CN105349553B - 一种花色调节基因VwMYB29及其应用 - Google Patents

一种花色调节基因VwMYB29及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105349553B
CN105349553B CN201510951487.6A CN201510951487A CN105349553B CN 105349553 B CN105349553 B CN 105349553B CN 201510951487 A CN201510951487 A CN 201510951487A CN 105349553 B CN105349553 B CN 105349553B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vwmyb29
heartsease
gene
regulatory gene
anthocyanin regulatory
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510951487.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105349553A (zh
Inventor
王健
龚胜
孙海燕
张珂
曾媛
李婧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hainan University
Original Assignee
Hainan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hainan University filed Critical Hainan University
Priority to CN201510951487.6A priority Critical patent/CN105349553B/zh
Publication of CN105349553A publication Critical patent/CN105349553A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105349553B publication Critical patent/CN105349553B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种花色调节基因VwMYB29，该花色调节基因VwMYB29的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示；它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2中所示。还公开了该花色调节基因VwMYB29在调节植物尤其是三色堇和月季花色中的应用。该花色调节基因VwMYB29能与植物表达载体pBI221重组，制成重组植物表达载体pBI221‑VwMYB29，该重组植物表达载体pBI221‑VwMYB29经基因枪法转化三色堇和月季后，能促使三色堇花瓣无色细胞出现颜色，月季花瓣浅色细胞出现深红色斑点。因此，该VwMYB29基因能用于调节植物尤其是三色堇和月季的花色。

Description

一种花色调节基因VwMYB29及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种花色调节基因VwMYB29及其应用。
背景技术
MYB(Myoblastoma)是一类最早于1941年从动物成肌细胞瘤中分离出来的转录调控基因(Graf,1992)。而第一个从植物中分离得到的MYB基因是玉米的C1基因((Paz-Areset al.,1987)。随后又从多种植物中分离得到了功能各异的MYB基因(Waites et al.,1998；Miyake et al.,2003；Chen et al.,2006)。
Cone等(1986)从玉米(Zea mays)中克隆的第一个调节花色素合成的单一型MYB基因—C1基因，它主要特异性的调节糊粉层花色素的生物合成，而P1基因则负责玉米其他部位的花色素的合成。Kobayashi等(2002)以巨峰葡萄(Vitis labruscana)为材料，从中克隆出了VlMYBA基因，并利用粒子轰击基因瞬时表达技术将该类基因导入葡萄体细胞胚，从中诱导出红紫色斑点的产生，最后得出结论VlMYBA cDNA的导入诱导了UFGT基因的表达，从而产生色斑。谢吉容等(2008)利用SSH以及RACE-PCR方法，从月季红花突变体(Rose hybrida‘Yesterday Love’)中克隆出了含有1个MYB结构域的RhMYB基因。通过RT-PCR技术证明RhMYB基因与月季花色素合成酶基因CHS在红花上存在正相关关系，但其在以野生型为对照的试验中表达量很低，这说明RhMYB蛋白对月季红花突变体花青素合成存在正调控。Gao等(2011)利用从苹果(Malus×domestica)中克隆的MdMYB6基因，将其导入拟南芥，再通过Real-time PCR技术分析花色素生物合成途径中各基因的表达量，得出转基因拟南芥中CHS、FLS、CHI、UFGT、DFR等表达量都少于野生型拟南芥，从而得出MYB转录因子MdMYB6抑制了相关结构基因的表达，使得花色素合成途径中花青素的积累受阻。Zhang等(2009)将单一重复结构域的MYB基因AtCPC转入烟草，获得了全部或者部分抑制色素表达的类型，在部分抑制的类型里出现了中肋有色素的花斑类型，而这些转基因植株的NtDFR、NtANS和Nt3GT基因都受到了较强的抑制。Nakatsuka等(2012)从日本龙胆(Gentiana triflora)中得到了GtMYBP3和GtMYBP4基因，通过瞬时表达发现GtMYBP3和GtMYBP4基因能够加强类黄酮生物合成早期FNS II和F3’H基因启动子的活性，而且GtMYBP3还能强化CHS基因启动子的活性，再将GtMYBP3和GtMYBP4基因转化到烟草花瓣中，结果导致了烟草花瓣中花青素量降低，出现了白化的花瓣。Aharoni等(2001)将草莓中的FaMYB1转入烟草，结果发现FaMYB1基因的过表达降低了类黄酮生物合成途径中酶的活性，从而减少了花青素和黄酮醇的积累，使得花瓣着色受到影响。邵文婷(2013)利用同源克隆方法得到茄子中SmMYB基因，对其进行荧光半定量分析，结果发现SmMYB基因在紫茄果皮中的表达量显著高于紫茄其他组织及白茄各组织，再对紫茄进行遮光处理，发现果皮中花青素含量与SmMYB和SmDFR基因表达水平呈正相关，由此得出SmMYB基因正向调控茄子花青素合成的结论。温超(2012)利用基因枪法介导的瞬时表达技术，将αMYB导入到中国水仙的花瓣和副冠中，成功诱导出了红色的斑点，从而证明了外源转录因子αMYB对水仙的花色素苷代谢途径产生了影响，并诱导了结构基因的表达，使花瓣发生了颜色的变化。
综上所述，MYB转录因子通过与花色素生物合成途径中的结构基因发生特异性结合，从而在转录水平上激活或抑制结构基因的表达，控制花色素的生物合成，最终影响植物花色的形成。
但目前还未有人从三色堇中克隆得到的花色调节基因，并用于调节三色堇和月季花色方面的研究。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种花色调节基因VwMYB29及其编码的蛋白质和含有该基因的重组植物表达载体。
本发明的第二个目的是提供上述花色调节基因VwMYB29在调节三色堇和月季花色中的应用。
本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种花色调节基因VwMYB29，该花色调节基因VwMYB29的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示。
一种由上述花色调节基因VwMYB29编码的蛋白质，所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中所示。
本发明以三色堇花瓣为原料，提取其总RNA，再将mRNA逆转录成cDNA第一链，以该cDNA第一链为模板，根据VwMYB29的同源基因设计引物，利用RT-PCR和RECE的方法扩增拼接获得全长cDNA序列，该全长cDNA序列的长度是900bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2中下划线部分为其开放阅读框，开放阅读框长度为600bp，将此开放阅读框命名为花色调节基因VwMYB29，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，由该花色调节基因VwMYB29编码的蛋白的氨基酸序列具有199个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.3中所示，将该蛋白命名为VwMYB29蛋白，其中5'端非编码区120bp，3’端非编码区180bp，并包括一个11bp的poly(A)尾巴。
经数据库比对显示，MYB29有2个重复结构域(15～62，68～111)，为典型的R2R3-MYB转录因子。
一种含有上述VwMYB29基因的重组植物表达载体。
优选的，所述的重组植物表达载体中的植物表达载体为pBI221。
本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述VwMYB29基因在调节植物花色中的应用。
优选的，所述的植物为三色堇或月季。
本发明将VwMYB29基因与载体pBI 221正向相连后得到重组质粒pBI 221-MYB29(重组植物表达载体)，将该重组质粒经基因枪法转化三色堇和月季后，能促使三色堇花瓣无色细胞出现颜色，月季花瓣浅色细胞出现深红色斑点。因此，该VwMYB29基因能用于调节三色堇和月季的花色。
本发明的有益效果是：本发明中的花色调节基因VwMYB29基因具有诱导三色堇无色花瓣细胞产生颜色、月季花瓣浅色细胞出现深红色色斑的作用，显示该基因具有改变花色的作用，将来可用于三色堇、月季花色育种，培育出具备更深颜色的新品种。
附图说明
图1为实施例2中的重组质粒pBI 221-MYB29图谱；
图2是实施例2中的重组质粒pBI 221-MYB29的双酶切电泳图，其中M:DL2000Marker,1:pBI 221-MYB29，2：MYB29；
图3为实施例3中的经基因枪轰击后的三色堇和月季花的显微镜图，其中A图为三色堇，B图为月季，方框代表导入基因后花色出现的变化，说明该基因可改变花色。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 VwMYB29基因的获取
1、三色堇花瓣总RNA提取
三色堇花瓣总RNA的提取方法采用李琴等(2013)的改良Trizol法，获得的总RNA利用1.2％的琼脂糖电泳进行检测。
2、三色堇花瓣MYB基因的克隆
2.1三色堇MYB基因cDNA全长克隆引物设计
利用Primer Premier 5.0引物设计软件设计3'RACE、5'RACE、全长扩增引物(表1)。
表1三色堇MYB基因3'RACE、5'RACE、全长扩增引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
MYB29-3’RACE-Outer CAAAGTTCTGAAATGAGCCACG
MYB29-3’RACE-Inner GACCGCAAACGCATACCTCC
MYB29-5’RACE-Outer GCTTCTGCGTGTTTGATGTGC
MYB29-5’RACE-Inner GTCCTCCAATAGTTCTTTATCTCAT
2.2三色堇MYB基因的全长克隆
(1)MYB基因cDNA 3’末端快速扩增
以三色堇总RNA为模版，根据3'-Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase(TaKaRa)的使用说明书合成3'RACE的cDNA第一链，然后按照以下反应体系和反应条件对MYB29基因的3'末端进行套式PCR。
外聚合酶链反应Outer PCR
以逆转录获得的3'RACE cDNA第一链为模版，按表2配制反应液。
表2三色堇MYB基因3'末端Outer PCR反应体系
成份 体积(μL)
3'RACE cDNA 2
1×cDNA Dilution BufferⅡ 8
MYB29-3'RACE-Outer Primer(10μM) 2
3'RACE Outer Primer(10μM) 2
10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free) 4
Mgcl2(25mM) 3
TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.25
ddH2O 28.75
Total Volume 50
反应条件：
内聚合酶链反应Inner PCR
以第一次Outer PCR的反应产物为模版，按表3配制反应液。
表3三色堇MYB基因3'末端Inner PCR反应体系
成份 体积(μL)
Outer PCR产物 1
dNTP Mixture(2.5μM) 8
MYB29-3'RACE-Inner Primer(10μM) 2
3'RACE Inner Primer(10μM) 2
10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free) 5
Mgcl2(25mM) 5
TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.5
ddH2O 26.5
Total Volume 50
反应条件：
(2)MYB基因cDNA 5’末端快速扩增
以三色堇总RNA为模版，根据5'-Full RACE Kit with TAP(TaKaRa)的使用说明书合成5'RACE的cDNA第一链，然后按照如下体系(表6)对MYB8和MYB29进行5'末端的快速扩增。
外聚合酶链反应Outer PCR
以逆转录获得的5'RACE cDNA第一链为模版，按表4配制反应液。
表4三色堇MYB基因5'末端Outer PCR反应体系
成份 体积(μL)
5'RACE cDNA 2
1×cDNA Dilution BufferⅡ 8
MYB29-5'RACE-Outer Primer(10μLM) 2
5'RACE Outer Primer(10μLM) 2
10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free) 4
Mgcl2(25mM) 3
TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.25
ddH2O 28.75
Total Volume 50
反应条件：
内聚合酶链反应Inner PCR
以第一次Outer PCR的反应产物为模版，按表5配制反应液。
表5三色堇MYB基因5'末端Inner PCR反应体系
成份 体积(μL)
Outer PCR产物 1
dNTP Mixture(2.5μM) 8
10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+Free) 5
Mgcl2(25mM) 5
TaKaRa LA Taq(5U/μL) 0.5
MYB29-5'RACE-Inner Primer(10μM) 2
5'RACE Inner Primer(10μM) 2
ddH2O 26.5
Total Volume 50
反应条件：
(3)MYB基因全长扩增
在获得MYB基因完整3'末端和5'末端序列后，利用DNAMAN等软件进行序列拼接，从而得到全长序列，再根据获得的序列设计全长引物，按以下步骤进行全长扩增。
表6 MYB基因全长扩增反应体系
成份 体积(μL)
cDNA 1
2×Taq PCR MasterMix 25
10uM Forward Primer 1
10uM Reverse Primer 1
ddH2O 22
Total volume 50
反应条件：
2.4PCR产物目的片段回收
参照快捷型琼脂糖DNA回收试剂盒Ⅱ型(BioTeke)回收凝胶中的目的基因。
2.5PCR产物目的片段TA克隆
利用回收纯化的目的基因，用pMD18-T Vector进行TA克隆。
(1)用0.2mL离心管在冰上配制连接液，如表7；
表7连接反应体系
成份 体积(μL)
pMD18-T Vector(pMD18-T载体) 0.5
DNA 4.5
Solution(溶液) 5
Total volume(总体积) 10
(2)16℃连接4小时；
(3)将连接液加入至100μL的DH5α感受态细胞中，并在冰上放置半小时；
(4)42℃水浴45秒后放置冰上1分钟；
(5)加入890μLSOC培养基，37℃震荡培养1小时；
(6)轻微离心后，弃上清，在含X-gal，IP TG和AMP的LB培养基上，加入100μL菌液，涂匀后37℃培养16小时。
2.5PCR产物目的片段测序
待培养基上长出适量白点时即可进行菌落PCR检测。
(1)使用灭菌牙签挑选白色菌落于400～500μLLB液体培养基(含100μg/mL Amp)中，37℃震荡培养10-12小时，直至管底部出现沉淀为止；
(2)利用M13载体通用引物进行菌落PCR检测，反应体系见表8；
表8菌落PCR反应体系
成份 体积(μL)
菌液 1
2×Taq PCR MasterMix 5
10uM Forward Primer(10uM上游引物) 1
10uM Reverse Primer(10uM下游引物) 1
ddH2O 2
Total volume(总体积) 10
PCR扩增反应条件如下：
(3)PCR产物进行电泳检测，并将结果为阳性的菌液送往上海英潍捷基贸易有限
公司测序。
3、三色堇MYB基因生物信息学分析
在获得MYB基因序列后，利用NCBI中Blast在线分析软件进行两两序列比对，进而验证该序列是否为目的序列；通过ORF Finder在线软件分析基因的开放阅读框；
结果表明，MYB29基因cDNA全长为900bp，如SEQ ID NO：2中所示，SEQ ID NO：2中下划线部分为其开放阅读框，开放阅读框长度为600bp，如SEQ ID NO：1中所示，编码199个氨基酸，SEQ ID NO：3中所示，其中5'端非编码区120bp，3’端非编码区180bp，并包括一个11bp的poly(A)尾巴。
将三色堇MYB29的核苷酸序列进行Blast比对发现，该基因与其他植物的MYB基因一致性在76％以上，其中与大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)和矮牵牛(Petunia×hybrida)等的一致性分别为83％、82％和82％。
经数据库比对显示，MYB29有2个重复结构域(15～62，68～111)，为典型的R2R3-MYB转录因子；将三色堇MYB29氨基酸序列与其他植物MYB基因的氨基酸序列进行两序列比对，结果发现三色堇MYB29与其他植物的MYB氨基酸一致性在65％～73％之间，其中与可可的一致性最高，达73％。
实施例2重组质粒pBI 221-MYB29的构建
1、重组植物表达载体pBI 221-MYB29的构建
(1)PCR扩增
首先，根据MYB29开放阅读框两端序列设计引物，并在MYB29的上、下游引物分别加入Xba I(TCTAGA)、BamH I(GGATCC)酶切位点(表9)。
表9 MYB29酶切引物
引物名称 引物序列(5’-3’)
MYB29-Xba-F AAATCTAGAATGGACAAAAGACCGTGCATC
MYB29-BamH-R ATCGGATCCTTAATCACCGTTAAATTGCATG
其次，使用高保真的Taq聚合酶进行PCR扩增，反应体系和反应条件如下表10。
表10 PCR扩增反应体系和反应条件
成份 体积(μL)
10×Buffer(10×缓冲液) 2.5
2.5mM dNTP 2.0
10μM Forward Primer(10uM上游引物) 0.5
10μM Reverse Primer(10uM下游引物) 0.5
Start Taq(Taq酶) 0.2
cDNA 0.5
ddH2O 18.8
Total volume(总体积) 25
反应条件为94℃5min；94℃30s，57℃～60℃1min，72℃45s，35个循环；72℃10min。
(2)目的基因的回收、TA克隆和测序
同实施例1中的2.4～2.5。
(3)质粒提取
将含有目的基因的菌液和表达载体pBI221在LB液体培养基中于37℃振荡培养12～16小时，然后参照E.Z.N.A.Plasmid Mini KitⅡ(OMEGA)说明书进行质粒的提取，获得质粒后用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳检测其完整性。
(4)酶切反应
由于选用的限制性内切酶所使用缓冲液和酶切温度的不同，本实验采用单酶切反应，通过两次酶切将目的片段切开。
首先，进行第一次酶切反应，反应体系如下表11：
表11 MYB29和载体pBI221第一次酶切反应体系
成份 体积(μL)
质粒DNA(MYB29或pBI 221) 8(约为1μg)
10×Buffer(10×缓冲液) 10
BamH I 1
ddH2O 81
Total 100
30℃酶切过夜，取5μL样品电泳检测其是否酶切完全。将酶切完全的样品进行过柱回收。
其次，进行第二次酶切。反应体系如下表12：
表12 MYB29和载体pBI221第二次酶切反应体系
37℃酶切过夜，取5μL样品电泳检测其是否完全酶切。
最后，将完全酶切的产物进行电泳，并将目的基因的小片段和载体的大片段切胶回收。
(5)连接
将切胶回收的目的基因的小片段和载体的大片段通过T4DNA连接酶进行16℃连接过夜，再全部转化大肠杆菌，于LB固体培养基(Ampr)上培养过夜。连接体系如下表13：
表13 MYB29和pBI221连接反应体系
成份 体积(μL)
MYB29 3-4(0.3pmol)
pBI 221 1-5(0.03pmol)
10×T4DNA Ligase Buffer 1
T4Ligase 0.5
Total 10
(6)检测
挑选白色菌于LB培养基中37℃震荡培养过夜，利用表达载体特异性引物进行菌液PCR，挑选阳性菌液再扩大培养，提取重组质粒，双酶切再次检测，双酶切产物中获得了MYB29(600bp)、pBI 221(4530bp)的片段，由此可得知重组质粒构建成功(图2中所示)。重组质粒pBI 221-MYB29图谱如图1中所示。
实施例3 VwMYB29基因在调节三色堇和月季花色中的应用
基因枪法介导MYB基因的瞬时表达
1、植物材料的预培养
将三色堇花瓣非色斑区域切下，经75％酒精处理5秒后清水3次洗净，接于1/2MS+0.5％琼脂培养基中预培养5小时，粉红月季鲜插培养。
2、仪器部件的灭菌处理
基因枪的金属部件，如滤网、飞行膜座、钢膜压圈、钢膜底座等，可经121℃高压灭菌处理；其它塑料制品，如飞行膜、可破裂膜等，均在75％的酒精中消毒15分钟；超净工作台和工作室在喷洒了75％的酒精后紫外灭菌1小时。
3、制备微弹
(1)钨粉的清洗
称取60mg钨粉于1.5mL离心管中，加入1mL无水乙醇，用超声波清洗仪震荡至颗粒呈悬浮状，然后8000×g离心5秒，丢弃上清液。加1mL无水乙醇，漩涡振荡5分钟，静止1分钟后8000×g离心5秒，弃掉上清液。加入1mL蒸馏水，漩涡振荡1分钟后8000×g离心1分钟，弃掉上清(重复3次)。在沉淀的钨粉中加入50％甘油600μL，然后边振荡边分装，每管60μL。
(2)DNA微弹悬浮液的制作
取分装好的已清洗的钨粉，振荡使其成悬浮状，迅速加入10μL实施例2(6)中制备的重组质粒，振荡30秒，再边振荡边加入60μL CaCl2(2.5M)，振荡30秒，加入24μL亚精胺(0.1M)，漩涡振荡1分钟，冰上放置5分钟，8000×g离心5秒，弃上清。加入200μL 70％乙醇，吹打沉淀使之悬浮，3000rpm离心10秒，弃上清，加入200μL无水乙醇，此步不要破坏沉淀，静置1分钟后弃上清。加入60μL无水乙醇振荡，使其成为悬浮液。
5、涂膜
将飞行膜置于飞行膜座中，一边涡旋振荡微弹一边用移液器吸取上述制备好的10μL微弹悬浮液，并迅速涂布于飞行膜中心直径1cm位置处，涂抹均匀，待其干燥后即可使用。
6、基因枪轰击
本次粒子轰击采用的轰击参数为：压力为8MPa，距离为95mm，真空度为-0.08MPa。
(1)开启氮气阀门以及真空泵、基因枪电源开关；
(2)将不锈钢垫圈置于钢膜底座上，用钢膜压圈压于其上，飞行膜置于飞行膜座上，涂膜；
(3)调节好轰击距离与压力；
(4)将植物材料置于样品室中，并将其对准基因枪出口，关闭并密封好样品室；
(5)打开真空泵开关，开始降压，当压力降至-0.08Mpa时，关闭真空泵开关，停止降压；
(6)打开高压触发按钮，开始充氮气，当听到轰击声后松开按钮；
(7)按下真空释放按钮，使真空度恢复为初始状态；
(8)取出样品，丢弃飞行膜和可破裂膜，粒子轰击结束。
7、结果
将完成转化的三色堇花瓣转移至MS培养基中，月季插入水中，于长日照(16h/8h)、25℃条件下培养2天，然后在荧光显微镜下观察转化情况，并拍照记录。
将培养两天后的材料在显微镜下进行观察，结果如图3中所示，结果发现在三色堇无色斑区出现了类似色斑的斑块(A图)。这说明外源基因已经成功进入了三色堇花瓣中，并成功表达。未打进花瓣的钨粉或打进花瓣但未表达的钨粉就没有类似的色斑，而是表现为钨粉本身的颜色，呈现为黑点。而被转化的月季花瓣则出现了明显的红色斑点(B图)。因此，该基因可用用来调节三色堇、月季的花色。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种花色调节基因VwMYB29，其特征是：该花色调节基因VwMYB29的核苷酸序列如SEQID NO：1中所示。
2.一种由权利要求1所述的花色调节基因VwMYB29编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：3中所示。
3.一种含有权利要求1所述的花色调节基因VwMYB29的重组植物表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组植物表达载体，其特征是：所述的重组植物表达载体中的植物表达载体为pBI221。
5.权利要求1所述的花色调节基因VwMYB29在调节植物花色中的应用，其中所述的植物为三色堇和月季。
CN201510951487.6A 2015-12-17 2015-12-17 一种花色调节基因VwMYB29及其应用 Expired - Fee Related CN105349553B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510951487.6A CN105349553B (zh) 2015-12-17 2015-12-17 一种花色调节基因VwMYB29及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510951487.6A CN105349553B (zh) 2015-12-17 2015-12-17 一种花色调节基因VwMYB29及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105349553A CN105349553A (zh) 2016-02-24
CN105349553B true CN105349553B (zh) 2018-09-07

Family

ID=55325615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510951487.6A Expired - Fee Related CN105349553B (zh) 2015-12-17 2015-12-17 一种花色调节基因VwMYB29及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105349553B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108220301B (zh) * 2018-02-12 2021-01-15 浙江农林大学 月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用
CN108998563A (zh) * 2018-09-21 2018-12-14 南京农业大学 精确鉴定葡萄果皮颜色的引物及其应用
WO2021114156A1 (zh) * 2019-12-12 2021-06-17 中国农业科学院生物技术研究所 一种花瓣紫斑蛋白及其编码基因
CN114807160B (zh) * 2022-03-10 2023-11-14 上海师范大学 调控月季花瓣颜色的基因RcGT、蛋白、重组载体、重组转化体、应用和方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1836039A (zh) * 2003-08-13 2006-09-20 国际花卉开发有限公司 改变了花色的蔷薇的制造方法
CN101679972A (zh) * 2007-06-20 2010-03-24 国际花卉开发有限公司 含有黄酮及二甲花翠素的月季及其生产方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1836039A (zh) * 2003-08-13 2006-09-20 国际花卉开发有限公司 改变了花色的蔷薇的制造方法
CN101679972A (zh) * 2007-06-20 2010-03-24 国际花卉开发有限公司 含有黄酮及二甲花翠素的月季及其生产方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
accession no.JR666111;EBI;《EBI》;20141201;全文 *
三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析;龚胜 等;《西北农林科技大学学报（自然科学版）》;20150731;第43卷(第7期);133-142 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105349553A (zh) 2016-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Laxa Intron-mediated enhancement: a tool for heterologous gene expression in plants?
US11591605B2 (en) Plant genome editing method
US11518998B2 (en) Method for creating transformed plant
CN105349553B (zh) 一种花色调节基因VwMYB29及其应用
Li et al. The R2R3-MYB factor FhMYB5 from Freesia hybrida contributes to the regulation of anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis
BR102015009386A2 (pt) transformação do milho haplóide
US9587243B2 (en) Ubiquitin regulatory elements
Magne et al. Lotus japonicus NOOT‐BOP‐COCH‐LIKE 1 is essential for nodule, nectary, leaf and flower development
CN103820445B (zh) 一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用
US20100199377A1 (en) Ubiquitin regulatory nucleic acids, vectors, and methods of using same
CN100535118C (zh) 百草枯抗性基因及维管束和毛状体特异性启动子
US7897841B2 (en) Seed-preferred regulatory elements
KR20170140922A (ko) 식물의 내염성을 증가시키는 벼 유래의 OsSIRP1 유전자 및 이의 용도
ES2336550T3 (es) Elementos de regulacion favorables a la inflorescencia precoz y sus usos.
CN104975024B (zh) 植物花药特异表达启动子pTaASG042的鉴定和应用
JP2004535774A (ja) 遺伝子発現における使用に適した制御要素
JP4919305B2 (ja) 葉特異的発現活性を有するプロモーター
AU2003218155A2 (en) Early inflorescence-preferred regulatory elements and uses thereof
US7667023B2 (en) Promoter and vectors for plant transformation and methods of using same
Lazarowitz et al. Plant development from the cellular perspective: integrating the signals
JP4505628B2 (ja) 葉特異的発現活性を有するプロモーター
JP4474542B2 (ja) 構成的発現プロモーター
US8648230B2 (en) Regulatory regions preferentially expressing in non-pollen plant tissue
CN116925201A (zh) 西洋参PqEXLA2蛋白及其编码基因与应用
MXPA02004307A (es) Promotor de semilla seleccionada de cebada.

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180907

Termination date: 20181217

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee