CN110305856B

CN110305856B - 一种细胞色素p450酶的应用

Info

Publication number: CN110305856B
Application number: CN201910568394.3A
Authority: CN
Inventors: 徐娟; 张海朋; 刘翠华; 李明月; 陈嘉景; 田静
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2019-06-27
Filing date: 2019-06-27
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-06-27
Also published as: CN110305856A

Abstract

本发明涉及一种细胞色素P450酶的应用，用于在植物体内催化芳樟醇合成顺式‑芳樟醇氧化物和反式‑芳樟醇氧化物中，所述细胞色素P450酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

Description

一种细胞色素P450酶的应用

技术领域

本发明涉及一种细胞色素P450酶的应用，具体涉及一种细胞色素P450酶在植物体内催化芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物中的应用。

背景技术

柑橘中富含挥发性物质，主要存储在柑橘油胞中，以柑橘果皮、叶片和花中为主，柑橘汁胞是最主要的实用部位，其品质直接影响柑橘鲜食及加工品的品质，所以提高柑橘汁胞中挥发性物质含量，可以提高柑橘果实品质。

顺式-、反式-芳樟醇氧化物是芳樟醇的两种氧化和环化衍生物，具有怡人的花香香味，可以提高柑橘果实的品质，顺式-、反式-芳樟醇氧化物在莽山野柑果实中含量较低，但其阈值更低，GC-O和重构实验表明顺式-、反式-芳樟醇氧化物是莽山野柑果实的特征香气物质。

细胞色素P450酶代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名，其可在体内催化多种反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞色素P450酶的新的功能。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种细胞色素P450酶的应用，用于在植物体内催化芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物，所述细胞色素P450酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述细胞色素P450酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步，所述植物体为柑橘果实。

进一步，通过使柑橘植株中表达细胞色素P450基因来催化柑橘果实中的芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物，从而提高柑橘果实中顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物的含量。

本发明的有益效果是：发明人意外的发现具有SEQ ID NO:1所示序列的细胞色素P450酶能够在植物体内催化芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物，顺式-、反式-芳樟醇氧化物具有怡人的花香香味，对于柑橘果实的香气感官具有重要影响，可以通过在柑橘植株中表达上述细胞色素P450酶提高柑橘果实内的顺式-、反式-芳樟醇氧化物，以此提高柑橘果实的香气感官品质。

附图说明

图1为本发明阳性愈伤组织的验证结果，其中图1A为RT-PCR验证阳性转基因愈伤组织，图1B为紫外线荧光验证阳性转基因愈伤组织，其中P为阳性对照，WT为野生型愈伤组织，CitLO1为转基因愈伤组织；

图2为本发明愈伤组织细胞系中挥发性物质的GC-MS图；

图3为本发明顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物的质谱图，其中图3A为顺式-芳樟醇氧化物，图3B为反式-芳樟醇氧化物。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1细胞色素P450基因LO1的获取

基因LO1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的细胞色素P450酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，属于CYP78A7家族。

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

atggaattggctgttaatcttccacctgttccagaggttccaggaaggctaccccttataggaaatttgttacagttgaaagagaagaaaccacacatgactttcacaagatgggcagagatgtatggaccaatttattctatcaaaactggagcttcctctatgattgttctcaattcggctgatgttgctaaagaggccatggtgaccagatatccatccatttcaacaaggaagctatcaaatgccctgaagatgctcacctctaataaatgtatggttgcaacaagtgactacgatgaatttcacaaaatggctaaacgatgtttactcacaaatgttttgggtggaaatgctcagaagcgacatcgaatccatagagacacaatgatggaaattatgtcaacccaatttcatgctcacatcaaggacaatcctctacaactagtgaatttcaggaaaatatttgagtctgaactttttgcagtgtcaatgaaacaggctgtaggaaaggttgtggaatcaatttatgtgaaggagcttggttccacattgtcaaaagatgaggtatttaaaattttagtgcttgacataatggagggagcaattgaggtggactggagagacttcttcccttacctaagatgggttcctaataaaggcgtggaaatgaaaattcagagattgtgtacccgcaggcaagcagtaatggatgccctcatcagcgaggccaaaagcagaattgcttcaggacaggaactgaattgttatgttgatcacttgttgtcagaagtaaaatcacttacagagcaacaaataagcatgctgctctgggagcctatcatcgagacatcagatactactttggtcacaacagaatgggccatgtatgagctcgcaaaggatccaatgcgacaggaccgtctatttcaggagattcaatcagtttgtgggtcaaacaagtttactgaggaaaacatagcacaggttccttacttgggagctgttttccatgaaactctgagaaagtacagtccagctccaatagttcctttaagatttgcacatgaagataccgaaataggaggatacttcattcctgctagaagtgagattgcaataaacatatacggatgcaacatggacaagaagcagtgggaaaacccagaggagtggcaacccgagagatttcttgatgggcaaaacgaccctgcagatttgtacaagacaatggcctttggagcaggaaagagggtgtgcgcaggttctcttcaggcaagtttgatagcttgcacagcaataggtaggctggtgcaggaattcaagtggaatctgagagagggtgaggaagaaagtgttgatactgttggcctcactactcacaagctaaatcctttccatgcaatcattaggcctaggcctaggaattaa

可以通过人工合成，也可以通过反转录得到基因LO1的全长序列，顺式-、反式-芳樟醇氧化物在莽山野柑果实中含量较低，但其阈值更低，利用莽山野柑花粉授粉可以显著提高华农红柚汁胞中顺式-、反式-芳樟醇氧化物含量，反转录得到基因LO1的核苷酸全长序列的具体方法为：提取授莽山野柑花粉华农红柚汁胞的mRNA，以mRNA为模板进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用引物对Fw-1和Rw-2进行PCR扩增，克隆出基因LO1的编码区序列，Fw-1和Rw-2的序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，然后回收连接，转化到大肠杆菌Trans5α中，选择测序正确的菌液提取质粒，然后酶切得到基因LO1的全长序列，其中SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4的序列分别为：

SEQ ID NO:3：atggattcaataacttcgatttct

SEQ ID NO:4：cgtgttaatgcttttcagggctag

实施例2基因LO1在BY2烟草悬浮细胞系中的表达

由于CYP450基因行使功能需要NADPH提供H⁺，BY2烟草悬浮细胞系是植物材料，可提供足量的H⁺，且转基因方便快速，因此以BY2烟草悬浮细胞系验证基因LO1的功能。

使用引物对Fw-2和Rw-2将实施例1得到的LO1编码基因序列两端添加接头序列，其中Fw-2和Rw-2的序列分别为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，在添加接头序列的基础上再利用通用引物Fw-3和Rw-3将克隆得到的序列利用Gateway方法连接到具有35S启动子和GFP报告基因的pH7WG2D超表达载体上得到LO1超表达载体，其中Fw-3和Rw-3的序列分别为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8，将LO1超表达载体转到农杆菌GV3101中，筛选得到阳性载体在50ml LB培养基中，28℃孵育至A₆₀₀为0.6-0.8，利用农杆菌介导法将重组的LO1超表达载体转入培养了4天的BY2烟草悬浮细胞中，经过48小时共培养将细胞系转移至含有头孢霉素和潮霉素的固体LB筛选培养基中，直至长出新的块状愈伤组织，将块状愈伤组织转移至新的固体培养基中继续培养直至长出大量愈伤组织，取少量愈伤组织在荧光立体显微镜488nm紫外线激发GFP，发出绿色荧光的为阳性转基因愈伤组织，提取DNA，利用LO1基因的全长克隆引物Fw-1和Rw-1克隆进一步鉴定转基因愈伤组织。

SEQ ID NO:5的序列为：

aaaaagcaggctcgatggattcaataacttcgatttct

SEQ ID NO:6的序列为：

agaaagctgggtacgtgttaatgcttttcagggctag

SEQ ID NO:7的序列为：

ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct

SEQ ID NO:8的序列为：

ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

结果如图1所示，其中图1A为RT-PCR验证阳性转基因愈伤组织，图1B为紫外线荧光验证阳性转基因愈伤组织，其中P为阳性对照，WT为野生型愈伤组织，CitLO1为转基因愈伤组织。

实施例3基因LO1在BY2烟草悬浮细胞系中功能分析

取2g实施例2制备的新鲜的转基因愈伤组织(转入LO1超表达载体)和野生型愈伤组织(转入空载pH7WG2D质粒)分别在MS液体培养基中培养7天，再称取1g新鲜的转基因愈伤组织和对照组愈伤组织分别在20mL液体培养基中培养4天，然后分别添加50μM(–)-芳樟醇(≥95.0％，CAS：126-91-0，Aldrich，Spain)做为底物，培养48小时后，收集烟草细胞用于挥发性物质的提取和检测。

将收集的烟草细胞，在液氮冷冻下研磨成粉末，称取1.00g粉末用于挥发性物质提取，提取方法为现有技术，具体可参考《Comprehensive comparative analysis ofvolatile compounds in citrus fruits of different species》。

利用GC-MS检测提取的挥发性物质，检测条件为：

TRACE GC Ultra GC结合DSQ II mass sectrometer(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)，进样量为1μl，色谱柱为TRACE TR-5 MS柱(30m×0.25mm×0.25μl，Thermo Scientific，Bellefonte，PA，USA)。载气为高纯氦气(99.999％)，不分流模式，恒流模式，流速为1ml/min。进样口，离子源和传输线的温度分别为250、260和280℃。GC的升温程序如下：40℃保持3min，然后以3℃/min的速度升温至160℃并保留1min，然后以5℃/min的速度升温至200℃并保留1min，最后以8℃/min的速度升温至240℃并保留3min。MS的条件如下：EI(电子轰击)离子源，电子轰击能量70eV，正离子扫描模式，质量扫描范围m/z45-400amu。

不添加芳樟醇的野生型愈伤组织细胞系中并没有检测到芳樟醇及衍生物，添加芳樟醇的野生型愈伤组织细胞系中可以检测到2个微弱的峰，添加芳樟醇的转基因愈伤组织细胞系中检测到2个强峰(如图2所示，P1和P2)，结合图3中的质谱图以及图2中的顺式-、反式-芳樟醇氧化物的标准样品，鉴定得到P1和P2分别为顺式-、反式-芳樟醇氧化物，添加芳樟醇的野生型愈伤组织细胞系中顺式-、反式-芳樟醇氧化物的含量分别为0.75±0.13μg/g和0.51±0.16μg/g，添加芳樟醇的转基因愈伤组织细胞系中顺式-、反式-芳樟醇氧化物的含量分别为2.47±0.32μg/g和2.35±0.27μg/g，与野生型烟草细胞系相比，转入了LO1基因的烟草细胞系中顺式-、反式-芳樟醇氧化物的含量分别增加了2.31倍和3.61倍，表明LO1基因可催化芳樟醇形成大量顺式-、反式-芳樟醇氧化物。

由于顺式-、反式-芳樟醇氧化物具有怡人的花香香味，对于柑橘果实的香气感官具有重要影响，并且柑橘果实中存在芳樟醇，可以通过在柑橘植株中表达本发明的SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列的细胞色素P450酶提高柑橘果实内的顺式-、反式-芳樟醇氧化物，以此提高柑橘果实的香气感官品质，可以通过农杆菌转导法将携带上述基因的表达载体导入柑橘植物的细胞中，筛选携带有所述质粒载体的细胞，并将其培育成植株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种细胞色素P450酶的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> 华农红柚(Citrus maxima)

<400> 1

Met Glu Leu Ala Val Asn Leu Pro Pro Val Pro Glu Val Pro Gly Arg

1 5 10 15

Leu Pro Leu Ile Gly Asn Leu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Pro His

20 25 30

Met Thr Phe Thr Arg Trp Ala Glu Met Tyr Gly Pro Ile Tyr Ser Ile

35 40 45

Lys Thr Gly Ala Ser Ser Met Ile Val Leu Asn Ser Ala Asp Val Ala

50 55 60

Lys Glu Ala Met Val Thr Arg Tyr Pro Ser Ile Ser Thr Arg Lys Leu

65 70 75 80

Ser Asn Ala Leu Lys Met Leu Thr Ser Asn Lys Cys Met Val Ala Thr

85 90 95

Ser Asp Tyr Asp Glu Phe His Lys Met Ala Lys Arg Cys Leu Leu Thr

100 105 110

Asn Val Leu Gly Gly Asn Ala Gln Lys Arg His Arg Ile His Arg Asp

115 120 125

Thr Met Met Glu Ile Met Ser Thr Gln Phe His Ala His Ile Lys Asp

130 135 140

Asn Pro Leu Gln Leu Val Asn Phe Arg Lys Ile Phe Glu Ser Glu Leu

145 150 155 160

Phe Ala Val Ser Met Lys Gln Ala Val Gly Lys Val Val Glu Ser Ile

165 170 175

Tyr Val Lys Glu Leu Gly Ser Thr Leu Ser Lys Asp Glu Val Phe Lys

180 185 190

Ile Leu Val Leu Asp Ile Met Glu Gly Ala Ile Glu Val Asp Trp Arg

195 200 205

Asp Phe Phe Pro Tyr Leu Arg Trp Val Pro Asn Lys Gly Val Glu Met

210 215 220

Lys Ile Gln Arg Leu Cys Thr Arg Arg Gln Ala Val Met Asp Ala Leu

225 230 235 240

Ile Ser Glu Ala Lys Ser Arg Ile Ala Ser Gly Gln Glu Leu Asn Cys

245 250 255

Tyr Val Asp His Leu Leu Ser Glu Val Lys Ser Leu Thr Glu Gln Gln

260 265 270

Ile Ser Met Leu Leu Trp Glu Pro Ile Ile Glu Thr Ser Asp Thr Thr

275 280 285

Leu Val Thr Thr Glu Trp Ala Met Tyr Glu Leu Ala Lys Asp Pro Met

290 295 300

Arg Gln Asp Arg Leu Phe Gln Glu Ile Gln Ser Val Cys Gly Ser Asn

305 310 315 320

Lys Phe Thr Glu Glu Asn Ile Ala Gln Val Pro Tyr Leu Gly Ala Val

325 330 335

Phe His Glu Thr Leu Arg Lys Tyr Ser Pro Ala Pro Ile Val Pro Leu

340 345 350

Arg Phe Ala His Glu Asp Thr Glu Ile Gly Gly Tyr Phe Ile Pro Ala

355 360 365

Arg Ser Glu Ile Ala Ile Asn Ile Tyr Gly Cys Asn Met Asp Lys Lys

370 375 380

Gln Trp Glu Asn Pro Glu Glu Trp Gln Pro Glu Arg Phe Leu Asp Gly

385 390 395 400

Gln Asn Asp Pro Ala Asp Leu Tyr Lys Thr Met Ala Phe Gly Ala Gly

405 410 415

Lys Arg Val Cys Ala Gly Ser Leu Gln Ala Ser Leu Ile Ala Cys Thr

420 425 430

Ala Ile Gly Arg Leu Val Gln Glu Phe Lys Trp Asn Leu Arg Glu Gly

435 440 445

Glu Glu Glu Ser Val Asp Thr Val Gly Leu Thr Thr His Lys Leu Asn

450 455 460

Pro Phe His Ala Ile Ile Arg Pro Arg Pro Arg Asn

465 470 475

<210> 2

<211> 1431

<212> DNA

<213> 华农红柚(Citrus maxima)

<400> 2

atggaattgg ctgttaatct tccacctgtt ccagaggttc caggaaggct accccttata 60

ggaaatttgt tacagttgaa agagaagaaa ccacacatga ctttcacaag atgggcagag 120

atgtatggac caatttattc tatcaaaact ggagcttcct ctatgattgt tctcaattcg 180

gctgatgttg ctaaagaggc catggtgacc agatatccat ccatttcaac aaggaagcta 240

tcaaatgccc tgaagatgct cacctctaat aaatgtatgg ttgcaacaag tgactacgat 300

gaatttcaca aaatggctaa acgatgttta ctcacaaatg ttttgggtgg aaatgctcag 360

aagcgacatc gaatccatag agacacaatg atggaaatta tgtcaaccca atttcatgct 420

cacatcaagg acaatcctct acaactagtg aatttcagga aaatatttga gtctgaactt 480

tttgcagtgt caatgaaaca ggctgtagga aaggttgtgg aatcaattta tgtgaaggag 540

cttggttcca cattgtcaaa agatgaggta tttaaaattt tagtgcttga cataatggag 600

ggagcaattg aggtggactg gagagacttc ttcccttacc taagatgggt tcctaataaa 660

ggcgtggaaa tgaaaattca gagattgtgt acccgcaggc aagcagtaat ggatgccctc 720

atcagcgagg ccaaaagcag aattgcttca ggacaggaac tgaattgtta tgttgatcac 780

ttgttgtcag aagtaaaatc acttacagag caacaaataa gcatgctgct ctgggagcct 840

atcatcgaga catcagatac tactttggtc acaacagaat gggccatgta tgagctcgca 900

aaggatccaa tgcgacagga ccgtctattt caggagattc aatcagtttg tgggtcaaac 960

aagtttactg aggaaaacat agcacaggtt ccttacttgg gagctgtttt ccatgaaact 1020

ctgagaaagt acagtccagc tccaatagtt cctttaagat ttgcacatga agataccgaa 1080

ataggaggat acttcattcc tgctagaagt gagattgcaa taaacatata cggatgcaac 1140

atggacaaga agcagtggga aaacccagag gagtggcaac ccgagagatt tcttgatggg 1200

caaaacgacc ctgcagattt gtacaagaca atggcctttg gagcaggaaa gagggtgtgc 1260

gcaggttctc ttcaggcaag tttgatagct tgcacagcaa taggtaggct ggtgcaggaa 1320

ttcaagtgga atctgagaga gggtgaggaa gaaagtgttg atactgttgg cctcactact 1380

cacaagctaa atcctttcca tgcaatcatt aggcctaggc ctaggaatta a 1431

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggattcaa taacttcgat ttct 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtgttaatg cttttcaggg ctag 24

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaagcagg ctcgatggat tcaataactt cgatttct 38

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agaaagctgg gtacgtgtta atgcttttca gggctag 37

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

Claims

1.一种细胞色素P450酶的应用，其特征在于，用于在植物体内催化芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物，所述植物体为柑橘果实，所述细胞色素P450酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述细胞色素P450酶的应用，其特征在于，所述细胞色素P450酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述细胞色素P450酶的应用，其特征在于，通过使柑橘植株中表达细胞色素P450基因来催化柑橘果实中的芳樟醇合成顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物，从而提高柑橘果实中顺式-芳樟醇氧化物和反式-芳樟醇氧化物的含量。