KR101168421B1 - 플라본 및 말비딘을 함유하는 장미 및 그 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자 재조합 수법에 의하여 플라본 및 말비딘을 함유하는 것을 특징으로 하는 장미를 제공한다. 해당 플라본 및 말비딘은 전형적으로는 제 각기, 도입된 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 및 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자의 발현에 의하여 생성된다. 상기 플라본 합성 효소 유전자는, 예를 들면, 현삼과 유래의 플라본 합성 효소 유전자이며, 구체 예로서, 현삼과 금어초 유래의 플라본 합성 효소 유전자 및 현삼과 토레니아 유래의 플라본 합성 효소 유전자이다. 또한, 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자는, 예를 들면, 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자이다. 또한, 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자,는 예를 들면, 현삼과 토레니아 유래의 메틸기 전이 효소 유전자이다.

플라본, 말비딘, 플라본 합성 효소 유전자, 유전자 재조합 수법에 의하여 플라본을 함유하는 장미

Description

플라본 및 말비딘을 함유하는 장미 및 그 생산 방법 {ROSE CONTAINING FLAVONE AND MALVIDIN, AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF}

본 발명은 플라본 (flavone) 및 말비딘 (malvidin)을 인위적으로 함유시킨 장미 (a rose)에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 조작에 의하여 플라본 및 말비딘을 함유시킴으로써 나타나는 코피그멘테이션 효과 (co-pigmentation effect)에 의하여 장미의 꽃의 색상을 개변 (변)하는 방법, 특히 꽃의 색상을 파란 색 방향으로 변화시키는 방법에 관한 것이기도 하다.

꽃은 식물의 생식기관이며 차세대가 되는 종자를 생산하기 위하여 필요한 것이다. 종자를 형성하려면 화분 (花粉)이 암술에 부착되어, 수정될 필요가 있다. 보통 화분의 운반은 벌이나 나비 등의 곤충이나, 벌새, 드물게는 박쥐에 의하여 행하여진다. 꽃잎의 역할은 화분을 나르는 이들 생물을 매료하는 것에 있는데, 식물은 이를 위하여 꽃의 색상이나 형태, 모양에 대하여 연구하고 있다.

꽃의 색상은 감상을 할 때에도 화훼의 가장 중요한 형질이기 때문에, 예로부터 여러 가지 색상의 꽃이 교배에 의하여 육종되어 왔다. 그러나, 하나의 식물 종의 꽃이 모든 색상을 가진 경우는 적은데, 예를 들면, 교배에 의하여 제작된 장미 (rose (Rosa hybrida)), 카네이션 (carnation (Dianthus caryophyllus)), 국화 (chrysanthemum (Chryanthemum morifolium)), 백합 (lily (Lilium spp .)) 등에는 보라색에서 파란 색의 품종이 없고, 꽃창포 (Japanese garden iris (Iris ensata thumb.)) 나 용담 (gentian (Gentiana triflora))에는 선명한 빨간 색의 품종은 없다.

꽃의 색상 중에서, 연노란 색에서부터 빨간 색, 파란 색은 플라보노이드 (flavonoid) 및 안토시아닌 (anthocyanin) (플라보노이드에 속하는 유색 배당체)에 유래하는 것이 많다. 플라보노이드는 식물의 대표적인 ２차 대사물로, 이하에 개시하는 바와 같이, C6C3C6의 기본 골격을 가지고, 페닐알라닌과 말로닐 CoA로부터 합성된다. C환의 산화 상태에 따라서, 플라본, 플라보놀 (flavonol) 등으로 분류된다.

플라보노이드는 자외선을 흡수하거나, 라디칼을 제거하거나 하므로, 원래는 식물체를 여러 가지 스트레스로부터 보호하는 기능을 담당하고 있는 것으로 생각된다. 또한, 건강에 좋은 성분으로서도 최근 주목받고 있다 (Harborne and Williams 2000 Phytochemistry 55, 481-504 참조).

유색의 안토시아닌에는 수백 분자 종이 알려져 있으나, 이하에 개시하는 바와 같이, 그 발색단 (發色團)인 안토시아니딘(anthocyanidin)으로는 (1) 오렌지색에서부터 빨간 색의 꽃에 많은 펠라르고니딘 (pelargonidin), (2) 빨간 색에서부터 홍색의 꽃에 많은 시아니딘 (cyanidin) 및 페오니딘 (peonidin) 및 (3) 보라색에서부터 파란 색의 꽃에 많은 델피니딘 (delphinidin), 페튜니딘 (petunidin) 및 말비딘 (malvidin)의 6종이 일반적이다.

안토시아닌의 구조는 그 색상에 큰 영향을 미친다. 안토시아닌의 Ｂ환의 수산기 수가 증가하면 파란 색을 증대시킨다. 따라서, 델피니딘형 안토시아닌은 펠라르고니딘형 안토시아닌, 시아니딘형 안토시아닌에 비하여 파랗다. 안토시아닌을 함유하는 플라보노이드의 생합성은 식물 종을 초월하여 잘 보존되어 있다. 플라보노이드는 세포질에서 생합성되어, 당이나 아실기가 부가된 후에, 액포에 수송되어 축적된다 (Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24 및 Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 편, Flowering and its manipulation, pp. 201-239, Blackwell Publishing Ltd. 참조).

생합성에 관한 효소의 구조 유전자는 모두 클로닝되어 있다. 재조합 식물을 제작할 수 있으면, 이들의 유전자의 발현을 인위적으로 조정함으로써 꽃에서 축적하는 플라보노이드의 구조와 양을 개변하여, 꽃의 색상을 바꿀 수 있다 (Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 1-24 및 Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 편, Flowering and its manipulation, pp. 201-239, Blackwell Publishing Ltd. 참조). 예컨대, 꽃잎에서 델피니딘을 생산할 수 없는 카네이션이나 장미에 있어서, 델피니딘을 합성하기 위하여 필요한 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 (이하, 「F3'5'H」이라고 줄여서 부른다.) 유전자를 발현되게 함으로써, 델피니딘을 생산시켜, 자연에는 없는 파란 꽃을 제작한 예가 있다 (Tanaka 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283-291 참조).

이와 같이 식물의 대사를 인위적으로 개변하는 방법은 대사 공학이라 불리기도 한다. 대사를 개변하여 원하는 물질을 축적시키려면 원하는 물질을 생산하는 효소 유전자를 재조합 식물에 있어서 발현시키면 되지만, 간혹 식물 자신이 보유한 내재된 효소와의 경합에 의하여, 원하는 물질이 전혀 축적되지 않거나 또는 거의 축적되지 않아서, 산업상 유용한 형질을 가지는 것에 이르지 않는 것도 많다.

예를 들면, 페튜니아 (Petunia hybrida)는 그 디히드로플라보놀 환원 효소 (이하, 「DFR」이라고 줄여서 부른다.)의 특이성 때문에 펠라르고니딘을 축적할 수 없고, 따라서 오렌지 색상의 품종은 천연에는 존재하지 않는다.

장미 등의 DFR 유전자를 도입함으로써 펠라르고니딘을 축적시킨 오렌지 색상의 페튜니아가 보고되어 있으나, 펠라르고니딘을 축적시키기 위하여는 DFR와 경합하는 플라보노이드 3'-수산화 효소 (이하, 「F3'H」이라고 줄여서 부른다.), F3'5'H, 플라보놀 합성 효소 (이하, 「FLS」이라고 줄여서 부른다.)의 유전자가 결손되어 있는 페튜니아 품종을 채용할 필요가 있으며, 이들이 결손되지 않은 페튜니아에 장미의 DFR 유전자를 도입하여도 표현형의 변화는 인정되지 않는다 (Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 편, Flowering and its manipulation, pp. 201-239, Blackwell Publishing Ltd. 참조). 따라서 원하는 유전자를 단지 도입하는 것만으로 원하는 화합물이 축적되어 표현형이 나타날 것인 지 아닌 지는 예상할 수 없다.

또한, 대사 공학에 있어서는 예상 외의 결과가 나타나는 경우도 많다. 예를 들면, 토레니아 (Torenia hybrida)에 있어서 플라본 합성 효소 유전자의 발현을 억제한 바, 플라본량이 감소하고, 플라바논 (flavanone)의 축적이 확인되었다. 플라바논이 축적하면 안토시아닌의 양은 증가할 것이지만, 실제로는 안토시아닌의 양도 감소하였다 (Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002 ). 이와 같이 대사물의 증감을 예상하기 곤란하여, 원하는 표현형을 얻으려면 예의 연구가 필요하다.

또한, 안토시아닌은 결합하는 방향족 아실기의 수가 증가하면 분자 내 코피그멘트 작용에 의하여 파랗게 된다. 2개 이상의 방향족 아실기가 있는 안토시안은 폴리아실화 안토시아닌이라 불리는데, 안정적인 파란 색상을 띤다 (Harborne and Williams 2000 phytochemistry 55, 481-504 참조).

필수 색소인 안토시아닌 색소 자체의 구조에 의한 것 이외에, 공존하는 플라보노이드 (코피그멘트라고도 한다)이나 금속 이온, 액포의 pH 등에 의하여도 꽃의 색상은 변화한다. 예를 들면, 플라본이나 플라보놀은 대표적인 코피그멘트로, 안토시아닌과 샌드위치 형태로 포갬으로써, 안토시아닌을 파랗게 하고, 짙게 보이도록 하는 효과가 있다 (Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl. Prod. 52 참조). 이 점에서, 플라본은 무색의 보조 색소 성분이라고 할 수 있다. 예를 들면 플라본의 일종인 이소비텍신 (isovitexin)은 꽃창포 (Japanese gardeniris (Iris ensata Thunb.)) 에 있어서 안토시아닌에 대하여 코피그멘트 효과를 발휘하고, 색상을 파 랗게 한다. 또한, 이소비텍신은 안토시아닌을 안정화하는 것에 의하여 꽃창포의 꽃의 색상을 안정화하는 것도 개시하고 있다 (Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 1-5 참조).

또한, 플라본은 플라보놀보다도 강한 코피그멘트 효과를 나타내는 것이 많다. 예를 들면 유전자 재조합 카네이션의 해석에서는 플라본이 플라보놀보다도 코피그멘트 효과가 강한 것이 개시되어 있다 (Fukui et al. Phytochemistry, 63, 15-23, 2003 참조). 따라서, 플라본의 축적은 꽃의 색상을 파랗게 하기 위하여 중요하다. 그러나, 모든 식물이 플라본을 생산할 수 있는 것은 아니며, 장미나 페튜니아 등은 플라본을 축적하지 않는 것이 알려져 있다. 또한, 플라본은 꽃의 색상 이외에, 자외선의 흡수, 다양한 스트레스, 다른 미생물과의 상호 작용 등에도 관여하고 있고, 플라본을 합성시키는 것에 의하여 새로운 형질을 가진 식물을 얻을 수 있는 것도 알려져 있다 (플라본 합성 효소를 코드하는 유전자에 관한 특허 문헌으로서, 일본 공개 특허 공보 2000-279182을 참조). 그러나, 장미에 있어서 플라본을 발현시킨 예는 아직 알려져 있지 않다.

플라본은 플라본 합성 효소가 촉매하는 반응에 의하여 플라바논으로부터 합성된다. 즉, 아피게닌 (apigenin)은 나린게닌 (naringenin)로부터, 루테오린 (luteolin)은 에리오딕티올 (eriodictyol)로부터, 트리세틴 (tricetin)은 펜타히드록시플라바논으로부터 합성된다. 플라본 합성 효소에는 플라본 합성 효소Ⅰ와 플라본 합성 효소Ⅱ의 2 종류가 있다. 양자는 동일한 반응을 촉매하지만, 다른 타입의 효소이다. 플라본 합성 효소Ⅰ는 2-옥소글루타르산 의존적인 디옥시게나제 (Britsch et al. (1981) Z. Naturforsch 36c pp. 742-750 및 Britsch (1990) Arch. Biochem. Biophys. 282 pp. 152-160 참조)의 일종이며, 플라본 합성 효소Ⅱ는 시토크롬 P450형의 모노옥시게나제이다. 플라본 합성 효소Ⅱ의 구조 유전자는 토레니아, 금어초, 차조기 (Perilla frutescens), 거베라 (gerbera (Gerbera hybrida)), 용담 등으로부터 얻을 수 있다 (Tanaka and Brugliera 2006 Ainsworth 편, Flowering and its manipulation, pp. 201-239, Blackwell Publishing Ltd. 참조).

플라본 합성 효소 유전자를, 플라본을 생산하지 않는 유전자 재조합 식물에 있어서 발현시키면, 플라본이 합성될 것으로 예상된다. 그러나, 페튜니아에 있어서 토레니아의 플라본 합성 효소 유전자를 발현시킨 바, 짙은 남보라색의 색상이 희미해졌다는 보고도 있다 (Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004). 또한, 용담 유래의 플라본 합성 효소 유전자를 담배에서 발현시킨 바, 플라본이 합성되었지만, 역시 꽃의 색상은 희미해졌다는 보고도 있다 (Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breeding 17:91-99 ). 이와 같이 플라본이 합성되어도 반드시 꽃의 색상은 파랗게 되는 것은 아니다. 즉, 코피그멘트 효과를 나타내지 않는 원인으로서 안토시아닌과 플라본의 양이나 비가 적절하지 않은 것이나, 안토시아닌과 플라본의 당이나 아실기에 의한 수식이 적절하지 않은 것 등을 들 수 있다. 이 결과들은 단지 플라본 합성 효소 유전자를 발현시켜 플라본을 축적시키는 것만으로는 꽃의 색상을 더 파랗게 할 수는 없다고 하는 것을 시사한다.

장미는 가장 인기가 있는 화훼 식물이며, 기원 전부터 재배되었다는 기록이 있다. 또한, 수백 년에 걸쳐 인위적인 품종 개량이 되어 왔다. 그 결과, 펠라르고 니딘, 시아니딘, 플라보놀과 한 플라보노이드를 함유하는 장미를 얻었다. 또한, 최근에는 유전자 재조합의 수법을 이용하여, 자연의 장미에는 없는 델피니딘을 생산하는 장미도 만들어져 있다. 그러나, 플라본을 축적하는 장미는 교배에 의하여도 유전자 재조합에 의하여도 아직 얻을 수 없다. 또한, 플라본과 말비딘의 양자를 축적하는 장미도 아직 얻을 수 없다.

식물의 품종 개량에 유전자 재조합의 수법을 채용하는 최대의 이점은 교배에 의한 품종 개량과 달리, 교배할 수 없는 식물이나 다른 생물의 유전자를 이용하여 식물을 개량할 수 있다는 것이다. 즉, 유전자 재조합의 수법을 이용하면 다른 종의 생물의 임의의 유전자를 임의의 식물, 예를 들면 장미에 도입하여, 그 식물에 새로운 능력을 부여할 수 있다고 하는 것이다. 그러나, 장미는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)나 담배 (tobacco (Nicotiana tabacum L.)) 등의 모델 식물과 달리, 도입한 유전자가 기능할 것인 지 아닌 지는 그 유전자의 기원이나 사용하는 프로모터 등에 크게 의존하는 것이 알려져 있다.

WO2005/017147에 따르면, 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 (F3'5'H)를 장미에 도입하였을 경우, 유전자 재조합 장미에 있어서, 페튜니아나 용담에 유래하는 동(同) 유전자는 발현되지 않고, 델피니딘도 검출되지 않았지만, 흥미롭게도 팬지 유래의 동 유전자는 발현되어, 델피니딘을 생산한다고 하는 새로운 능력을 장미에 부여할 수 있었다. 이 결과는 장미에 있어서는 어느 식물 종 유래의 유전자를 도입하면 기능할 지는 용이하게 유추할 수 없다는 것을 보여준다.

또한, 국화에 있어서는 어떠한 유전자를 도입할 수 있어도 그 유전자가 국화에서 기능할 것인가 아닌가는 예상하기 곤란하고, 또한, 재조합 국화의 가령(加齡)에 따라서 도입한 유전자가 기능하지 않게 되는 것이 알려져 있다. 재조합 식물에 있어서 이종의 유전자의 전사에 자주 사용되는 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터는 용담에 있어서는 기능하지 않는 것도 보고되어 있다 (Mishiba et al. Plant Journal 2005, 44: 541-556 참조).

플라본을 장미에서 합성시키려면 플라본 합성 효소 유전자를 발현시키면 좋다는 것은 용이하게 유추할 수 있으나, 디옥시게나제형 또는 시토크롬 P450형의 어느 쪽의 플라본 합성 효소를 발현시키면 좋은 지, 어느 식물기원의 플라본 합성 효소 유전자를 발현시키면 좋은 지 등에 대하여는 용이하게 유추할 수는 없으므로, 시행 착오가 요구된다. 또한, 코피그멘트 효과는 액포 중에 안토시아닌과 플라본이나 플라보놀이 일정한 농도로 공존하면 나타나는 현상이지만, 발색원인 안토시아닌의 배당화 등의 수식 상태에 대하여, 코피그멘트가 되는 플라본이나 플라보놀이 보다 적합한 배당화 등의 수식을 받을 필요가 있는 것도 밝혀져 있다 (Nature. 2005 Aug 11;436 (7052): 791 및 Nature, 358, 515-518 (1992)참조).

즉, 필요한 색조 발현을 위하여는 안토시아닌과 플라본?플라보놀이 최적의 구조상의 조합을 취할 필요가 있고, 또한, 어떻게 수식된 안토시아닌과 플라본?플라보놀을 공존시키면 좋은 지에 대하여도 시행 착오를 필요로 할 것이다. 또한, 플라본 합성 효소가 장미에서 기능하였다고 하더라도, 천연의 장미에서는 나린게닌 등의 플라바논은 플라바논 3-수산화 효소 (이하, 「F3H」이라고 줄여서 부른다.)에 의하여 신속하게 수산화되기 때문에, 플라바논으로부터 플라본이 합성된다고는 할 수 없다.

따라서, 본 발명은 장미에 있어서의 목적으로 하는 색조 발현을 위하여 적절한 색소를 함유하는 장미를 제공하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자는 예의 검토한 결과, 장미에 인위적으로 플라본 및 말비딘을 함유시킴으로써 목적으로 하는 색조 발현이 달성되는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성되었다.

구체적으로는, 본 발명은 아래와 같다 :

1. 유전자 재조합 수법에 의하여 플라본 및 말비딘을 함유하는 것을 특징으로 하는 장미 (a rose).

2. 플라본을 함유하고, 또한, 팬지 (Viola x wittrockiana) 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 및 안토시아닌의 메틸기 전이 효소의 발현에 의하여 말비딘을 함유한 것인, 상기 1에 기재된 장미.

3.안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자, 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 3',5'-수산화 효소 유전자의 발현에 의하여, 말비딘, 플라본 및 델피니딘을 가진, 상기 1 또는 2에 기재된 장미.

4. 상기 플라본 합성 효소 유전자는 현삼과 유래의 플라본 합성 효소 유전자인 것인, 상기 1～3의 어느 하나에 기재된 장미.

5. 상기 현삼과 유래의 플라본 합성 효소 유전자는 현삼과 금어초 (Scrophulariaceae, Antirrhinum majus) 유래의 플라본 합성 효소 유전자인 것인, 상기 4에 기재된 장미.

6. 상기 현삼과 유래의 플라본 합성 효소 유전자는 현삼과 토레니아 (Scrophulariaceae, Torenia hybrida) 유래의 플라본 합성 효소 유전자인 것인, 상기 4에 기재된 장미.

7. 상기 현삼과 금어초 유래의 플라본 합성 효소 유전자는

(1) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(2) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(3) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90% 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소, 또는

(4) 배열 번호 1에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라본 합성 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자인 것인 상기 5에 기재된 장미.

8. 상기 현삼과 토레니아 유래의 플라본 합성 효소 유전자는

(1) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(2) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(3) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90% 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소, 또는

(4) 배열 번호 3에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라본 합성 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자인 것인 상기 6에 기재된 장미.

9. 상기 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자는

(1) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라보노이드 3',5'-수산화 효소,

(2) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라보노이드 3',5'-수산화 효소,

(3) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라보노이드 3',5'-수산화 효소, 또는

(4) 배열 번호 7에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라보노이드 3',5'-수산화 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자인 것인 상기 2～8의 어느 하나에 기재된 장미.

10. 상기 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자는

(1) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소,

(2) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소,

(3) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소, 또는

(4) 배열 번호 9에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 메틸기 전이 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자인, 상기 2～9의 어느 하나에 기재된 장미.

11.안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자, 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 3',5'-수산화 효소 유전자의 도입 전의 숙주와 비교하여 꽃의 색상이 변화된 것인, 상기 2～10의 어느 하나에 기재된 장미.

12. 상기 꽃의 색상의 변화는 파란 색을 향하여 변화하는 것인, 상기 11에 기재된 장미.

13. 상기 꽃의 색상의 변화는 L*a*b 표색계 색도도에 있어서의 색상 각도 (θ)가 파란 색 방향 축인 270°에 가까워지는 변화인 것인, 상기 11 또는 12에 기재된 장미.

14. 상기 꽃의 색상의 변화는 꽃잎의 반사 스펙트럼의 극소값이 장파장측으로 시프트하는 변화인 것인 상기 11에 기재된 장미.

15. 상기 1～14의 어느 하나의 항에 기재된 장미와 동일한 성질을 가진, 그 부분, 자손, 조직, 영양 증식체 또는 세포.

16. 유전자 재조합 수법에 의하여 플라본 및 말비딘을 함유시킴으로써 나타나는 코피그멘테이션 효과에 의하여 장미의 꽃의 색상을 개변하는 방법.

17. 상기 코피그멘테이션 효과는 꽃의 색상을 파란 색 방향으로 변화시키는 효과인 것인 상기 16에 기재되어 있는 방법.

발명을 실시하기 위한 최선의 상태

용어의 정의

용어 「장미 (a rose)」라 함은 본 명세서 중에서 사용할 때, 장미목 장미과 장미속 (Order, Rosales, Family, Rosaceae , Genus Rosa)의 낙엽저목인 감상용 식물의 총칭을 말하며, 특정한 품종에 한정되는 것을 의도하지 않고, 또한 식물의 전체 또는 통상적으로 꽃을 함유하는 부분을 의미한다.

용어 「장미」의 「부분, 자손, 조직, 영양 증식체 또는 세포」라 함은, 본 명세서 중에 사용할 때, 본원 발명에 관한 「장미」의 소망하는 유전적 형질이 보유되어 있는 한, 해당 「장미」에 유래하는 모든 물(物)을 의미하고, 특정한 것에 한정되는 것을 의도하지 않는다.

용어 「높은 스트린젠트 조건」이라 함은, 본 명세서 중에서 사용할 때, 예를 들면, 6×SSC (1×SSC의 조성: 0.15 M NaCl, 0.015 M 구연산 나트륨, pH 7.0)와 0.5％ SDS와 5×덴하르트와 100㎍/㎖ 변성 단편화 연어 정자 DNA와 50% 포름아미드를 함유하는 용액 중에서, 안티센스 사슬과, 대상의 핵산을 55℃에서 하루 밤 보온하고, 0.1×SSC 등의 조건 및/또는 60℃ 이상 등의 조건 하에서의 세정을 행하는 조건을 말하는데, 특히, 백그라운드의 비특이적인 시그널이 실질적으로 존재하지 않게 되는 조건을 말한다.

용어 「L*a*b 표색계 색도도에 있어서의 색상 각도 (θ)」라 함은 본 명세서 중에서 사용할 때, 1976년 국제 증명 위원회 (CIE)에서 규격화되고, 일본에 있어서도 JIS8729로서 채용된 색상 각도 (θ)를 말하는데, 0°는 빨강 방향, 90°는 노랑 방향, 180°는 초록 방향, 그리고 270°는 파랑 방향이다. 한편, 꽃의 색상은 이러한 색상 각도와, RHS (영국 왕립원예협회)의 컬러차트의 데이터를 병용하여 나타낼 수 있다.

플라본 합성 유전자, 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자 및 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자의 도입

장미에, 공지의 방법으로, 차조기 유래의 플라본 합성 효소Ⅱ의 유전자를, 팬지 유래의 F3'5'H 유전자 등과 함께 도입하였다. 그 결과, 차조기 유래의 플라본 합성 효소Ⅱ의 유전자를 도입한 장미에서는 플라본은 검출되지 않아서, 이 유전자는 장미 내에서는 기능하지 않는 것으로 나타났다. 또한, 토레니아 또는 금어초 유래의 플라본 합성 효소Ⅱ의 유전자를 도입한 장미에서는 플라본이 검출되어, 플라본 합성 유전자는 장미 내에서 기능하는 것을 알 수 있었다.

이와 같이 하여, 종래에는 존재하지 않은 플라본을 축적하는 장미를 작출할 수 있었다. 플라본의 총 플라보노이드 중의 함량（％）은 1％ 이상, 좋기로는 5％ 이상, 더 좋기로는 10％ 이상, 가장 좋기로는 30％ 이상이면 좋다. 안토시아닌과 플라본의 양쪽을 축적하는 장미는 같은 안토시아닌만을 함유하는 장미보다도 상대적으로 파란 색을 띠고 있어서, 플라본의 축적이 청색화라고 하는 새로운 형질의 부여에 공헌하고 있는 것을 알 수 있었다.

또한, B환이 메틸화된 안토시아닌 (말비딘을 함유하는 안토시아닌)과 플라본이 공존할 때에, 델피니딘을 함유하는 안토시아닌과 플라본이 공존할 경우보다 높은 코피그멘트 효과가 발휘되는 것을 밝혀내고, 전술한 플라본 합성 효소Ⅱ의 유전자와 팬지의 F3'5'H 유전자에 추가하여, B 환의 메틸기 전이 효소 유전자를 도입하는 것에 의하여, 메틸화된 델피니딘형 안토시아닌과 플라본을 장미 꽃잎에서 축적시켜, 장미 꽃잎을 더 파랗게 하는 것이 가능하게 되었다.

또한, 교잡 시험에 의하여, 델피니딘형 안토시아닌과 플라본의 양쪽을 축적하는 형질은 자손에게도 전달되는 것을 알 수 있었다.

이들의 것부터, 원래 꽃잎으로 플라본을 축적하지 않고 있거나, 또는 말비딘등 메틸화된 안토시아닌을 축적하지 않고 있는 식물에 있어서, 이들의 화합물을 동시에 축적시킴으로써, 꽃잎의 색채를 더 파랗게 하는 것이 가능하게 된다. 이 때, 장미 등과 같이, 원래 플라본과 말비딘의 모두 축적하지 않고 있는 식물을 숙주로서 채용하는 것이 좋다.

본 발명에 관련된 효소류는 전형적으로는 배열표에 기재되어 있는 특정한 아미노산 배열을 가진 효소이다. 그러나, 효소에 있어서는 특정한, 예를 들면 생래의, 아미노산 배열뿐만 아니라, 효소 활성에 관여하는 영역 이외의 영역에 있어서 아미노산 배열이 수식되어 있어도, 소망하는 효소 활성이 유지되는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 효소류는 배열 번호에 나타내는 특정한 아미노산 배열에 대하여, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가지고, 본래의 효소 활성을 유지하고 있는 단백질 및 배열 번호에 나타내는 특정한 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가지며, 본래의 효소 활성을 유지하고 있는 단백질도, 본 발명의 효소에 포함된다.

또한, 어떠한 효소를 코드하는 유전자를 입수하면, 해당 유전자에 대하여 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산은 해당 효소와 동일한 활성을 가진 효소를 코드하고 있을 개연성이 높은 것이 알려져 있다. 따라서, 특정한 배열 번호로 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드되고, 또한, 원하는 효소 활성을 가진 효소도, 본 발명의 효소에 포함된다.

따라서, 본 발명에 관여하는 효소 유전자로서 아래에 기재된 것을 들 수 있다.

(A) 금어초 ( Antirrhinum majus ) 유래의 플라본 합성 효소 유전자

(1) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(2) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(3) 배열 번호 2에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소, 또는

(4) 배열 번호 1에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라본 합성 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자.

(B) 토레니아 ( Torenia hybrida ) 유래의 플라본 합성 효소 유전자

(1) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(2) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(3) 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소, 또는

(4) 배열 번호 3에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라본 합성 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자.

(C) 차조기 ( Perilla frutescens ) 유래의 플라본 합성 효소 유전자

(1) 배열 번호 6에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(2) 배열 번호 6에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소,

(3) 배열 번호 6에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소, 또는

(4) 배열 번호 5에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 플라본 합성 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자.

(D)팬지 (pansy ( Viola x wittrockiana )) 유래의 3',5'-수산화 효소 유전자

(1) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열을 가진 3',5'-수산화 효소,

(2) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 3',5'-수산화 효소,

(3) 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 3',5'-수산화 효소, 또는

(4) 배열 번호 7에 나타내는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 3',5'-수산화 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자.

(E) 토레니아 ( Torenia hybrida ) 유래의 메틸기 전이 효소 유전자

(1) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소,

(2) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1개～수개의 아미노산의 부가, 결실 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의하여 수식된 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소,

(3) 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열에 대하여 90％ 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소, 또는

(4) 배열 번호 9에 개시하는 염기 배열을 가진 핵산과 높은 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산에 의하여 코드된 메틸기 전이 효소,

중 어느 하나를 코드하는 유전자.

이하의 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 본 실시예는 본 발명을 예시하는 것만을 목적으로 하고, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되는 것을 의도하지 않는다.

실시예 1: 안토시아닌에 대한 플라본의 코피그멘트 효과의 시뮬레이션

안토시아닌에 대한 플라본의 코피그멘트 효과의 시뮬레이션을 행하기 위하여, 우선 안토시아닌류를 조제하였다. 시아닌 (Cyanin)은 장미 품종 "Rote Rose",(rose cv. "Rote Rose")의 꽃잎으로부터 추출, 정제하였다. 델핀 (Delphin)은 바베나 품종 "타피엔 바이올렛" (vberbena cv. "Tapien Violet" vberbena variety Sunmaref TP-V ("Tapien Violet")("Tapien"은 일본에서 등록된 상표이다.)의 꽃잎으로부터 추출한 색소를, 알칼리 가수 분해한 후 정제하였다. 말빈 (Malvin) 및 Luteolin 7-O-glucoside는 후나코시가부시키가이샤에서 구입하였다.

이와 같이 하여 조제한 여러 가지 안토시아닌에 대하여 플라본 (Luteolin 7-O-glucoside)을 pH 5.0의 완충액 중에, 0, 1, 2, 4 당량의 몰 농도비로 첨가하고, 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 안토시아닌으로서는, 시아닌 (Cyanidin 3,5-diglucoside), 델핀 (Delphinidin 3,5-diglucoside), 말빈 (Malvidin 3,5-diglucoside)을 사용하였다. 안토시아닌의 농도는 시아닌, 델핀 및 말빈은 1 mM로 하였다.

이하의 표 1과 2에 나타내는 바와 같이, 플라본의 첨가에 의하여, 안토시아닌 수용액의 흡광도는 증대하여, 그 변화의 비율 (흡광도비)은 말빈에서 최대이었 다. 또한, 흡수 극대 (λmax)도 플라본의 첨가와 함께 장파장측으로 시프트하였다. 그 변화의 비율은 말빈에서 최대이고, 다음으로 델핀이었다. 또한, L*a*b* 표색계에 의하여 색채 값의 평가를 실시한 바, 플라본의 첨가에 의하여, 색채의 청색화가 관찰되고, 색상도 상승하였다. 그 효과는 말빈에서 가장 현저하였다. 즉, Luteolin 7-O-glucoside의 코피그멘트 효과를 가장 받는 것은 말빈인 것이 밝혀졌다.

표 1

표 2

실시예 2 ( 참고예 ): 장미 품종 " Lavande "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 차조기 유래 플라본 합성 효소 유전자의 도입

일본 공개 특허 공보 2000-279182에 기재된 차조기 유래 플라본 합성 효소 유전자를 함유하는 플라스미드, pYFS3을 XbaI로 소화한 후, 평활 말단화하고, 또한 BamHI로 소화하여, 약 1.8kb의 시소플라본 합성 효소 유전자 단편을 얻었다. 한편, WO2005/017147에 기재된 pSPB906을 XhoI로 소화한 후, 평활 말단화하고, 또한 BamHI로 소화하였다. 이 평활 말단과 BamHI 절단 부위의 사이에, 전술한 차조기의 플라본 합성 효소 유전자 단편을 삽입하여 906-pYFS3을 얻었다. 906-pYES3은 El235S 프로모터와 D8 터미네이터 (모두 WO2005/017147에 기재)의 사이에 차조기 유래의 플라본 합성 효소 유전자를 가진 것이다.

우에야마(Uyama) 등의 보고 (Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002)에 기재된 pSPB176의 BamHI와 SalI 부위에, WO2005/017147에 기재된 pCGP1961로부터 BamHI와 XhoI의 부분 소화로 잘라낸 팬지 F3'5'H #40 유전자의 단편을 삽입한 플라스미드를 pSPB575로 하였다. 이 AscI 부위에, 전술한 906-pYFS3을 AscI로 소화하여 얻는 약 3.4kb의 차조기의 플라본 합성 효소 유전자 발현 카세트를 삽입하였다. 얻은 플라스미드 중에서, F3'5'H #40 유전자의 발현 카세트와 차조기의 플라본 합성 효소의 발현 카세트가 동일한 방향으로 연결된 벡터를 pSPB1310이라 하였다. 본 플라스미드는 식물에 있어서는 팬지의 F3'5'H #40 유전자와 차조기의 플라본 합성 효소 유전자 구성적으로 발현된다.

이와 같이 제작한 pSPB1310을 연보라빛계 장미 품종 "Lavande"(maure rose variety "Lavande")에 도입하고, 55 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 한 50 개체 중에서 49 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유 율은 최고 70％（평균 26％）이었다. 그러나, 플라본은 전혀 검출되지 않고, 차조기 유래의 플라본 합성 효소 유전자가 장미의 세포에서는 기능하지 않고 있는 것으로 추측되었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 3에 나타낸다.

표 3

실시예 3: 장미 품종 " Lavande "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니 아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 도입

아카시 (Akashi) 등의 보고 (Plant Cell Physiol 40, 1182-1186, 1999)에 기재된 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자가 플라스미드 pBluescript II SK (-)의 EcoRI와 XhoI 부위에 삽입된 플라스미드를 pSPB426이라 하였다. 이것을 KpnI 로 소화한 후, 평활 말단화하고, 또한 BamHI로 소화하여, 약 1.7kb의 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자 단편을 얻었다. 한편, WO2005/017147에 기재된 pSPB906을 XhoI로 소화한 후, 평활 말단화하고, 또한 BamHI로 소화하였다. 이 평활 말단과 BamHI절단 부위의 사이에, 전술한 토레니아의 플라본 합성 효소 유전자 단편을 삽입하여 906-426을 얻었다.

우에야마(Uyama) 등의 보고 (Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263, 2002)에 기재된 pSPB176의 BamHI와 SalI 부위에, WO2005/017147에 기재된 pCGP1961로부터 BamHI와 XhoI의 부분 소화로 잘라낸 팬지 F3'5'H #40 유전자의 단편을 삽입한 플라스미드를 pSPB575로 하였다. 이 AscI 부위에, 전술한 906-426을 AscI로 소화하여 얻는 약 3.3 kb의 토레니아의 플라본 합성 효소 유전자 발현 카세트를 삽입하였다. 얻은 플라스미드 중에서, F3'5'H #40 유전자의 발현 카세트와 토레니아의 플라본 합성 효소의 발현 카세트가 동일한 방향으로 연결된 벡터를 pSPB1309라 하였다. 본 플라스미드는 식물에 있어서는 팬지 F3'5'H #40 유전자와 토레니아의 플라본 합성 효소 유전자 구성적으로 발현된다.

이와 같이 하여 제작한 pSPB1309을 연보라빛계 장미 품종 "Lavande"에 도입하여, 50 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 한 38 개체 중에서 36 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 45％（평균 12％）이었다. 한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 35 개체에서 새로 플라본 (루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 1.68 ㎎이라는 높은 함유량이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 4에 나타낸다.

표 4

실시예 4: 장미 품종 " WKS124 "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 도입

사몬 핑크계 장미 품종 "WKS124" (salman-pink rose variety "WKS124")에 실시예 3에 기재된 pSPB1309을 도입하고, 40 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 한 27 개체 중 26 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있고, 델피니딘 함유율은 최고 96％（평균 81％）이었다. 한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 26 개체에서 새로 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 4.41 ㎎ 이라는 높은 함유량이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 5에 나타낸다.

표 5

실시예 5: 장미 품종 " WKS124 "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자의 도입

실시예 3에 기재된 pSPB1309를 PacI 처리하고, 토레니아 유래의 플라본 합성 효소 발현 카세트와 팬지 유래 F3'5'H #40 유전자 발현 카세트의 연결 부위 부근에 존재하는 (더 엄밀하게는 플라본 합성 효소 발현 카세트의 D8 터미네이터 3 말단 부근에 존재한다) PacI 부위와 벡터의 멀티클로닝 사이트 내의 PacI 부위를 절단함으로써, 팬지 F3'5'H #40 유전자 발현 카세트를 잘라내었다.

한편, WO2003-062428에 기재된 토레니아의 메틸기 전이 효소 유전자 발현 카세트를 가진 바이너리 (binary) 벡터 pSPB1530을 PacI로 절단하고, 거기에 상기 팬지 F3'5'H #40 발현 카세트를, 메틸기 전이 효소 유전자 발현 카세트와 동일한 방향으로 삽입하였다. 본 플라스미드를 TMT-BP40이라 한다.

한편, pSPB1309을 AscI로 절단하여, 토레니아의 플라본 합성 효소 발현 카세트를 잘라내었다. 이것을 TMT-BP40의 AscI 부위에, 이들의 발현 카세트와 동일한 방향으로 삽입하고, 얻은 플라스미드를 pSFL535라 하였다. 본 플라스미드는 식물에 있어서, 팬지 F3'5'H #40 유전자와 토레니아의 메틸기 전이 효소 유전자 및 토레니아의 플라본 합성 효소 유전자를 구성적으로 발현된다.

이와 같이 하여 얻은 pSFL535을 사몬 핑크계의 장미 「WKS124」에 도입하고, 173 개체의 형질 전환체를 얻었다. 안토시아니딘 분석을 한 98 개체의 형질 전환체 중에서 88 개체에서 말비딘 (델피니딘의 3'위와 5'위가 메틸화된 안토시아니딘)의 축적을 확인할 수 있고, 장미의 꽃잎에 있어서 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자가 기능하고 있는 것이 생성물에 의하여 나타났다. 또한, 말비딘 함유율은 최고 84％（평균 50％）이었다.

한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 77 개체에서 새로 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 4.58 ㎎이라는 높은 함유량이었다. 또한, 51 개체에서 메틸화한 트리세틴이 검출되었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 6에 나타낸다.

표 6

실시예 6: 장미 품종 " Lavande "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니 아 유래 플라본 합성 효소 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자의 도입

실시예 5에 기재된 pSFL535을 연보라빛계 장미 품종 "Lavande"에 도입하여, 130 개체의 형질 전환체를 얻었다. 안토시아니딘 분석을 한 118 개체의 형질 전환체 중에서 37 개체에서 말비딘 (델피니딘의 3'위와 5'위가 메틸화된 안토시아니딘)의 축적을 확인할 수 있고, 장미의 꽃잎에 있어서 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자가 기능하고 있는 것이 생성물에 의하여 나타났다. 또한, 말비딘 함유율은 최고 55.6％（평균 20.5％）이었다.

한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 78 개체에서 새로 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 5.11 ㎎이라는 높은 함유량이었다. 또한, 플라본을 생산하고 있었던 형질 전환체 중에서 20 개체에서 메틸화한 트리세틴 또는 루테오린이 검출되었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 7에 나타낸다.

표 7

실시예 7: 장미 품종 " WKS82 "에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자의 도입

실시예 5에 기재된 pSFL535을 연보라빛계 장미 품종 "WKS82" (mauve rose variety "WKS82")에 도입하여, 250 개체의 형질 전환체를 얻었다. 안토시아니딘 분석을 한 232 개체의 형질 전환체 중에서 110 개체에서 말비딘 (델피니딘의 3'위와 5'위가 메틸화된 안토시아니딘)의 축적을 확인할 수 있고, 장미의 꽃잎에 있어서 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자가 기능하고 있는 것이 생성물에 의하여 나타났다. 또한, 말비딘 함유율은 최고 65.2％（평균 19.7％）이었다.

한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 125 개체에서 새로 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 4.71 ㎎이라는 높은 함유량이었다. 또한, 플라본을 생산하고 있었던 형질 전환체 중에서 80 개체에서 메틸화한 트리세틴 또는 루테오린이 검출되었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 8에 나타낸다.

표 8

실시예 8: 장미 품종 "WKS140"에의 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자의 도입

실시예 5에 기재된 pSFL535을 연보라빛계 장미 품종 "WKS140"(mauve rose variety "WKS140")에 도입하여, 74 개체의 형질 전환체를 얻었다. 안토시아니딘 분석을 한 74개체의 형질 전환체 중에서 20 개체에서 말비딘 (델피니딘의 3'위와 5'위가 메틸화된 안토시아니딘)의 축적을 확인할 수 있고, 장미의 꽃잎에 있어서 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자가 기능하고 있는 것이 생성물에 의하여 나타났다. 또한, 말비딘 함유율은 최고 51.3％（평균 33.5％）이었다.

한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 29 개체에서 새로 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 3.04 ㎎이라는 높은 함유량이었다. 또한, 플라본을 생산하고 있었던 형질 전환체 중에서 20 개체에서 메틸화한 트리세틴 또는 루테오린이 검출되었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 9에 나타낸다.

표 9

실시예 9: 플라본 및 말비딘 합성 능력의 후대에의 전파-팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자를 도입한 유전자 재조합 장미와 재배 장미와의 교잡

장미에 부여한 플라본 합성 능력의 후대에의 유전 양식을 조사하기 위하여, 실시예 5에서 작출한 말비딘 및 플라본을 생산하는 장미 (표 6 중에서, 식물 No. 6)을 화분친으로서 사용한 교배를 실시하였다. 종자친에는 중륜계 재배 장미 "Medeo (메데오)"(floribunda rose variety "Medeo")를 사용하였다.

취득한 형질 전환체 F1 잡종 후대 중에서 10 개체의 색소 분석을 한 바, 7 개체에서 말비딘의 축적이 확인되고, 장미의 꽃잎에 있어서 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자가 기능하고 있는 것이 생성물에 의하여 나타났다. 또한, 말비딘 함유율은 최고 68.2％（평균 46.6％）이었다.

한편, 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자의 활동에 의하여, 8 개체의 형질 전환체 후대에서 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적도 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 7.35 ㎎이라는 극히 높은 함유량이었다. 또한, 플라본을 생산하고 있었던 형질 전환체 후대 중에서 6 개체에서 메틸화한 트리세틴이 검출되었다.

대표적인 형질 전환체 후대의 분석 값을 이하의 표 10에 나타낸다.

표 10

실시예 10: 플라본 합성 능력의 후대에의 전파

팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자를 도입한 장미 품종 " WKS124 "와 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자와 토레니아 유래 플라본 합성 효소 유전자를 도입한 장미 품종 " Lavande "의 교배

장미에 부여한 플라본 합성 능력의 후대에의 유전 양식을 조사하기 위하여, 실시예 3에서 작출한 플라본 생산주 (표 4 중에서, 식물 No. 4)를 화분친으로서 사용한 교배를 실시하였다. 종자친에는 장미 품종 WKS124에 pSPB1532을 도입하고, 팬지 유래 F3'5'H ＃40 유전자 및 토레니아 유래 안토시아닌 메틸기 전이 효소 유전자의 작용에 의하여 꽃잎에서 말비딘을 고도로 축적한 형질 전환체 WKS124/1532-12-1 (WO2003/062428에 기재)을 채용하였다.

취득한 형질 전환체 후대 중에서 149 개체의 색소 분석을 실시한 바, 88 개체에서 플라본 (트리세틴, 루테오린, 아피게닌)의 축적을 확인할 수 있었다. 플라본 총량은 최고로 신선 꽃잎 중량 1 g당 4.09 ㎎이라는 높은 함유량이었다. 또한, 42 개체에서 메틸화한 트리세틴이 검출되고, 11 개체에서 메틸화한 루테오린 (Chrysoeriol (3'Met-Lut))이 검출되었다. 한편, 색소 분석을 한 149 개체 중에서 129 개체에서 말비딘의 축적을 확인할 수 있었다. 말비딘 함유율은 최고 79％（평균 36％）이었다.

대표적인 형질 전환체 후대의 분석 값을 이하의 표 11에 나타낸다.

표 11

실시예 11: 플라본을 함유하는 장미의 꽃의 색상의 평가

실시예 4 및 5에 있어서 작출한 형질 전환체 (장미 품종 "WKS124" 숙주라 한다)에 대하여, (1) 주(主) 색소로서 델피니딘을 축적하고, 플라본을 함유하지 않는 것, (2) 주 색소로서 델피니딘을 축적하고, 플라본을 함유하는 것, (3) 주 색소로서 말비딘을 고도로 축적하고, 플라본을 함유하지 않는 것 및 (4) 주 색소로서 말비딘을 고도로 축적하고, 플라본을 함유하는 것 및 (5) 숙주 (주 색소로서 펠라르고니딘을 축적)로 하는 그룹으로 분류하고, 각각의 꽃잎의 색채에 대하여 분광측색계를 사용하여 평가를 행하였다 (ｎ=10).

주색소가 델피니딘 타입인 장미, 말비딘 타입인 장미 어느 것에 있어서도, 플라본이 공존할 경우에 꽃잎의 색상 각도는 파란 색 방향으로 시프트하고 있었다. 또한, 주색소가 말비딘 타입인 장미에 있어서는 그 경향이 더 현저하여, 반사 스펙트럼의 극소 (λMin)도 장파장측으로 크게 시프트하고 있었다. 이상의 결과로부터 플라본의 공존에 의하여 꽃잎의 색채가 파랗게 변화되는 것이 확인되었다. 결과를 이하의 표 12에 나타낸다.

표 12

본 발명에 의하여, 감상용 식물로서 인기가 있는 화훼 식물인 장미에 있어서, 유전자 재조합 수법에 의하여 플라본 및 말비딘을 함유시킴으로써, 코피그멘테이션 효과에 의하여 장미의 꽃의 색상을 파란 색 방향으로 변화시킬 수 있다. 파란 색의 장미는 감상용 식물로서의 상품 수요가 예상된다.

여기에서, 본 명세서 중에 인용한 특허 문헌, 비특허 기술 문헌의 모두를, 개별로 또는 그것들을 전체로서, 본 명세서 중에 원용한다.

지금까지, 본 발명을 설명하였지만, 본 발명은 그 본질로부터 일탈하지 않 고, 수정 또는 변경될 수 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 발명의 범위는 실시예의 기재에 기초하는 것이 아니라, 첨부한 청구의 범위에 의하여 해석되어야 하는 것은 말할 필요도 없다.

SEQUENCE LISTING <110> International Flower Developments Proprietary Limited <120> Rose comprising flavone and malvidin, and process for the preparation thereof <130> IFD(STY)-V635-PCT,TW <140> PCT/JP2008/ <141> 2008-06-19 <150> JP2007-162959 <151> 2007-06-20 <160> 10 <210> 1 <211> 1706 <212> DNA <213> Antirrhinum majus <220> <221> CDS <222> (41)...(1557) <223> Nucleotide sequence encoding flavone synthase <400> 1 gctttacaca cacacacaca cacacacaca caaacaaaa atg tct aca ctt gtc tac 57 Met Ser Thr Leu Val Tyr 1 5 agc aca ctc ttc atc ctc tca acc ctc ctc ctc acc ctc cta acc cgc 105 Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu Leu Leu Thr Leu Leu Thr Arg 10 15 20 acc cgc cgc aag acc cgc ccg ccc ggc cca tta gcc ctc ccc tta ata 153 Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly Pro Leu Ala Leu Pro Leu Ile 25 30 35 ggc cac tta cac ctc ctc ggc cca aag ctc cac cac acc ttc cac caa 201 Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys Leu His His Thr Phe His Gln 40 45 50 ttc tcc caa cgc tac ggc ccg ctc atc cag ctc tac ctc ggc tcc 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cgc tgc gtc att 242 Tyr Gly Pro Leu Met Gln Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile 60 65 70 gct gcc tcg ccg gag ctc gcc aag gaa tgc ctc aag aca cac gag ctc 290 Ala Ala Ser Pro Glu Leu Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu 75 80 85 90 gtc ttc tcc tcc cgc aaa cac tcc acc gcc att gat atc gtc acc tac 338 Val Phe Ser Ser Arg Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr 95 100 105 gat tca tcc ttc gct ttc tct ccc tac ggg cct tac tgg aaa ttc atc 386 Asp Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile 110 115 120 aag aaa tta tgc acc tac gag ctg ctc ggg gcc cga aat ctc gcc cac 434 Lys Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ala His 125 130 135 ttt cag ccc atc agg act ctc gaa gtc aag tct ttc ctc caa att ctt 482 Phe Gln Pro Ile Arg Thr Leu Glu Val Lys Ser Phe Leu Gln Ile Leu 140 145 150 atg cgc aag ggt gaa tcg ggg gag agc ttc aac gtg act gag gag ctc 530 Met Arg Lys Gly Glu Ser Gly Glu Ser Phe Asn Val Thr Glu Glu Leu 155 160 165 170 gtg aag ctg acg agc aac gtc ata tcg cat atg atg ctg agc ata cgg 578 Val Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser His Met Met Leu Ser Ile Arg 175 180 185 tgt tca gag acg gag tcg gag gcg gag gcg gcg agg acg gtg att cgg 626 Cys Ser Glu Thr Glu Ser Glu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile Arg 190 195 200 gag gtc acg cag ata ttt ggg gag ttc gac gtc tcc gac atc ata tgg 674 Glu Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser Asp Ile Ile Trp 205 210 215 ctt tgt aag aac ttc gat ttc caa ggt ata agg aag cgg tcc gag gat 722 Leu Cys Lys Asn Phe Asp Phe Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp 220 225 230 atc cag agg aga tat gat gct ctg ctg gag aag atc atc acc gac aga 770 Ile Gln Arg Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Thr Asp Arg 235 240 245 250 gag aag cag agg cgg acc cac ggc ggc ggt ggc ggc ggc ggg gaa gcc 818 Glu Lys Gln Arg Arg Thr His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala 255 260 265 aag gat ttt ctt gac atg ttc ctc gac ata atg gag agc ggg aaa gcc 866 Lys Asp Phe Leu Asp Met Phe Leu Asp Ile Met Glu Ser Gly Lys Ala 270 275 280 gaa gtt aaa ttc acg agg gag cat ctc aaa gct ttg att ctg gat ttc 914 Glu Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe 285 290 295 ttc acc gcc ggc acc gac acg acg gcg atc gtg tgt gaa tgg gcg ata 962 Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Val Cys Glu Trp Ala Ile 300 305 310 gca gaa gtg atc aac aat cca aat gtg ttg aag aaa gct caa gaa gag 1010 Ala Glu Val Ile Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu 315 320 325 330 att gcc aac atc gtc gga ttc gac aga att ctg caa gaa tcc gac gcc 1058 Ile Ala Asn Ile Val Gly Phe Asp Arg Ile Leu Gln Glu Ser Asp Ala 335 340 345 cca aat ctg ccc tac ctt caa gcc ctc atc aaa gaa aca ttc cgg ctc 1106 Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Leu Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu 350 355 360 cac cct cca atc cca atg ctg gcg agg aaa tcg atc tcc gac tgc gtc 1154 His Pro Pro Ile Pro Met Leu Ala Arg Lys Ser Ile Ser Asp Cys Val 365 370 375 atc gac ggc tac atg att ccg gcc aac acg ctg ctc ttc gtc aac ctc 1202 Ile Asp Gly Tyr Met Ile Pro Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu 380 385 390 tgg tcc atg ggg cgg aac cct aaa atc tgg gac tac ccg acg gcg ttc 1250 Trp Ser Met Gly Arg Asn Pro Lys Ile Trp Asp Tyr Pro Thr Ala Phe 395 400 405 410 cag ccg gag agg ttt ctg gag aag gaa aag gcc gcc atc gat gtt aaa 1298 Gln Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Glu Lys Ala Ala Ile Asp Val Lys 415 420 425 ggg cag cat ttt gag ctg cta ccg ttc gga acg ggc agg aga ggc tgc 1346 Gly Gln His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys 430 435 440 cca ggg atg ctt tta gcc att cag gag gtg gtc atc ata att ggg acg 1394 Pro Gly Met Leu Leu Ala Ile Gln Glu Val Val Ile Ile Ile Gly Thr 445 450 455 atg att caa tgc ttc gat tgg aag ctg ccc gac ggc tcc ggc cat gtt 1442 Met Ile Gln Cys Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Ser Gly His Val 460 465 470 gat atg gca gaa cgg cca ggg ctc acg gca ccg cga gag acc gat ttg 1490 Asp Met Ala Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Glu Thr Asp Leu 475 480 485 490 ttt tgc cgt gtg gtg ccg cga gtt gat ccg ttg gtt gtt tcc acc cag 1538 Phe Cys Arg Val Val Pro Arg Val Asp Pro Leu Val Val Ser Thr Gln 495 500 505 tgatcacccc ctttaaattt attaatgata tatttttatt ttgagaaaaa ataaaaatgc 1598 taattgtttt gtttcatgat gtaattgtta attagtttct attgtgcgct gtcgcgtgtc 1658 gcgtggctta agataagatt gtatcattgg tacctaggat gtattttcat tttcaataaa 1718 ttattttgtg ctgtgtatat taaaaaaaaa aaagaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1770 <210> 6 <211> 506 <212> PRT <213> Perilla frutescens <220> <221> <222> <223> Amino acid sequence of flavone synthase <400> 6 Met Ala Leu Tyr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Ala Ala Val Val Arg 1 5 10 15 Ser Val Leu Asp Arg Lys Arg Gly Arg Pro Pro Tyr Pro Pro Gly Pro 20 25 30 Phe Pro Leu Pro Ile Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Leu 35 40 45 His Gln Thr Phe His Asp Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Met Gln 50 55 60 Leu Arg Leu Gly Ser Ile Arg Cys Val Ile Ala Ala Ser Pro Glu Leu 65 70 75 80 Ala Lys Glu Cys Leu Lys Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys 85 90 95 His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala Phe 100 105 110 Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr 115 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gct tgg atg gat ttg caa ggg atc gag cga ggg 720 Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly 225 230 235 atg aag aag ctg cac acg aag ttt gat gtg tta ttg acg aag atg gtg 768 Met Lys Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val 240 245 250 aag gag cat aga gcg acg agt cat gag cgc aaa ggg aag gca gat ttc 816 Lys Glu His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe 255 260 265 270 ctc gac gtt ctc ttg gaa gaa tgc gac aat aca aat ggg gag aag ctt 864 Leu Asp Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu 275 280 285 agt att acc aat atc aaa gct gtc ctt ttg aat cta ttc acg gcg ggc 912 Ser Ile Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly 290 295 300 acg gac aca tct tcg agc ata atc gaa tgg gcg tta acg gag atg atc 960 Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile 305 310 315 aag aat ccg acg atc tta aaa aag gcg caa gag gag atg gat cga gtc 1008 Lys Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Arg Val 320 325 330 atc ggt 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flavonoid-3',5'-hydroxylase <400> 8 Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Leu 1 5 10 15 Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met 145 150 155 160 Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg 180 185 190 Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met 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Gln Leu Lys Glu Leu Arg Ser Ala Thr Val Asp Lys Tyr Gln Tyr 30 35 40 45 tgg agc ttg atg aat gtt cca gct gat gag ggg cag ttc att tca atg 251 Trp Ser Leu Met Asn Val Pro Ala Asp Glu Gly Gln Phe Ile Ser Met 50 55 60 tta ctg aaa att atg aac gca aaa aag aca att gaa gtt gga gtt ttc 299 Leu Leu Lys Ile Met Asn Ala Lys Lys Thr Ile Glu Val Gly Val Phe 65 70 75 aca ggc tac tca ctc cta tca act gct ctg gct cta cct gat gat ggc 347 Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ser Thr Ala Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly 80 85 90 aaa atc gtt gcc att gat cct gat aga gaa gct tat gag act ggt ttg 395 Lys Ile Val Ala Ile Asp Pro Asp Arg Glu Ala Tyr Glu Thr Gly Leu 95 100 105 cca ttt atc aag aaa gca aac gtg gct cat aaa atc caa tac ata caa 443 Pro Phe Ile Lys Lys Ala Asn Val Ala His Lys Ile Gln Tyr Ile Gln 110 115 120 125 tct gat gcc atg aaa gtc atg aat gac ctc att gct gcc aag gga gaa 491 Ser Asp Ala Met Lys Val Met Asn Asp Leu Ile Ala Ala Lys Gly Glu 130 135 140 gaa gaa gag ggg agc ttt gac ttt ggg ttc gtg gat gca gac aaa gaa 539 Glu Glu Glu Gly Ser Phe Asp Phe Gly Phe Val Asp Ala Asp Lys Glu 145 150 155 aac tac ata aac tac cac gag aaa ctg ttg aag ctg gtt aag gtt gga 587 Asn Tyr Ile Asn Tyr His Glu Lys Leu Leu Lys Leu Val Lys Val Gly 160 165 170 ggg atc ata gga tac gac aac act ctg tgg tct gga aca gtt gct gca 635 Gly Ile Ile Gly Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Ser Gly Thr Val Ala Ala 175 180 185 tct gaa gac gat gag aat aat atg caa gac tac tta aga ggt tgc aga 683 Ser Glu Asp Asp Glu Asn Asn Met Gln Asp Tyr Leu Arg Gly Cys Arg 190 195 200 205 ggg cat atc ctc aaa cta aac tcc ttt ctc gca aac gat gat cgg att 731 Gly His Ile Leu Lys Leu Asn Ser Phe Leu Ala Asn Asp Asp Arg Ile 210 215 220 gaa ttg gct cac ctc tct att gga gat gga ctc acc ttg tgc aaa cgt 779 Glu Leu Ala His Leu Ser Ile Gly Asp Gly Leu Thr Leu Cys Lys Arg 225 230 235 ctc aaa taataatttt caactttatt attattgttt cataaaaagc atttactgct 835 Leu Lys ggcctggcct ggcctgtttc agcatcttat atttctattg ttctaaatat tttagttatc 895 ttgtttatca acttgtctgt cttatatgtt taaaagaaag atgtcatgta attgtaactc 955 gatcgggctc ttgtaatatt ataatgaatt ttattgattt caaaaaaaaa aaaaaaaaa 1014 <210>10 <211>239 <212>PRT <213>Torenia hybrida <220> <221> <222> <223>Amino acid sequence of methyltransferase <400>10 Met Lys Asp Lys Phe Tyr Gly Thr Ile Leu Gln Ser Glu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Lys Tyr Leu Leu Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Arg Glu His Pro Gln Leu 20 25 30 Lys Glu Leu Arg Ser Ala Thr Val Asp Lys Tyr Gln Tyr Trp Ser Leu 35 40 45 Met Asn Val Pro Ala Asp Glu Gly Gln Phe Ile Ser Met Leu Leu Lys 50 55 60 Ile Met Asn Ala Lys Lys Thr Ile Glu Val Gly Val Phe Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Ser Leu Leu Ser Thr Ala Leu Ala Leu Pro Asp Asp Gly Lys Ile Val 85 90 95 Ala Ile Asp Pro Asp Arg Glu Ala Tyr Glu Thr Gly Leu Pro Phe Ile 100 105 110 Lys Lys Ala Asn Val Ala His Lys Ile Gln Tyr Ile Gln Ser Asp Ala 115 120 125 Met Lys Val Met Asn Asp Leu Ile Ala Ala Lys Gly Glu Glu Glu Glu 130 135 140 Gly Ser Phe Asp Phe Gly Phe Val Asp Ala Asp Lys Glu Asn Tyr Ile 145 150 155 160 Asn Tyr His Glu Lys Leu Leu Lys Leu Val Lys Val Gly Gly Ile Ile 165 170 175 Gly Tyr Asp Asn Thr Leu Trp Ser Gly Thr Val Ala Ala Ser Glu Asp 180 185 190 Asp Glu Asn Asn Met Gln Asp Tyr Leu Arg Gly Cys Arg Gly His Ile 195 200 205 Leu Lys Leu Asn Ser Phe Leu Ala Asn Asp Asp Arg Ile Glu Leu Ala 210 215 220 His Leu Ser Ile Gly Asp Gly Leu Thr Leu Cys Lys Arg Leu Lys 225 230 235

Claims (17)

1. 현삼과 토레니아 (Scrophulariaceae, Torenia hybrida) 유래의 플라본 합성 효소 유전자에 의한 플라본 및 팬지 (Viola x wittrockiana) 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 및 현삼과 토레니아 유래의 안토시아닌의 메틸기 전이 효소의 발현에 의한 말비딘을 함유하는 것을 특징으로 하는 장미 (Rosa hybrida).
2. 제1항에 있어서, 상기 현삼과 토레니아 유래의 플라본 합성 효소 유전자는 배열 번호 4에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라본 합성 효소를 코드하는 유전자인 것인 장미.
3. 제1항에 있어서, 상기 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자는 배열 번호 8에 기재된 아미노산 배열을 가진 플라보노이드 3',5'-수산화 효소를 코드하는 유전자인 것인 장미.
4. 제1항에 있어서, 상기 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자는 배열 번호 10에 기재된 아미노산 배열을 가진 메틸기 전이 효소를 코드하는 유전자인 것인 장미.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자, 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자의 도입 전의 숙주와 비교하여 꽃의 색상이 파란 색을 향하여 변화한 것인 장미.
6. 제5항에 있어서, 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자, 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자의 도입 전의 숙주와 비교하여 꽃의 색상이 L*a*b 표색계 색도도에 있어서의 색상 각도 (θ)가 파란 색 방향 축인 270°에 가까워지게 변화한 것인 장미.
7. 제5항에 있어서, 상기 꽃의 색상의 변화는 꽃잎의 반사 스펙트럼의 극소값이 장파장측으로 시프트하는 변화인 것인 장미.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 장미와 동일한 유전적 형질을 보유하는 장미 (Rosa hybrida)의 조직.
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 장미와 동일한 유전적 형질을 보유하는 장미 (Rosa hybrida)의 자손.
10. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 장미와 동일한 유전적 형질을 보유하는 장미 (Rosa hybrida)의 세포.
11. 현삼과 토레니아 (Scrophulariaceae, Torenia hybrida) 유래의 플라본 합성 효소 유전자에 의한 플라본 및 팬지 (Viola x wittrockiana) 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 및 안토시아닌의 메틸기 전이 효소의 발현에 의한 말비딘을 함유시킴으로써 나타나는 코피그멘테이션 효과에 의하여 장미 (Rosa hybrida)의 꽃의 색상을 개변하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 코피그멘테이션 효과는 안토시아닌의 메틸기 전이 효소 유전자, 플라본 합성 효소 유전자 및 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소 유전자의 도입 전의 숙주와 비교하여 꽃의 색상을 파란 색 방향으로 변화시키는 효과인 것인 방법.
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