-T1(购自北京全式金生物技术有限公司)，扩增鉴定后即可摇菌保存菌液，获得携带空载体PRI101的大肠杆菌，用携带空载体PRI101的大肠杆菌转化农杆菌EHA105感受态细胞，得到的含有空载体PRI101的农杆菌用于转化南果梨果实。

本对比例同样以盛花期后135d的南果梨果实为试验材料，采用农杆菌介导法瞬时侵染南果梨果实，具体方法与实施例3相同。

图4为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中表型分析对比图；从图4可以看出，过表达PuAOX1a基因的南果梨成熟度略高于对照组。

测定实施例3和对比例1瞬时转化后南果梨果实中的香气含量，具体方法为：

将实施例3和对比例1中农杆菌介导法瞬时侵染的南果梨果实在室温下(25±1℃)静置贮藏9d，分别测定瞬时转化后南果梨果实中PuAOX1a基因表达量和酯类香气含量。

图5为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中PuAOX1a基因表达量分析对比图；图6为对比例1和实施例3瞬时转化后南果梨果实中酯类香气含量对比图。从图5和图6可以看出，在相同的贮藏条件下，实施例3中的南果梨果实的PuAOX1a基因表达量和酯类香气含量均得到的明显增加，其中实施例3的南果梨果实和对比例1的南果梨果实的酯类香气含量分别为0.53μg·g^-1和0.38μg·g^-1。由此可以证实，南果梨PuAOX1a基因可以促进南果梨果实中酯类香气成分的积累，提高南果梨的果实香气，为增加果实香气含量提供了理论依据与技术手段，具有很大的应用价值。

Claims (10)

1.一种南果梨PuAOX1a基因，其特征在于，所述南果梨PuAOX1a基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

2.一种南果梨PuAOX1a基因编码的蛋白，其特征在于，所述南果梨PuAOX1a基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体包括权利要求1所述的南果梨PuAOX1a基因。

4.根据权利要求3所述一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体为在植物表达载体pRI101-CaMV35S中插入权利要求1所述的南果梨PuAOX1a基因构建而成。

5.根据权利要求4所述一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，其特征在于，所述过表达载体的构建方法包括以下步骤：

步骤1、以南果梨总RNA为模板反转录得到cDNA，再以所得cDNA为模板，利用PuAOX1a引物组进行PCR扩增，得到南果梨PuAOX1a基因；

步骤2、将步骤1得到的南果梨PuAOX1a基因与植物表达载体pRI101- CaMV35S连接，得到过表达载体pRI101-PuAOX1a。

6.根据权利要求5所述一种南果梨PuAOX1a基因的过表达载体，其特征在于，所述PuAOX1a引物组包括引物PuAOX1a-F和引物PuAOX1a-R；

所述引物PuAOX1a-F的核苷酸序列为：5＇－ATGGTCTTCACTCCTTTACTT－3＇；

所述引物PuAOX1a-R的核苷酸序列为：5＇－TCAACCTATTCTTGAGTTATCT－3＇。

7.一种如权利要求1或2所述的南果梨PuAOX1a基因在提高南果梨果实香气中的应用。

8.一种如权利要求3-6任一所述的南果梨PuAOX1a基因的过表达载体在提高南果梨果实香气中的应用。

9.根据权利要求8所述南果梨PuAOX1a基因的过表达载体在提高果实香气中的应用，其特征在于，将携带南果梨PuAOX1a基因的过表达载体pRI101-PuAOX1a转入农杆菌中，采用农杆菌介导法瞬时侵染南果梨果实。

10.根据权利要求9所述南果梨PuAOX1a基因的过表达载体在提高果实香气中的应用，其特征在于，所述农杆菌介导法瞬时侵染是将含有过表达载体pRI101-PuAOX1a的农杆菌注射入南果梨果实中。