CN110066810B - 一种柽柳质膜Na+/H+ antiporter基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因及其应用，属于基因工程技术领域。该柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次从柽柳中克隆获得柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因，通过转化拟南芥、大豆、棉花和酵母，得到超表达柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的拟南芥、大豆、棉花和酵母，其耐盐性较未转化或转化大豆、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的更高，表明柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在提高植物或酵母耐盐性的应用中具有突出的效果，在提高植物或菌种耐盐性育种领域有重要应用价值。

Description

一种柽柳质膜Na+/H+ antiporter基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因及其应用。

背景技术

土壤盐渍化、荒漠化已成为导致全球可利用耕地日益减少和影响作物生长发育、限制产量及品质提高的主要非生物逆境因子之一，已构成限制现代农业生产与可持续发展的世界性难题之一。据不完全统计，全世界约占地球陆地总面积的7％为盐渍土，约22％的灌溉地正在遭到日益加剧的盐害的影响(Bhatnagar-Mathur et al.，2008)。生长环境中高浓度的盐会引起植物细胞渗透和离子胁迫、营养失衡和氧化损伤以及影响代谢过程，导致细胞生长受到抑制甚至死亡，进而影响植物的生长发育过程(Qadir et al.，2008)。NaCl是土壤中溶解性最强、含量最多的盐，也是造成植物或作物盐胁迫的主要原因。其中Na⁺不是大多数植物生长所必需的离子，过量的Na⁺在植物细胞内外积累会导致细胞内渗透势、离子和活性氧等方面的稳态失衡(Adem et al.，2014)。

在盐胁迫下，植物细胞往往通过阻止对Na⁺的吸收、促进Na⁺的外排或将Na⁺区隔化到液泡等手段来维持细胞内Na⁺稳态(Rajendran et al.，2009)。其中，盐胁迫下植物减轻Na⁺毒害的主要有效策略之一，是由质膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白(Na⁺/H⁺ antiporter)驱动的将Na⁺从细胞质转运出质膜或胞外。植物在盐胁迫下从细胞质中外排Na⁺的过程是一种耗能的主动转运，这种耗能的Na⁺转运过程是与质膜上H⁺-ATP酶的活性协调进行的，后者可形成跨质膜内外的H⁺电化学梯度作为Na⁺外流的驱动力，即质子驱动力。因此定位于植物细胞质膜上的Na⁺/H⁺ antiporter，其主要功能为介导细胞内Na⁺的外排，并控制Na⁺从根到地上部的长距离运输，对提高植物的耐盐性非常有利(Rozema and Schat 2013；Deinlein etal.，2014；Gu et al.，2018)。

就盐生植物而言，一般包括真盐生、泌盐生和假盐生植物三种类型(Ding et al.，2010)。与淡土植物相比，盐生植物在控制Na⁺在根部的吸收和外排，细胞液泡内的区隔化及其在不同器官、组织的分配等能力或效率方面均明显优于淡土植物。此外，盐生植物在形态上往往还具有独特的排盐或泌盐结构，比如盐腺、囊泡等(Munns and Tester 2008)。就泌盐盐生植物柽柳(Tamarix chinensis L.)而言，它隶属于柽柳科，在全世界分布约90种，在中国有18种1变种，在盐生荒漠植被类型中占有主要地位，研究表明其最高能在含盐量为3.5％(约600mM NaCl)的土壤中存活(张立宾等，2008)。迄今为止，国内、外对柽柳属植物耐盐性的研究多集中在其特殊形态结构-盐腺的发生及其泌盐机制上。到目前为止，已有40多种植物的质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因被克隆并对其生理功能进行了研究，包括淡土植物如水稻、番茄、菊花、陆地棉和大豆等，盐生植物如盐芥、藜麦、海马齿和海篷子等。这些植物Na⁺/H⁺ antiporter基因的表达水平在盐胁迫下均表现上调，其编码蛋白具有相似的结构及保守区域，并且该基因的过表达能够提高转基因植物或酵母的耐盐性。这不仅表明质膜Na⁺/H⁺antiporter基因广泛存在于植物界中，它对植物耐盐性的机理研究及其开发利用都有着非常重要的学术意义和实践价值，也提示我们盐生植物的质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因可能在其适应盐胁迫过程中较淡土植物发挥更加重要的作用。因此，从盐生植物中发掘耐盐基因，比如质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因，并研究其提高或改良其它植物或作物耐盐性的生理效应和分子机制，就具有更加重要的学术意义和实践应用价值。但是，目前关于盐生植物质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在耐盐性功能调控和植物基因工程改良方面的研究主要集中在部分真盐生植物上，有关该基因在泌盐盐生植物，比如柽柳中的研究很少，关于该基因对提高大豆、棉花、拟南芥等作物或植物以及酵母耐盐性的生理效应，经检索目前未见这方面的报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因，可用于在植物改良育种中，提高植物的耐盐性；本发明的另一目的是提供一种柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在植物基因工程中应用的方法，可有效增强各种植物和酵母菌的耐盐性。

技术方案：为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所。

所述柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

含有所述基因的重组载体、转基因细胞或重组菌。

一种利用柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因培育植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建所述柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的重组载体；

2)将所构建的柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的重组载体转化到植物或植物细胞中；

3)培育筛选得到的植物新品种。

所述柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在提高植物耐盐性育种中的应用。

所述柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在提高植物耐盐性育种中的应用，所述植物包括拟南芥、大豆、棉花。

一种采用柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因提高植物耐盐性的方法，包括以下步骤：

1)克隆柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因

2)构建柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的重组载体；

3)将所构建的柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的重组载体转化到植物细胞中；

4)耐盐筛选表达，提高植株耐盐性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1)本申请的柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因首次从泌盐盐生植物中克隆，通过软件DNAMAN6.0分析柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter蛋白的氨基酸序列与已报道的39种植物(其中11种盐生植物)质膜Na⁺/H⁺ antiporter蛋白的相似性，发现本申请的柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter蛋白与来自淡土植物的序列相似性范围为54.82％(中华大节竹)～72.06％(葡萄)，除了有些相似度更低的植物如条斑紫菜(15.64％)和小立碗藓(48.34％)。与盐生植物中该蛋白的相似性为60.22％～91.91％，其中与长叶红砂该蛋白序列相似性最高，为91.91％。

2)采用多种技术手段证实该基因可明显提高不同类型植物的耐盐性。

3)与其他植物种类相比，柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因在将来植物耐盐种质创新或作物新品种培育方面具有可优先利用的潜力和更好的应用前景。

附图说明

图1为盐胁迫对转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因拟南芥幼苗生长的影响图，图中：1.拟南芥野生型WT；2.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因WT；3.拟南芥突变体mutant；4.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因mutant；

图2为盐胁迫下转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因拟南芥幼苗地上部离子含量分析结果图，图中：1.拟南芥野生型WT；2.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因WT；3.拟南芥突变体mutant；4.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因mutant。A：Na⁺含量；B：K⁺含量；C：Na⁺/K⁺比值；

图3为盐胁迫下过表达大豆或柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆发根组合植株表型比较图，图中：1.转空载empty vector大豆；2.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆；

图4为盐胁迫下过表达大豆和柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆发根组合植株离子含量分析结果图，图中：1.转空载empty vector大豆；2.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因大豆。A：Na⁺含量；B：K⁺含量；C：Na⁺/K⁺比值；

图5为盐胁迫对过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因/沉默棉花质膜Na⁺/H⁺antiporter基因棉花幼苗生长影响图，图中：1.沉默棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因棉花幼苗；2.过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺ antipotter基因/沉默棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因棉花幼苗；

图6为盐胁迫下过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因/沉默棉花质膜Na⁺/H⁺antiporter基因棉花幼苗根、茎、叶中离子含量变化图，图中：A：Na⁺含量；B：K⁺含量；C：Na⁺/K⁺比值；

图7为盐胁迫下转柽柳或大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因对酵母突变体生长表型的影响图，图中：1.酵母野生型ena1；2.酵母突变体ena1nha1；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因突变体；4.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体

图8为盐胁迫下转柽柳、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因酵母突变体生长表型的变化图，图中：1.酵母野生型ena1；2.酵母突变体enalnha1；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因突变体；4.转棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体；5.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体；

图9为盐胁迫下转柽柳或大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因对酵母突变体离子含量的影响图，图中：1.酵母野生型ena1；2.酵母突变体ena1nha1；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因突变体；4.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体。A：Na⁺含量；B：K⁺含量；C：Na⁺/K⁺比值；

图10是盐胁迫下转柽柳、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因后酵母突变体细胞内离子含量变化结果图；注：1.酵母野生型ena1；2.酵母突变体ena1nha1；3.转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体；4.转棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体；5.转大豆质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因突变体。A：Na⁺含量；B：K⁺含量；C：Na⁺/K⁺比值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

方法：用同源重组法构建表达载体，对转基因拟南芥、大豆、棉花进行盐处理表型比较，分析柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因对盐胁迫下上述转基因植株生长的影响，使用火焰光度计测定Na⁺、K⁺的含量，并计算Na⁺/K⁺比。利用酵母回补，比较不同来源Na⁺/H⁺antiporter基因对酵母耐盐性贡献大小。统计分析测量结果，并应用SPSS软件Duncan检验分析柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因对植物耐盐性的影响。

实施例1：柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的克隆

提取多枝柽柳(来自新疆中国科学院吐鲁番沙漠植物园)的RNA，并以此为模板合成cDNA第一条链，根据多个物种Na⁺/H⁺ antiporter基因序列的比对结果，设计中间片段的引物，引物序列如下：

MS-F：5’-ATGAATGATGGGACNGCNAT-3’；

MS-R：5’-ANNGCACTTTCCTGCCANA-3’；

N：A/G/C/T。

按照Invitrogen公司的RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends说明方法，用Primer Premier5软件进行引物的设计。根据RACE结果确定基因的CDS区，并设计全长引物序列如下：

F：5’-ATGGCAGCGGTGTCCGAATT-3’；

R：5’-TCAAGAAGCATGACGGAAAGATAGC-3’。

用PrimeSTAR GXL DNAPolymerase进行克隆，将四次PCR反应的产物送到上海生工生物公司进行测序，将测序结果进行比对，确定了最终的序列，如SEQ ID NO.1所示，命名为柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因，其所表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

采用根癌农杆菌介导的浸花法将柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因分别转化到拟南芥WT和突变体mutant植株中，主要过程如下：

1、拟南芥过表达载体的构建

将实施例1中克隆出的柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter全长基因为模板，用PrimeSTARGXL DNA Polymerase进行克隆，体系如下(50μL)：10μL 5×PrimeSTAR GXL Buffer，4μLdNTP Mixture(2.5mM each)，1μL 1300-F，1μL 1300-R，1μL PrimeSTAR GXLDNAPolymerase，1μL模板质粒，ddH₂O补充至50μL。其中，

1300-F：

5’-GTACCCGGGGATCCTCTAGAATGGCAGCGGTGTCCGAATT-3’；

1300-R：

5’-ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATCAAGAAGCATGACGGAAAGATAGC-3’；

(2)PCR反应程序：98℃3min；98℃10s，60℃15s，68℃3min40s，30个循环；68℃10min；4℃保温

(3)载体质粒的提取

按照GENEray的质粒小量提取试剂盒对载体pCAMBIA1300大肠杆菌的质粒进行提取，具体方法按照试剂盒中的方法进行。

(4)质粒酶切

酶切体系按照TaKaRa的QuickCut^TM Kpn I配制。5μL 10×QuickCutBuffer，1μg质粒DNA，1μLQuickCutase，ddH₂O补充至50μL，37℃水浴锅反应1h。

(7)胶回收(目的片段及酶切产物)：从琼脂糖胶中切下和目的条带大小差不多的部分，放在离心管里备用(尽量用干净的刀片迅速切下)。根据胶块的重量加入适量的Binding Solution，将胶放到60℃的水浴锅里直到融化为止(将离心管轻柔的上下翻转5-6次帮助溶胶)。剩余胶回收过程应该按照GENEray购买的薄型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒中的说明书上的方法进行DNA片段的回收。

(8)连接体系(20μL)：目的基因5.1μL，酶切产物2.5μL，2×HieffCloneEnzyme 10μL，ddH₂O补充至50μL。

(9)大肠杆菌转化

1)将感受态细胞从-80℃冰箱中取出，冰上融化5min。将连接产物全部转入感受态细胞中，其中连接产物和感受态细胞体积比不得大于1∶5，并放置冰上30min。2)42℃水浴锅60s，迅速放入冰上放置2min。加入500μL LB培养基后，37℃，200rpm/min使菌复苏60min。3)将上述菌液涂布在含有Ampicillin的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h，培养时间长短根据菌落生长情况。用灭菌后的牙签挑取单菌落进行菌落PCR。

PCR程序为：94℃10min94℃1min，58℃1min，72℃3min40s，35个循环；72℃10min。

(10)将PCR鉴定成功的菌落进行测序验证，测序成功后保菌后续农杆菌转化用。

2、农杆菌GV3103转化

提取重组质粒，并将质粒通过热激法转化到农杆菌中，并且挑取阳性单菌落进行扩大培养，以备后续使用。

3、花序侵染法转化拟南芥植株

参照Clough(1998)的方法，对野生型(A.thaliana)和突变体(mutant)拟南芥进行侵染。主要过程为：

把转化成功含有pCAMBIA1300-柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的GV3101农杆菌接种到少量YEP中(含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素)，放到28℃摇床200rpm/min培养12-16h。将上述摇浓的菌液转至50mLYEP培养基中继续扩大培养至OD₆₀₀＝1.8。取少量1mL菌液于1.5mL离心管中，5000g离心10min。将离心管底部的菌体用转化介质进行重悬，重悬后的菌液浓度大概在OD₆₀₀＝1.0左右。将拟南芥已经受精或者已经将要结果荚的花剪掉，取少量重悬的菌液点在未受精的花上将用菌液侵染过的植株，用少量ddH₂O喷洒后，暗处培养24h。隔天进行第二次侵染直至无花开为止。

4、转基因植株的筛选及鉴定

(1)MS固体培养基中拟南芥的种植

准备：蓝色枪头、黄色枪头(用剪刀将枪头的尖端剪掉)、ddH₂O、1.5mL离心管，MS固体培养基于121℃灭菌锅中灭菌15min，乙醇和次氯酸钠。

将收取的种子取少量1.5mL离心管中，准备消毒(种子过多容易消毒不充分)。在超净工作台中用无菌水配制75％乙醇和10％次氯酸钠。向含有种子的离心管中加入800μL75％乙醇，并且计时2min。注意：不要使种子成团，压紧瓶盖，轻弹管壁，并且不停摇晃。将酒精吸干净，并且加入800μL10％次氯酸钠，计时8min，每隔两分钟上下摇晃并且轻弹管底。用无菌水清洗种子3-5次，然后用剪过的黄枪头吸取少量的种子，将种子点在含有50mg/L潮霉素B的MS培养基上。4℃春化2-4d后，转到培养室进行培养。萌发两周后，选取健壮根长的苗移到至装有1/2 Hogland营养液的塑料周转箱中进行培养。

(2)CTAB法提取植株的DNA

将CTAB溶液放到65℃水浴锅中预热，并取少量植物组织加入500μL CTAB研磨充分，并转入1.5mL离心管中。65℃水浴锅中放置1h-5h，放置时间可以调节，若放置的时间短，应该每隔几分钟就上下翻转离心管混匀。加入500μL氯仿-异戊醇，放到低速摇床中轻柔的震荡5min。将离心管从摇床中取出，放置5min，高速离心10min后取上清280μL。加入280μL预冷的异戊醇，翻转混匀，并且静置30min。高速离心，4min，弃上清，用75％乙醇洗两次。将剩余的酒精吹干，并加入50μL去离子水溶解。

(3)PCR鉴定阳性植株

设计鉴定引物序列如下：

F：5'-ATGGCAGCGGTGTCCGAATT-3’；

R：5’-TCAAGAAGCATGACGGAAAGATAGC-3’。

以上述所提取的DNA为模板进行PCR。

PCR程序为：94℃10min；94℃1min，58℃1min，72℃3min40s，35个循环；72℃10min。

(4)拟南芥T₃代纯合株系的筛选

通过上述平板抗生素筛选以及DNA水平的鉴定，筛选出T₁代阳性植株，并通过逐代筛选和鉴定获得T₃种子。通过在补充有40mg L^-1潮霉素B的MS培养基上发芽来选择转化体。通过PCR鉴定T₂植物的纯合系。拟南芥WT和突变体mutant及其转基因材料种子消毒后播于MS培养基中培养5d后，挑选长势一致的幼苗转移至含有蛭石的盆钵(置含1/2 Hoagland营养液的塑料周转箱)中培养4周后，然后对照组继续培养，处理组用含有150mM NaCl的1/2Hogland营养液培养7天，进行拍照及Na⁺、K⁺含量测定。如图1所示，上述4种拟南芥在NaCl处理下生长都较对照受到明显抑制，其中对突变体的影响程度最大，表现为植株尤其矮小，叶片萎蔫变黄；不过，WT和mutant在转入柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因后，在盐胁迫下植株的生长得以明显恢复，尤其是对mutant材料(图1)。与正常培养(对照)相比，盐处理后WT和mutant植株地上部Na⁺含量均显著上升，分别为对照的4.18和6.67倍，可见mutant升幅更大；WT和mutant在转入柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因后，盐胁迫下植株地上部Na⁺含量均显著下降，分别为对照的3.90和4.07倍，也可见转基因mutant材料降幅更大(图2A)。盐胁迫下4种拟南芥植株地上部K⁺含量都有不同程度的下降，但WT和mutant在转入柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因后，它们地上部K⁺含量较非转基因材料均有不同程度的恢复(图2B)。相应地，盐胁迫下4种拟南芥成年植株地上部Na⁺/K⁺比值的变化与Na⁺含量基本一致(图2C)。

实施例3：

采用发根农杆菌K599介导的过表达转化法分别对大豆幼苗进行柽柳和大豆的质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的转化，主要过程如下：

1、发根农杆菌的转化

(1)将农杆菌感受态从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化后加入实施例2中的重组质粒，轻弹管壁充分混匀，置于冰上30min。(2)将感受态放置在液氮中快速冷却90s，迅速转至37℃水浴中60s，再将其转入冰上放置5min。(3)向感受态中加入900μL LB液体培养基，28℃恒温摇床中200rpm培养2-4h。(4)取200μL菌液将其涂在含有卡纳抗生素的LB固态培养基上，28℃培养16h。(5)挑取单菌落，进行目的基因的菌落或菌液PCR验证。已成功鉴定的阳性菌斑在LB液体培养基中进行小摇，保菌以备后续的侵染转化。

2、大豆幼苗的培养

以Lee68为实验材料，种子用0.1％HgCl₂消毒10min，去离子水充分冲洗后浸种约6h，然后置于恒温箱内在暗中25℃催芽，选取发芽一致者播种于蛭石中，昼夜温度分别为25℃/18℃的条件下培养，第3d后，子叶顶出蛭石为最佳侵染实验材料。

3、农杆菌侵染幼苗

挑选大小一直的萌发幼苗，剪去大豆材料原有的主根，用上述转化的农杆菌OD值在0.8-1左右的菌液浸泡子叶节下胚轴伤口40-60min。

4、幼苗培养

将大豆幼苗扦插一定湿度的蛭石中，昼夜温度分别为28℃/20℃的条件下培养5d，伤口膨大形成愈伤，第10d，长出1cm左右的发根，再用1/2 Hoagland营养液炼苗5d，获得相应过表达发根组合植株及转空载植株。用含有120mM NaCl的1/2 Hoagland营养液处理7天后，进行表型观察、拍照及根、茎和叶中Na⁺、K⁺含量测定和Na⁺/K⁺比值比较。结果显示，与对照组相比，NaCl处理后各转化大豆植株(含转空载)的生长均受到明显抑制，但是过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因大豆植株在生长表型方面要优于过表达大豆该基因的转化植株(图3)。此外，盐胁迫下上述各大豆材料根、茎和叶中的Na⁺含量都显著升高，K⁺含量都降低，相应地各部位Na⁺/K⁺比值都显著上升。其中，过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因大豆组合植株各部位Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值的升幅及K⁺含量的降幅都相对较小(图4)。

实施例4：

联合采用发根农杆菌K599介导的过表达和TRV病毒介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)两种方法，获得沉默棉花质膜Na⁺/H⁺antiporter基因的棉花植株，以及过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因/沉默棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的棉花发根组合植株，主要过程如下：

1、棉花沉默载体的构建

按照实施例2中的载体构建方法，将棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因连接到载体pTRV2上。

2、农杆菌GV3103转化

根据实施例2中方法，将pTRV1，pTRV2-棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因和pCAMBIA1300-柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因提取重组质粒，并将质粒通过热激法转化到农杆菌中，并且挑取阳性单菌落进行扩大培养，备用。

3、组合植株的获得

将子叶完全展开后的棉花幼苗，用手术刀在棉花下胚轴处切掉原根，活化的转pCAMBIA1300-柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的发根农杆菌K599(以空pCAMBIA1300为对照)侵染棉花下胚轴30～50min，移栽至湿润蛭石里，保鲜膜覆盖保湿，继续在培养室生长至发根长出，提取根、叶的DNA鉴定阳性植株。取长势一致的转Vector和转柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因棉花发根组合植株，用1/2 Hoagland营养液培养。待苗长至两叶一心时，将1∶1混合的pTRV1和pTRV2-棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因根癌农杆菌GV3101的重悬液侵染上述转Vector和转柽柳质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因棉花发根组合植株的子叶，继续培养10d，获得沉默棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的棉花植株和过表达柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因/沉默棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的棉花发根组合植株。在盐胁迫(200mM NaCl，7d后)后，两种棉花幼苗的生长均受到明显抑制，部分真叶失水萎蔫，但后者受到的盐害症状相对较轻(图5)。此外，遭受盐胁迫后两种棉花幼苗根、茎、叶K⁺含量都较对照明显降低，Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值显著上升，但Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值的升幅都是后者显著小于前者(图6)。

实施例5：

以酵母野生型酵母ena1作为阳性对照，将柽柳、大豆、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺antiporter基因分别转化酵母突变体ena1nha1后，主要过程如下：

1、酵母表达载体的构建

按照实施例2中的载体构建方法，将柽柳、大豆、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺antiporter基因分别连接酵母表达载体pYES2。

2、酵母转化

将测序正确的重组质粒转化酵母菌株，通过LiAc法转化酵母。

(1)取100μL酵母感受态与10μL质粒(上述构建完成的质粒)和10μL Carrier DNA(水浴锅中煮沸5min后冰上放置)混合充分。(2)加入600μL PEG/LiAc重悬菌体，30℃放置30min。(3)加入70μL DMSO，颠倒混匀，42℃水浴锅15min，冰上急冷2min，12000rpm/min1min。(4)弃上清，100μL H₂O重悬，涂布在缺陷尿嘧啶的氨基酸培养基中(SD-Ura)。(5)将上述涂过菌液的平板放到30℃恒温培养箱中培养2-3d。对长出的单菌落进行PCR验证，验证成功后保菌后续试验用。

将转化成功酵母液体培养，以OD₅₅₀＝0.5为起始浓度，10倍梯度稀释，分别点在YPD(含1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)，YPG(含1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％半乳糖)，或精氨酸-磷酸盐培养基(AP培养基：10mM精氨酸，8mM H₃PO₄，2mM MgSO₄，0.2mM CaCl₂，2％葡萄糖，维生素和微量元素，pH为6.5)以及添加NaCl(130mM)和KCl(1mM)的精氨酸-磷酸盐培养基，30℃培养3天，观察生长表型并拍照记录。采用火焰分光光度计测定酵母细胞中Na⁺和K⁺的含量，并计算Na⁺/K⁺比值。结果显示：在盐胁迫下酵母突变体ena1nha1长势较差，分别转入柽柳、大豆、棉花或拟南芥质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的突变体菌株ena1nha1的生长都得到了明显的改善，都表现出良好的回补效应(图7，图8)。此外，盐胁迫下转化的各类酵母突变体细胞内K⁺含量明显提高，Na⁺含量和Na⁺/K⁺比值都显著下降，其中转泌盐盐生植物柽柳、耐盐性强的作物棉花质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因对酵母突变体的回补效应明显大于转耐盐性相对较弱的大豆或拟南芥质膜Na⁺/H⁺ antiporter基因的(图9，图10)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种柽柳质膜Na+/H+ antiporter基因及其应用

<130> 100

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3489

<212> DNA

<213> Tamarix chinensis L.

<400> 1

atggcagcgg tgtccgaatt gcagcttccg ctaaggttaa cggcggaggc tccgagtagc 60

agtgagacta cttctgaatc gaatccgaca gacgccgtca tcttcgtcgg agtaagcttg 120

gtattaggaa tcgcctgccg gcatctcctc cgtggtacta gagtaccgta tacagtcgcc 180

ttgcttgttc tcggcattgg tcttggatcg ttagagtatg gtacagacca tggtctggga 240

aggttaggag atggcattcg tctttgggag cgcatcgatc cagagctctt attggctgtg 300

tttcttcctg cactgctctt cgaaagttca cattcgatgg agattcacca aataaagaga 360

tgtatagtgc aaatgtttct gctagctggt ccaggtgttc taatatcaac cttctgtctt 420

ggagctgcta tgaagttgac tttcccatat gattggaatt ggaagacatc attgttgctt 480

ggtggacttc taagtgctac tgatcctgtg gctgttgttg ctcttttgaa agatcttggt 540

gcgagcaaga aactgagtac aataattgaa ggagaatcgt tgatgaatga tgggactgcc 600

attgtggtct atcagctatt ctatcaaatg gtacttggca aaacattcac ttgggttaaa 660

gttgtcaaat atttggtgca agtttctctt ggagctgtgg gaattggaat tgcatttgga 720

atagcttcgg tgttgtggat tgggtttata ttcaatgaca cagtcataga gattactttg 780

acacttgctg tgagctacgt agcgtacttc actgctcaag agggagctga tgtatctggt 840

gtattaacag tgatgacttt aggaatgttt tatgctgcat ttgctaggac ggcttttaag 900

agtgaaggcc aacatagttt gcatcatttt tgggaaatgg tagcatatat tgctaataca 960

ttaattttta tcttgagtgg tgctgtcata gctcaaggtg ttttaagcag tgatgatttg 1020

ttcaaaaacc atggttattc gtgggcttac ctgattcttc tttatgtata tcttcacatt 1080

tctcgggcta tagtagttgg tgtattgttt ccatttctaa ggcattttgg ctatggtttg 1140

gagtggaagg aagctattat tctgatatgg tctggtcttc gaggggctgt ggcattgtcc 1200

ctttcgttat cagtgaagag tgctagtggc acatcagctc tcctcacttc tgaaactgga 1260

actttgtttg tcttcttcac tggtggaatt gtattcttaa cgctgatagt caatgggtca 1320

actgtacaat ttgttttacg tatgttgggg atggatcgat tatctgctgc gaaaaggcgc 1380

attttggaat tcacaaagta tgaaatgtta aataaggcat tagaagcatt tggtgatttg 1440

ggagaagatg aagaactagg acctgctgac tggcctactg tcaaaagata tattaaatcg 1500

ttggatgatg ttgaagggga acgtgtgcat cctcatgatg cttctggatc tgatgctgat 1560

ctggatccta tgggcttgaa agatatacgt gtgcggattt taaacggtgt tcaagctgct 1620

tattggacta tgcttgatga aggaaggata acacaaagta ctgcaaatat tttaatgcta 1680

tcagttgatg aagcactaga ctccgtgggt catgaaccat tgtgtgattg gaatggttta 1740

aagtctaatg ttcattttcc aagttattac cgatttcttc agtctagcat atgtccaaga 1800

aaactggtta cctttttcac tgttgagaga ttagagtctg cgtgttacat atgtgcagcc 1860

ttcttacgtg ctcacagact tgcgcgccaa caactgcatg aattcatagg tgacagtgaa 1920

attgcttgta tggtcattaa agaaagcgag acagaaggag aagaagcaag aaagttcttg 1980

gaagatgttc gtatgacatt tccacaggtt ttacgtgttg tcaagacgag gcaagtaaca 2040

cactcagtgt taaaacattt aattgattat gttgagaatc ttgagaaggt tggattactg 2100

gaagagaaag aaatgcttca tctccatgat gctgtccaga gggacttaaa gaaggtacta 2160

cgtaatccac ctttagtgaa gatcccaaaa ataggggata tgattaccat tcatcctttg 2220

cttggggctc ttccttctgc agctcgtgag ctgcttgtgg gttccagcaa agaaataatg 2280

aaattacgtg gtgtgacact ttacaaagaa ggttctaaac caaatggtat atggctcata 2340

tcaagtggag tggtgaagtg gacaagcaag agtgtatcta gcaaacttgc atttcaccca 2400

acatttactc acggaagtac tgtgggttta tatgaagtac tggttgggaa gccttatatt 2460

tctgatatgg tcacagattc tgtggttctt tgcttctttg ttgatgctga caaaatagtc 2520

tctgtcctga gatctgatcc tgatgtggag ggatttttct ggcaggaaag tgctattgta 2580

cttgcaaaaa tgttggttcc acaagtattt cagaagatgc ctatgccaga gctcagagca 2640

cttgttgctg aaaggtccac tatgagcata tacataaggg gtgaaacagt agaggtccct 2700

catcattcca ttggcattct cctggaagga tttgtaaaaa gtcacggtct tcatcaagaa 2760

atgattacag caccagcagc actgtggtct tccaaaggga atgcaagttt cctaagccaa 2820

gaaggagctg ggttaagatc aacagccagc ttttatcatc aagcggcatc atactatgtc 2880

gaagccagag ctagagtaat catctttgat atggcagcat ttgaagcaga aaatgttctc 2940

cagaggcggc catcctcact ggttctgcat ccggatcaat ctgctaagtc ccttagtagg 3000

gaatttggtg gtcttatgag ttggcctgag cattacttca aggctgcacc acaggatcct 3060

caccttgggg ataagaatga acatccaaac aatctgtccg caaaagctat gcagcttagc 3120

atctatggta gcatggtgcc cagggtccca tcacgtcgtg ggaatttcca gcagatagtg 3180

caaataaaac catcacatag cctttcatat ccttcagtgc cattaggtga tcaggaacgt 3240

ccccttgttt ctgtgagatc agaaggatcc acaaggaata gacttgaaga ggaattggca 3300

agatcggatc ttgcaccacc gtcacacagt aggcacccaa gtatatcaca cagtaggcat 3360

ccaagtgtat cacacagtag gcaccaaagt gtcgtgaaag atgaatcaag tgacgaatca 3420

ggtggtgaag aggatgtcat tgtgcgcatt gattcaccga gcaggctatc tttccgtcat 3480

gcttcttga 3489

<210> 2

<211> 1162

<212> PRT

<213> Tamarix chinensis L.

<400> 2

Met Ala Ala Val Ser Glu Leu Gln Leu Pro Leu Arg Leu Thr Ala Glu

1 5 10 15

Ala Pro Ser Ser Ser Glu Thr Thr Ser Glu Ser Asn Pro Thr Asp Ala

20 25 30

Val Ile Phe Val Gly Val Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Cys Arg His

35 40 45

Leu Leu Arg Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Val Leu

50 55 60

Gly Ile Gly Leu Gly Ser Leu Glu Tyr Gly Thr Asp His Gly Leu Gly

65 70 75 80

Arg Leu Gly Asp Gly Ile Arg Leu Trp Glu Arg Ile Asp Pro Glu Leu

85 90 95

Leu Leu Ala Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ser His Ser

100 105 110

Met Glu Ile His Gln Ile Lys Arg Cys Ile Val Gln Met Phe Leu Leu

115 120 125

Ala Gly Pro Gly Val Leu Ile Ser Thr Phe Cys Leu Gly Ala Ala Met

130 135 140

Lys Leu Thr Phe Pro Tyr Asp Trp Asn Trp Lys Thr Ser Leu Leu Leu

145 150 155 160

Gly Gly Leu Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu

165 170 175

Lys Asp Leu Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Ile Ile Glu Gly Glu

180 185 190

Ser Leu Met Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Gln Leu Phe Tyr

195 200 205

Gln Met Val Leu Gly Lys Thr Phe Thr Trp Val Lys Val Val Lys Tyr

210 215 220

Leu Val Gln Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Phe Gly

225 230 235 240

Ile Ala Ser Val Leu Trp Ile Gly Phe Ile Phe Asn Asp Thr Val Ile

245 250 255

Glu Ile Thr Leu Thr Leu Ala Val Ser Tyr Val Ala Tyr Phe Thr Ala

260 265 270

Gln Glu Gly Ala Asp Val Ser Gly Val Leu Thr Val Met Thr Leu Gly

275 280 285

Met Phe Tyr Ala Ala Phe Ala Arg Thr Ala Phe Lys Ser Glu Gly Gln

290 295 300

His Ser Leu His His Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr

305 310 315 320

Leu Ile Phe Ile Leu Ser Gly Ala Val Ile Ala Gln Gly Val Leu Ser

325 330 335

Ser Asp Asp Leu Phe Lys Asn His Gly Tyr Ser Trp Ala Tyr Leu Ile

340 345 350

Leu Leu Tyr Val Tyr Leu His Ile Ser Arg Ala Ile Val Val Gly Val

355 360 365

Leu Phe Pro Phe Leu Arg His Phe Gly Tyr Gly Leu Glu Trp Lys Glu

370 375 380

Ala Ile Ile Leu Ile Trp Ser Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser

385 390 395 400

Leu Ser Leu Ser Val Lys Ser Ala Ser Gly Thr Ser Ala Leu Leu Thr

405 410 415

Ser Glu Thr Gly Thr Leu Phe Val Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe

420 425 430

Leu Thr Leu Ile Val Asn Gly Ser Thr Val Gln Phe Val Leu Arg Met

435 440 445

Leu Gly Met Asp Arg Leu Ser Ala Ala Lys Arg Arg Ile Leu Glu Phe

450 455 460

Thr Lys Tyr Glu Met Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ala Phe Gly Asp Leu

465 470 475 480

Gly Glu Asp Glu Glu Leu Gly Pro Ala Asp Trp Pro Thr Val Lys Arg

485 490 495

Tyr Ile Lys Ser Leu Asp Asp Val Glu Gly Glu Arg Val His Pro His

500 505 510

Asp Ala Ser Gly Ser Asp Ala Asp Leu Asp Pro Met Gly Leu Lys Asp

515 520 525

Ile Arg Val Arg Ile Leu Asn Gly Val Gln Ala Ala Tyr Trp Thr Met

530 535 540

Leu Asp Glu Gly Arg Ile Thr Gln Ser Thr Ala Asn Ile Leu Met Leu

545 550 555 560

Ser Val Asp Glu Ala Leu Asp Ser Val Gly His Glu Pro Leu Cys Asp

565 570 575

Trp Asn Gly Leu Lys Ser Asn Val His Phe Pro Ser Tyr Tyr Arg Phe

580 585 590

Leu Gln Ser Ser Ile Cys Pro Arg Lys Leu Val Thr Phe Phe Thr Val

595 600 605

Glu Arg Leu Glu Ser Ala Cys Tyr Ile Cys Ala Ala Phe Leu Arg Ala

610 615 620

His Arg Leu Ala Arg Gln Gln Leu His Glu Phe Ile Gly Asp Ser Glu

625 630 635 640

Ile Ala Cys Met Val Ile Lys Glu Ser Glu Thr Glu Gly Glu Glu Ala

645 650 655

Arg Lys Phe Leu Glu Asp Val Arg Met Thr Phe Pro Gln Val Leu Arg

660 665 670

Val Val Lys Thr Arg Gln Val Thr His Ser Val Leu Lys His Leu Ile

675 680 685

Asp Tyr Val Glu Asn Leu Glu Lys Val Gly Leu Leu Glu Glu Lys Glu

690 695 700

Met Leu His Leu His Asp Ala Val Gln Arg Asp Leu Lys Lys Val Leu

705 710 715 720

Arg Asn Pro Pro Leu Val Lys Ile Pro Lys Ile Gly Asp Met Ile Thr

725 730 735

Ile His Pro Leu Leu Gly Ala Leu Pro Ser Ala Ala Arg Glu Leu Leu

740 745 750

Val Gly Ser Ser Lys Glu Ile Met Lys Leu Arg Gly Val Thr Leu Tyr

755 760 765

Lys Glu Gly Ser Lys Pro Asn Gly Ile Trp Leu Ile Ser Ser Gly Val

770 775 780

Val Lys Trp Thr Ser Lys Ser Val Ser Ser Lys Leu Ala Phe His Pro

785 790 795 800

Thr Phe Thr His Gly Ser Thr Val Gly Leu Tyr Glu Val Leu Val Gly

805 810 815

Lys Pro Tyr Ile Ser Asp Met Val Thr Asp Ser Val Val Leu Cys Phe

820 825 830

Phe Val Asp Ala Asp Lys Ile Val Ser Val Leu Arg Ser Asp Pro Asp

835 840 845

Val Glu Gly Phe Phe Trp Gln Glu Ser Ala Ile Val Leu Ala Lys Met

850 855 860

Leu Val Pro Gln Val Phe Gln Lys Met Pro Met Pro Glu Leu Arg Ala

865 870 875 880

Leu Val Ala Glu Arg Ser Thr Met Ser Ile Tyr Ile Arg Gly Glu Thr

885 890 895

Val Glu Val Pro His His Ser Ile Gly Ile Leu Leu Glu Gly Phe Val

900 905 910

Lys Ser His Gly Leu His Gln Glu Met Ile Thr Ala Pro Ala Ala Leu

915 920 925

Trp Ser Ser Lys Gly Asn Ala Ser Phe Leu Ser Gln Glu Gly Ala Gly

930 935 940

Leu Arg Ser Thr Ala Ser Phe Tyr His Gln Ala Ala Ser Tyr Tyr Val

945 950 955 960

Glu Ala Arg Ala Arg Val Ile Ile Phe Asp Met Ala Ala Phe Glu Ala

965 970 975

Glu Asn Val Leu Gln Arg Arg Pro Ser Ser Leu Val Leu His Pro Asp

980 985 990

Gln Ser Ala Lys Ser Leu Ser Arg Glu Phe Gly Gly Leu Met Ser Trp

995 1000 1005

Pro Glu His Tyr Phe Lys Ala Ala Pro Gln Asp Pro His Leu Gly Asp

1010 1015 1020

Lys Asn Glu His Pro Asn Asn Leu Ser Ala Lys Ala Met Gln Leu Ser

1025 1030 1035 1040

Ile Tyr Gly Ser Met Val Pro Arg Val Pro Ser Arg Arg Gly Asn Phe

1045 1050 1055

Gln Gln Ile Val Gln Ile Lys Pro Ser His Ser Leu Ser Tyr Pro Ser

1060 1065 1070

Val Pro Leu Gly Asp Gln Glu Arg Pro Leu Val Ser Val Arg Ser Glu

1075 1080 1085

Gly Ser Thr Arg Asn Arg Leu Glu Glu Glu Leu Ala Arg Ser Asp Leu

1090 1095 1100

Ala Pro Pro Ser His Ser Arg His Pro Ser Ile Ser His Ser Arg His

1105 1110 1115 1120

Pro Ser Val Ser His Ser Arg His Gln Ser Val Val Lys Asp Glu Ser

1125 1130 1135

Ser Asp Glu Ser Gly Gly Glu Glu Asp Val Ile Val Arg Ile Asp Ser

1140 1145 1150

Pro Ser Arg Leu Ser Phe Arg His Ala Ser

1155 1160

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> MS -F引物序列(Artificial)

<400> 3

atgaatgatg ggacngcnat 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> MS -R引物序列(Artificial)

<400> 4

anngcacttt cctgccana 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> F引物序列(Artificial)

<400> 5

atggcagcgg tgtccgaatt 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> R引物序列(Artificial)

<400> 6

tcaagaagca tgacggaaag atagc 25

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 1300-F引物序列(Artificial)

<400> 7

gtacccgggg atcctctaga atggcagcgg tgtccgaatt 40

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 1300-R引物序列(Artificial)

<400> 8

atgcctgcag gtcgactcta gatcaagaag catgacggaa agatagc 47

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> F（阳性植株）引物序列(Artificial)

<400> 9

atggcagcgg tgtccgaatt 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> R（阳性植株）引物序列(Artificial)

<400> 10

tcaagaagca tgacggaaag atagc 25

Claims (6)

1.一种柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因，其核苷酸序列如SEQ ID No .1所示。

2.权利要求1所述柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo .2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因在提高植物耐盐性育种中的应用。

5.如权利要求4所述柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因在提高植物耐盐性育种中的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥、大豆、棉花。

6.一种采用柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因提高植物耐盐性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)克隆柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因；

2)构建柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因的重组载体；

3)将所构建的柽柳质膜Na⁺/H⁺antiporter基因的重组载体转化到植物细胞中；

4)耐盐筛选表达，提高植株耐盐性。

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