CN108220301B

CN108220301B - 月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用

Info

Publication number: CN108220301B
Application number: CN201810144068.5A
Authority: CN
Inventors: 罗平; 崔永一; 陈雯; 李卓雅
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2018-02-12
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2038-02-12
Also published as: CN108220301A

Abstract

本发明公开了一种月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用。所述的DNA片段包含月季抗逆功能基因RcMYBPA1，其DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示，其对应的蛋白质的序列如SEQ ID NO:2所示。该基因片段能够提高植物原花青素含量并增强植物抗逆性。将该基因片段直接转化植物，使转基因植物的原花青素含量增加，增强植物耐胁迫能力。

Description

月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种月季基因片段的分离克隆、功能验证和应用。

背景技术

原花青素(Procyanidins，PAs)是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称。大量研究表明原花青素具有极强的抗氧化活性，其清除氧自由基的能力比常用的天然抗氧化剂强出许多，是VC的20倍，VE的50倍，是迄今为止发现的最有效的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂之一。原花青素的含量的增加可以在很大程度上提高植物抗逆性，包括生物胁迫和非生物胁迫。在非生物胁迫方面，原花青素可以大幅提高植物的抗氧化能力，消除光、热产生的自由基而起到光保护作用，使植物不受UV的伤害；缓解水分胁迫造成的膜脂过氧化来保护细胞膜和细胞壁。除非生物胁迫外，原花青素在避免生物入侵的防御机制中也举足轻重，它具有抵抗病菌入侵的作用，且对食草动物有拒食作用。

原花青素的生物活性还有很高的药用价值，据报道，从黑莓、葡萄、荔枝、茶和落叶松等提取的原花青素都具有不同程度抗氧化作用。自由基和氧化应激是导致众多心血管疾病的重要原因，原花青素可清除人体内自由基，且现代毒理学的急性毒性和长期毒性实验研究证明原花青素对生物无害，无不良影响，是一类可以安全应用的物质(陈会丛，2014)。动物实验和临床研究表明，原花青素的自由基清除作用有利于保持心脏功能，减少心肌缺血再灌注损伤；降低血液胆固醇水平，减少血管壁上的胆固醇沉积，抵抗动脉粥样硬化；降低肠道糖吸收及促进胰岛素释放，降低血糖；减少血小板黏附，保护血管内皮细胞，降低血液浓度，提高血管弹性，降低血压；减轻氧化应激伤害，并能改善人体微循环，通过这一系列作用，达到预防心血管疾病，保护心血管系统的目的。原花青素在抗肿瘤方面的功效国内外也已经有诸多报道，研究证实原花青素能在不同程度上抑制多种癌细胞的生长，对皮肤癌、口腔癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌等均有一定的预防或治疗作用。原花青素的抗癌机制，主要通过原花青素抗氧化活性、调节信号分子的表达、促进癌细胞凋亡、阻断细胞周期等来起作用。原花青素还具有抑菌、消炎、抗病毒、保护大脑功能、缓解帕金森病、抗紫外线、保护神经系统、治疗眼疾等功效。目前，原花青素作为营养强化剂、天然防腐剂、天然抗氧化剂、DNA保护剂等，被广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。

月季(Rosa chinensis‘Old Blush’)是蔷薇科蔷薇属多年生落叶丛生灌木，具有花期较长，花型秀美，花色丰富，花香馥郁等优点，素有“花中皇后”之美誉，是四大切花之首，在中国传统名花中评价也极高。月季不仅仅具有很高的观赏价值，也极具经济价值，其花瓣果实均含有丰富的原花青素，可以提取、分离纯化出原花青素。优化原花青素的提取工艺，使技术更加成熟、科学，使提取过程高效化、产业化，有利于提高产品的附加值，创造出更大的经济效益。合理开发利用月季中丰富的原花青素资源，结合原花青素的功能特性，可以研发出符合人们需要的生物防治剂、功能食品、保健食品、药品、化妆品等系列产品，其工业前景十分广阔。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种月季RcMYBPA1基因，该基因的DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述月季RcMYBPA1基因由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4从月季的花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。

本发明还提供了月季RcMYBPA1基因的蛋白编码序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了上述月季RcMYBPA1基因在提高植物原花青素合成方面的应用。

本发明还提供了上述月季RcMYBPA1基因在增强植物抗逆性方面的应用。

本发明的有益效果是，月季RcMYBPA1基因与植物原花青素合成有关。将该基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后直接转入一般植物体，转基因植株的原花青素含量显著增加，转基因植株的抗逆性能力明显增强。

附图说明

图1是本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s结构示意图；

图2是本发明的超量植物表达载体pCAMBIA2300s---RcMYBPA1构建示意图；

图3是RcMYBPA1基因在转基因植株中的表达量情况图；

图4是RcMYBPA1转基因植株原花青素含量检测柱状图；

图5是RcMYBPA1(OE6、OE9、OE13)转基因烟草与对照野生型烟草(WT)脱水率示意图；

图6是RcMYBPA1(OE6、OE9、OE13)转基因烟草与对照野生型烟草(WT)脱水表型及活性氧积累检测对比图；脱水后叶片表型对比一级氮蓝四唑(NBT)对超氧阴离子的染色；

图7是RcMYBPA1(OE6、OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理叶绿素测定柱状图；

图8是RcMYBPA1(OE6、OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下活性氧及过氧根离子检测对比图。

具体实施方式

本发明提供了月季中表达RcMYBPA1的基因编码序列及其功能，具体包括：RhMYBPA1基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体构建，以及转化此基因于烟草内，进行分子鉴定和表型观察。

本发明首先从月季中克隆出RcMYBPA1功能基因。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框为855bp，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。

本发明还提供了这种月季RcMYBPA1蛋白编码序列，它有284个氨基酸残基，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了用于调取获得月季样品中基因RcMYBPA1的一对核苷酸引物。该引物根据基因RcMYBPA1设计，使用该对引物对月季花瓣样品cDNA进行PCR扩增可获得855bp的基因片段。该引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物:5’ATGGGAAGGGCTCCTTGTT 3’(见序列表SEQ ID NO:3)

P2反向引物:5’TTAGATCAACAGTGATTCAGCAAAC 3’(见序列表SEQ ID NO:4)

本发明还提供了一对检测月季RcMYBPA1基因在转基因烟草中表达的核苷酸引物。该引物根据基因RcMYBPA1设计，使用此对引物对转化该基因的烟草样品cDNA进行RT-PCR扩增，检测该基因是否在转基因烟草中表达，可获得229bp的基因片段。该引物对的DNA序列为：

P3正向引物:5’CCTTGGTCTGATTTCAAAGAGGGTG 3’(见序列表SEQ ID NO:5)

P4反向引物:5’TCAACAGTGATTCAGCAAACGAGTC 3’(见序列表SEQ ID NO:6)

可利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，通过直接DNA转化、电导、农杆菌介导等常规生物技术方法将本发明提供的RcMYBPA1的编码基因导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。使用本发明的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前面可加上任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育抗逆性显著增强的植物种类。

本发明还提供了一种转基因烟草原花青素提取方法。准确称取0.4g叶片和花瓣，加入3mL提取液(丙酮︰水︰冰醋酸＝70︰29.5︰0.5，体积比)于水浴条件下35℃超声1h，期间每隔20min用旋转振荡器振荡2min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再分别用氯仿和正己烷抽提2次，然后用孔径0.45μm的尼龙微孔滤器过滤，保存于–40℃冰箱中，用于原花青素含量测定。

实施例1：分离克隆RcMYBPA1基因

本发明的前期对月季EST数据库(http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/rose_454/index.cgi)进行生物信息学分析，发现一个新的MYB类转录因子，命名为RcMYBPA1。设计特异引物P1(见序列表SEQ ID NO:3)正向引物5’ATGGGAAGGGCTCCTTGTT 3’和P2(见序列表SEQ ID NO:4)反向引物5’TTAGATCAACAGTGATTCAGCAAAC 3’，将测序序列的1-855bp从中国古老月季品种‘月月粉’花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来，扩增得到的片段如SEQ ID NO:1所示。其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

具体步骤为：

采用常用的CTAB法(参照：《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编)从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA，具体步骤如下：

1、向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(W/V)CTAB，NaCl1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·Cl 100mmol/L，2％(W/V)pvp)和10％

(V/V)的β-巯基乙醇，在水浴锅中预热。

2、将玫瑰花瓣用液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟。

3、加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃下12000g离心10min。4、取上清，重复步骤3。

5、取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，12000g，4℃离心15分钟，弃上清，用75％(V/V)乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。6、以从玫瑰品种‘丰花’中提取花瓣总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min。

7、根据转录测序中的序列设计的特异引物P1(见序列表SEQ ID NO:3)5’ATGGGAAGGGCTCCTTGTT 3’和P2(见序列表SEQ ID NO:4)5’TTAGATCAACAGTGATTCAGCAAAC3’，将RcMYBPA1从月季品种‘月月粉’花瓣RNA反转录得到的cDNA中扩增出来。

反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，37个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入

18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆被命名为

18-RcMYBPA1质粒。

实施例2：RcMYBPA1基因超量表达载体的构建，转化

如图2所示，为了能更好地阐明该基因的功能，申请人将其在烟草中超量表达，从转基因植株的表型来验证。具体步骤是：首先将实施例1中得到的阳性克隆

18-RcMYBPA1质粒用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，回收目的片段；同时，用同样的方法酶切携带双烟草花叶病毒启动子35S的遗传转化载体pCAMBIA2300s(该遗传转化载体来自湖北省武汉市华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。酶切完毕，用包含RcMYBPA1基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(图1)载体做连接反应，转化大肠杆菌DH5α(大肠杆菌菌株购自宝生物工程大连有限公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-RcMYBPA1。

通过农杆菌介导的烟草遗传转化方法将其导入到烟草NC89中，经过侵染、共培养、筛选同时具有卡那霉素抗性和潮霉素抗性的转化苗，再通过生根、练苗移栽等常规步骤，得到转基因植株。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄氨基嘌呤)；NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)；Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)；Hyg(Hygromycin，潮霉素)

(2)用于早花烟草遗传转化的培养基配方

表1列出了本发明的各种培养基的成分及其用量。

表1：早花烟草转化培养基设计

注：1/2MS，MS培养基的配制参见：Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15:473-497报道的方法。

表1中的Kan(Kanamycin，卡那霉素)、Cef(Cefotaxime，头孢霉素)，Hyg(Hygromycin，潮霉素)，采用0.45μm滤膜过滤方法灭菌，在上述除Kan、Hyg、Cef成分以外的培养基经常规121℃高压蒸汽灭菌20min后，待培养基冷却至50-60℃时，在超净工作台上加入。

(1)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)农杆菌的培养

首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上预培养农杆菌EHA105 48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L氯化钠+Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6。

2)叶盘转化法

a.剪取早花烟草无菌苗上部完全展开的幼嫩叶片，将叶片剪成0.8cm×0.8cm大小小块，放入无菌烧杯中；

b.将准备好的菌液倒入烧杯，轻轻摇晃烧杯。叶片在菌液中浸泡10min；

c.将步骤b中的叶片取出，转移至灭好菌的滤纸上吸干；然后放置在如上所述的共培养培养基上暗培养三天，培养温度为28℃；

d.三天后，将叶片转入如表1所述的出芽选择培养基上，光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性芽的筛选分化，培养温度为28℃；

e.抗性芽形成后，将其切下，转入如上所述的壮苗选择培养基上，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，进行Kan和Hyg抗性苗的筛选，培养温度为28℃；

f.将筛选得到的抗性苗转入如上所述的生根选择培养基上使其生根，在光照和暗培养交替(光照强度1000-1500lx，光照时间：16h/d，黑暗时间：8h/d)下培养，培养温度为28℃。

3)移栽

洗掉转基因早花烟草植株根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的一个周内保持水分湿润。

结果共获得15个株系的PCR检测结果为阳性的转入质粒pCAMBIA2300s-RcMYBPA1的T₀代转基因烟草。

实施例3：RcMYBPA1基因转基因T₀代在田间的表型观测与RT-PCR检测

为了验证RcMYBPA1是否已转入烟草及其表达情况，本发明采用了常用的RT-PCR方法对部分转基因烟草植株中RcMYBPA1基因表达进行了检测(结果见图3)。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因烟草1-6号株系中提取花的总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min，42℃50min，70℃10min。先用报道的看家基因EF1α对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，根据看家基因EF1α的序列设计一对引物P5(见序列表SEQ ID NO:7)正向引物(5-TGGTTGTGACTTTTGGTCCCA)和P6(见序列表SEQ ID NO:8)反向引物(5-ACAAACCCACGCTTGAGATCC)，进行PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，28个循环；72℃延伸10min。试验结果如图3所示，看家基因EF1α在野生型烟草和转基因烟草中均能扩出，并且亮度一致。然后，根据RcMYBPA1基因的序列，在靠近3’端设计一对引物P3(见序列表SEQ ID NO:5)正向引物(5-CCTTGGTCTGATTTCAAAGAGGGTG)和P4(见序列表SEQ ID NO:6)反向引物(5-TTAGATCAACAGTGATTCAGCAAAC)，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

试验结果表明，3株转基因烟草内均检测到有RcMYBPA1基因的表达，结果如图3所示。图3中显示：1-3：为转入质粒pCAMBIA2300s-RcMYBPA1的转基因烟草的RT-PCR扩增结果。4为没有转化的烟草的PCR扩增结果。

实施例4:转RcMYBPA1早花烟草原花青素的提取与测定

准确称取0.4g叶片，加入3mL提取液(丙酮︰水︰冰醋酸＝70︰29.5︰0.5，体积比)于水浴条件下35℃超声1h，期间每隔20min用旋转振荡器振荡2min。12000rpm离心10min，取上清至新的离心管中，再分别用氯仿和正己烷抽提2次，然后用孔径0.45μm的尼龙微孔滤器过滤，保存于–40℃冰箱中。使用NanoDrop2000C光谱系统进行定量分析，50μL中加入200μL对二甲氨基肉桂醛(DMACA；Sigma-Aldrich，MO，USA)(0.1％DMACA，90％reagent-gradeethanol，10％HCl)，在640nm下每隔1min测定一次，连续测定10min，取读数最大值，采用3次重复，取平均值。原花青素含量采用标准品(+)—儿茶素(Sigma-Aldrich，MO，USA)定量。

图4是RcMYBPA1转基因植株原花青素含量检测柱状图，其中，WT野生型烟草(作为转基因烟草的对照)，OE6、OE9和OE13为3个转基因株系。试验结果表明，3株转基因烟草内原花青素含量显著高于野生型烟草，说明RcMYBPA1对原花青素的合成具有增强效应。

实施例5:转RcMYBPA1烟草抗逆性测定

为了能更好地阐明该基因的功能，申请人选用，OE6，OE9和OE12用半定量RT-PCR鉴定为三个超表达系，选用这二个株系及野生型(WT)进行脱水及盐处理。具体步骤是：首先将每个系取30天大的转基因苗的同一部位叶片置于培养皿上自然脱水90分钟，对脱水前后未转化植株及三个转基因株系活性氧积累进行组织化学染色分析，分别采用二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑(NBT)对H₂O₂及O₂ ^-积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)；并测定最后一个时间点(脱水90分钟)的电导率以及丙二醛(MDA)含量；图5是RcMYBPA1(OE6、OE9、OE13)转基因烟草与对照野生型烟草(WT)脱水率示意图；取每个系约30天大的幼苗叶片自然脱水90分钟，每10分钟测定鲜重，以脱水前的材料为对照，计算失水率。同时，将生长约30d的烟草苗打成圆孔后浸入150mM盐溶液中，处理7d，对H₂O处理前后未转化植株及二个转基因株系活性氧积累进行组织化学染色分析，采用二氨基联苯胺(DAB)对H₂O₂积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)；并测定丙二醛(MDA)含量和叶绿素含量。图6是RcMYBPA1(OE6、OE9、OE13)转基因烟草与对照野生型烟草(WT)脱水表型及活性氧积累检测对比图；脱水后叶片表型对比一级氮蓝四唑(NBT)对超氧阴离子的染色。

(1)DAB和NBT组织化学染色分析步骤

对O₂ ^-的检测，叶片浸在1mg ml^-1NBT溶液中(PH7.8磷酸缓冲液)1-2h叶片有明显表型(叶片蓝色)。H₂O₂的检测，叶片浸在1mg ml^-1pH7.8磷酸缓冲液的DAB工作液中(pH7.8)，光下染色8个小时，等有明显表型进行脱色(褐色)，再用无水乙醇将叶片绿色完全脱除后，最后用清水洗。

(2)叶绿素含量的测定步骤

取一定量的叶片组织的样品研磨均匀后加入80％丙酮放入室温避光15min，粗提液离心，室温，10000g，20min，上清液(叶绿素色素提取液)用分紫外分光仪(Shimadzu UV-1600，Japan)在波长663，645和480nm测其吸光度。计算公式参考李合生植物生理生化学实验原理和技术第2版。

相对失水率反映了植物叶片的持水能力，是衡量抗旱的一个重要指标。失水率越高，则叶片的失水量越大，其对干旱环境的抗逆性越差。结果表明随着脱水时间的延长，叶片水分散失越来越多。但在90min时，转基因植株3个株系比WT的失水率要小，活性氧检测表明转基因植株积累较少的活性氧(染色较浅)，说明细胞受伤害比较小。表明转基因烟草耐脱水能力比野生型强。

图7是RcMYBPA1(OE6、OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理叶绿素测定柱状图；可见盐处理下，转基因植株叶绿素含量要显著高于野生型植株，说明转基因植株耐盐性增强；NBT结果表明其对照叶片的染色程度都较深，说明其体内的超氧阴离子含量较多，表明叶片在盐处理过程中，叶片受伤害程度加深，体内超氧阴离子含量增加；转基因的超氧阴离子含量较少，表明转RcMYBPA1基因株系的叶片受到的伤害较小。

我们将转基因和野生型苗的叶片在水处理和盐处理后分别进行DAB染色，图8是RcMYBPA1(OE6、OE9)转基因烟草与对照野生型烟草盐处理下活性氧及过氧根离子检测对比图。图8说明水处理的叶片染色较浅，转基因和野生型之间没有差异，但是盐处理后，转基因和野生型叶片的染色程度都加深，但是转基因植株颜色较对照浅，说明转基因的H2O2含量比野生型的低，表明了转基因株系耐盐性增强。

序列表

<110> 浙江农林大学

<120> 月季RcMYBPA1基因及其在提高植物原花青素合成和增强抗逆性上的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 月季(Rosa hybrida)

<400> 1

atgggaaggg ttccttgttg ttcaaaggtt ggtttgcaca gaggtccatg gactcccaga 60

gaggacacat tactcaccaa atatattgaa gctcatggtg aaggccattg gagatccttg 120

cccaaaaaag ccggcctcct taggtgtggg aagagttgca ggctaggatg gatgaactac 180

ctaaggccag atatcaagag aggaaacatt actccagacg aagatgacct aattatccga 240

ctgcattcac ttctcggaaa ccgctggtct ctcatcgccg gtagacttcc tggtcgaacc 300

gataacgaga tcaagaacta ctggaacacc catctcagca aaaggctcgt gagcgaagga 360

actgacccga acacgcacca aaaactatcc cagcctcctg cccccaagga aaacaagagg 420

aagaagaagc agaaccacaa agccaagaac aagaacaata ctgaagatcg catagtgccc 480

caaaagccta aggtccatct ccccaaaccc accagggtaa cttcctttgt taacctacca 540

agaaacgata gctttaccac ggctagcact gctgtgtctt ctagccagga tcaagttctg 600

gatcatgtta acaatattat tccttggtct gatttcaaag agggtggggt ggtgttctct 660

gttgttgatg ggtcgtcgtc ggatttcgag tgtgatcagt ctcgaataat ccttaatgtt 720

gtagctggtg atgatgatga ccacaatttg gaaaatattt acgaggaata tctgcaggcc 780

cttctgaaaa cgacagatca agatcagaac tgccaagttg agttagactc gtttgctgaa 840

tcactgttga tctaa 855

<210> 2

<211> 284

<212> PRT

<213> 月季(Rosa hybrida)

<400> 2

Met Gly Arg Val Pro Cys Cys Ser Lys Val Gly Leu His Arg Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Pro Arg Glu Asp Thr Leu Leu Thr Lys Tyr Ile Glu Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly His Trp Arg Ser Leu Pro Lys Lys Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Gly Trp Met Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Ile Thr Pro Asp Glu Asp Asp Leu Ile Ile Arg

65 70 75 80

Leu His Ser Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Val Ser Glu Gly Thr Asp Pro Asn Thr His Gln Lys

115 120 125

Leu Ser Gln Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asn Lys Arg Lys Lys Lys Gln

130 135 140

Asn His Lys Ala Lys Asn Lys Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ile Val Pro

145 150 155 160

Gln Lys Pro Lys Val His Leu Pro Lys Pro Thr Arg Val Thr Ser Phe

165 170 175

Val Asn Leu Pro Arg Asn Asp Ser Phe Thr Thr Ala Ser Thr Ala Val

180 185 190

Ser Ser Ser Gln Asp Gln Val Leu Asp His Val Asn Asn Ile Ile Pro

195 200 205

Trp Ser Asp Phe Lys Glu Gly Gly Val Val Phe Ser Val Val Asp Gly

210 215 220

Ser Ser Ser Asp Phe Glu Cys Asp Gln Ser Arg Ile Ile Leu Asn Val

225 230 235 240

Val Ala Gly Asp Asp Asp Asp His Asn Leu Glu Asn Ile Tyr Glu Glu

245 250 255

Tyr Leu Gln Ala Leu Leu Lys Thr Thr Asp Gln Asp Gln Asn Cys Gln

260 265 270

Val Glu Leu Asp Ser Phe Ala Glu Ser Leu Leu Ile

275 280

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

atgggaaggg ctccttgtt 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

ttagatcaac agtgattcag caaac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

ccttggtctg atttcaaaga gggtg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tcaacagtga ttcagcaaac gagtc 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

tggttgtgac ttttggtccc a 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

acaaacccac gcttgagatc c 21

Claims

1.一种月季RcMYBPA1基因，其特征在于，该基因的DNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述月季RcMYBPA1基因的蛋白编码序列，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种权利要求1所述月季RcMYBPA1基因在提高植物原花青素合成方面的应用。

4.一种权利要求1所述月季RcMYBPA1基因在增强植物抗逆性方面的应用，其中，抗逆性为抗旱和抗盐。