CN1836039A - 改变了花色的蔷薇的制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蔷薇的制造方法，其特征为人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’－羟化酶的基因。

Description

改变了花色的蔷薇的制造方法

技术领域

本发明涉及具有新型花色的蔷薇(包含通称玫瑰及月季)的制造方法。具体地说，本发明涉及蔷薇的制造方法，其通过人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码还原双氢杨梅树皮素(dihydromyricetin)的二氢黄酮醇(dihydroflavonol)还原酶的基因。

背景技术

花瓣的功能在于吸引昆虫·鸟类等传送花粉的传粉媒介(pollinator)，所以花的颜色、形状、图案及香味是与传粉媒介共同进化的【本田利夫等，现代化学，5月号，25-32(1998)】。其结果，很少有一个种的花拥有所有的颜色，例如蔷薇、香石竹中无紫色到蓝色的品种，菖蒲、龙胆中无鲜红色的品种。花色是花卉鉴赏中最重要的性状，所以古往今来各种颜色的花都是通过杂交进行育种。特别是玫瑰被称为花中女王，且因其市场价值高，所以在全世界均进行杂交。

例如，在无黄色品种的蔷薇中杂交西亚原产的黄玫瑰(Rosafoetida)，育成了现在的黄色蔷薇。但是，由于花的颜色由植物本身所具有的遗传性确定，所以通过有限的可利用基因源进行杂交育种，可实现的花色是有限的(Tanaka et al.Plant Cell Physiol.39 1119-1126，1998、Mol et al.Curr.Opinion Biotechnol.10，198-201 1999)。其中育成蓝色蔷薇一直是不可能的代名词，可与亚瑟王的圣杯匹敌(大场英章《蔷薇的诞生》1997中公新书，铃木正彦《植物生物工程的魔法蓝色蔷薇不再是梦》1990讲谈社BLUE BACKS，最相叶月《蓝蔷薇》2001小学馆)。

现在，虽然存在被称为“蓝色蔷薇”的品种，但一般是指“藤色系”的蔷薇。由杂交进行的“蓝色蔷薇”的品种改良最早是于1945年育出的带有浅紫色的灰色的“Gray Pearl”。之后，又于1957年育出了浅紫粉色的“Staring Silver”，并由这些品种作为杂交亲本育出了“BlueMoon”(1964年育出)和“Madame Violet”(1981年育出)等大量的藤色系蔷薇。而且，还利用这些藤色系蔷薇等进一步反复育种，育出了“青龙”(1992年育出)、“Blue Heaven”(2002年育出)等的淡灰色系蔷薇，并作为新型的“蓝色蔷薇”为人瞩目。

但是上述花的颜色实际上不是蓝色，而只停留于带有灰色的模糊的粉色，不论长年来如何努力进行育种，可称为“蓝色”的蔷薇仍不存在。在园艺界，一般用英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC：The RoyalHorticultural Society Colour Chart)把紫色到蓝色的系列称为“蓝色”的较多。本发明的目的是创出具有英国皇家园艺学会色谱标准所示的紫色系、紫蓝色系或蓝色系花色的蔷薇。

花的颜色主要来源于花色素苷、类胡萝卜素及甜菜拉因(betalain)的3种化合物，但控制蓝色的是最大吸收波长幅度最大(丛橘黄色到蓝色)的花色素苷。花色素苷是类黄酮的一种，以图1所示的代谢途径进行生物合成。花色素苷通常于上皮细胞的液泡中局部存在。花色素苷的色调(即花色)很大程度上依赖于花色素苷的构造，B环的羟基数越多越呈现蓝色。B环的羟化由类黄酮3’-羟化酶(F3′H)及类黄酮3’，5’-羟化酶(F3′5′H)催化。F3′H和F3′5′H无活性时合成花葵素(橙色到红色)，F3′H有活性时合成花青素(红色到鲜红色)，F3′5′H有活性时合成花翠素(紫色)。

这些花色素被糖或酰基修饰，形成各种各样的花色素苷。一般地，修饰的芳香族酰基越多，花色素苷越蓝。花色素苷因液泡的pH、共存的黄酮醇、黄酮及金属离子等，颜色会有很大变化(齐藤规夫蛋白质核酸酵素47 202-209 2002，Broullard and Dangles，In the flavonoids：Advances in Research since 1986(Ed by Harborne)Capmann and Hall，London pp565-588，Tanaka et al.Plant Cell Physiol.39 1119-1126，1998、Mol et al，Trends in Plant Science 3，212-217 1998，Mol etal.Curr.Opinion Biotechnol.10，198-201 1999)。

蔷薇花瓣中的花色素苷是花葵素和花青素及甲基花青素的衍生物，不存在花翠素的衍生物(Biolley and May，J.Experimental Botany，44，1725-1734 1993，Mikanagi Y，Saito N，Yokoi M and TatsuzawaF(2000)Biochem Systematics Ecol.28：887-902)。这是没有蓝色蔷薇的最大的原因。现在的蔷薇由可杂交的蔷薇的近缘种(R.multiflora，R.chinensis，R.gigantean，R.moschata，R.gallica，R.whichuraiana，R.foetida等]杂交育出的。

尽管在杂交上付出很多努力，却未育出蓝色蔷薇的原因是蔷薇的近缘种中无制造花翠素的能力。为在花瓣中制造花翠素，如上所述F3′5′H需在花瓣中表达，但在蔷薇及蔷薇近缘种的花瓣中F3′5′H却不表达。因此，通过杂交使花翠素在花瓣中积累而获得蓝色蔷薇是不可能的。并且，已知蔷薇花瓣中含有微量的蓝色色素Rosa Cyanin，其化学结构虽已被确定(日本特开2002-201372号公报)，但还没有通过增加RosaCyanin育出蓝色蔷薇的报道，也没有关于Rosa Cyanin的生物合成途径及与其有关的酶或基因的论述。

另外，有以生物制造蓝色或紫色色素的实例，蓼蓝制造靛蓝(例如Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb；60(6)：720-5)，微生物生产紫色杆菌素(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000 Oct；2(4)：513-9、Org.Lett.，Vol.3，No.13，2001，1981-1984)，并有关于这些物质来源于色氨酸及其生物合成途径的见解。

其他，虽已知由栀子果实中的环烯醚萜类化合物产生蓝色色素(S.Fujikawa，Y.Fukui，K.Koga，T.Iwashita，H.Komura，K.Nomoto，(1987)Structure of genipocyanin G1，a spontaneous reactionproduct between genipin and glycine.Tetrahedron Lett.28(40)，4699-700、S.Fujikawa，Y.Fukui，K.Koga，J.Kumada，(1987)Brilliant skyblue pigment formation from gardenia fruits.J.Ferment.Technol.65(4)，419-24)及来源于苔藓的甘菊蓝(Azulene)(和光纯药工业株式会社)等，但却没有使其在植物花瓣中表达从而使花色变蓝的报道。

人们曾期待如能把在其他植物中表达的F3′5′H基因导入蔷薇中并使其在花瓣中表达，即可育出蓝色蔷薇(最相叶月《蓝蔷薇》2001小学馆)。F3′5′H基因可从矮牵牛、龙胆、洋桔梗等许多植物中获得(Holton et al.Nature 366，276-279，1993，Tanaka et al.Plant CellPhysiol.37，711-716 1996，WO93/18155)。且还有关于蔷薇转化系统的报道(例如Firoozababy et al.Bio/Technology 12：883-888(1994)，US 5480789、US 5792927、EP 536 327 A1、US 20010007157 A1)。

而且，实际上已有把矮牵牛的F3′5′H基因导入蔷薇的报道(WO93/18155、WO94/28140)。

但尚未获得蓝色蔷薇，为获得蓝色蔷薇，需设法改变适用于蔷薇花色的色素的代谢。

同时，将F3′5′H基因导入不产生花翠素而产生花葵素的红色香石竹中时，虽在确认了花葵素的同时，也确认了有花翠素的积累，但花色只停留在略带紫色的红色(WO94/28140)。其结果显示出，只有F3′5′H基因的表达还不能得到“蓝色”的香石竹，还需抑制合成香石竹的内源性花葵素的代谢过程。

为避免与香石竹的内源性代谢途径[由二氢黄酮醇还原酶(DFR)还原香橙素(dihydrokaempferol)(DHK)]的竞争，从白色香石竹中选择缺少DFR的品种。在此香石竹中导入F3′5′H和矮牵牛DFR[不能还原DHK，能有效还原双氢杨梅树皮素(dihydromyricetin)(DHM)]的基因。其结果，获得了花翠素含量基本达100％，花色也变成以往香石竹中没有的蓝紫色的重组香石竹，实例为(蛋白质核酸酵素，Vol.47，No.3，p228，2002)。所以，为在香石竹中实现蓝色花，不仅需要通过F3′5′H基因的表达积累花翠素，还需更多的研究。

从多种植物中已克隆出DFR(矮牵牛、烟草、蔷薇、蓝猪耳、金鱼草、非洲菊、惠兰、大麦、玉米等)(Meyer et al.Nature 330，677-678，1987，Helariutta et al.Plant Mol.Biol.22 183-193 1993，Tanakaet al.Plant Cell Physiol.36，1023-1031，Johnson et al.PlantJ.19，81-85，1999)。对于DFR基因，因植物种的不同，底物专一性也不同，矮牵牛、烟草、惠兰的DFR基因不能还原DHK，矮牵牛的DFR基因在二氢黄酮醇中还原DHM最有效(Forkmann et al.Z.Naturforsch.42c，1146-1148，1987，Johnson et al.Plant J.19，81-85，1999)。但还没有使上述DFR基因在蔷薇中表达的例子。

如上所述，避免与内源性代谢途径或酶和来源于外源基因的酶例如F3′5′H竞争的方法，可为在欠缺某一基因的品种中导入基因。并且，人为抑制目的基因表达的方法，虽可通过同源重组等使目的基因缺失，但因同源重组的频率低，可适用的植物种也受到限制，所以未达到实用化(例如，Nat Biotechnol 2002、20：1030-4)。)

转录水平上的抑制方法可利用转录靶基因mRNA的反义RNA的反义法(van der Krol et al.Nature 333，866-869，1988)，转录与靶基因mRNA相同的RNA的正义(共抑制法cosuppression)法(Napoli etal.Plant Cell 2，279-289，1990)，转录对应于靶基因mRNA的双链RNA的方法(RNAi法、Waterhouse et al.Pro.Natl.Acd.Sci.USA95，13959-13964 1998)。

关于上述3种方法，已有很多成功例。在蔷薇中，虽有在花色素苷的合成中，通过所需查耳酮合酶(CHS)基因的共抑制法，使花色从红色变成粉色的报道(Gutterson HortScience 30：964-966 1995)，但此时CHS的抑制不完全，未达到完全抑制花色素苷的合成以得到白花系。

专利文献1  日本特开2002-201372号公报

专利文献2  WO93/18155

专利文献3  USP 5480789

专利文献4  USP 5792927

专利文献5  EP 536 327 A1

专利文献6  US 20010007157 A1

专利文献7  WO94/28140

非专利文献1 本田利夫等现代化学5月号25-32(1998)

非专利文献2 Tanaka et al.Plant Cell Physiol.39 1119-1126，1998

非专利文献3  Mol et al.Curr.Opinion Biotechnol.10，198-201 1999

非专利文献4  大场英章《蔷薇的诞生》1997中公新书

非专利文献5  铃木正彦《植物生物工程的魔法蓝色蔷薇不再是梦》1990讲谈社BLUE BACKS

非专利文献6  最相叶月《蓝蔷薇》2001小学馆

非专利文献7  齐藤规夫蛋白质核酸酵素47 202-209 2002

非专利文献8  Broullard et al.In the flavonoids：Advancesin Research since 1986(Ed byHarborne)Capmann and Hall，Londonpp565-588

非专利文献9  Tanaka et al.Plant Cell Physiol.39 1119-1126，1998

非专利文献10  Mol et al，Trends in Plant Science 3，212-2171998

非专利文献11  Mol et al.Curr.Opinion Biotechnol.10，198-201 1999

非专利文献12  Biolley and May，J.Experimental Botany，44，1725-1734 1993

非专利文献13  Mikanagi Y，et al.(2000)Biochem SystematicsEcol.28：887-902

非专利文献14  Appl Microbiol Biotechnol 2003Feb；60(6)：720-5

非专利文献15  J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2000 Oct；2(4)：513-9

非专利文献16  Org.Lett.，Vol.3，No.13，2001，1981-1984

非专利文献17  S.Fujikawa，et al.(1987)Tetrahedron Lett.28(40)，4699-700

非专利文献18  S.Fujikawa，et al.(1987)J.Ferment.Technol.65(4)，419-24

非专利文献19  Holton et al.Nature 366，276-279，1993

非专利文献20  Tanaka et al.Plant Cell Physiol.37，711-7161996

非专利文献21  Firoozababy et al.Bio/Technology 12：883-888(1994)

非专利文献22  蛋白质核酸酵素，Vol.47，No.3，p228，2002

非专利文献23  Meyer et al.Nature 330，677-678，1987

非专利文献24  Helariutta et al.Plant Mol.Biol.22 183-1931993

非专利文献25  Tanaka et al.Plant Cell Physiol.36，1023-1031

非专利文献26  Johnson et al.Plant J.19，81-85，1999

非专利文献27  Forkmann et al.Z.Naturforsch.42c，1146-1148，1987

非专利文献28  Nat Biotechnol 2002、20：1030-4

非专利文献29  van der Krol et al.Nature 333，866-869，1988

非专利文献30  Napoli et al.Plant Cell 2，279-289，1990

非专利文献31  Waterhouse et al.Pro.Natl.Acd.Sci.USA 95，13959-13964 1998

非专利文献32  Gutterson HortScience 30：964-966 1995

非专利文献33  铃木省三，《蔷薇、花图谱》，小学馆，p.256-260，1990

发明内容

如上所述，通过将F3′5′H基因导入蔷薇，使其在花瓣中表达，可改变蔷薇的花色。在香石竹中，通过在缺少DFR的品种中表达F3′5′H基因和矮牵牛DFR基因，可育出蓝紫色香石竹。但至今还未创出“蓝色蔷薇”。所以，本发明欲提供开蓝色花的蔷薇。

因此，本发明提供(1)蔷薇的制造方法，其以人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因为特征。

本发明还提供(2)蔷薇的制造方法，其以人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码二氢黄酮醇还原酶的基因为特征。

本发明又提供(3)蔷薇的制造方法，其以人为抑制蔷薇的内源性二氢黄酮醇还原酶的表达，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码来源于蔷薇以外的二氢黄酮醇还原酶的基因为特征。

本发明进一步提供(4)蔷薇的制造方法，其以人为抑制蔷薇的内源性类黄酮3’-羟化酶的表达，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因为特征。

上述编码三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因是指例如序列号：1或序列号：3记载的基因。并且，上述编码二氢黄酮醇还原酶的基因优选来源于鸢尾、赛亚麻(Nierembergia)、矮牵牛、惠兰、龙胆、洋桔梗的基因。

本发明还提供(5)通过上述(1)～(4)中任一项所述的制造方法得到的蔷薇或与其具有相同特性的其后代或其组织。

本发明又提供(6)通过上述(1)～(4)中任一项的制造方法得到的蔷薇花瓣的颜色为紫色、蓝紫色或蓝色的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织。

本发明还提供蔷薇花瓣的颜色属于英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)的紫色系、紫蓝色系或蓝色系，且如上述(6)所述的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织，。

本发明又进一步提供蔷薇花瓣的花色属于英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)紫色系的85a或85b，且如上述(7)所述的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织。

附图说明

图1  表示类黄酮的生物合成途径。

CHS：查耳酮合酶、CHI：查耳酮异构酶、

FNS：黄酮合成酶、F3H：二氢黄酮3-羟化酶、

F3′H：类黄酮3’-羟化酶、

F3′5′H：类黄酮3’5’-羟化酶、FLS：黄酮醇合成酶、

DFR：二氢黄酮醇4-还原酶、

ANS：花色素合成酶、AS：呋喃酮合成酶、

C2′GT：查耳酮2’糖苷化酶

图2表示质粒pBERD1的结构。

图3表示质粒pBPDBP2的结构。

图4表示质粒pBPDBP8的结构。

图5表示质粒pSPB461的结构。

图6表示质粒pSPB472的结构。

图7表示质粒pSPB130的结构。

图8表示质粒pSPB919的结构。

图9表示质粒pSPB920的结构。

图10表示质粒pSPB1106的结构。

具体实施方式

蔷薇中即使产生花葵素花色也不变蓝的理由有几点。经酰基或糖的修饰，花色素苷的稳定性、溶解度和颜色发生变化。即由于芳香族酰基的附加颜色会变蓝。另外，称为黄酮醇、黄酮的助色素与花色素苷形成复合体时，颜色会变蓝，最大吸收波长向长波长移动，吸光度也增加。花色素苷的颜色也随pH值而变化。pH值低时变红，接近中性时变蓝，所以花色依赖于局部存在花色素苷的液泡的pH值。并且，因与Al³⁺、Mg²⁺等金属离子共存而形成的金属复合物也对花色起重要的影响。试行错误和锐意研究的结果，在此提出了提高花瓣中花翠素比例的方案。

首先，用与育出蓝紫色香石竹同样的手法试育蓝色蔷薇。即尝试解析了白色蔷薇的112个品种，鉴定了DFR欠缺株，但与香石竹不同的是，未获得完全的DFR欠缺系统。这大概是因为香石竹是2倍体，而通常栽培的蔷薇是4倍体，所以获得单一的基因欠缺株很困难。

其次，在花色为白色的品种坦尼克(Tineke)中导入三色堇的F3′5′H基因和矮牵牛DFR基因时，虽确认了花翠素的积累，但量极少，未达到蓝色蔷薇的程度。

本发明中，使用基因工程的方法人为抑制属于蔷薇的内源性类黄酮合成途径的酶DFR基因，且通过使三色堇的F3′5′H基因表达，再通过使还原双氢杨梅树皮素的DFR基因表达，以使花翠素含有率约占花瓣中含有的总花色素的80％-100％，可获得蓝色蔷薇。

还原双氢杨梅树皮素的DFR基因，在此使用鸢尾(鸢尾科)、赛亚麻(茄科)、矮牵牛(茄科)，但其他作为还原双氢杨梅树皮素的DFR基因的起源还可例举为烟草(茄科)、仙客来(报春花科)、飞燕草(毛茛科)、惠兰(兰科)、龙胆(龙胆科)、洋桔梗(龙胆科)等不积累花葵素的植物(Forkmann 1991 Plant Breeding 106 1-26 Johnson等、Plant J.1999 19 81-85)。本发明中使用的DFR基因优选优先还原双氢杨梅树皮素的基因。

并且本发明中，使用基因工程的方法人为抑制属于蔷薇的内源性类黄酮合成途径的酶类黄酮3’-羟化酶(F3′H)的基因，且通过使三色堇的F3′5′H基因表达，使花翠素含有率约占花瓣中含有的总花色素的80％-100％，从而可获得蓝色蔷薇。

由本发明获得的蔷薇具有至今为止还不存在的花色，通过本发明，可提供不仅属于英国皇家园艺学会色谱标准的红色深红色系(REDPURPLE GROUP)、深红色系(PURPLE GROUP)、深红紫色系(PURPLE VIOLETGROUP)，还有属于紫色系(VIOLET GROUP)、紫蓝色系(VIOLET BLUEGROUP)、蓝色系(BLUE GROUP)花色的蔷薇。

实施例

以下根据实施例，详细叙述本发明。分子生物学的方法无特殊要求时均依据Molecular Cloning(Sambrook and Russell，2001，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

实施例1.花色测定方法

花瓣色彩的分析使用分光测色仪CM2022[美能达(MINOLTA)株式会社、日本]10度视觉、D65光源测定，通过色彩管理软件SpectraMagic[美能达(MINOLTA)株式会社、日本]进行分析。另外，英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)的编号是以使用目测判定及上述机器测定所得到的色度值(CIE L*a*b*色度系统)为基础，用色彩分类系统Version2.1.1[株式会社日本综合研究所(日本)、日本特开2002-016935号公报]进行近似色对照。通过使用此系统，能客观地选择近似的RHSCC编号。

用此方法测定以往所谓的“蓝色蔷薇”品种花瓣的色度，求出在RHSCC中的近似色时，Blue Moon和Madame Violet为186d(GREYED-PURPLE GROUP)，Lavande为186c(GREYED-PURPLE GROUP)，青龙为189d(GREYED-GREEN GROUP)，Blue Heaven为198d(GREYED-GREEN GROUP)。因此，这些品种虽被称为蓝色蔷薇，但其RHSCC编号的分类属灰色系，并无本发明所指的目标蓝色。

实施例2.类黄酮的分析

1)花瓣色素的提取

将冷冻干燥的花瓣0.5g置于含有4ml 0.1％TFA的50％乙腈(CH₃CN)中，经20分钟超声波提取，再用0.45μm的过滤器过滤。此提取液的花色素苷的高效液相色谱法(HPLC)分析条件如下。色谱柱使用RSpakDE-413L(4.6mmφ×25cm、昭工株式会社)，流速为0.6ml/min，流动相为含有0.5％三氟乙酸(TFA)的CH₃CN/H₂O，10％～50％的直线浓度梯度15分钟后，用含有0.5％TFA的50％CH₃CN/H₂O进行10分钟的等度(isocratic)洗脱。检测使用光电二极管阵列(PHOTODIODE ARRAY)检测器SPD-M10A(岛津制作所)，检测600-250nm的波长范围，并由520nm吸光度的面积求出各花色素苷的比例。

2)花色素的分析

将上述滤液0.2ml放入玻璃试管中减压干固，并溶解于0.2ml的6N盐酸(HCl)中，进行100℃、20分钟水解。分解后的花色素用0.2ml的1-戊醇提取，并用HPLC按以下条件下分析有机层。色谱柱使用ODS-A312(6mmφ×15cm、YMC株式会社)，流动相中使用CH₃COOH∶CH₃OH∶H₂O＝15∶20∶65的溶液，以流速1ml/min洗脱。

检测使用光电二极管阵列(PHOTODIODE ARRAY)检测器SPD-M10A(岛津制作所)，测定600-400nm的光谱，用最大吸收波长(λmax)及保留时间(R.T.)鉴定后，用520nm吸光度的面积定量。此HPLC条件下的花翠素及花青素的保留时间和λmax为4.0分钟、5.2分钟及534nm、525nm。鉴定、定量以从funakoshi株式会社购入的花翠素盐酸盐及花青素盐酸盐作为标准品使用。

3)黄酮醇的分析

将花瓣提取液0.2ml置于1.5ml的离心管(Eppendorf tube)中减压干固后，溶于pH值为4.5的0.2ml的0.1M磷酸钾缓冲液(KPB)中，加入6单位(unit)β-葡萄糖苷酶(新日本化学株式会社)和1unit的柚苷酶(naringinase)(Sigma Chemical Co.，MO，USA)，保持30℃、16小时。反应后，将0.2ml的90％CH₃CN添加入酶反应液中，结束反应。将此液用0.45μm过滤器过滤后，以下述条件进行HPLC分析。

色谱柱使用Develosil C30-UG-5(4.6mmφ×15cm、野村化学株式会社)，流速为0.6ml/min，流动相为含有0.1％TFA的CH₃CN/H₂O，18％～63％的直线浓度梯度10分钟后，用含有0.1％TFA的63％CH₃CN/H₂O进行10分钟等度(isocratic)洗脱。检测使用光电二极管阵列检测器SPD-M10A，检测400-250nm的波长范围。此条件下的山奈黄素与槲皮素的R.T.和λmax分别为11.6分钟、365nm以及10.3分钟、370nm。定量用A330nm的面积进行，使用funakoshi株式会社山奈黄素与槲皮素作为标准品。

实施例3.DH值的测定

将于-80℃、1小时或1小时以上冷冻的蔷薇花瓣约2g用均质机进行挤压，得到榨汁液。将其用连接微小电极6069-10C(崛场制作所)的pH值测定计(F-22、崛场制作所)测定pH值。

实施例4.蔷薇的转化

关于蔷薇的转化已报导了许多方法，(例如Firoozababy et al.Bio/Technology 12：883-888(1994)、US 5480789、US 5792927、EP 536327 A1、US 20010007157 A1)，依照这些方法可进行转化。具体地说，是在根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株(Lazo et al.Bio/Technology 9：963-967，1991)的菌液中，把从无菌苗叶片诱导出的蔷薇的愈伤组织浸入5分钟，用灭菌滤纸吸去多余的菌液后，移植到继代培养基，进行2日的黑暗共培养。

之后，用加入了400mg/L羧苄青霉素的MS液体培养基洗净后，移植到到继代培养基中加入了50mg/L卡那霉素和200mg/L羧苄青霉素的选拔·除菌培养基中。在选拔培养基上，将生长未受阻碍、正常增殖的部分进行反复移植和培养，以选出卡那霉素抗性愈伤组织。将显示出卡那霉素抗性的转化愈伤组织置于添加了50mg/L卡那霉素和200mg/L羧苄青霉素的再分化培养基中培养，以得到卡那霉素抗性芽(shoot)。

所得芽在

1/2MS培养基中发根后，进行驯化。驯化转化体上盆后，放入封闭式温室中栽培使其开花。

实施例5.蔷薇类黄酮基因的获得

将来源于蔷薇品种红衣主教(Kardinal)花瓣的cDNA文库以矮牵牛的DFR基因(于WO96/36716中记载)为探针进行筛选，获得蔷薇的DFR cDNA，作为pCGP645。详细内容已有报道(Tanaka et al.Plant CellPhysiol.36，1023-1031 1995)。

同样，将相同文库用矮牵牛的查耳酮合酶-A(CHS-A)基因(Koes etal.Gene(1989)81，245-257)与金鱼草的花色素合成酶(ANS)基因(Martin et al.Plant J，(1991)1，37-49)，通过以公知的方法(Tanakaet al.Plant Cell Physiol.36，1023-1031 1995)进行筛选，获得蔷薇的查耳酮合酶(CHS)及花色素合成酶(ANS)的同源基因，分别作为pCGP634和pCGP1375。蔷薇的CHS碱基序列表示于序列表·序列号：5，蔷薇的ANS碱基序列表示于序列表·序列号：6中。

实施例6.白色蔷薇的筛选

为使用基因重组的方法育出蓝色品种，并为避免内源性花色素苷合成途径与导入基因(具体地说为F3′5′H基因)的竞争，需挑选只缺少DFR基因的品种，并在其品种中导入来源于矮牵牛的DFR基因和F3′5′H基因即可(WO96/36716)。

白色蔷薇的品种有很多，从中寻找只缺少DFR基因，而其他的花色素苷生物合成酶基因正常表达的品种。花色变白的原因是与花色素苷生物合成有关的结构基因的变异或缺失，及控制与花色素苷生物合成有关的结构基因转录的转录调节因子的缺失。在此，根据WO96/36716，寻找DFR基因的mRNA缺失的蔷薇。

首先根据实施例1中所述的方法，主要分析白色蔷薇112系统中花瓣的类黄酮组成，选择类黄酮高积累的品系。之后，测定花瓣榨汁的pH值，将pH值相对高的品种80系统作为第一候选。

其次，从上述品种的花瓣中提取RNA。RNA的提取根据公知的方法(Tanaka et al.Plant Cell Physiol.36，1023-1031 1995)进行。使用所得到的RNA检测了有无与蔷薇的DFR基因(Tanaka et al.PlantCell Physiol.36，1023-1031 1995)和蔷薇花色素合成酶(ANS)基因相对应的mRNA。根据逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，选出内源性DFR mRNA的表达量低，且ANS mRNA量为正常水平的8个品种[WKS-11、13、22、36、43、天晴(White Killarney)、藤本蔷薇(Turu)No.2、坦尼克(Tineke)]。

而且，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)是用从各个品种的花瓣中得到的RNA，使用用于RT-PCR的第一链合成试剂盒[Super ScriptFirst-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)]。在DFRmRNA的检测中使用DFR-2F(5’-CAAGCAATGGCATCGGAATC-3’)

(序列号：13)和DFR-2B(5’-TTTCCAGTGAGTGGCGAAAGTC-3’)(序列号：14)的引物，在ANSmRNA的检测中使用ANS-2F(5’-TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3’)(序列号：15)和ANS-2B(5’-CCTCACCTTCTCCCTTGTT-3’)(序列号：16)的引物。

对此8个品种，进行Northern解析(表1)，决定对于DFRmRNA显示出低水平倾向，ANSmRNA水平正常，且培养特性优异，能转化的2个品种(Tineke、WKS36)，导入实际用于制造花翠素的构件。

表1

品种名	黄酮醇(mg/g petal)			pH	RT-PCR
								Q	K	Total	DFR	CHS	ANS
	WKS-36	0.082	8.095		8.177	4.81	-							+	+
White Killarney				1.343				6.113	7.456	4.7	+	+	+
	Turu No2.	0.715	5.188		5.903	4.7	+							+	+
WKS-11				2.028				0.475	2.503	4.51	+	+	+
	Tineke	0.097	4.337		4.434	4.45	-							+	+
WKS-13				0.320				3.993	4.313	4.45	-	+	+
	WKS-22	0.145	10.469		10.614	4.41	-							+	+
WKS-43				0.045				2.104	2.149	4.07	-	+	+

+：检测出的mRNA与有色蔷薇(品种Rote Rose)程度相同。

-：mRNA比有色蔷薇(品种Rote Rose)水平低。

Q：槲皮素、K：山奈黄素

实施例7.来源于蔷薇的DFR基因向Tineke的导入

pE2113(Mitsuhara et al.Plant Vell Physiol.37，45-59 1996)具有重复增强子(enhancer)序列的花椰菜花叶病毒35S(E1235S)启动子和胭脂碱(nopaline)合成酶终止子。将此质粒用SacI酶切，使用Blunting Kit(TaKaRa)形成平末端。将此DNA片段与8bp的SalI接头(linker)(TaKaRa)连接，所得质粒作为pUE5。

将pUE5用HindIII与EcoRI酶切，将得到的约3kb的DNA片段导入用HindIII与EcoRI酶切后的pBin19(Bevan M，BinaryAgrobacterium Vector for plant transformation.Nucl.Acid Res.12.8711-21，1984)，把所得质粒作为pBE5。把pCGP645用BamHI和XhoI酶切，获得含有全长蔷薇DFR cDNA的DNA片段。用BamHI和XhoI酶切pBE5，并与上述片段连接，作为pBERD1(图2)。将此质粒导入Agrobacterium tumefaciens Ag10株。

将pBERD1(图2)导入白色系蔷薇品种“Tineke”，得到18个转化体。所得转化体中的6个花色发生了变化。对2个清楚地显示出白色向粉色的花色变化的转化体进行色素分析时，均确认出有花青素、花葵素的积累(表2)。根据上述结果，可推断出品种Tineke是缺少DFR基因的品种。

               表2

个体编号	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
			1	0.014	0.005
2	0.014	0.006

Cya：花青素、Pel：花葵素

实施例8.来源于三色堇的F3’5’H基因(#18)和来源于矮牵牛的DFR基因向Tineke的导入

从三色堇(品种Black Pansy)的小花蕾的花瓣中，根据Turpen和Griffith的方法(BioTechniques 4：11-15，1986)提取RNA，使用oligotex-dT(Qiagen)纯化polyA+RNA。使用本polyA+RNA和λZAPII/GigapackII克隆试剂盒(Stratagene)，构建了来源于三色堇小花蕾的花瓣的cDNA文库。将在NZY平板上生长的约100,000pfu噬菌斑(phage plaque)转录到Colony/PlaqueScreen(Dupont)后，使用制造者推荐的方法处理。将其用³²P标记，并把矮牵牛Hf1cDNA(pCGP602、Holton et al.，Nature，366，p276-279，1993)作为探针进行筛选。

将膜置于杂交缓冲液[10％(v/v)甲酰胺、1M NaCl，10％(w/v)葡聚糖硫酸酯、1％SDS]中，经42℃、1小时的预杂交后，加入³²P标记的探针，使其为1×10⁶cpm/ml，再进行42℃、16小时的杂交。之后，将膜放入2 xSSC，1％SDS中，42℃、清洗1小时，再进一步更换新洗涤液清洗1小时。使洗净后的膜在柯达照相机XAR光片上与增感屏同时感光，检测出了杂交信号。

所得cDNA的解析结果，得到了与矮牵牛Hf1显示出高度同一性的2种cDNA。将此2种cDNA作为三色堇的F3′，5′H cDNA，BP#18(pCGP1959)及BP#40(pCGP1961)。#18的碱基序列表示为序列号：1，其氨基酸序列表示为序列号：2，#40的碱基序列表示为序列号：3，其氨基酸序列表示为序列号：4。BP#18与BP#40在DNA水平上具有82％的同一性。且BP#18与BP#40两者在DNA水平上，与矮牵牛Hf1显示了60％、与矮牵牛Hf2(Holton et al.，Nature，366，p276-279，1993)显示了62％的同一性。

一方面将pUE5用EcoRI酶切，使用Blunting Kit(TaKaRa)与形成平末端的DNA片段和8bp的HindIII接头(TaKaRa)连接，所得质粒作为pUE5H。将来源于三色堇的含有F3′5′H#18 cDNA的质粒pCGP1959用BamHI完全酶切，再回收用XhoI部分酶切后所得的约1.8kb的DNA片段。另一方面，其与用BamHI和XhoI酶切的pUE5H连接，所得质粒作为pUEBP18。

同时，通过将pCGP1403(WO96/36716)用BamHI和XhoI酶切后回收含有矮牵牛DFR cDNA的DNA片段，将此片段与用BamHI和XhoI酶切的pBE5连接形成pBEPD2。之后，将pUEBP18用HindIII部分酶切，回收含有E1235S启动子、来源于三色堇的F3′5′H#18cDNA、nos终止子的约2.8kb的DNA片段。此片段与把pBEPD 2用HindIII部分酶切的DNA片段连接，得到双元载体质粒pBPDBP2(图3)。将此质粒导入(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株。

将pBPDBP2(图3)导入白色系蔷薇品种“Tineke”，得到40个转化体。所得转化体中23个花色发生了变化，并确认了进行色素分析的19个中16个积累了花翠素(表3)。花翠素的含有率虽然最高达100％(平均为87％)，但即使色素量为最高时，1g花瓣中也只含0.035mg的极少量，花色只停留于从RHS色谱标准158d(YELLOW-WHITE GROUP)向56a(RED GROUP)、65b(RED-PURPLE GROUP)的变化，而未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系、蓝色系，所以未能获得目标蓝色蔷薇。

                                            表3

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	87	0.002	0.000	0.000	0.058	0.354
2	100	0.004	0.000	0.338	0.059	1.921
							3	82	0.002	0.001	0.203	0.039	1.382
4	100	0.003	0.000	0.245	0.050	1.840
							5	76	0.005	0.001	0.000	0.280	3.288
6	0	0.000	0.000	0.000	0.098	0.409
							7	0	0.000	0.001	0.000	0.101	0.358
8	0	0.000	0.001	0.000	0.030	2.277
							9	83	0.013	0.003	0.000	0.117	0.841
10	85	0.011	0.002	0.000	0.104	3.300
							11	84	0.020	0.004	0.000	0.168	3.137
12	91	0.025	0.002	0.294	0.119	1.252
							13	90	0.028	0.003	0.000	0.075	1.912
14	91	0.014	0.001	0.000	0.152	2.667
							15	90	0.035	0.004	0.000	0.086	1.616
16	83	0.023	0.005	0.000	0.117	2.267
							17	91	0.014	0.001	0.000	0.113	0.825
18	76	0.003	0.001	0.000	0.085	2.351
							19	82	0.005	0.001	0.000	0.054	1.616

Del：花翠素、M：杨梅黄酮

实施例9.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于矮牵牛的DFR基因向Tineke的导入

将质粒pE2113(Mitsuhara et al.Plant Vell Physiol.37，45-591996)用HindIII和XbaI酶切，回收所得约800bp的DNA片段后，与用HindIII和XbaI酶切的pBinl9(Bevan M，Binary AgrobacteriumVector for plant transformation.Nucl.Acid Res.12.8711-21，1984)连接。所得质粒作为pCGP1391。同时，pCGP669(于WO94/28140中记载)含有矮牵牛的查耳酮合酶A(CHS-A)基因的启动子。将此质粒用EcoRI酶切后形成平末端，再进一步用HindIII酶切。

将此约700bp的DNA片段用HindIII和SnabI酶切后与pCGP1391连接，所得质粒为pCGP1707。另外，将含有来源于三色堇的F3′5′H#40cDNA的质粒pCGP1961用BamHI完全酶切，再进一步用XhoI部分酶切，回收得到的约1.8kb的DNA片段，并与用BamHI和XhoI酶切的pUE5H连接，所得质粒作为pUEBP40。将pUEBP40用EcoRV和XbaI酶切，回收约5.5kb的DNA片段。

此片段与把pCGP1707用HindIII酶切后形成平末端，再用XbaI酶切后所得的约700bp的片段连接，得到pUFBP40。之后，把pUFBP40用HindIII部分酶切，回收含有花椰菜35S启动子增强子、CHS-A启动子、来源于三色堇的F3′5′H#40 cDNA、nos终止子的约3.4kb的DNA片段。此片段与把pBEPD2用HindIII部分酶切的DNA片段连接，得到双元载体质粒pBPDBP8(图4)。将此质粒导入Agrobacterium tumefaciens Ag10株。

将pBPDBP8(图4)导入白色系蔷薇品种“Tineke”中，得到53个转化体。所得转化体中17个花色发生了变化，并确认了进行色素分析的9个中8个积累了花翠素(表4)。花翠素的含有率虽然最高达93％(平均为79％)，但即使色素量为最高时，1g花瓣中也只含0.014mg的极少量，花色只停留于从RHS色谱标准158d(YELLOW-WHITE GROUP)向56a(RED GROUP)、65b(Red-Purple Group)的变化，而未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系、蓝色系，所以未能获得目标蓝色蔷薇。同时也说明上述品种Tineke不是只缺少DFR基因的品种。

                                                      表4

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	0	0.000	0.001	0.000	0.018	2.023
2	9	0.001	0.006	na	na	na
							3	93	0.011	0.001	0.000	0.036	2.724
4	86	0.007	0.001	0.000	0.076	2.957
							5	71	0.013	0.006	0.000	0.073	2.503
6	87	0.014	0.002	0.000	0.058	3.390
							7	78	0.005	0.002	0.000	0.049	1.241
8	47	0.004	0.004	0.000	0.070	1.800
							9	78	0.004	0.001	0.000	0.029	2.326

na：未经分析·测定

实施例10.来源于三色堇的F3’5’H基因(#18)与来源于矮牵牛的DFR基因向WKS36的导入

将pBPDBP2(图3)导入白色系蔷薇“WKS36”，得到138个转化体。所得转化体中10个花色发生了变化，并确认了全部积累了花翠素(表5)。花翠素的含有率虽然最高达91％(平均为60％)，但色素量在1g花瓣中也只含0.033mg的极少量，花色只停留于向极浅的粉色的变化，而未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系、蓝色系，所以未能获得目标蓝色蔷薇。同时也说明上述品种WKS36不是只缺少DFR基因的品种。

                                              表5

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	60	0.008	0.005	0.381	0.169	2.291
2	40	0.006	0.009	0.633	0.486	2.911
							3	54	0.005	0.005	0.654	0.336	3.460
4	43	0.016	0.021	0.000	0.656	2.469
							5	53	0.009	0.008	0.404	0.325	2.397
6	53	0.004	0.003	0.498	0.251	2.768
							7	45	0.013	0.016	0.000	0.381	1.537
8	83	0.004	0.001	0.000	0.156	1.632
							9	80	0.033	0.008	0.000	0.557	3.766
10	91	0.013	0.000	0.000	0.184	2.610

实施例11.来源于三色堇的F3’5’H基因(#18)与来源于矮牵牛的DFR基因向WKS36的导入

用PacI接头取代了pUCAP(van Engelen et al.TransgenicResearch 4，288-290，1995)的AscI位点的质粒为pUCPP。同时，如下述方法得到蔷薇的查耳酮合酶启动子与来源于三色堇的F3’5’H#18cDNA及nos终止子连接的表达盒。

从蔷薇品种Kardinal的嫩叶中提取染色体DNA(Tanaka et al.，Plant Cell Physiol.，36：1023-1031，1995)。将约100μg的DNA用Sau3AI部分酶切，用蔗糖密度梯度回收约20kb的DNA组分。

其与用BamHI酶切的λ噬菌体EMBL3(例如Stratagene公司)连接，使用制造者推荐的方法构建染色体DNA文库。用以蔷薇的查耳酮合酶cDNA(DNA数据库GenBank的存取号AB038246)为探针的公知的方法(Tanaka et al.，Plant Cell Physiol.，36：1023-1031，1995)筛选此文库。在所得到的查耳酮合酶染色体克隆的λCHS20中，含有查耳酮合酶起始密码子的上游约6.4kb的DNA序列。在将λCHS20用HindIII和EcoRV酶切后得到的约2.9kb的DNA片段中，含有查耳酮合酶的启动子区域。

此片段与把pUC19(Yanisch-Perron C et al.，Gene 33：103-119，1985)用HindIII和SmaI酶切后的片段连接，作为pCGP1116。此处含有的查耳酮合酶启动子部分的序列表示为序列号：21。将pCGP1116用HindIII和KpnI酶切后所得的约2.9kb的DNA片段，与把pJB1(Bodeau，Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maizeanthocyanin genes.Dissertation(学位论文)，Stanford University，USA，1994)用HindIII和KpnI酶切后所得的DNA片段连接，得到pCGP197。

另外，含有把pUE5用SacI和KpnI酶切后所得约300bp的胭脂碱合成酶终止子的DNA片段形成平末端，并与用EcoRV和BamHI酶切后再形成平末端的pBluescriptSK-连接。将所得质粒中终止子的5’侧靠近pBluescriptSK-的SalI的质粒作为pCGP1986。将pCGP1986用XhoI酶切，形成平末端后，再用SalI酶切的DNA片段，与把pCGP197用HindIII酶切后形成平末端，再用SalI酶切后所得的DNA片段连接，得到pCGP2201。

再将pCGP2201用SalI酶切后形成平末端的DNA片段，与把pCGP1959用BamHI和KpnI酶切后再形成平末端的约1.7kb的DNA片段(包含三色堇的类黄酮3′，5′-羟化酶基因)连接。将所得质粒中蔷薇查耳酮合酶启动子可使三色堇的类黄酮3′，5′-羟化酶基因正向转录插入的质粒作为pCGP2203。将质粒pCGP2203用HindIII和SacI酶切后回收。在pUCPP的HindIII和SacI位点克隆此DNA片段，并作为pSPB459。之后，将质粒pE2113用SnaBI酶切，插入BamHI接头(TaKaRa)，将所得质粒作为pUE6。

将pUE6用HindIII和BamHI酶切后所得约700bp的DNA片段，与将pCGP1405(WO96/36716)用BamHI和BglII酶切后所得的约2.2kb的DNA片段，和用HindIII和BamHI酶切的双元载体pBinplus(vanEngelen et al.Transgenic Research 4，288-290，1995)连接，得到pSPB460。把pSPB459用PacI酶切后得到约5kb的DNA片段，通过将此片段导入pSPB460的PacI位点，得到在双元载体上矮牵牛DFR与三色堇F3′5′H#18基因正向连接的pSPB461(图5)。并设法使本质粒在植物中组成性表达来源于矮牵牛的DFR基因，使来源于三色堇的F3′5′H#18基因在花瓣特异性转录。将此质粒导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株。

将pSPB461(图5)导入白色系蔷薇“WKS36”，得到229个转化体。所得转化体中16个花色发生了变化，并确认了进行色素分析的12个中全部积累了花翠素(表6)。花翠素的含有率虽然最高达79％(平均为58％)，但色素量在1g花瓣中也只含0.031mg的极少量，花色只停留于向极浅的粉色的变化，而未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系、蓝色系，所以未能获得目标蓝色蔷薇。同时也说明品种WKS36不是只缺少DFR基因的品种。

                                             表6

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	39	0.002	0.004	0.000	0.414	3.744
2	52	0.006	0.005	0.000	0.465	3.363
							3	27	0.002	0.005	0.000	0.342	3.703
4	58	0.014	0.010	0.000	0.430	2.780
							5	62	0.008	0.005	0.498	0.281	2.189
6	72	0.002	0.001	0.000	0.193	2.391
							7	71	0.010	0.004	0.000	0.152	4.021
8	79	0.031	0.008	0.403	0.215	2.660
							9	26	0.004	0.011	0.000	0.249	2.331
10	54	0.007	0.006	0.000	0.299	2.085
							11	74	0.017	0.006	0.145	0.248	3.505
12	74	0.013	0.005	0.000	0.229	2.005

实施例12.来源于三色堇的F3’5’H基因(#18)与来源于矮牵牛的DFR基因及来源于紫苏的花色素苷3-糖苷酰基转移酶基因向WKS36的导入

在来源于紫苏的羟基肉桂酰辅酶A(hydrocinnamoyl CoA)：花色素苷3-糖苷酰基转移酶(3AT)基因上附加起始密码子的基因作为pSAT208F(Yonekura-Sakakibara et al.Plant Cell Physiol.41，495-502，2000)。把pSPB580(PCT/AU03/00079)用BamHI和XhoI酶切后所得的约3.9kb的DNA片段，与把pSAT208F用BamHI和XhoI酶切后所得的约1.8kb的DNA片段连接。

通过将所得质粒用AscI酶切，回收含有E1235S启动子和紫苏3AT基因及来源于矮牵牛磷脂转移酶(phospholipid transfer)蛋白质的终止子的DNA片段。将此DNA片段插入到前述pSPB461的AscI位点，得到来源于紫苏3AT、来源于矮牵牛DFR及来源于三色堇F3′5′H#18的基因的转录方向为正方向的质粒pSPB472(图6)。并设法使本质粒在植物中组成性表达来源于紫苏3的AT基因和来源于矮牵牛的DFR基因，使来源于三色堇的F3′5′H#18基因在花瓣特异性转录。将此质粒导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株。

将pSPB472(图6)导入白色系蔷薇“WKS36”，得到75个转化体。所得转化体中4个花色发生了变化，确认了进行色素分析的3个中全部积累了花翠素(表7)。花翠素的含有率虽然最高达67％(平均为49％)，但色素量在1g花瓣中含0.011mg的极少量，花色只停留于向极浅的粉色的变化，而未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系、蓝色系，所以未能获得目标蓝色蔷薇。以上也说明品种WKS36不是只缺少DFR基因的品种。

                                         表7

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	32	0.003	0.006	0.219	0.236	1.972
2	67	0.011	0.005	0.520	0.329	3.234
							3	46	0.006	0.007	0.000	0.579	3.874

如上所述，无论筛选了多少白色蔷薇，均未能得到只缺少DFR基因的品种。也就是说，用育出蓝色香石竹的方法(WO94/28140)未能获得蓝色蔷薇。

实施例13.通过共抑制法抑制来源于蔷薇的DFR基因

将pBERD1导入藤色系蔷薇品种“熏衣草(Lavande)”，得到26个转化体，但却完全未得到花色有变化的转化体，可见，用共抑制法抑制蔷薇的内源性DFR基因是很困难的。

实施例14.有色蔷薇的筛选

为育出蓝色蔷薇，决定从有色蔷薇中选育品种。以有色蔷薇中相对带蓝色的品种为中心，通过目视选出了136个系统，对89个系统进行了色素分析。经调查的有色蔷薇的分析值如表8～表10所示。

                                                表8

名称	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
						Lavande	0.078	0.000	0.000	0.451	0.078
Madame Violet	0.055	0.000	0.000	1.780	0.189
						Vol de Nuit	0.317	0.003	0.000	2.661	0.316
Blue Moon	0.049	0.000	0.000	1.341	0.119
						青龙	0.015	0.000	0.000	3.030	1.300
WKS077	1.875	0.008	0.000	1.430	0.247
						WKS078	0.211	0.000	0.000	1.286	0.133
WKS079	2.864	0.003	0.000	1.030	0.106
						WKS080	0.040	0.000	0.000	0.362	0.047
WKS081	0.032	0.000	0.000	4.480	1.563
						WKS082	0.074	0.000	0.000	2.400	0.196
WKS083	0.018	0.405	0.000	0.146	0.962
						WKS084	0.055	0.000	0.000	1.269	0.159
WKS087	0.032	0.000	0.000	0.797	0.134
						WKS089	0.030	0.000	0.000	1.484	0.317
WKS090	1.571	0.007	0.000	1.346	0.339
						WKS091	0.045	0.169	0.000	0.186	0.899
WKS092	0.038	0.002	0.000	1.358	0.135
						WKS095	0.015	0.000	0.000	2.945	0.255
WKS096	0.024	0.000	0.000	2.032	0.349
						WKS097	0.991	0.002	0.000	1.659	0.185
WKS100	0.051	0.000	0.000	1.410	0.615
						WKS101	0.424	0.000	0.000	2.194	0.482
WKS104	0.066	0.000	0.000	2.347	0.424
						WKS107	1.202	0.004	0.000	3.134	0.460
WKS114	0.429	0.000	0.000	3.509	0.541
						WKS116	0.026	0.000	0.000	3.440	0.868
WKS117	0.027	0.000	0.000	0.227	0.149
						WKS121	0.669	0.006	0.000	1.336	0.453
WKS123	0.487	0.003	0.000	3.663	0.826

Peo：甲基花青素

                                            表9

名称	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
						WKS124	0.022	0.045	0.000	0.192	2.012
WKS125	0.187	0.002	0.000	0.349	0.089
						WKS126	0.544	0.002	0.000	2.226	0.895
WKS127	1.609	0.008	0.006	2.278	0.528
						WKS128	1.844	0.003	0.007	2.576	0.409
WKS129	1.645	0.002	0.006	0.450	0.160
						WKS130	1.332	0.008	0.005	1.599	0.525
WKS131	0.582	0.002	0.001	2.460	0.567
						WKS132	1.101	0.006	0.000	0.298	0.208
WKS133	2.773	0.003	0.000	1.263	0.230
						WKS133	3.487	0.011	0.023	0.414	0.108
WKS134	1.084	0.001	0.002	2.777	0.413
						WKS135	0.241	0.007	0.001	0.803	0.113
WKS136	0.637	0.000	0.003	1.451	0.062
						WKS137	1.208	0.014	0.002	1.034	1.027
WKS138	1.955	0.006	0.000	3.857	0.855
						WKS139	0.285	0.003	0.000	1.363	0.538
WKS140	0.075	0.000	0.000	0.291	0.097
						WKS141	0.197	0.000	0.000	0.358	0.045
WKS142	1.906	0.029	0.106	1.890	1.860
						WKS143	1.125	0.027	0.020	1.596	1.129
WKS144	2.685	0.484	0.000	0.160	0.184
						WKS145	0.948	0.006	0.000	3.086	1.222
WKS146	3.108	0.047	0.000	0.228	0.398
						WKS147	0.593	0.003	0.004	3.619	0.924
WKS148	0.059	0.000	0.000	3.113	0.466
						WKS149	1.101	0.013	0.000	1.481	1.866
WKS150	0.498	0.562	0.000	0.061	0.156
						WKS151	0.947	1.073	0.000	0.038	0.227
WKS152	0.303	1.599	0.000	0.015	0.464

Peo：甲基花青素

                                                    表10

名称	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
						WKS153	1.178	0.796	0.000	0.020	0.179
WKS154	0.219	0.659	0.000	0.007	0.265
						WKS155	0.547	0.006	0.000	1. 274	0.073
WKS156	0.851	0.005	0.000	1.139	0.238
						WKS157	0.955	0.555	0.000	0.133	1.315
WKS158	0.634	0.005	0.000	0.526	0.219
						WKS159	0.106	0.320	0.000	0.034	0.959
WKS160	0.750	0.005	0.000	2.283	0.768
						WKS161	0.262	0.419	0.000	0.197	1.115
WKS162	0.039	0.564	0.000	0.041	0.447
						WKS163	0.184	0.002	0.000	0.756	0.105
WKS164	0.918	0.012	0.000	1.954	2.832
						WKS165	0.097	0.604	0.000	0.026	0.197
WKS166	0.116	0.015	0.000	0.488	0.566
						WKS167	0.647	0.002	0.000	2.507	0.499
WKS168	1.109	0.029	0.000	1.797	2.328
						WKS169	0.070	0.003	0.000	0.208	1.369
Baby Faurax	2.247	0.022	0.058	4.518	0.580
						Indigo	0.891	0.006	0.000	5.781	3.820
Intermezzo	0.040	0.000	0.000	1.075	0.443
						James Veitch	1.281	0.004	0.002	2.087	0.923
Lagoon	0.053	0.000	0.000	2.887	0.315
						Magenta	0.126	0.000	0.000	1.062	0.191
MRS COLVILLE	1.666	0.012	0.000	3.500	2.940
						Mme.Isaac Pereire	0.629	0.003	0.000	1.021	0.105
Mme.de La Roche-Lambert	0.869	0.005	0.000	4.994	2.794
						Roseraie de L′hay	0.364	0.005	1.256	0.156	0.077
Rose de Rescht	1.348	0.004	0.000	4.027	0.842
						Rose du Roi a Fleurs Pourpres	2.556	0.017	0.000	0.968	0.411

Peo：甲基花青素

实施例15.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向Lavande的导入

花色素苷经芳香族酰基修饰后可使花色素苷更稳定，且可使颜色变蓝(例如，WO96/25500)。为制造酰基化的花翠素型花色素苷，进行了如下试验。

从蓝猪耳品种Summer Wave的花瓣中得到RNA，再配制polyA⁺RNA。用此polyA⁺RNA，以λZAPII(Stratagene公司)为载体，使用directional cDNA文库制作试剂盒(Stratagene公司)，并用制造者推荐的方法构建cDNA文库。因蓝猪耳的主要花色素苷的5位的葡萄糖被芳香族酰基修饰(Suzuki et al.Molecular Breeding 2000 6，239-246)，所以在蓝猪耳的花瓣中，花色素苷酰基转移酶可表达。

花色素苷酰基转移酶保存有称为Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys的氨基酸序列，通过将与此对应的合成DNA作为引物使用，可获得花色素苷酰基转移酶基因(WO96/25500)。具体地说，构建蓝猪耳cDNA文库时，以合成的10ng单链cDNA为模板，以100ng的ATC引物(5′-GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA-3′、I是肌苷)(序列号：17)、100ng的寡聚(oligo)d T引物(5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG-3’)(序列号：18)为引物，使用Taq聚合酶(TaKaRa、日本)，在制造者推荐的条件下进行聚合酶链反应(PCR)。

PCR以95℃、1分钟，55℃、1分钟及72℃、1分钟为1循环，进行25次循环反应。将所得约400bp的DNA片段通过Gene Clean II(BIO，101.Inc.)，用制造者推荐的方法回收，在pCR-TOPO进行亚克隆。确定其碱基序列时，在龙胆的酰基转移酶基因(Fujiwara et al.(1998)Plant J.16 421-431)中发现了相同的序列。碱基序列使用Dye-primer法[美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)]、序列分析仪(sequencer)310或377[均属于美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)]来确定。

将此DNA片段使用DIG标记检测试剂盒(Nipponroche)由DIG标记，使用制造者推荐的方法，通过噬菌斑杂交法筛选蓝猪耳的cDNA文库。随机选择12个得到的带有阳性信号的克隆，从中回收质粒，以确定碱基序列。其显示了在花色素苷酰基转移酶上的高度的同源性。，确定了这些克隆中pTAT7克隆含有的cDNA的全碱基序列。此碱基序列表示为序列号：7，且与其对应的氨基酸序列表示为序列号：8。

将pBE2113-GUS(Mitsuhara et al.Plant Vell Physiol.37，45-591996)用SacI酶切后，形成平末端，插入8bp的XhoI接头(TaKaRa)。在此质粒的BamHI和XhoI位点，插入把pTAT7用BamHI和XhoI酶切后所得的约1.7kb的DNA，得到pSPB120。通过将pSPB120用SnaBI和BamHI酶切后形成平末端并连接，得到pSPB120’。同时，将含有来源于三色堇的F3’5’H#40 cDNA的质粒pCGP1961用BamHI完全酶切后，再用XhoI部分酶切，回收所得到的约1.8kb的DNA片段，此片段与用BamHI和XhoI酶切的pUE5H连接，所得质粒为pUEBP40。

通过将pUEBP40用SnaBI和BamHI酶切后形成平末端并连接，得到pUEBP40’。将pUEBP40’用HindIII部分酶切后所得到的约2.7kb的DNA片段回收，与把pSPB120’用HindIII部分酶切后的DNA片段连接。所得质粒中，从双元载体上的right border侧，按新霉素磷酸转移酶基因、来源于三色堇的F3′5′H#40基因、来源于蓝猪耳的5AT基因的顺序，把各自按相同方向连接的双元载体作为pSPB130(图7)。并设法使本质粒在植物中，组成性表达来源于三色堇的F3′5′H#40基因和来源于蓝猪耳的5AT基因，使基因在花瓣特异性转录。将此质粒导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株。

将pSPB130(图7)导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，得到41个转化体。确认了进行色素分析的32个中20个积累了花翠素(表11及表12)。花翠素含有率最高达71％(平均为36％)。花色从RHS色谱标准186c(GRAYED-PURPLE GROUP)向79d(PURPLE GROUP)变化。且此时的酰基化花色素苷的比例停留在总花色素苷的30％左右。在测定经酰基化的花色素苷的光谱时，其最大吸收波长虽比花翠素3，5-二糖苷向长波长移动了4nm，但因占总花色素苷中的比例低，所以未使花色有明显的变化。

                                           表11

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								1	0	9	0.005	0.050	na	na	na
2	0	11	0.009	0.069	na	na	na
								3	0	10	0.010	0.087	na	na	na
4	0	22	0.028	0.102	na	na	na
								5	5	51	0.073	0.069	na	na	na
6	4	57	0.093	0.069	na	na	na
								7	5	48	0.039	0.042	na	na	na
8	13	0	0.000	0.065	na	na	na
								9	17	9	0.006	0.062	na	na	na
10	26	0	0.000	0.104	na	na	na
								11	17	67	0.074	0.036	na	na	na
12	0	0	0.000	0.131	na	na	na
								13	0	0	0.000	0.083	na	na	na
14	6	48	0.084	0.092	na	na	na
								15	0	20	0.020	0.081	na	na	na
16	42	13	0.020	0.131	0.000	0.637	0.020
								17	32	36	0.032	0.058	na	na	na
18	7	0	0.000	0.146	na	na	na
								19	0	0	0.000	0.069	na	na	na
20	0	0	0.000	0.142	na	na	na
								21	0	0	0.000	0.080	na	na	na

na：未经分析·测定

                                            表12

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								22	0	0	0.000	0.069	na	na	na
23	0	0	0.000	0.057	na	na	na
								24	18	4	0.006	0.149	na	na	na
25	17	4	0.008	0.208	na	na	na
								26	0	0	0.000	0.188	na	na	na
27	0	0	0.000	0.078	na	na	na
								28	17	67	0.090	0.044	na	na	na
29	17	71	0.057	0.024	na	na	na
								30	16	40	0.040	0.059	na	na	na
31	21	70	0.082	0.036	0.305	0.062	0.008
								32	18	62	0.066	0.040	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例16.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS100的导入

将pSPB130(图7)导入藤色系蔷薇“WKS100”，得到146个转化体。并确认了进行色素分析的63个中56个积累了花翠素(表13～表15)。花翠素含有率最高达95％(平均为44％)。花色从RHS色谱标准56d(RED GROUP)向186d(GRAYED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                                     表13

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									1	20	75	0.036	0.012	0.000	2.944	0.974	0.322
2	16	51	0.027	0.027	0.000	1.685	1.734	0.512
									3	13	50	0.024	0.024	0.000	0.000	1.382	1.912
4	23	50	0.037	0.037	0.000	na	na	na
									5	9	25	0.013	0.033	0.005	na	na	na
6	10	26	0.034	0.097	0.000	na	na	na
									7	13	65	0.053	0.028	0.000	1.936	1.184	0.760
8	13	65	0.044	0.024	0.000	1.622	1.065	0.562
									9	14	62	0.033	0.021	0.000	2.096	1.444	0.710
10	14	95	0.137	0.008	0.000	0.000	0.156	1.097
									11	10	62	0.036	0.022	0.000	2.025	1.194	0.799
12	5	59	0.054	0.038	0.000	2.194	1.289	0.783
									13	9	43	0.033	0.044	0.000	2.542	1.803	0.734
14	9	50	0.030	0.031	0.000	0.020	1.971	0.741
									15	1	70	0.066	0.028	0.000	1.652	1.659	0.867
16	0	20	0.008	0.023	0.008	0.308	2.632	1.463
									17	1	63	0.068	0.040	0.000	2.037	2.128	1.554
18	21	51	0.037	0.035	0.000	2.659	1.936	1.002
									19	0	0	0.000	0.095	0.000	na	na	na
20	0	0	0.000	0.037	0.000	na	na	na
									21	0	23	0.026	0.086	0.003	0.182	4.554	3.083
22	4	71	0.110	0.044	0.000	3.265	1.643	1.341
									23	12	65	0.051	0.025	0.002	1.356	0.888	0.387
24	6	58	0.038	0.027	0.000	2.374	2.016	0.809
									25	5	52	0.044	0.040	0.000	2.651	2.546	1.108

na：未经分析·测定

                                                     表14

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									26	6	64	0.033	0.019	0.000	2.707	1.546	0.605
27	16	0	0.000	0.041	0.000	na	na	na
									28	16	13	0.007	0.050	0.000	0.249	3.359	1.459
29	12	7	0.007	0.095	0.000	na	na	na
									30	15	9	0.007	0.069	0.000	na	na	na
31	15	8	0.007	0.081	0.000	na	na	na
									32	7	7	0.007	0.094	0.000	na	na	na
33	13	10	0.006	0.055	0.000	na	na	na
									34	14	46	0.078	0.090	0.002	na	na	na
35	7	8	0.007	0.078	0.000	na	na	na
									36	3	48	0.045	0.039	0.010	3.050	2.304	1.326
37	2	39	0.029	0.046	0.000	na	na	na
									38	1	55	0.073	0.059	0.000	1.608	2.138	1.015
39	1	33	0.030	0.063	0.000	na	na	na
									40	2	59	0.050	0.035	0.000	3.651	2.727	1.076
41	17	15	0.011	0.061	0.000	na	na	na
									42	0	0	0.000	0.048	0.002	na	na	na
43	3	17	0.009	0.046	0.000	na	na	na
									44	40	32	0.027	0.058	0.000	na	na	na
45	2	0	0.000	0.031	0.000	na	na	na
									46	2	0	0.000	0.038	0.000	na	na	na
47	1	8	0.004	0.048	0.000	na	na	na
									48	19	57	0.046	0.034	0.000	2.626	2.165	0.900
49	10	59	0.047	0.032	0.000	1.737	1.901	1.054
									50	2	70	0.057	0.024	0.000	1.545	0.880	0.694

na：未经分析·测定

                                                       表15

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									51	4	10	0.006	0.056	0.000	na	na	na
52	16	12	0.006	0.039	0.002	na	na	na
									53	34	84	0.156	0.030	0.000	5.100	1.056	0.511
54	32	89	0.131	0.017	0.000	3.907	0.803	0.431
									55	29	89	0.098	0.013	0.000	3.687	0.453	0.226
56	21	83	0.083	0.017	0.000	2.679	0.817	0.431
									57	14	8	0.007	0.082	0.000	na	na	na
58	9	44	0.034	0.041	0.002	2.258	2.054	0.672
									59	7	51	0.040	0.038	0.000	2.246	2.151	0.765
60	0	7	0.008	0.111	0.000	na	na	na
									61	1	48	0.069	0.073	0.000	1.558	1.730	0.565
62	13	0	0.000	0.036	0.000	na	na	na
									63	16	14	0.005	0.029	0.000	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例17.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS116的导入

将pSPB130(图7)导入浅藤色系蔷薇“WKS116”，得到282个转化体。并确认了进行色素分析的36个中33个积累了花翠素(表16及表17)。花翠素含有率最高达80％(平均为73％)。花色从RHS色谱标准196d(GRAYED-GREEN GROUP)向186d(GRAYED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                                       表16

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								1	1.8	78	0.015	0.004	0.746	0.753	0.507
2	12.7	78	0.097	0.028	1.826	2.352	1.572
								3	5.9	78	0.030	0.009	1.000	1.452	0.934
4	0.0	76	0.030	0.010	0.813	0.990	0.480
								5	2.6	72	0.038	0.015	1.279	1.835	0.832
6	0.0	72	0.019	0.007	0.839	0.983	0.642
								7	3.1	75	0.033	0.011	1.131	1.476	0.877
8	1.9	75	0.028	0.009	0.761	0.977	0.466
								9	2.6	76	0.034	0.011	na	na	na
10	2.7	73	0.031	0.011	na	na	na
								11	4.4	77	0.033	0.010	1.001	1.003	0.618
12	7.0	74	0.035	0.012	0.849	0.945	0.577
								13	9.3	74	0.025	0.009	na	na	na
14	3.2	80	0.044	0.011	1.045	0.959	0.545
								15	4.5	75	0.031	0.010	1.115	1.256	0.729
16	10.5	71	0.028	0.012	1.055	1.155	0.670
								17	1.7	51	0.016	0.016	0.330	1.537	1.052
18	10.5	77	0.112	0.033	2.008	2.976	2.216
								19	0.0	0	0.000	0.010	na	na	na
20	0.0	30	0.007	0.015	na	na	na
								21	na	56	0.013	0.010	0.197	1.960	1.463
22	4.4	47	0.006	0.007	na	na	na
								23	3.6	77	0.026	0.008	na	na	na

na：未经分析·测定

                                                  表17

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								24	7.2	82	0.028	0.006	1.295	1.272	0.805
25	3.5	83	0.035	0.007	na	na	na
								26	17.4	26	0.009	0.025	na	na	na
27	39.3	91	0.101	0.010	3.499	0.563	0.178
								28	28.2	85	0.047	0.005	na	na	na
29	0.0	0	0.000	0.025	na	na	na
								30	10.4	89	0.092	0.012	na	na	na
31	1.9	0	0.000	0.036	na	na	na
								32	5.8	76	0.027	0.009	na	na	na
33	16.8	88	0.066	0.009	na	na	na
								34	10.5	87	0.103	0.015	na	na	na
35	13.7	38	0.021	0.034	na	na	na
								36	18.3	95	0.051	0.003	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例18.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS124的导入

将pSPB130(图7)导入浅橙色系蔷薇“WKS124”，得到50个转化体。并确认了进行色素分析的15个中13个积累了花翠素(表18)。花翠素含有率最高达95％(平均为82％)。花色从RHS色谱标准52d(REDGROUP)向71c(RED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                                     表18

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									1	0.6	0	0.000	0.013	0.069	na	na	na
2	35.5	75	0.256	0.051	0.034	0.066	0.093	1.190
									3	43.0	78	0.385	0.068	0.041	0.039	0.046	1.197
4	44.2	85	0.811	0.120	0.028	0.106	0.094	1.021
									5	na	86	0.907	0.123	0.024	0.219	0.066	0.852
6	4.6	0	0.000	0.023	0.075	na	na	na
									7	7.9	90	1.498	0.169	0.008	0.905	0.143	0.679
8	8.4	90	1.403	0.146	0.008	0.971	0.145	0.827
									9	26.7	88	0.521	0.066	0.003	0.623	0.108	0.853
10	21.9	89	0.504	0.058	0.003	0.636	0.098	0.727
									11	26.0	85	0.928	0.145	0.019	0.424	0.152	0.455
12	3.8	95	1.017	0.058	0.000	1.161	0.140	0.262
									13	11.6	84	0.939	0.156	0.025	0.748	0.128	0.262
14	38.5	69	0.166	0.071	0.007	0.000	0.059	0.776
									15	27.1	55	0.137	0.040	0.074	0.000	0.021	2.330

na：未经分析·测定

实施例19.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS132的导入

将pSPB130(图7)导入鲜红色系蔷薇“WKS132”，得到24个转化体。并确认了进行色素分析的7个中6个积累了花翠素(表19)。花翠素含有率最高达43％(平均为12％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLEGROUP)向66a(RED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                        表19

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
						1	1.8	0.4	0.008	1.872	0.009
2	1.0	0.0	0.000	1.409	0.010
						3	21.3	11.4	0.237	1.841	0.007
4	6.8	42.5	0.461	0.619	0.006
						5	7.6	9.5	0.204	1.936	0.011
6	na	1.3	0.016	1.227	0.007
						7	23.7	5.4	0.081	1.407	0.005

实施例20.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS133的导入

将pSPB130(图7)导入深红紫色系蔷薇“WKS133”，得到16个转化体。并确认了进行色素分析的8个全部积累了花翠素(表20)。花翠素含有率最高达34％(平均为11％)。花色从RHS色谱标准53a(RED GROUP)向61a(RED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                                        表20

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
										1	10.3	23.7	1.322	4.253	0.009	0.004	0.691	0.792	0.133
2	11.8	33.8	1.192	2.324	0.005	0.003	0.621	0.422	0.093
										3	6.1	12.9	0.009	0.060	0.000	0.000	0.102	0.500	0.048
4	3.8	9.1	0.363	3.627	0.005	0.008	na	na	na
										5	15.8	2.0	0.078	3.774	0.009	0.000	0.045	0.939	0.472
6	11.5	2.7	0.135	4.771	0.011	0.005	0.046	0.576	0.034
										7	13.3	3.0	0.180	5.800	0.009	0.009	0.100	0.937	0.179
8	12.2	3.5	0.161	4.470	0.009	0.009	0.068	0.738	0.148

na：未经分析·测定

实施例21.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS137的导入

将pSPB130(图7)导入深红紫色系蔷薇“WKS137”，得到20个转化体。并确认了进行色素分析的17个全部积累了花翠素(表21)。花翠素含有率最高达1.3％(平均为0.4％)。未看出花色从RHS色谱标准61b(RED-PURPLE GROUP)的变化。

                                                      表21

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
										1	0.5	0.3	0.008	2.821	0.037	0.000	na	na	na
2	0.8	0.3	0.010	3.384	0.051	0.000	na	na	na
										3	0.4	0.3	0.005	1.982	0.014	0.000	na	na	na
4	0.6	0.2	0.008	3.344	0.057	0.000	na	na	na
										5	0.7	0.4	0.011	3.145	0.035	0.000	na	na	na
6	0.7	1.3	0.025	2.919	0.040	0.003	na	na	na
										7	0.4	0.3	0.008	2.820	0.045	0.000	na	na	na
8	0.5	0.4	0.010	2.467	0.042	0.000	na	na	na
										9	0.7	0.2	0.010	3.836	0.024	0.000	na	na	na
10	0.1	0.5	0.008	1.743	0.016	0.000	na	na	na
										11	0.7	0.4	0.011	2.593	0.027	0.003	na	na	na
12	0.6	0.3	0.007	2.393	0.022	0.000	0.048	3.026	2.812
										13	1.4	0.2	0.009	3.756	0.065	0.000	na	na	na
14	0.7	0.4	0.008	2.149	0.024	0.001	na	na	na
										15	0.8	0.5	0.007	2.281	0.041	0.000	na	na	na
16	0.5	0.5	0.007	1.314	0.014	0.000	na	na	na
										17	1.0	0.2	0.007	2.892	0.051	0.000	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例22.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS140的导入

将pSPB130(图7)导入藤色系蔷薇“WKS140”，得到197个转化体。并确认了进行色素分析的45个中37个积累了花翠素(表22及表23)。

花翠素含有率最高达94％(平均为47％)。花色从RHS色谱标准186d(GREYED-PURPLE GROUP)向79d(PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                          表22

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								1	3.5	0.0	0.000	0.090	na	na	na
2	2.5	0.0	0.000	0.093	0.096	2.429	0.246
								3	5.5	63.5	0.061	0.035	0.688	1.090	0.106
4	13.2	17.7	0.013	0.059	na	na	na
								5	5.4	11.6	0.017	0.129	na	na	na
6	3.6	12.3	0.011	0.078	na	na	na
								7	13.6	11.7	0.009	0.069	na	na	na
8	4.1	22.3	0.012	0.041	0.057	1.950	0.492
								9	3.3	0.0	0.000	0.071	na	na	na
10	2.6	18.6	0.017	0.076	na	na	na
								11	4.2	18.6	0.012	0.052	0.130	3.101	1.172
12	6.5	25.0	0.026	0.079	0.251	2.300	0.592
								13	1.3	0.0	0.000	0.062	0.000	2.200	0.552
14	22.7	85.4	0.261	0.045	1.649	0.943	0.126
								15	20.9	57.4	0.093	0.069	0.481	1.418	0.182
16	16.4	39.9	0.052	0.078	na	na	na
								17	15.2	50.8	0.074	0.072	na	na	na
18	6.1	22.6	0.036	0.111	0.148	2.152	0.279
								19	2.7	0.0	0.000	0.033	na	na	na
20	9.1	52.6	0.041	0.037	na	na	na
								21	4.4	46.2	0.075	0.087	na	na	na
22	8.5	34.7	0.040	0.075	0.195	1.847	0.394
								23	11.0	30.9	0.018	0.040	0.155	1.106	0.142
24	13.4	46.8	0.056	0.063	na	na	na
								25	2.8	5.1	0.006	0.107	na	na	na

na：未经分析·测定

                                                 表23

个体番号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								26	4.1	6.8	0.007	0.098	na	na	na
27	31.4	93.4	0.252	0.018	1.434	0.361	0.052
								28	13.4	86.7	0.101	0.016	1.237	1.740	0.499
29	32.3	94.2	0.200	0.012	0.862	0.131	0.029
								30	13.0	89.7	0.176	0.020	0.553	0.289	0.026
31	12.3	87.1	0.150	0.022	1.007	0.674	0.135
								32	6.7	9.9	0.009	0.086	na	na	na
33	11.5	67.4	0.108	0.052	na	na	na
								34	5.0	11.2	0.014	0.110	0.074	2.588	0.659
35	12.5	79.7	0.088	0.022	1.192	1.185	0.574
								36	15.0	83.4	0.065	0.013	1.478	1.147	0.570
37	1.8	0.0	0.000	0.068	na	na	na
								38	1.3	44.3	0.105	0.132	0.582	3.259	1.232
39	2.5	73.6	0.114	0.041	na	na	na
								40	14.0	85.3	0.165	0.028	1.881	1.035	0.180
41	0.5	4.3	0.006	0.144	na	na	na
								42	9.9	53.3	0.040	0.035	0.373	1.038	0.164
43	33.5	87.4	0.275	0.040	1.851	0.701	0.148
								44	1.3	0.0	0.000	0.073	na	na	na
45	1.5	0.0	0.000	0.062	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例23.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS77的导入

将pSPB130(图7)导入深红紫色系蔷薇“WKS77”，得到35个转化体。并确认了进行色素分析的17个全部积累了花翠素(表24)。花翠素含有率最高达57％(平均为33％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLE GROUP)向71a(RED-PURPLE GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                       表24

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									1	6.2	42.5	1.153	1.552	0.008	0.484	0.679	0.196
2	7.6	38.6	0.618	0.979	0.005	0.267	0.465	0.094
									3	3.9	40.4	0.706	1.030	0.011	1.266	1.768	0.722
4	2.0	46.9	0.372	0.417	0.004	0.363	0.608	0.276
									5	5.4	40.6	0.540	0.784	0.005	1.077	1.809	0.645
6	2.0	44.7	1.078	1.325	0.009	0.516	1.034	0.382
									7	2.1	46.5	0.398	0.453	0.005	0.353	0.792	0.569
8	5.8	39.7	0.647	0.980	0.005	0.425	0.706	0.183
									9	4.7	40.0	0.844	1.268	0.000	0.310	0.764	0.199
10	7.6	39.7	1.345	2.033	0.009	0.350	0.635	0.119
									11	14.1	2.9	0.068	2.274	0.013	na	na	na
12	12.8	6.9	0.126	1.688	0.009	na	na	na
									13	12.7	4.2	0.109	2.468	0.012	0.060	1.541	0.366
14	13.0	20.9	0.704	2.669	0.000	0.407	2.502	0.694
									15	19.3	43.5	1.011	1.308	0.007	0.357	0.843	0.276
16	19.6	6.1	0.092	1.414	0.010	0.120	1.740	0.477
									17	22.8	56.6	1.068	0.814	0.004	0.604	0.503	0.126

na：未经分析·测定

实施例24.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS82的导入

将pSPB130(图7)导入藤色系蔷薇“WKS82”，得到89个转化体。并确认了进行色素分析的44个全部积累了花翠素(表25及表26)。花翠素含有率最高达91％(平均为49％)。花色从RHS色谱标准186d(GREYED-PURPLE GROUP)向80c(PURPLE-VIOLET GROUP)变化。但未达到RHSCC的紫色系、紫蓝色系和蓝色系，未能获得目标蓝色蔷薇。

                                        表25

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									1	10.5	52.3	0.055	0.050	0.000	0.430	0.883	0.083
2	15.9	62.5	0.091	0.054	0.000	0.570	0.549	0.030
									3	15.9	36.6	0.044	0.076	0.000	0.622	2.221	0.102
4	6.8	40.0	0.023	0.034	0.000	0.247	0.986	0.172
									5	15.0	82.9	0.087	0.018	0.000	5.451	0.403	0.042
6	na	89.7	0.072	0.008	0.000	0.853	0.163	0.062
									7	9.5	89.5	0.101	0.012	0.000	0.719	0.144	0.019
8	14.7	11.4	0.012	0.090	0.000	na	na	na
									9	11.6	29.3	0.024	0.059	0.000	na	na	na
10	8.7	15.2	0.010	0.053	0.000	na	na	na
									11	7.9	59.0	0.046	0.032	0.000	0.580	0.619	0.022
12	8.5	55.6	0.060	0.048	0.000	1.318	1.615	0.165
									13	13.9	42.3	0.026	0.035	0.000	0.603	1.094	0.052
14	10.1	10.3	0.008	0.073	0.000	na	na	na
									15	10.6	18.8	0.018	0.079	0.000	na	na	na
16	9.3	11.7	0.009	0.066	0.000	na	na	na
									17	14.3	76.2	0.112	0.035	0.000	3.741	1.587	0.377
18	12.7	76.7	0.101	0.031	0.000	1.608	0.656	0.075
									19	9.8	71.7	0.057	0.022	0.000	1.403	0.455	0.041
20	5.3	14.1	0.011	0.068	0.000	0.132	2.999	0.720
									21	3.5	18.5	0.008	0.035	0.000	na	na	na
22	7.7	23.1	0.017	0.055	0.000	0.141	0.929	0.034
									23	5.4	19.0	0.015	0.065	0.000	0.297	4.128	1.350

na：未经分析·测定

                                        表26

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
									24	1.1	42.1	0.036	0.050	0.000	0.609	2.929	0.679
25	22.7	91.0	0.079	0.008	0.000	0.964	0.218	0.018
									26	6.1	61.3	0.048	0.030	0.000	0.490	0.468	0.029
27	8.7	91.3	0.097	0.009	0.000	2.053	0.339	0.123
									28	9.4	59.9	0.060	0.040	0.000	1.537	1.631	0.422
29	5.5	51.2	0.040	0.038	0.000	0.688	0.723	0.038
									30	5.1	61.4	0.056	0.032	0.003	0.637	0.537	0.087
31	7.0	53.3	0.037	0.032	0.000	0.706	1.032	0.051
									32	5.7	58.1	0.071	0.051	0.000	1.592	1.478	0.220
33	4.3	64.6	0.092	0.050	0.000	0.849	0.753	0.035
									34	6.4	61.7	0.042	0.026	0.000	0.477	0.468	0.023
35	8.9	58.8	0.048	0.034	0.000	0.646	0.928	0.063
									36	6.2	11.6	0.007	0.057	0.000	0.094	1.132	0.066
37	7.1	51.2	0.038	0.036	0.000	0.911	1.135	0.079
									38	5.8	50.8	0.029	0.028	0.000	0.868	1.105	0.096
39	5.5	47.0	0.027	0.023	0.007	1.366	1.632	0.105
									40	4.9	67.0	0.044	0.022	0.000	0.795	0.586	0.051
41	na	61.1	0.053	0.033	0.000	1.310	1.466	0.259
									42	9.6	71.0	0.074	0.030	0.000	0.460	0.337	0.023
43	1.2	27.6	0.009	0.024	0.000	na	na	na
									44	5.2	13.8	0.013	0.078	0.000	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例25.来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因向WKS91的导入

将pSPB130(图7)导入浅橙色系蔷薇“WKS91”，得到10个转化体。并确认了进行色素分析的2个中只有1个积累了花翠素(表27)。花翠素含有率最高达2％。未看出花色从RHS色谱标准43c(RED GROUP)的变化。

                                     表27

个体编号	酰基化(％)	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
						1	0.7	0.0	0.000	0.090	0.307
2	0.0	1.8	0.006	0.040	0.295

实施例26.熏衣草(Lavande)中来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于鸢尾的DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

从蓝色切花鸢尾的花瓣中取得RNA，再配制polyA⁺RNA。用此polyA⁺RNA，以λZAPII(Stratagene公司)为载体，使用cDNA文库制作试剂盒(Stratagene公司)，并用制造者推荐的方法构建cDNA文库。鸢尾的DFR基因片段与获得龙胆的DFR基因片段的报道同法进行(Tanaka et al.Plant Cell Physiol.37，711-716，1996)。

将所得约400bp的DNA片段通过Gene Clean用制造者推荐的方法回收，亚克隆到pCR-TOPO。确定其碱基序列时，在蔷薇的DFR基因上可看出相同的序列。使用此DNA片段，筛选鸢尾cDNA文库，得到含有全长的氨基酸序列的鸢尾DFRcDNA。其中确定了作为pSPB906的克隆中含有的cDNA的全碱基序列。此碱基序列表示为序列号：9，且与其对应的氨基酸序列表示为序列号：10。

之后，将pSPB580用BamHI和XhoI酶切后得到的约3.9kb的DNA片段，与将pSPB906用BamHI和XhoI酶切后得到的约1.5kb的DNA片段连接，所得质粒作为pSPB909。

如下进行了在植物中转录蔷薇DFR cDNA的双链RNA。通过将pCGP1364(Tanaka et al.Plant Cell Physiol.(1995)36 1023-1031))用PstI部分酶切，并把得到的约3.5kb的DNA片段(包含Mac1启动子、蔷薇DFRcDNA，mas终止子)插入到pUC19(Yanisch-Perron C et al.，Gene 33：103-119，1985)的PstI位点，所得质粒中pUC19的HindIII位点靠近MacI启动子的质粒作为pCGP1394。

之后，将pCGP1394用HindIII和SacII酶切后所得约1.4kb的DNA片段，与将pCGP1394用PstI酶切、形成平末端后再用SacII酶切得到的约1.9kb的DNA片段，和将pBinPLUS用SacI酶切、形成平末端后再用HindIII酶切得到的双元载体片段连接，得到pSPB185。通过将pSPB185用XbaI酶切、形成平末端后，与SalI接头连接，得到pSPB521。再通过将pUE6用HindIII和BamHI酶切所得约700bp的DNA片段，与将pSPB521用HindIII和SacI酶切所得的双元载体DNA片段，和将pE2113用BamHI和SacI酶切所得的GUS基因DNA片段连接，得到pSPB528。

pSPB528是具有增强子的，在花椰菜花叶病毒35S启动子与甘露碱(Mannopine)合成酶终止子之间插入结构基因并可使其在植物中表达的双元载体。另外，为缩短pCGP645中含有的蔷薇DFR cDNA の 5’非翻译区序列，将pCGP645用SmaI和PvuI酶切、形成平末端后再连接，得到pCGP645s。

以pCGP645s为模板，将反向引物与合成引物RDF310(5’-CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTCG-3’)(序列号：19)作为引物，通过PCR扩增获得蔷薇DFR cDNA的5’侧序列，并克隆到pCRTOPO。确定DNA的碱基序列，由PCR确认有无错误。将其作为pSPB569。

再pCGP645s为模板，将反向引物与合成引物RDF830(5’-GGGTCGACGCGGCCCTCTGCTTTCGG-3’)(序列号：20)作为引物，通过PCR扩增获得长度不同的蔷薇DFR cDNA的5’侧序列，并克隆到pCRTOPO。确定DNA的碱基序列，由PCR确认有无错误。

将其作为pSPB570。将pSPB528用BamHI和SacI酶切后所得的双元载体的DNA片段，与把pSPB569用SacI和XhoI酶切后所得的0.3kb的DNA片段，和将pSPB570用BamHI和SalI酶切后所得的DNA片段连接，得到pSPB572。本载体是为在植物中转录蔷薇DFR cDNA双链RNA而设计的。

将pUE6用SacI酶切，形成平末端后，插入SalI接头得到pUE8。将pUE8用HindIII和EcoRI酶切后所得DNA片段导入pBinPLUS的HindIII和EcoRI位点，形成pSPB189。将pSPB189用BamHI和SalI酶切后得到的约3.7kb的DNA片段，与把pCGP1961用BamHI完全酶切后再用XhoI部分酶切所得到的约1.8kb的DNA片段连接，得到pSPB567。将pSPB572用PacI酶切，脱磷处理后，与把pSPB567用PacI酶切后得到的约2.8kb的DNA片段连接，选择nptII基因与来源于三色堇的F3′5′H#40同向转录的质粒，作为pSPB905。

将pSPB905用AscI酶切，脱磷处理后，与把pSPB909用AscI酶切后得到的约2.5kb的DNA片段连接，得到与nptII遗伝子同向转录鸢尾DFR基因的质粒，形成pSPB919(图8)。因本质粒在蔷薇中转录来源于鸢尾的DFR基因和来源于三色堇的F3’5’H #40基因，所以期待通过双链RNA的转录抑制蔷薇的DFR基因的表达。将此质粒导入Agrobacterium tumefaciens Ag10株。

将pSPB919(图8)导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，得到87个转化体。并确认了进行色素分析的38个中31个积累了花翠素(表28及表29)。花翠素含有率最高达100％(平均为76％)。花色发生了从RHS色谱标准186c(GREYED-PURPLE GROUP)向85a，b(VIOLET GROUP)的非常大的变化。

如上所述从蔷薇花瓣中提取RNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离RNA后，转录到HI-BOND N(Amersham公司)(例如Tanaka et al.1995)。mRNA的检测使用DIG Northern Starter Kit(Roche)，用制造者推荐的方法进行。蔷薇DFRmRNA的检测中，以pCGP645(Tanaka et al.Plant Cell Physiol.36，1023-1031 1995)为模板，将用T7引物转录的产物作为探针使用。

三色堇F3′5′H #40 mRNA的检测中，以pCGP1961为模板，将用T7引物转录的产物作为探针使用。鸢尾DFRmRNA的检测中，以pSPB906为模板，将用T7引物转录的产物作为探针使用。在花色变化了的蔷薇中，检测出了来源于三色堇的F3′5′H #40和来源于鸢尾DFR基因的mRNA。同时，蔷薇DFRmRNA与宿主相比显著减少，由于在低分子量的位置检测出了扩增带，所以可知蔷薇DFRmRNA发生了分解。

                                        表28

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	0.0	0.000	0.105	0.036	0.856	0.038
2	0.0	0.000	0.125	na	na	na
							3	0.0	0.000	0.091	0.023	0.851	0.101
4	0.0	0.000	0.116	0.000	1.336	0.087
							5	0.0	0.000	0.048	na	na	na
6	88.5	0.086	0.011	1.626	1.187	0.411
							7	90.8	0.089	0.009	0.797	1.548	0.087
8	84.0	0.046	0.009	0.163	0.699	0.016
							9	87.8	0.062	0.009	0.193	0.760	0.022
10	89.3	0.072	0.009	0.210	0.575	0.033
							11	91.5	0.049	0.005	0.398	0.805	0.050
12	91.5	0.032	0.003	0.100	0.811	0.014
							13	85.7	0.040	0.007	0.092	0.497	0.012
14	64.9	0.040	0.021	0.263	0.327	0.015
							15	88.3	0.041	0.005	na	na	na
16	66.4	0.011	0.006	0.036	1.221	0.030
							17	79.7	0.008	0.002	0.030	0.765	0.009
18	100.0	0.010	0.000	0.048	1.343	0.067
							19	95.9	0.040	0.002	0.159	0.136	0.004
20	65.4	0.016	0.008	0.090	1.244	0.048
							21	18.8	0.011	0.049	0.048	0.855	0.020
22	0.0	0.000	0.110	0.000	1.274	0.079
							23	0.0	0.000	0.140	0.000	1.952	0.200

na：未经分析·测定

                                        表29

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							24	41.4	0.102	0.144	0.265	0.417	0.015
25	34.3	0.042	0.081	0.167	0.429	0.024
							26	34.6	0.023	0.043	na	na	na
27	41.4	0.082	0.116	0.232	0.385	0.019
							28	37.7	0.046	0.076	0.254	0.429	0.018
29	36.1	0.032	0.057	0.151	0.235	0.042
							30	97.2	0.052	0.002	0.208	0.088	0.004
31	93.0	0.038	0.003	0.347	0.137	0.007
							32	98.2	0.101	0.002	0.339	0.258	0.029
33	91.3	0.039	0.004	na	na	na
							34	91.9	0.041	0.004	0.332	0.120	0.007
35	96.8	0.052	0.002	na	na	na
							36	96.7	0.084	0.003	0.342	0.168	0.010
37	88.0	0.014	0.002	0.076	1.000	0.029
							38	84.5	0.016	0.003	0.074	1.121	0.025

na：未经分析·测定

实施例27.Lavande中来源于三色堇的F3’5’H基因(#40)与来源于赛亚麻DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

从赛亚麻(Nierembergia hybrida)品种Fairy Bell Patio LightBlue(三得利花卉株式会社)的花瓣中得到RNA，再配制polyA⁺RNA。用此polyA⁺RNA，以λZAPII(Stratagene公司)为载体，使用cDNA文库合成试剂盒(Stratagene公司)，并用制造者推荐的方法构建cDNA文库。此cDNA文库使用DIG标记了的矮牵牛DFR cDNA(来源于pCGP1405)筛选。

筛选的条件用DIG标记系统并遵循了制造者推荐的噬菌斑杂交法。预杂交及杂交缓冲液中的甲酰胺浓度为30％，于37℃杂交一夜。另外膜的清洗是在含有1％SDS的5xSSC中55℃时进行。从得到的大量阳性信号中的20噬菌斑回收质粒，使用反向引物(TaKaRa)确定碱基序列。其显示了以矮牵牛为主的其他植物DFR基因的同源性。确定了其中作为pSPB709的克隆的cDNA的全序列。所得碱基序列表示为序列号：11，且与其对应的氨基酸序列表示为序列号：12。

将pSPB580用BamHI和XhoI酶切后得到的约3.9kb的DNA片段，与把pSPB709用BamHI和XhoI酶切后所得的约1.5kb的DNA片段连接，所得质粒为pSPB910。将pSPB905用AscI酶切、进行脱磷处理后，与把pSPB910用AscI酶切后所得的约2.5kb的DNA片段连接，得到与nptII基因同向转录赛亚麻DFR基因的质粒，作为pSPB920(图9)。因本质粒在蔷薇中转录来源于赛亚麻的DFR基因和来源于三色堇的F3’5’H #40基因，所以期待通过双链RNA的转录抑制蔷薇DFR基因的表达。将此质粒导入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ag10株。

将pSPB920(图9)导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，获得56个转化体。并确认了进行色素分析的24个中23个积累了花翠素(表30)。花翠素含有率最高达100％(平均为43％)。花色从RHS色谱标准186c(GREYED-PURPLE GROUP)向85b(VIOLET GROUP)变化。

                                          表30

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
							1	69.5	0.025	0.002	0.081	2.265	0.066
2	85.4	0.024	0.004	0.114	1.355	0.032
							3	71.8	0.006	0.002	0.043	0.781	0.027
4	100.0	0.012	0.000	0.414	0.283	0.030
							5	88.2	0.015	0.002	0.506	0.126	0.030
6	100.0	0.013	0.000	0.430	0.123	0.008
							7	33.3	0.019	0.038	na	na	na
8	37.3	0.012	0.020	na	na	na
							9	48.2	0.012	0.013	na	na	na
10	18.9	0.011	0.049	0.053	1.023	0.022
							11	39.7	0.037	0.056	0.120	1.157	0.035
12	9.4	0.010	0.095	na	na	na
							13	11.0	0.008	0.062	na	na	na
14	24.4	0.017	0.054	0.128	1.852	0.181
							15	12.4	0.015	0.102	na	na	na
16	89.7	0.089	0.010	0.530	1.424	0.165
							17	15.4	0.006	0.035	na	na	na
18	22.3	0.006	0.019	0.018	1.286	0.038
							19	10.4	0.007	0.058	0.039	1.673	0.045
20	28.3	0.006	0.015	0.028	0.932	0.025
							21	35.2	0.015	0.028	0.105	0.743	0.028
22	16.0	0.010	0.052	na	na	na
							23	0.0	0.000	0.018	0.013	1.764	0.027
24	13.7	0.007	0.042	0.033	1.469	0.041

na：未经分析·测定

实施例28.向后代的性状遗传

将pSPB919(图8)导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，把得到的转化体(LA/919-2-13)作为父本(花粉)，使用非重组体WKS77或WKS133作为母本进行杂交(铃木省三，《蔷薇、花图谱》，小学馆，p.256-260、1990)。授粉后第100天收获果实。播种时，首先去除果实采收瘦果，再剥开瘦果取出胚后，于培养皿内的湿润滤纸上置床。播种时的水，使用在灭菌水中添加了PPM^TM(P1ant Preservative Mixture，PLANT CELLTECHNOLOGY，INC.)1ml/l、卡那霉素50mg/l的产物，只将正常发芽的种子上盆，进行育苗。

确认了所得转化体后代中，进行色素分析的40个全部积累了花翠素(表31及表32)。花翠素含有率最高达99％(平均为46％)。

                                        表31

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)
						1	89.8	0.494	0.056	0.000	0.000
2	96.1	3.900	0.153	0.005	0.000
						3	55.9	0.836	0.660	0.000	0.000
4	24.6	0.041	0.127	0.000	0.000
						5	23.5	1.108	3.605	0.009	0.002
6	25.9	0.191	0.545	0.003	0.000
						7	0.5	0.013	2.552	0.012	0.002
8	75.8	0.283	0.090	0.000	0.000
						9	95.9	1.420	0.061	0.000	0.000
10	30.8	0.862	1.841	0.007	0.105
						11	13.3	0.068	0.441	0.004	0.000
12	23.9	0.529	1.667	0.023	0.000
						12	43.7	0.280	0.362	0.000	0.000
14	19.3	0.035	0.145	0.000	0.000
						15	0.6	0.008	1.418	0.021	0.000
16	20.8	0.048	0.183	0.000	0.000
						17	92.5	2.257	0.177	0.007	0.000
18	66.4	2.496	1.247	0.015	0.000
						19	42.4	0.369	0.497	0.004	0.000
20	75.6	0.597	0.183	0.010	0.000
						21	19.6	0.271	1.103	0.008	0.000
22	71.0	0.107	0.044	0.000	0.000
						23	0.6	0.006	0.850	0.004	0.000

                                     表32

个体编号	Del含有率(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	Peo(mg/g)
						24	16.7	0.053	0.263	0.000	0.000
25	71.8	0.211	0.083	0.000	0.000
						26	18.6	0.177	0.769	0.003	0.000
27	1.3	0.009	0.652	0.004	0.000
						28	59.7	0.183	0.124	0.000	0.000
29	39.6	0.124	0.187	0.003	0.000
						30	21.4	0.187	0.684	0.003	0.000
31	0.6	0.005	0.763	0.004	0.000
						32	38.8	0.226	0.353	0.003	0.000
33	50.5	0.154	0.151	0.000	0.000
						34	28.0	0.267	0.682	0.003	0.000
35	83.9	0.204	0.039	0.000	0.000
						36	64.9	0.380	0.205	0.000	0.000
37	78.8	0.239	0.064	0.000	0.000
						38	97.4	0.614	0.016	0.000	0.000
39	98.7	0.805	0.011	0.000	0.000
						40	54.9	0.083	0.068	0.000	0.000

实施例29.WKS140中来源于三色堇的F3’5’H#40基因与来源于鸢尾DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

将pSPB919导入藤色系蔷薇品种“WKS140”，得到89个转化体。确认了进行色素分析的79个中7 4个积累了花翠素。花翠素含有率最高达100％(平均为68％)。花色从RHS色谱标准186d(GREYED-PURPLE GROUP)主要向84c(VIOLET GROUP)变化。

                                    表33

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
					1	0.0％	0.0000	0.0423	0.0000
2	89.9％	0.0242	0.0027	na
					3	90.0％	0.0245	0.0027	na
4	88.6％	0.0093	0.0012	na
					5	43.5％	0.0042	0.0054	na
6	91.2％	0.0118	0.0011	na
					7	81.2％	0.0027	0.0006	na
8	81.0％	0.0173	0.0041	na
					9	73.9％	0.0733	0.0259	na
10	62.9％	0.0321	0.0190	na
					11	91.9％	0.0962	0.0084	na
12	99.1％	0.1606	0.0015	na
					13	94.7％	0.0588	0.0033	na
14	100.0％	0.0839	0.0000	na
					15	0.0％	0.0000	0.0005	na
16	98.4％	0.0296	0.0005	na
					17	80.4％	0.1748	0.0451	na
18	94.6％	0.0190	0.0000	na
					19	0.0％	0.0000	0.0714	na
20	34.3％	0.0099	0.0191	na
					21	30.9％	0.0126	0.0282	na
22	65.6％	0.0294	0.0154	na
					23	24.1％	0.0205	0.0646	na

na：未经分析·测定

实施例30.WKS77中来源于三色堇的F3’5’H#40基因与来源于鸢尾DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

将pSPB919导入深红紫色系蔷薇品种“WKS77”，得到50个转化体。并确认了进行色素分析的23个中21个积累了花翠素。花翠素含有率最高达81％(平均为19％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLE GROUP)向77b(PURPLE GROUP)变化。

                                        表34

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
					1	26.0％	1.2028	3.4033	0.0117
2	41.5％	0.6473	0.9093	0.0048
					3	80.8％	0.2210	0.0526	na
4	68.0％	0.1865	0.0878	na
					5	68.5％	0.2090	0.0951	0.0010
6	1.5％	0.0119	0.7731	0.0051
					7	1.5％	0.0114	0.7304	0.0041
8	0.2％	0.0069	2.9266	0.0063
					9	0.2％	0.0017	1.0791	0.0062
10	0.0％	0.0000	0.5013	0.0043
					11	0.1％	0.0028	2.3418	0.0110
12	0.4％	0.0091	2.4603	0.0126
					13	0.2％	0.0040	1.7766	0.0096
14	0.3％	0.0026	0.9046	0.0052
					15	0.0％	0.0000	1.6063	0.0100
16	22.2％	0.3279	1.1392	0.0049
					17	24.0％	0.2638	0.8288	0.0052
18	1.4％	0.0240	1.6777	0.0118
					19	1.1％	0.0186	1.6352	0.0101
20	26.7％	0.2645	0.7230	0.0037
					21	22.7％	0.2200	0.7460	0.0046
22	40.1％	0.8929	1.3374	0.0071

na：未经分析·测定

实施例31.WKS77中来源于三色堇的F3’5’H#40基因与来源于赛亚麻DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

将pSPB920导入深红紫色系蔷薇“WKS77”，得到30个转化体。并确认了进行色素分析的27个中26个积累了花翠素。花翠素含有率最高达98％(平均为60％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLE GROUP)向77b(PURPLE GROUP)变化。

                                          表35

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
					1	93.9％	0.1679	0.0110	0.0000
2	97.6％	0.2311	0.0058	na
					3	96.3％	0.1684	0.0065	na
4	97.1％	0.1012	0.0017	na
					5	9.6％	0.0946	0.7810	0.1104
6	21.9％	0.1462	0.5166	0.0034
					7	12.7％	0.1097	0.7495	0.0049
8	97.9％	0.1942	0.0042	na
					9	98.1％	0.1228	0.0024	na
10	3.2％	0.0360	1.0689	0.0035
					11	3.1％	0.0267	0.9587	0.0032
12	4.8％	0.1138	2.2562	0.0049
					13	6.2％	0.1066	1.5999	0.0080
14	96.5％	0.3541	0.0132	na
					15	2.1％	0.0173	0.7852	0.0068
16	94.7％	0.2898	0.0160	0.0000
					17	96.7％	0.0819	0.0020	0.0000
18	95.8％	0.6969	0.0309	na
					19	96.4％	0.4868	0.0181	na
20	64.3％	0.3092	0.1724	na
					21	26.9％	0.2740	0.7431	0.0025
22	19.9％	0.3760	1.5028	0.0071
					23	88.2％	0.0316	0.0042	na
24	94.2％	0.0259	0.0016	na
					25	90.4％	0.0481	0.0051	na

na：未经分析·测定

实施例32.WKS77中来源于三色堇的F3’5’H#40基因与来源于矮牵牛DFR基因的表达和蔷薇内源性DFR基因的抑制

将pSPB921导入深红紫色系蔷薇“WKS77”，得到15个转化体。并确认了进行色素分析的13个中12个积累了花翠素。花翠素含有率最高达98％(平均为60％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLE GROUP)向72b(RED-PURPLE GROUP)变化。

                                        表36

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
					1	90.0％	0.0549	0.0061	na
2	38.4％	0.3397	0.5402	0.0041
					3	56.9％	0.7834	0.5824	0.0099
4	58.5％	0.0196	0.0139	na
					5	90.3％	0.1336	0.0144	na
6	90.9％	0.1251	0.0126	na
					7	86.7％	0.1771	0.0274	na
8	91.6％	0.0113	0.0010	na
					9	97.5％	0.0864	0.0022	na
10	9.5％	0.2687	2.6591	0.0000
					11	8.8％	0.1421	1.4598	0.0071
12	0.4％	0.0060	1.3554	0.0053

na：未经分析·测定

实施例33.向后代的性状遗传

将pSPB919导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，将所得转化体(LA/919-4-10)作为父本(花粉)，使用非重组体蔷薇的品种BlackBaccara作为母本与实施例28同法进行杂交。授粉后第100天收获果实。播种时，首先去除果实采收瘦果，再剥开瘦果取出胚后，于培养皿内的湿润滤纸上置床。播种时的水，使用在灭菌水中添加了PPM^TM(PlantPreservative Mixture，PLANT CELL TECHNOLOGY，INC.)1ml/l、卡那霉素50mg/l的产物，只将正常发芽的种子上盆，进行育苗。

确认了所得转化体的后代中，进行色素分析的18个全部积累了花翠素。花翠素含有率最高达99.8％(平均为98.7％)。

                                表37

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)
					1	97.8％	0.6633	0.0142	0.0009
2	99.0％	0.9002	0.0096	na
					3	98.5％	0.5385	0.0080	na
4	99.5％	2.0561	0.0087	0.0016
					5	99.8％	1.6556	0.0034	na
6	96.6％	0.5601	0.0200	na
					7	99.0％	0.6148	0.0063	na
8	98.9％	1.6867	0.0193	na
					9	95.0％	0.5740	0.0304	na
10	96.9％	0.1152	0.0036	na
					11	99.3％	0.0683	0.0005	na
12	99.6％	0.1248	0.0005	na
					13	99.5％	0.3574	0.0010	0.0000
14	99.6％	0.5500	0.0021	na
					15	99.6％	1.2322	0.0049	na
16	99.7％	1.4384	0.0042	na
					17	99.8％	0.5117	0.0010	na
18	98.3％	0.8073	0.0140	na

na：未经分析·测定

实施例34.WKS77中来源于三色堇的F3’5’H#40基因的表达和蔷薇内源性F3’H基因的抑制

将pSPB1106(图10)导入深红紫色系蔷薇品种“WKS77”，得到40个转化体。并确认了进行色素分析的26个中全部积累了花翠素。花翠素含有率最高达80.0％(平均为30.5％)。花色从RHS色谱标准57a(RED-PURPLE GROUP)向83d(VIOLET GROUP)变化。

                                               表38

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								1	68.7％	0.5497	0.2275	0.0241	na	na	na
2	78.8％	0.3449	0.0830	0.0096	na	na	na
								3	80.0％	0.6949	0.1604	0.0144	na	na	na
4	71.2％	0.4377	0.1563	0.0214	na	na	na
								5	72.7％	0.5260	0.1715	0.0266	0.3812	0.2275	1.7669
6	70.7％	0.3829	0.1449	0.0146	na	na	na
								7	10.3％	0.0358	0.3031	0.0071	na	na	na
8	15.6％	0.1847	0.9530	0.0444	na	na	na
								9	4.8％	0.0739	1.4586	0.0149	na	na	na
10	1.1％	0.0114	1.0411	0.0144	na	na	na
								11	54.0％	1.3206	1.1166	0.0092	na	na	na
12	57.8％	0.8842	0.6410	0.0056	na	na	na
								13	0.9％	0.0242	2.5500	0.0168	na	na	na
14	23.0％	0.2087	0.6909	0.0062	na	na	na
								15	12.7％	0.1645	1.1271	0.0058	na	na	na
16	26.4％	0.5275	1.4645	0.0132	na	na	na
								17	18.7％	0.3555	1.5310	0.0109	na	na	na
18	24.2％	0.4388	1.3687	0.0072	na	na	na
								19	64.7％	0.4029	0.1945	0.0249	0.6368	0.3949	2.0567
20	0.1％	0.0021	1.8646	0.0077	na	na	na
								21	0.0％	0.0000	0.9708	0.0062	na	na	na
22	0.1％	0.0022	2.6049	0.0127	na	na	na
								23	0.4％	0.0066	1.8002	0.0066	na	na	na
24	0.5％	0.0079	1.4670	0.0056	0.0000	1.3096	0.2414
								25	17.3％	0.1000	0.4671	0.0099	na	na	na
26	18.3％	0.1232	0.5418	0.0052	na	na	na

na：未经分析·测定

实施例35.Lavande中来源于三色堇的F3’5’H#40基因的表达和蔷薇内源性F3’H基因的抑制

将pSPB1106导入藤色系蔷薇品种“Lavande”，得到40个转化体。并确认了进行色素分析的25个中23个积累了花翠素。花翠素含有率最高达98.3％(平均为46.9％)。

                                           表39

个体编号	Del(％)	Del(mg/g)	Cya(mg/g)	Pel(mg/g)	M(mg/g)	Q(mg/g)	K(mg/g)
								1	76.8％	0.0732	0.0188	0.0032	0.5705	0.1595	0.3073
2	80.1％	0.1441	0.0296	0.0061	0.5298	0.1881	4.3294
								3	3.7％	0.0086	0.2174	0.0027	na	na	na
4	4.4％	0.0079	0.1691	0.0034	na	na	na
								5	8.8％	0.0158	0.1557	0.0070	na	na	na
6	39.0％	0.0212	0.0128	0.0204	0.0000	0.0363	1.3107
								7	44.4％	0.0089	0.0027	0.0084	0.0756	0.0573	1.3689
8	40.4％	0.0165	0.0071	0.0172	0.0365	0.0592	2.5211
								9	42.0％	0.0087	0.0036	0.0084	0.0752	0.0596	1.2661
10	13.5％	0.0153	0.0939	0.0040	0.1288	1.0594	0.5440
								11	81.6％	0.2252	0.0447	0.0061	0.3947	0.1401	0.3947
12	78.8％	0.1022	0.0239	0.0036	0.6700	0.2137	0.5847
								13	81.7％	0.2125	0.0438	0.0036	1.3616	0.4621	0.7478
14	80.9％	0.1829	0.0388	0.0044	0.4100	0.2405	0.0567
								15	70.9％	0.0664	0.0204	0.0069	0.4230	0.1221	0.1788
16	0.0％	0.0000	0.0844	0.0000	na	na	na
								17	98.0％	0.2363	0.0048	0.0000	0.0000	1.0613	0.2698
18	98.3％	0.1398	0.0025	0.0000	0.0479	0.7060	0.1299
								19	4.2％	0.0078	0.1724	0.0040	0.0000	0.8627	0.2075
20	0.0％	0.0000	0.1696	0.0043	na	na	na
								21	60.0％	0.0333	0.0115	0.0107	0.0000	0.0740	1.8678
22	14.3％	0.0091	0.0454	0.0088	0.1096	0.5305	0.6453
								23	15.1％	0.0082	0.0408	0.0053	na	na	na
24	17.6％	0.0082	0.0324	0.0059	na	na	na
								25	24.4％	0.0147	0.0375	0.0080	0.0000	0.2147	0.9765

na：未经分析·测定

以上可显示，由于导入的外源基因向后代传递，且其基因在后代中表达，使原本蔷薇花瓣中不存在的生成花翠素的性状得以向后代蔷薇传递。因此，使用本基因进行改变了花色的蔷薇的杂交育种，可育出含有蓝色、紫色的新型花色的蔷薇。

通过人为抑制蔷薇内源性的代谢途径的进程，例如二氢黄酮醇还原酶的表达，且使编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码来源于蔷薇以外的二氢黄酮醇还原酶的基因进行表达，可育出蓝色～紫色的蔷薇。并且还说明了因上述基因可向子代传达，所以蓝色蔷薇的性状可通过杂交来利用。

                                序列表

<110>Internatinal Flower Developments Proprietary Limited

<120>花色改变了的蔷薇的制造方法(Process for production of rose with altered color)

<130>P835

<160>21

<210>1

<211>1662

<212>DNA

<213>三色堇(Pansy)

<220>

<223>编码三色堇#18 F3’5’H的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding pansy#18 F3’5’H)

<400>1

gaattcggca cgagagccaa t atg gca att cca gtc act gac ctt gct gtc    51

                        Met Ala Ile Pro Val Thr Asp Leu Ala Val

                          1               5                  10

gcg gtt atc ctt ttc ttg atc act cgc ttc cta gtt cgt tct ctt ttc    99

Ala Val Ile Leu Phe Leu Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe

                 15                  20                  25

aag aaa cca acc gga ccg ctc ccg ccg ggt cct tca ggc tgg ccc ttg   147

Lys Lys Pro Thr Gly Pro Leu Pro Pro Gly Pro Ser Gly Trp Pro Leu

             30                  35                  40

gtg ggc gcg ctc cct ctc cta ggc gcc atg cct cac gtc aca cta gcc   195

Val Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Ala Met Pro His Val Thr Leu Ala

         45                  50                  55

aac ctc gct aaa aaa tac ggt ccg atc atg tac cta aaa atg ggc acg   243

Asn Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr

     60                  65                  70

tgc gac atg gtg gtc gcg tcc act ccc gac tcg gct cga gcc ttc ctc   291

Cys Asp Met Val Val Ala Ser Thr Pro Asp Ser Ala Arg Ala Phe Leu

 75                  80                  85                  90

aaa acc cta gac ctc aac ttc tcc gac cgc ccg ccc aac gcc ggc gcc   339

Lys Thr Leu Asp Leu Asn Phe Ser Asp Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala

                 95                 100                 105

acc cat ttg gcg tac ggc gcg cag gac ttg gtc ttc gcg aag tac ggt   387

Thr His Leu Ala Tyr Gly Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly

            110                 115                 120

cca agg tgg aag acc cta aga aaa ttg agc aac ctc cac atg cta ggc   435

Pro Arg Trp Lys Thr Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly

        125                 130                 135

ggg aag gcg ctg gac gat tgg gct cac gtg agg gct aac gag cta ggc   483

Gly Lys Ala Leu Asp Asp Trp Ala His Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly

    140                 145                 150

cac atg ctt aac gcc atg tgc gag gcg agc cgg tgc gga gag ccc gtg   531

His Met Leu Asn Ala Met Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val

155                 160                 165                 170

gtg ctg gcc gag atg ctc acg tac gcc atg gcc aac atg atc ggt caa   579

Val Leu Ala Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln

                175                 180                 185

gtg ata ctg agt cgg cgc gtg ttc gtc acc aaa ggg aca gag tcg aac   627

Val Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn

            190                 195                 200

gag ttc aaa gat atg gtg gtc gag ttg atg act tcc gcg ggg tat ttc   675

Glu Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe

        205                 210                 215

aac att ggt gac ttc ata ccg tcg att gct tgg atg gat ttg caa ggg   723

Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly

    220                 225                 230

atc gag cga ggg atg aag aaa ttg cac acg aaa ttc gat gtt ttg ttg   771

Ile Glu Arg Gly Met Lys Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu

235                 240                 245                 250

acg aag atg atg aag gag cac aga gcg acg agt cat gag cgc gaa ggg   819

Thr Lys Met Met Lys Glu His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Glu Gly

                255                 260                 265

aaa tcg gat ttc ctc gac gtc ctc ttg gaa gaa tgc gag aat aca aat   867

Lys Ser Asp Phe Leu Asp Val Leu Leu Glu Glu Cys Glu Asn Thr Asn

            270                 275                 280

ggc gag aag ctt aat gtt acc aac gtc aaa gct gtc ctc ttg aac tta   915

Gly Glu Lys Leu Asn Val Thr Asn Val Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu

        285                 290                 295

ttc acg gcg ggt acg gac aca tct tca agc ata atc gaa tgg gcg tta     963

Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu

    300                 305                 310

acc gaa atg atg aag aat ccg acg atc tta aaa aag acc caa gaa gag    1011

Thr Glu Met Met Lys Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Thr Gln Glu Glu

315                 320                 325                 330

atg gat cga gtc atc ggt cgc gat cgg aga ttg ctc gaa tcc gac gtt    1059

Met Asp Arg Val Ile Gly Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Val

                335                 340                 345

tcg aaa ctc ccg tat tta caa gcc ata gcg aaa gaa aca tat cgt aaa    1107

Ser Lys Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys

            350                 355                 360

cac cca tcg aca cct cta aac ctg ccg agg att gcg atc caa gca tgt    1155

His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys

        365                 370                 375

gaa gtt gat ggc tac tac atc ccc aaa gac acg agg ctt agc gtc aac    1203

Glu Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asp Thr Arg Leu Ser Val Asn

    380                 385                 390

att tgg gcg atc ggt cgg gac cca agt gtt tgg gag aat cca tcg gag    1251

Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Ser Val Trp Glu Asn Pro Ser Glu

395                 400                 405                 410

ttc tcg cct gaa aga ttc ttg tct gag gag aat ggg aag atc agt cca    1299

Phe Ser Pro Glu Arg Phe Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Ser Pro

                415                 420                 425

ggc ggg aat gat ttt gag ctg att ccg ttt gga gca ggg agg aga att    1347

Gly Gly Asn Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile

            430                 435                 440

tgt gct ggg aca agg atg gga atg gtc ctt gta agt tat att ttg ggc    1395

Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly

        445                 450                 455

act ttg gtc cat tct ttt gat tgg aaa tta cca aat ggg gtc agt gag    1443

Thr Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Glu

    460                 465                 470

att aac atg gat gag agt ttt ggg ctt gcg ttg caa aag gcc gtg cct    1491

Ile Asn Met Asp Glu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro

475                 480                 485                 490

ctc tcg gct acg gtc agt cca cga ttg gcc cca agc gcg tac gtt ata     1539

Leu Ser Ala Thr Val Ser Pro Arg Leu Ala Pro Ser Ala Tyr Val Ile

                495                 500                 505

tgagctgatg ggctgggcct gagcccaaac atattgggtg tgttttatct gtaattttta   1599

atattataaa gttcgtaatt ttgtatttat ggttaattat gagttaaaaa aaaaaaaaaa   1659

aaa                                                                 1662

<210>2

<211>506

<212>PRT

<213>三色堇(Pansy)

<220>

<223>三色堇#18 F3’5’H的氨基酸序列(Amino acid sequence of pansy #18 F3’5’H)

<400>2

Met Ala Ile Pro Val Thr Asp Leu Ala Val Ala Val Ile Leu Phe Leu

  1               5                  10                  15

Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Gly Pro

             20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Ser Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu

         35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Thr Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Tyr

     50                  55                  60

Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala

 65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Asp Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                 85                  90                  95

Phe Ser Asp Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Thr His Leu Ala Tyr Gly

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp

    130                 135                 140

Trp Ala His Val Arg Ala Asn Glu Leu Gly His Met Leu Asn Ala Met

145                 150                 155                 160

Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg

            180                 185                 190

Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        195                 200                 205

Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    210                 215                 220

Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys

225                 230                 235                 240

Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Met Lys Glu

                245                 250                 255

His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Glu Gly Lys Ser Asp Phe Leu Asp

            260                 265                 270

Val Leu Leu Glu Glu Cys Glu Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Asn Val

        275                 280                 285

Thr Asn Val Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

    290                 295                 300

Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Met Lys Asn

305                 310                 315                 320

Pro Thr Ile Leu Lys Lys Thr Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly

                325                 330                 335

Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Val Ser Lys Leu Pro Tyr Leu

            340                 345                 350

Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

        355                 360                 365

Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr

    370                 375                 380

Ile Pro Lys Asp Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

385                 390                 395                 400

Asp Pro Ser Val Trp Glu Asn Pro Ser Glu Phe Ser Pro Glu Arg Phe

                405                 410                 415

Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Ser Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu

            420                 425                 430

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        435                 440                 445

Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe

    450                 455                 460

Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Glu Ile Asn Met Asp Glu Ser

465                 470                 475                 480

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Thr Val Ser

                485                 490                 495

Pro Arg Leu Ala Pro Ser Ala Tyr Val Ile

            500                 505

<210>3

<211>1795

<212>DNA

<213>三色堇(Pansy)

<220>

<223>编码三色堇#40 F3’5’H的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding pansy #40 F3’5’H)

<400>3

gaattcggca cgaggacaac atg gca att cta gtc acc gac ttc gtt gtc       50

                      Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val

                        1               5                  10

gcg gct ata att ttc ttg atc act cgg ttc tta gtt cgt tct ctt ttc     98

Ala Ala Ile Ile Phe Leu Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe

                 15                  20                  25

aag aaa cca acc cga ccg ctc ccc ccg ggt cct ctc ggt tgg ccc ttg    146

Lys Lys Pro Thr Arg Pro Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu

             30                  35                  40

gtg ggc gcc ctc cct ctc cta ggc gcc atg cct cac gtc gca cta gcc    194

Val Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala

         45                  50                  55

aaa ctc gct aag aag tat ggt ccg atc atg cac cta aaa atg ggc acg    242

Lys Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr

     60                  65                  70

tgc gac atg gtg gtc gcg tcc acc ccc gag tcg gct cga gcc ttc ctc    290

Cys Asp Met Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu

 75                  80                  85                  90

aaa acg cta gac ctc aac ttc tcc aac cgn cca ccc aac gcg ggc gca    338

Lys Thr Leu Asp Leu Asn Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala

                 95                 100                 105

tcc cac cta gcg tac ggc gcg cag gac tta gtc ttc gcc aag tac ggt    386

Ser His Leu Ala Tyr Gly Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly

            110                 115                 120

ccg agg tgg aag act tta aga aaa ttg agc aac ctc cac atg cta ggc    434

Pro Arg Trp Lys Thr Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly

        125                 130                 135

ggg aag gcg ttg gat gat tgg gca aat gtg agg gtc acc gag cta ggc    482

Gly Lys Ala Leu Asp Asp Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly

    140                 145                 150

cac atg ctt aaa gcc atg tgc gag gcg agc cgg tgc ggg gag ccc gtg    530

His Met Leu Lys Ala Met Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val

155                 160                 165                 170

gtg ctg gcc gag atg ctc acg tac gcc atg gcg aac atg atc ggt caa    578

Val Leu Ala Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln

                175                 180                 180

gtg ata ctc agc cgg cgc gtg ttc gtg acc aaa ggg acc gag tct aac    626

Val Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn

            185                 190                 195

gag ttc aaa gac atg gtg gtc gag ttg atg acg tcc gcc ggg tac ttc    674

Glu Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe

        200                 205                 210

aac atc ggt gac ttc ata ccc tcg atc gct tgg atg gat ttg caa ggg    722

Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly

    215                 220                 225

atc gag cga ggg atg aag aag ctg cac acg aag ttt gat gtg tta ttg    770

Ile Glu Arg Gly Met Lys Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu

230                 235                 240                 245

acg aag atg gtg aag gag cat aga gcg acg agt cat gag cgc aaa ggg    818

Thr Lys Met Val Lys Glu His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly

                250                 255                 260

aag gca gat ttc ctc gac gtt ctc ttg gaa gaa tgc gac aat aca aat    866

Lys Ala Asp Phe Leu Asp Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn

            265                 270                 275

ggg gag aag ctt agt att acc aat atc aaa gct gtc ctt ttg aat cta    914

Gly Glu Lys Leu Ser Ile Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu

        280                 285                 290

ttc acg gcg ggc acg gac aca tct tcg agc ata atc gaa tgg gcg tta    962

Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu

    295                 300                 305

acg gag atg atc aag aat ccg acg atc tta aaa aag gcg caa gag gag    1010

Thr Glu Met Ile Lys Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu

310                 315                 320                 325

atg gat cga gtc atc ggt cgt gat cgg agg ctg ctc gaa tcg gac ata    1058

Met Asp Arg Val Ile Gly Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile

                330                 335                 340

tcg agc ctc ccg tac cta caa gcc att gct aaa gaa acg tat cgc aaa    1106

Ser Ser Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys

            345                 350                 355

cac ccg tcg acg cct ctc aac ttg ccg agg att gcg atc caa gca tgt    1154

His Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys

        360                 365                 370

gaa gtt gat ggc tac tac atc cct aag gac gcg agg ctt agc gtg aac    1202

Glu Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn

    375                 380                 385

att tgg gcg atc ggt cgg gac ccg aat gtt tgg gag aat ccg ttg gag    1250

Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu

390                 395                 400                 405

ttc ttg ccg gaa aga ttc ttg tct gaa gag aat ggg aag atc aat ccc    1298

Phe Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Asn Pro

                410                 415                 420

ggt ggg aat gat ttt aag ctg att ccg ttt gga gcc ggg agg aga att    1346

Gly Gly Asn Asp Phe Lys Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile

            425                 430                 435

tgt gcg ggg aca agg atg gga atg gtc ctt gta agt tat att ttg ggc    1394

Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly

        440                 445                 450

act ttg gtc cat tct ttt gat tgg aaa tta cca aat ggt gtc gct gag    1442

Thr Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu

    455                 460                 465

ctt aat atg gat gaa agt ttt ggg ctt gca ttg caa aag gcc gtg ccg    1490

Leu Asn Met Asp Glu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro

470                 475                 480                 485

ctc tcg gcc ttg gtc agc cca cgg ttg gcc tca aac ccg tac gca acc    1538

Leu Ser Ala Leu Val Ser Pro Arg Leu Ala Ser Asn Pro Tyr Ala Thr

                490                 495                 500

tgagctaatg ggctgggcct agttttgtgg gccctaattt agagactttt gtgttttaag  1598

gtgtgtactt tattaattgg gtgcttaaat gtgtgtttta atttgtattt atggttaatt  1658

atgactttat tgtataatta tttatttttc ccttctgggt attttatcca tttaattttt  1718

cttcagaatt atgatcatag ttatcagaat aaaattgaaa ataatgaatc ggaaaaaaaa  1778

aaaaaaaaaa aaaaaaa                                                 1795

<210>4

<211>501

<212>PRT

<213>三色堇(Pansy)

<220>

<223>三色堇#40 F3’5’H的氨基酸序列(Amino acid sequence of pansy #40 F3’5’H)

<400>4

Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Leu

  1               5                  10                  15

Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro

             20                  25                  30

Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu

         35                  40                  45

Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr

     50                  55                  60

Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala

 65                  70                  75                  80

Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn

                 85                  90                  95

Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly

            100                 105                 110

Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu

        115                 120                 125

Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp

    130                 135                 140

Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met

145                 150                 155                 160

Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu

                165                 170                 175

Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg

            180                 180                 185

Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val

        190                 195                 200

Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile

    205                 210                 215

Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys

220                 225                 230                 235

Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val Lys Glu

                240                 245                 250

His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe Leu Asp

            255                 260                 265

Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Ser Ile

        270                 275                 280

Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp

    285                 290                 295

Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile Lys Asn

300                 305                 310                 315

Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly

                320                 325                 330

Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Ser Ser Leu Pro Tyr Leu

            335                 340                 345

Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu

        350                 355                 360

Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr

    365                 370                 375

Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg

380                 385                 390                 395

Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Leu Pro Glu Arg Phe

                400                 405                 410

Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Asn Pro Gly Gly Asn Asp Phe Lys

            415                 420                 425

Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met

        430                 435                 440

Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe

    445                 450                 455

Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu Asn Met Asp Glu Ser

460                 465                 470                 475

Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser

                480                 485                 490

Pro Arg Leu Ala Ser Asn Pro Tyr Ala Thr

            495                 500

<210>5

<211>1474

<212>DNA

<213>蔷薇(Rose)

<220>

<223>编码蔷薇查耳酮合酶的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding rose chalcone synthase)

<400>5

ggagatatca aaatggtgac cgtcgaggaa gtccgcaagg ctcaacgcgc tgagggtccg    60

gctaccgtcc tggccatcgg gacagcaact cctcccaact gtattgacca gagcacatac   120

cccgactact acttccgtat cactaagagc gagcacaagg ctgagctcaa ggagaaattc   180

cagcgcatgt gtgacaaatc tatgatcaag aagcgctaca tgtacttgac cgaagaaatt   240

cttaaggaga atcctagtat gtgtgagtac atggcccctt cacttgatgc aagacaagat   300

atggtggttg ttgaaattcc aaagcttgga aaagaggctg ccactaaggc tattaaggaa   360

tggggtcagc ccaagtccaa aatcacccac ttggtctttt gtaccactag tggcgtcgac   420

atgcccgggg ccgattacca gctcactaag ctcttaggcc tccgcccgtc cgtgaagcgt   480

ctcatgatgt accaacaagg gtgtttcgcc ggaggcacgg tgctccggtt ggctaaggac   540

ttggccgaga acaacaaggg tgcacgtgtt cttgttgttt gctcagagat cactgccgtg   600

actttccgtg ggcctagcga cacccatctc gatagtcttg tgggccaagc cttgttcggt   660

gatggtgctg cggccattat tgttggggcc gacccattgc ccgaggttga gaagccttcg   720

ttcgagttgg tctcggcagc ccaaactatc cttcctgaca gtgacggagc catcgacggg   780

catcttcgtg aagttgggct cacatttcac ctcctcaaag atgttcccgg gctgatttca   840

aagaacatcg agaagagcct caacgaggcc ttcaaacctt tgaacatcac agactggaac   900

tcacttttct ggattgcaca cccgggtggc cctgcaattt tagaccaagt agaggctaaa   960

ttgggcctga agcccgaaaa gttagaagcc acaaggcata tattatccga gtacggcaat  1020

atgtctagtg cttgtgtgtt gtttattttg gacgaggtgc ggagaaagtc tgcagctaat  1080

gggcacaaga ccactggaga aggcctggag tggggtgtcc tatttggttt tgggccaggg  1140

ctcaccgtcg agaccgtcgt gcttcacagt gtggctgctt aaacttgaag gcatctgggt  1200

tcacttgagt gatctgctcc tggatttgtt cttatatatg tatcgtttcc actctacttt  1260

ccttgttaga tttccttttt tggatttatt tttctggtga atttagcaat atatgtaatg  1320

atgaataata ttattccaca aatttcatac gagcaaaagt tcctgcaata atttagttag  1380

aagttgactt tccggaagat ttagagcggg gaatatatct cccactagct gaaagattat  1440

ccggggatag agtacgttca aaaaaaaaaa aaaa                              1474

<210>6

<211>420

<212>DNA

<213>蔷薇(Rose)

<220>

<223>编码部分蔷薇花色素合成酶的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding part of rose anthocyanidin synthase)

<400>6

gaagaaggga ggctggagaa ggaggtcggt ggactcgaag aactcgtcct gcaaatgaaa     60

atcaactact acccaaaatg ccctcagccg gaacttgccc tcggcgtgga agcccacacc    120

gacataagtg cactcacctt catcctccac aacatggttc ccggcctgca gctcttctac    180

ggcggcaaat gggtgacagc gaaatgcgtg cccaactcca tcgtcatgca catcggcgac    240

aacttggaga ttctgagcaa cggcaagtac aagagcattt ttcacagggg ggattgtcaa    300

caagggagaa ggtgaggttc tcgttggcgg ttttcttgta gccacccagg aggaggtcat    360

tctcaagccg ttgcgacgac tgtctcgagg aggaaccgcg tcttccaccc gacttttcgg    420

<210>7

<211>1808

<212>DNA

<213>蓝猪耳(Torenia)

<220>

<223>编码蓝猪耳花色素苷酰基转移酶的核苷酸序列(Nucleotide sequence encodingTorenia anthocyanin acyl trans ferase)

<400>7

cttcaaagcc aaaaagaaac aattaatca atg gct gtt gaa gcc ccc aaa aca     53

                                Met Ala Val Glu Ala Pro Lys Thr

                                  1               5

ata tgt gca gtc ctc gaa aac tct ctt att aca cca caa agt acc gat    101

Ile Cys Ala Val Leu Glu Asn Ser Leu Ile Thr Pro Gln Ser Thr Asp

     10                  15                  20

aca gaa caa act ctt tca ctc aca ttc ttt gac atc aaa tgg gtt cat    149

Thr Glu Gln Thr Leu Ser Leu Thr Phe Phe Asp Ile Lys Trp Val His

 25                  30                  35                  40

ttt cat cca atg caa tgc ctt gtg ttg tac aac ttc cca tgt tct aag    197

Phe His Pro Met Gln Cys Leu Val Leu Tyr Asn Phe Pro Cys Ser Lys

                 45                  50                  55

tca cat ttt ctc gaa gcc aca gtt ccg agc ttc aaa tca tca ctc tcc    245

Ser His Phe Leu Glu Ala Thr Val Pro Ser Phe Lys Ser Ser Leu Ser

             60                  65                  70

aaa act ctc aga cac tat ctt cca tta tca gga aac tta tac tat cca    293

Lys Thr Leu Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Tyr Pro

         75                  80                  85

aac ccg acc cat gac atg gat gat gat gaa tcg aac atg ccc gag atc    341

Asn Pro Thr His Asp Met Asp Asp Asp Glu Ser Asn Met Pro Glu Ile

     90                  95                 100

cgt tat aaa cct ggc gac tcg gtt tct cta acc gtt gca gag tac ttc    389

Arg Tyr Lys Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Val Ala Glu Tyr Phe

105                 110                 115                 120

tcc ggt cat gaa gac aat acg act act gaa gaa tac ttc aat tac ctc    437

Ser Gly His Glu Asp Asn Thr Thr Thr Glu Glu Tyr Phe Asn Tyr Leu

                125                 130                 135

act gga aat ttc cag aga gat tgc gat caa ttc tat gat ctc tta ccc    485

Thr Gly Asn Phe Gln Arg Asp Cys Asp Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Pro

            140                 145                 150

gat ttt cga gac ccg gaa acc gaa tcc aat tgc aca gta atc cca ctt    533

Asp Phe Arg Asp Pro Glu Thr Glu Ser Asn Cys Thr Val Ile Pro Leu

        155                 160                 165

ata gca gtt caa atc aca ctc ttt cca ggt gct ggg ata tgt ctg ggg    581

Ile Ala Val Gln Ile Thr Leu Phe Pro Gly Ala Gly Ile Cys Leu Gly

    170                 175                 180

gtc atc aac agt cac gta gtt gge gat gcg agt tcc ata gtg gga ttc    629

Val Ile Asn Ser His Val Val Gly Asp Ala Ser Ser Ile Val Gly Phe

185                 190                 195                 200

atc aaa gct tgg agt aaa gtt gca atg tat gaa gac gat gaa gag att    677

Ile Lys Ala Trp Ser Lys Val Ala Met Tyr Glu Asp Asp Glu Glu Ile

                205                 210                 215

cta gct aac aac aat ttg att cca tct tat gac aga tca gtc gtg aaa    725

Leu Ala Asn Asn Asn Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Arg Ser Val Val Lys

            220                 225                 230

gat cca aaa ggg atc aaa tct ttg ctc tgg aac aag atg aag aac gtg     773

Asp Pro Lys Gly Ile Lys Ser Leu Leu Trp Asn Lys Met Lys Asn Val

        235                 240                 245

aaa tat caa ccc caa ccc gca aaa cat ctc cca aca aac aag gtc cga     821

Lys Tyr Gln Pro Gln Pro Ala Lys His Leu Pro Thr Asn Lys Val Arg

    250                 255                 260

gcc aca tac acc ttg aga aag aac gat atc gag agg ctg aaa acc cga     869

Ala Thr Tyr Thr Leu Arg Lys Asn Asp Ile Glu Arg Leu Lys Thr Arg

265                 270                 275                 280

atc cga tcc aag aaa cca ggc aca acc tgc tta tca tct ttc aca atc     917

Ile Arg Ser Lys Lys Pro Gly Thr Thr Cys Leu Ser Ser Phe Thr Ile

                285                 290                 295

gca aca gcc tat gct tgg aca tgc ctt gca aaa tct gca gca gaa gct     965

Ala Thr Ala Tyr Ala Trp Thr Cys Leu Ala Lys Ser Ala Ala Glu Ala

            300                 305                 310

gaa gaa caa gta gtc caa gac agt gac gac gag cac ttg ctc atg ccc    1013

Glu Glu Gln Val Val Gln Asp Ser Asp Asp Glu His Leu Leu Met Pro

        315                 320                 325

gtt gat ttg aga cca aga ata gat cct cca tta cca cct tct tac ttt    1061

Val Asp Leu Arg Pro Arg Ile Asp Pro Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Phe

    330                 335                 340

gga aac tgc gtt ctt cca tct ttt gcg aaa acg acg cat ggg ctt ttg    1109

Gly Asn Cys VaI Leu Pro Ser Phe Ala Lys Thr Thr His Gly Leu Leu

345                 350                 355                 360

aaa gga gag tta ggg ctt ttt aat gca gtg gaa gtg att agt gat gtc    1157

Lys Gly Glu Leu Gly Leu Phe Asn Ala Val Glu Val Ile Ser Asp Val

                365                 370                 375

att acc ggt atc gtt agc aag aaa tat gac ttg ttc aaa gac tta gac    1205

Ile Thr Gly Ile Val Ser Lys Lys Tyr Asp Leu Phe Lys Asp Leu Asp

            380                 385                 390

aga caa ggt gag att ttt cgt gcc ttg ttc gga aaa cga gtg ttg gcg    1253

Arg Gln Gly Glu Ile Phe Arg Ala Leu Phe Gly Lys Arg Val Leu Ala

        395                 400                 405

atc atg ggt tcg cct aag ttc gat ctc tac gaa gtt gat ttc ggg tgg    1301

Ile Met Gly Ser Pro Lys Phe Asp Leu Tyr Glu Val Asp Phe Gly Trp

    410                 415                 420

ggt aag ccg aag aag att gaa cct gtg tcc att gat aga gag agg acg    1349

Gly Lys Pro Lys Lys Ile Glu Pro Val Ser Ile Asp Arg Glu Arg Thr

425                 430                 435                 440

act atg tgg att agc aag tct ggc gag ttt gag ggt gga ttg gag att    1397

Thr Met Trp Ile Ser Lys Ser Gly Glu Phe Glu Gly Gly Leu Glu Ile

                445                 450                 455

ggt ttt tct ttc aat aag aag aaa atg gat gct ttt ggc gag tgt ttt    1445

Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Lys Met Asp Ala Phe Gly Glu Cys Phe

            460                 465                 470

aac agc ggt ttg aag gat att taatttaaaa aattgtttag ctttgatgca       1496

Asn Ser Gly Leu Lys Asp Ile

        475

tgcgttttat atatgttgtg aaataatgtg gtgtgcaata actagagtaa ctttaggtta  1556

ataaattcgg tttttctgtt aaatctggat gattcgtgca agcaaactgt cgatgcgttg  1616

gatggatgtc gggtggtgtg gagattgttg aagaaggaaa tggatgcttt ttttatggtg  1676

gtttgaagga tttgaatgtg tagattattg gtttattgag gttgtttata tttgtgtatg  1736

ttgtttatgc atgaaaaata tttagatccc aacattttat gtatgacgtg gtttaatatt  1796

tcgatttcga tc                                                      1808

<210>8

<211>479

<212>PRT

<213>蓝猪耳(Torenia)

<220>

<223>蓝猪耳花色素苷酰基转移酶的氨基酸序列(Amino acid sequence of Torenia anthocyanin acyl transferase)

<400>8

Met Ala Val Glu Ala Pro Lys Thr Ile Cys Ala Val Leu Glu Asn Ser

  1               5                  10                  15

Leu Ile Thr Pro Gln Ser Thr Asp Thr Glu Gln Thr Leu Ser Leu Thr

             20                  25                  30

Phe Phe Asp Ile Lys Trp Val His Phe His Pro Met Gln Cys Leu Val

         35                  40                  45

Leu Tyr Asn Phe Pro Cys Ser Lys Ser His Phe Leu Glu Ala Thr Val

     50                  55                  60

Pro Ser Phe Lys Ser Ser Leu Ser Lys Thr Leu Arg His Tyr Leu Pro

 65                  70                  75                  80

Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Tyr Pro Asn Pro Thr His Asp Met Asp Asp

                 85                  90                  95

Asp Glu Ser Asn Met Pro Glu Ile Arg Tyr Lys Pro Gly Asp Ser Val

            100                 105                 110

Ser Leu Thr Val Ala Glu Tyr Phe Ser Gly His Glu Asp Asn Thr Thr

        115                 120                 125

Thr Glu Glu Tyr Phe Asn Tyr Leu Thr Gly Asn Phe Gln Arg Asp Cys

    130                 135                 140

Asp Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Pro Asp Phe Arg Asp Pro Glu Thr Glu

145                 150                 155                 160

Ser Asn Cys Thr Val Ile Pro Leu Ile Ala Val Gln Ile Thr Leu Phe

                165                 170                 175

Pro Gly Ala Gly Ile Cys Leu Gly Val Ile Asn Ser His Val Val Gly

            180                 185                 190

Asp Ala Ser Ser Ile Val Gly Phe Ile Lys Ala Trp Ser Lys Val Ala

        195                 200                 205

Met Tyr Glu Asp Asp Glu Glu Ile Leu Ala Asn Asn Asn Leu Ile Pro

    210                 215                 220

Ser Tyr Asp Arg Ser Val Val Lys Asp Pro Lys Gly Ile Lys Ser Leu

225                 230                 235                 240

Leu Trp Asn Lys Met Lys Asn Val Lys Tyr Gln Pro Gln Pro Ala Lys

                245                 250                 255

His Leu Pro Thr Asn Lys Val Arg Ala Thr Tyr Thr Leu Arg Lys Asn

            260                 265                 270

Asp Ile Glu Arg Leu Lys Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys Pro Gly Thr

        275                 280                 285

Thr Cys Leu Ser Ser Phe Thr Ile Ala Thr Ala Tyr Ala Trp Thr Cys

    290                 295                 300

Leu Ala Lys Ser Ala Ala Glu Ala Glu Glu Gln Val Val Gln Asp Ser

305                 310                 315                 320

Asp Asp Glu His Leu Leu Met Pro Val Asp Leu Arg Pro Arg Ile Asp

                325                 330                 335

Pro Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Phe Gly Asn Cys Val Leu Pro Ser Phe

            340                 345                 350

Ala Lys Thr Thr His Gly Leu Leu Lys Gly Glu Leu Gly Leu Phe Asn

        355                 360                 365

Ala Val Glu Val Ile Ser Asp Val Ile Thr Gly Ile Val Ser Lys Lys

    370                 375                 380

Tyr Asp Leu Phe Lys Asp Leu Asp Arg Gln Gly Glu Ile Phe Arg Ala

385                 390                 395                 400

Leu Phe Gly Lys Arg Val Leu Ala Ile Met Gly Ser Pro Lys Phe Asp

                405                 410                 415

Leu Tyr Glu Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Lys Lys Ile Glu Pro

            420                 425                 430

Val Ser Ile Asp Arg Glu Arg Thr Thr Met Trp Ile Ser Lys Ser Gly

        435                 440                 445

Glu Phe Glu Gly Gly Leu Glu Ile Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Lys

    450                 455                 460

Met Asp Ala Phe Gly Glu Cys Phe Asn Ser Gly Leu Lys Asp Ile

465                 470                 475

<210>9

<211>1252

<212>DNA

<213>鸢尾(Iris)

<220>

<223>编码鸢尾二氢黄酮醇还原酶的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding Iris dihydrofravonol reductase)

<400>9

aaacaatata tcgag atg atg agc ccc gtt gtc gtg acc gga gcg agc ggc    51

                 Met Met Ser Pro Val Val Val Thr Gly Ala Ser Gly

                   1               5                  10

tac gtc ggt tca tgg ctt gtt atg aag ctc ctt cgc gac ggc tac gcc    99

Tyr Val Gly Ser Trp Leu Val Met Lys Leu Leu Arg Asp Gly Tyr Ala

         15                  20                  25

gtt cga gcc act gtc aga gac cca acc aat gtg gag aag acg aag ccg    147

Val Arg Ala Thr Val Arg Asp Pro Thr Asn Val Glu Lys Thr Lys Pro

    30                  35                  40

ctg ttg gac ctc ccc gga gct gac gcg ctg ctc acc atc tgg aag gca    195

Leu Leu Asp Leu Pro Gly Ala Asp Ala Leu Leu Thr Ile Trp Lys Ala

 45                  50                  55                  60

gac ctc ggc cag gac gga agc ttc gac aag gcg gtc gca gga tgc acc    243

Asp Leu Gly Gln Asp Gly Ser Phe Asp Lys Ala Val Ala Gly Cys Thr

                 65                 70                   75

gcg gtc ttc cac gtc gcc acg ccc atg gat ttc gag tcc aag gac cca    291

Ala Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro

             80                  85                  90

gaa aac gag gtg atc aag ccg acc ata aat ggc gtt tta agt atc atg    339

Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Ile Asn Gly Val Leu Ser Ile Met

         95                 100                 105

agg tcc tgt aag aag gcc gga acg gtc aaa cgc gtc gtc ttc act tca    387

Arg Ser Cys Lys Lys Ala Gly Thr Val Lys Arg Val Val Phe Thr Ser

    110                 115                 120

tcc gcc ggg acg gtg gac gtg aaa gaa cat cag cag acg gag tac gac    435

Ser Ala Gly Thr Val Asp Val Lys Glu His Gln Gln Thr Glu Tyr Asp

125                 130                 135                 140

gag agc tcg tgg agc gac gtc gac ttc tgc aga cgt gtc aag atg aca    483

Glu Ser Ser Trp Ser Asp Val Asp Phe Cys Arg Arg Val Lys Met Thr

                145                 150                 155

ggc tgg atg tat ttt gtg tcg aag act ctg gcc gag aga gca gcc tgg    531

Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Thr Leu Ala Glu Arg Ala Ala Trp

            160                 165                 170

gaa ttt gca aga gag aat ggc ata gac ttc ata agc atc atc ccc acg    579

Glu Phe Ala Arg Glu Asn Gly Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Thr

        175                 180                 185

cta gtc gtc ggt cct ttc atc acc aca act atg cca ccc agc atg gtg    627

Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Thr Thr Met Pro Pro Ser Met Val

    190                 195                 200

act gcg cta tca ttc atg aca gga aac gaa gca cac tat cac ata atc    675

Thr Ala Leu Ser Phe Met Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr His Ile Ile

205                 210                 215                 220

aag cac gcg cag ctc gtc cac ctt gac gac ctg tgc gct gcc cac att    723

Lys His Ala Gln Leu Val His Leu Asp Asp Leu Cys Ala Ala His Ile

                225                 230                 235

tac ctc ctg aat cgc ccc gaa gcg aac ggg agg tac ata tgc tca tcg    771

Tyr Leu Leu Asn Arg Pro Glu Ala Asn Gly Arg Tyr Ile Cys Ser Ser

            240                 245                 250

cac gaa gcc acc atc cac gac ctg gcg agg atg gtc agg gag agg cac    819

His Glu Ala Thr Ile His Asp Leu Ala Arg Met Val Arg Glu Arg His

        255                 260                 265

cct tgg tgc ggc tcc ata ccc gaa aag ttc gac ggc atc gag aag gac     867

Pro Trp Cys Gly Ser Ile Pro Glu Lys Phe Asp Gly Ile Glu Lys Asp

    270                 275                 280

gtc aga acc gtg cac ttc tct tcc aag agg ctt ttg gac ctc ggg ttc     915

Val Arg Thr Val His Phe Ser Ser Lys Arg Leu Leu Asp Leu Gly Phe

285                 290                 295                 300

gag ttc aag tac acg gtg gaa gaa atg ttc gac gaa gcg ata cgg tcg     963

Glu Phe Lys Tyr Thr Val Glu Glu Met Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ser

                305                 310                 315

tgc gtc gag aag aag ctc ata ccc ctc cct gag aat ggc aac gtg gac    1011

Cys Val Glu Lys Lys Leu Ile Pro Leu Pro Glu Asn Gly Asn Val Asp

            320                 325                 330

gca gct gcc ggg gct aaa gac atg gtt cat gga gca gag gaa cat gcc    1059

Ala Ala Ala Gly Ala Lys Asp Met Val His Gly Ala Glu Glu His Ala

        335                 340                 345

cga att gct atg gaa cta gaa cca aaa aaa aag gtc aag tgaaatgtga     1108

Arg Ile Ala Met Glu Leu Glu Pro Lys Lys Lys Val Lys

    350                 355                 360

agatacaaca ttttatgcgt atggacatta caatcttaga tgttcaaggt ttcaaattgt  1168

atcttaagtg tatgatttat gttgacactc ggaagtttca ttgaaattaa taaaaaggga  1228

tttgctcaaa aaaaaaaaaa aaaa                                         1252

<210>10

<211>361

<212>PRT

<213>鸢尾(Iris)

<220>

<223>编码鸢尾二氢黄酮醇还原酶的氨基酸序列(Amino acid sequence encoding Iris dihydrofravonol reductase)

<400>10

Met Met Ser Pro Val Val Val Thr Gly Ala Ser Gly Tyr Val Gly Ser

  1               5                  10                  15

Trp Leu Val Met Lys Leu Leu Arg Asp Gly Tyr Ala Val Arg Ala Thr

             20                  25                  30

Val Arg Asp Pro Thr Asn Val Glu Lys Thr Lys Pro Leu Leu Asp Leu

         35                  40                  45

Pro Gly Ala Asp Ala Leu Leu Thr Ile Trp Lys Ala Asp Leu Gly Gln

     50                  55                  60

Asp Gly Ser Phe Asp Lys Ala Val Ala Gly Cys Thr Ala Val Phe His

 65                  70                  75                  80

Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val

                 85                  90                  95

Ile Lys Pro Thr Ile Asn Gly Val Leu Ser Ile Met Arg Ser Cys Lys

            100                 105                 110

Lys Ala Gly Thr Val Lys Arg Val Val Phe Thr Ser Ser Ala Gly Thr

        115                 120                 125

Val Asp Val Lys Glu His Gln Gln Thr Glu Tyr Asp Glu Ser Ser Trp

    130                 135                 140

Ser Asp Val Asp Phe Cys Arg Arg Val Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr

145                 150                 155                 160

Phe Val Ser Lys Thr Leu Ala Glu Arg Ala Ala Trp Glu Phe Ala Arg

                165                 170                 175

Glu Asn Gly Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Thr Leu Val Val Gly

            180                 185                 190

Pro Phe Ile Thr Thr Thr Met Pro Pro Ser Met Val Thr Ala Leu Ser

        195                 200                 205

Phe Met Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr His Ile Ile Lys His Ala Gln

    210                 215                 220

Leu Val His Leu Asp Asp Leu Cys Ala Ala His Ile Tyr Leu Leu Asn

225                 230                 235                 240

Arg Pro Glu Ala Asn Gly Arg Tyr Ile Cys Ser Ser His Glu Ala Thr

                245                 250                 255

Ile His Asp Leu Ala Arg Met Val Arg Glu Arg His Pro Trp Cys Gly

            260                 265                 270

Ser Ile Pro Glu Lys Phe Asp Gly Ile Glu Lys Asp Val Arg Thr Val

        275                 280                 285

His Phe Ser Ser Lys Arg Leu Leu Asp Leu Gly Phe Glu Phe Lys Tyr

    290                 295                 300

Thr Val Glu Glu Met Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ser Cys Val Glu Lys

305                 310                 315                 320

Lys Leu Ile Pro Leu Pro Glu Asn Gly Asn Val Asp Ala Ala Ala Gly

                325                 330                 335

Ala Lys Asp Met Val His Gly Ala Glu Glu His Ala Arg Ile Ala Met

            340                 345                 350

Glu Leu Glu Pro Lys Lys Lys Val Lys

        355                 360

<210>11

<211>1297

<212>DNA

<213>杂种赛亚麻(Nierembergia hybrida)

<220>

<223>编码杂种赛亚麻的二氢黄酮醇还原酶的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding Nierembergia hybrida dihydrofravonol reductase)

<400>11

attcatacta cattttcccg tccttaagta aattttattt ctgaaa atg gca agc      55

                                                   Met Ala Ser

                                                     1

gaa gca gtt cat gct agt ccg aca gtt tgt gtc acc gga gca gct gga    103

Glu Ala Val His Ala Ser Pro Thr Val Cys Val Thr Gly Ala Ala Gly

      5                  10                  15

ttc att ggc tct tgg ctt gtc atg aga ctc ctt gaa cgc ggt tat aat    151

Phe Ile Gly Ser Trp Leu Val Met Arg Leu Leu Glu Arg Gly Tyr Asn

 20                  25                  30                  35

gtt cat gct act gtt cgt gat cct gag aac aag aag aag gtg aaa cat    199

Val His Ala Thr Val Arg Asp Pro Glu Asn Lys Lys Lys Val Lys His

                 40                  45                  50

cta cag gaa ttg cca aaa gct gat acg aac tta acg ctg tgg aaa gcg    247

Leu Gln Glu Leu Pro Lys Ala Asp Thr Asn Leu Thr Leu Trp Lys Ala

             55                  60                  65

gac ttg gcg gta gaa gga agc ttt gat gaa gcc att aaa ggc tgt caa    295

Asp Leu Ala Val Glu Gly Ser Phe Asp Glu Ala Ile Lys Gly Cys Gln

         70                  75                  80

gga gta ttt cat gtg gcc act cct atg gat ttc gag tcc aag gac cct    343

Gly Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro

     85                  90                  95

gag aat gaa gta atc aag cca aca gtc cag gga atg ttg agc atc ata    391

Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Val Gln Gly Met Leu Ser Ile Ile

100                 105                 110                 115

gaa tca tgt gtt aaa gca aac aca gtg aag agg ttg gtt ttc act tcg    439

Glu Ser Cys Val Lys Ala Asn Thr Val Lys Arg Leu Val Phe Thr Ser

                120                 125                 130

tct gct gga act cta gat gtc caa gag caa caa aaa ctc ttc tac gat    487

Ser Ala Gly Thr Leu Asp Val Gln Glu Gln Gln Lys Leu Phe Tyr Asp

            135                 140                 145

gag acc agc tgg agc gac ttg gac ttc ata aat gcc aag aag atg aca    535

Glu Thr Ser Trp Ser Asp Leu Asp Phe Ile Asn Ala Lys Lys Met Thr

        150                 155                 160

gga tgg atg tac ttt gtt tca aag ata ctc gcg gag aag gct gca atg    583

Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Ile Leu Ala Glu Lys Ala Ala Met

    165                 170                 175

gaa gaa gct aaa aag aac aac att gat ttc att agc atc ata cca cca    631

Glu Glu Ala Lys Lys Asn Asn Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Pro

180                 185                 190                 195

ctg gtt gtt ggt cca ttc atc acc cct tcg ttc ccg cct agt tta atc    679

Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Pro Ser Phe Pro Pro Ser Leu Ile

                200                 205                 210

act gcc ctt tca cta att act ggg aat gaa gct cac tac tgc atc att    727

Thr Ala Leu Ser Leu Ile Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr Cys Ile Ile

            215                 220                 225

aaa caa ggt caa tat gtg cat ttg gat gat ctt tgt gag gct tac ata    775

Lys Gln Gly Gln Tyr Val His Leu Asp Asp Leu Cys Glu Ala Tyr Ile

        230                 235                 240

ttc ttg tat gaa cac cct aaa gca gag gga agg ttc att tgc tcg tcc    823

Phe Leu Tyr Glu His Pro Lys Ala Glu Gly Arg Phe Ile Cys Ser Ser

    245                 250                 255

cat cat gct atc atc tat gat gta gct aag atg atc cga gaa aaa tgg    871

His His Ala Ile Ile Tyr Asp Val Ala Lys Met Ile Arg Glu Lys Trp

260                 265                 270                 275

cca gag tac tac gtt cct aca gag ttt aaa ggc atc gct aag gac cta    919

Pro Glu Tyr Tyr Val Pro Thr Glu Phe Lys Gly Ile Ala Lys Asp Leu

                280                 285                 290

cct gtg gtg gct ttt tcg tca aag aag ttg aca gat atg ggt ttt cag    967

Pro Val Val Ala Phe Ser Ser Lys Lys Leu Thr Asp Met Gly Phe Gln

            295                 300                 305

ttc aag tac act ttg gag gat atg tat aaa ggg gcc att gag act tgt     1015

Phe Lys Tyr Thr Leu Glu Asp Met Tyr Lys Gly Ala Ile Glu Thr Cys

        310                 315                 320

cga cag aag cag ttg ctt ccc ttt tct acc aat agg cct tcg gaa aat     1063

Arg Gln Lys Gln Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn Arg Pro Ser Glu Asn

    325                 330                 335

gga ctt gac aaa gaa gcc att tcc att tct tct gaa aac ttt gca agt     1111

Gly Leu Asp Lys Glu Ala Ile Ser Ile Ser Ser Glu Asn Phe Ala Ser

340                 345                 350                 355

gga aaa gag aat gca cca gtt gca aat cac aaa gta aag tta aca agt     1159

Gly Lys Glu Asn Ala Pro Val Ala Asn His Lys Val Lys Leu Thr Ser

                360                 365                 370

gtt gaa attt agaactgca atctttcaaa tgtaaaagag gcaagcttgc ctatcaacat  1218

Val Glu Ile

ctttgcttct aagttgtcat ctatttgttt ctttaatgct aaagcagtaa aaggttcaat   1278

gaaaaaaaaa aaaaaaaaa                                                1297

<210>12

<211>374

<212>PRT

<213>杂种赛亚麻(Nierembergia hybrida)

<220>

<223>杂种赛亚麻二氢黄酮醇还原酶的氨基酸序列(Amino acid sequence of Nierembergia hybrida dihydrofravonol reductase)

<400>12

Met Ala Ser Glu Ala Val His Ala Ser Pro Thr Val Cys Val Thr Gly

  1               5                  10                  15

Ala Ala Gly Phe Ile Gly Ser Trp Leu Val Met Arg Leu Leu Glu Arg

             20                  25                  30

Gly Tyr Asn Val His Ala Thr Val Arg Asp Pro Glu Asn Lys Lys Lys

         35                  40                  45

Val Lys His Leu Gln Glu Leu Pro Lys Ala Asp Thr Asn Leu Thr Leu

     50                  55                  60

Trp Lys Ala Asp Leu Ala Val Glu Gly Ser Phe Asp Glu Ala Ile Lys

 65                  70                  75                  80

Gly Cys Gln Gly Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser

                 85                  90                  95

Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Val Gln Gly Met Leu

            100                 105                 110

Ser Ile Ile Glu Ser Cys Val Lys Ala Asn Thr Val Lys Arg Leu Val

        115                 120                 125

Phe Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Asp Val Gln Glu Gln Gln Lys Leu

    130                 135                 140

Phe Tyr Asp Glu Thr Ser Trp Ser Asp Leu Asp Phe Ile Asn Ala Lys

145                 150                 155                 160

Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Ile Leu Ala Glu Lys

                165                 170                 175

Ala Ala Met Glu Glu Ala Lys Lys Asn Asn Ile Asp Phe Ile Ser Ile

            180                 185                 190

Ile Pro Pro Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Pro Ser Phe Pro Pro

        195                 200                 205

Ser Leu Ile Thr Ala Leu Ser Leu Ile Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr

    210                 215                 220

Cys Ile Ile Lys Gln Gly Gln Tyr Val His Leu Asp Asp Leu Cys Glu

225                 230                 235                 240

Ala Tyr Ile Phe Leu Tyr Glu His Pro Lys Ala Glu Gly Arg Phe Ile

                245                 250                 255

Cys Ser Ser His His Ala Ile Ile Tyr Asp Val Ala Lys Met Ile Arg

            260                 265                 270

Glu Lys Trp Pro Glu Tyr Tyr Val Pro Thr Glu Phe Lys Gly Ile Ala

        275                 280                 285

Lys Asp Leu Pro Val Val Ala Phe Ser Ser Lys Lys Leu Thr Asp Met

    290                 295                 300

Gly Phe Gln Phe Lys Tyr Thr Leu Glu Asp Met Tyr Lys Gly Ala Ile

305                 310                 315                 320

Glu Thr Cys Arg Gln Lys Gln Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn Arg Pro

                325                 330                 335

Ser Glu Asn Gly Leu Asp Lys Glu Ala Ile Ser Ile Ser Ser Glu Asn

            340                 345                 350

Phe Ala Ser Gly Lys Glu Asn Ala Pro Val Ala Asn His Lys Val Lys

        355                 360                 365

Leu Thr Ser Val Glu Ile

    370

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)DFR-2F

<400>13

caagcaatgg catcggaatc                                                20

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)DFR-2B

<400>14

tttccagtga gtggcgaaag tc                                             22

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)ANS-2F

<400>15

tggactcgaa gaactcgtcc                                                20

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)ANS-2B

<400>16

cctcaccttc tcccttgtt                                                 19

<210>17

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>ATC引物(Primer)

<400>17

gayttyggit ggggiaa                                                   17

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>Origo dT引物(Primer)

<400>18

tttttttttt tttttttctc gag                                            23

<210>19

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)RDF310

<400>19

ccctcgagcc cttgatggcc tcgtcg                                         26

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221>

<222>

<223>引物(Primer)RDF830

<400>20

gggtcgacgc ggccctctgc tttcgg                                         26

<210>21

<211>2934

<212>DNA

<213>蔷薇(Rose)

<220>

<223>蔷薇查耳酮合酶启动子的核苷酸序列(Nuceotide sequence of rose chalconesynthase promotor)

<400>21

aagcttcagc aagagttgaa gaaataggga cagagccatc catgtgcttt gatgaatctg     60

atgggataca aaatgtgaaa gattcacttg ctgatttatc cagaatttct tcatatagtg    120

aggagaatgt tgaaagatct aatgatgagc actctgttaa actagacgga attcatgtgc    180

agcacgagtg tcatgagggc agtgaagaag acaaacctga tggtaagagc ggtgagaatg    240

cagttgatct ggctaatcat ggcatggctc gaactgattt ttgtcagata acagaagaga    300

ttgagaatgg agtagtcatc actgagatga gcaacattgc caaccctgat aaaactgata    360

ttccaaacgg ggtgcctcaa aatgagactg atgatggatt taataacact caggatgatg    420

ctaatacaaa ggaagtgaca gaagagaatt ctgacagacg tgcgaaggaa gtgacagaag    480

agaattctga caaagatgtt ttgaagaata tccttgaatt ctcacgtgct tcttctgtgg    540

tggattttga aattccagtg ttggatgtga aatttacttc tcttgaaagt tgcagtgcca    600

cttgttctct tgcagccctt ttgtctgaat cgccggaatc aatgactgaa gcaccttgtg    660

tgaggcaaat tgatgatgtg cccccggttg gtgaggagtc tagcttgatt ttggtggaag    720

atcgggagcc ggttggtcct actcctgatg gtaatttttc tgtggatatg gattactata    780

gtgtagcaga acctttgagc acatgggatg cgaatctgca gtgtgaaaca tcaaatagcc    840

atgagacttt tgctgcaagt ctcatttgat agcttctgtg ttaataactt tgttagtctg    900

tacataaatt tgtctagaca agaattggtc gtgtactatc gtgtgttttt gccgtgcttt    960

agtactcatg aaccaattca gagaaaactg gctgcatatt ttgaggagtc tctgaattct   1020

tcaatgctca actggtatgc atgtaggtgg catatcactt cagggattct tctattcttt   1080

aactttacgc atcttgacat tttgtatata acaaaatcag gtctattggg tgaaagtaat   1140

tggctagaat ggaaagctct acggttttac cgcaggtcaa ttttcatagc tccacaagtg   1200

aattgaaaat gctcataggc tttatgtttg tcctccacct ctggcgacga tgtttgttgg    1260

ggagttaact caaacctacc accaaactcg aacccatctt ccataattta taatacaaat    1320

ttgcgatcat ttgttcatcc aattattgtg acactcggct accacccaaa atatcggtca    1380

cagacccaaa cgtattgtca caacaaatcg tgtctctcgc attaaacaca gctagaaaga    1440

agagttgaac ccacaattcg agcacccact acctatgtac gaagtcatga gttcgagtca    1500

ccataggggt agaagtgaaa tcatttgatc atctttaaag aaataaaagg aagagttgaa    1560

cccacaattg gctcttgtcc caaaaagaac taatagttca gtgcaccgac gtgtatttgc    1620

accgacataa atggattgtt agattatatt aaatacactc ttaggttatt aataaaaata    1680

ttaattataa atatcaaaag ttgagatcat cttataaatg ttgggtcagt tacaccgtcg    1740

gtgcatagaa taatttccaa actatataat agccttcatt ttctgattta gctcatggga    1800

catgattgct ataaataatt gtactcgtag aggcatactt gtgtcttttt atacagttgt    1860

actgaagctc agaaaagttt atgaaggtga gaactgagaa gggcaaggca tttggtagtt    1920

gaggtatatg agagcatgaa ccccatgcat tgcagctacc acctctcttt tttccttctt    1980

cccatacaaa taaaaccaac tcttctcacc taagtctatc atctttattt atggcagctc    2040

ttgcttaatt agctcatcta tattatatta tttatctata atatgtgtca ctctgtctac    2100

ctaccagccc aaaataaaac tgataatagt caatttgatg atattttttg ttttttgttt    2160

tgttttgtct tttttgtatt gattttttta aaattaaaat gacttcattt tttgtttttg    2220

tttttttttc tatttttttt tatagaaaaa ttggcaaact ttcattatct gttattgatg    2280

acaattaagc cattaaaacc tataattaat tatctttcaa ttcgagtaaa tttaaaacgg    2340

tgtaaaatta aaatatgatc gtattcttaa atgaataaaa ctcacttaat aatagtaata    2400

cttgaatcac atctacgaac atagattctt ttcatccagt ctaaccatgt ttgaatatat    2460

agagtttgat tatggttatg tctttgtcca cattttggtt tgtaaataaa tgtgcaacgg    2520

aggtatggta ctgttgctct atcaaattca agtttgaatt aaaagaaaaa aaaaaagacg    2580

atattttgtg cgctttgttt ggtaggtaaa acgagagaac aaacgcattc caaatcatgc    2640

ggattttgat cggcaacaca caccacaaaa aaccgtacac gatgcacgtg ccatttgccg    2700

ggggtttcta acaaggtaat tgggcaggca cgtgatcccc cagctaccca cctctcgctt    2760

cccttctcaa actccttttc catgtatata tacaacccct tttctcagac cattatattc    2820

taacattttt gctttgctat tgtaacgcaa caaaaactgc tcattccatc cttgttcctc    2880

cccattttga tcttctctcg acccttctcc gagatgggta ccgagctcga attc          2934

Claims (8)

1.蔷薇的制造方法，其特征为人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因。

2.权利要求1所述的蔷薇的制造方法，其特征为人为抑制蔷薇的内源性代谢途径，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码二氢黄酮醇还原酶的基因。

3.权利要求2所述的蔷薇的制造方法，其特征为人为抑制蔷薇内源性的二氢黄酮醇还原酶的表达，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因及编码来源于蔷薇以外的二氢黄酮醇还原酶的基因。

4.权利要求1所述的蔷薇的制造方法，其特征为人为抑制蔷薇的内源性类黄酮3’-羟化酶的表达，且表达编码来源于三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶的基因。

5.通过权利要求1～4中任一项所述的制造方法得到的蔷薇或与其具有相同特性的其后代或其组织。

6.通过权利要求1～4中任一项所述的制造方法得到的蔷薇花瓣的颜色为紫色、蓝紫色或蓝色的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织。

7.权利要求6所述的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织，其蔷薇的花瓣的颜色属于英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)的紫色系、紫蓝色系或蓝色系。

8.权利要求7所述的蔷薇或与其具有相同特性的后代或其组织，其蔷薇的花瓣的颜色属于英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)紫色系的85a或85b。

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