CN110408649B

CN110408649B - Nor基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实中类黄酮化合物合成中的应用

Info

Publication number: CN110408649B
Application number: CN201910675934.8A
Authority: CN
Inventors: 傅达奇; 罗云波; 高颖; 朱鸿亮
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-07-25
Filing date: 2019-07-25
Publication date: 2021-04-27
Anticipated expiration: 2039-07-25
Also published as: CN110408649A

Abstract

本发明公开了NOR基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实中类黄酮化合物合成中的应用。本发明公开的NOR基因编码的蛋白质为氨基酸序列是序列3的蛋白质。本发明利用CRISPR/Cas9方法敲除了植物中的NOR基因，得到了NOR基因突变体，该突变体的果实中的一部分类黄酮化合物含量显著增加，另一部分类黄酮化合物含量显著下降。以上结果说明NOR基因参与调控植物果实类黄酮化合物的合成。

Description

NOR基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实中类黄酮化合物合成中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，NOR基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实中类黄酮化合物合成中的应用。

背景技术

果实不仅提供植物繁衍的种子，而且是人类膳食营养的重要来源。果实成熟是种子发育和果实品质形成的关键阶段，受到内在遗传因素和外在环境条件的调控，是复杂和精细的生物学过程。果实成熟本质上是成熟相关基因选择性表达的结果，这些变化受到转录因子的调控。因此，筛选和鉴定果实成熟关键转录因子是解析果实成熟分子机制的重要内容，不仅能完善果实成熟的转录调控网络，而且能为今后通过生物技术方法获得品质和贮藏特性改善的果实品种提供基因资源。

类黄酮是多酚类化合物，其中碳环的变化产生了黄酮、黄酮醇、黄烷醇、儿茶素、黄烷酮、花青素和异黄酮等不同种类的类黄酮类化合物。类黄酮是植物中最丰富的一类单体苯丙烷类化合物，苯丙烷类是以苯丙氨酸为底物合成的以芳香环为基本骨架的植物次生代谢物。类黄酮化合物具有较强的抗氧化能力，具有抗癌、抗炎、预防心血管疾病等功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物果实中类黄酮化合物的含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了调控NOR蛋白质活性的物质或调控植物NOR蛋白质含量的物质在D1)-D6)任一种中的应用：

D1)调控植物果实类黄酮化合物合成；

D2)促进植物果实类黄酮化合物合成；

D3)抑制植物果实类黄酮化合物合成；

D4)制备调控植物果实类黄酮化合物合成产品；

D5)制备促进植物果实类黄酮化合物合成产品；

D6)制备抑制植物果实类黄酮化合物合成产品。

上述应用中，所述NOR蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；

A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述调控植物NOR蛋白质含量的物质为NOR蛋白质或其相关生物材料；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述NOR蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制NOR蛋白质编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

上述A2)中的NOR蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的NOR蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的NOR蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上常用蛋白标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的NOR蛋白质。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下b1)-b5)中的任一种：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b3)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述NOR蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)或b4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述NOR蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NOR蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的NOR蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码NOR蛋白质且具有NOR蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码NOR蛋白质的核酸分子的表达盒(NOR基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达NOR蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动NOR基因转录的启动子，还可包括终止NOR基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述NOR基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

B9)所述重组载体可为利用CRISPR/Cas9方法制备的可以降低NOR含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列可为T1、T2、T3和/或T4，所述T1为序列1的第280-299位，所述T2为序列1的第231-212位的反向互补序列，所述T3为序列1的第1169-1188位，所述T4为序列1的第363-344位的反向互补序列。

所述重组载体具体可为pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体。所述pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体为利用BsaI在pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H的多克隆位点间依次插入LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述类黄酮化合物可为黄酮化合物、黄酮醇化合物、黄烷酮化合物、异黄酮化合物和/或花青素化合物。

所述黄酮化合物可为：五羟黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮O-芥子酸、五羟黄酮、金圣草(黄)素、白杨素C-己糖苷、毡毛美洲茶素、6-C-己糖基木犀草素O-戊糖苷、芹菜素5-O-葡萄糖苷、C-己糖基-木犀草素C-戊糖苷、麦黄酮O-二己糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷、樱花素、C-戊糖基C-己糖芹菜素、金圣草黄素7-O-己糖苷、木犀草素O-己糖基-O-戊糖苷、8-C-己糖基-木犀草素O-戊糖苷、木犀草素3‘,7-二氧葡萄糖苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷(野漆树苷)、芹菜素、金合欢素O-乙酰己糖苷、圣草酚C-己糖基-O-己糖苷、木犀草苷、异牧荆素、麦黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮7-O-己糖苷和/或羟甲基黄酮5-O-己糖苷；

所述黄酮醇化合物可为：杨梅素、异鼠李素、紫杉叶素、山柰酚、阿福豆苷(番泻叶山奈苷)、甲基槲皮素O-己糖苷、二氢山奈酚、三叶豆甙、淫羊藿苷、槲皮素、桑色素水合物、异鼠李素5-O-己糖苷、紫云英苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、黄颜木素和/或二氢杨梅素；

所述黄烷酮化合物可为：异甘草素、乔松素、高圣草酚、橙皮素、7-氧甲基圣草酚、圣草酚O-丙二酰己糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(樱黄素)、异樱花亭、柚皮素O-丙二酰己糖苷、根皮素、橙皮素O-葡萄糖醛酸、紫铆因、橙皮素O-丙二酰基己糖苷、圣草酚和/或阿福豆素；

所述异黄酮化合物可为：2'-羟基黄豆苷元、染料木苷、6-羟基黄豆苷原、染料木素和/或大豆苷；

所述花青素化合物可为：锦葵色素3-O-半乳糖苷、花翠素、松香花青素O-己糖苷、锦葵色素3-O-葡糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和/或矢车菊素O-丁香酸。

上述应用中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)茄科植物；

M3)番茄。

本发明还提供了下述M1或M2的方法：

M1、提高植物果实类黄酮化合物含量的方法，包括：降低受体植物中NOR蛋白质的活性、降低受体植物中NOR蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物果实相比类黄酮化合物含量增加的目的植物，实现植物果实类黄酮化合物含量的提高；

M2、培育果实类黄酮化合物含量增加植物的方法，包括：降低受体植物中NOR蛋白质的活性、降低受体植物中NOR蛋白质的含量、抑制受体植物中NOR蛋白质的编码基因的表达或敲除受体植物中NOR蛋白质的编码基因，得到与所述受体植物相比果实类黄酮化合物含量增加的目的植物；

所述类黄酮化合物为异牧荆素、麦黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮7-O-己糖苷、羟甲基黄酮5-O-己糖苷、二氢杨梅素、阿福豆素、大豆苷和/或矢车菊素O-丁香酸。

上述方法中，所述敲除受体植物中NOR蛋白质的编码基因可利用CRISPR/Cas9方法实现。

上述方法中，CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列可为T1、T2、T3和T4，所述T1为序列1的第280-299位，所述T2为序列1的第231-212位的反向互补序列，所述T3为序列1的第1169-1188位，所述T4为序列1的第363-344位的反向互补序列。

在本发明的一个实施例中，所述受体植物为nor#11或nor#19。

与野生型植物相比，所述nor#11的序列编辑情况如下：两条染色体的NOR基因的T2序列处中发生4个核苷酸的缺失和5个核苷酸的替换，具体的为将野生型植物中序列1的中的CTCCCACCGGGG(即序列1的第215-226位)替换为GGTGGGAG；两条染色体的NOR基因的T1序列处发生一个核苷酸的缺失，即缺失了序列1的第296位核苷酸。

与野生型植物相比，所述nor#19的两条染色体的NOR基因的T4序列处缺失了5个核苷酸，即缺失了序列1的第347-351位核苷酸。

上述方法中，所述受体植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)茄科植物；

M3)番茄。

本发明还提供了具有D1)-D3)中任一功能的产品，所述产品含有所述NOR蛋白质或所述生物材料：

D1)调控植物果实类黄酮化合物合成；

D2)促进植物果实类黄酮化合物合成；

D3)抑制植物果实类黄酮化合物合成。

所述产品可以所述NOR蛋白质或所述生物材料作为其活性成分，还可将所述NOR蛋白质或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述产品中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)茄科植物；

M3)番茄。

本发明利用CRISPR/Cas9方法敲除了植物中的NOR基因，得到了NOR基因突变体，该突变体的果实中的一部分类黄酮化合物——异牧荆素、麦黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮7-O-己糖苷、羟甲基黄酮5-O-己糖苷、二氢杨梅素、阿福豆素、大豆苷和/或矢车菊素O-丁香酸含量显著增加，另一部分类黄酮化合物——五羟黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮O-芥子酸、五羟黄酮、金圣草(黄)素、白杨素C-己糖苷、毡毛美洲茶素、6-C-己糖基木犀草素O-戊糖苷、芹菜素5-O-葡萄糖苷、C-己糖基-木犀草素C-戊糖苷、麦黄酮O-二己糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷、樱花素、C-戊糖基C-己糖芹菜素、金圣草黄素7-O-己糖苷、木犀草素O-己糖基-O-戊糖苷、8-C-己糖基-木犀草素O-戊糖苷、木犀草素3‘,7-二氧葡萄糖苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷(野漆树苷)、芹菜素、金合欢素O-乙酰己糖苷、圣草酚C-己糖基-O-己糖苷、木犀草苷；杨梅素、异鼠李素、紫杉叶素、山柰酚、阿福豆苷(番泻叶山奈苷)、甲基槲皮素O-己糖苷、二氢山奈酚、三叶豆甙、淫羊藿苷、槲皮素、桑色素水合物、异鼠李素5-O-己糖苷、紫云英苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、黄颜木素；异甘草素、乔松素、高圣草酚、橙皮素、7-氧甲基圣草酚、圣草酚O-丙二酰己糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(樱黄素)、异樱花亭、柚皮素O-丙二酰己糖苷、根皮素、橙皮素O-葡萄糖醛酸、紫铆因、橙皮素O-丙二酰基己糖苷、圣草酚；2'-羟基黄豆苷元、染料木苷、6-羟基黄豆苷原、染料木素；锦葵色素3-O-半乳糖苷、花翠素、松香花青素O-己糖苷、锦葵色素3-O-葡糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷含量显著下降。以上结果说明NOR基因参与调控植物果实类黄酮化合物的合成。

附图说明

图1为四个靶序列及其在NOR基因上的位置。

图2为通过重叠PCR制备含有靶序列的sgRNA表达盒的DNA片段的步骤。

图3为CR-NOR T₀代靶点编辑方式分析。a：PCR扩增靶点片段的琼脂糖凝胶电泳分析。b：CR-NOR#1和CR-NOR#3基因编辑方式分析，CR-NOR#1-T3和CR-NOR#1-T4分别表示CR-NOR#1的T3和T4上下游序列，CR-NOR#3-T1和CR-NOR#3-T4分别表示CR-NOR#3的T1和T4上下游序列。b图中，括号中“×n*”中的n代表随机测定的12条序列中相应编辑方式出现的次数。

图4为nor#11和nor#19两个株系靶点编辑方式分析。

图5为代谢物主成分分析图。X轴表示第一主成分，Y轴表示第二主成分，mix代表质控样品。

图6为差异代谢物火山图。火山图中每个点代表一个差异代谢物，图中代谢物的“下调”、“上调”以及“没有明显变化”，均是与野生型相比，直线代表|Log2(fold change)|＝1(横轴上竖直线)以及VIP-value＝1(纵轴上横直线)。

图7为差异代谢物KEGG富集结果图。点的大小代表富集到每个通路中差异代谢物的个数。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的野生型番茄品种Solanum lycopersicum cv Ailsa Craig(Marian Bemer et al.,The Tomato FRUITFULL Homologs TDR4/FUL1and MBP7/FUL2Regulate Ethylene-Independent Aspects of Fruit Ripening,The Plant Cell,Vol.24:4437–4451)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、NOR基因调控番茄果实中类黄酮物质的合成

本实施例突变番茄中的NOR基因，发现该基因突变后番茄果实中类黄酮物质发生变化，NOR基因的基因组序列为序列表中序列1，其CDS序列为序列表中序列2，编码序列表中序列3所示的NOR蛋白质。具体步骤如下：

一、重组载体的构建

1、靶序列的选择：所选靶序列为T1(序列1的第280-299位)、T2(序列1的第231-212位的反向互补序列)、T3(序列1的第1169-1188位)和T4(序列1的第363-344位的反向互补序列)，具体见图1。

2、启动子的选择：使用拟南芥来源的4个small nuclear RNA启动子：AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29，启动子的排列顺序为：AtU3d，AtU3b，AtU6-1，AtU6-29。

3、含有靶序列的sgRNA表达盒的DNA片段的制备：

按照图2的原理，经过两轮PCR，获得四个DNA片段，分别为LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA，LacZ-AtU3d-T1-gRNA中包含靶向T1的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA1)的表达盒，且sgRNA1的表达由AtU3d驱动；AtU3b-T2-gRNA中包含靶向T2的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA2)的表达盒，且sgRNA2的表达由AtU3b驱动；AtU6-1-T3-gRNA中包含靶向T3的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA3)的表达盒，且sgRNA3的表达由AtU6-1驱动；AtU6-29-T4-gRNA中包含靶向T3的sgRNA(将该sgRNA记为sgRNA3)的表达盒，且sgRNA3的表达由AtU6-29驱动。这四个DNA片段的制备方法如下：

(1)第一轮PCR

按照表1在冰上配制第一轮PCR反应体系。其中，KOD酶和10×KOD Plus Buffer为TOYOBO公司产品，各引物的序列见表2。

表1、第一轮PCR反应体系

制备LacZ-AtU3d-T1-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR T1，所用U#T#-为U3d-NOR T1，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU3d质粒；制备AtU3b-T2-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR T2，所用U#T#-为U3b-NOR T2，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU3b质粒；制备AtU6-1-T3-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR T3，所用U#T#-为U6-1-NORT3，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU6-1质粒；制备AtU6-29-T4-gRNA时第一轮PCR所用gRT#+为gR-NOR T4，所用U#T#-为U6-29-NOR T4，所用PYLgRNA-AtU#质粒为PYLgRNA-AtU6-29质粒。PYLgRNA-AtU3d质粒、PYLgRNA-AtU3b质粒、PYLgRNA-AtU6-1质粒和PYLgRNA-AtU6-29质粒均记载在文献(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu YG.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex GenomeEditing in Monocot and Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)中。

表2、引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		U-F	CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
gR-R	CGGAGGAAAATTCCATCCAC
		U3d-NOR T1	GAATCGGAGCGCCGGCGACTGACCAATGGTGCTTTG
gR-NOR T1	GTCGCCGGCGCTCCGATTCGTTTTAGAGCTAGAAAT
		U3b-NOR T2	CAACTCCCACCGGGGTTTCGTGACCAATGTTGCTCC
gR-NOR T2	CGAAACCCCGGTGGGAGTTGGTTTTAGAGCTAGAAAT
		U6-1-NOR T3	CTTTTGGTGGTTTACCGCCGCAATCACTACTTCGTCT
gR-NOR T3	CGGCGGTAAACCACCAAAAGGTTTTAGAGCTAGAAAT
		U6-29-NOR T4	TGGGAACTCCCTGGTACTATCAATCTCTTAGTCGACT
gR-NOR T4	ATAGTACCAGGGAGTTCCCAGTTTTAGAGCTAGAAAT

配置好反应体系后，按照表3的条件进行第一轮PCR。

表3、第一轮PCR反应程序

PCR反应结束后，得到四种PCR产物。

(2)第二轮PCR

按照表4在冰上配制第二轮PCR反应体系，模板为稀释10倍的相应第一轮PCR反应产物。特异性引物对为如下四对引物，每个反应体系中一对引物：

Pps-GGL和Pgs-GG2组成的引物对，用于扩增LacZ-AtU3d-T1-gRNA；Pps-GG2和Pgs-GG3组成的引物对，用于扩增AtU3b-T2-gRNA；Pps-GG3和Pgs-GG4组成的引物对，用于扩增AtU6-1-T3-gRNA；Pps-GG4和Pgs-GGR组成的引物对，用于扩增AtU6-29-T4-gRNA。各引物见表5。

表4、第二轮PCR反应体系

表4中，特异性引物对的浓度是指该引物对中每条引物的浓度。

表5、引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		Pps-GGL	TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG2	AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC
		Pps-GG2	TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG3	AGCGTGGGTCTCGTCTTCACTCCATCCACTCCAAGCTC
		Pps-GG3	TTCAGAGGTCTCTAAGACTTTGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GG4	AGCGTGGGTCTCGAGTCCTTTCCATCCACTCCAAGCTC
		Pps-GG4	TTCAGAGGTCTCTGACTACATGGAATCGGCAGCAAAGG
Pgs-GGR	AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCT

配置好反应体系后，按照表6的条件进行第二轮PCR。

表6、第二轮PCR反应程序

反应完成后，将四种PCR产物等量混合后进行纯化，得到如下四个DNA片段的混合物：LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA。

4、重组载体的制备

采用Golden Gate cloning方法完成目的DNA片段与pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H载体(Ma X,Zhang Q,Zhu Q,Liu W,Chen Y,Qiu R,Wang B,Yang Z,Li H,Lin Y,Xie Y,Shen R,Chen S,Wang Z,Chen Y,Guo J,Chen L,Zhao X,Dong Z,Liu Y G.A Robust CRISPR/Cas9System for Convenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Monocotand Dicot Plants[J].Molecular Plant,2015,8(8):1274-1284)的酶切连接反应，反应结束后，将序列正确的重组载体记为pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体。反应体系见表7，反应条件见表8。

pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体：pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体为利用BsaI在pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H的多克隆位点间依次插入LacZ-AtU3d-T1-gRNA、AtU3b-T2-gRNA、AtU6-1-T3-gRNA和AtU6-29-T4-gRNA得到的重组载体。

表7、sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9-P_ubi-H载体的酶切-连接体系

表7中，10×CutSmart Buffer为NEB公司产品，T4DNA ligase和10×T4DNA ligaseBuffer为Promaga公司产品，Bsa I-HF为NEB公司产品。

表8、Golden Gate cloning反应条件

二、番茄遗传转化

采用农杆菌介导的叶盘转化法将pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体转化野生型番茄品种AC。所有操作均在无菌操作台中进行，具体步骤如下：

(1)播种：取适量番茄种子于无菌培养皿中，用75％的乙醇浸泡(晃动使接触均匀)消毒5min，倒掉乙醇溶液，再用4％次氯酸钠溶液浸泡(晃动使接触均匀)8min，最后用无菌水清洗7-8次，每次浸泡1min。之后将种子播种于种子萌发培养基T0。

(2)种子萌发：步骤(1)完成后，将播种好的种子置于暗室培养3-4d左右，出芽后置于光下培养2-4d，待子叶完全展开后用于下一步操作。

(3)预培养：步骤(2)完成后，将番茄小苗根部置于无菌水中，剪去子叶叶尖，将每片子叶的剩余部分剪成两个5×5mm的方块，背面向上放置于铺有一层滤纸的T1预培养培养基上，培养两天，得到预培养的外植体。

(4)制备侵染液：将pYLCRISPR/Cas9-NOR基因编辑载体导入农杆菌GV3101中，得到重组菌，挑取重组菌单菌落于3mL LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素以及50μg/mL利福平)中，28℃过夜震荡培养16h。次日取300μl菌液于20mL LB(含有50μg/mL卡那霉素、50μg/mL庆大霉素以及50μg/mL利福平)培养基中，28℃震荡培养6-7h至OD₆₀₀达到0.5-0.6。5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水重悬菌体至0D₆₀₀＝0.1-0.2，得到侵染液。

(5)共培养：将步骤(3)预培养的外植体浸泡到步骤(4)的侵染液中，轻轻震荡5min后倒掉侵染液，吸干多余侵染液后将外植体重新放回预培养培养基T1中，放置于暗室中共培养2d。

(6)芽诱导培养：步骤(5)完成后，将共培养2d的外植体从暗室取出，背面向下置于芽诱导培养基T21中，25℃16h光照/8h黑暗条件下培养7d，之后转入新鲜的芽诱导培养基T21继代培养，每隔2周更换新的培养基，直至外植体长出愈伤组织并长出小叶。

(7)芽伸长培养：步骤(6)完成后，待外植体长出小叶后转入芽伸长培养基T22中，每两周更换新鲜的培养基，直至茎伸长至4-5cm。

(8)生根培养：步骤(7)完成后，茎伸长后剪去愈伤组织，转入生根培养基T3中，培养3-4周，直至根系发达。

(9)土培：步骤(8)完成后，小心将小苗从培养基中移出，用清水将根上残留的培养基洗净，将小苗转入湿润的土盆中，培养获得14株T₀代NOR基因编辑植株。

种子萌发培养基T0(800mL)：MS盐1.77g，蔗糖12g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右倒入培养瓶中；

T1预培养培养基(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入6-BA至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L，混匀后制备平板；

芽诱导培养基T21(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、ZT至浓度为1mg/L、IAA至浓度为0.1mg/L，混匀后制备平板；

芽伸长培养基T22(800mL)：MS盐3.55g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至5.8，加琼脂5.33g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为10mg/L、特美汀至浓度为200mg/L、ZT至浓度为0.5mg/L、GA至浓度为1mg/L，混匀后倒入培养瓶中；

生根培养基T3(800mL)：MS盐1.77g，蔗糖24g，完全溶解后用1mol/L NaOH调节pH至58，加琼脂533g，121℃高压蒸汽灭菌20min，待冷却到55℃左右加入潮霉素至浓度为5mg/L、特美汀至浓度为150mg/L、IBA至浓度为2mg/L，混匀后倒入培养瓶中。

三、NOR基因编辑植株的检测

以步骤二所得NOR基因编辑植株的基因组DNA为模板，分别利用每个靶序列上下游约300bp附近设计的PCR引物扩增靶序列附近的600bp左右的DNA序列，并进行测序，用于基因组编辑方式检测，PCR引物序列见表9。

表9、NOR基因靶点突变检测引物

表9中，引物For与Rev均用于扩增目的片段，Seq1、Seq2和Seq均为测序引物。

测序成功后通过靶点编辑方式分析网站DSDecode

(http://dsdecode.scgene.com/)并结合人工读峰图与基因标准序列比对分析的方法对各个靶序列及其上下游的编辑方式进行分析。

按照等位基因编辑方式的不同，可将获得的转基因分为以下几种，如表10所示：

表10、CRISPR/Cas9基因编辑方式列表

14株T₀代NOR基因编辑植株各个靶序列及其上下游的PCR扩增结果如图3中a所示，分析各靶点PCR产物测序结果后发现，在这14个株系中，选择2个代表性的发生NOR基因编辑的株系CR-NOR#1和CR-NOR#3进行后续实验，这两个株系的基因编辑方式如图3中b所示。

由于CRISPR/Cas9基因编辑系统具有脱靶的风险，因此需要对目的基因发生编辑的阳性转基因株系进行脱靶分析，以确定只有目的基因发生基因编辑。首先，获取CRISPR-P网站预测的可能脱靶的位置信息，每个靶点筛选最可能脱靶的两条基因序列(脱靶信息见表12)；然后在SGN网站下载可能脱靶基因的DNA序列，找到可能脱靶的位置，设计PCR引物扩增并测序(脱靶检测PCR引物及测序引物见表11)；最后通过与标准序列比对确定该位置是否出现脱靶现象。结果显示，CR-NOR#1和CR-NOR#3中均未发生脱靶现象。

表11、脱靶位点检测引物

表11中，引物For与Rev均用于扩增目的片段，Seq为测序引物。

表12、潜在脱靶位点检测结果

随后，收集NOR基因编辑的T₀代转基因株系CR-NOR#1和CR-NOR#3的番茄种子，催芽后播种于湿润的土盆内。3周后，将植株分别编号，取真叶提取DNA，并以此DNA为模板PCR扩增各靶点序列，测序分析后，筛选出纯合突变体用于后续实验。在继代培养过程中，CR-NOR#3株系位于5’端的T2靶点发生基因编辑，并且在T₀代杂合编辑的T1靶点出现了新的基因编辑方式。经过3代种植筛选，从CR-NOR#3株系中筛选出两个纯合转基因株系，分别命名为nor#11和nor#19，在这两个纯合株系中NOR基因的具体编辑方式如图4所示。在这两个纯合株系中，NOR基因的突变导致移码突变，蛋白翻译均提前终止，分别获得剩余47个氨基酸和61个氨基酸的截短的NOR蛋白，NAC结构域被破坏。

具体的，nor#11的序列编辑情况如下：两条染色体的NOR基因的T2序列处中发生4个核苷酸的缺失和5个核苷酸的替换，具体的为将野生型中序列1的中的CTCCCACCGGGG(即序列1的第215-226位)替换为GGTGGGAG；两条染色体的NOR基因的T1序列处发生一个核苷酸的缺失，即缺失了序列1的第296位核苷酸。nor#19的两条染色体的NOR基因的T4序列处缺失了5个核苷酸，即缺失了序列1的第347-351位核苷酸。

为了确保这两个株系只有NOR基因发生了突变，对nor#11和nor#19进行了脱靶分析。分析结果见表12，这两个株系均未发生脱靶现象。除此之外，我们还对NOR的同源基因NOR-like1的DNA序列进行测定，未发现脱靶。并且还检测了另外两个已报道的参与番茄果实成熟的SlNAC4(Solyc11g017470)和SlNAC1(Solyc04g009440)基因的DNA序列，也并未发现脱靶现象。这些结果说明，nor#11和nor#19这两个基因编辑突变体是只有NOR基因发生突变的单基因突变体，并且突变体的表型是由NOR基因突变造成的。

四、表型分析

待测植株：野生型番茄品种AC(WT)、nor#11。

采集待测植株番茄果实破色后6d果实的果皮组织，委托武汉迈特维尔生物科技有限公司进行广泛靶向代谢组学分析。

(一)总体样本主成分分析

通过对WT和nor#11果实样本(包括质控样品mix)进行主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)，初步了解组内样本之间变异度的大小以及各组样本之间的总体代谢物差异。PCA分析结果如图5所示，WT和nor#11以及质控样本mix三组之间分离趋势明显，说明nor#11果实中的代谢物与WT之间存在明显差异。

(二)差异代谢物筛选

本次广泛靶向代谢组学实验共检测到600种代谢物，如果log2(fold change)≥1并且VIP值≥1(VIP，variable importance in project，VIP值代表对应代谢物的组间差异在OPLS-DA模型中各组样本分类判别中的影响强度)则认定为差异代谢物。根据上述筛选条件，在nor#11和WT两个样本之间共筛选到185种差异代谢物，其中与WT相比，135种代谢物的含量在nor#11中下调，50种代谢物的含量在nor#11中上调，差异代谢物可视化火山图如6所示。

(三)差异代谢物KEGG富集分析

为了将差异代谢物富集到相关的代谢通路中，以了解差异代谢物的功能，将差异代谢物进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析。KEGG分析结果如图7所示，P值越接近于0，表示富集越显著，图中点的大小代表富集到相应通路上的差异显著代谢物个数，Rich factor代表差异代谢物在其对应通路中的富集个数与该通路中注释的代谢物总数的比值，Rich factor越大表示相关代谢物在该通路中富集程度越大。从图7差异代谢物KEGG富集结果图中可以发现，NOR对番茄果实中类黄酮生物合成、黄酮与黄酮醇生物合成、苯丙烷类化合物的生物合成、次生代谢产物的生物合成、异黄酮类生物合成影响最为显著。

综上所述，NOR基因突变对番茄果实中类黄酮化合物代谢产生较大影响。因此，对差异代谢物中类黄酮类化合物进行筛选，发现与WT对比，nor#11中有68种类黄酮化合物的含量发生变化，其中绝大部分类黄酮化合物的含量显著下调，显著下调的类黄酮化合物有五羟黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮O-芥子酸、五羟黄酮、金圣草(黄)素、白杨素C-己糖苷、毡毛美洲茶素、6-C-己糖基木犀草素O-戊糖苷、芹菜素5-O-葡萄糖苷、C-己糖基-木犀草素C-戊糖苷、麦黄酮O-二己糖苷、芹菜素7-O-葡萄糖苷、樱花素、C-戊糖基C-己糖芹菜素、金圣草黄素7-O-己糖苷、木犀草素O-己糖基-O-戊糖苷、8-C-己糖基-木犀草素O-戊糖苷、木犀草素3‘,7-二氧葡萄糖苷、芹菜素7-O-新橘皮糖苷(野漆树苷)、芹菜素、金合欢素O-乙酰己糖苷、圣草酚C-己糖基-O-己糖苷、木犀草苷；杨梅素、异鼠李素、紫杉叶素、山柰酚、阿福豆苷(番泻叶山奈苷)、甲基槲皮素O-己糖苷、二氢山奈酚、三叶豆甙、淫羊藿苷、槲皮素、桑色素水合物、异鼠李素5-O-己糖苷、紫云英苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、黄颜木素；异甘草素、乔松素、高圣草酚、橙皮素、7-氧甲基圣草酚、圣草酚O-丙二酰己糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷(樱黄素)、异樱花亭、柚皮素O-丙二酰己糖苷、根皮素、橙皮素O-葡萄糖醛酸、紫铆因、橙皮素O-丙二酰基己糖苷、圣草酚；2'-羟基黄豆苷元、染料木苷、6-羟基黄豆苷原、染料木素；锦葵色素3-O-半乳糖苷、花翠素、松香花青素O-己糖苷、锦葵色素3-O-葡糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷；个别类黄酮化合物的含量显著上调，显著上调的类黄酮化合物有异牧荆素、麦黄酮O-丙二酰己糖苷、麦黄酮7-O-己糖苷、羟甲基黄酮5-O-己糖苷、二氢杨梅素、阿福豆素、大豆苷和/或矢车菊素O-丁香酸。如表13所示。

表13、NOR调控的类黄酮化合物列表

综上所述，NOR基因突变导致类黄酮化合物含量降低，NOR正向调控番茄果实中类黄酮的生物合成。

<110> 中国农业大学

<120> NOR基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实中类黄酮化合物合成中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2891

<212> DNA

<213> 番茄

<400> 1

ccaactaaat tccttcttgt ttatcatttt ctctcttccc aaaaaaaaat cccaaaattt 60

aatcataata caattcgaat ttatcaacct cgtactacgt acatattttt gttggtacgt 120

aaaatactga attcaggtca actcaaacat cgtaaattgt gatttcttta tggaaagtac 180

ggattcatca accgggacac gtcatcagcc tcaactccca ccggggtttc gattccaccc 240

gacggacgaa gaactcatcg tccactacct caaaaaacga gtcgccggcg ctccgattcc 300

ggtggatatt attggtgaaa ttgatcttta taagtttgat ccatgggaac tccctggtac 360

tattttcacc actatactat attttcttgc cctataactt atatataggg gaaaaagatc 420

ggagtcagcg atgaacaatt attgtgtcta aattaaattt taaatatgca atagattggt 480

gacgaatttc gttgctaatt aattttttag tgataaatta atatttttcc cctttttaat 540

cttcatgttt tttatcacaa agttttctat gaccaactta taaagatttg aactcgatca 600

attttttttt tagaatgaat gaacttatgt tatatatagt gatattttaa atgctttttt 660

atattttcaa aagatatcca cgataacgtg taaaaagtga atttgcaaaa aaaaaaatgt 720

agtacctttt atttaatttt attgtagata atttagattt taattttgaa tttgtttaat 780

ttaaattctg aatcgtataa tatttattta atttctattt tttgagtttt tttttggagg 840

gtgcttaaaa agtagtattc acaaatataa agtagtggac aaacataaag tagtggaccc 900

ataatttatt tttttaaaaa ttatattaaa actatttgtt aagtttaaat tctgaattat 960

cttcttatca tgtgtttaac gcagctaagg caatattcgg agagcaagaa tggttctttt 1020

ttagtccaag agatagaaaa tatcctaacg gggcgaggcc aaatcgggct gcaacatcgg 1080

gttattggaa ggctaccgga accgacaagc cggtttttac ttccggtgga acacaaaagg 1140

ttggggtaaa aaaggcgctc gttttttacg gcggtaaacc accaaaaggg gtaaaaacta 1200

attggatcat gcatgaatac agagttgtag aaaataaaac aaataacaag ccacttggtt 1260

gtgataatat tgttgccaac aaaaaaggat ctttgagggt aagtcctaaa ttttgcatcg 1320

aaactaattt ctctatcgta tcagataggg ataagatata cgtatactct aatctccttg 1380

aaccccacaa gtactatact agatatgttg ttgttgtaga tgacttgatt caactttcaa 1440

atttttgatg aaaatgttta agttatatat acatatatat ataggcggag ctaaaaattt 1500

cgataagggg gtttaaatct gaaaaaatgg atatacgaaa tagccgaaag aggttcgaca 1560

tagattattt taaccatata aaaataatac aattttcata tatatatacg cgtggttaat 1620

atgaggaata ttttatacta ttaatgtact ttaaccaggg gcggctctag agttgatgaa 1680

ccctctcagc gaaaatttac gttgtatatt taaggtacct tttaataatt tttgtattta 1740

tatattaatt ttgaacctct tgaatataag attagacgtt gacttagtgg tttcaggggt 1800

tcaaatcact attctttttt tcctaacccc cttaatgaaa atcctgaatc ggccactaac 1860

tttaactggt tatagaaggt taatcttact agaaaaaagc atgaaattct aaccgacaaa 1920

gatgtagtcg cccagttaga taagacgttt aaattgggac ggatagagtt actttatttt 1980

tcactgtcat atgttactat atattgacac ttcacttaaa gagttatcat atcgatattt 2040

ttactattag tgtacataac acaaactcga ataaattcaa tgtttcatta gctagttaat 2100

tagtctaact tttttaaaaa aaaatatttt tcttactcca cactatttta ttttattttt 2160

ttgcagctag atgattgggt tttatgtcga atttacaaga agaataacac acaaaggtcc 2220

atagatgatt tgcatgatat gttgggatcg ataccacaaa atgtaccaaa ttcaatatta 2280

caaggaataa agccttcaaa ctatggtaca atattgctcg aaaatgaatc gaatatgtac 2340

gatggaatta tgaataacac gaacgatatt atcaacaata ataatagatc cattccacaa 2400

atatcgtcaa agagaacgat gcatggaggt ttgtattgga ataacgacga agcaacaaca 2460

acaacaacaa ctattgatag gaaccattct ccaaatacaa aaaggttcct tgttgagaac 2520

aacgaggacg atggacttaa catgaataat atttcgcgaa ttacaaatca tgaacaaagt 2580

agctccattg ccaatttcct gagccagttt cctcaaaatc cttcgattca acaacaacaa 2640

caacaacaag aagaagtatt gggatctctt aatgatgggg tcgtctttcg acaaccttat 2700

aatcaagtta ctggcatgaa ttggtactct taaagatata aaaaggcaaa aaatagttag 2760

ccctgtaaaa tcaatcgatc aatcaatcat agatatatta tatatggatt tcgttatatt 2820

ttacttttag ttagaattaa tatatagaat atcttctatc tcacattaac aaataagaac 2880

atttataaca a 2891

<210> 2

<211> 1068

<212> DNA

<213> 番茄

<400> 2

atggaaagta cggattcatc aaccgggaca cgtcatcagc ctcaactccc accggggttt 60

cgattccacc cgacggacga agaactcatc gtccactacc tcaaaaaacg agtcgccggc 120

gctccgattc cggtggatat tattggtgaa attgatcttt ataagtttga tccatgggaa 180

ctccctgcta aggcaatatt cggagagcaa gaatggttct tttttagtcc aagagataga 240

aaatatccta acggggcgag gccaaatcgg gctgcaacat cgggttattg gaaggctacc 300

ggaaccgaca agccggtttt tacttccggt ggaacacaaa aggttggggt aaaaaaggcg 360

ctcgtttttt acggcggtaa accaccaaaa ggggtaaaaa ctaattggat catgcatgaa 420

tacagagttg tagaaaataa aacaaataac aagccacttg gttgtgataa tattgttgcc 480

aacaaaaaag gatctttgag gctagatgat tgggttttat gtcgaattta caagaagaat 540

aacacacaaa ggtccataga tgatttgcat gatatgttgg gatcgatacc acaaaatgta 600

ccaaattcaa tattacaagg aataaagcct tcaaactatg gtacaatatt gctcgaaaat 660

gaatcgaata tgtacgatgg aattatgaat aacacgaacg atattatcaa caataataat 720

agatccattc cacaaatatc gtcaaagaga acgatgcatg gaggtttgta ttggaataac 780

gacgaagcaa caacaacaac aacaactatt gataggaacc attctccaaa tacaaaaagg 840

ttccttgttg agaacaacga ggacgatgga cttaacatga ataatatttc gcgaattaca 900

aatcatgaac aaagtagctc cattgccaat ttcctgagcc agtttcctca aaatccttcg 960

attcaacaac aacaacaaca acaagaagaa gtattgggat ctcttaatga tggggtcgtc 1020

tttcgacaac cttataatca agttactggc atgaattggt actcttaa 1068

<210> 3

<211> 355

<212> PRT

<213> 番茄

<400> 3

Met Glu Ser Thr Asp Ser Ser Thr Gly Thr Arg His Gln Pro Gln Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Ile Val His

20 25 30

Tyr Leu Lys Lys Arg Val Ala Gly Ala Pro Ile Pro Val Asp Ile Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp Pro Trp Glu Leu Pro Ala Lys

50 55 60

Ala Ile Phe Gly Glu Gln Glu Trp Phe Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg

65 70 75 80

Lys Tyr Pro Asn Gly Ala Arg Pro Asn Arg Ala Ala Thr Ser Gly Tyr

85 90 95

Trp Lys Ala Thr Gly Thr Asp Lys Pro Val Phe Thr Ser Gly Gly Thr

100 105 110

Gln Lys Val Gly Val Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr Gly Gly Lys Pro

115 120 125

Pro Lys Gly Val Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Val Val

130 135 140

Glu Asn Lys Thr Asn Asn Lys Pro Leu Gly Cys Asp Asn Ile Val Ala

145 150 155 160

Asn Lys Lys Gly Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile

165 170 175

Tyr Lys Lys Asn Asn Thr Gln Arg Ser Ile Asp Asp Leu His Asp Met

180 185 190

Leu Gly Ser Ile Pro Gln Asn Val Pro Asn Ser Ile Leu Gln Gly Ile

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Tyr Gly Thr Ile Leu Leu Glu Asn Glu Ser Asn Met

210 215 220

Tyr Asp Gly Ile Met Asn Asn Thr Asn Asp Ile Ile Asn Asn Asn Asn

225 230 235 240

Arg Ser Ile Pro Gln Ile Ser Ser Lys Arg Thr Met His Gly Gly Leu

245 250 255

Tyr Trp Asn Asn Asp Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ile Asp Arg

260 265 270

Asn His Ser Pro Asn Thr Lys Arg Phe Leu Val Glu Asn Asn Glu Asp

275 280 285

Asp Gly Leu Asn Met Asn Asn Ile Ser Arg Ile Thr Asn His Glu Gln

290 295 300

Ser Ser Ser Ile Ala Asn Phe Leu Ser Gln Phe Pro Gln Asn Pro Ser

305 310 315 320

Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Glu Val Leu Gly Ser Leu Asn

325 330 335

Asp Gly Val Val Phe Arg Gln Pro Tyr Asn Gln Val Thr Gly Met Asn

340 345 350

Trp Tyr Ser

355

Claims

1.下述M1或M2的方法：

所述类黄酮化合物为异牧荆素、麦黄酮 O-丙二酰己糖苷、麦黄酮 7-O-己糖苷、羟甲基黄酮 5-O-己糖苷、二氢杨梅素、阿福豆素、大豆苷和/或矢车菊素 O-丁香酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述敲除受体植物中NOR蛋白质的编码基因利用CRISPR/Cas9方法实现。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列为T1、T2、T3和/或T4，所述T1为序列1的第280-299位，所述T2为序列1的第231-212位的反向互补序列，所述T3为序列1的第363-344位，所述T4为序列1的第1169-1188位的反向互补序列。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述受体植物为双子叶植物或单子叶植物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为茄科植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述茄科植物为番茄。