CN114317570A

CN114317570A - 一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用

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Publication number: CN114317570A
Application number: CN202111633759.XA
Authority: CN
Inventors: 王长泉; 王伟男; 孙晶晶; 陆俊; 刘金义
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及基因工程应用技术领域，提供一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用。本发明提供编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS，所述基因RcAOS的CDS序列如SEQ ID NO.1所示；提供了编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA，所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；以及所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS在抗月季灰霉病中的应用。过表达基因RcAOS能够增强月季对灰霉病的抗性，而沉默该基因使得月季对灰霉病的防御减弱。该发明为通过提升植物内源茉莉酸合成来提高抗病性提供了指导与依据，为月季生产中病害的绿色防控提供新的思路。

Description

一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程应用技术领域，尤其涉及一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用。

背景技术

灰霉菌属半知菌亚门真菌，是最主要的真菌病原体之一，具有寄主范围广、致病能力强和杀灭难度大等特点。灰霉菌是一种死体营养型病菌，在侵染时会杀死寄主的细胞和组织，由局部病斑扩散至整个器官，严重时可导致植株腐烂，在园艺生产中造成了巨大的经济损失。月季是世界四大切花之一，具有极高的经济价值和观赏价值。在温室以及大田生产中，灰霉病均被认为是月季最严重的病害之一。月季在温度20～25℃、湿度较高时生长最旺盛，但同时也是灰霉菌的最适生长条件，该病害已成为制约月季观赏性栽培及生产的主要因素之一。

茉莉酸是植物体内广泛存在的一类环戊酮衍生物类信号分子与生长调节物质。月季RcAOS基因所编码的丙二烯氧化物合酶(AOS)是茉莉酸生物合成途径中第一个特异性的酶，在叶绿体中调控13(S)-氢过氧-亚麻酸(13-HPOT)转化为有光学活性的12-氧-植物二烯酸(12-OPDA)，再经过一系列反应最终合成茉莉酸，并通过茉莉酸信号转导途径诱导下游防御机制的激活。研究表明，外源施用茉莉酸甲酯可以诱导植物自身产生抗病性反应。

灰霉病菌变异速度快，极易产生抗药性，以往通过化学防治不仅使生产成本大幅上升、病菌抗药性快速提高，同时也带来严重的药害，对地区物种多样性造成危害。因此，利用茉莉酸诱导植物自身产生抗病性为科学防治灰霉病提供了新的方法并得到广泛关注。然而，目前关于月季RcAOS基因在月季抗灰霉病方面的研究与应用还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS，过表达该基因能够增强月季对灰霉病的抗性，而沉默该基因使得月季对灰霉病的防御减弱。该发明为通过提升植物内源茉莉酸合成来提高抗病性提供了指导与依据，为月季生产中病害的绿色防控提供了新的思路，为选育高抗病性月季品种奠定了基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS，所述基因RcAOS的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了基因RcAOS的过表达载体，包括所述的基因RcAOS的CDS序列和初始载体。

本发明提供了编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA，所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了基因RcAOS的干扰载体，包括转录基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列和初始载体。

本发明提供了编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS或基因RcAOS的过表达载体在抗月季灰霉病中的应用。

优选的，所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS或基因RcAOS的过表达载体的应用包括以下步骤：

克隆扩增获得基因RcAOS；

应用Gateway技术将所述基因RcAOS重组于初始载体获得基因RcAOS的过表达载体；

将所述基因RcAOS的过表达载体采用农杆菌介导法转化到月季中。

优选的，所述克隆扩增基因RcAOS步骤中，克隆扩增基因RcAOS的引物包括RcAOS-F和RcAOS-R，所述RcAOS-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述RcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

本发明提供了编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA或基因RcAOS的干扰载体在阻断月季内源茉莉酸的生物合成中的应用。

优选的，所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA或基因RcAOS的干扰载体的应用包括以下步骤：

克隆扩增获得编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列；

应用Gateway技术将所述编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列重组于初始载体获得基因RcAOS的干扰载体；

将所述基因RcAOS的干扰载体采用农杆菌介导法转化到月季中。

优选的，所述克隆扩增获得编码基因RcAOS的干扰RNA核苷酸序列的步骤中，克隆扩增所述编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列的引物包括RcAOSRNAi-F和RcAOSRNAi-R，所述RcAOSRNAi-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述RcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。

本发明所述的基因RcAOS的表达与月季抗病性有关，过表达该基因后月季对灰霉病的抗性增强，具体表现为病斑减小，干扰该基因后月季更易受到灰霉病侵染，具体表现为病斑变大。该基因通过调控月季内源性茉莉酸的生物合成参与月季对灰霉病的防御，通过对该基因的应用能够为月季生产中灰霉病的防治提供新的途径。

本发明通过构建月季茉莉酸合成途径核心基因RcAOS的过表达载体以及干扰载体，通过转基因促进或阻断植物体内内源茉莉酸的生物合成。过表达载体转化月季叶片的基因RcAOS表达量显著上调，干扰载体转化月季叶片的基因RcAOS表达量明显下调。

附图说明

图1为RcAOS-R05过表达载质粒图谱；

图2为RcAOS-R03干扰载体质粒图谱；

图3为载体质粒和插入片段的交叉引物进行PCR产物电泳图，其中OE-Control为以‘月月粉’野生型叶片基因组DNA为模板，以RcAOS-R05质粒和插入片段的交叉引物进行PCR扩增产物的电泳结果；OE-RcAOS为以RcAOS-R05转化叶片基因组DNA为模板，以RcAOS-R05质粒和插入片段的交叉引物进行PCR扩增产物的电泳结果；Ri-Control为以‘月月粉’野生型叶片基因组DNA为模板，以RcAOS-R03质粒和插入片段的交叉引物进行PCR扩增产物的电泳结果；Ri-RcAOS为以RcAOS-R03转化叶片基因组DNA为模板，以RcAOS-R03质粒和插入片段的交叉引物进行PCR扩增产物的电泳结果；

图4为野生型、RcAOS-R05转化叶片、RcAOS-R03转化叶片中RcAOS基因的相对表达量分析结果，其中Control为野生型叶片RcAOS基因的相对表达量；OE-RcAOS为RcAOS-R05转化叶片中RcAOS基因的相对表达量；Ri-RcAOS为RcAOS-R03转化叶片中RcAOS基因的相对表达量；

图5为接种灰霉菌48h后病斑表型图，其中Control野生型叶片病斑表型；OE-RcAOS为RcAOS-R05转化叶片病斑表型；Ri-RcAOS为RcAOS-R03转化叶片病斑表型；

图6为接种灰霉菌48h后病斑直径统计图，其中Control为野生型叶片病斑直径；OE-RcAOS为RcAOS-R05转化叶片病斑直径；Ri-RcAOS为RcAOS-R03转化叶片病斑直径。

具体实施方式

本发明提供了一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS，所述基因RcAOS的CDS序列，优选的如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述过表达载体的初始载体为pFAST-R05，基因片段和载体的重组策略为Gateway技术，将RcAOS的CDS序列正向插入载体的attR1和attR2之间。

优选的，所述干扰载体的初始载体为pFAST-R03，干扰片段和载体的重组策略为Gateway技术，将干扰序列分别双向插入载体的2个attR1和attR2之间。

本发明中，优选的所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS或基因RcAOS的过表达载体的应用包括以下步骤：

克隆扩增获得基因RcAOS；

将所述基因RcAOS的过表达载体采用农杆菌介导法转化到月季中；

进一步优选的还包括：

在得到过表达转化的月季后，使用交叉引物PCR方法，通过CTAB法提取转化叶片的DNA作为模板，使用来自质粒与插入片段的交叉引物从基因组水平上克隆特异性条带；交叉引物优选为P35S-F和RcAOS-R，所述P35S-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，所述RcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，验证RcAOS-R05载体是否成功整合进基因组中，PCR产物有扩增条带为转化成功，无条带为转化不成功或者未转化的野生型对照，反应体系及程序如下：

表1验证RcAOS-R05过表达载体反应体系

PCR反应程序如下：

94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃2min

GOTO step2×35

72℃5min

4℃保存；

在验证载体成功整合进基因组后，使用荧光定量PCR方法，转化月季叶片取样并提取RNA，反转录得到的cDNA稀释8倍后作为模板；以表5所述PCR反应体系，混合离心后在型号为Bio-Rad CFX96 RT-PCR的荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为：95℃30s；95℃5s，60℃30s，95℃15s，40个循环；65℃60s；95℃15s。

并且在最后构建溶解曲线，以验证引物的特异性。以RcGAPDH为内参基因，每个处理进行三次生物学重复和三次技术重复，对定量结果用2^-ΔΔCT方法进行计算，得到目标基因的相对表达量，检测转化成功的月季叶片中RcAOS基因的表达量；

对转化成功的月季叶片进行抗灰霉病鉴定。

本发明中，优选的采用注射器法将过表达载体转入月季中。

本发明中，所述克隆扩增基因RcAOS的CDS序列的步骤中，提取野生型叶片总RNA并进行反转录，得到扩增所需的模板cDNA，利用高保真PCR技术进行克隆；克隆扩增基因RcAOS的CDS序列的引物优选为RcAOS-F和RcAOS-R，所述RcAOS-F引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.3，所述RcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。使用TRANSGEN公司的FastPfu FlyDNA聚合酶进行RcAOS基因CDS序列的克隆，反应体系及程序如下：

表2 RcAOS基因CDS序列扩增体系

PCR反应程序为：

95℃2min

95℃20s

55℃20s

72℃30s

GOTO step2×35

72℃5min

4℃保存。

克隆扩增获得编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列；

将所述基因RcAOS的干扰载体采用农杆菌介导法转化到月季中；

进一步优选的还包括：

在得到干扰表达的月季后，使用交叉引物PCR方法，通过CTAB法提取转化叶片的DNA作为模板，使用来自质粒与插入片段的交叉引物从基因组水平上克隆特异性条带；交叉引物优选为T35S-F和RcAOSRNAi-R，所述T35S-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，所述RcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6，验证RcAOS-R03载体是否成功整合进基因组中，PCR产物有扩增条带为转化成功，无条带为转化不成功或者未转化的野生型对照，反应体系及程序如下：

表3验证RcAOS-R03干扰载体反应体系

PCR反应程序如下：

94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃1min

GOTO step2×35

72℃5min

4℃保存；

对转化成功的月季叶片进行抗灰霉病鉴定。

本发明中，提取野生型叶片总RNA并进行反转录，得到扩增所需的模板cDNA，利用高保真PCR技术进行克隆；所述克隆扩增获得编码基因RcAOS的干扰RNA核苷酸序列的步骤中，克隆扩增所述编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列的引物优选为RcAOSRNAi-F和RcAOSRNAi-R，所述RcAOSRNAi-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述RcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6使用TRANSGEN公司的FastPfu Fly DNA聚合酶进行RcAOS基因干扰RNA核苷酸序列的克隆，反应体系及程序如下：

表4 RcAOS基因干扰RNA核苷酸序列扩增体系

PCR反应程序为：

95℃2min

95℃20s

55℃20s

72℃15s

GOTO step2×35

72℃5min

4℃保存。

本发明中，对验证成功的过表达载体RcAOS-R05、干扰载体RcAOS-R03转化月季叶片优选的分别进行灰霉病病菌接种，48h后进行病斑大小统计，并与野生型叶片进行对比。

本发明中，所述验证RcAOS-R05载体的交叉引物优选为P35S-F和RcAOS-R，所述P35S-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.7，所述RcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

本发明中，所述验证RcAOS-R03载体交叉引物优选为T35S-F和RcAOSRNAi-R，所述T35S-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.8，所述RcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ IDNO.6。

本发明中，所述正常月季叶片检测RcAOS基因的表达量的内参基因的引物优选为qRcGADPH-F和qRcGADPH-R，所述qRcGADPH-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，所述qRcGADPH-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.10。

本发明中，所述过表达载体转化月季叶片检测RcAOS基因的表达量的引物优选为qRcAOS-F和qRcAOS-R，所述qRcAOS-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.11，所述qRcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

本发明中，所述干扰载体转化月季叶片检测RcAOS基因的表达量的引物优选为qRcAOSRNAi-F和qRcAOSRNAi-R，所述qRcAOSRNAi-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.13，所述qRcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.14。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

月季RcAOS基因过表达叶片以及干扰叶片的获得及其抗灰霉病能力鉴定

一、供试材料：本实验中的供试材料为月季品种‘月月粉’(Rosa chinensis'OldBlush')组培苗叶片。

二、实验方法：

(1)供试月季组培苗叶片的获得：以‘月月粉’的体外繁殖芽作为起始材料，在增殖培养基(MS+1.5mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L sucrose+6.5g/Lagar，pH值为5.75)上每3-4周进行传代培养，获得一定量的组培苗后取部分转接至生根培养基(MS+30g/L sucrose+6.5g/L agar，pH值为5.75)上，待叶片宽度约8mm时，可用于转化以及灰霉菌侵染实验。

(2)载体质粒转化农杆菌及其鉴定：

提取‘月月粉’野生型叶片总RNA并进行反转录，得到扩增所需的模板cDNA。然后根据‘月月粉’基因组数据设计目的片段RcAOS-CDS、RcAOS-RNAi的扩增引物，利用高保真PCR技术进行克隆。克隆产物送测并将所得序列与‘月月粉’基因组数据进行比对，确认序列完全一致后将产物构建到入门载体上，并应用Gateway技术通过LR反应将RcAOS-CDS、RcAOS-RNAi片段分别构建到终载RcAOS-R05质粒以及RcAOS-R03质粒上。

采用冻融法将构建完成的RcAOS-R05质粒或RcAOS-R03质粒转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞中。具体步骤：将1.5μL RcAOS-R05以及RcAOS-R03载体质粒加入100μL农杆菌GV3101感受态细胞中；液氮速冻5min，37℃水浴5min；在超净工作台中加入1mLYEB液体培养基，28℃，200rpm摇床震荡5h；12000rpm，室温离心1min，吸弃上清，剩余100-150μL上清液用于重悬沉淀；将重悬液均匀涂布于含Spec(终浓度50μg/mL)、Rif(终浓度50μg/mL)以及Gen(终浓度50μg/mL)的YEB固体培养基上，28℃，倒置暗培养48-72h，直到长出单克隆菌落。挑取单克隆，摇菌并用交叉引物进行菌液PCR以检测质粒是否成功转进农杆菌中。挑取条带正确且明亮的单克隆摇菌，与50％甘油1:1混匀，保存于-80℃冰箱中备用。

所用引物序列如下：

克隆引物：

RcAOS-F:5’-CACCATGGCTTCTACTTCCTCCTTAGCT-3’(SEQ ID NO.3)

RcAOS-R:5’-AAAGCTAGCTCTTTTGAGCGAGGT-3’(SEQ ID NO.4)

RcAOSRNAi-F:5’-CACAGCGAACTAGCGCAGGA-3’(SEQ ID NO.5)

RcAOSRNAi-R:5’-AACAGCCTTGACGCCAGCAT-3’(SEQ ID NO.6)

鉴定用交叉引物：

P35S-F:5’-GACGTTCCAACCACGTCTTCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)

RcAOS-R:5’-AAAGCTAGCTCTTTTGAGCGAGGT-3’(SEQ ID NO.4)

T35S-F:5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3’(SEQ ID NO.8)

RcAOSRNAi-R:5’-AACAGCCTTGACGCCAGCAT-3’(SEQ ID NO.6)

(3)侵染菌液的制备：将保存好的含有RcAOS-R05和RcAOS-R03质粒的农杆菌重新划板，挑取单克隆于2mLYEB液体培养基中(加入抗生素50μg/mL Spec、50μg/mL Rif、50μg/mL Gen)，28℃震荡培养1天至液体浑浊。将浑浊的农杆菌转到50mL YEB液体培养基中过夜培养(加入抗生素50μg/mL Spec、50μg/mL Rif、50μg/mL Gen)。用紫外线分光光度计检测过夜培养的菌液OD600的值，选取OD600在0.8至1之间浓度的菌液。将菌液转移至50mL离心管内，4000rpm离心10min，倒去上清液，加入MS缓冲液(MS 4.74g/L，以无菌水做为溶剂)悬浮菌体，以不含有目的基因片段的空载质粒菌液作为对照。

(4)采用注射器法对月季叶片进行侵染：选取宽度大于8mm、生长状态良好，大小均匀一致的月季组培苗叶片放入50ml注射器针筒中，将农杆菌悬浮液吸入注射器内，用拇指按压注射器上下来回抽8min，待叶片呈现半透明状，悬浮液充分进入叶片中后，从针筒中取出叶片并用无菌水清洗，放入含有1％琼脂的覆盖透明圆顶培养皿中，用于灰霉菌接种实验。

(5)验证载体是否成功整合到植物基因组内：通过CTAB法提取转化叶片的DNA，使用来自质粒与插入片段的交叉引物从基因组水平上克隆特异性条带，验证RcAOS-R05、RcAOS-R03载体是否成功整合进基因组中。

所用交叉引物序列如下：

P35S-F:5’-GACGTTCCAACCACGTCTTCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)

RcAOS-R:5’-AAAGCTAGCTCTTTTGAGCGAGGT-3’(SEQ ID NO.4)

T35S-F:5’-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3’(SEQ ID NO.8)

RcAOSRNAi-R:5’-AACAGCCTTGACGCCAGCAT-3’(SEQ ID NO.6)

(6)采用荧光定量PCR方法检测RcAOS基因过表达以及干扰载体转化月季叶片中RcAOS基因表达量：根据‘月月粉’基因组数据设计荧光定量引物，过表达株系在基因序列中跨保守结构域设计一对引物，干扰株系在基因序列中跨5’UTR区设计一对引物，利用Premier 5.0软件和Oligo网站设计特异性扩增引物，并由安徽通用有限公司合成。

对照以及转化月季叶片取样并提取RNA，反转录得到的cDNA稀释8倍后作为模板，参照

Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)的操作说明书，对样品中RcAOS基因的表达量进行检测，每个定量管中的反应体系如下：

表5荧光定量PCR反应体系

混合离心后在型号为Bio-Rad CFX96 RT-PCR的荧光定量PCR仪上进行反应，反应程序为：

95℃30s

95℃5s

60℃30s

95℃15s

GOTO step 2×40

65℃60s

95℃15s

并且在最后插入溶解曲线，以验证引物的特异性。以RcGAPDH为内参基因，每个处理进行三次生物学重复和三次技术重复，对定量结果用2^-ΔΔCT方法进行计算，得到目标基因的相对表达量。

所用引物序列如下：

qRcGADPH-F:5’-GGTCAAGGTCATTGCTTGGT-3’(SEQ ID NO.9)

qRcGADPH-R:5’-GGATCGATCACATCGACAGA-3’(SEQ ID NO.10)

qRcAOS-F:5’-TGTGCCAGACAGGTTTGTCG-3’(SEQ ID NO.11)

qRcAOS-R:5’-CACTGTTTGTTCCCGACCGT-3’(SEQ ID NO.12)

qRcAOSRNAi-F:5’-AGCCACCTGCAAATTAATGGCT-3’(SEQ ID NO.13)

qRcAOSRNAi-R:5’-ACGGCGAGTGGATGGGAATG-3’(SEQ ID NO.14)

(7)RcAOS基因过表达以及干扰月季叶片的抗灰霉病鉴定

将宽度大于8mm、生长状态良好，大小均匀一致的‘月月粉’野生型叶片以及RcAOS基因过表达、干扰载体转化叶片放在有透明圆顶且含1％琼脂培养皿中，在每片叶子上接种8μL浓度为10⁶孢子/mL的有机葡萄汁与灰霉菌孢子混合悬浮液(混合体积比为1:1)，并放置于22℃光照培养箱中进行培养。

接种灰霉菌孢子48h后对叶片表面病斑进行拍照，使用image J软件测量病斑直径，统计至少30个病斑图像，用SPSS软件对数据进行差异显著分析。

三、实验结果

如图3所示，使用来自RcAOS-R05以及RcAOS-R03质粒与插入片段的交叉引物从基因组水平上克隆得到特异性条带，证明RcAOS-R05、RcAOS-R03载体分别已经成功整合进月季基因组中，通过转化获得RcAOS基因过表达以及干扰月季叶片各40片。

如图4所示qRT-PCR结果，相较于‘月月粉’野生型叶片，RcAOS过表达叶片中RcAOS基因的表达量显著上升，而RcAOS干扰叶片中RcAOS基因的表达量发生了明显的下调。实验结果表明RcAOS-R05过表达载体转化后在月季叶片中促进RcAOS基因的表达，RcAOS-R03干扰载体转化后抑制了RcAOS基因的表达。

如图5、图6所示转化叶片抗病性鉴定结果显示：接种灰霉菌混合孢子悬浮液48h后，RcAOS过表达叶片的病斑面积明显小于对照，且病斑直径显著低于对照；而RcAOS干扰叶片的病斑面积明显大于对照，且病斑直径显著高于对照。实验结果表明，RcAOS过表达叶片对灰霉病抗性得到了显著的提升，RcAOS干扰叶片对灰霉病的抗性明显减弱。

通过以上实验结果可以明确得到：本发明通过构建月季RcAOS基因的过表达以及干扰载体并将其分别转化月季叶片，得到RcAOS过表达以及干扰月季叶片；RcAOS过表达叶片中RcAOS基因表达量显著上升，对灰霉病抵抗力明显提高；RcAOS干扰叶片中RcAOS基因表达量显著下调，灰霉病抗性明显减弱。

本发明所述月季RcAOS基因的表达与灰霉病抗病性有关，过表达该基因后月季对灰霉病的抗性增强，干扰该基因后月季更易受到灰霉病侵染。该基因所编码的丙二烯氧化物合酶(AOS)是茉莉酸生物合成途径中第1个特异性的酶，通过调控月季内源性茉莉酸的生物合成途径参与月季对灰霉病的防御。过表达该基因促进了月季体内茉莉酸的合成与积累，进而激活茉莉酸信号转导途径下游基因的表达，从而增强了月季对灰霉病的抗性；反之，沉默该基因的表达则产生相反的作用，使得月季更易感病。通过对该基因的应用能够为月季生产中灰霉病的防治提供新的途径。

综上所述，该发明为通过提升植物内源茉莉酸合成来提高抗病性提供了指导与依据，为月季生产中病害的绿色防控提供了新的思路，为选育高抗病性月季品种奠定了基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS及其在抗月季灰霉病中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcttcta cttcctcctt agctttccct tctctgcagc tacaattcca aacaccacgc 60

aagtcattcc catccactcg ccgtattttc ctccgtccga tctgcgcatc cgtctcggag 120

aagtcatcgt cttcatcctc ctccatctca tcacaacccg cagagccaac caagcttccc 180

ttgaggaaaa tccccggcga ctatggcctt cccttcgtgg gtcccctcaa ggatcgccag 240

gactacttct acaaccaagg ccgggaggag ttcttcaagt ctcgtatcca gaagcaccag 300

tccaccgtgt tcagagtcaa catgccacct ggccccttca tcaccaccaa atcccaggtc 360

gtcgtcttgc tcgacggcaa gagcttcccg gtcctctttg acgtttccaa ggtcgaaaag 420

aaagacctct tcaccggcac ctacatgccc tcattggagc tcaccggcgg ttacagaatt 480

ctctcctacc tcgacccctc ggagcccaag cacgacaagc tcaagcgtgt aatgttctat 540

ctcctaaagt ctggtattaa gtctgtgatc cctgagttcc actcaagcta cgccgagttt 600

tttgaaactc tggaaaccaa gctcgctgat aatggtaaag ccagcttcaa cgaggccaac 660

gatcaagcag ctttcaattt cttggctcgc tcactctacg gtgctaatcc ggccgatacc 720

caactcggca ccgacggtcc taaattggtc cagaaatggg ttctattcca actgagtccg 780

attctagttc ttggtctacc aaagttcatt gaagattctc tgtttcacac cttccctctc 840

ccaccgtttt tggtcaagaa agactaccag agactctacg acttcttcta ccagtcatcc 900

ggccacgtgc tcgacgaggc agagaggctc ggagtgtcca gagacgaagc gtgtcacaac 960

ctgttgttcg ccacgtgttt caactcattc ggaggtatga agcttttatt tcccagcatg 1020

ctcaagtgga tcggccgcgc cggggccaaa ctccacagcg aactagcgca ggagatccgc 1080

tcggccgtca gatccaacgg cgggaaaatc accatgtccg ccatggagca aatgccgttg 1140

atgaagtctg tggtgtacga agctttccgg atcgagccac cggttcctct acagtacggt 1200

agggcaaaga ctgacctagt catcgagagc cacgacgcgg cgtttaaggt gaaagaaggc 1260

gagatgttat ttgggttcca accttttgcg accaaggacc ccaaaatctt cgaaaaagcc 1320

gcggagtttg tgccggacag gtttgtcggt gaagaagggg agaagttgtt acagcacgtg 1380

ctttggtcca acggtccgga gacggaaact ccgacggtcg ggaacaaaca gtgtgccgga 1440

aaagacttcg tcatgctggc gtcaaggctg ttggtggtgg agttttttct ccgatatgat 1500

tcgttcgaga ttgaagttgc tgcttcgcct ttgggagctg ccattaccat gacctcgctc 1560

aaaagagcta gcttttga 1578

<210> 2

<211> 419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cacagcgaac tagcgcagga gatccgctcg gccgtcagat ccaacggcgg gaaaatcacc 60

atgtccgcca tggagcaaat gccgttgatg aagtctgtgg tgtacgaagc tttccggatc 120

gagccaccgg ttcctctaca gtacggtagg gcaaagactg acctagtcat cgagagccac 180

gacgcggcgt ttaaggtgaa agaaggcgag atgttatttg ggttccaacc ttttgcgacc 240

aaggacccca aaatcttcga aaaagccgcg gagtttgtgc cggacaggtt tgtcggtgaa 300

gaaggggaga agttgttaca gcacgtgctt tggtccaacg gtccggagac ggaaactccg 360

acggtcggga acaaacagtg tgccggaaaa gacttcgtca tgctggcgtc aaggctgtt 419

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccatggct tctacttcct ccttagct 28

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagctagct cttttgagcg aggt 24

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacagcgaac tagcgcagga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aacagccttg acgccagcat 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gacgttccaa ccacgtcttc aaag 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggtcactgg attttggttt tagg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtcaaggtc attgcttggt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatcgatca catcgacaga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtgccagac aggtttgtcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cactgtttgt tcccgaccgt 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agccacctgc aaattaatgg ct 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acggcgagtg gatgggaatg 20

Claims

1.一种编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS，其特征在于，所述基因RcAOS的CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种基因RcAOS的过表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的基因RcAOS的CDS序列和初始载体。

3.权利要求1所述的编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA，其特征在于，所述干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种基因RcAOS的干扰载体，其特征在于，包括权利要求3所述的基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列和初始载体。

5.权利要求1所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS或权利要求2所述的基因RcAOS的过表达载体在抗月季灰霉病中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

克隆扩增获得基因RcAOS；

应用Gateway技术将所述基因RcAOS重组于初始载体获得权利要求2所述基因RcAOS的过表达载体；

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，克隆扩增基因RcAOS的引物包括RcAOS-F和RcAOS-R，所述RcAOS-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，所述RcAOS-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。

8.权利要求3所述编码月季丙二烯氧化物合酶的基因RcAOS的干扰RNA或权利要求4所述基因RcAOS的干扰载体在阻断月季内源茉莉酸的生物合成中的应用。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

克隆扩增获得编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列；

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，克隆扩增所述编码基因RcAOS的干扰RNA的核苷酸序列的引物包括RcAOSRNAi-F和RcAOSRNAi-R，所述RcAOSRNAi-F引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，所述RcAOSRNAi-R引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。