KR20060081400A

KR20060081400A - 꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법

Info

Publication number: KR20060081400A
Application number: KR1020067003032A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 다나카; 유코 후쿠이; 준이치 도가미; 유키히사 가츠모토; 마사코 미즈타니
Original assignee: 인터내쇼날 플라워 디벨럽먼트 피티와이. 리미티드
Priority date: 2003-08-13
Filing date: 2004-08-13
Publication date: 2006-07-12
Also published as: ATE527348T1; JP4690197B2; AU2004264488B2; AU2004264488A1; CA2537065A1; IL173603A; SG146636A1; EP1652916A1; JPWO2005017147A1; US20110126320A1; CN1836039B; KR101100930B1; IL173603A0; CA2537065C; EP1652916B1; CN1836039A; EP1652916A4; WO2005017147A1; US8410335B2

Abstract

장미의 내재성 대사 경로를 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조방법.

장미 내재성 대사 경로, 장미의 유래의 디히드로플라보놀 환원 효소, 장미 이외의 유래의 디히드로플라보놀 환원 효소, 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소

Description

꽃의 색상이 변경된 장미의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING ROSE WITH MODIFIED COLOR}

본 발명은 새로운 꽃 색깔을 가지는 장미의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는 장미 내재성의 대사 경로를 인위적으로 억제하고 또한 팬지의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자와 디히드로미리세틴을 환원하는 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것에 의한 장미의 제조 방법에 관한 것이다.

꽃잎의 역할은 꽃가루를 옮기는 곤충·조류 등의 폴리네이터를 매료시키는 것에 있기 때문에, 꽃의 색이나 형태, 모양, 향기는 폴리네이터와 함께 진화해 왔다(혼다 도시오 등 현대화학 5월호 25-32 (1998)). 아마도 그 결과로서 한 가지 종의 꽃이 모든 색을 가지는 경우는 적고, 예를 들면, 장미나 카네이션에는 보라색부터 파란색 품종이 없고, 창포(calamus)나 용담(gentian)에는 선명한 붉은 품종은 없다. 꽃의 색은 감상할 때에도 꽃이나 관상수의 가장 중요한 형질이므로, 예로부터 여러 가지 색의 꽃을 교배에 의하여 육종해 왔다. 특히 장미는 꽃의 여왕이라 불리고, 또한, 시장가치도 높으므로 세계적으로 교배시켜왔다.

예를 들면, 노란색 품종이 없었던 장미에 서아시아 원산의 Rosa foetida를 교배시킴으로써 현재의 노란색 장미가 육종되었다. 그러나 꽃의 색은 그 식물이 가지는 유전적 능력에 의하여 결정되기 때문에, 이용할 수 있는 유전 자원이 한정되는 교배에 의한 육종으로는 실현될 수 있는 꽃의 색깔에 한계가 있다(Tanaka et al. Plant Cell Physio 1. 39 1119-1l26, 1998, Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999). 그 중에서도 파란색 장미의 육성은 불가능의 대명사로도 여겨지고, 아서왕의 성배에 필적하는 것으로 여겨져 왔다(오오바 에이조「장미의 탄생」1997 중공신서, 스즈키 마사히코「식물 바이오의 마법 파란색 장미도 꿈은 아니다」1990 코단샤 블루박스, 사이쇼 하즈키 「파란색 장미」 2001 쇼우갓칸).

현재, 일반적으로「파란색 장미」라고 불리는 품종은 존재하지만, 이것은 「옅은 자색(lilac)」의 장미를 가리킨다. 교배에 의한「파란색 장미」의 품종 개량은 1945년 작출된 연보라를 띤 회색의「그레이 펄」이 최초라고 한다. 그 후, 1957년에 연보라 핑크의「스털링 실버」가 작출되고, 이들 품종을 교배 부모로 하여「블루문」(1964년 작출)이나 「마담 비오레」(1981년 작출) 등, 많은 옅은 자색계 장미가 만들어졌다. 또한, 이러한 옅은 자색계 장미 등을 이용하여, 육종을 거듭함으로써,「청룡」(1992년 작출)이나 「블루 헤븐」(2002년 작출) 등의, 희미한 그레이계의 장미가 작출되어 새로운 유형의 「파란색 장미」로서 주목을 끌고 있다.

그러나 이러한 꽃의 색은 실제로는 파랗지 않고 회색을 띤 옅은 핑크에 머물고 있어 오랜 세월의 육종 노력에도 불구하고, 아직도「파란색」장미라고 할 수 있는 장미는 존재하지 않는다. 원예 업계에 있어서 일반적으로 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC: The Royal Horticultural Society Colour Chart)에서 바이올렛으로부터 블루 그룹이「파란색」이라고 불리는 경우가 많다. 본 발명은 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트에서 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹 또는 블루 그룹으로 표시되는 꽃의 색깔을 가지는 장미의 정출을 목표로 하는 것이다.

꽃의 색은 주로 안토시아닌, 카로테노이드, 베타레인의 3종의 화합물군에 유래하지만, 파란색을 관장하는 것은 극대 흡수 파장의 폭이 가장 넓은(오렌지색에서부터 청색) 안토시아닌이다. 안토시아닌은 플라보노이드의 일종으로 도1에 나타낸 대사 경로로 생합성된다. 안토시아닌은 통상 상피세포의 액포 중에 국부적으로 존재한다. 안토시아닌의 색조(즉, 꽃의 색)은 안토시아닌의 구조에 크게 의존하고, B고리의 수산기의 수가 많을수록 파랗게 된다. B고리의 수산화는 플라보노이드 3' 내지 수산화 효소(F3'H) 및 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소(F3'5'H)에 의하여 촉매된다. F3'H 활성과 F3'5'H 활성이 없는 경우에는 페랄고니딘(오렌지색으로부터 적색)이 합성되고, F3'H 활성이 있는 경우는 시아니딘 (빨강으로부터 홍색)이 합성되어 F3'5'H 활성이 있는 경우는 델피니딘(보라색)이 합성된다.

이러한 안토시아니딘은 당이나 아실기에 의하여 수식되어 여러가지 안토시아닌이 된다. 일반적으로 수식하는 방향족 아실기가 많을수록 안토시아닌은 파랗게 된다. 안토시아닌은 액포의 pH, 공존하는 플라보놀이나 플라본, 금속 이온 등에 따라서도 크게 색이 바뀐다(사이토 노리오, 단백질 핵산 효소 47 202-209 2002, Broullard and Dangles, In the flavonoids: Advances in Research since 1986 (Ed by Harborne) Capmann and Ha U, London pp565-588, Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1l26, 1998, Mol et al, Trends in Plant Science 3, 212-217 1998, Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999).

장미의 꽃잎의 안토시아닌은 페랄고니딘과 시아니딘 및 페오니딘의 유도체이며, 델피니딘의 유도체는 존재하지 않는다(Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-17341993, Mikanagi Y, Saito N, Yokoi M and Tatsuzawa F (2000) Biochem Systematics Ecol. 28:887-902). 이것이 파란색 장미가 없는 최대의 이유로 여겨지고 있다. 현재의 장미는 교배 가능한 장미의 근친종(R. multiflora, R. chinensis, R. gigantean, R. moschata, R. gallica, R. whichuraiana, R. foetida 등)의 교배에 의하여 작출된다.

많은 교배 노력에도 불구하고, 파란색 장미가 실현되지 못한 것은 장미의 근친종에는 델피니딘을 생산하는 능력이 없기 때문으로 생각되고 있다. 꽃잎에서 델피니딘을 생산하기 위하여는 상술한 바와 같이 F3'5'H가 꽃잎에서 발현할 필요가 있으나, 장미 및 장미의 근친종의 꽃잎에서는 F3'5'H가 발현하고 있지 않는 것으로 생각된다. 따라서 교배에 의하여 델피니딘을 꽃잎에서 축적시켜 파란색 장미를 취득하는 것은 불가능할 것이다. 또한, 장미 꽃잎에 미량이 푸른 색소 로자시아닌이 포함되어 있는 것은 알려져 있고 그 화학 구조도 결정되어 있지만(일본공개특허공보 2002-201372), 로자시아닌을 증가시킴으로써 파란색 장미를 작출한 보고는 없고, 로자시아닌의 생합성 경로, 거기에 관련되는 효소나 유전자에 대하여 알려진 바도 없다.

또한, 생물이 생산하는 푸른색이나 보라색의 색소의 예로서 인도 쪽(indigo) 가 생산하는 인디고(예를 들어, Appl Microbiol Biotechnol 2003 Feb;60(6):720-5)나 미생물이 생산하는 비오라세인(J. (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2000 Oct; 2(4): 513-9, 0rg. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984)가 있고, 이들은 트립토판에 유래한다는 것과 생합성 경로에 대하여 밝혀져 있다.

그 밖에 치자나무의 열매에서 유래되는 이리도이드 화합물에 의한 청색 색소(S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, T. Iwashita, H. Komura, K. Nomoto, (1987) Structure of genipocyanin Gl, a spontaneous reaction product between genipin and glycine. Tetrahedron Lett. 28(40), 4699-700, S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, J. Kumada, (1987) Brilliant skyblue pigment formation from gardenia fruits. J. Ferment. Technol. 65(4), 419-24)나, 이끼 유래의 아즈렌(와코 준야쿠 고교가부시키가이샤)등도 알려져 있으나, 이들을 식물 꽃잎에서 발현시켜, 꽃의 색깔을 파랗게 만들었다는 보고는 없다.

장미에 다른 식물에서 발현하고 있는 F3'5'H의 유전자를 도입하여 꽃잎에서 발현시킬 수 있으면 파란색 장미를 작출할 수 있는 것은 아닐까하는 기대가 있었다(사이쇼 하즈키「파란색 장미」2001 쇼우갓칸). F3'5'H 유전자는 페튜니아, 용담, 리시안셔스(lisianthus) 등 많은 식물로부터 얻어지고 있다(Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993, Tanaka et al. Plant Cell Physio1. 37, 711-7161996, WO93/18155). 또한, 장미의 형질 전환계에 대해서도 보고되어 있다(예를 들어 Firoozababy et al. Bio/Technology12:883-888(1994), US5480789, US5792927, EP536327 Al, US 20010007157 Al).

또는 실제로 장미에 페튜니아의 F3'5'H 유전자를 도입한 보고도 있다(WO93/18155, WO94/28140).

그러나, 파란색 장미를 얻는데 이르지는 않았고, 파란색 장미를 얻기 위하여는 장미에 적절한 꽃의 색 색소의 대사를 개변하는 연구가 필요할 것으로 생각된다.

한편, F3'5'H 유전자를 델피니딘을 생산하지 않고 페랄고니딘을 생산하고 있는 붉은 카네이션에 도입하였더니, 페랄고니딘과 함께, 델피니딘이 축적되는 것으로 확인되었지만, 꽃의 색깔은 약간 보라색을 띤 빨강으로 바뀌는 것에 머물었다(WO94/28140). 이 결과는 F3'5'H의 발현만으로는「파란색」카네이션을 얻지 못하고, 카네이션의 내재성의 페랄고니딘 합성으로의 대사 흐름을 억제할 필요가 있는 것을 시사하고 있다.

카네이션의 내재성의 대사 경로(디히드로플라보놀 환원 효소(DFR)에 의한 디히드로캠페롤(DHK)의 환원)와의 경합을 피하기 위하여, 흰 카네이션중에서 DFR이 결손되고 있는 품종을 선택하였다. 이 카네이션에, F3'5'H와 페튜니아 DFR(DHK를 환원하지 못하고, 디히드로미리세틴(DHM)을 효율적으로 환원하는 것이 알려져 있었다)의 유전자를 도입하였다. 그 결과, 델피니딘의 함량이 거의 100%이고, 꽃의 색깔도 종래의 카네이션에는 없었던 푸른 보라색이 된 재조합 카네이션을 취득할 수 있었던 예가 있다(단백질 핵산 효소, Vo1. 47, No. 3, p228, 2002). 이와 같이 카네이션에 푸른 꽃을 실현하기 위하여는 F3'5'H 유전자의 발현에 의한 델피니딘의 축적 만이 아니라, 다른 연구가 필요하였다.

DFR은 이미 많은 식물로부터 클로닝되고 있다(페튜니아, 담배, 장미, 트레니어, 금어초, 거베라, 심비듐, 대맥, 사탕옥수수 등)(Meyer et al. Nature 330, 677-678, 1987, Helariutta et al. Plant Mo1. Biol. 22 183-193 1993, Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, Johnson et a1. P1ant J. 19, 81-85, 1999). DFR 유전자에 대하여서는 식물종에 의하여 기질 특이성이 달라, 페튜니아, 담배, 신비듐의 DFR 유전자는 DHK를 환원할 수 없는 것이 알려져 있고, 페튜니아의 DFR 유전자는 디히드로플라보놀 중에서는 DHM를 가장 효율적으로 환원하는 것이 알려져 있다(Forkmann et al. Z. Naturforsch. 42c, 1146-1148, 1987, Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999). 그러나 이러한 DFR 유전자를 장미로 발현시킨 예는 보고되어 있지 않다.

내재성의 대사 경로나 효소와 외래의 유전자 유래의 효소, 예를 들어 F3'5'H와의 경합을 회피하는 방법으로서는 위에서 설명한 바와 같이, 어느 유전자가 결손된 품종에 유전자를 도입하는 방법이 있다. 또한, 인위적으로 목적으로 하는 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서 목적으로 하는 유전자를 상동 재조합 등에 의하여 결실시키는 방법도 알려져 있으나, 상동 재조합의 빈도가 낮고, 적응할 수 있는 식물종도 한정되어 있기 때문에, 실용화하는 데에는 이르지 않았다(예를 들어, Nat Biotechnol 2002, 20:1030-4).

전사 레펠로의 억제 방법으로서 표적 유전자의 mRNA의 안티센스 RNA를 전사시키는 안티센스법(van der Krol et al. Nature 333, 866-869, 1988), 동적 유전자의 mRNA와 같은 RNA를 전사시키는 센스(co-suppression) 법(Napoli et al. Plant Cell 2, 279-289, 1990), 표적으로 하는 유전자의 mRNA에 대응하는 2개 사슬의 RNA를 전사하는 방법(RNAi법, Waterhouse et al. Pro. Natl. Acd. Sci. USA 95, 13959-13964 1998)이 이용되고 있다.

이러한 3개의 방법에 대하여는 많은 성공한 예가 알려져 있다. 장미에 대하여는 안토시아닌의 합성에 필요한 칼콘신타제(CHS) 유전자의 코서프레션(co-suppression)에 의하여, 꽃의 색깔을 빨강으로부터 핑크로 변경한 것이 보고되어 있지만(Gutterson HortScience30:964-966 1995)가, 이 경우 CHS의 억제가 불완전하고, 완전하게 안토시아닌의 합성을 억제하여 흰 꽃의 계통을 얻는 데는 이르지 않았다.

특허 문헌 1 일본공개특허공보 2002-201372호

특허 문헌 2 WO93/18155

특허 문헌 3 USP 5480789

특허 문헌 4 USP 5792927

특허 문헌 5 EP 536 327 A1

특허 문헌 6 US 20010007157Al

특허 문헌 7 WO94/28140

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비특허문헌 6 사이쇼 하즈키 「파란색 장미」2001 쇼우갓칸

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상기한 바와 같이 장미에 F3'5'H 유전자를 도입하여 꽃잎에서 발현시킴으로써 장미의 꽃의 색을 개변할 수 있었다. 카네이션에서는 DFR 결손 품종으로 F3'5'H 유전자와 페튜니아 DFR 유전자를 발현시킴으로써, 청보라색의 카네이션을 재배할 수 있었다.

그러나, 아직「파란색 장미」는 정출되어 있지 않다. 이에 본 발명은 파란 꽃을 피우는 장미를 제공하고자 하는 것이다.

따라서 본 발명은 (1) 장미의 내재성 대사 경로를 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (2) 장미의 내재성의 대사 경로를 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자 및 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (3) 장미의 내재성의 디히드로플라보놀 환원 효소의 발현을 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자 및 장미 이외의 유래의 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (4) 장미의 내재성의 플라보노이드 3'-수산화 효소의 발현을 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법을 제공한다.

상기 팬지의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자는 예를 들면, 배열 번호:1 또는 배열 번호: 3에 기재된 유전자이다. 또한, 상기 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자는 바람직하게는 아이리스, 니렘베르기아, 페튜니아, 심비듐, 용담, 리시안셔스 유래이다.

본 발명은 또한, (5) 상기 (1) 내지 (4)중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의하여 얻을 수 있는 장미 또는 그것과 동일한 성질을 가지는 그 자손 또는 그러한 조직을 제공한다.

본 발명은 또한, (6) 상기 (1) 내지 (4)의 어느 한 제조 방법에 의하여 얻어진 장미의 꽃잎의 색이 보라색, 청보라 또는 파란색인 장미 또는 그것과 같은 성질을 가지는 자손 또는 그러한 조직을 제공한다.

본 발명은 또한, 장미의 꽃잎의 색이 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC)의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹 또는 블루 그룹에 속하는 것으로, 상기 (6)에 기재된 장미 또는 그것과 같은 성질을 가지는 자손 또는 그러한 조직을 제공한다.

본 발명은 또한, 장미의 꽃잎의 색이 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC)의 바이올렛 그룹의 85a 또는 85b에 속하는 것인, 상기 (7)에 기재된 장미 또는 그것과 같은 성질을 가지는 자손 또는 그러한 조직을 제공한다.

도 1은 플라보노이드의 생합성 경로를 나타낸다.

CHS: 칼콘 합성 효소, CHI: 칼콘이소메라제,

FNS: 플라본 합성 효소, F3H 플라바논 3-수산화 효소,

F3'H: 플라보노이드 3'-수산화 효소,

F3'5'H: 플라보노이드 3',5'-수산화 효소,

FLS: 플라보놀 합성 효소,

DFR: 디히드로플라보놀 4-환원 효소,

ANS: 안토시아니딘 합성 효소, AS: 올론 합성 효소,

C2'GT: 칼콘 2'배당화 효소

도 2는 플라스미드 pBERD1의 구조를 나타낸다.

도 3은 플라스미드 pBPDBP2의 구조를 나타낸다.

도 4는 플라스미드 pBPDBP8의 구조를 나타낸다.

도 5는 플라스미드 pSPB461의 구조를 나타낸다.

도 6은 플라스미드 pSPB472의 구조를 나타낸다.

도 7은 플라스미드 pSPB130의 구조를 나타낸다.

도 8은 플라스미드 pSPB919의 구조를 나타낸다.

도 9는 플라스미드 pSPB920의 구조를 나타낸다.

도 l0는 플라스미드 pSPB1106의 구조를 나타낸다.

장미에서 델피니딘이 생산되어도 꽃의 색깔이 파랗게 되지 않는 이유로는 몇가지를 생각할 수 있다. 아실기나 당의 수식에 의하여 안토시아닌의 안정성, 용해도, 색이 변화한다. 즉, 방향족 아실기의 부가에 의하여 파랗게 되는 것이 알려져 있다. 또한, 플라보놀이나 플라본과 같은 코피그먼트와 안토시아닌이 복합체를 형 성하면, 색이 파랗게 되어, 극대 흡수 파장은 장파장으로 시프트하여 흡광도도 증가한다. 안토시아닌의 색은 pH에 의하여도 변화한다. pH가 낮으면 붉고, 중성 부근에서 파랗게 되기 때문에, 꽃의 색은 안토시아닌이 국부적으로 존재하는 액포의 pH에 의존한다. 또한, Al³ ⁺, Mg² ⁺ 등의 금속 이온과의 공존에 의한 금속 착체의 형성이 꽃의 색깔에 중요한 영향을 주는 경우도 있다. 시행 착오와 예의 검토한 결과, 여기에서는 꽃잎으로의 델피니딘의 비율을 높이는 방법을 고안하였다.

먼저, 청보라색의 카네이션의 작출과 같은 수법으로 파란색 장미의 작출을 시도하였다.

즉 흰 장미 112 품종을 해석하여 DFR 결손주의 분류를 시도하였지만, 카네이션의 경우와는 달리 완전한 DFR 결손 계통을 취득할 수 없었다. 이것은 카네이션이 2배체인데 대하여, 통상 재배되는 장미는 4배체이기 때문에, 단일 유전자의 결손주를 구하는 것이 곤란하기 때문으로 생각된다.

다음으로, 꽃의 색깔이 흰 품종 Tineke에 팬지의 F3'5'H 유전자와 페튜니아의 DFR 유전자를 도입하였더니, 델피니딘의 축적은 인정되었지만, 양이 적어, 파란색 장미에는 이르지 않았다.

본 발명에 있어서는 장미의 내재성 플라보노이드 합성 경로에 속하는 효소인 DFR의 유전자를 유전자 공학의 수법을 이용하여 인위적으로 억제하고, 또한 팬지의 F3'5'H 유전자를 발현시키고, 또한 디히드로미리세틴을 환원하는 DFR 유전자를 발현시킴으로써 델피니딘의 함유율을 꽃잎에 포함되는 총 안토시아니딘 중 80-100%로 함으로써, 파란색 장미를 실현할 수 있었다.

디히드로미리세틴을 환원하는 DFR 유전자는 여기에서는 아이리스(붓꽃과), 니렘베르기아(가지과), 페튜니아(가지과)를 이용하였지만, 그 밖에 디히드로미리세틴을 환원하는 DFR 유전자의 기원으로서는 담배(가지과), 시클라멘(앵초과), 델피늄(미나리아재비과), 심비듐(난과), 용담(용담과), 리시안셔스(용담과) 등 페랄고니딘을 축적하지 않는 식물을 들 수 있다(Forkmann 1991 Plant Breeding 106 1-26 Johnson등, Plant J. 1999 19 81-85). 본 발명에 대하여 사용하는 DFR 유전자, 디히드로미리세틴을 쉽게 환원하는 유전자가 바람직하다.

또한, 본 발명에 대하여서는 장미의 내재성의 플라보노이드 합성 경로에 속하는 효소인 플라보노이드 3'-수산화 효소(F3' H)의 유전자를 유전자 공학의 수법을 이용하여 인위적으로 억제하고, 또한 팬지의 F3'5'H 유전자를 발현시킴으로써, 델피니딘의 함유율을 꽃잎에 포함되는 총 안토시아니딘 중 80-100%로 함으로써, 파란색 장미를 실현할 수 있었다.

본 발명에 의하여 얻어진 장미는 지금까지 없는 꽃의 색깔을 가지는 것이고, 본 발명에 의하여, 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트로, 레드-퍼플 그룹, 퍼플 그룹, 퍼플-바이올렛 그룹 뿐만 아니라, 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에 속하는 꽃의 색깔을 가지는 장미를 제공할 수 있다.

실시예

이하 실시예에 따라서, 발명의 상세에 대하여 설명한다. 분자생물학적 수법은 특히 명기하지 않는 이상 Molecular Cloning(Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co1d Spring Harbor, New York)에 의한 것이다.

실시예 1. 꽃의 색깔 측정 방법

꽃잎 색채 평가는 분광 측색계 CM2022(미놀타 가부시키가이샤, 일본)를 이용하여 10도 시야, D65 광원에서 측정하고, 색채 관리 소프트 SpectraMagic(미놀타 가부시키가이샤, 일본)에 의하여 해석을 실시하였다. 또한, 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC) 번호는 육안 판정 및 상기 기기 측정에 의하여 얻어진 색채치(CIE L*a*b*표색계)를 기초로, 색채 분류 시스템 Version2. 1. 1(가부시키가이샤 니혼소고겐큐쇼(일본), 일본공개특허공보 2002-016935호)를 이용하여 근사색 조합을 행하였다. 이 시스템을 이용함으로써 객관적으로 근사한 RHSCC 번호를 선택할 수 있다.

이 방법으로 종래의 이른바 “파란색 장미"로 불리는 품종의 꽃잎의 색채를 측정하고, RHSCC에 있어서의 근사색을 구하였더니, 블루문이나 마담 비오레는 186d(GREYED-PURPLE GR0UP), 라반데(Lavande)는 186c(GREYED-PURPLE GR0UP), 청룡은 l89d(GREYED-GREEN GR0UP), 블루헤븐은 198d(GREYED-GREEN GR0UP)였다. 따라서 이러한 품종은 파란색 장미로 불리고 있지만 RHSCC 번호의 분류에서는 그레이 그룹이며, 본 발명이 목적으로 하고 있는 파란색은 가지고 있지 않다.

실시예 2. 플라보노이드의 분석

1) 꽃잎 색소의 추출

동결 건조한 꽃잎 0.5g를 4ml의 0.1%TFA를 포함한 50% 아세트니트릴(CH₃CN) 중에서 20분간, 초음파 하에서 추출하여 0.45㎛의 필터로 여과하였다. 이 추출액의 안토시아닌의 고속 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석은 이하의 조건으로 하였다. 컬럼은 RSpak DE-413L(4.6mmφ x 25cm, 쇼코가부시키가이샤)을 이용하여 유속 0.6 ml/min로, 이동상은 0.5% 트리플루오르 초산(TFA)을 포함하는 10%에서 50%의 CH₃CN/H₂O의 직선 농도 구배 15분간 후, 0.5% TFA를 포함한 50%의 CH₃CN/H₂O로 10분간의 이소클래틱 용출을 실시하였다. 검출은 포토다이오드 어레이 검출기 SPD-M10A(시마즈세이사쿠쇼)를 이용하여 600-250nm의 파장 영역을 검출하고, 520nm의 흡광도의 면적에 의하여 각 안토시아닌의 존재비를 구하였다.

2) 안토시아니딘의 분석

상기 여과액 0.2ml를 유리 시험관중에서 감압 건조시켜, 0.2ml의 6N염산(HCl)에 용해하고, 100℃에서 20분간, 가수분해를 실시하였다. 분해 후의 안토시아니딘은 0.2ml의 1-펜탄올로 추출하고, 유기층을 HPLC로 이하의 조건에 의하여 분석하였다. 컬럼은 ODS-A312(6mm x 15cm, 와이엠시가부시키가이샤)를 이용하여 이동상에는 CH₃COOH:CH₃0H:H₂0=15:20:65의 용액을 이용하여 유속 1ml/min로 용출하였다.

검출은 포토다이오드 어레이 검출기 SPD-MlOA(시마즈세이사쿠쇼)로 600-400nm의 스펙트럼을 측정하고, 흡수 극대(λmax) 및 리텐션 타임(R. T. )으로 동정하여 520 nm의 흡광도의 면적으로 정량하였다. 이 HPLC 조건 하에서 델피니딘 및 시아니딘의 리텐션 타임 및 λmax는 4.0분, 5.2분 및 534nm, 525nm였다. 동정, 정량에는 후나코시가부시키가이샤에서 구입한 델피니딘 염산염 및 시아니딘 염산염을 표품으로서 이용하였다.

3) 플라보놀의 분석

꽃잎의 추출여과액 0.2ml를 1.5ml의 에펜돌프 튜브 중에서 감압 건조시켜 0.2ml의 0.1M 인산 칼륨 완충액(KPB) pH4.5에 용해하고, 6 유닛의β-글루코시다아제(신니혼가가쿠가부시키가이샤)와 1 unit의 나린게나아제(Sigma Chemical Co., M0, USA)를 가하고 30℃에서 16시간 유지하였다. 반응 후, 0.2ml의 90% CH₃CN를 효소 반응액에 첨가하고, 반응을 종료하였다. 이 액을 0.45㎛의 필터로 여과하고, 아래와 같은 조건으로 HPLC를 실시하였다.

컬럼은 Develosil C30-UG-5(4.6mmφ x 15cm, 노무라가가쿠가부시키가이샤)를 이용하여 유속 0.6ml/min로, 이동상은 0.1% TFA를 포함한 18% 내지 63%의 CH₃CN/H₂0의 직선 농도 구배 10분간 후, 0.1% TFA를 포함하는 63%의 CH₃CN/H₂O의 이소클래틱 용출을 10분간 실시하였다. 검출은 포토다이오드 어레이 검출기 SPD-M10A를 사용하여, 400-250nm의 파장 영역을 검출하였다. 이 조건하에서 켐페롤과 케르세틴의 R.T와λmax는 각각 11.6분간, 365nm 및 10.3분간, 370nm였다. 정량은 A330nm의 면적으로 실시하고, 표품으로서 후나코시가부시키가이샤의 켐페롤과 케르세틴을 이용하였다.

실시예 3. pH의 측정방법

-80℃에서 1시간 이상 동결한 장미 꽃잎 약 2g를, 호모디나이저를 이용하여 짜서, 착즙액을 얻었다. 이것을 pH미터(F-22, 호리바세이사쿠쇼)에 미소 전극 6069-10C(호리바세이사쿠쇼)를 접속하여 pH를 측정하였다.

실시예 4. 장미의 형질 전환

장미의 형질 전환에 관하여서는 이미 많은 방법이 보고되고 있고(예를 들어 Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888(1994), US 5480789, US 5792927, EP 536 327 Al, US 20010007157Al), 이러한 방법에 따라서 형질 전환을 실시할 수 있다. 구체적으로는 어그로박테리움·튜메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) Ag 1O주(Lazo et al. Bio/Techno1ogy 9:963-967, 1991)의 균액 중에, 무균 모종의 잎으로부터 유도한 장미의 칼루스 조직을 5분간 담그고, 멸균 여과지로 여분의 균액을 닦아낸 후, 계대용 배지에 이식하고, 2일간 어두운 곳에서 공존 배양하였다.

그 후, 카르베니실린을 40Omg을 가한 MS 액체 배지에서 세정하고, 계대용 배지에 카나마이신 50mg/L와 카르페니시린 200mg/L를 가한 선발·제균용 배지에 이식하였다. 선발 배지상에서 생육 저해를 받지 않고, 정상적으로 증식하는 부분의 이식과 배양을 반복하여, 카나마이신 내성 유합 조직을 선발하였다. 카나마이신 내성을 나타낸 형질 전환 유합 조직을, 카나마이신 50mg/L, 카르베니실린 20Omg/L를 첨가한 재분화용의 배지에서 배양하고, 카나마이신 내성 슈트를 얻었다. 얻어진 슈트는 1/2 MS 배지에서 발근시킨 후, 순화를 실시하였다. 순화 개체는 이식후, 폐쇄계 온실에서 재배하여 개화시켰다.

실시예 5. 장미의 플라보노이드 유전자의 취득

장미 품종 카디날 꽃잎 유래의 cDNA 라이브러리를 페튜니아의 DFR 유전자(WO96/36716에 기재)를 프로브로 하여 스크리닝하고 장미의 DFRcDNA를 취득하고, pCGP645로 하였다. 상세사항은 이미 보고되고 있다(Tanaka et al. Plant Cell Physio1. 36, l023-1031 1995).

마찬가지로 동일한 라이브러리를 페튜니아의 칼콘신타제-A(CHS-A) 유전자(Koes et al. Gene(1989) 81, 245-257)와 금어초의 안토시아니딘신타제(ANS) 유전자(Martin et al. PlantJ, (1991) 1, 37-49)로, 공지의 방법(Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-10311995)으로 스크리닝함으로써 장미의 칼콘신타제(CHS)와 안토시아니딘신타제(ANS)의 호모로그를 취득하고, 각각 pCGP634와 pCGP1375로 하였다. 장미의 CHS의 염기 배열을 배열표·배열 번호:5에, 장미의 ANS의 염기 배열을 배열 번호:6으로 각각 나타낸다.

실시예 6. 흰색 장미 클리닝

유전자 재조합의 수법으로 파란색 품종을 작출하기 위하여는 내재성의 안토시아닌 합성 경로와 도입하는 유전자(구체적으로는 F3'5'H 유전자)와의 경합을 회피하기 위하여 DFR 유전자만이 결손되어 있는 품종을 선발하고, 그 품종에 페튜니아 유래 DFR 유전자와 F3'5'H 유전자를 도입하면 좋다(WO96/36716).

흰 장미의 품종은 다수 있는데, 이 안에서 DFR 유전자만이 결손되고, 다른 안토시아닌 생합성 효소 유전자는 정상적으로 발현하고 있는 품종을 탐색하였다. 꽃의 색이 희어지는 원인은 안토시아닌 생합성에 관련되는 구조유전자의 변이 또는 결실에 의한 경우와 안토시아닌 생합성에 관련되는 구조유전자의 전사를 제어하는 전사 조절 인자의 결실에 의한 경우가 있는 것으로 생각된다. 여기에서는 WO96/36716에 따라, DFR 유전자의 mRNA가 결손되어 있는 장미를 탐색하였다.

주로 흰색 장미 112 계통에 대하여 우선 실시예 1에 기재한 방법에 의하여 꽃잎의 플라보노이드의 조성을 분석하고, 플라보놀이 고축적되어 있는 계통을 선택하였다. 그 후, 꽃잎의 착즙의 pH를 측정하고, 상대적으로 pH가 높은 품종 80 계통을 일차 후보로 하였다.

다음으로, 이들 품종의 꽃잎으로부터 RNA를 추출하였다. RNA의 추출은 공지의 방법에 따랐다(Tanaka et al. Plant Cell Physio1. 36, 1023-l031 1995). 얻어진 RNA를 이용하여 장미 DFR 유전자(Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031l995)와 장미 안토시아니딘신타제(ANS) 유전자에 대응하는 mRNA의 유무를 조사하였다. RT-PCR법에 의하여, 내재성의 DFR mRNA의 발현량이 낮고, 또한 ANS mRNA량이 정상적인 레벨의 품종 8 품종(WKS-11, 13, 22, 36, 43, 화이트 키라니, 쓰루 No. 2, 티네케)를 선발하였다.

또한, RT-PCR은 각각의 품종의 꽃잎으로부터 얻은 RNA를 이용하여 Super Script First-strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)를 이용하였다. DFR mRNA의 검출에는 DFR-2F(5'-CAAGCAATGGCATCGGAATC-3')(배열 번호:13)과 DFR-2B(5'-TTTCCA, GTGAGTGGCGAAAGTC-3')(배열 번호:14)의 프라이머를, ANSmRNA의 검출에는 ANS-2F(5'-TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3')(배열 번호:15)와 ANS-2B(5'-CCTCACCTTCTCCCTTGTT-3')(배열 번호:16)의 프라이머를 이용하였다.

이러한 8 품종에 대해서, 노잔 해석을 하여(표 1), DFRmRNA 레벨이 낮은 경향을 나타내고, ANSmRNA 레벨이 정상적이고, 또한 배양 특성이 뛰어나 형질 전환 가능한 2 품종(티네케, WKS36)에 대하여 실제로 델피니딘 생산용 콘스트럭트를 도 입하는 것을 결정하였다.

실시예 7· 티네케로의 장미 유래 DFR 유전자의 도입

pE2113(Mitsuhara et al. Plant Vell Physiol. 37, 45-59 1996)는 인핸서 배열을 반복한 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S(El235S) 프로모터와 노파린신타제ㅌ터미네이터를 가진다. 이 플라스미드를 SacI로 소화하고, BluntingKit(다카라)를 이용하여 평활 말단으로 하였다. 이 DNA 단편을 8bp의 SaU 링커(다카라)와 라이게이션하고, 얻어진 플라스미드를 pUE5로 하였다. pUE5를 HindIII와 EcoRI로 소화하여 얻을 수 있는 약 3kb의 DNA 단편을 HindIII와 EcoRI로 소화한 pBin19(Bevan M, Binary Agrobacterium Vector for plant transformation. Nucl Acid es. 12. 8711-21, 1984)에 도입하고, 얻어진 플라스미드를 pBE5로 하였다. pCGP645를 BamHI와 XhoI로 소화하여 완전한 길이의 장미 DFRcDNA를 포함한 DNA 단편을 얻었다. 이것을 BamHI와 XhoI로 소화한 pBE5에 연결하고, pBERDl(도 2)로 하였다. 이 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens Ag 1O주에 도입하였다.

백색계 장미 품종 「티네케」pBERDl(도 2)를 도입하고, 18 개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체 중 6 개체에서 꽃의 색깔이 변화하였다. 흰색으로부터 핑크에 이르는 명확한 꽃의 색깔을 볼 수 있었던 2 개체에 있어 색소 분석을 실시했는데, 모두 시아니딘, 페랄고니딘의 축적이 확인되었다(표 2). 이 결과에 의하여, 품종 티네케 DFR 유전자가 결손된 품종인 것이 추측되었다.

개체 번호	Cya(mg/g)	Pe1(mg/g)
1	0.014	0.005
2	0.0l4	0.006

Cya:시아니딘, PeL 페랄고니딘

실시예8 . 티디케로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#18)과 페튜니아 유래 DFR 유전자의 도입

팬지(품종 블랙 팬지)의 꽃봉오리의 꽃잎으로부터 Turpen와 Griffith의 방법(BioTechniques 4:11-15, 1986)에 따라서 RNA를 추출하고, oligotex-dT(Qiagen)를 이용하여 polyA+RNA를 정제하였다. 본polyA+RNA와 λZAPII/GigapackII 클로닝 키트(Stratqgene)를 이용하여, 팬지 꽃봉오리의 꽃잎에 유래하는 cDNA 라이브러리를 제작하였다. NZY 플레이트상에서 생육시킨 약 10O,OOOpfu의 퍼지 플라크를 Co1ony/PlaqueScreen(Dupont)에 전사한 후, 제조원이 추천한 방법에 따라서 처리를 하였다. 이들을 ³²P로 라벨한, 페튜니아 Hf1cDNA(pCGP602, Holton et al., Nature, 366, p276-279, 1993)을 프로브로 하여 스크리닝하였다.

멤블레인을 하이브리다이제이션 버퍼(10%(v/v) 폼 아미드, 1M NaC1, 10%(w/v) 텍스트란 설페이트, 1% SDS) 중에서 42℃, 1시간 프리(pre)하이브리다이제이션한 후, ³²P 라벨한 프로브를 1 xl0⁶cpm/ml가 되도록 가하고, 42℃, 16시간 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 후, 멤블레인을 2xSSC, 1% SDS 중, 42℃, 1시간 세정하고, 또한 새로운 세정액으로 바꾸어 1시간 세정하였다. 세정 후의 멤블레인을 코닥 XAR 필름에 증감 스크린과 함께 감광시켜, 하이브리다이제이션 시그널을 검출하였다.

얻어진 cDNA의 해석의 결과, 페튜니아 Hf1과 높은 동일성을 나타내는 2 종류의 cDNA를 얻은 것을 알 수 있었다. 이 2 종류의 cDNA을 팬지의 F3', 5'H cDNA,bp#18(pCGP1959) 및bp#40(pCGP1961)로 하였다. #18의 염기 배열을 배열 번호:1, 그 아미노산 배열을 배열 번호:2에 나타내고, #40의 염기 배열을 배열 번호:3, 그 아미노산 배열을 배열 번호:4에 나타낸다.bp#18와bp#40은 DNA 레벨로 82%의 동일성을 가진다. 또한bp#18과bp#40은 모두 DNA 레벨로, 페튜니아 Hf1와 60%, 페튜니아 Hf2(Holton et al., Nature, 366, p276-279, 1993)와 62%의 동일성을 나타낸다.

한편, pUE5를 EcoRI로 소화하고, Blunting Kit(다카라)를 이용하여 평활 말단으로 한 DNA 단편과 8bp의 HindIII 링커1(다카라)으로 라이게이션하고, 얻어진 플라스미드를 pUE5H로 하였다. 팬지 유래의 F3'5'H #18 cDNA를 포함한 플라스미드 pCGP1959(를 BamHI로 완전 소화하고, 또한 XhoI로 부분 소화하여 얻어진 약 1.8kb의 DNA 단편을 회수하였다. 한편, 이것과 BamHI와 XhoI로 소화한 pUE5H와 라이게이션하여 얻은 플라스미드를 pUEBP18로 하였다.

한편, 페튜니아 DFRcDNA를 포함한 DNA 단편을, pCGP1403(WO96/36716)를 BamHI와 XhoI로 소화함으로써 회수하고, 이 DNA 단편과 BamHI와 XhoI로 소화한 pBE5와 연결하고, pBEPD2로 하였다. 다음으로 pUEBP18를 HindIII로 부분 소화하고, El235S 프로모터, 팬지 유래 F3'5'H #18 cDNA, nos 터미네이터를 포함한 약 2.8kb의 DNA 단편을 회수하였다. 이 단편과 pBEPD2를 HindIII로 부분 소화한 DNA 단편을 연결하고, 바이너리 벡터 플라스미드 pBPDBP2(도 3)를 얻었다.

이 플라스미드를 어그로박테리움·튜메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) Ag 1O주에 도입하였다. 백색계 장미 품종 「티네케」에 pBPDBP2(도 3)를 도입하고, 40 개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체 중 23 개체로 꽃의 색깔이 변화하고, 색소 분석을 실시한 19 개체 중 16 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 3). 델피니딘 함유율은 최고 100%(평균 87%)가 되었지만, 색소량이 최고 로도 꽃잎 1g당 0.035mg와 극히 적고, 꽃의 색깔은 RHS 칼라 챠트 158d(YELL0W-WHITE GR0UP)으로부터, 56a(RED GR0UP)이나 65b(RED-PURPLE GR0UP)으로의 변화에 그치고 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않고, 목적으로 하는 파란 색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 9. 티네케로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 페튜니아 유래 DFR 유전자의 도입

플라스미드 pE2113(Mitsuhara et al. Plant Vel1 Physio1. 37, 45-59 1996)(을)를 HindHI와 XbaI로 소화하여 얻을 수 있는 약 800bp의 DNA 단편을 회수하고, HindIn와 XbaI로 소화한 pBin19(Bevan M, Binary Agrobacterium Vector for plant transformation. Nucl. Acid Res. 12. 8711-21, 1984)에 연결하였다. 얻어진 플라스미드를 pCGP1391로 하였다. 한편, pCGP669(WO94/28140에 기재)는 페튜니아의 칼콘신타제 A(CHS-A) 유전자의 프로모터를 포함하고 있다. 이 플라스미드를 EcoRI로 소화한 후, 평활 말단화하고, 또한 HindIII로 소화하였다.

이 약 700bp의 DNA 단편을 HindIII와 SnaBI로 소화한 pCGP1391와 연결하고, 얻어진 플라스미드를 pCGP1707로 하였다. 또한, 팬지 유래의 F3'5'H #40 cDNA를 포함한 플라스미드 pCGP1961를 BamHI로 완전 소화하고, 또한 XhoI로 부분 소화할 수 있을 수 있는 약 1.8kb의 DNA 단편을 회수하고, 이것과 Ban1HI와 XhoI로 소화한 pUE5H와 라이게이션하여 얻어진 플라스미드를 pUEBP40로 하였다. pUEBP40를 EcoRV와 XbaI로 소화한 약 5.5kb의 DNA 단편을 회수하였다.

이 단편과 pCGP1707를 HindIII로 소화한 후 평활 말단화하고, 또한 XbaI로 소화하여 얻은 약 70Obp의 단편을 연결하여, pUFBP40를 얻었다. 다음으로 pUFBP40를 HindIII로 부분 소화하고, 컬리플라워 35S 프로모터 인핸서, CHS-A프로모터, 팬지 유래 F3'5'H #40 cDNA, nos 터미네이터를 포함한 약 3.4kb의 DNA 단편을 회수하였다. 이 단편과 pBEPD2를 HindIII로 부분 소화한 DNA 단편을 연결하고, 바이너리 벡터 플라스미드 pBPDBP8(도 4)를 얻었다. 이 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens Ag 1O주에 도입하였다.

백색계 장미 품종 「티네케」에 pBPDBP8(도 4)를 도입하고, 53개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체 중 17 개체로 꽃의 색깔이 변화하고, 색소 분석을 실시한 9 개체중 8 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 4). 델피니딘 함유율은 최고 93%(평균 79%)가 되었지만, 색소량이 최대에서도 꽃잎 1g당 0.014mg으로 극히 작고, 꽃의 색깔은 RHS 칼라 챠트 158d(YELL0W-WHITE GR0UP)으로부터, 56a(RED GR0UP)이나 65b(Red-Purple Group)으로의 변화에 그쳐 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에 이르지 않고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다. 또한, 이상은 품종 티네케가 DFR 유전자만이 결손된 품종이 아니라는 것을 시사하고 있다.

실시예 10. WKS36로 의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#18)와 페튜니아 유래 DFR 유전자의 도입

백색계 장미 「WKS36」에 pBPDBP2(도 3)를 도입하고, 138 개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체중 10 개체에서 꽃의 색깔이 변화하고, 모든 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 5). 델피니딘 함유율은 최고 91%(평균 60%)가 되었지만, 색소량이 최대로도 꽃잎 1g당 0.033mg으로 극히 작고, 꽃의 색깔은 매우 옅은 핑크로의 변화에 그쳐 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에 이르지 않고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다. 또한, 이상은 품종 WKS36은 DFR 유전자만이 결손된 품종이 아니라는 것을 시사하고 있다.

실시예 11. WKS 36로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자와 페튜니아 유래 DFR 유전자의 도입

pUCAP(van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995)의 AscI 부위를 PacI 링커로 치환한 플라스미드를 pUCPP로 하였다. 한편, 장미의 칼콘신타제 프로모터와 팬지 유래의 F3'5'H #18 cDNA와 nos 터미네이터를 연결한 발현 카세트를 이하와 같이 얻었다.

장미 품종 Kardina1의 어린 잎으로부터 염색체 DNA를 추출하였다(Tanaka et al., Plant Cell Physio1., 36:1023-1031, 1995). 약l00μg의 DNA를 Sau3AI로 부분 소화하고, 자당 밀도 구배에 의하여 약 20kb의 DNA화분을 회수하였다.

이것과 BamHI로 소화한 Lambda 살균 바이러스 EMBL3(예를 들어 스트라타진사)와 연결하고, 제조자가 추천하는 방법으로 염색체 DNA 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리를 장미의 칼콘신타제 cDNA(DNA 데이터 페이스 GenBank의 억세션 번호 AB038246)를 프로브로 하여 공지의 방법(Tanaka et al., Plant Cell Physio1., 36:1023-1031, 1995)로 스크리닝하였다. 얻어진 칼콘신타제의 염색체 클론 중 Lambda CHS20에는 칼콘신타제의 개시 코돈의 상류 약 6.4kb의 DNA 배열이 포함되어 있었다. Lambda CHS20를 HindIII와 EcoRV로 소화하여 얻어진 약 2.9kb의 DNA 단편에는 칼콘신타제의 프로모터 영역이 포함되어 있다.

이 단편을 pUC19(Yanisch-PerronC et al., Gene33:103-U9, 1985)를 HindIII와 SmaI로 소화한 단편과 연결하였다. 이것을 pCGPU16로 하였다. 이것에 포함되는 칼콘신타제 프로모터 부분의 배열은 배열 번호:21에 나타내었다. pCGP1116를 HindIII와 KpnI로 소화하여 얻은 약 2.9kb의 DNA 단편과 pJB1(Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Dissertation(학위 논문), Stanford University, USA, 1994)를 HindIII와 KpnI로 소화하여 얻은 DNA 단편을 연결하여 pCGP197를 얻었다.

한편, pUE5를 SacI와 KpnI로 소화하여 얻은 약 300bp의 노파린신타제 터미네이터를 포함한 DNA 단편을 평활 말단화하고, EcoRV와 BamHI로 소화하고 또한 평활 말단화한 pBluescriptSK-와 결합하였다. 얻어진 플라스미드 중 타미네이터의 5'측이 pBluescriptSK-의 SalI에 가까운 것을 pCGP1986로 하였다. pCGP1986를 XhoI로 소화하고, 평활 말단화하고, 또한 SalI로 소화한 DNA 단편과 pCGP197를 HindIII로 소화한 후 평활 말단화하고 또한 SalI로 소화하여 얻은 DNA 단편을 연결하여, pCGP2201를 얻었다.

또한 pCGP2201를 SalI로 소화하고, 평활 말단화한 DNA 단편과 pCGP1959를 BamHI와 KpnI로 소화하고 또한 평활 말단화한 약 1.7kb의 DNA 단편(팬지의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소 유전자를 포함한다)를 연결하였다. 얻어진 플라스미드 중 장미 칼콘신타제 프로모터가 팬지의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소 유전자를 순방향으로 전사할 수 있는 방향으로 삽입된 것을 pCGP2203로 하였다. 플라스미드 pCGP2203를 HindIII와 SacI로 소화함으로써 회수하였다. 이 DNA 단편을 pUCPP의 HindIII와 SacI 부위로 클로닝하고, 이것을 pSPB459로 하였다. 다음으로 플라스미드 pE2113를 SnaBI로 소화하고, BamHI 링커(다카라)를 삽입하여 얻어진 플라스미드를 pUE6로 하였다.

pUE6를 HindIII와 BamHI로 소화하여 얻은 약 700bp의 DNA 단편과 pCGP1405(WO96/36716)를 BamHI와 BglII로 소화하여 얻은 약 2.2kb의 DNA 단편과 HindIII와 BamHI로 소화한 바이너리 벡터 pBinplus(van Engelen et a1. Transgenic Research4, 288-290, 1995)를 연결하여, pSPB460를 얻었다. pSPB459를 PacI로 소화하여 얻은 약 5kb의 DNA 단편을, pSPB460의 PacI 사이트에 도입함으로써, 바이너리벡터상에서 페튜니아 DFR와 팬지 F3'5'H #18 유전자가 순방향으로 연결된 pSPB461(도 5)를 얻었다. 본 플라스미드는 식물에 있어서는 페튜니아 유래의 DFR 유전자를 구성적으로 발현하고, 팬지 유래의 F3'5'H #18 유전자를 꽃잎 특이적으로 전사하도록 되어 있다. 이 플라스미드를 어그로박테리움·튜메페이션스 (Agrobacterium tumefaciens) Ag 10주에 도입하였다.

백색계 장미 「WKS36」에 pSPB461(도 5)를 도입하고, 229 개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체중 16 개체로 꽃의 색깔이 변화하고, 색소 분석을 실시한 12 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 6).

델피니딘 함유율은 최고 79%(평균 58%)가 되었지만, 색소량이 최대로도 꽃잎 1g당 0.031mg으로 극히 적고, 꽃의 색깔은 매우 옅은 핑크로의 변화에 그쳐 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에 이르지 않고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다. 또한, 이상은 품종 WKS36은 DFR 유전자만이 결손된 품종이 아니라는 것을 시사하고 있다.

실시예 12. WKS36로 의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#18), 페튜니아 유래 DFR 유전자 및 차조기 유래 안토시아닌3 -글루코시드 아실기 전이 효소 유전자의 도입

차조기(japanese basil) 유래의 히드록시시나모일 CoA:안토시아닌3-글루코시드 아실기 전이 효소(3AT) 유전자에 개시 코돈을 부가한 유전자를 pSAT208F(Yonekura-Sakakibara et al. Plant Cell Physiol. 41, 495-502, 2000)으로 하였다. pSPB580(PCT/AUO3/00079)를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 3. 9kb의 DNA 단편과 pSAT208F를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 1. 8kb의 DNA 단편을 연결하였다.

얻어진 플라스미드를 AscI로 소화함으로써, El235S 프로모터와 차조기 3AT 유전자와 페튜니아 포스폴리피드트란아스파 단백질 유래의 터미네이터를 포함한 DNA 단편을 회수하였다. 이 DNA 단편을 전술의 pSPB461의 AscI 부위에 삽입하고, ㄴ차조기 유래 3 AT, 페튜니아 유래 DFR, 팬지 유래 F3'5'H #18의 유전자의 전사 방향이 순방향으로 되어 있는 플라스미드 pSPB472(도 6)를 얻었다.

본 플라스미드는 식물에 있어서는 차조기 유래 3 AT유전자와 페튜니아 유래 DFR 유전자를 구성적으로 발현하고, 팬지 유래 F3'5'H#18 유전자를 꽃잎 특이적으로 전사하도록 되어 있다. 이 플라스미드를 어그로박테리움·튜메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) Ag 10주에 도입하였다.

백색계 장미「WKS36」에 pSPB472(도 6)를 도입하고, 75 개체의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체중‘4 개체에서 꽃의 색깔이 변화하고, 색소 분석을 실시한 3 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 7). 델피니딘 함유율은 최고 67%(평균 49%)가 되었지만, 색소량이 최대로도 꽃잎 1g당 0.011mg으로 극히 적고, 꽃의 색깔은 매우 옅은 핑크로의 변화에 그쳐 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에 이르지 않고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다. 또한, 이상도 품종 WKS36은 DFR 유전자만이 결손된 품종이 아니라는 것을 시사하고 있다.

이와 같이 다수의 흰 장미를 스크리닝했음에도 불구하고 DFR 유전자만이 결손된 품종을 얻을 수 없었다. 즉, 파란색 카네이션을 작출한 방법(WO94/28l40)으로는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 13· 코서프레션에 의한 장미 유래 DFR 유전자의 억제

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」에 pBERD1를 도입하고, 26 개체의 형질 전환체를 얻었다. 그러나, 꽃의 색깔의 변화한 개체는 전혀 얻지 못하고, 코서프레션법으로는 장미의 내재성의 DFR 유전자를 억제하는 것이 곤란하다는 것이 시사되었다.

실시예 14. 유색 장미의 스크리닝

다음으로 유색의 장미 중에서, 파란색 장미를 제작하기 위한 품종을 선발하기로 하였다.

유색의 장미 중에서 상대적으로 푸른 기를 띠고 있는 품종을 중심으로 육안으로 136 계통을 선발하고, 89 계통에 대해 색소 분석을 실시하였다. 조사한 유색 장미의 분석치를 표 8 내지 표 10에 나타낸다.

실시예 15. 라반데로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토 시아닌5 -아실기 전이 효소 유전자의 도입

안토시아닌을 방향족 아실기에 의하여 수식함으로써 안토시아닌을 안정시키고, 또한 그 색을 푸르게 할 수 있다(예를 들어, WO96/25500). 아실화한 델피니딘형 안토시아닌의 생산을 목표로 하여 이하의 실험을 실시하였다.

토레니아 품종 써머 웨이브 꽃잎으로부터 RNA를 얻고, 또한 이로부터 polyA+RNA를 조제하였다. 이 polyA⁺RNA로부터λZAPII(Stratagene사)를 벡터로 하는 cDNA 라이브러리를 directional cDNA 라이브러리 제작 키트(Stratagene사)을 이용하여 제조ㅅ사 추천하는 방법으로 제작하였다. 토레니아의 주요 안토시아닌 5위의 글루코오스가 방향족 아실기에 의하여 수식되고 있기 때문에(Suzuki et al. Molecular Breeding 2000 6, 239-246), 토레니아 꽃잎에 있어서는 안토시아닌 아실기 전이 효소가 발현되고 있다.

안토시아닌 아실기 전이 효소는 Asp-Phe-Gly-Trp-Gly-Lys라고 하는 아미노산 배열이 보존되고 있고, 이것에 대응하는 합성 DNA를 프라이머로서 이용함으로써 안토시아닌 아실기 전이 효소 유전자를 취득할 수 있다(WO96/25500). 구체적으로는 토레니아 cDNA 라이브러리 제작 시에 합성한 1개 사슬 cDNAlOng를 주형으로 하고, 100ng의 ATC 프라이머1(5'-GA(TC) TT(TC) GGITGGGGIAA-3', I는 이노신)(배열 번호: 17), 10Ong의 올리고 dT 프라이머(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG-3')(배열 번호:18)을 프라이머로 하고, Taq 폴리메라제(다카라, 일본)를 이용하여 제조자가 추천하는 조건으로 PCR를 실시하였다.

PCR는 95℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 및 72℃에서 1분간을 1 사이클로 하는 반응을 25 사이클 실시하였다. 얻어진 약 40Obp의 DNA 단편을 Gene CleanII(BIO, 101. Inc.)에 의하여 제조자가 추천하는 방법으로 회수하고, pCR-TOPO으로 서브 클로닝하였다. 그 염기 배열을 결정하였더니 용담의 아실기 전이 효소유전자(Fujiwara et al·(1998) PlantJ. 1642l-431)에 상동인 배열을 볼 수 있었다. 또한 염기 배열은 다이프라이머법(아플라이드 바이오 시스템즈사)을 이용하여 시퀀서 310 또는 377(모두 바이오 시스템즈사)을 이용하여서 결정하였다.

이 DNA 단편을 DIG 표지 검출 키트(일본 롯슈)를 이용하여 DIG에 의하여 표지하고, 제조자가 추천하는 방법으로 토레니아의 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리다이제이션법에 의하여 스크리닝하였다. 얻어진 포지티브 시그널을 초래한 클론을 무작위로 12개 선택하고, 그것으로부터 플라스미드를 회수하고, 염기 배열을 결정하였다. 이들은 안토시아닌 아실기 전이 효소에 좋은 상동성을 나타내었다. 이러한 클론 중 pTAT7로 한 클론에 포함되는 cDNA의 전염기 배열을 결정하였다. 이 염기 배열을 배열 번호:7에 나타내고, 또한 그것에 대응하는 아미노산 배열을 배열 번호:8에 나타낸다.

pBE2113rGUS(Mitsuhara et al. PlantVellPhysio1. 37, 45-591996)를 SacI로 소화한 후, 평활 말단화하고, 8bp의 Xhd 링커(다카라)를 삽입하였다. 이 플라스미드의 BamHI와 Xhd 부위에 pTAT7를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 1.7kb의 DNA를 삽입하고, pSPB120를 얻었다. pSPB120를 SnaBI와 BamHI로 소화한 후 평활 말단화하여 라이게이션함으로써 pSPBl20'를 얻었다. 한편, 팬지 유래의 F3'5'H #40 cDNA를 포함한 플라스미드 pCGP1961를 BamHI로 완전 소화하고, 또한 XhoI로 부분 소화하여 얻은 약 1.8kb의 DNA 단편을 회수하고, 이것과 BamHI와 XhoI로 소화한 pUE5H와 라이게이션하여 얻은 플라스미드를 pUEBP40로 하였다.

pUEBP40를 SnaBI와 BamHI로 소화한 후 평활 말단화해 라이게이션함으로써 pUEBP40'를 얻었다. pUEBP40'를 HindIII로 부분 소화하여 얻은 약 2.7kb의 DNA 단편을 회수하고, pSPB120'를 HindIH로 부분 소화한 DNA 단편과 연결하였다. 얻어진 플라스미드 중, 바이너리 벡터상에서 라이트 보더측으로부터, 네오마이신 포스포트란스페라제 유전자, 팬지 유래 F3'5'H #40 유전자, 토레니아 유래 5 AT 유전자의 순서로 각각이 동일한 방향으로 연결된 바이너리 벡터를 pSPB130(도 7)로 하였다. 본 플라스미드는 식물에 있어서는 팬지 유래 F3'5'H #40 유전자와 토레니아 유래 5 AT 유전자 구성적으로 발현하고, 유전자를 꽃잎 특이적으로 전사하도록 되어 있다. 이 플라스미드를 어그로박테리움·튜메페이션스(Agrobacterium tumefaciens) Ag 10주에 도입하였다.

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 41 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 32 개체중 20 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 11 및 표 12). 델피니딘 함유율은 최고 71%(평균 36%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 186c(GRAYED-PURPLE GR0UP)에서 79d(PURPLE GR0UP)으로 변화하였다. 또한 이 때의 아실화 안토시아닌의 비율은 총 안토시아닌의 30% 정도에 그쳤다. 아실화된 안토시아닌의 스펙트럼을 측정하였더니, 그 흡수 극대 파장은 델피니딘 3, 5-디글루코시드보다 4nm 긴 파장 시프트하고 있었지만, 총 안토시아닌 중의 비율이 낮기 때문에, 꽃의 색깔에 명료한 효과를 주는 것에는 이르지 않았다.

실시예16 . WKS100 로의 팬지 F3'5'H 유전자 (#40)과 토레니아 유래 안토시아 닌5 - 아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 자색계 장미 「WKS100」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 146 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 63 개체 중 56 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 13 내지 표 15). 델피니딘 함유율은 최고 95%(평균 44%)였다. 꽃의 색깔은 RnS 칼라 차트 56d(RED GROUP)로부터 l86d(GRAYED-PURPLE GROUP)으로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 17. WKS1l6로 의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 자색계 장미 「WKS116」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 82 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 36 개체 중 33 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 16 및 표 l7).

델피니딘 함유율은 최고 80%(평균 73%)였다. 꽃의 색깔은 RnS 칼라 차트 196d(GRAYYED-GREEN GROUP)로부터 l86d(GRAYED-PURPLE GROUP)로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 18. WKS124로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아 닌5 -아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 자색계 장미 「WKS124」pSPB130(도 7)를 도입하고, 50 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소분기를 실시한 15 개체중 13 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 18). 델피니딘 함유율은 최고 95%(평균 82%)였다. 꽃의 색깔은 RnS 칼라 차트 52d(RED GROUP)로부터 l86d(GRAYED-PURPLE GROUP)로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 19. WKS132 로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

선홍색계 장미 「WKS132」pSPB130(도 7)를 도입하고, 24 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 7 개체중 6 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 19).

델피니딘 함유율은 최고 43%(평균 12%)였다. 꽃의 색깔은 RnS 칼라 차트 57a(RED PURPLE GR0UP)에로부터 66a(RED-PURPLE GROUP)로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 20. WKS133 으로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토 시아닌5 -아실기 전이 효소 유전자의 도입

짙은 적자계 장미 「WKS133」pSPB130(도 7)를 도입하고, 16 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 8 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 20). 델피니딘 함유율은 최고 34%(평균 11%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 53a(RED GR0UP)에서 61a(RED-PURPLE GR0UP)로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 21. WKS137 로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

짙은 적자계 장미 「WKS137」pSPB130(도 7)를 도입하고, 20 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 17 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 21). 델피니딘 함유율은 최고 1.3%(평균 0.4%)이었다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 61b(RED-PURPLE GROUP)로부터 변화는 볼 수 없었다.

실시예 22. WKS140 으로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 자색계 장미 「WKS140」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 197 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 45 개체 중 37 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 22및 표 23). 델피니딘 함유율은 최고 94%(평균 47%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 챠트 186d(GREYED-PURPLE GR0UP)에서 79d(PURPLE GR0UP)으로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 23. WKS77 로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

짙은 적자계 장미 「WKS77」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 35 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 한 17 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 24). 델피니딘 함유율은 최고 57%(평균 33%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 57a(RED-PURPLE GR0UP )에서 71a(RED-PURPLE GR0UP)으로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 24. WKS82 로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5 -아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 자색계 장미 「WKS82」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, 89 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 44 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 25 및 표 26). 델피니딘 함유율은 최고 91%(평균 49%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 186d(GREYED-PURPLE GR0UP)에서 80c(PURPLE-VI0LET GR0UP)으로 변화하였다. 그러나 RHSCC의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹, 블루 그룹에는 이르지 않았고, 목적으로 하는 파란색 장미를 얻을 수 없었다.

실시예 25. WKS91 로의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 토레니아 유래 안토시아닌5-아실기 전이 효소 유전자의 도입

옅은 오렌지색계 장미 「WKS91」에 pSPB130(도 7)를 도입하고, l0개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 2 개체중 1 개체에서만 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 27). 델피니딘 함유율은 최고 2%였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 43c(RED GR0UP)로부터 변화가 보이지 않았다.

실시예 26. 라반데에서의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 아이리스 유래 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

꺾은 푸른 아이리스 꽃잎으로부터 RNA를 얻고, 또한 이로부터 polyA⁺RNA를 조제하였다. 이 polyA⁺RNA로부터 λZAPII(Stratagene사)를 벡터로 하는 cDNA 라이브러리를 cDNA 라이브러리 제작 키트(Stratagene사)을 이용하여 제조자가 추천하는 방법으로 제작하였다. 아이리스의 DFR 유전자 단편은 용담의 DFR 유전자 단편을 취득한 보고와 동일하게 실시하였다(Tanaka et al. Plant Cell Physio1. 37, 7U-716, 1996).

얻어진 약 400bp의 DNA 단편을 진(gene) 클린에 의하여 제조자가 추천하는 방법으로 회수하고, pCR-TOPO로 서브 클로닝 하였다. 그 염기 배열을 결정하였더니 장미 DFR 유전자에 상동인 배열을 볼 수 있었다. 이 DNA 단편을 이용하여 아이리스 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고, 전체 길이의 아미노산 배열을 포함한 아이리스 DFRcDNA를 얻었다. 그 중 pSPB906로 한 클론에 포함되는 cDNA의 전염기 배열을 결정하였다. 이 염기 배열을 배열 번호:9에 나타내고, 그에 대응하는 아미노산 배열을 배열 번호:10에 나타낸다.

다음으로 pSPB580를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 3.9kb의 DNA 단편과 pSPB906를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 1.5kb의 DNA 단편을 연결하여 얻은 플라스미드를 pSPB909로 하였다.

식물 중에서 장미 DFRcDNA의 2개 사슬 RNA를 전사하는 것은 다음과 같이 제작하였다. pCGP1364(Tanaka et al. Plant Cell Physio1. (1995) 36 1023-1031)를 pstI로 부분 소화하여 얻은 약 3.5kb의 DNA 단편(Macl 프로모터, 장미 DFRcDNA, mas 터미네이터를 포함한다)을 pUC19(Yanisch-PerronC et al., Gene33:103-119, 1985)의 PstI 부위에 삽입함으로써 얻은 플라스미드 중 pUC19의 HindIII 부위가 Macl 프로모터에 근접하고 있는 것을 pCGP1394로 하였다.

다음으로, pCGP1394를 HindIII와 SacII로 소화하여 얻은 약 1.4kb의 DNA 단편과 pCGP1394를 PstI로 소화한 후 평활 말단화하고 또한 SacII로 소화하여 얻은 약 1.9kb의 DNA 단편과 pBinPLUS를 SacI로 소화한 후 평활 말단화하고, 또한 HindIII로 소화하여 얻은 바이너리 벡터 단편을 연결하여 pSPB185를 얻었다. pSPB185를 XbaI로 소화하고, 평활 말단화하고, Sa1I 링커와 라이게이션함으로써, pSPB521를 얻었다. pUE6를 HindIII와 BamHI로 소화하여 얻은 약 700bp의 DNA 단편과 pSPB521를 HindIII와 SacI로 소화하여 얻은 바이너리 벡터 DNA 단편과 pE2113를 BamHI와 SacI로 소화하여 얻은 GUS유전자 DNA 단편을 연결함으로써 pSPB528를 얻었다.

pSPB528는 인핸서를 가지는 컬리플러워 모자이크 바이러스 35S프로모터와 마노핀신타제 터미네이터의 사이에 구조 유전자를 삽입하여 식물로 발현시킬 수 있는 바이너리 벡터이다. 또한, pCGP645에 포함되는 장미 DFRcDNA의 5'비번역 영역 배열을 짧게 하기 위하여 pCGP645를 SmaI와 PvuI로 소화한 후 평활 말단화하고, 라이게이션하여 얻은 pCGP645s를 얻었다.

장미 DFRcDNA의 5'측 배열을, pCGP645s를 주형으로 리버스 프라이머와 합성 프라이머 RDF310(5'-CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTC-3')(배열 번호:19)를 프라이머로 이용하여 PCR에 의하여 증폭함으로써 취득하고, pCRTOPO으로 클로닝하였다. DNA의 염기 배열을 결정하여 PCR에 의한 에러가 없는 것을 확인하였다. 이것을 pSPB569로 하였다. 또 길이가 다른 장미 DFRcDNA의 5'측 배열을, pCGP645s를 주형으로 리버스프라이머와 합성 프라이머 RDF830(5'-GGGTCGACGCGGCCCTCTGCTTTCGG-3')(배열 번호:20)을 프라이머로 이용하여 PCR에 의하여 증폭함으로써 취득하고, pCRTOPO에 클로닝하였다. DNA의 염기 배열을 결정하여 PCR에 의한 에러가 없는 것을 확인하였다.

이것을 pSPB570로 하였다. pSPB528를 BamHI와 SacI로 소화하여 얻은 바이너리 벡터의 DNA 단편과 pSPB569를 SacI와 XhoI로 소화하여 얻은 0.3kb의 DNA 단편과 pSPB570를 BamHI와 SalI로 소화하여 얻은 DNA 단편을 연결하여 pSPB572를 얻었다. 본 벡터는 식물중에서 장미 DFRcDNA의 2개 사슬 RNA를 전사하도록 디자인되어 있다.

pUE6를 SacI로 소화하고, 평활 말단화하고, SalI 링커를 삽입하여 pUE8를 얻었다. pUE8를 HindIII와 EcoRI로 소화하여 얻은 DNA 단편을 pBinPLUS의 HindIII와 EcoRI 부위에 도입하고, pSPB189로 하였다. pSPB189를 BamHI와 SalI로 소화하여 얻은 약 3.7kb의 DNA 단편과 pCGP1961를 BamHI로 완전 소화하고 또한 XhoI로 부분 소화하여 얻은 약 1.8kb의 DNA 단편을 연결하여 pSPB567를 얻었다. pSPB572를 PacI 소화하고, 탈인산화 처리를 실시한 후, pSPB567를 PacI로 소화하여 얻은 약 2.8kb의 DNA 단편을 연결하고, nptII유전자와 팬지 유래의 F3'5'H #40이 동일한 방향으로 전사되는 플라스미드를 선택하고, pSPB905로 하였다.

pSPB905를 AscI로 소화하고, 탈인산화 처리를 실시한 후, pSPB909를 AscI로 소화하여 얻은 약 2.5kb의 DNA 단편을 연결하고, nptII 유전자와 같은 방향으로 아이리스 DFR 유전자가 전사되는 플라스미드를 얻고, pSPB919(도 8)로 하였다. 본 플라스미드는 장미에 있어서는 아이리스 유래의 DFR 유전자와 팬지 유래의 F3'5'H #40 유전자를 전사하고, 장미의 DFR 유전자의 발현을 2개 사슬 RNA의 전사에 의하여 억제할 것으로 기대된다. 이 플라스미드를 Agrobacterium tumefaciens Ag 10주에 도입하였다.

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」pSPB919(도 8)를 도입하고, 87 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 38 개체중 31 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 28 및 표 29). 델피니딘 함유율은 최고 100%(평균 76%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 186c(GREYED-PURPLE GR0UP)에서 85a, b(VI0LETGR0UP)로 크게 변화하였다.

장미 꽃잎으로부터 RNA를 전술한 바와 같이 추출하고, 아가로스 겔 전기 영동에 의하여 RNA를 분리한 후 하이본드 N(아마샴사)에 전사하였다(예를 들어 Tanaka et al. 1995). mRNA의 검출은 DIG Northern Starter Kit(Roche)를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 의하여 실시하였다. 장미 DFRmRNA의 검출에는 pCGP645(Tanaka et al. P1ant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995)를 주형으로서 이용하고 T7 프라이머로 전사한 것을 프로브로서 이용하였다.

팬지 F3'5'H#40 mRNA의 검출에는 pCGP1961를 주형으로서 이용하고 T7 프라이머로 전사한 것을 프로브로서 이용하였다. 아이리스 DFRmRNA의 검출에는 pSPB906를 주형으로서 이용하고 T7 프라이머로 전사한 것을 프로브로서 이용하였다. 색이 변화한 장미에 있어서는 팬지 유래 F3'5'H #40과 아이리스 DFR 유전자의 mRNA는 검출되었다. 한편, 장미 DFRmRNA는 숙주에 비하여 유의의하게 감소되어 있었고, 저분자량의 위치에 밴드가 검출되는 것으로 볼 때 장미 DFRmRNA의 분해가 일어나고 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 27. 라반데에서의 팬지 유래 F3'5'H 유전자(#40)와 니렘베르기아 유래 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

니렘베르기아(Nierembergiahybrida) 품종 페어리 벨파티오 라이트 블루(산토리프라워즈 가부시키가이샤)의 꽃잎으로부터 RNA를 얻고, 또한 이로부터 polyA⁺RNA를 조제하였다. 이 polyA⁺RNA로부터 λZAPII(Stratagene사)를 벡터로 하는 cDNA 라이브러리를 cDNA 라이브러리 합성 키트(Stratagene사)을 이용하여 제조자가 추천하는 방법으로 제작하였다. 이 cDNA 라이브러리를 DIG 표지한 페튜니아 DFRcDNA(pCGP1405에 유래)를 이용하여 스크리닝하였다. 스크리닝의 조건은 DIG 표지 시스템으로 제조자가 추천하는 플라크하이브리다이제이션 방법을 따랐다. 다만, 프리(pre)하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션 버퍼중의 폼 아미드 농도를 30%로 하고, 37℃에서 하룻밤 하이브리다이제이션을 실시하였다. 또한 멤블레인의 세정은 1% SDS를 포함한 5xSSC 중에서 55℃로 실시하였다. 얻어진 다수의 포지티브 시그널 중 20 플라크로부터 플라스미드를 회수하고, 리버스 프라이머(다카라)를 이용하여 염기 배열의 결정을 실시하였다. 이들은 페튜니아를 비롯하여 다른 식물의 DFR 유전자에 상동성을 나타내었다. 이들 중 pSPB709로 한 클론의 cDNA의 전배열을 결정하였다. 얻어진 염기 배열을 배열 번호:11에 나타내고, 그것에 대응하는 아미노산 배열을 배열 번호:12에 나타낸다.

pSPB580를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 3.9kb의 DNA 단편과 pSPB709를 BamHI와 XhoI로 소화하여 얻은 약 1.5kb의 DNA 단편을 연결하여 얻은 플라스미드를 pSPB910로 하였다. pSPB905를 AscI로 소화하고, 탈인산화 처리를 실시한 후, pSPB910를 AscI로 소화하여 얻은 약 2.5kb의 DNA 단편을 연결하고, nptII 유전자와 같은 방향으로 니렘베르기아 DFR 유전자가 전사되는 플라스미드를 얻어, pSPB920(도 9)로 하였다. 본 플라스미드는 장미에 있어서는 니렘베르기아 유래의 DFR 유전자와 팬지 유래의 F3'5'H #40 유전자를 전사하고, 장미의 DFR 유전자의 발현을 2개 사슬 RNA의 전사에 의하여 억제할 것으로 기대된다. 이 플라스미드를 어그로박테리움·튜메레이션스(Agrobacteriumtumefaciens) Ag 10주에 도입하였다.

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」에 pSPB920(도 9)를 도입하고, 56 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 24 개체중 23 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 30). 델피니딘 함유율은 최고 100%(평균 43%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 186c(GREYED-PURPLE GR0UP)에서 85b(VI0LET GR0UP)로 변화하였다.

실시예 28. 후대에의 형질의 유전

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」에 pSPB919(도 8)를 도입하여 얻은 형질 전환체(LA/919-2-13)를 화분 부모에 이용하여 어머니로서 비변형체의 WKS77 또는 WKS133를 이용하여 교배(스즈키 쇼조, 「장미, 꽃도감」, 쇼우갓칸, p. 256-260, 1990)하였다. 수분(受粉) 후 100일째에 과실을 수확하였다. 파종은 우선 과실 껍질을 벗기고 과육을 채취하고, 또한 과육을 잘라내어 배(胚)를 꺼낸 후, 샬레내의 적신 여과지 위에 올렸두었다. 파종시에 사용하는 물은 멸균수에 ppMn(plant Preservative Mixture, PLANT CELL TECHN0L0GY, INC. ) 1ml/l, 카나마이신을 5Omg/l 첨가한 것을 이용하여 정상적으로 발아한 것만을 이식하여, 육묘를 실시하였다.

얻어진 형질 전환체 후대 중, 색소 분석을 실시한 40 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다(표 31및 표 32). 델피니딘 함유율은 최고 99%(평균 46%)였다.

실시예 29. WKS140에서 의 팬지 F3'5'H #40 유전자와 아이리스 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

옅은 자색계 장미 품종 「WKS140」에 pSPB919를 도입하고, 89 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 79 개체중 74 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율 최고 100%(평균 68%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 186d(GREYED-PURPLE GROUP)로부터 주로 84c(VIOLET GROUP)으로 변화하였다.

실시예 30. WKS77에서 의 팬지 F3'5'H #40 유전자와 아이리스 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

짙은 적자계 장미 품종 「WKS77」에 pSPB919를 도입하고, 50 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 23 개체중 21 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 81%(평균 19%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 챠트 57a(RED-PURPLE GR0UP)에서 77b(PURPLEGROUP)으로 변화하였다.

실시예 31. WKS77에서 의 팬지 F3'5'H #40 유전자와 니렘베르기아 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

짙은 적자계 장미「WKS77」에 pSPB920를 도입하고, 30 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 27 개체 중, 26 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. ·델피니딘 함유율은 최고 98%(평균 60%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 57a(RE트 PURPLE GR0UP)에서 77b(PURPLEGROUP)로 변화하였다.

실시례 32 WKS77 로의 팬지 F3'5'H #40 유전자와 페튜니아 DFR 유전자의 발현과 장미 내재성 DFR 유전자의 억제

짙은 적자계 장미 「WKS77」에 pSPB921를 도입하고, 15 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 13 개체중 12 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 98%(평균 60%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 57a(RED-PURPLE GR0UP)에서 72b(RED-PURPLE GROUP)으로 변화하였다.

옅은 자색계 장미 품종 「라반데」에 pSPB919를 도입하여 얻은 형질 전환체(LA/919-4-l0)를 화분 부모에 이용하여 어머니로서 비변형체 장미 품종 블랙 바카라를 이용하여 실시예 28과 동일하게 교배를 실시하였다. 수분 후 100일째에 과실을 수확하였다. 파종은 우선 과실을 벗겨 과육을 채취하고, 또한 과육을 벗겨내고 배를 꺼낸 후, 샬레 내의 적신 여과지 위에 올려놓았다. 파종시에 사용하는 물은 멸균수에 PPMn(Plant Preservative Mixture, PLANT CELL TECHNOLOGY, INC.)를 1ml/l, 카나마이신을 50mg/l첨가한 것을 사용하고, 정상적으로 발아한 것만을 이식하여 육묘하였다.

얻어진 형질 전환체 후대 가운데, 색소 분석을 실시한 18 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 99.8%(평균 98.7%)였다.

실시예 34. WKS77 에서의 팬지 F3'5'H #40 유전자의 발현과 장미 내재성 F3'H 유전자의 억제

짙은 적자계 장미 품종 「WKS77」에 pSPB1106(도 10)를 도입하고, 4O개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 26 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 80.0%(평균 30.5%)였다. 꽃의 색깔은 RHS 칼라 차트 57a(RED-PURPLE GR0UP)에서 83d(VIOLET GROUP)으로 크게 변화하였다.

옅은 자색계 장미 품종 「Lavande」에 pSPBl106를 도입하고, 40 개체의 형질 전환체를 얻었다. 색소 분석을 실시한 25 개체중 23 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였다. 델피니딘 함유율은 최고 98.3%(평균 46.9%)였다.

이상은 도입한 외래 유전자가 후대에 전달되고, 또한 그 유전자가 후대에 있어서 발현하고, 본래 장미 꽃잎에서는 볼 수 없는 델피니딘을 생성하는 형질이 후대의 장미에 전달되는 것을 나타내고 있다.

따라서, 본 유전자를 사용하여 색상이 변화된 장미를 교배 육종함으로써, 파란색이나 보라색을 포함한 새로운 색상의 장미를 작출할 수 있는 것을 나타내고 있다.

장미의 내재성 대사 경로의 작용, 예를 들면 디히드로플라보놀 환원 효소의 발현을 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3',5'-수산화 효소를 코드하는 유전자 및 장미 이외의 유래의 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써, 파란색 내지 보라색의 장미를 작출할 수 있다.

또한, 이러한 유전자는 다음 세대에도 전달되어 파란색 장미의 형질은 교배에 의하여 이용될 수 있다는 것도 알게 되었다.

<110> International Flower Developments Proprietary Limited <120> Process for production of rose with altered color <130> KP-CH-066646 <150> JP 2003-293121 <151> 2003-08-13 <150> JP 2004-192034 <151> 2004-06-29 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1662 <212> DNA <213> pansy <220> <221> CDS <222> (22)..(1539) <223> Nucleotide sequence encoding pansy #18 F3'5'H <400> 1 gaattcggca cgagagccaa t atg gca att cca gtc act gac ctt 45 Met Ala Ile Pro Val Thr Asp Leu 1 5 gct gtc gcg gtt atc ctt ttc ttg atc act cgc ttc cta gtt cgt tct 93 Ala Val Ala Val Ile Leu Phe Leu Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser 10 15 20 ctt ttc aag aaa cca acc gga ccg ctc ccg ccg ggt cct tca ggc tgg 141 Leu Phe Lys Lys Pro Thr Gly Pro Leu Pro Pro Gly Pro Ser Gly Trp 25 30 35 40 ccc ttg gtg ggc gcg ctc cct ctc cta ggc gcc atg cct cac gtc aca 189 Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Ala Met Pro His Val Thr 45 50 55 cta gcc aac ctc gct aaa aaa tac ggt ccg atc atg tac cta aaa atg 237 Leu Ala Asn Leu Ala Lys Lys Tyr 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1245 Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Ser Val Trp Glu Asn Pro 395 400 405 tcg gag ttc tcg cct gaa aga ttc ttg tct gag gag aat ggg aag atc 1293 Ser Glu Phe Ser Pro Glu Arg Phe Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile 410 415 420 agt cca ggc ggg aat gat ttt gag ctg att ccg ttt gga gca ggg agg 1341 Ser Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg 425 430 435 440 aga att tgt gct ggg aca agg atg gga atg gtc ctt gta agt tat att 1389 Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile 445 450 455 ttg ggc act ttg gtc cat tct ttt gat tgg aaa tta cca aat ggg gtc 1437 Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val 460 465 470 agt gag att aac atg gat gag agt ttt ggg ctt gcg ttg caa aag gcc 1485 Ser Glu Ile Asn Met Asp Glu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala 475 480 485 gtg cct ctc tcg gct acg gtc agt cca cga ttg gcc cca agc gcg tac 1533 Val Pro Leu Ser Ala Thr Val Ser Pro Arg Leu Ala Pro Ser Ala Tyr 490 495 500 gtt ata t gagctgatgg gctgggcctg agcccaaaca 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175 Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg 180 185 190 Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys 225 230 235 240 Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Met Lys Glu 245 250 255 His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Glu Gly Lys Ser Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Val Leu Leu Glu Glu Cys Glu Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Asn Val 275 280 285 Thr Asn Val Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Met Lys Asn 305 310 315 320 Pro Thr Ile Leu Lys Lys Thr Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly 325 330 335 Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Val Ser Lys Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asp Thr Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Ser Val Trp Glu Asn Pro Ser Glu Phe Ser Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Ser Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ser Glu Ile Asn Met Asp Glu Ser 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Thr Val Ser 485 490 495 Pro Arg Leu Ala Pro Ser Ala Tyr Val Ile 500 505 <210> 3 <211> 1795 <212> DNA <213> pansy <220> <221> CDS <222> (21)..(1538) <223> Nucleotide sequene encoding pansy #40 F3'5'H <400> 3 gaattcggca cgaggacaac atg gca att cta gtc acc gac ttc gtt gtc gcg 53 Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala 1 5 10 gct ata att ttc ttg atc act cgg ttc tta gtt cgt tct ctt ttc aag 101 Ala Ile Ile Phe Leu Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys 15 20 25 aaa cca acc cga ccg ctc ccc ccg ggt cct ctc ggt tgg ccc ttg gtg 149 Lys Pro Thr Arg Pro Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val 30 35 40 ggc gcc ctc cct ctc cta ggc gcc atg cct cac gtc gca cta gcc aaa 197 Gly Ala Leu Pro Leu Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys 45 50 55 ctc gct aag aag tat ggt ccg atc atg cac cta aaa atg ggc acg tgc 245 Leu Ala Lys Lys Tyr Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys 60 65 70 75 gac atg gtg gtc gcg tcc acc ccc gag tcg gct cga gcc ttc ctc aaa 293 Asp Met Val Val Ala Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys 80 85 90 acg cta gac ctc aac ttc tcc aac cgn cca ccc aac gcg ggc gca tcc 341 Thr Leu Asp Leu Asn Phe Ser Asn Xaa Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser 95 100 105 cac cta gcg tac ggc gcg cag gac tta gtc ttc gcc aag tac ggt ccg 389 His Leu Ala Tyr Gly Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro 110 115 120 agg tgg aag act tta aga aaa ttg agc aac ctc cac atg cta ggc ggg 437 Arg Trp Lys Thr Leu Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly 125 130 135 aag gcg ttg gat gat tgg gca aat gtg agg gtc acc gag cta ggc cac 485 Lys Ala Leu Asp Asp Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His 140 145 150 155 atg ctt aaa gcc atg tgc gag gcg agc cgg tgc ggg gag ccc gtg gtg 533 Met Leu Lys Ala Met Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val 160 165 170 ctg gcc gag atg ctc acg tac gcc atg gcg aac atg atc ggt caa gtg 581 Leu Ala Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val 175 180 185 ata ctc agc cgg cgc gtg ttc gtg acc aaa ggg acc gag tct aac gag 629 Ile Leu Ser Arg Arg Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu 190 195 200 ttc aaa gac atg gtg gtc gag ttg atg acg tcc gcc ggg tac ttc aac 677 Phe Lys Asp Met Val Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn 205 210 215 atc ggt gac ttc ata ccc tcg atc gct tgg atg gat ttg caa ggg atc 725 Ile Gly Asp Phe Ile Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile 220 225 230 235 gag cga ggg atg aag aag ctg cac acg aag ttt gat gtg tta ttg acg 773 Glu Arg Gly Met Lys Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr 240 245 250 aag atg gtg aag gag cat aga gcg acg agt cat gag cgc aaa ggg aag 821 Lys Met Val Lys Glu His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys 255 260 265 gca gat ttc ctc gac gtt ctc ttg gaa gaa tgc gac aat aca aat ggg 869 Ala Asp Phe Leu Asp Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly 270 275 280 gag aag ctt agt att acc aat atc aaa gct gtc ctt ttg aat cta ttc 917 Glu Lys Leu Ser Ile Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe 285 290 295 acg gcg ggc acg gac aca tct tcg agc ata atc gaa tgg gcg tta acg 965 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr 300 305 310 315 gag atg atc aag aat ccg acg atc tta aaa aag gcg caa gag gag atg 1013 Glu Met Ile Lys Asn Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met 320 325 330 gat cga gtc atc ggt cgt gat cgg agg ctg ctc gaa tcg gac ata tcg 1061 Asp Arg Val Ile Gly Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Ser 335 340 345 agc ctc ccg tac cta caa gcc att gct aaa gaa acg tat cgc aaa cac 1109 Ser Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His 350 355 360 ccg tcg acg cct ctc aac ttg ccg agg att gcg atc caa gca tgt gaa 1157 Pro Ser Thr Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu 365 370 375 gtt gat ggc tac tac atc cct aag gac gcg agg ctt agc gtg aac att 1205 Val Asp Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn Ile 380 385 390 395 tgg gcg atc ggt cgg gac ccg aat gtt tgg gag aat ccg ttg gag ttc 1253 Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe 400 405 410 ttg ccg gaa aga ttc ttg tct gaa gag aat ggg aag atc aat ccc ggt 1301 Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Asn Pro Gly 415 420 425 ggg aat gat ttt aag ctg att ccg ttt gga gcc ggg agg aga att tgt 1349 Gly Asn Asp Phe Lys Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys 430 435 440 gcg ggg aca agg atg gga atg gtc ctt gta agt tat att ttg ggc act 1397 Ala Gly Thr Arg Met Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr 445 450 455 ttg gtc cat tct ttt gat tgg aaa tta cca aat ggt gtc gct gag ctt 1445 Leu Val His Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu 460 465 470 475 aat atg gat gaa agt ttt ggg ctt gca ttg caa aag gcc gtg ccg ctc 1493 Asn Met Asp Glu Ser Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu 480 485 490 tcg gcc ttg gtc agc cca cgg ttg gcc tca aac ccg tac gca acc tg 1540 Ser Ala Leu Val Ser Pro Arg Leu Ala Ser Asn Pro Tyr Ala Thr 495 500 505 agctaatggg ctgggcctag ttttgtgggc cctaatttag agacttttgt gttttaaggt 1600 gtgtacttta ttaattgggt gcttaaatgt gtgttttaat ttgtatttat ggttaattat 1660 gactttattg tataattatt tatttttccc ttctgggtat tttatccatt taatttttct 1720 tcagaattat gatcatagtt atcagaataa aattgaaaat aatgaatcgg aaaaaaaaaa 1780 aaaaaaaaaa aaaaa 1795 <210> 4 <211> 506 <212> PRT <213> pansy <400> 4 Met Ala Ile Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala Ile Ile Phe Leu 1 5 10 15 Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 Gly Pro Ile Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95 Phe Ser Asn Xaa Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gln Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met 145 150 155 160 Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gln Val Ile Leu Ser Arg Arg 180 185 190 Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Ser Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Glu Arg Gly Met Lys 225 230 235 240 Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val Lys Glu 245 250 255 His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Ser Ile 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser Ile Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile Lys Asn 305 310 315 320 Pro Thr Ile Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly 325 330 335 Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Ser Ser Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Gln Ala Ile Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gln Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Leu Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys Ile Asn Pro Gly Gly Asn Asp Phe Lys 420 425 430 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Met Val Leu Val Ser Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu Asn Met Asp Glu Ser 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gln Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser 485 490 495 Pro Arg Leu Ala Ser Asn Pro Tyr Ala Thr 500 505 <210> 5 <211> 1474 <212> DNA <213> rose <220> <221> unsure <222> (1)..(1474) <223> Nucleotide sequene encoding rose chalcone synthase <400> 5 ggagatatca aaatggtgac cgtcgaggaa gtccgcaagg ctcaacgcgc tgagggtccg 60 gctaccgtcc tggccatcgg gacagcaact cctcccaact gtattgacca gagcacatac 120 cccgactact acttccgtat cactaagagc gagcacaagg ctgagctcaa ggagaaattc 180 cagcgcatgt gtgacaaatc tatgatcaag aagcgctaca tgtacttgac cgaagaaatt 240 cttaaggaga atcctagtat gtgtgagtac atggcccctt cacttgatgc aagacaagat 300 atggtggttg ttgaaattcc aaagcttgga aaagaggctg ccactaaggc tattaaggaa 360 tggggtcagc ccaagtccaa aatcacccac ttggtctttt gtaccactag tggcgtcgac 420 atgcccgggg ccgattacca gctcactaag ctcttaggcc tccgcccgtc cgtgaagcgt 480 ctcatgatgt accaacaagg gtgtttcgcc ggaggcacgg tgctccggtt ggctaaggac 540 ttggccgaga acaacaaggg tgcacgtgtt cttgttgttt gctcagagat cactgccgtg 600 actttccgtg ggcctagcga cacccatctc gatagtcttg tgggccaagc cttgttcggt 660 gatggtgctg cggccattat tgttggggcc gacccattgc ccgaggttga gaagccttcg 720 ttcgagttgg tctcggcagc ccaaactatc cttcctgaca gtgacggagc catcgacggg 780 catcttcgtg aagttgggct cacatttcac ctcctcaaag atgttcccgg gctgatttca 840 aagaacatcg agaagagcct caacgaggcc ttcaaacctt tgaacatcac agactggaac 900 tcacttttct ggattgcaca cccgggtggc cctgcaattt tagaccaagt agaggctaaa 960 ttgggcctga agcccgaaaa gttagaagcc acaaggcata tattatccga gtacggcaat 1020 atgtctagtg cttgtgtgtt gtttattttg gacgaggtgc ggagaaagtc tgcagctaat 1080 gggcacaaga ccactggaga aggcctggag tggggtgtcc tatttggttt tgggccaggg 1140 ctcaccgtcg agaccgtcgt gcttcacagt gtggctgctt aaacttgaag gcatctgggt 1200 tcacttgagt gatctgctcc tggatttgtt cttatatatg tatcgtttcc actctacttt 1260 ccttgttaga tttccttttt tggatttatt tttctggtga atttagcaat atatgtaatg 1320 atgaataata ttattccaca aatttcatac gagcaaaagt tcctgcaata atttagttag 1380 aagttgactt tccggaagat ttagagcggg gaatatatct cccactagct gaaagattat 1440 ccggggatag agtacgttca aaaaaaaaaa aaaa 1474 <210> 6 <211> 420 <212> DNA <213> rose <220> <221> unsure <222> (1)..(420) <223> Nucleotide sequence encoding part of rose anthocyanidin synthase <400> 6 gaagaaggga ggctggagaa ggaggtcggt ggactcgaag aactcgtcct gcaaatgaaa 60 atcaactact acccaaaatg ccctcagccg gaacttgccc tcggcgtgga agcccacacc 120 gacataagtg cactcacctt catcctccac aacatggttc ccggcctgca gctcttctac 180 ggcggcaaat gggtgacagc gaaatgcgtg cccaactcca tcgtcatgca catcggcgac 240 aacttggaga ttctgagcaa cggcaagtac aagagcattt ttcacagggg ggattgtcaa 300 caagggagaa ggtgaggttc tcgttggcgg ttttcttgta gccacccagg aggaggtcat 360 tctcaagccg ttgcgacgac tgtctcgagg aggaaccgcg tcttccaccc gacttttcgg 420 420 <210> 7 <211> 1808 <212> DNA <213> Torenia <220> <221> CDS <222> (30)..(1466) <223> Nucleotide sequence encoding Toenia anthocyanin acyl transferase <400> 7 cttcaaagcc aaaaagaaac aattaatca atg gct gtt gaa gcc ccc aaa aca 53 Met Ala Val Glu Ala Pro Lys Thr 1 5 ata tgt gca gtc ctc gaa aac tct ctt att aca cca caa agt acc gat 101 Ile Cys Ala Val Leu Glu Asn Ser Leu Ile Thr Pro Gln Ser Thr Asp 10 15 20 aca gaa caa act ctt tca ctc aca ttc ttt gac atc aaa tgg gtt cat 149 Thr Glu Gln Thr Leu Ser Leu Thr Phe Phe Asp Ile Lys Trp Val His 25 30 35 40 ttt cat cca atg caa tgc ctt gtg ttg tac aac ttc cca tgt tct aag 197 Phe His Pro Met Gln Cys Leu Val Leu Tyr Asn Phe Pro Cys Ser Lys 45 50 55 tca cat ttt ctc gaa gcc aca gtt ccg agc ttc aaa tca tca ctc tcc 245 Ser His Phe Leu Glu Ala Thr Val Pro Ser Phe Lys Ser Ser Leu Ser 60 65 70 aaa act ctc aga cac tat ctt cca tta tca gga aac tta tac tat cca 293 Lys Thr Leu Arg His Tyr Leu Pro Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Tyr Pro 75 80 85 aac ccg acc cat gac atg gat gat gat gaa tcg aac atg ccc gag atc 341 Asn Pro Thr His Asp Met Asp Asp Asp Glu Ser Asn Met Pro Glu Ile 90 95 100 cgt tat aaa cct ggc gac tcg gtt tct cta acc gtt gca gag tac ttc 389 Arg Tyr Lys Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Thr Val Ala Glu Tyr Phe 105 110 115 120 tcc ggt cat gaa gac aat acg act act gaa gaa tac ttc aat tac ctc 437 Ser Gly His Glu Asp Asn Thr Thr Thr Glu Glu Tyr Phe Asn Tyr Leu 125 130 135 act gga aat ttc cag aga gat tgc gat caa ttc tat gat ctc tta ccc 485 Thr Gly Asn Phe Gln Arg Asp Cys Asp Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Pro 140 145 150 gat ttt cga gac ccg gaa acc gaa tcc aat tgc aca gta atc cca ctt 533 Asp Phe Arg Asp Pro Glu Thr Glu Ser Asn Cys Thr Val Ile Pro Leu 155 160 165 ata gca gtt caa atc aca ctc ttt cca ggt gct ggg ata tgt ctg ggg 581 Ile Ala Val Gln Ile Thr Leu Phe Pro Gly Ala Gly Ile Cys Leu Gly 170 175 180 gtc atc aac agt cac gta gtt ggc gat gcg agt tcc ata gtg gga ttc 629 Val Ile Asn Ser His Val Val Gly Asp Ala Ser Ser Ile Val Gly Phe 185 190 195 200 atc aaa gct tgg agt aaa gtt gca atg tat gaa gac gat gaa gag att 677 Ile Lys Ala Trp Ser Lys Val Ala Met Tyr Glu Asp Asp Glu Glu Ile 205 210 215 cta gct aac aac aat ttg att cca tct tat gac aga tca gtc gtg aaa 725 Leu Ala Asn Asn Asn Leu Ile Pro Ser Tyr Asp Arg Ser Val Val Lys 220 225 230 gat cca aaa ggg atc aaa tct ttg ctc tgg aac aag atg aag aac gtg 773 Asp Pro Lys Gly Ile Lys Ser Leu Leu Trp Asn Lys Met 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Lys Thr Thr His Gly Leu Leu 345 350 355 360 aaa gga gag tta ggg ctt ttt aat gca gtg gaa gtg att agt gat gtc 1157 Lys Gly Glu Leu Gly Leu Phe Asn Ala Val Glu Val Ile Ser Asp Val 365 370 375 att acc ggt atc gtt agc aag aaa tat gac ttg ttc aaa gac tta gac 1205 Ile Thr Gly Ile Val Ser Lys Lys Tyr Asp Leu Phe Lys Asp Leu Asp 380 385 390 aga caa ggt gag att ttt cgt gcc ttg ttc gga aaa cga gtg ttg gcg 1253 Arg Gln Gly Glu Ile Phe Arg Ala Leu Phe Gly Lys Arg Val Leu Ala 395 400 405 atc atg ggt tcg cct aag ttc gat ctc tac gaa gtt gat ttc ggg tgg 1301 Ile Met Gly Ser Pro Lys Phe Asp Leu Tyr Glu Val Asp Phe Gly Trp 410 415 420 ggt aag ccg aag aag att gaa cct gtg tcc att gat aga gag agg acg 1349 Gly Lys Pro Lys Lys Ile Glu Pro Val Ser Ile Asp Arg Glu Arg Thr 425 430 435 440 act atg tgg att agc aag tct ggc gag ttt gag ggt gga ttg gag att 1397 Thr Met Trp Ile Ser Lys Ser Gly Glu Phe Glu Gly Gly Leu Glu Ile 445 450 455 ggt ttt tct ttc aat aag aag aaa atg gat gct ttt ggc gag tgt ttt 1445 Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Lys Met Asp Ala Phe Gly Glu Cys Phe 460 465 470 aac agc ggt ttg aag gat att taat ttaaaaaatt gtttagcttt gatgcatgcg 1500 Asn Ser Gly Leu Lys Asp Ile 475 ttttatatat gttgtgaaat aatgtggtgt gcaataacta gagtaacttt aggttaataa 1560 attcggtttt tctgttaaat ctggatgatt cgtgcaagca aactgtcgat gcgttggatg 1620 gatgtcgggt ggtgtggaga ttgttgaaga aggaaatgga tgcttttttt atggtggttt 1680 gaaggatttg aatgtgtaga ttattggttt attgaggttg tttatatttg tgtatgttgt 1740 ttatgcatga aaaatattta gatcccaaca ttttatgtat gacgtggttt aatatttcga 1800 tttcgatc 1808 <210> 8 <211> 479 <212> PRT <213> Torenia <400> 8 Met Ala Val Glu Ala Pro Lys Thr Ile Cys Ala Val Leu Glu Asn Ser 1 5 10 15 Leu Ile Thr Pro Gln Ser Thr Asp Thr Glu Gln Thr Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Phe Phe Asp Ile Lys Trp Val His Phe His Pro Met Gln Cys Leu Val 35 40 45 Leu Tyr Asn Phe Pro Cys Ser Lys Ser His Phe Leu Glu Ala Thr Val 50 55 60 Pro Ser Phe Lys Ser Ser Leu Ser Lys Thr Leu Arg His Tyr Leu Pro 65 70 75 80 Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Tyr Pro Asn Pro Thr His Asp Met Asp Asp 85 90 95 Asp Glu Ser Asn Met Pro Glu Ile Arg Tyr Lys Pro Gly Asp Ser Val 100 105 110 Ser Leu Thr Val Ala Glu Tyr Phe Ser Gly His Glu Asp Asn Thr Thr 115 120 125 Thr Glu Glu Tyr Phe Asn Tyr Leu Thr Gly Asn Phe Gln Arg Asp Cys 130 135 140 Asp Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Pro Asp Phe Arg Asp Pro Glu Thr Glu 145 150 155 160 Ser Asn Cys Thr Val Ile Pro Leu Ile Ala Val Gln Ile Thr Leu Phe 165 170 175 Pro Gly Ala Gly Ile Cys Leu Gly Val Ile Asn Ser His Val Val Gly 180 185 190 Asp Ala Ser Ser Ile Val Gly Phe Ile Lys Ala Trp Ser Lys Val Ala 195 200 205 Met Tyr Glu Asp Asp Glu Glu Ile Leu Ala Asn Asn Asn Leu Ile Pro 210 215 220 Ser Tyr Asp Arg Ser Val Val Lys Asp Pro Lys Gly Ile Lys Ser Leu 225 230 235 240 Leu Trp Asn Lys Met Lys Asn Val Lys Tyr Gln Pro Gln Pro Ala Lys 245 250 255 His Leu Pro Thr Asn Lys Val Arg Ala Thr Tyr Thr Leu Arg Lys Asn 260 265 270 Asp Ile Glu Arg Leu Lys Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys Pro Gly Thr 275 280 285 Thr Cys Leu Ser Ser Phe Thr Ile Ala Thr Ala Tyr Ala Trp Thr Cys 290 295 300 Leu Ala Lys Ser Ala Ala Glu Ala Glu Glu Gln Val Val Gln Asp Ser 305 310 315 320 Asp Asp Glu His Leu Leu Met Pro Val Asp Leu Arg Pro Arg Ile Asp 325 330 335 Pro Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Phe Gly Asn Cys Val Leu Pro Ser Phe 340 345 350 Ala Lys Thr Thr His Gly Leu Leu Lys Gly Glu Leu Gly Leu Phe Asn 355 360 365 Ala Val Glu Val Ile Ser Asp Val Ile Thr Gly Ile Val Ser Lys Lys 370 375 380 Tyr Asp Leu Phe Lys Asp Leu Asp Arg Gln Gly Glu Ile Phe Arg Ala 385 390 395 400 Leu Phe Gly Lys Arg Val Leu Ala Ile Met Gly Ser Pro Lys Phe Asp 405 410 415 Leu Tyr Glu Val Asp Phe Gly Trp Gly Lys Pro Lys Lys Ile Glu Pro 420 425 430 Val Ser Ile Asp Arg Glu Arg Thr Thr Met Trp Ile Ser Lys Ser Gly 435 440 445 Glu Phe Glu Gly Gly Leu Glu Ile Gly Phe Ser Phe Asn Lys Lys Lys 450 455 460 Met Asp Ala Phe Gly Glu Cys Phe Asn Ser Gly Leu Lys Asp Ile 465 470 475 <210> 9 <211> 1252 <212> DNA <213> Iris <220> <221> CDS <222> (16)..(1098) <223> Nucleotide sequence encoding Iris dihydrofravonol reductase <400> 9 aaacaatata tcgag atg atg agc ccc gtt gtc gtg acc gga gcg agc 48 Met Met Ser Pro Val Val Val Thr Gly Ala Ser 1 5 10 ggc tac gtc ggt tca tgg ctt gtt atg aag ctc ctt cgc gac ggc tac 96 Gly Tyr Val Gly Ser Trp Leu Val Met Lys Leu Leu Arg Asp Gly Tyr 15 20 25 gcc gtt cga gcc act gtc aga gac cca acc aat gtg gag aag acg aag 144 Ala Val Arg Ala Thr Val Arg Asp Pro Thr Asn Val Glu Lys Thr Lys 30 35 40 ccg ctg ttg gac ctc ccc gga gct gac gcg ctg ctc acc atc tgg aag 192 Pro Leu Leu Asp Leu Pro Gly Ala Asp Ala Leu Leu Thr Ile Trp Lys 45 50 55 gca gac ctc ggc cag gac gga agc ttc gac aag gcg gtc gca gga tgc 240 Ala Asp Leu Gly Gln Asp Gly Ser Phe Asp Lys Ala Val Ala Gly Cys 60 65 70 75 acc gcg gtc ttc cac gtc gcc acg ccc atg gat ttc gag tcc aag gac 288 Thr Ala Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp 80 85 90 cca gaa aac gag gtg atc aag ccg acc ata aat ggc gtt tta agt atc 336 Pro Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Ile Asn Gly Val Leu Ser Ile 95 100 105 atg agg tcc tgt aag aag gcc gga acg gtc aaa cgc gtc gtc ttc act 384 Met Arg Ser Cys Lys Lys Ala Gly Thr Val Lys Arg Val Val Phe Thr 110 115 120 tca tcc gcc ggg acg gtg gac gtg aaa gaa cat cag cag acg gag tac 432 Ser Ser Ala Gly Thr Val Asp Val Lys Glu His Gln Gln Thr Glu Tyr 125 130 135 gac gag agc tcg tgg agc gac gtc gac ttc tgc aga cgt gtc aag atg 480 Asp Glu Ser Ser Trp Ser Asp Val Asp Phe Cys Arg Arg Val Lys Met 140 145 150 155 aca ggc tgg atg tat ttt gtg tcg aag act ctg gcc gag aga gca gcc 528 Thr Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Thr Leu Ala Glu Arg Ala Ala 160 165 170 tgg gaa ttt gca aga gag aat ggc ata gac ttc ata agc atc atc ccc 576 Trp Glu Phe Ala Arg Glu Asn Gly Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro 175 180 185 acg cta gtc gtc ggt cct ttc atc acc aca act atg cca ccc agc atg 624 Thr Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Thr Thr Met Pro Pro Ser Met 190 195 200 gtg act gcg cta tca ttc atg aca gga aac gaa gca cac tat cac ata 672 Val Thr Ala Leu Ser Phe Met Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr His Ile 205 210 215 atc aag cac gcg cag ctc gtc cac ctt gac gac ctg tgc gct gcc cac 720 Ile Lys His Ala Gln Leu Val His Leu Asp Asp Leu Cys Ala Ala His 220 225 230 235 att tac ctc ctg aat cgc ccc gaa gcg aac ggg agg tac ata tgc tca 768 Ile Tyr Leu Leu Asn Arg Pro Glu Ala Asn Gly Arg Tyr Ile Cys Ser 240 245 250 tcg cac gaa gcc acc atc cac gac ctg gcg agg atg gtc agg gag agg 816 Ser His Glu Ala Thr Ile His Asp Leu Ala Arg Met Val Arg Glu Arg 255 260 265 cac cct tgg tgc ggc tcc ata ccc gaa aag ttc gac ggc atc gag aag 864 His Pro Trp Cys Gly Ser Ile Pro Glu Lys Phe Asp Gly Ile Glu Lys 270 275 280 gac gtc aga acc gtg cac ttc tct tcc aag agg ctt ttg gac ctc ggg 912 Asp Val Arg Thr Val His Phe Ser Ser Lys Arg Leu Leu Asp Leu Gly 285 290 295 ttc gag ttc aag tac acg gtg gaa gaa atg ttc gac gaa gcg ata cgg 960 Phe Glu Phe Lys Tyr Thr Val Glu Glu Met Phe Asp Glu Ala Ile Arg 300 305 310 315 tcg tgc gtc gag aag aag ctc ata ccc ctc cct gag aat ggc aac gtg 1008 Ser Cys Val Glu Lys Lys Leu Ile Pro Leu Pro Glu Asn Gly Asn Val 320 325 330 gac gca gct gcc ggg gct aaa gac atg gtt cat gga gca gag gaa cat 1056 Asp Ala Ala Ala Gly Ala Lys Asp Met Val His Gly Ala Glu Glu His 335 340 345 gcc cga att gct atg gaa cta gaa cca aaa aaa aag gtc aag tg 1100 Ala Arg Ile Ala Met Glu Leu Glu Pro Lys Lys Lys Val Lys 350 355 360 aaatgtgaag atacaacatt ttatgcgtat ggacattaca atcttagatg ttcaaggttt 1160 caaattgtat cttaagtgta tgatttatgt tgacactcgg aagtttcatt gaaattaata 1220 aaaagggatt tgctcaaaaa aaaaaaaaaa aa 1252 <210> 10 <211> 361 <212> PRT <213> Iris <400> 10 Met Met Ser Pro Val Val Val Thr Gly Ala Ser Gly Tyr Val Gly Ser 1 5 10 15 Trp Leu Val Met Lys Leu Leu Arg Asp Gly Tyr Ala Val Arg Ala Thr 20 25 30 Val Arg Asp Pro Thr Asn Val Glu Lys Thr Lys Pro Leu Leu Asp Leu 35 40 45 Pro Gly Ala Asp Ala Leu Leu Thr Ile Trp Lys Ala Asp Leu Gly Gln 50 55 60 Asp Gly Ser Phe Asp Lys Ala Val Ala Gly Cys Thr Ala Val Phe His 65 70 75 80 Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val 85 90 95 Ile Lys Pro Thr Ile Asn Gly Val Leu Ser Ile Met Arg Ser Cys Lys 100 105 110 Lys Ala Gly Thr Val Lys Arg Val Val Phe Thr Ser Ser Ala Gly Thr 115 120 125 Val Asp Val Lys Glu His Gln Gln Thr Glu Tyr Asp Glu Ser Ser Trp 130 135 140 Ser Asp Val Asp Phe Cys Arg Arg Val Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr 145 150 155 160 Phe Val Ser Lys Thr Leu Ala Glu Arg Ala Ala Trp Glu Phe Ala Arg 165 170 175 Glu Asn Gly Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Thr Leu Val Val Gly 180 185 190 Pro Phe Ile Thr Thr Thr Met Pro Pro Ser Met Val Thr Ala Leu Ser 195 200 205 Phe Met Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr His Ile Ile Lys His Ala Gln 210 215 220 Leu Val His Leu Asp Asp Leu Cys Ala Ala His Ile Tyr Leu Leu Asn 225 230 235 240 Arg Pro Glu Ala Asn Gly Arg Tyr Ile Cys Ser Ser His Glu Ala Thr 245 250 255 Ile His Asp Leu Ala Arg Met Val Arg Glu Arg His Pro Trp Cys Gly 260 265 270 Ser Ile Pro Glu Lys Phe Asp Gly Ile Glu Lys Asp Val Arg Thr Val 275 280 285 His Phe Ser Ser Lys Arg Leu Leu Asp Leu Gly Phe Glu Phe Lys Tyr 290 295 300 Thr Val Glu Glu Met Phe Asp Glu Ala Ile Arg Ser Cys Val Glu Lys 305 310 315 320 Lys Leu Ile Pro Leu Pro Glu Asn Gly Asn Val Asp Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Ala Lys Asp Met Val His Gly Ala Glu Glu His Ala Arg Ile Ala Met 340 345 350 Glu Leu Glu Pro Lys Lys Lys Val Lys 355 360 <210> 11 <211> 1297 <212> DNA <213> Nierembergia hybrida <220> <221> CDS <222> (47)..(1168) <223> Nucleotide sequence encoding Nierembergia hybrida dihydrofravonol reductase <400> 11 attcatacta cattttcccg tccttaagta aattttattt ctgaaa atg gca agc 55 Met Ala Ser 1 gaa gca gtt cat gct agt ccg aca gtt tgt gtc acc gga gca gct gga 103 Glu Ala Val His Ala Ser Pro Thr Val Cys Val Thr Gly Ala Ala Gly 5 10 15 ttc att ggc tct tgg ctt gtc atg aga ctc ctt gaa cgc ggt tat aat 151 Phe Ile Gly Ser Trp Leu Val Met Arg Leu Leu Glu Arg Gly Tyr Asn 20 25 30 35 gtt cat gct act gtt cgt gat cct gag aac aag aag aag gtg aaa cat 199 Val His Ala Thr Val Arg Asp Pro Glu Asn Lys Lys Lys Val Lys His 40 45 50 cta cag gaa ttg cca aaa gct gat acg aac tta acg ctg tgg aaa gcg 247 Leu Gln Glu Leu Pro Lys Ala Asp Thr Asn Leu Thr Leu Trp Lys Ala 55 60 65 gac ttg gcg gta gaa gga agc ttt gat gaa gcc att aaa ggc tgt caa 295 Asp Leu Ala Val Glu Gly Ser Phe Asp Glu Ala Ile Lys Gly Cys Gln 70 75 80 gga gta ttt cat gtg gcc act cct atg gat ttc gag tcc aag gac cct 343 Gly Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser Lys Asp Pro 85 90 95 gag aat gaa gta atc aag cca aca gtc cag gga atg ttg agc atc ata 391 Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Val Gln Gly Met Leu Ser Ile Ile 100 105 110 115 gaa tca tgt gtt aaa gca aac aca gtg aag agg ttg gtt ttc act tcg 439 Glu Ser Cys Val Lys Ala Asn Thr Val Lys Arg Leu Val Phe Thr Ser 120 125 130 tct gct gga act cta gat gtc caa gag caa caa aaa ctc ttc tac gat 487 Ser Ala Gly Thr Leu Asp Val Gln Glu Gln Gln Lys Leu Phe Tyr Asp 135 140 145 gag acc agc tgg agc gac ttg gac ttc ata aat gcc aag aag atg aca 535 Glu Thr Ser Trp Ser Asp Leu Asp Phe Ile Asn Ala Lys Lys Met Thr 150 155 160 gga tgg atg tac ttt gtt tca aag ata ctc gcg gag aag gct gca atg 583 Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Ile Leu Ala Glu Lys Ala Ala Met 165 170 175 gaa gaa gct aaa aag aac aac att gat ttc att agc atc ata cca cca 631 Glu Glu Ala Lys Lys Asn Asn Ile Asp Phe Ile Ser Ile Ile Pro Pro 180 185 190 195 ctg gtt gtt ggt cca ttc atc acc cct tcg ttc ccg cct agt tta atc 679 Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Pro Ser Phe Pro Pro Ser Leu Ile 200 205 210 act gcc ctt tca cta att act ggg aat gaa gct cac tac tgc atc att 727 Thr Ala Leu Ser Leu Ile Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr Cys Ile Ile 215 220 225 aaa caa ggt caa tat gtg cat ttg gat gat ctt tgt gag gct tac ata 775 Lys Gln Gly Gln Tyr Val His Leu Asp Asp Leu Cys Glu Ala Tyr Ile 230 235 240 ttc ttg tat gaa cac cct aaa gca gag gga agg ttc att tgc tcg tcc 823 Phe Leu Tyr Glu His Pro Lys Ala Glu Gly Arg Phe Ile Cys Ser Ser 245 250 255 cat cat gct atc atc tat gat gta gct aag atg atc cga gaa aaa tgg 871 His His Ala Ile Ile Tyr Asp Val Ala Lys Met Ile Arg Glu Lys Trp 260 265 270 275 cca gag tac tac gtt cct aca gag ttt aaa ggc atc gct aag gac cta 919 Pro Glu Tyr Tyr Val Pro Thr Glu Phe Lys Gly Ile Ala Lys Asp Leu 280 285 290 cct gtg gtg gct ttt tcg tca aag aag ttg aca gat atg ggt ttt cag 967 Pro Val Val Ala Phe Ser Ser Lys Lys Leu Thr Asp Met Gly Phe Gln 295 300 305 ttc aag tac act ttg gag gat atg tat aaa ggg gcc att gag act tgt 1015 Phe Lys Tyr Thr Leu Glu Asp Met Tyr Lys Gly Ala Ile Glu Thr Cys 310 315 320 cga cag aag cag ttg ctt ccc ttt tct acc aat agg cct tcg gaa aat 1063 Arg Gln Lys Gln Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn Arg Pro Ser Glu Asn 325 330 335 gga ctt gac aaa gaa gcc att tcc att tct tct gaa aac ttt gca agt 1111 Gly Leu Asp Lys Glu Ala Ile Ser Ile Ser Ser Glu Asn Phe Ala Ser 340 345 350 355 gga aaa gag aat gca cca gtt gca aat cac aaa gta aag tta aca agt 1159 Gly Lys Glu Asn Ala Pro Val Ala Asn His Lys Val Lys Leu Thr Ser 360 365 370 gtt gaa att ta gaactgcaat ctttcaaatg taaaagaggc aagcttgcct 1210 Val Glu Ile atcaacatct ttgcttctaa gttgtcatct atttgtttct ttaatgctaa agcagtaaaa 1270 ggttcaatga aaaaaaaaaa aaaaaaa 1297 <210> 12 <211> 374 <212> PRT <213> Nierembergia hybrida <400> 12 Met Ala Ser Glu Ala Val His Ala Ser Pro Thr Val Cys Val Thr Gly 1 5 10 15 Ala Ala Gly Phe Ile Gly Ser Trp Leu Val Met Arg Leu Leu Glu Arg 20 25 30 Gly Tyr Asn Val His Ala Thr Val Arg Asp Pro Glu Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Val Lys His Leu Gln Glu Leu Pro Lys Ala Asp Thr Asn Leu Thr Leu 50 55 60 Trp Lys Ala Asp Leu Ala Val Glu Gly Ser Phe Asp Glu Ala Ile Lys 65 70 75 80 Gly Cys Gln Gly Val Phe His Val Ala Thr Pro Met Asp Phe Glu Ser 85 90 95 Lys Asp Pro Glu Asn Glu Val Ile Lys Pro Thr Val Gln Gly Met Leu 100 105 110 Ser Ile Ile Glu Ser Cys Val Lys Ala Asn Thr Val Lys Arg Leu Val 115 120 125 Phe Thr Ser Ser Ala Gly Thr Leu Asp Val Gln Glu Gln Gln Lys Leu 130 135 140 Phe Tyr Asp Glu Thr Ser Trp Ser Asp Leu Asp Phe Ile Asn Ala Lys 145 150 155 160 Lys Met Thr Gly Trp Met Tyr Phe Val Ser Lys Ile Leu Ala Glu Lys 165 170 175 Ala Ala Met Glu Glu Ala Lys Lys Asn Asn Ile Asp Phe Ile Ser Ile 180 185 190 Ile Pro Pro Leu Val Val Gly Pro Phe Ile Thr Pro Ser Phe Pro Pro 195 200 205 Ser Leu Ile Thr Ala Leu Ser Leu Ile Thr Gly Asn Glu Ala His Tyr 210 215 220 Cys Ile Ile Lys Gln Gly Gln Tyr Val His Leu Asp Asp Leu Cys Glu 225 230 235 240 Ala Tyr Ile Phe Leu Tyr Glu His Pro Lys Ala Glu Gly Arg Phe Ile 245 250 255 Cys Ser Ser His His Ala Ile Ile Tyr Asp Val Ala Lys Met Ile Arg 260 265 270 Glu Lys Trp Pro Glu Tyr Tyr Val Pro Thr Glu Phe Lys Gly Ile Ala 275 280 285 Lys Asp Leu Pro Val Val Ala Phe Ser Ser Lys Lys Leu Thr Asp Met 290 295 300 Gly Phe Gln Phe Lys Tyr Thr Leu Glu Asp Met Tyr Lys Gly Ala Ile 305 310 315 320 Glu Thr Cys Arg Gln Lys Gln Leu Leu Pro Phe Ser Thr Asn Arg Pro 325 330 335 Ser Glu Asn Gly Leu Asp Lys Glu Ala Ile Ser Ile Ser Ser Glu Asn 340 345 350 Phe Ala Ser Gly Lys Glu Asn Ala Pro Val Ala Asn His Lys Val Lys 355 360 365 Leu Thr Ser Val Glu Ile 370 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DFR-2F <400> 13 caagcaatgg catcggaatc 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DFR-2B <400> 14 tttccagtga gtggcgaaag tc 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ANS-2F <400> 15 tggactcgaa gaactcgtcc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ANS-2B <400> 16 cctcaccttc tcccttgtt 19 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATC Primer: The symbol"n" in the sequence means inosine <400> 17 gayttyggnt ggggnaa 17 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Origo dT Primer <400> 18 tttttttttt tttttttctc gag 23 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RDF310 <400> 19 ccctcgagcc cttgatggcc tcgtcg 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer RDF830 <400> 20 gggtcgacgc ggccctctgc tttcgg 26 <210> 21 <211> 2934 <212> DNA <213> rose <220> <221> unsure <222> (1)..(2934) <223> Nucleotide sequence of rose chalcone synthase promotor <400> 21 aagcttcagc aagagttgaa gaaataggga cagagccatc catgtgcttt gatgaatctg 60 atgggataca aaatgtgaaa gattcacttg ctgatttatc cagaatttct tcatatagtg 120 aggagaatgt tgaaagatct aatgatgagc actctgttaa actagacgga attcatgtgc 180 agcacgagtg tcatgagggc agtgaagaag acaaacctga tggtaagagc ggtgagaatg 240 cagttgatct ggctaatcat ggcatggctc gaactgattt ttgtcagata acagaagaga 300 ttgagaatgg agtagtcatc actgagatga gcaacattgc caaccctgat aaaactgata 360 ttccaaacgg ggtgcctcaa aatgagactg atgatggatt taataacact caggatgatg 420 ctaatacaaa ggaagtgaca gaagagaatt ctgacagacg tgcgaaggaa gtgacagaag 480 agaattctga caaagatgtt ttgaagaata tccttgaatt ctcacgtgct tcttctgtgg 540 tggattttga aattccagtg ttggatgtga aatttacttc tcttgaaagt tgcagtgcca 600 cttgttctct tgcagccctt ttgtctgaat cgccggaatc aatgactgaa gcaccttgtg 660 tgaggcaaat tgatgatgtg cccccggttg gtgaggagtc tagcttgatt ttggtggaag 720 atcgggagcc ggttggtcct actcctgatg gtaatttttc tgtggatatg gattactata 780 gtgtagcaga acctttgagc acatgggatg cgaatctgca gtgtgaaaca tcaaatagcc 840 atgagacttt tgctgcaagt ctcatttgat agcttctgtg ttaataactt tgttagtctg 900 tacataaatt tgtctagaca agaattggtc gtgtactatc gtgtgttttt gccgtgcttt 960 agtactcatg aaccaattca gagaaaactg gctgcatatt ttgaggagtc tctgaattct 1020 tcaatgctca actggtatgc atgtaggtgg catatcactt cagggattct tctattcttt 1080 aactttacgc atcttgacat tttgtatata acaaaatcag gtctattggg tgaaagtaat 1140 tggctagaat ggaaagctct acggttttac cgcaggtcaa ttttcatagc tccacaagtg 1200 aattgaaaat gctcataggc tttatgtttg tcctccacct ctggcgacga tgtttgttgg 1260 ggagttaact caaacctacc accaaactcg aacccatctt ccataattta taatacaaat 1320 ttgcgatcat ttgttcatcc aattattgtg acactcggct accacccaaa atatcggtca 1380 cagacccaaa cgtattgtca caacaaatcg tgtctctcgc attaaacaca gctagaaaga 1440 agagttgaac ccacaattcg agcacccact acctatgtac gaagtcatga gttcgagtca 1500 ccataggggt agaagtgaaa tcatttgatc atctttaaag aaataaaagg aagagttgaa 1560 cccacaattg gctcttgtcc caaaaagaac taatagttca gtgcaccgac gtgtatttgc 1620 accgacataa atggattgtt agattatatt aaatacactc ttaggttatt aataaaaata 1680 ttaattataa atatcaaaag ttgagatcat cttataaatg ttgggtcagt tacaccgtcg 1740 gtgcatagaa taatttccaa actatataat agccttcatt ttctgattta gctcatggga 1800 catgattgct ataaataatt gtactcgtag aggcatactt gtgtcttttt atacagttgt 1860 actgaagctc agaaaagttt atgaaggtga gaactgagaa gggcaaggca tttggtagtt 1920 gaggtatatg agagcatgaa ccccatgcat tgcagctacc acctctcttt tttccttctt 1980 cccatacaaa taaaaccaac tcttctcacc taagtctatc atctttattt atggcagctc 2040 ttgcttaatt agctcatcta tattatatta tttatctata atatgtgtca ctctgtctac 2100 ctaccagccc aaaataaaac tgataatagt caatttgatg atattttttg ttttttgttt 2160 tgttttgtct tttttgtatt gattttttta aaattaaaat gacttcattt tttgtttttg 2220 tttttttttc tatttttttt tatagaaaaa ttggcaaact ttcattatct gttattgatg 2280 acaattaagc cattaaaacc tataattaat tatctttcaa ttcgagtaaa tttaaaacgg 2340 tgtaaaatta aaatatgatc gtattcttaa atgaataaaa ctcacttaat aatagtaata 2400 cttgaatcac atctacgaac atagattctt ttcatccagt ctaaccatgt ttgaatatat 2460 agagtttgat tatggttatg tctttgtcca cattttggtt tgtaaataaa tgtgcaacgg 2520 aggtatggta ctgttgctct atcaaattca agtttgaatt aaaagaaaaa aaaaaagacg 2580 atattttgtg cgctttgttt ggtaggtaaa acgagagaac aaacgcattc caaatcatgc 2640 ggattttgat cggcaacaca caccacaaaa aaccgtacac gatgcacgtg ccatttgccg 2700 ggggtttcta acaaggtaat tgggcaggca cgtgatcccc cagctaccca cctctcgctt 2760 cccttctcaa actccttttc catgtatata tacaacccct tttctcagac cattatattc 2820 taacattttt gctttgctat tgtaacgcaa caaaaactgc tcattccatc cttgttcctc 2880 cccattttga tcttctctcg acccttctcc gagatgggta ccgagctcga attc 2934

Claims

장미의 내재성 대사 경로를 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법.
제1항에 있어서, 장미의 내재성 대사 경로를 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자 및 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법.
제2항에 있어서, 장미의 내재성 디히드로플라보놀 환원 효소의 발현을 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자 및 장미 이외의 유래의 디히드로플라보놀 환원 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법.
제1항에 있어서, 장미의 내재성 플라보노이드 3'-수산화 효소의 발현을 인위적으로 억제하고, 또한 팬지 유래의 플라보노이드 3', 5'-수산화 효소를 코드하는 유전자를 발현시키는 것을 특징으로 하는 장미의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 의하여 얻어지는 장미 또는 그것과 동일한 성질을 가지는 그 자손 또는 그 조직.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 제조 방법에 의하여 얻어진 장미의 꽃잎의 색이 보라색, 청보라 또는 파란색인 장미 또는 그것과 동일한 성질을 가지는 자손 또는 그 조직.
제6항에 있어서, 장미의 꽃잎의 색이 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC)의 바이올렛 그룹, 바이올렛-블루 그룹 또는 블루 그룹에 속하는 것인 장미 또는 그것과 같은 성질을 가지는 자손 또는 그 조직.
제7항에 있어서, 장미의 꽃잎의 색이 영국 왕립 원예 협회 칼라 차트(RHSCC)의 바이올렛 그룹의 85a 또는 85b에 속하는 것인 장미 또는 그것과 같은 성질을 가지는 자손 또는 그 조직.