CN113373158B - 芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用，属于植物基因工程技术领域，所述芝麻SiWRKY67基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明首次报道了芝麻SiWRKY67基因在褪黑素合成中的功能与应用，通过构建SiWRKY67基因过表达载体，使其在芝麻毛状根的过量表达，验证了转基因芝麻毛状根中SiWRKY67能够诱导褪黑素的合成，证实了SiWRKY67基因具有正调控褪黑素合成，进而提高芝麻中褪黑素含量的功能，这对解析芝麻褪黑素含量遗传调控机制，培育高褪黑素芝麻新品种，提升芝麻营养品质具有重要意义。

Description

芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用。

背景技术

褪黑素(Melatonin)，是一种吲哚类激素，其化学名称为N-乙酰-5-甲氧基色胺，分子式为C₁₃H₁₆N₂O₂，分子量为232.28。1958年，褪黑素首次在奶牛松果腺中被发现，此后褪黑素在多种动物中被广泛鉴定。褪黑素广泛存在于人体内的各个部位，但含量极少(pg/mL水平)。在动物中，褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍，抗衰老、免疫调节、神经保护、抗肿瘤、对其他内分泌的调节、促进细胞生长等。1995年，褪黑素被发现在植物组织中广泛存在。包括人在内的动物都可以从含有褪黑素的食物中摄取褪黑素，从而在体内发挥生理保健作用，如改善睡眠、增加机体内免疫功能、清除自由基抗氧化损伤，保护生物大分子作用，使得褪黑素成为植物重要的功能性成分之一。然而植物中褪黑素含量非常低，因此提高植物特别是作物中的褪黑素含量，对于促进人类健康具有重要意义。植物中褪黑素的合成途径已十分清晰，但对褪黑素合成调控基因的报道甚少。

芝麻(Sesamum indicum L.)是重要而古老的油料作物之一，在我国已有2700年栽培历史。芝麻广泛分布在北纬40°到南纬40°的热带和亚热带地区，在亚洲、欧洲、非洲和美洲均有种植，其中亚洲和非洲的种植面积占世界种植面积90％以上。芝麻富含不饱和脂肪酸，油酸和亚油酸之和高达83％左右，蛋白质、钙、磷、铁、维生素E含量丰富。芝麻保健功能显著，特有的功能成分芝麻素和芝麻林素具有抗氧化、清除自由基、抗癌抗肿瘤等多种生理活性。芝麻香油、芝麻酱等深受我国消费者喜爱，是人民高质量生活不可或缺的特色食品。目前我国芝麻年消费和进口量均居世界之首，年消费总量达到150万吨。芝麻种子中褪黑素含量较高，是补充褪黑素的理想食源之一。因此，解析芝麻褪黑素含量遗传调控机制，发掘褪黑素合成调控基因，对于培育高褪黑素芝麻新品种，提升芝麻营养品质具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的空白，提供了芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用，通过SiWRKY67基因在芝麻毛状根的过量表达实验，证实了芝麻SiWRKY67基因具有正调控褪黑素合成的功能，从而提高芝麻中褪黑素含量，对解析芝麻褪黑素含量遗传调控机制，培育高褪黑素芝麻新品种，提升芝麻营养品质具有重要意义。

本发明的目的之一在于提供了芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用，其中所述芝麻SiWRKY67基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述芝麻SiWRKY67基因正调控褪黑素的合成。

进一步地，所述芝麻SiWRKY67基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。

本发明的目的之二在于提供了一种包含上述芝麻SiWRKY67基因的载体和/或细胞在调控褪黑素合成中的应用。

进一步地，所述包含芝麻SiWRKY67基因的载体为克隆载体或过表达载体

进一步地，所述过表达载体为将芝麻SiWRKY67基因与植物表达载体pCAMBIA1301S连接起来构建得到的载体pCAMBIA1301S-SiWRKY67。

进一步地，所述包含芝麻SiWRKY67基因的细胞的构建方法为：扩增如SEQ ID NO.1所示的芝麻SiWRKY67基因，双酶切获得线性化表达载体，将所述芝麻SiWRKY67基因与线性化载体连接并转入受体细胞中，培养筛选鉴定后得到。

进一步地，采用如序列表SEQ ID NO.3-4所示的引物扩增得到芝麻SiWRKY67基因。

本发明的目的之三在于提供了所述芝麻SiWRKY67基因，或所述芝麻SiWRKY67基因编码的蛋白，或所述包含芝麻SiWRKY67基因的载体和/或细胞在提高植物褪黑素含量中的应用。

进一步地，将包含芝麻SiWRKY67基因的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，并侵染芝麻子叶外植体，诱导外植体增殖分化，得到褪黑素含量提高的芝麻。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首次报道了芝麻SiWRKY67基因在褪黑素合成中的功能与应用，通过构建SiWRKY67基因过表达载体，使其在芝麻毛状根的过量表达，验证了转基因芝麻毛状根中SiWRKY67能够诱导褪黑素的合成，证实了SiWRKY67基因具有正调控褪黑素合成，进而提高芝麻中褪黑素含量的功能，这对解析芝麻褪黑素含量遗传调控机制，培育高褪黑素芝麻新品种，提升芝麻营养品质具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中芝麻种子褪黑素含量全基因组关联分析的曼哈顿图，其中SD和HB是两个不同环境表型的关联结果；

图2为本发明实施例1中含SiWRKY67基因的植物表达载体pCAMBIA1301S-SiWRKY67的表达图谱；

图3为本发明实施例2中转基因芝麻毛状根的诱导和培养，其中3-A为外植体侵染8天后产生的毛状根，图3-B为继代培养2周后的毛状根；

图4为本发明实施例2中转基因芝麻毛状根中GUS基因的PCR检测结果，其中VC为空载体对照，1-15为不同的转基因根系；

图5为本发明实施例2中转基因芝麻毛状根株系中SiWRKY67基因的荧光定量PCR检测结果，其中VC为空载体对照，SiWRKY67-OE#1，-OE#2，-OE#3为3个阳性转基因根系。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)，或Draper等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1芝麻SiWRKY67基因的获得与过表达载体构建

1、芝麻SiWRKY67基因的获得

(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取500份芝麻材料进行重测序分析；

(2)利用Illumina Hiseq 2500测序平台，用2×76双末端测序法对500份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)采用EMMAX软件包对两个环境的芝麻种子褪黑素含量进行全基因组关联分析，在两个环境中均检测到了1个位于6号连锁群上6839561bp处的SNP与种子褪黑素含量显著关联(P<10^-20)(如图1所示)；

(4)通过芝麻参考基因组比对和基因注释分析，在峰值SNP位点所在的候选区段筛选到一个WRKY转录因子SiWRKY67(登录号：LOC105163923)，猜测其可能与褪黑素含量相关；

(5)根据SiWRKY67基因的CDS序列，利用Primer5.0设计可以扩增其完整CDS序列的引物，引物序列(包含修饰碱基)如下：

SiWRKY67-F：

5’-AGCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGTCTTCCGCCTCTTTCACTAGT-3’(如SEQ ID NO.3所示)

SiWRKY67-R：

5’-CAGGTCGACTCTAGAGGATCCTCAGCGGAGCAAAGACTCGA-3’(如SEQ ID NO.4所示)；

(6)取高褪黑素含量芝麻种质G118开花10天后的种子，提取总RNA，逆转录为cDNA，以反转后的cDNA为模板，利用步骤(5)中的引物SiWRKY67-F/R进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得SiWRKY67基因序列，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、包含芝麻SiWRKY67基因的过表达载体构建

将上述克隆得到的芝麻SiWRKY67基因利用同源重组的方法与pCAMBIA1301S(本实验室提供，是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的遗传转化载体)质粒连接构建植物表达载体，命名为pCAMBIA1301S-SiWRKY67(载体图谱如图2所示)，具体操作如下：

(1)首先利用双酶切(BamHI和KpnI)(Takara)方法获得线性化载体，然后通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化获得高纯度线性化载体。

(2)将上述克隆得到的芝麻SiWRKY67基因目的片段DNA和线性化载体以3:1的摩尔比加到1.5mL的离心管中进行重组反应，混匀后在37℃放置约30min，加入10μL的反应液到50μL的DH5a感受态细胞中，用移液器轻轻混匀，于冰上孵育20min，42℃水浴中热激45秒后快速置冰上冷却2min。

(3)加入300μL LB液体培养基，37℃孵育45-60min。5000rpm离心2min收集菌体，弃掉部分上清，用剩余的培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Kan抗性的LB固体培养基上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养16-24h。

(4)挑取重组反应转化平板上若干个克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的菌落，挑取相应单菌落于含有Kan抗生素的液体LB培养基中37℃、200rpm培养箱中培养过夜，提取质粒或将菌液直接测序以及通过酶切电泳来鉴定载体准确性。

实施例2芝麻SiWRKY67基因在芝麻毛状根中的功能验证

将实施例1中制备的载体pCAMBIA1301S-SiWRKY67转入发根农杆菌K599，再侵染芝麻子叶外植体，诱导转基因毛状根的发生，并检测转基因毛状根中SiWRKY67基因的表达情况以及褪黑素含量。具体操作如下：

1、转SiWRKY67芝麻毛状根的诱导和培养

(1)重组载体转入农杆菌K599：

1)每100μL K599农杆菌感受态细胞中加入2μg质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

2)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养5h。6000rpm离心1min收集菌体，留取100μL左右上清，轻轻吹打重悬菌体，将其均匀地涂布于含有Kan的LB固体培养基上，倒置放于28℃培养箱培养2天，挑取若干个阳性克隆利用菌落PCR简单验证结果。

(2)芝麻毛状根的诱导和培养

1)将芝麻种子预先灭菌处理，具体灭菌方法为：无菌水摇晃冲洗1min；70％-75％乙醇处理30s；无菌水冲洗1次；3％次氯酸钠处理8-10min；无菌水冲洗1次；无菌水冲洗3-5次，每次1min；种子置于无菌滤纸上自然吹干。将灭菌后的芝麻种子接种到MS+蔗糖30g/L+琼脂8g/L+0.075％PPM，pH5.8培养基上。培养条件为温度28±2℃，光照强度1500-2000lux，光周期16h/8h，7-10d可获得芝麻无菌苗。

2)将子叶从芝麻无菌苗上分离，并在每个子叶上用解剖刀切出5mm左右的伤口2-3个，把处理好的子叶摆在MS培养基(NH₄NO₃ 1650mg/L+KNO₃ 1900mg/L+CaCl₂·2H₂O 440mg/L+MgSO₄·7H₂O 370mg/L+KH₂PO₄ 170mg/L+KI 0.83mg/L+H₃BO₃ 6.2mg/L+MnSO₄·4H₂O22.3mg/L+ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L+Na₂EDTA 37.25mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7-8g/L，pH 5.8)上保湿，等待用于农杆菌侵染。

3)将含有pCAMBIA1301S-SiWRKY67质粒的K599菌株在TY固体培养基(胰蛋白胨5g/L+酵母提取物3g/L+氯化钙10mmol/L+琼脂15g/L)上，28℃培养2-3d后，挑取单菌落接种到5mL TY液体培养基中，200rpm，28℃振荡培养24h。取1mL菌液继续接种到200mL液体TY培养基中，200rpm，28℃振荡至菌液OD₆₀₀值为0.6-0.8时，侵染处理过的子叶外植体10min。

4)将侵染后的子叶置于无菌滤纸上至子叶表面无多余菌液，然后放置在共培养基1/10MS(NH₄NO₃ 165mg/L+KNO₃ 190mg/L+CaCl₂·2H₂O 44mg/L+MgSO₄·7H₂O 37mg/L+KH₂PO₄17mg/L+KI 0.83mg/L+H₃BO₃ 6.2mg/L+MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L+ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L+Na₂EDTA37.25mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+MES 3.9g/L+琼脂8g/L+DTT 150mg/L+AS0.02g/L，pH5.4上，共培养3d。

5)将共培养后的外植体转入清洗培养基MS(NH₄NO₃ 1650mg/L+KNO₃1900mg/L+CaCl₂·2H₂O 440mg/L+MgSO4·7H₂O 370mg/L+KH₂PO₄ 170mg/L+KI0.83mg/L+H₃BO₃ 6.2mg/L+MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L+ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L+CuSO₄·5H₂O0.025mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L+Na₂EDTA37.25mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+噻孢霉素200-250mg/L+羧苄青霉素200-250mg/L，pH 5.8中，清洗3次，每次1min至培养基清澈，然后置于无菌滤纸上，自然吹干至子叶表面无明显水分后置于诱导生根和继代培养基1/2MS(NH₄NO₃ 825mg/L+KNO₃ 950mg/L+CaCl₂·2H₂O 220mg/L+MgSO₄·7H₂O 185mg/L+KH₂PO₄ 85mg/L+KI 0.83mg/L+H₃BO₃ 6.2mg/L+MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L+ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L+Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg/L+CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L+CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L+Na₂EDTA37.25mg/L+FeSO₄·7H₂O 27.85mg/L+肌醇100mg/L+甘氨酸2mg/L+盐酸硫胺素0.1mg/L+盐酸吡哆醇0.5mg/L+烟酸0.5mg/L)+蔗糖30g/L+MES 0.6g/L+200mg/L特美汀+琼脂7g/L，pH5.8上。7-8d后，从子叶与子叶柄伤口以及子叶伤口部位观察到有毛状根产生，如图3-A所示。

6)2周后，将快速生长的毛状根从外植体上切下，接种到新的诱导生根和继代培养基上继续扩大培养，继代培养后的毛状根如图3-B所示，以后每两周继代一次。

本发明上述所使用的培养基都是按照常规的灭菌方法处理的，高温高压(121℃，1.5个大气压)灭菌20min后使用的。

本发明的培养室是在常规的芝麻组织培养室(温度28℃左右，光照1000-1500lux，光/暗周期16h/8h，湿度70％左右)中进行的。

2、转基因毛状根PCR以及荧光定量PCR检测

在继代培养基上生长一段时间后，将获得的毛状根提取DNA进行PCR检测，PCR检测扩增pCAMBIA1301S载体上的GUS基因片段，所采用的引物为：

GUS-F：5’-GTCGCGCAAGACTGTAACCA-3’；

GUS-R：5’-CGGCGAAATTCCATACCTG-3’，

扩增产物为1078bp，扩增检测结果如图4所示，结果表明，发根农杆菌所携带的质粒基因已经整合进芝麻毛状根体内；

用RNA提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取3个阳性转基因毛状根总RNA，然后用反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)获得cDNA，以各自cDNA为模板，以芝麻Histone H3.3基因(LOC105159325)为内参，其中Histone H3.3基因的引物包括：

H3.3F：5’-GTTGGTCTCTTTGAGGAC-3’；

H3.3R：5’-CAGCTGGATGTCTTTTGG-3’；

用SiWRKY67特异引物SiWRKY67QRT-F/R：

SiWRKY67QRT-F：5’-CCATCGCAACAACAATACTG-3’；(SEQ ID NO.5)

SiWRKY67QRT-R：5’-CCATCATCGGACCTTCTG-3’；(SEQ ID NO.6)

对目标基因进行qRT-PCR表达验证(qRT-PCR Mix：南京诺唯赞生物科技有限公司；仪器：Roche

480)，检测结果如图5所示。结果表明：以空载体(VC)转化为对照，SiWRKY67基因在检测的3个转基因毛状根株系(SiWRKY67-OE#1，-OE#2，-OE#3)中表达量均显著提高(图5)。

3、转基因毛状根褪黑素含量测定

收集上述SiWRKY67超量表达的转基因毛状根家系和空载体转化材料，通过UHPLC-MS/MS检测其中褪黑素含量。样品用液氮冷冻后研磨成粉，称取0.2±0.001g于离心管中，加入1mL乙腈涡旋30s后置于4℃冰箱中12h。离心(10000g，4℃，20min)后收集上清液，在35℃下氮气蒸发至微干，加入100μL水/乙腈(90/10,v/v)复溶，过0.22μm有机膜后待上机。色谱条件为：色谱柱为Thermofisher Hypersil GOLD^TM C18(2.1mm×100mm,3μm)，流动相A为0.1％(v/v)的甲酸水溶液，流动相B为纯甲醇。梯度洗脱：1min，流动相A为95％；2.5min-5min，流动相A由80％到65％；5min-7.5min，流动相A由65％到10％；7.6min-10min，流动相A为95％。柱温40℃，进样量3μL，流速0.3mL/min。质谱条件为：电喷雾正离子模式(ESI+)电离，喷雾电压4000V，毛细管温度330℃，鞘气(N₂)8units，辅气(N₂)8units，碰撞气(Ar)1.5mTorr，扫描方式为SRM全扫模式，扫描时间0.2s。检测离子对为m/z 233→174；130。检测结果如表1所示。

表1 SiWRKY67超表达转基因毛状根株系的褪黑素含量

3个重复数据用平均值±标准差表示。VC：空载体对照。FW：鲜重。ND：未检出。

结果显示，在空载体对照中，褪黑素含量低于检出限，即含量未检出，而在3个SiWRKY67基因超量表达株系中，褪黑素含量可达0.329-0.406ng/g FW，即说明SiWRKY67基因具有正调控褪黑素合成的功能。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1629

<212> DNA

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

<400> 1

atgtcttccg cctctttcac tagtcttctt gcctccgacc accaccctac ttccgccgcc 60

gccgtcgtca gcaaaggtct tggtgatcgg atagcggaga ggacgggttc tggagttcct 120

aagttcaagt ctcttccgcc gccgtcgctt cccatatcgc caccgcccgc tgccttctct 180

ccttcttcct tctttgctat ccctcatggg ttgagccctg ccgagctttt ggattctcct 240

gttcttctgt cggcttctaa tattttgccc tctccaacta cagggacctt tccaattcag 300

ggtttcgatt ggaagagcaa gtctgacagg gcccagcagc agcaggaagt ggaaatcaaa 360

aatcaacaga agggcttctc ggatttctct ttccaagccc aaacaaagcc tctgacatct 420

tatggacagc agacatgggg ttatcaagaa cctgttaatc aagatgtttc atcatcagac 480

aaacccaacc aggaatcgga attcagttca acccatgagg tttctacatt ccaaacaagc 540

catcgcaaca acaatactgt ccgatcagaa tacgatcatt acaatcagtc atcacagaca 600

ataaacgaca acagaaggtc cgatgatggg tacaattgga ggaaatatgg gcagaaacag 660

gtgaagggga gtgaaaatcc acgaagctat tacaaatgca cgcaccccaa ttgtccgacc 720

aagaaaaaga tcgaacggtc gttggatgga cggatcactg aaattgttta caagggtact 780

cacaaccatc cgaagcctca gtcgggcagg agatcatcgt cgtcctcatc aacagcatcg 840

gcttcttcta tagtaattca gacttgcagt actcagtcca atgaaatccc tgagcagtcc 900

tatggattga atgctgccgg aaaagtggac tcctttgtct ctacaccaga gaactcttcg 960

atatctatcg aagatttgga gcagagtgct cagaagagca agtcgggtgg agatgagttc 1020

gatgaggttg agcctgatgc gaagagatgg aaaggtgaga atgagagtga aggtatttcg 1080

gcaatgggga ataggacagt gagagagcca agagttgtag ttcaaactat gagtgatata 1140

gatatactcg atgatggata tagatggaga aaatatggtc agaaagtggt caagggaaat 1200

cccaatccca ggagctatta caagtgcact agtcaagggt gtcaagtaag gaaacacgtg 1260

gaacgagcgg cccacgacac gagggccgtg ataaccacct acgaggggaa gcacaaccac 1320

gatgtccctg ctgctcgtgg cagtggcaac agcagttccc ttagcagaac cgtgccgtat 1380

attccaagca acaatgcaac cattgctgca gttaggccta taacgttgca gcataacttg 1440

gcttatccaa tgccagtccg cagcagtgca aggccaccga cggttgaaga tgatgcaccg 1500

tatatgtcgg agagccatag acattcaaga ttcggaaact caataacttc ttgcgtcgac 1560

aatgcgttgt tttcaagagc taaggacgag cccggagacg acatgtttct cgagtctttg 1620

ctccgctga 1629

<210> 2

<211> 542

<212> PRT

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

<400> 2

Met Ser Ser Ala Ser Phe Thr Ser Leu Leu Ala Ser Asp His His Pro

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ala Ala Val Val Ser Lys Gly Leu Gly Asp Arg Ile Ala

20 25 30

Glu Arg Thr Gly Ser Gly Val Pro Lys Phe Lys Ser Leu Pro Pro Pro

35 40 45

Ser Leu Pro Ile Ser Pro Pro Pro Ala Ala Phe Ser Pro Ser Ser Phe

50 55 60

Phe Ala Ile Pro His Gly Leu Ser Pro Ala Glu Leu Leu Asp Ser Pro

65 70 75 80

Val Leu Leu Ser Ala Ser Asn Ile Leu Pro Ser Pro Thr Thr Gly Thr

85 90 95

Phe Pro Ile Gln Gly Phe Asp Trp Lys Ser Lys Ser Asp Arg Ala Gln

100 105 110

Gln Gln Gln Glu Val Glu Ile Lys Asn Gln Gln Lys Gly Phe Ser Asp

115 120 125

Phe Ser Phe Gln Ala Gln Thr Lys Pro Leu Thr Ser Tyr Gly Gln Gln

130 135 140

Thr Trp Gly Tyr Gln Glu Pro Val Asn Gln Asp Val Ser Ser Ser Asp

145 150 155 160

Lys Pro Asn Gln Glu Ser Glu Phe Ser Ser Thr His Glu Val Ser Thr

165 170 175

Phe Gln Thr Ser His Arg Asn Asn Asn Thr Val Arg Ser Glu Tyr Asp

180 185 190

His Tyr Asn Gln Ser Ser Gln Thr Ile Asn Asp Asn Arg Arg Ser Asp

195 200 205

Asp Gly Tyr Asn Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Gln Val Lys Gly Ser

210 215 220

Glu Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr His Pro Asn Cys Pro Thr

225 230 235 240

Lys Lys Lys Ile Glu Arg Ser Leu Asp Gly Arg Ile Thr Glu Ile Val

245 250 255

Tyr Lys Gly Thr His Asn His Pro Lys Pro Gln Ser Gly Arg Arg Ser

260 265 270

Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ile Val Ile Gln Thr

275 280 285

Cys Ser Thr Gln Ser Asn Glu Ile Pro Glu Gln Ser Tyr Gly Leu Asn

290 295 300

Ala Ala Gly Lys Val Asp Ser Phe Val Ser Thr Pro Glu Asn Ser Ser

305 310 315 320

Ile Ser Ile Glu Asp Leu Glu Gln Ser Ala Gln Lys Ser Lys Ser Gly

325 330 335

Gly Asp Glu Phe Asp Glu Val Glu Pro Asp Ala Lys Arg Trp Lys Gly

340 345 350

Glu Asn Glu Ser Glu Gly Ile Ser Ala Met Gly Asn Arg Thr Val Arg

355 360 365

Glu Pro Arg Val Val Val Gln Thr Met Ser Asp Ile Asp Ile Leu Asp

370 375 380

Asp Gly Tyr Arg Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Val Lys Gly Asn

385 390 395 400

Pro Asn Pro Arg Ser Tyr Tyr Lys Cys Thr Ser Gln Gly Cys Gln Val

405 410 415

Arg Lys His Val Glu Arg Ala Ala His Asp Thr Arg Ala Val Ile Thr

420 425 430

Thr Tyr Glu Gly Lys His Asn His Asp Val Pro Ala Ala Arg Gly Ser

435 440 445

Gly Asn Ser Ser Ser Leu Ser Arg Thr Val Pro Tyr Ile Pro Ser Asn

450 455 460

Asn Ala Thr Ile Ala Ala Val Arg Pro Ile Thr Leu Gln His Asn Leu

465 470 475 480

Ala Tyr Pro Met Pro Val Arg Ser Ser Ala Arg Pro Pro Thr Val Glu

485 490 495

Asp Asp Ala Pro Tyr Met Ser Glu Ser His Arg His Ser Arg Phe Gly

500 505 510

Asn Ser Ile Thr Ser Cys Val Asp Asn Ala Leu Phe Ser Arg Ala Lys

515 520 525

Asp Glu Pro Gly Asp Asp Met Phe Leu Glu Ser Leu Leu Arg

530 535 540

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctttcgcg agctcggtac catgtcttcc gcctctttca ctagt 45

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caggtcgact ctagaggatc ctcagcggag caaagactcg a 41

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccatcgcaac aacaatactg 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccatcatcgg accttctg 18

Claims (10)

1.芝麻SiWRKY67基因在调控褪黑素合成中的应用，其特征在于，所述芝麻SiWRKY67基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芝麻SiWRKY67基因正调控褪黑素的合成。

3.根据权利要求1所述的芝麻SiWRKY67基因编码的蛋白在调控褪黑素合成中的应用，其特征在于，所述芝麻SiWRKY67基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.一种包含如权利要求1所述的芝麻SiWRKY67基因的载体和/或细胞在调控褪黑素合成中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包含芝麻SiWRKY67基因的载体为克隆载体或过表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述过表达载体为将芝麻SiWRKY67基因与植物表达载体pCAMBIA1301S连接起来构建得到的载体pCAMBIA1301S-SiWRKY67。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述包含芝麻SiWRKY67基因的细胞的构建方法为：扩增如SEQ ID NO.1所示的芝麻SiWRKY67基因，双酶切获得线性化表达载体，将所述芝麻SiWRKY67基因与线性化载体连接并转入受体细胞中，培养筛选鉴定后得到。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用如序列表SEQ ID NO.3-4所示的引物扩增得到芝麻SiWRKY67基因。

9.如权利要求1中所述的芝麻SiWRKY67基因，或如权利要求3中所述的蛋白，或如权利要求4中所述的包含芝麻SiWRKY67基因的载体和/或细胞在提高植物褪黑素含量中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将包含芝麻SiWRKY67基因的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，并侵染芝麻子叶外植体，诱导外植体增殖分化，得到褪黑素含量提高的芝麻。

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