ES2370175T3 - Proceso para la producción de una rosa con color modificado. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una rosa caracterizado por la supresión artificial de la ruta de síntesis flavonoide de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica la flavonoide 3',5'-hidroxilasa que presenta la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No 1 ó 3, donde la vía de síntesis flavonoide de la rosa se suprime mediante (i) la supresión artificial de la expresión de la dihidroflavonol reductasa endógena de la rosa; o (ii) la supresión artificial de la expresión de la flavonoide 3'-hidroxilasa endógena de la rosa.

Description

Proceso para la producción de una rosa con color modificado

Campo Técnico

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para producir una rosa con colores de pétalo alterados. Más específicamente, se refiere a un procedimiento para producir una rosa mediante la inhibición artificial de la vía metabólica endógena de la rosa y la expresión del gen que codifica el flavonoide 3’,5’ hidroxilasa del pensamiento y el gen que codifica la dihidroflavonol reductasa, que reduce la dihidromiricetina.

Técnica previa

Los pétalos de las flores desempeñan la función de atraer a los polinizadores, como insectos y pájaros que transportan el polen de la planta y, por tanto, los colores, formas, patrones y olores de las flores evolucionaron conjuntamente con los polinizadores (Honda, T. et al., Gendai Kagaku, May, 25-32 (1998)). Probablemente, como resultado de esto, es raro que una única especie de flor presente varios colores diferentes, y por ejemplo, las variedades de rosas o claveles de color violeta a azul no existen, en tanto que tampoco existen las variedades de lirios o gencianas de colores rojos brillantes no existen. Debido a que el color de la flor es el aspecto más importante de los pétalos a los efectos de la apreciación, tradicionalmente las flores de diferentes colores se han cultivado mediante cruzamiento. La rosa, conocida como la “reina de las flores” y con gran valor comercial, también ha sido cruzada en el mundo entero.

Por ejemplo, el cultivar de rosa amarilla actual se creó mediante el cruzamiento de la Rosa foetida, proveniente de Asia occidental, con una variedad de rosa no amarilla. No obstante, debido a que el color de la flor se determina por la capacidad genética de la planta, se ha alcanzado un límite en los colores de las flores que pueden producirse actualmente en las cepas cruzadas cuyas fuentes genéticas disponibles se encuentran restringidas (Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39, 1119-1126, 1998; Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999). Entre estas, se había pensado que el cultivo de rosas azules era imposible y se lo consideró como el “santo grial” de los colores (Oba, H., “Bara no Tanjo”, 1997, Chukoshinsho; Suzuki, M., “Shokubutsu Bio no Mahou: Aoi Bara mo Yume dewanakuhatta”, 1990, Kodansha Bluebacks; Saisho, H., “Aoi Bara”, 2001, Shogakkan).

A pesar de que actualmente existen las variedades de “rosas azules”, estas son en realidad rosas de color violeta claro. Se cree que la primera variedad mejorada de “rosa azul” mediante cruzamiento es la de color gris con un tono en color violeta claro “Grey Perl” creada en 1945. La rosa de color rosado y violeta claro “Staring Silver” se creó posteriormente en 1957 y estas variedades se cruzaron para producir varias rosas de color violeta claro “Blue Moon” (1964) y “Madam Violet” (1981). Estas rosas de color violeta claro y otras rosas se utilizaron posteriormente en otros cruzamientos para crear las rosas de color gris claro como “Seiryu” (1992) y “Blue Heaven” (2002), que se anunciaron como nuevos tipos de “rosas azules”.

No obstante, estos colores de flores no son en realidad azules sino meramente rosado grisáceo claro y a pesar de los años de cruzamientos, no existe aún ningún ejemplo de una rosa verdaderamente “azul”. En la industria de la horticultura, el grupo de colores de violeta a azul generalmente se considera “azul” de conformidad con la RHSCC (tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura). El objetivo de la presente invención es crear rosales que tengan colores de flores dentro del “grupo violeta”, el grupo “violeta-azul” y el “grupo azul” de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura.

Los colores de las flores se derivan principalmente de los tres grupos compuestos de antocianinas, carotenoides y betalaninas, pero son las antocianinas, que presentan el mayor intervalo de longitud de onda de absorción (de naranja a azul), las que producen el color azul. Las antocianinas pertenecen a la familia de los flavonoides y se biosintetizan mediante la vía metabólica que se muestra en la figura 1. Normalmente, las antocianinas se ubican en las vacuolas de las células epiteliales. El tono de color de las antocianinas (es decir, el color de la flor) depende en gran medida de la estructura de las antocianinas, con grupos hidroxilo más numerosos en el anillo B que dan como resultado un color más azul. La hidroxilación del anillo B se cataliza mediante el flavonoide 3′-hidroxilasa (F3′H) y el flavonoide 3′,5′-hidroxilasa (F3′5′H). La ausencia de actividad de F3′H y F3′5′H conduce a la síntesis de la pelargonidina (colores de naranja a rojo), la presencia de actividad de F3′H conduce a la síntesis de cianidina (colores rojo a carmín) y la presencia de actividad de F3′5′H conduce a la síntesis de la delfinidina (color violeta).

Estas antocianidinas se modifican con azúcares y grupos acilo para producir una variedad de antocianinas. En términos generales, un mayor número de grupos acilo aromáticos modificadores se corresponde con las antocianinas más azules. Las antocianinas también producen colores totalmente diferentes en función del pH de la vacuola y los flavonoles copresentes y las flavonas o iones metálicos (Saito, N., Tanpakushitsu Kakusan Kouso, 47 202-209, 2002; Broullard and Dangles, In the flavonoids: Advances in Research since 1986 (Ed. by Harborne) Capmann and Hall, London pp. 565-588; Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998; Mol et al., Trends in Plant Science 3, 212-217, 1998; Mol et al., Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999).

Las antocianinas de los pétalos de la rosa son derivados de la pelargonidina, la cianidina y la peonidina y no se conoce ningún derivado de delfinidina (Biolley and May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734 1993; Mikanagi Y., Saito N.,

Yokoi M. y Tatsuzawa F. (2000) Biochem. Systematics Ecol. 28:887-902). Se considera que esta es la principal razón por la que no existen rosas azules. Las rosas existentes han sido creadas mediante el cruzamiento de especies de rosas relacionadas y cruzables (R. multiflora, R. chinensis, R. gigantean, R. moschata, R. gallica, R. whichuraiana, R. foetida, etc.).

El hecho de que no se haya logrado ninguna rosa azul a pesar de los reiterados esfuerzos en el cruzamiento se atribuye a la falta de capacidad para producir delfinidina por parte de las variedades relacionadas con las rosas. La producción de delfinidina en los pétalos de rosa requeriría la expresión de F3′5′H en los pétalos como se menciona anteriormente, pero se cree que el F35′H no se expresa en los pétalos de rosa y variedades relacionadas con la rosa. Por tanto, es

′prácticamente imposible obtener una rosa azul mediante la acumulación de delfinidina en los pétalos mediante cruzamiento. Se sabe que las cantidades de vestigios de pigmento azul rosacianina se encuentran en los pétalos de rosas y se determinó su estructura química (publicación de patente japonesa sin examinar No. 2002-201372), pero no se conoce ningún informe con respecto al aumento de la rosacianina para crear una rosa azul y no se ha publicado ninguna conclusión acerca de la vía de biosíntesis de la rosacianina o las enzimas o genes pertinentes.

Los ejemplos de colores azul o violeta producidos por organismos biológicos también incluyen el color índigo producido por la planta índigo (por ejemplo, Appl. Microbiol. Biotechnol. Febrero 2003, 60(6):720-5) y la violaceína producida por microbios (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Octubre 2000 2(4):513-9; Org. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984) y se ha estudiado su derivación del triptófano y sus vías biosintéticas.

Asimismo se conocen los pigmentos azules basados en los compuestos iridoides derivados del fruto de la gardenia (S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, T. Iwashita, H. Komura, K. Nomoto, (1987) “Structure of genipocyanin G1, a spontaneous reaction product between genipin and glycine”. Tetrahedron Lett. 28 (40), 4699-700; S. Fujikawa, Y. Fukui, K. Koga, J. Kumada, (1987), “Brilliant skyblue pigment formation from gardenia fruits, J. Ferment. Technol. 65 (4), 419-24) and lichenderived azulenes” (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.), pero no se ha informado de que estos se expresen en los pétalos de las flores de las plantas para producir flores de color azul.

Se esperaba crear una rosa azul mediante la transferencia del gen F35′H expresado por otras plantas a la rosa y la

′expresión de este en los pétalos de rosa (Saisho, H., “Aoi Bara”, 2001, Shogakkan). El gen F35′H se obtuvo a partir d e

′varias plantas, entre las que se incluyen la petunia, la genciana y la Eustoma russellianum (Holton et al. Nature 366, 276279, 1993; Tanaka et al. Plan Cell Physiol. 37, 711-716 1996; WO93/18155). Asimismo, se ha informado de las variedades transformadas de rosa (por ejemplo, Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994); patente de los Estados Unidos No. 5,480,789; patente de los Estados Unidos No. 5,792,927; EP 536,327 A1; US 20010007157 A1).

Asimismo, se informó sobre la transferencia real del gen F3′5′H de petunia a la rosa (WO93/18155, WO94/28140).

No obstante, no ha sido posible obtener una rosa azul y se cree que para obtener una rosa azul se requerirá una modificación que altere el metabolismo de los pigmentos de la flor adecuados para la rosa.

Por otra parte, se confirmó que la transferencia del gen F3

′5′H al clavel rojo, que produce pelargonidina en lugar de delfinidina, conduce a la acumulación de la pelargonidina y la delfinidina, pero el color de la flor se altera para producir solamente un rojo ligeramente purpurino (WO94/28140). Este resultado sugiere que no es posible obtener un clavel “azul” simplemente mediante la expresión de F3′5′H y que es necesario inhibir la vía metabólica a la síntesis endóg ena de la pelargonidina del clavel.

Para evitar la competencia con la vía metabólica endógena del clavel (reducción del dihidrocaempferol (DHK) mediante la dihidroflavonol reductasa (DFR)), se seleccionó una variedad que carece de DFR entre los claveles blancos. Se transfirió al clavel el gen F3′5′H y el gen DFR de petunia (que reduce de forma eficaz la dihidromiricetina (DHM) sin reducir el DHK). Esto resultó en un caso de obtención con éxito de un clavel recombinante con un contenido de delfinidina de aproximadamente el 100% y una flor de color azul-violeta que previamente no se encontraba en el clavel (Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Vol. 47, No. 3, p 228, 2002). Por tanto, fue necesaria una modificación adicional para obtener una flor de clavel de color azul, además de acumular la delfinidina mediante la expresión del gen F3′5′H.

La DFR ya ha sido clonada a partir de varias plantas (petunia, tabaco, rosa, Torenia, boca de dragón, margarita de Transvaal, orquídea, cebada, maíz, etc.) (Meyer et al., Nature 330, 677-678, 1987; Helariutta et al., Plant Mol. Biol. 22, 183-193 1993; Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031; Johnson et al., Plant J. 19, 81-85, 1999). La especificidad de sustrato del gen DFR difiere en función de la variedad de planta y se sabe que los genes DFR de la petunia, el tabaco y la orquídea no pueden reducir el DHK, mientras que el gen DFR de la petunia reduce de forma más eficaz la DHM entre los dihidroflavonoles (Forkmann et al., Z. Naturforsch. 42c, 1146-1148, 1987; Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999). No obstante, no se informó sobre ningún caso para la expresión de estos genes DFR en rosas.

Como medio para evitar la competencia con la vía metabólica endógena o entre la enzima y la enzima exógena derivada de genes exógenos como el F3′5′H, como se establece anteriormente, el gen puede transferi rse a una variedad que carezca del gen. Asimismo, se sabe que la expresión del gen diana puede inhibirse artificialmente mediante procedimientos de eliminación que implican la recombinación homóloga del gen diana, pero debido a la baja frecuencia de la recombinación homóloga y el número limitado de variedades de planta adecuadas, esto no se ha puesto en práctica (por ejemplo, Nat. Biotechnol. 2002, 20:1030-4).

Los procedimientos de inhibición del nivel de transcripción incluyen el procedimiento antisentido que utiliza transcripciones de ARN antisentido para el ARNm del gen diana (van der Krol et al., Nature 333, 866-869, 1988), el procedimiento sentido (cosupresión) que utiliza transcripciones de ARN equivalentes al ARNm del gen diana (Napoli et al., Plant Cell 2, 279-289, 1990) y un procedimiento para utilizar transcripciones de ARN bicatenario que corresponden al ARNm del gen diana (procedimiento ARNi; Waterhouse et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964, 1998).

Se publicaron numerosos ejemplos exitosos de estos tres procedimientos. Para la rosa, se informó que la cosupresión del gen chalcona sintasa (CHS) que es necesario para la síntesis de las antocianinas, altera con éxito el color de la flor de rojo a rosado (Gutterson HortScience 30:964-966 1995), pero esta supresión de CHS es incompleta y por tanto no ha sido posible suprimir de forma total la síntesis de antocianina para obtener una cepa de flor blanca.

•

Documento de patente 1: Publicación de patente japonesa sin examinar No. 2002-201372

•

Documento de patente 2: WO93/18155

•

Documento de patente 3: Patente de los Estados Unidos No. 5,480,789

•

Documento de patente 4: Patente de los Estados Unidos No. 5,792,927

•

Documento de patente 5: Patente europea 536 327 A1

•

Documento de patente 6: US 20010007157 A1

•

Documento de patente 7: WO94/28140

•

Documento que no es una patente 1: Honda T. et al. Gendai Kagaku, May, 25-32 (1998)

•

Documento que no es una patente 2: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39, 1119-1126, 1998

•

Documento que no es una patente 3: Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999

•

Documento que no es una patente 4: Oba, H., “Bara no Tanjo”, 1997, Chukoshinsho

•

Documento que no es una patente 5: Suzuki, M., “Shokubutsu Bio no Mahou: Aoi Bara mo Yume dewanakunatta”, 1990, Kodansha Bluebacks

•

Documento que no es una patente 6: Saisho, H., “Aoi Bara”, 2001, Shogakkan

•

Documento que no es una patente 7: Saito, N., Tanpakushitsu Kakusan Kouso, 47 202-209, 2002

•

Documento que no es una patente 8: Broullard et al. In the flavonoids: Advances in Research since 1986 (Ed por Harborne) Capmann y Hall, London pp 565-588

•

Documento que no es una patente 9: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 39 1119-1126, 1998

•

Documento que no es una patente 10: Mol et al, Trends in Plant Science 3, 212-217 1998

•

Documento que no es una patente 11: Mol et al. Curr. Opinion Biotechnol. 10, 198-201 1999

•

Documento que no es una patente 12: Biolley y May, J. Experimental Botany, 44, 1725-1734 1993

•

Documento que no es una patente 13: Mikanagi Y, et al. (2000) Biochem Systematics Ecol. 28:887-902

•

Documento que no es una patente 14: Appl. Microbiol. Biotechnol. Febrero de 2003; 60(6):720-5

•

Documento que no es una patente 15: J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Octubre de 2000; 2 (4): 513-9

•

Documento que no es una patente 16: Org. Lett., Vol. 3, No. 13, 2001, 1981-1984

•

Documento que no es una patente 17: S. Fujikawa, et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28 (40), 4699-700

•

Documento que no es una patente 18: S. Fujikawa, et al. (1987) J. Ferment. Technol. 65 (4), 419-24

•

Documento que no es una patente 19: Holton et al. Nature 366, 276-279, 1993

•

Documento que no es una patente 20: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 37, 711-716 1996

•

Documento que no es una patente 21: Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994)

•

Documento que no es una patente 22: Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Vol. 47, No. 3, p 228, 2002

•

Documento que no es una patente 23: Meyer et al. Nature 330, 677-678, 1987

•

Documento que no es una patente 24: Helariutta et al. Plant Mol. Biol. 22 183-193 1993

5 • Documento que no es una patente 25: Tanaka et al. Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031

•

Documento que no es una patente 26: Johnson et al. Plant J. 19, 81-85, 1999

•

Documento que no es patente 27: Forkmann et al. Z. Naturforsch. 42c, 1146-1148, 1987

•

Documento que no es una patente 28: Nat Biotechnol 2002, 20:1030-4

•

Documento que no es una patente 29: van der Krol et al. Nature 333, 866-869, 1988

10 • Documento que no es una patente 30: Napoli et al. Plant Cell 2, 279-289, 1990

•

Documento que no es una patente 31: Waterhouse et al. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13959-13964 1998

•

Documento que no es una patente 32: Gutterson HortScience 30:964-966 1995

•

Documento que no es una patente 33: Suzuki, S., “Bara, Hanazufu”, Shogakkann, p. 256-260, 1990

Divulgación de la invención

15 Como se menciona anteriormente, los colores de la rosa se alteraron con éxito mediante la transferencia del gen F3′5′H a la rosa y la expresión de este en los pétalos. En el clavel, el gen F3′5′H y el gen DFR de la petunia se expresaron en las variedades con deficiencia de DFR para crear claveles de color azul-violeta. No obstante, aún no se ha creado la “rosa azul”. Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un rosal que florezca con una flor azul.

La invención proporciona por tanto (1) un procedimiento para producir una rosa caracterizada por la supresión artificial de 20 la vía metabólica endógena de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica flavonoide 3′,5′-hidroxilasa.

La invención proporciona además (2) un procedimiento para producir una rosa caracterizada por la supresión artificial de la vía metabólica endógena de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica el flavonoide 3′,5′ -hidroxilasa y el gen que codifica la dihidroflavonol reductasa.

Asimismo la invención también proporciona (3) un procedimiento para producir una rosa caracterizada por la supresión

25 artificial de la dihidroflavonol reductasa endógena de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica el flavonoide 3′,5′-hidroxilasa y el gen que codifica la dihidroflavonol reductasa derivada de una planta que no es un rosal.

Asimismo la invención también proporciona (4) un procedimiento para producir una rosa caracterizada por la supresión artificial de la expresión del flavonoide 3′ -hidroxilasa endógeno de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica el flavonoide 3′,5′-hidroxilasa.

30 El gen del pensamiento mencionado anteriormente que codifica el flavonoide 3′,5′ -hidroxilasa es, por ejemplo, el gen que se enumera en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. El gen que codifica la dihidroflavonol reductasa se deriva preferentemente de lirio, Nierembergia, petunia, orquídea, genciana o Eustoma russellianum.

Asimismo la invención también proporciona (5) una rosa obtenida mediante el procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de los puntos (1) a (4) anteriores o su progenie o tejido que tiene las mismas propiedades 35 que la rosa.

Asimismo la invención también proporciona (6) una rosa obtenida mediante el procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de los puntos (1) a (4) anteriores o su progenie o tejido donde el color del pétalo de la rosa es violeta.

La invención proporciona además (7) una rosa de conformidad con el punto (6) anterior o su progenie o tejido, donde el 40 color del pétalo de la rosa pertenece al “grupo violeta" de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC).

La invención proporciona además (8) una rosa de conformidad con el punto (7) anterior o su progenie o tejido, donde el color del pétalo de la rosa pertenece al “grupo violeta" 85a u 85b de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la vía de biosíntesis del flavonoide.

CHS: Chalcona sintasa, CHI: Chalcona isomerasa, FNS: Flavona sintasa, F3H: Flavanona 3-hidroxilasa

F3′H: Flavonoide 3′-hidroxilasa

F3′5′H: Flavonoide 3′5′-hidroxilasa, FLS: Flavonol sintasa

DFR: Dihidroflavonol 4-reductasa

ANS: Antocianidina sintasa, AS: Aurona sintasa C2′GT: Chalcona 2′-glucosil transferasa.

La figura 2 muestra la estructura del plásmido pBERD1.

La figura 3 muestra la estructura del plásmido pBPDBP2.

La figura 4 muestra la estructura del plásmido pBPDBP8.

La figura 5 muestra la estructura del plásmido pSPB461.

La figura 6 muestra la estructura del plásmido pSPB472.

La figura 7 muestra la estructura del plásmido pSPB130.

La figura 8 muestra la estructura del plásmido pSPB919.

La figura 9 muestra la estructura del plásmido pSPB920.

La figura 10 muestra la estructura del plásmido pSPB1106.

Modo más adecuado para realizar la invención

Pueden enumerarse varias razones para explicar la falta del color azul en la rosa incluso con la producción de delfinidina. La estabilidad, solubilidad y color de las antocianinas varían en función de la modificación con grupos acilo y los azúcares. Específicamente, se sabe que el aumento en el número de grupos acilo aromáticos resulta en más color azul. Asimismo, la formación de complejos entre los copigmentos y antocianinas de flavonol y flavona produce un color azul y cambia el alcance máximo de longitud de onda de absorción hacia el extremo de la longitud de onda más larga, al tiempo que aumenta la absorbancia. El color de la antocianina también depende del pH. Debido a que el pH más bajo tiende al color rojo y el pH más neutral produce un color azul, el color de la flor depende del pH de las vacuolas en las cuales se encuentran las antocianinas. Asimismo, la formación de quelados metálicos en copresencia de iones metálicos como el Al3+ y Mg2+ puede también afectar de forma significativa el color de la flor. El ensayo y error y la investigación diligente condujeron a la propuesta de una modificación por la cual se aumenta la proporción de delfinidina en los pétalos de la flor.

En primer lugar, se intentó crear una rosa azul mediante el mismo procedimiento utilizado para crear un clavel azulvioleta. Específicamente, se intentó analizar la variedad de rosa blanca 112 e identificar una línea con deficiencia de DFR pero, a diferencia del clavel, no se pudo obtener ninguna línea con deficiencia completa de DFR. Esto puede ser debido al hecho de que el clavel es diploide mientras que la rosa cultivada de forma ordinaria es tetraploide, por lo que es difícil encontrar una línea que sea deficiente en un solo gen.

A continuación, el gen F3′5′H del pensamiento y el gen de la DFR de la petunia se transfirieron a la variedad de flor blanca Tineke y se detectó la acumulación de delfinidina, pero la cantidad fue mínima y no se obtuvo una rosa azul.

De conformidad con la presente invención, el gen DFR, una enzima que participa en la vía de síntesis flavonoide endógena de la rosa, se suprime artificialmente mediante una técnica de ingeniería genética y el gen F3′5′H del pensamiento se expresa al tiempo que también se expresa un gen de DFR que reduce la dihidromiricetina, para aumentar el contenido de delfinidina a aproximadamente el 80-100% del total de antocianidinas en los pétalos de la flor, lo que de ese modo permite la realización de una rosa azul.

Los genes DFR que reducen la dihidromiricetina utilizados en este caso fueron derivados de lirio (Iridaceae), Nierembergia (Solanaceae) y petunia (Solanaceae), pero como otras fuentes de genes DFR que reducen la dihidromiricetina pueden mencionarse las plantas que no acumulan pelargonidina como la del tabaco (Solanaceae), ciclamen (Primulaceae), espuela de caballero (Ranunculaceae), orquídea (Orchidaceae), gentiana (Gentianaceae), Eustoma russellianum (Gentianaceae) y similares (Forkmann 1991, Plant Breeding 106, 1-26; Johnson et al., Plant J. 1999, 19, 81-85). Los genes DFR utilizados para la presente invención son genes que reducen preferentemente la dihidromiricetina.

De conformidad con la presente invención, el gen flavonoide 3′-hidroxilasa (F3′H), una enzima que participa en la vía de síntesis flavonoide endógena de la rosa, se suprime artificialmente mediante una técnica de ingeniería genética y el gen F3′5′H del pensamiento se expresa para aumentar el contenido de delfinidina a aproximadamente el 80-100% del total de antocianidinas en los pétalos de la flor, lo que de ese modo permite la realización de una rosa azul.

Las rosas obtenidas de conformidad con la invención presentan colores de flor inexistentes hasta el momento y la invención puede proporcionar rosas con colores de flor que pertenecen no solamente al grupo de rojo-púrpura, grupo púrpura y grupo púrpura-violeta sino también al grupo violeta de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se explicará en mayor detalle mediante los siguientes ejemplos. A menos que se especifique de otro modo, los protocolos biológicos moleculares utilizados se basaron en la clonación molecular (Sambrook and Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Ejemplo 1. Procedimiento de medición del color de la flor

El tono de color del pétalo de la flor se evaluó por medición mediante el uso de un colorímetro espectrofotométrico (Minolta Japón) con un campo visual de 10º y una fuente de luz D65 y análisis mediante el uso de un software de control del color SpectraMagic (Minolta Japón). El número de la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC) es el color más cercano en comparación con el Sistema de Clasificación de Colores 2.1.1 (The Japan Research Institute Co., Ltd.; publicación de patente japonesa sin examinar No. 2002-016935), basado en el valor del color (sistema de colores CIE L*a*b*) obtenido mediante discriminación visual y medición con el dispositivo mencionado anteriormente. Este sistema puede utilizarse para la selección objetiva del número de la RHSCC más cercano.

Tras la medición de los tonos de colores de los pétalos de la flor de los cultivares que se denominan "rosas azules" y la determinación de los colores más cercanos de conformidad con la RHSCC mediante este procedimiento, se determinó que los colores “Blue Moon” y “Madam Violet” eran 186d (grupo púrpura grisáceo), Lavande era 186c (grupo púrpura grisáceo), Seiryu era 189d (grupo verde grisáceo) y “Blue Heaven” era 198d (grupo verde grisáceo). Estas cultivares se denominan rosas azules pero se clasifican en grupos de “Gris” de conformidad con el número de la RHSCC y por lo tanto no presentan el color azul que es objeto de la presente invención.

Ejemplo 2. Análisis de flavonoides

1) Extracción del color del pétalo de la flor

Una porción de 0,5 g de pétalos de rosa liofilizados se sometió a la extracción en 4 ml de acetonitrilo al 50% (CH3CN) que contenía TFA al 0,1 % durante 20 minutos bajo vibración ultrasónica y después se filtró con un filtro de 0,45μm. Se realizó cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de las antocianinas en el extracto en las siguientes condiciones. Se llevó a cabo la elución isocrática mediante el uso de una columna RSpak DE-413L (4,6 mmφ×25 cm, Shoko Co., Ltd.) con una velocidad de flujo de 0,6 ml/min y una fase móvil a un gradiente de concentración lineal de CH3CN/H2O al 10%→50% que contenía ácido trifluoroacético (TFA) al 0,5% durante 15 minutos seguida de CH3CN/H2O al 50% que contenía TFA al 0,5% durante 10 minutos. La detección se realizó mediante el uso de un detector de haz de fotodiodos SPD-M10A (Laboratorios Shimadzu), con detección en el intervalo de longitud de onda de 600-250 nm y un cálculo de la proporción de abundancia de cada antocianina basada en el área de absorbancia de 520 nm.

2) Análisis de antocianidinas

Una porción de 0,2 ml del filtrado se secó completamente a presión reducida en un tubo de ensayo de vidrio y se disolvió en 0,2 ml de ácido clorhídrico (HCl) 6N y se sometió a hidrólisis a 100°C durante 20 minutos. Las antocianidinas hidrolizadas se extrajeron con 0,2 ml de 1-pentanol y la capa orgánica se analizó mediante HPLC en las siguientes condiciones. La columna utilizada fue ODS-A312 (6 mmφ×15 cm, YMC Co., Ltd.) y la elución se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 1 ml/min mediante el uso de una solución de CH3COOH:CH3OH:H2O=15:20:65 como la fase móvil.

La detección se realizó mediante medición espectral a 600-400 nm mediante el uso de un detector de haz de fotodiodos SPD-M10A (Laboratorios Shimadzu), la identificación basada en la absorción máxima (

λmáx) y el tiempo de retención (RT) y cuantificación basada en un área de absorbancia de 520 nm. El tiempo de retención yλmáx de la delfi nidina y la cianidina en estas condiciones de HPLC fue de 4,0 min, 5,2 min y 534 nm, 525 nm, respectivamente. El hidrocloruro de delfinidina y el hidrocloruro de cianidina comprados a Funakoshi Co., Ltd. se utilizaron como muestras para la identificación y cuantificación.

3) Análisis de flavonoles

Una porción de 0,2 ml del filtrado extraído de los pétalos de la flor se secó hasta endurecerse a presión reducida en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se disolvió en 0,2 ml de una solución amortiguadora de fosfato de potasio (KPB) 0,1 M a un pH de 4,5 y después seβ

agregaron 6 unidades de -glucosidasa (Shinnihon Kagaku Co., Ltd.) y una unidad de naringenasa (Sigma Chemical Co., MO, USA) y la mezcla se mantuvo a 30°C durante 16 horas. Después de la reacción, se agregaron 0,2 ml de CH3CN al 90% a la solución de reacción enzimática para finalizar la reacción. La solución se filtró con un filtro de 0,45 μm y se sometió a HPLC en las siguientes condiciones.

La elución isocrática se llevó a cabo mediante el uso de una columna de Develosil C30-UG-5 (4,6 mmφ×15 cm, Nomura Chemical Co., Ltd.) con una velocidad de flujo de 0,6 ml/min y una fase móvil a un gradiente de concentración lineal de CH3CN/H2O al 18%-+63% que contenía TFA al 0,1% durante 10 minutos seguido de CH3CN/H2O al 63% que contenía TFA al 0,1% durante 10 minutos. La detección se realizó mediante el uso de un detector de haz de fotodiodos SPD-M10A, con detección en el intervalo de longitud de onda de 400-250 nm. El tiempo de retención yλmáx del kaempferol y la quercetina en estas condiciones fue de 11,6 min, 365 nm y 10,3 min, 370 nm, respectivamente. El kaempferol y la quercetina comprados a Funakoshi Co., Ltd. se utilizaron como muestras para la cuantificación basada en el área A330 nm.

Ejemplo 3. Procedimiento de medición del pH

Aproximadamente 2g de pétalos de rosa congelados a -80°C durante una hora o más se prensaron con un homogenizador para obtener el jugo de pétalos. El pH se midió mediante la conexión de un microelectrodo 6069-10C (Laboratorios Horiba) a un medidor de pH (F-22, Horiba Laboratories).

Ejemplo 4. Transformación de la rosa

Se informó acerca de varios procedimientos para la transformación de rosas (por ejemplo, Firoozababy et al. Bio/Technology 12:883-888 (1994); Patente de los Estados Unidos No. 5,480,789; patente de los Estados Unidos No. 5,792,927; patente europea 536.327 A1; US 20010007157 A1), y la transformación puede llevarse a cabo mediante cualquiera de estas técnicas. Específicamente, se sumergieron los callos de la rosa tomados de las hojas asépticas de plántula durante 5 minutos en una suspensión bacteriana de Agrobacterium tumefaciens Ag10 (Lazo et al., Bio/Technology 9:963-967, 1991), el exceso de suspensión bacteriana se extrajo con papel de filtro estéril y los callos se transfirieron a un medio de subcultivo y se cocultivaron durante 2 días en un cuarto oscuro.

Después de enjuagar posteriormente con un medio líquido de MS que contenía 400 mg/L de carbenicilina, los callos se transfirieron a un medio de selección/eliminación preparado mediante la adición de 50 mg/L de kanamicina y 200 mg/L carbenicilina a un medio de subcultivo. Después de repetir la transferencia y cultivo de las porciones que crecieron normalmente en el medio de selección sin inhibición de crecimiento, se seleccionaron los callos resistentes a la kanamicina. Los callos transformados resistentes a la kanamicina se cultivaron en un medio de rediferenciación que contenía 50 mg/L de kanamicina y 200 mg/L de carbenicilina para obtener brotes resistentes a la kanamicina. Los brotes obtenidos se enraizaron en un medio 1/2MS y después se acondicionaron. Las plantas acondicionadas se colocaron en macetas y luego se cultivaron en un invernadero cerrado hasta florecer.

Ejemplo 5. Obtención del gen flavonoide de la rosa

La biblioteca de ADNc derivada de los pétalos de la flor de la variedad de rosa Kardinal se detectó mediante el uso del gen DFR de la petunia (descrito en WO96/36716) como sonda, para obtener el ADNc de DFR de la rosa que se denominó pCGP645. Los detalles se describieron (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995).

De igual modo, la misma biblioteca se detectó con el gen chalcona sintasa-A (CHS-A) de la petunia (Koes et al., Gene (1989) 81, 245-257) y el gen antocianidina sintasa (ANS) (Martin et al., Plant J., (1991) 1, 37-49) de conformidad con un procedimiento conocido públicamente (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031 1995), para obtener los homólogos de la chalcona sintasa (CHS) y antocianidina sintasa (ANS) de la rosa que fueron denominados como pCGP634 y pCGP1375, respectivamente. La secuencia de nucleótidos para la CHS de la rosa se enumera como la SEQ ID NO: 5 y la secuencia de nucleótidos para la ANS de la rosa se enumera como la SEQ ID NO: 6.

Ejemplo 6. Detección de la rosa blanca

Para la creación de un cultivar azul mediante la recombinación de genes, pueden seleccionarse los cultivares que carecen únicamente del gen DFR para evitar la competición entre la vía de síntesis endógena de la antocianina y los genes introducidos (especialmente el gen F3′5′H) y el gen DFR de la petunia y el gen F3′5H transferidos a sus cultivares (WO96/36716).

Se realizó una selección entre las numerosas variedades existentes de rosas blancas para detectar aquellas que únicamente carecían del gen DFR y que expresaban normalmente otros genes enzimáticos de biosíntesis de antocianinas. Se cree que la causa del blanqueamiento del color de la flor es una mutación ocasional o eliminación de los genes estructurales implicados en la biosíntesis de antocianinas y la pérdida ocasional de factores que regulan la transcripción de los genes estructurales que participan en la biosíntesis de antocianina. Se examinaron las rosas que carecían del ARNm del gen DFR de conformidad con el procedimiento descrito en WO96/36716.

En primer lugar, se analizaron 112 líneas de rosas principalmente blancas para detectar la composición flavonoide de los pétalos de la flor mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 1 y se seleccionaron las líneas con una alta acumulación de flavonoles. El pH de cada jugo de pétalo después se midió y se escogieron 80 cultivares con un pH relativamente alto como principales candidatos.

A continuación se extrajo el ARN de los pétalos de estos cultivares. La extracción de ARN se logró mediante un procedimiento conocido públicamente (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995). El ARN obtenido se utilizó para examinar la presencia o ausencia de ARNm que corresponde al gen DFR de la rosa (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995) y al gen antocianidina sintasa (ANS) de la rosa. Se llevó a cabo la RT-PCR y se seleccionaron ocho cultivares (WKS-11, 13, 22, 36, 43, White Killarney, Tsuru No. 2, Tineke) que tenían una expresión endógena baja de ARNm de DFR y niveles normales de ARNm de ANS.

La RT-PCR se llevó a cabo con un Sistema Script de Síntesis de Primera hebra para RT-PCR (Invitrogen) mediante el uso del ARN obtenido de los pétalos de cada cultivar. Se detectó el ARNm de DFR mediante el uso de cebadores de DFR-2F (5′ -CAAGCAATGGCATCGGAATC-3′) (SEQ ID NO: 13) y DFR-2B (5′ -TTTCCAGTGAGTGGCGAAAGTC-3′) (SEQ ID NO: 14) y el ARNm de la ANS se detectó mediante el uso de cebadores de ANS-2F (5′ -TGGACTCGAAGAACTCGTCC-3′) (SEQ ID NO: 15) y ANS-2B (5′-CCTCACCTTCTCCCTTGTT-3′) (SEQ ID NO: 16).

Estos ocho cultivares mostraron niveles bajos de ARNm de DFR y niveles normales de ARNm de ANS en la inmunotransferencia Northern blotting (Tabla 1) y sus propiedades de cultivo fueron excelentes. Se eligieron dos de los cultivares transformables (Tineke, WKS36) para la transferencia real de la construcción que produce delfinidina.

TABLA 1

Nombre del cultivar

Flavonoles (mg/g de pétalo) pH RT-PCR

Q

K Total DFR CHS ANS

WKS-36

0,082 8,095 8,177 4,81 − + +

Killarney blanca

1,343 6,113 7,456 4,7 + + +

Tsuru No. 2

0,715 5,188 5,903 4,7 + + +

WKS-11

2, 028 0,475 2,503 4,51 + +

Tineke

0,097 4,337 4,434 4,45 − + +

WKS-13

0,320 3,993 4,313 4,45 − + +

WKS-22

0,145 10,469 10,614 4,41 − + +

WKS-43

0,045 2,104 2,149 4,07 − + +

+: ARNm detectado en el mismo nivel que la rosa de color (cultivar Rote Rose) −: ARNm detectado en niveles más bajos que la rosa de color (cultivar Rote Rose) Q: Quercetina, K: kaempferol

Ejemplo 7. Transferencia del gen DFR a la rosa a Tineke

El plásmido pE2113 (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-59, 1996) comprende el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (E1235S) que contiene repetición de la secuencia promotora y el terminador de la nopalina sintasa. Este plásmido se digirió con SacI y los extremos se cortaron mediante el uso de un kit de corte (Takara). El fragmento de ADN se ligó con un ligador SalI (Takara) 8 bp y el plásmido obtenido se denominó pUE5.

El plásmido pUE5 se digirió con HindIII y EcoRI para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kb, el cual se introdujo en el pBin19 (Bevan M., Binary Agrobacterium Vector for plant transformation. Nucl. Acid Res. 12. 8711-21, 1984) anteriormente digerido con HindIII y EcoRI, para obtener el plásmido pBE5. A continuación, el pCGP645 se digirió con BamHI y XhoI para obtener un fragmento de ADN que contiene ADNc de DFR de rosa de longitud completa. Este se ligó con pBE5 digerido con BamHI y XhoI para construir pBERD1 (FIG. 2). El plásmido se transfirió a Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pBERD1 (FIG. 2) se transfirió al cultivar de rosa blanca “Tineke” y se obtuvieron 18 transformantes. El color de la flor se alteró en seis de los transformantes obtenidos. El análisis de pigmentos de dos plantas en las cuales se observó un claro cambio de color de blanco a rosado confirmó la acumulación de cianidina y pelargonidina en ambas (Tabla 2). Estos resultados sugirieron que el cultivar Tineke es un cultivar que carece del gen DFR.

TABLA 2 5

No. de planta

Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

0,014 0,005

2

0,014 0,006

Cia: Cianidina, Pel: Pelargonidina

Ejemplo 8. Transferencia del gen F3′5′H (#18) del pensamiento y el gen DFR de la petunia a Tineke

Se extrajo el ARN de los pétalos del pensamiento en ciernes (variedad de pensamiento negro) mediante el procedimiento de Turpen y Griffith (BioTechniques 4:11-15, 1986) y se utilizó Oligotex-dT (Qiagen) para la purificación del poliA+ARN. Se utilizó este poliA+ARN y un kit de clonación λZAPII/GigapackII (Stratagene) para co nstruir una biblioteca de ADNc a partir de los pétalos del pensamiento en ciernes. Después de transferir aproximadamente 100.000 pfu de las placas de fagos cultivadas en una placa NZY a una Colony/PlaqueScreen (DuPont), el tratamiento se llevó a cabo según el protocolo recomendado por el fabricante. Las placas se marcaron con 32P y se tamizaron mediante el uso de Hf1ADNc de petunia Hf1DNAc (pCGP602, Holton et al., Nature, 366, p 276-279, 1993) como sonda.

La membrana se sometió a pre-hibridación durante 1 hora a 42°C en una solución amortiguadora de hibridación (formamida al 10% (v/v), NaCl 1 M, sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 1%), y luego la sonda marcada con 32P se agregó a 1×106 cpm/ml y la hibridación se llevó a cabo durante 16 horas a 42° C. Se lavó la membrana durante 1 hora en 2×SSC, SDS al 1% a 42°C, se intercambió la solución de lavado fresca y se lavó nuevamente durante 1 hora. La membrana lavada se expuso en una película Kodak XAR junto con una pantalla intensificadora y se detectó la señal de hibridación.

Los resultados del análisis de ADNc demostraron que los dos ADNc obtenidos presentaban una alta identidad con el Hf1 de petunia. Los dos tipos de ADNc se ′5′H del pensamiento BP#18 (pCGP1959) y BP#40

denominaron ADNc F3(pCGP1961). La secuencia de nucleótidos para #18 se enumera como la SEQ ID NO: 1 y su secuencia de aminoácidos correspondiente se enumera como la SEQ ID NO: 2, la secuencia de nucleótidos para #40 se enumera como la SEQ ID No. 3 y su secuencia de aminoácidos correspondiente se enumera como la SEQ ID NO: 4. El BP#18 y BP#40 tienen un 82% de identidad en el nivel de ADN. Asimismo, tanto el BP#18 como el BP#40 presentan un 60% de identidad con el Hf1 de petunia y un 62% de identidad con el Hf2 de petunia (Holton et al., Nature, 366, p 276-279, 1993) en el nivel de ADN.

Por otra parte, el plásmido pUE5 se digirió con EcoRI y los extremos se cortaron mediante el uso de un kit de corte (Takara) y el fragmento de ADN obtenido se ligó con un ligador HindIII 8 bp (Takara), lo que produjo un plásmido que se denominó pUE5H. Se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb obtenido mediante digestión completa del plásmido pCGP1959 que contenía ADNc F3′5′H #18 del pensamiento con BamHI y a digestión parcial con XhoI. El plásmido obtenido mediante enlace de este pUE5H digerido con BamHI y XhoI se denominó pUEBP18.

Por otra parte, se recuperó un fragmento de ADN que contenía ADNc de DFR de petunia mediante la digestión de pCGP1403 (WO96/36716) con BamHI y XhoI y este fragmento de ADN se ligó con el pBE5 que había sido digerido con BamHI y XhoI para preparar pBEPD2. A continuación, el pUEBP18 se digirió parcialmente con HindIII y se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb que contenía el promotor E1235S, el ADNc F3′5′H #18 del pensamiento y el terminador nos. Este fragmento se ligó con un fragmento de ADN obtenido mediante digestión parcial de pBEPD2 con HindIII para obtener un plásmido de vector binario pBPDBP2 (FIG. 3). El plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pBPDBP2 (FIG. 3) se transfirió al cultivar de rosa blanca “Tineke” y se obtuvieron 40 transformantes. El color de la flor se alteró en 23 de los transformantes obtenidos y el análisis de pigmentos confirmó la acumulación de delfinidina en 16 de los 19 transformantes analizados (Tabla 3). El contenido de delfinidina fue de un 100% como máximo (promedio: 87%) pero la cantidad máxima de pigmento fue muy baja a 0,035 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alteró únicamente del color 158d de la tabla de colores de la RHS (grupo amarillo-blanco) al color 56a (grupo rojo) o 65b (grupo rojo-púrpura), y tampoco se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC ni se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 3

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

87 0,002 0,00 0 0,000 0,058 0,354

2

100 0,004 0,000 0,338 0,059 1,921

3

82 0,002 0,001 0,203 0,039 1,382

4

100 0,003 0, 000 0,245 0,050 1,840

5

76 0,005 0,001 0,000 0,280 3,288

6

0 0,000 0,000 0,000 0,098 0,409

7

0 0,000 0,001 0,000 0,101 0,358

8

0 0,000 0,001 0,000 0,030 2,277

9

83 0,013 0,003 0,000 0,117 0,841

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

10

85 0,011 0,002 0,000 0,104 3,300

11

84 0,020 0,004 0,000 0,168 3,137

12

91 0,025 0,002 0,294 0,119 1,252

13

90 0,028 0 ,003 0,000 0,075 1,912

14

91 0,014 0,001 0,000 0,152 2,667

15

90 0,035 0,004 0,000 0,086 1,616

16

83 0,023 0,005 0,000 0,117 2,267

17

91 0,014 0,001 0,0 00 0,113 0,825

18

7 6 0,003 0,001 0,000 0,085 2,351

19

82 0,005 0,001 0,000 0,054 1,616

Del: Delfinidina, M: Miricetina

Ejemplo 9. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR de la petunia a Tineke

El plásmido pE2113 (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-59, 1996) se digirió con HindIII y XbaI para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 800 bp, que se ligó con pBin19 (Bevan M., Binary Agrobacterium Vector for plant transformation. Nucl. Acid Res. 12. 8711-21, 1984) digerido anteriormente con HindIII y XbaI. El plásmido obtenido se

5 denominó pCGP1391. Otro plásmido, el pCGP669 (WO94/21840), contiene el promotor del gen chalcona sintasa-A (CHS-A) de la petunia. Este plásmido se digirió con EcoRI, se cortó y luego digirió con HindIII.

El fragmento de ADN de aproximadamente 700 bp se ligó con pCGP1391 que había sido digerido previamente con HindIII y SnaBI y el plásmido obtenido se denominó pCGP1707. Asimismo, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb obtenido mediante digestión completa del plásmido pCGP1961 que contenía ADNc F3′5′H #40

10 del pensamiento con BamHI y a digestión parcial con XhoI. El plásmido obtenido mediante ligazón de este pUE5H digerido con BamHI y XhoI se denominó pUEBP40. El plásmido pUEBP40 se digirió con EcoRV y XbaI y se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 5,5 kb.

Este fragmento se ligó con un fragmento de aproximadamente 700 bp obtenido mediante la digestión del plásmido pCGP1707 con HindIII, el corte de los extremos y la digestión adicional con XbaI para obtener el plásmido pUFBP40. A

15 continuación, el pUFBP40 se digirió parcialmente con HindIII y se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,4 kb que contenía el potenciador del promotor 35S de la coliflor, el promotor CHS-A, el ADNc F3′5′H #40 del pensamiento y el terminador nos. Este fragmento se ligó con un fragmento de ADN obtenido mediante digestión parcial del pBEPD2 con HindIII para obtener un plásmido de vector binario pBPDBP8 (FIG. 4). El plásmido se introdujo en Agrobacterium tumefaciens Ag10.

20 El plásmido pBPDBP8 (FIG. 4) se transfirió al cultivar de rosa blanca “Tineke” y se obtuvieron 53 transformantes. El color de la flor se alteró en 17 de los transformantes obtenidos y el análisis de pigmentos confirmó la acumulación de delfinidina en 8 de los 9 transformantes analizados (Tabla 4). El contenido de delfinidina fue de un 93% como máximo (promedio: 79%) pero la cantidad máxima de pigmento fue muy baja a 0,014 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alteró únicamente del color 158d de la tabla de colores de la RHS (grupo amarillo-blanco) al color 56a (grupo rojo) o

25 65b (grupo rojo-púrpura), y tampoco se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC ni se pudo obtener la rosa azul diana. Esto sugirió que la variedad Tineke no es una variedad que carece únicamente del gen DFR.

TABLA 4 5

No. de planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

0 0,000 0,001 0,000 0,018 2,023

2

9 0,001 0,006 na na na

3

93 0,011 0,001 0,000 0,036 2,724

4

86 0,007 0,001 0,000 0,076 2,957

5

71 0,013 0,006 0,000 0,073 2,503

6

87 0,014 0,002 0,000 0,058 3,390

7

78 0,005 0,002 0,000 0,049 1,241

No. de planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

8

47 0,004 0,004 0,000 0,070 1,800

9

78 0,004 0,001 0,000 0,029 2,326

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 10. Transferencia del gen F3′5′H (#18) del pensamiento y el gen DFR de la petunia a WKS36

El plásmido pBPDBP2 (FIG. 3) se transfirió al cultivar de rosa blanca “WKS36” y se obtuvieron 138 transformantes. El color de la flor se alteró en 10 de los transformantes obtenidos y se confirmó la acumulación de delfinidina en todas las plantas (Tabla 5). El contenido de delfinidina fue de un 91% como máximo (promedio: 60%) pero la cantidad máxima de pigmento fue muy baja a 0,033 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alteró únicamente a un color rosado muy claro, y tampoco se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC ni se pudo obtener la rosa azul diana. Esto sugirió que la variedad WKS36 no es una variedad que carece únicamente del gen DFR.

TABLA 5

No. de planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

60 0,008 0,005 0,381 0,169 2,291

2

40 0,006 0,009 0,633 0,486 2,911

3

54 0,005 0,005 0,654 0,336 3,460

4

43 0,016 0,021 0,000 0,656 2,469

5

53 0,009 0,008 0,404 0,325 2,397

6

53 0,004 0,003 0,498 0,251 2,768

7

45 0,013 0,01 6 0,000 0,381 1,537

8

83 0,004 0,001 0,000 0,156 1,632

9

80 0,033 0,008 0,000 0,557 3,766

10

91 0,013 0,0 00 0,000 0,184 2,610

Ejemplo 11. Transferencia del gen F3′5′H (#18) del pensamiento y el gen DFR de la petunia a WKS36

El plásmido obtenido mediante el reemplazo del sitio AscI del plásmido pUCAP (van Engelen et al., Transgenic Research 4, 288-290, 1995) con el ligador PacI se denominó pUCPP. Por otra parte, se obtuvo un cassette de expresión preparado ligando el promotor de chalcona sintasa de la rosa, el ADNc F3

′5′H #18 del pensamiento y el terminador nos de la

siguiente forma.

Se extrajo el ADN cromosómico de hojas jóvenes del cultivar de rosa Kardinal (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995). Una porción de aproximadamente 100 μg de ADN se ó parcialmente con Sau3AI y

digiri se recuperaron fragmentos de ADN de aproximadamente 20-kb mediante el gradiente de densidad de sacarosa.

Estos se ligaron con fago lambda EMBL3 (por ejemplo, Stratagene) que había sido digerido con BamHI y se preparó una biblioteca de ADN cromosómico mediante el protocolo recomendado por el fabricante. La biblioteca se analizó con un procedimiento conocido públicamente (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995) mediante el uso del ADNc de la chalcona sintasa de la rosa (DNA database: GenBank Accession No. AB038246) como sonda. Entre los clones de cromosomas de chalcona sintasa obtenidos, se encontró el lambda CHS20 que incluyó una secuencia de ADN de aproximadamente 6,4 kb secuencia arriba desde el codón de inicio de la charcona sintasa. El fragmento de ADN de aproximadamente 2,9 kb obtenido mediante la digestión de lambda CHS20 con HindIII y EcoRV incluye la región promotora de charcona sintasa.

Este fragmento se ligó con un fragmento obtenido mediante la digestión del pUC19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33:103-119, 1985) con HindIII y SmaI. Este se denominó pCGP1116. La secuencia de la región promotora de chalcona sintasa incluida en este se enumera como la SEQ ID NO: 21. Se ligó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,9 kb obtenido mediante la digestión del pCGP1116 con HindIII y KpnI, con un fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pJB1 (Bodeau, Molecular and genetic regulation of Bronze-2 and other maize anthocyanin genes. Dissertation, Stanford University, USA, 1994) con HindIII y KpnI para obtener el pCGP197.

Por otra parte, un fragmento de ADN de aproximadamente 300 bp que contenía el terminador de la nopalina sintasa, obtenido mediante la digestión del pUE5 con SacI y KpnI, se cortó y se ligó con el pBluescriptSK que había sido digerido con EcoRV y BamHI y cortado. Un plásmido entre los obtenidos en los que el extremo 5del terminador se e ncontraba

′

cerca del sitio SalI del pBluescriptSK se denominó pCGP1986. Un fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pCGP1986 con XhoI, el corte de los extremos y la digestión adicional con SalI se ligó con un fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pCGP197 con HindIII, el corte de los extremos y la digestión adicional con SalI, para obtener el pCGP2201.

A continuación, el fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pCGP2201 con SalI y el corte de los extremos se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb (que contenía el gen flavonoide 35′ -hidroxilasa del

′pensamiento) obtenido mediante la digestión del pCGP1959 con BamHI y KpnI y el corte de los extremos. El plásmido de aquellos obtenidos en los cuales el promotor de chalcona sintasa de la rosa había sido insertado en una dirección que permitía la transcripción del gen flavonoide 3′,5′ -hidroxilasa del pensamiento en la dirección hacia delante se denominó pCGP2203. El plásmido pCGP2203 se recuperó mediante la digestión con HindIII y SacI. El fragmento de ADN se clonó en los sitios HindIII y Sad del pUCPP y el plásmido resultante se denominó pSPB459. A continuación, el plásmido pE2113 se digirió con SnaBI y se insertó un ligador de BamHI (Takara) para obtener un plásmido denominado pUE6.

El fragmento de ADN de aproximadamente 700 bp obtenido mediante la digestión del pUE6 con HindIII y BamHI se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2,2 kb obtenido mediante la digestión del pCGP1405 (WO96/36716) con BamHI y BglII y con el vector binario pBinplus (van Engelen et al., Transgenic Research 4, 288-290, 1995) digerido con HindIII y BamHI, para obtener el pSPB460. Un fragmento de ADN de aproximadamente 5 kb obtenido mediante la digestión del pSPB459 con PacI se introdujo en el sitio PacI del pSPB460 para obtener el pSPB461 (FIG. 5), que tiene los genes DFR de la petunia y F3′5′H #18 del pensamiento unidos en la dirección hacia delante en el vector binario. Este plásmido se modifica para la expresión constitutiva del gen DFR de la petunia en plantas y la transcripción específica del gen F3′5′H #18 del pensamiento en los pétalos de las flores. El plásmido se transfirió a Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pSPB461 (FIG. 5) se transfirió a la rosa blanca “WKS36” y se obtuvieron 229 transformantes. El color de la flor se alteró en 16 de los transformantes obtenidos y se confirmó la acumulación de delfinidina en 12 de las plantas a las cuales se le analizó el pigmento (Tabla 6). El contenido de delfinidina fue de un 79% como máximo (promedio: 58%) pero la cantidad máxima de pigmento fue muy baja a 0,031 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alteró únicamente a un color rosa muy claro, y tampoco se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana. Esto sugirió que la variedad WKS36 no es una variedad que carece únicamente del gen DFR.

TABLA 6

No. de planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

39 0,002 0,004 0,000 0,414 3,744

2

52 0,006 0,005 0,000 0,465 3,363

3

27 0,002 0,005 0,000 0,342 3, 703

4

58 0,014 0,010 0,000 0,430 2,780

5

62 0,008 0,005 0,498 0,281 2,189

6

72 0,002 0,001 0,000 0,193 2, 391

7

71 0,010 0,004 0,000 0,152 4,021

8

79 0,031 0,008 0,403 0,215 2,660

9

26 0,004 0,011 0,000 0,249 2, 331

10

54 0,007 0,006 0,000 0,299 2,085

11

74 0,017 0,006 0,145 0,248 3,505

12

74 0,013 0,005 0,000 0,229 2,005

Ejemplo 12. Transferencia del gen F3′5′H (#18) de pensamiento, el gen DFR de petunia y el gen antocianina βglucosida aciltransferasa de perilla a WKS36

El gen que comprende el codón de inicio agregado al gen hidroxicinamoil CoA: antocianina -glucosida aciltransferasa

β (3AT) de perilla se denominó pSAT208F (Yonekura-Sakakibara et al., Plant Cell Physiol. 41, 495-502, 2000). Un fragmento de ADN de aproximadamente 3,9 kb obtenido mediante la digestión del pSPB580 (PCT/AU03/00079) con BamHI y XhoI se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb obtenido mediante la digestión del pSAT208F con BamHI y XhoI.

El plásmido obtenido se digirió con AscI y se recuperó un fragmento de ADN que contenía el promotor E1235S, el gen 3AT de perilla y el terminador de proteínas de transferencia de fosfolípidos de la petunia. El fragmento de ADN se insertó en el sitio AscI del pSPB461 para obtener el plásmido pSPB472 (FIG. 6) donde las direcciones de transcripción de los genes 3AT de perilla, el DFR de petunia y el F3′5′H #18 del pensamiento se encontraba n en dirección 3′. Este plásmido se modifica para la expresión constitutiva del gen 3AT de la perilla y el gen DFR de la petunia en plantas y la transcripción específica del gen F3′5′H #18 del pensamiento en los pétalos de las flores. El plásmido se transf irió a

5 Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pSPB472 (FIG. 6) se transfirió a la rosa blanca “WKS36” y se obtuvieron 75 transformantes. El color de la flor se alteró en cuatro de los transformantes obtenidos y se confirmó la acumulación de delfinidina en las tres plantas a las cuales se le analizó el pigmento (Tabla 7). El contenido de delfinidina fue de un 67% como máximo (promedio: 49%) pero la cantidad máxima de pigmento fue muy baja a 0,011 mg por gramo de pétalos y el color de la flor se alteró únicamente

10 a un color rosa muy claro y tampoco se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC ni se pudo obtener la rosa azul diana. Esto sugirió que la variedad WKS36 no es una variedad que carece únicamente del gen DFR.

TABLA 7

No. de planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

32 0,003 0,006 0,219 0,236 1,972

2

67 0,011 0,005 0,520 0,329 3,234

3

46 0,006 0,007 0,000 0,579 3,874

Por tanto, a pesar del análisis de varias rosas blancas, no fue posible obtener un cultivar que careciera únicamente del 15 gen DFR. En otras palabras, no fue posible obtener la rosa azul mediante el procedimiento para la creación del clavel azul (WO94/28140).

Ejemplo 13. Inhibición del gen DFR de la rosa mediante cosupresión

El plásmido pBERD1 se transfirió a la rosa violeta claro “Lavande” y se obtuvieron 26 transformantes. No obstante, ninguna de las plantas presentó alteración del color, lo que sugirió que es difícil inhibir el gen DFR endógeno de la rosa 20 mediante cosupresión.

Ejemplo 14. Detección de rosas de colores

Los cultivares para la creación de rosas azules luego se seleccionaron entre las rosas de colores. Después de seleccionar visualmente 136 líneas de los cultivares de rosas de colores con tonos relativamente azules, 89 de las líneas se sometieron al análisis de pigmento. Los valores obtenidos para las rosas de colores examinadas se muestran en las

25 tablas 8 a 10.

TABLA 8 TABLA 9 TABLA 10 5

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

Lavande

0,078 0,000 0,000 0,451 0,078

Madam Violet

0,055 0,000 0,000 1,780 0,189

Vol de Nuit

0,317 0,003 0,000 2,661 0,316

Blue Moon

0,049 0,000 0,000 1,341 0,119

Seiryu

0,015 0,000 0,000 3,030 1,300

WKS077

1,875 0,008 0,000 1,430 0,247

WKS078

0,211 0,000 0,000 1,286 0,133

WKS079

2,864 0,003 0,000 1,030 0,106

WKS080

0,040 0,000 0,000 0,362 0,047

WKS081

0,032 0,000 0,000 4,480 1,563

WKS082

0,074 0,000 0,000 2,400 0,196

WKS083

0,018 0,405 0,000 0,146 0,962

WKS084

0,055 0,000 0,000 1,269 0,159

WKS087

0,032 0,000 0,000 0,797 0,134

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

WKS089

0,030 0,000 0,000 1,484 0,317

WKS090

1,571 0,007 0,000 1,346 0,339

WKS091

0,045 0,169 0,000 0,186 0,899

WKS092

0,038 0,002 0,000 1,358 0,135

WKS095

0,015 0,000 0,000 2,945 0,255

WKS096

0,024 0,000 0,000 2 ,032 0,349

WKS097

0,991 0,002 0,000 1,659 0,185

WKS100

0,051 0,000 0,000 1,410 0,615

WKS101

0,424 0,000 0,000 2,194 0,482

WKS104

0,066 0,000 0,000 2,347 0,424

WKS107

1,202 0,004 0,000 3,134 0,460

WKS114

0,429 0,000 0,000 3,509 0,541

WKS116

0,026 0,000 0,000 3,440 0,868

WKS117

0,027 0,000 0,000 0,227 0,149

WKS121

0,669 0,006 0,000 1,336 0,453

WKS123

0,487 0,003 0,000 3,663 0,826

Peo: Peonidina

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

WKS124

0,022 0,045 0,000 0,192 2,012

WKS12 5

0,187 0,002 0,000 0,349 0,089

WKS126

0,544 0,002 0,000 2,226 0,895

WKS127

1,609 0,008 0,006 2,278 0,528

WKS128

1,844 0,003 0,007 2,576 0,409

WKS129

1,645 0,002 0,006 0,450 0,160

WKS130

1,332 0,008 0,005 1,599 0,525

WKS131

0,582 0,002 0,001 2,460 0,567

WKS132

1,101 0,006 0,000 0,298 0,208

WKS133

2,773 0,003 0,000 1,263 0,230

WKS133

3,487 0,011 0,023 0,414 0,108

WKS134

1,084 0,001 0,002 2,777 0,413

WKS135

0,241 0,007 0,001 0,803 0,113

WKS136

0,637 0,000 0,003 1,451 0,062

WKS137

1,208 0,014 0,002 1,034 1,027

WKS138

1,955 0,006 0,000 3,857 0,855

WKS139

0,285 0,003 0,000 1,363 0,538

WKS140

0,075 0,000 0,000 0,291 0,097

WKS141

0,197 0,000 0,000 0,358 0,045

WKS142

1,906 0,029 0,106 1,890 1,860

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

WKS143

1,125 0,027 0,020 1,596 1,129

WKS144

2,685 0,484 0,000 0,160 0,184

WKS145

0,948 0,006 0,000 3,086 1,222

WKS146

3,108 0,047 0,000 0,228 0,398

WKS 147

0,593 0,003 0,004 3,619 0,924

WKS148

0,059 0,000 0,000 3,113 0,466

WKS149

1,101 0,013 0,000 1,481 1,866

WKS150

0,498 0,562 0,000 0,061 0,156

WKS151

0,947 1,073 0,00 0 0,038 0,227

WKS152

0,303 1,599 0,000 0,015 0,464

Peo: Peonidina

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

WKS153

1,178 0,796 0,000 0,020 0,179

WKS154

0,219 0,659 0,000 0,007 0,265

WKS155

0,547 0, 006 0,000 1,274 0,073

WKS156

0,851 0,005 0,000 1,139 0,238

WKS157

0,955 0,555 0,000 0,133 1,315

WKS158

0,634 0,005 0,000 0,526 0,219

WKS159

0,106 0,320 0,000 0,034 0,959

WKS160

0,750 0,005 0,000 2,283 0,768

WKS161

0,262 0,419 0,000 0,197 1,115

WKS162

0,039 0,564 0,000 0,041 0,447

WKS163

0,184 0,002 0,000 0, 756 0,105

WKS164

0,918 0,012 0,000 1,954 2,832

WKS165

0,097 0,604 0,000 0,026 0,197

WKS166

0, 116 0,015 0,000 0,488 0,566

WKS167

0,647 0,002 0,000 2,507 0,499

WKS168

1,109 0,029 0,000 1,797 2,328

WKS169

0,070 0,003 0,000 0,208 1,369

Baby Faurax

2,247 0,022 0,058 4,518 0,580

Indigo

0,891 0,006 0,000 5,781 3,820

Intermezzo

0,040 0,000 0,000 1,075 0,443

James Veitch

1,281 0,004 0,002 2,087 0,923

Lagoon

0,053 0,000 0,000 2,887 0,315

Magenta

0,126 0,000 0,000 1,062 0,191

MRS COLVILLE

1,666 0,012 0,000 3,500 2,940

Mme. Isaac Pereire

0,629 0,003 0,000 1,021 0,105

Nombre

Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

Mme. de La Roche-Lambert

0,869 0,005 0,000 4,994 2,794

Roseraie de L'hay

0,364 0,005 1,256 0,156 0,077

Rose de Rescht

1,348 0,004 0,000 4,0 27 0,842

Rose du Roi a Fleurs Pourpres

2,556 0,017 0,000 0,968 0,411

Peo: Peonidina

Ejemplo 15. Transferencia del gen F3-aciltransferasa de

′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5 Torenia a Lavande

La modificación de las antocianinas con grupos acilo aromáticos puede estabilizar las antocianinas y producir un color más azul (por ejemplo, WO96/25500). El siguiente experimento fue realizado con el objetivo de producir antocianinas de tipo delfinidina acilada.

Se obtuvo el ARN de los pétalos de la flor de verano Torenia y se preparó el poliA+ARN a partir de estos. Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del poliA+ARN con λZAPII (Stratagene) como vector, mediante el uso de un kit de preparación de biblioteca de ADNc direccional (Stratagene) de conformidad con el protocolo recomendado del fabricante. La antocianina principal de Torenia se modifica con un grupo acilo aromático en la posición 5 de la glucosa (Suzuki et al., Molecular Breeding 2000 6, 239-246) y por tanto la antocianina aciltransferasa se expresa en los pétalos de Torenia.

La antocianina aciltransferasa incluye la secuencia de aminoácidos conservada Asp-Fe-Gli-Trp-Gli-Lis y el ADN sintético correspondiente puede utilizarse como cebador para obtener el gen antocianina aciltransferasa (WO96/25500). Específicamente, se utilizaron 10 ng de ADNc de hebra simple para la construcción de la biblioteca de ADNc de Torenia como plantilla y se utilizaron 100 ng de cebador ATC (5′ -GA(TC)TT(TC)GGITGGGGIAA-3′, I: inosina) (SEQ ID NO: 17) y 100 ng de cebador oligo dT (5′ -TTTTTTTTTTTTTTTTTCTCGAG-3′) (SEQ ID NO: 18) como cebadores para la PCR con Taq polimerasa (Takara, Japan) en las condiciones recomendadas por el fabricante.

La PCR se llevó a cabo en 25 ciclos de reacción con un ciclo que consistió en 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C. El fragmento de ADN de aproximadamente 400 bp que fue obtenido se recuperó con el gen Clean II (BIO,

101. Inc.) de conformidad con el protocolo recomendado por el fabricante y se subclonó en el pCR-TOPO. La determinación de la secuencia de nucleótidos reveló una secuencia homóloga al gen aciltransferasa de genciana (Fujiwara et al., 1998, Plant J. 16 421-431). La secuencia de nucleótidos se determinó mediante el procedimiento de imprimación de colorante (Applied Biosystems), mediante el uso del secuenciador 310 o 377 (ambos de Applied Biosystems).

El fragmento de ADN se marcó con DIG mediante el uso de un kit de detección marcador DIG (Japan Roche) y se utilizó para el análisis de una biblioteca de ADNc de Torenia mediante la hibridación de placas de conformidad con el protocolo recomendado por el fabricante. Doce de los clones de señal positiva obtenidos se seleccionaron de forma aleatoria, los plásmidos se recuperaron y se determinaron sus secuencias de nucleótidos. Estos mostraron una alta homología con la antocianina aciltransferasa. Se determinó la secuencia de nucleótidos total del ADNc en el clon denominado pTAT7. La secuencia de nucleótidos se enumera como la SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se enumera como la SEQ ID NO: 8.

Después de digerir el pBE2113-GUS (Mitsuhara et al., Plant Cell Physiol. 37, 45-59, 1996) con SacI, se cortaron los extremos y se insertó un ligador XhoI de 8 bp (Takara). Se insertó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb obtenido mediante la digestión del pTAT7 con BamHI y XhoI en los sitios BamHI y XhoI de este plásmido para obtener el pSPB120. Después de digerir el pSPB120 con SnaBI y BamHI, se cortaron los extremos y se realizó el enlace para obtener el pSPB120′. Por otra parte, el plásmido pCGP1961 que contiene el ADNc F3′5′H #18 del pensamiento se digirió completamente con BamHI y después se digirió parcialmente con XhoI para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb que se recuperó y se ligó con pUE5H digerido anteriormente con BamHI and XhoI, para obtener el plásmido que se denominó pUEBP40.

Después de digerir el pUEBP40 con SnaBI y BamHI, se cortaron los extremos y se realizó una ligazón para obtener el pUEBP40′. Este plásmido pUEBP40′ se digirió parcialmente con HindIII para obtener un fragmento de ADN de aproximadamente 2,7 kb que se recuperó y se unió con un fragmento de ADN obtenido mediante digestión parcial del pSPB120′ con HindIII. De los plásmidos obtenidos, el vector binario que tiene el gen neomicina fosfotransferasa, el gen F3′5′H #40 del pensamiento y el gen 5AT de Torenia ligados en ese orden en la misma dirección de la secuencia del borde derecho del vector binario, se denominó pSPB130 (FIG. 7). Este plásmido se modifica para la expresión constitutiva del gen F3′5′H #40 del pensamiento y el gen 5AT de Torenia en plantas y la transcripción específica de genes en los pétalos de la flor. El plásmido se transfirió a Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” y se obtuvieron 41 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 20 de las 32 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 11 y 12). El contenido de delfinidina fue de un 71% como máximo (promedio: 36%). El color de la flor se alteró del 186c de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) al 79d (grupo púrpura). La proporción de antocianinas aciladas fue tan solo de aproximadamente un 30% del total de antocianinas. Tras la medición espectral de las antocianinas aciladas, el alcance máximo de longitud de onda de absorción se había movido hacia la longitud de onda más larga en 4nm de la delfinidina 3,5-diglucosida, pero debido a la baja proporción entre el total de antocianinas, no se logró ningún efecto claro en el color de la flor.

TABLA 11

No. de Planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

0 9 0,005 0,050 na na na

2

0 11 0,009 0,069 na na na

3

0 10 0,010 0,087 na na na

4

0 22 0,028 0,102 na na na

5

5

51 0,073 0,069 na na na

6

4 57 0,093 0,069 na na na

7

5 48 0,039 0,042 na na na

8

13 0 0,000 0,065 na na na

9

17 9 0,006 0,062 na na na

10

26 0 0,000 0,104 na na na

11

17 67 0,074 0, 036 na na na

12

0 0 0,000 0,131 na na na

13

0 0 0,000 0,083 na na na

14

6 48 0,084 0,092 na na na

15

0 20 0,020 0,081 na na na

16

42 13 0,020 0,131 0,000 0,637 0,020

17

32 36 0,032 0,058 na na na

18

7 0 0,000 0,146 na na na

19

0 0 0,000 0,069 na na na

20

0 0 0,000 0,142 na na na

21

0 0 0,000 0,080 na na na

na: no hubo análisis/medición

TABLA 12

No. de Planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

22

0 0 0,000 0,069 na na na

23

0 0 0,000 0,057 na na na

24

18 4 0,006 0,149 na na na

25

17 4 0,008 0,208 na na na

26

0 0 0,000 0,188 na na na

27

0 0 0,000 0,078 na na na

28

17 67 0,090 0,044 na na na

No. de Planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

29

17 71 0,057 0 ,024 na na na

30

16 40 0,040 0,059 na na na

31

21 70 0,082 0,036 0,305 0,062 0,008

32

18 62 0,066 0,040 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 16. Transferencia del gen F3-aciltransferasa de

′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5 Torenia a WKS100

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “WKS100” y se obtuvieron 146 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 56 de las 63 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 13 15). El contenido de delfinidina fue de un 95% como máximo (promedio: 44%). El color de la flor se alteró del 56d de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo) al 186d (grupo púrpura grisáceo). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 13 TABLA 14

No. de planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

20 75 0,036 0,012 0,000 2,944 0,974 0,322

2

16 51 0, 027 0,027 0,000 1,685 1,734 0,512

3

13 50 0,024 0,024 0,000 0,000 1,382 1,912

4

23 50 0,037 0,037 0,000 na na na

5

9 25 0,013 0,033 0,005 na na na

6

10 26 0,034 0,097 0,000 na na na

7

13 65 0,053 0,028 0,000 1,936 1,184 0,760

8

13 65 0,044 0,024 0,000 1,622 1,065 0,562

9

14 62 0,033 0,021 0,000 2,096 1,444 0,710

10

14 95 0,137 0,008 0,000 0,000 0,156 1,097

11

10 62 0,036 0,022 0,000 2 ,025 1,194 0,799

12

5 59 0,054 0,038 0,000 2,194 1,289 0,783

13

9 43 0,033 0,044 0,000 2,542 1,803 0,734

14

9 50 0,030 0,031 0,000 0,020 1,971 0,741

15

1 70 0,066 0,028 0,000 1,652 1,659 0,867

16

0 20 0,008 0,023 0,008 0,308 2,632 1,463

17

1 63 0,068 0,040 0,000 2,037 2,128 1,554

18

21 51 0,037 0,035 0,000 2,659 1,936 1,002

19

0 0 0,0 00 0,095 0,000 na na na

20

0 0 0,000 0,037 0,000 na na na

21

0 23 0,026 0,086 0,003 0,182 4,554 3,083

22

4 71 0,110 0,044 0,000 3,265 1,643 1,341

23

12 65 0 ,051 0,025 0,002 1,356 0,888 0,387

24

6 58 0,038 0,027 0,000 2,374 2,016 0,809

25

5 52 0,044 0,040 0,000 2,651 2,546 1,108

na: no hubo análisis/medición

No. de planta

Acilación(%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

26

6 64 0,033 0,019 0,000 2,707 1,546 0,605

27

16 0 0, 000 0,041 0,000 na na na

28

16 13 0,007 0,050 0,000 0,249 3,359 1,459

29

12 7 0,007 0,095 0,000 na na na

30

15 9 0,00 7 0,069 0,000 na na na

31

15 8 0,007 0,081 0,000 na na na

32

7 7 0,007 0,094 0,000 na na na

33

13 10 0,006 0,055 0,000 na na na

34

14 46 0,078 0,090 0,002 na na na

35

7 8 0,007 0,078 0,000 na na na

36

3 48 0,045 0,039 0,010 3,050 2,304 1,326

37

2 39 0,029 0,046 0,000 na na na

38

1 55 0,073 0,059 0,000 1,608 2,138 1,015

39

1 33 0,030 0,063 0,000 na na na

40

2 59 0,050 0,035 3,651 2,727 1,076 2

41

17 15 0,011 0,061 0,000 na na na

42

0 0 0,000 0,048 0,002 na na na

4 3

3 17 0,009 0,046 0,000 na na na

44

40 32 0,027 0,058 0,000 na na na

45

2 0 0,000 0,031 0,000 na na na

46

2 0 0,000 0,038 0,000 na na na

47

1 8 0,004 0,048 0,000 na na na

48

19 57 0,046 0,034 0,000 2,626 2,165 0,900

49

10 59 0,047 0,032 0,000 1,737 1,901 1,054

50

2 70 0,057 0,024 0,000 1,545 0,880 0,694

na: no hubo análisis/medición

TABLA 15

No. de planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

51

4 10 0,006 0,056 0,000 na na na

52

16 12 0,006 0,039 0,002 na na na

53

34 84 0,156 0,030 0,000 5,100 1,056 0,511

54

32 89 0,131 0,017 0,000 3,907 0,803 0,431

55

29 89 0 ,098 0,013 0,000 3,687 0,453 0,226

56

21 83 0,083 0,017 0,000 2,679 0,817 0,431

57

14 8 0,007 0,082 0,000 na na na

58

9 44 0,034 0,041 0,002 2,258 2,054 0,672

59

7 51 0,040 0,038 0,000 2,246 2,151 0,765

60

0 7 0,008 0,111 0,000 na na na

No. de planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

61

1 48 0,069 0,073 0,000 1,558 1,730 0,565

62

13 0 0,000 0,036 0,000 na na na

63

16 14 0,005 0,029 0,000 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 17. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de Torenia a WKS116

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “WKS116” y se obtuvieron 282 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 33 de las 36 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 16 y 17). El contenido de delfinidina fue de un 80% como máximo (promedio: 73%). El color de la flor se alteró del 196d de la tabla de colores de la RHS (grupo verde grisáceo) al 186d (grupo púrpura grisáceo). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 16 TABLA 17

No. de Planta

Acilación (%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

1,8 78 0,015 0,004 0,746 0,753 0,507

2

12,7 78 0,097 0,028 1,826 2,352 1,572

3

5,9 78 0,030 0,009 1,000 1,452 0,934

4

0,0 76 0,030 0,010 0 ,813 0,990 0,480

5

2,6 72 0,038 0,015 1,279 1,835 0,832

6

0,0 72 0,019 0,007 0,839 0,983 0,642

7

3,1 75 0,033 0,011 1,131 1,476 0,877

8

1,9 75 0 ,028 0,009 0,761 0,977 0,466

9

2,6 76 0,034 0,011 na na na

10

2,7 73 0,031 0,011 na na na

11

4,4 77 0,033 0,010 1,001 1,003 0,618

12

7,0 74 0,035 0,012 0,849 0,945 0,577

13

9,3 74 0,025 0,009 na na na

14

3,2 80 0,044 0,011 1,045 0,959 0,545

15

4,5 75 0,031 0,010 1,115 1,256 0,729

16

10,5 71 0,028 0,012 1,055 1,155 0,670

17

1,7 51 0,016 0,016 0,330 1,537 1,052

18

10,5 77 0,112 0,033 2,008 2,976 2,216

19

0,0 0 0,000 0,010 na na na

20

0,0 30 0,007 0,015 na na na

21

na 56 0,013 0,010 0,197 1,960 1,463

22

4,4 47 0,006 0,007 na na na

23

3,6 77 0,026 0,008 na na na

na: no hubo análisis/medición

No. de Planta

Acilación(%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

24

7,2 82 0,028 0,006 1,295 1,272 0,805

25

3,5 83 0,035 0,007 na na na

26

17,4 26 0,009 0,025 na na na

27

39,3 91 0,101 0,010 3,499 0,563 0,178

28

28,2 85 0,047 0,005 na na na

29

0,0 0 0,000 0,025 na na na

30

10,4 89 0,092 0,012 na na na

31

1,9 0 0,000 0,036 na na na

32

5,8 76 0,027 0,009 na na na

33

16,8 88 0,066 0,009 na na na

34

10,5 87 0,103 0,015 na na na

35

13,7 38 0,021 0,034 na na na

36

18,3 95 0,051 0,003 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 18. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5 -aciltransferasa de Torenia a WKS124

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color anaranjado claro “WKS124” y se obtuvieron 0,50 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 13 de las 15 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 18). El contenido de delfinidina fue de un 95% como máximo (promedio: 82%). El color de la flor se alteró del 52d de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo) al 71c (grupo púrpura grisáceo). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 18

No. de Planta

Acilación(%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

0,6 0 0,000 0,013 0,069 na na na

2

35,5 75 0,256 0,051 0,034 0,066 0,093 1,190

3

43,0 78 0,385 0,068 0,041 0,039 0,046 1,197

4

44,2 85 0,811 0,120 0,028 0,106 0,094 1,021

5

na 86 0,907 0,123 0,024 0,219 0,066 0,852

6

4,6 0 0,000 0,023 0,075 na na na

7

7,9 90 1,498 0,169 0,008 0,905 0,143 0,679

8

8,4 90 1,403 0,146 0,008 0,971 0,145 0,827

9

26,7 88 0,521 0,066 0,003 0,623 0,108 0,853

10

21,9 89 0,504 0,058 0,003 0,636 0,098 0,727

11

26,0 85 0,928 0,145 0,019 0,424 0,152 0,455

12

3,8 95 1,017 0,058 0,000 1,161 0,140 0,262

13

11,6 84 0,939 0,156 0,025 0,748 0,128 0,262

14

38,5 69 0,166 0,071 0,007 0,000 0,059 0,776

15

27,1 55 0,137 0,040 0,074 0,000 0,021 2,330

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 19. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de Torenia a WKS132

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color rojo fuerte “WKS132” y se obtuvieron 24 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 6 de las 7 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 19). El contenido de delfinidina fue de un 43% como máximo (promedio: 12%). El color de la flor se alteró del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 66a (grupo rojo-púrpura). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 19

No. de Planta

Acilación(%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

1,8 0,4 0,008 1,872 0,009

2

1,0 0,0 0,000 1,409 0,010

3

21,3 11,4 0,237 1,841 0,007

4

6,8 42,5 0,461 0,619 0,006

5

7,6 9,5 0,204 1,936 0,011

6

na 0,016 1,3 1,227 0,007

7

23,7 5,4 0,081 1,407 0,005

Ejemplo 20. Transferencia del gen F3 y el gen antocianina 5-aciltransferasa de

′5′H (#40) del pensamiento 10 Torenia a WKS133

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-violeta oscuro “WKS133” y se obtuvieron 16 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en las ocho plantas cuyo pigmento se analizó (tabla 20). El contenido de delfinidina fue de un 34% como máximo (promedio: 11%). El color de la flor se alteró del 53a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo) al 61a (grupo rojo-púrpura). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo

15 violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 20

No. de Planta

Acilación (% ) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

10,3 23,7 1,322 4,253 0,009 0,004 0,691 0,792 0,133

2

11,8 33,8 1,192 2,324 0,005 0,003 0,621 0,422 0,093

3

6,1 12,9 0,009 0,060 0,000 0,000 0,102 0,500 0,048

4

3,8 9,1 0,363 3,627 0,005 0,008 na na na

5

15,8 2,0 0,078 3,774 0,009 0, 000 0,045 0,939 0,472

6

11,5 2,7 0,135 4,771 0,011 0,005 0,046 0,576 0,034

7

13,3 3,0 0,180 5,800 0,009 0,009 0,100 0,937 0,179

8

12, 2 3,5 0,161 4,470 0,009 0,009 0,068 0,738 0,148

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 21. Transferencia del gen F3 miento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de

′5′H (#40) del pensa Torenia a WKS137

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-violeta oscuro “WKS137” y se obtuvieron

20 20 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en las 17 plantas cuyo pigmento se analizó (tabla 21). El contenido de delfinidina fue de un 1,3% como máximo (promedio: 0,4%). No se observó ninguna alteración en el color de la flor con respecto al color 61b de la tabla de colores (grupo rojo-púrpura).

TABLA 21

No. de Planta

Acilación (% ) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

0,5 0,3 0,008 2,821 0,037 0,000 na na na

2

0,8 0,3 0,010 3,384 0,051 0,000 na na na

3

0,4 0,3 0,005 1,982 0,014 0,000 na na na

4

0,6 0,2 0,008 3,344 0 ,057 0,000 na na na

5

0,7 0,4 0,011 3,145 0,035 0,000 na na na

6

0,7 1,3 0,025 2,919 0,040 0,003 na na na

7

0,4 0,3 0,008 2,820 0,045 0,000 na na na

8

0,5 0,4 0,010 2,467 0,042 0,000 na na na

9

0,7 0,2 0,010 3,836 0 ,024 0,000 na na na

10

0,1 0,5 0,008 1,743 0,016 0,000 na na na

11

0,7 0,4 0,0 11 2,593 0,027 0,003 na na na

12

0,6 0, 3 0,007 2,393 0,022 0,000 0,048 3,026 2,812

13

1,4 0,2 0,009 3,756 0,065 0,000 na na na

14

0,7 0,4 0,008 2 ,149 0,024 0,001 na na na

15

0,8 0,5 0, 007 2,281 0,041 0,000 na na na

16

0,5 0 ,5 0,007 1,314 0,014 0,000 na na na

17

1,0 0,2 0,007 2,892 0,051 0,000 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 22. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de Torenia a WKS140

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “WKS140” y se obtuvieron 197 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 37 de las 45 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 22 y 23). El contenido de delfinidina fue de un 94% como máximo (promedio: 47%). El color de la flor se alteró del 186d de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) al 79d (grupo púrpura). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 22 TABLA 23

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

3,5 0,0 0,000 0,090 na na na

2

2,5 0,0 0,000 0,093 0,096 2,429 0,246

3

5,5 63,5 0,061 0,035 0,688 1,090 0,106

4

13,2 17,7 0,013 0,059 na na na

5

5,4 11,6 0,017 0,129 na na na

6

3,6 12,3 0, 011 0,078 na na na

7

13,6 11,7 0,009 0, 069 na na na

8

4,1 22,3 0,012 0,041 0,0 57 1,950 0,492

9

3, 3 0,0 0,000 0,071 na na na

10

2,6 18,6 0,017 0,076 na na na

11

4,2 18,6 0,012 0,052 0,130 3,101 1,172

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

12

6,5 25,0 0,026 0,079 0,251 2,300 0,592

13

1,3 0,0 0,000 0,0 62 0,000 2,200 0,552

14

22,7 85,4 0,261 0,045 1,649 0,943 0,126

15

20,9 57,4 0,093 0,069 0,481 1,418 0,182

16

16,4 39,9 0,052 0,078 n a na na

17

15,2 50,8 0,074 0,072 na na na

18

6,1 22,6 0,036 0,111 0,148 2,152 0,279

19

2,7 0,0 0, 000 0,033 na na na

20

9,1 52,6 0,041 0, 037 na na na

21

4,4 46,2 0,075 0,087 na na na

22

8,5 34,7 0,040 0,075 0,195 1, 847 0,394

23

11,0 3 0,9 0,018 0,040 0,155 1,106 0,142

24

13,4 46,8 0,056 0,063 na na na

25

2,8 5,1 0,006 0,107 na na na

na: no hubo análisis/medición

No. de Planta

Acilación(%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

26

4,1 6,8 0,00 7 0,098 na na na

27

31,4 93,4 0,252 0,0 18 1,434 0,361 0,052

28

13,4 86,7 0,101 0,016 1,237 1,740 0,499

29

32,3 94,2 0,200 0,012 0,862 0,131 0,029

30

13,0 89,7 0,176 0,020 0 ,553 0,289 0,026

31

12,3 87,1 0,150 0,022 1,007 0,674 0,135

32

6,7 9,9 0,009 0,086 na na na

33

11,5 67,4 0,108 0,052 na na na

34

5,0 11,2 0,014 0,110 0,074 2,588 0,659

35

12,5 79,7 0,088 0,022 1,192 1,185 0,574

36

15,0 83,4 0,065 0,013 1,478 1,147 0,570

37

1,8 0,0 0,000 0,068 na na na

38

1,3 44,3 0,105 0,132 0,582 3,259 1,232

39

2,5 73,6 0,114 0,041 na na na

40

14,0 85,3 0,165 0,028 1,881 1,035 0,180

41

0,5 4,3 0,006 0,144 na na na

42

9,9 53,3 0,040 0,035 0,373 1,038 0,164

43

33,5 87,4 0,275 0, 040 1,851 0,701 0,148

44

1,3 0,0 0,000 0,073 na na na

45

1 ,5 0,0 0,000 0,062 na na na

na: no hubo análisis/medición

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-púrpura oscuro “WKS77” y se obtuvieron 35 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en las 17 plantas cuyo pigmento se analizó (tabla 24). El contenido de delfinidina fue de un 57% como máximo (promedio: 33%). El color de la flor se alteró del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 71a (grupo rojo-púrpura). No obstante, no se logró ningún color del grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 24

Ejemplo 23. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de Torenia a WKS77

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

6,2 42,5 1,15 3 1,552 0,008 0,484 0,679 0,196

2

7,6 38,6 0,618 0,979 0,005 0,267 0,465 0,094

3

3,9 4 0,4 0,706 1,030 0,011 1,266 1,768 0,722

4

2,0 46,9 0,372 0,417 0,004 0,363 0,608 0,276

5

5,4 40,6 0,540 0,784 0,00 5 1,077 1,809 0,645

6

2,0 44,7 1,078 1,325 0,009 0,516 1,034 0,382

7

2,1 46,5 0,398 0, 453 0,005 0,353 0,792 0,569

8

5,8 39,7 0,647 0,980 0,005 0,425 0,706 0,183

9

4,7 40,0 0,844 1,268 0,000 0,310 0,76 4 0,199

10

7,6 39,7 1,345 2,033 0,009 0,350 0,635 0,119

11

14,1 2,9 0,068 2,274 0,013 na na na

12

12,8 6,9 0,126 1,688 0,009 na na na

13

12,7 4,2 0,109 2,468 0,012 0,060 1,541 0,366

14

20,9 13,0 0,704 2,669 0,00 0 0,407 2,502 0,694

15

19,3 43,5 1,011 1,308 0,007 0,357 0,843 0,276

16

19,6 6,1 0,092 1,414 0,010 0,120 1,740 0,4 77

17

22,8 56,6 1,0 68 0,814 0,004 0,604 0,503 0,126

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 24. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de 10 Torenia a WKS82

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “WKS82” y se obtuvieron 89 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en las 44 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 25 y 26). El contenido de delfinidina fue de un 91% como máximo (promedio: 49%). El color de la flor se alteró del 186d de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) al 80c (grupo púrpura-violeta). No obstante, no se logró ningún color del

15 grupo violeta, grupo violeta-azul o grupo azul de conformidad con la RHSCC y no se pudo obtener la rosa azul diana.

TABLA 25 TABLA 26 5

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

10,5 52,3 0,0 55 0,050 0,000 0,430 0,883 0,083

2

15,9 62,5 0,091 0,054 0,000 0,570 0,549 0,030

3

15,9 36,6 0,044 0,076 0,000 0,6 22 2,221 0,102

4

6, 8 40,0 0,023 0,034 0,000 0,247 0,986 0,172

5

15,0 82,9 0,087 0,018 0,000 5,451 0,403 0,042

6

na 89,7 0,072 0,008 0,000 0,853 0,163 0,062

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

7

9,5 89,5 0,101 0,012 0,000 0,719 0,144 0,0 19

8

14,7 11,4 0,01 2 0,090 0,000 na na na

9

11,6 29,3 0,02 4 0,059 0,000 na na na

10

8,7 15,2 0,01 0 0,053 0,000 na na na

11

7,9 59,0 0,04 6 0,032 0,000 0,580 0,619 0,022

12

8,5 55,6 0,060 0,048 0,000 1,318 1,615 0,165

13

13,9 42,3 0,026 0,035 0,000 0,6 03 1,094 0,052

14

1 0,1 10,3 0,008 0,073 0,000 na na na

15

10,6 18,8 0,018 0,079 0,000 na na na

16

9,3 11,7 0,009 0,066 0,000 na na na

17

14,3 76,2 0,112 0,035 0,000 3,741 1,587 0,377

18

12,7 76,7 0,101 0,031 0,000 1,608 0,656 0,075

19

9,8 71,7 0,057 0,022 0,000 1,403 0,455 0,04 1

20

5,3 14,1 0,011 0,068 0,000 0,132 2,999 0,720

21

3,5 18,5 0,008 0,035 0,000 na na< /td> na

22

7,7 23,1 0,017 0,055 0,000 0,141 0,929 0,034

23

5,4 19,0 0,015 0,065 0,000 0,297 4,128 1,350

na: no hubo análisis/medición

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

24

1,1 42,1 0,0 36 0,050 0,000 0,609 2,929 0,679

25

22,7 91,0 0,079 0,008 0,000 0,964 0,218 0,018

26

6,1 61,3 0,048 0,030 0,000 0, 490 0,468 0,029

27

8,7 91,3 0,097 0,009 0,000 2,053 0,339 0,123

28

9,4 59,9 0,060 0,040 0,000 1,537 1,631 0,422

29

5,5 51,2 0,040 0,0 38 0,000 0,688 0,723 0,038

30

5,1 61,4 0,056 0,032 0,003 0,637 0,537 0,087

31

7,0 53,3 0,037 0,032 0,000 0,706 1,0 32 0,051

32

5,7 58, 1 0,071 0,051 0,000 1,592 1,478 0,220

33

4,3 64,6 0,092 0,050 0,000 0,849 0,753 0,035

34

6,4 61,7 0,042 0,026 0,00 0 0,477 0,468 0,023

35

8,9 58,8 0,048 0,034 0,000 0,646 0,928 0,063

36

6,2 11,6 0,007 0,057 0,000 0,094 1,132 0,06 6

37

7,1 51,2 0,038 0,036 0,000 0,911 1,135 0,079

38

5,8 50,8 0,029 0,028 0,000 0,868 1,105 0,096

39

5,5 47,0 0,027 0,023 0,007 1,366 1,632 0,105

40

4,9 67,0 0,044 0,022 0,000 0,795 0,586 0,051

41

na 61,1 0,053 0,033 0, 000 1,310 1,466 0,259

No. de Planta

Acilación (%) Contenido de Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

42

9,6 71,0 0,074 0,030 0,000 0,460 0,337 0,023

43

1,2 27,6 0,009 0,024 0,000 na na na

44

5,2 13,8 0,013 0,078 0,000 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 25. Transferencia del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen antocianina 5-aciltransferasa de Torenia a WKS91

El plásmido pSPB130 (FIG. 7) se transfirió a la variedad de rosa de color anaranjado claro “WKS91” y se obtuvieron 10 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en solamente una de las dos plantas cuyo pigmento se analizó (tabla 27). El contenido de delfinidina fue de un 2% como máximo. No se observó ninguna alteración en el color de la flor con respecto al color 43c (grupo rojo) de la tabla de colores de la RHS.

TABLA 27

No. de Planta

Acilación(%) Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

0,7 0,0 0,000 0,090 0,307

2

0,0 1,8 0,006 0,040 0,295

Ejemplo 26. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR del lirio y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en Lavande

Se obtuvo el ARN de los pétalos de la flores cortadas del lirio azul y se preparó el poliA+ARN a partir de estos. Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del poliA+ARN con λZAPII (Stratagene) como vector, mediante el uso de un kit de preparación de biblioteca de ADNc (Stratagene) de conformidad con el protocolo recomendado del fabricante. El fragmento de gen DFR del lirio se preparó mediante el mismo procedimiento que se utilizó para obtener el fragmento de gen DFR de la genciana (Tanaka et al, Plant Cell Physiol, 37, 711-716 1996).

El fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 400 bp se recuperó con el gen Clean de conformidad con el protocolo recomendado del fabricante y se subclonó en el pCR-TOPO. La determinación de la secuencia de nucleótidos reveló una secuencia homóloga al gen DFR de la rosa. El fragmento de ADN se utilizó para el análisis de la biblioteca de ADNc del lirio y se obtuvo el ADNc del DFR del lirio que incluye la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Se determinó la secuencia total de nucleótidos del ADNc en el clon denominado pSPB906. La secuencia de nucleótidos se enumera como la SEQ ID NO: 9 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se enumera como la SEQ ID NO: 10.

A continuación, se ligó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,9 kb obtenido mediante la digestión del pSPB580 con BamHI y XhoI, con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb obtenido mediante la digestión del pSPB906 con BamHI y XhoI y el plásmido obtenido se denominó pSPB909.

Se preparó un vector para la transcripción del ARN bicatenario para el ADNc del DFR de la rosa en plantas de la siguiente forma. Un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb (que incluye el promotor Mac1, el ADNc del DFR de la rosa y el terminador mas) obtenido mediante la digestión parcial del pCGP1364 (Tanaka et al., Plant Cell Physiol, (1995) 36, 1023-1031) con PstI se insertó en el sitio PstI del pUC19 (Yanisch-Perron C et al., Gene 33:103-119, 1985) para obtener los plásmidos, entre los cuales un plásmido con el sitio HindIII del pUC19 cerca del promotor MacI se denominó pCGP1394.

A continuación, se ligó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,4 kb obtenido mediante la digestión del pCGP1394 con HindIII y SacII, con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,9 kb obtenido mediante la digestión del pCGP1394 con PstI, el corte de los extremos y la digestión adicional con SacII y con un fragmento de vector binario obtenido mediante la digestión del pBinPLUS con SacI, el corte de los extremos y la digestión adicional con HindIII, para obtener pSPB185. El plásmido pSPB185 se digirió con XbaI, se cortó y se ligó con un ligador SalI para obtener el pSPB521. Un fragmento de ADN de aproximadamente 700 bp obtenido mediante la digestión del pUE6 con HindIII y BamHI se ligó con un fragmento de ADN de vector binario obtenido mediante la digestión del pSPB521 con HindIII y SacI y con un fragmento del gen GUS obtenido mediante la digestión del pE2113 con BamHI y SacI, para obtener pSPB528.

El plásmido pSPB528 es un vector binario que tiene un gen estructural insertado entre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor que contiene potenciador y el terminador de manopina sintasa, que se expresa en plantas. Asimismo, para acortar la secuencia no traducida del extremo 5’ del ADNc del DFR de la rosa en pCGP645, el plásmido pCGP645 se digirió con SmaI y PvuI, se cortó y se volvió a ligar para obtener el pCGP645s.

La secuencia del extremo 5′ del ADNc del DFR de la rosa se obtuvo mediante amplificación por PCR con el uso del pCGP645s como plantilla y un cebador inverso y el′ cebador sintético RDF310 (5 -CCCTCGAGCCCTTGATGGCCTCGTCG-3′) (SEQ ID NO: 19) como cebadores y se clonó en el pCRTOPO. Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN y se confirmó la ausencia de errores mediante PCR. Este plásmido se denominó pSPB569. Asimismo, la secuencia del extremo 5′ del ADNc del DFR de la rosa con una longitud diferente se obtuvo por amplificación mediante el uso del pCGP645s como plantilla y un cebador inverso y el cebador sintético RDF830 (5′-GGGTCGACGCGGCCCTCTGCTTTCGG-3′) (SEQ ID NO: 20) como cebadores y se clonó en el pCRTOPO. Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN y se confirmó la ausencia de errores mediante PCR.

Este plásmido se denominó pSPB570. Se ligó un fragmento de ADN del vector binario obtenido mediante la digestión del pSPB528 con BamHI y SacI y un fragmento de ADN de aproximadamente 0,3 kb obtenido mediante la digestión del pSPB569 con Sacl y XhoI, con un fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pSPB570 con BamHI y SalI, para obtener el pSPB572. Este vector se diseñó para la transcripción del ARN bicatenario para el ADNc del DFR de la rosa en plantas.

El plásmido pUE6 se digirió con Sacl y se cortó y el ligador SalI se insertó para obtener el pUE8. Se introdujo un fragmento de ADN obtenido mediante la digestión del pUE8 con HindIII y EcoRI en los sitios HindIII y EcoRI del pBinPLUS para obtener el plásmido pSPB189. Se ligó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,7 kb obtenido mediante la digestión del pSPB189 con BamHI y SalI, con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb obtenido mediante la digestión completa del pCGP1961 con BamHI seguida por la digestión parcial con XhoI, para obtener el plásmido pSPB567. Después de la digestión del PacI y el tratamiento de desfosforilación del pSPB572, se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb obtenido mediante la digestión del pSPB567 con PacI y se seleccionó un plásmido con transcripción del gen nptII y el gen F3′5′H #40 del pensamiento en la misma dirección y se denominó pSPB905.

Después de la digestión del AscI y el tratamiento de desfosforilación del pSPB905, se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kb obtenido mediante la digestión del pSPB909 con AscI y se seleccionó un plásmido con transcripción del gen DFR del lirio en la misma dirección en la que se obtuvo el gen nptII y se denominó pSPB919 (FIG. 8). Se espera que este plásmido permita la transcripción del gen DFR del lirio y el gen F3′S′H #4 0 del pensamiento en la rosa, al tiempo que suprima la expresión del gen DFR de la rosa debido a la transcripción del ARN bicatenario. El plásmido se transfirió a Agrobacterium tumefaciens Ag10.

El plásmido pSPB919 (FIG. 8) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” y se obtuvieron 87 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 31 de las 38 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 28 y 29). El contenido de delfinidina fue de un 100% como máximo (promedio: 76%). El color de la flor se alteró del 186c de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) al 85a,b (grupo violeta).

Se extrajo el ARN de los pétalos de la rosa de la misma forma que se explicó anteriormente y después de separar el ARN mediante la electroforesis en gel de azarosa, se transfirió al Hybond N (Amersham) (por ejemplo, Tanaka et al., 1995). El ARNm se detectó mediante el uso de un kit DIG Northern Starter (Roche) con el protocolo recomendado del fabricante. El ARNm del DFR de la rosa se detectó mediante el uso del pCGP645 (Tanaka et al., Plant Cell Physiol. 36, 1023-1031, 1995) como plantilla y un cebador T7 de transcripción como sonda.

La detección del ARNm del pensamiento #40 se logró mediante el uso del pCGP1961 como plantilla y un cebador T7 de transcripción como sonda. La detección del ARNm del DFR del lirio se logró mediante el uso del pSPB906 como plantilla y un cebador T7 de transcripción como sonda. Se detectaron los genes F3′5′H #40 del pensamiento y DFR del lirio en las rosas con alteración de color. Por otra parte, el ARNm del DFR de la rosa se redujo de forma significativa en comparación con el huésped y se detectó una banda en la posición de bajo peso molecular, lo que indicó la descomposición del ARNm del DFR de la rosa.

TABLA 28 TABLA 29

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

0,0 0,000 0,1 05 0,036 0,856 0,038

2

0,0 0,000 0,125 na na na

3

0,0 0,00 0 0,091 0,023 0,851 0,101

4

0,0 0,000 0,116 0,000 1,336 0,087

5

0,0 0,000 0,048 na na na

6

88,5 0,086 0,011 1,626 1,187 0,411

7

90,8 0,089 0,009 0,797 1,548 0,087

8

84,0 0,046 0,009 0,163 0,6 99 0,016

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

9

87,8 0,0 62 0,009 0,193 0,760 0,022

10

89,3 0,072 0,009 0,210 0,575 0,033

11

91,5 0,049 0,005 0,398 0,805 0,050

12

91,5 0,032 0,003 0,100 0,811 0,014

13

85,7 0,040 0,007 0,092 0,497 0,012

14

64,9 0,040 0,021 0,263 0,327 0,015

15

88,3 0,041 0,005 na na na

16

66,4 0,011 0,006 0,036 1,221 0,030

17

79,7 0,008 0,002 0,030 0,765 0,009

18

100,0 0,010 0,000 0,048 1, 343 0,067

19

95,9 0 ,040 0,002 0,159 0,136 0,004

20

65,4 0,016 0,00 8 0,090 1,244 0,048

21

18,8 0,011 0,049 0,048 0,855 0,020

22

0,0 0,000 0,110 0,000 1,274 0,079

23

0,0 0,000 0,140 0,000 1,952 0,200

na: no hubo análisis/medición

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

24

41,4 0,102 0 ,144 0,265 0,417 0,015

25

34,3 0,042 0,081 0,16 7 0,429 0,024

26

34 ,6 0,023 0,043 na na na

27

41,4 0,082 0 ,116 0,232 0,385 0,019

28

37,7 0,046 0,076 0,25 4 0,429 0,018

29

36 ,1 0,032 0,057 0,151 0,235 0,042

30

97,2 0,052< /td> 0,002 0,208 0,088 0,004

31

93,0 0,038 0,003 0,347 0,137 0,007

32

98,2 0,101 0,002 0,339 0,258 0,029

33

91,3 0,039 0,004 na na na

34

91,9 0,041 0,004 0,332 0,120 0,007

35

96,8 0,052 0,002 na n a na

36

96,7 0,084< /td> 0,003 0,342 0,168 0,010

37

88,0 0,014 0,002 0,076 1,000 0,029

38

84,5 0,016 0,003 0,074 1,121 0,025

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 27. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamie nto y el gen DFR de Nierembergia y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en Lavande

El ARN se obtuvo a partir de los pétalos del cultivar Nierembergia hybrida, Fairy Bell Patio Light Blue (Suntory Flowers Co., Ltd,) y el poliA+ARN se preparó a partir de estos. Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del poliA+ARN con 5 λZAPII (Stratagene) como vector, mediante el uso de un íntesis sde biblioteca de ADNc (Stratagene) de

kit de

conformidad con el protocolo recomendado del fabricante. La biblioteca de ADNc se analizó mediante el uso del ADNc de DFR de la petunia marcado con DIG (del pCGP1405).

Las condiciones de análisis fueron de conformidad con el procedimiento de hibridación de placas mediante el uso de un sistema de marcado con DIG, de conformidad con el protocolo recomendado del fabricante. No obstante, la 10 concentración de formaldehído fue de un 30% para la prehibridación y las soluciones amortiguadoras de hibridación y la hibridación se llevó a cabo durante la noche a 37°C. La membrana se lavó a 55° C, en 5×SSC que contenía SDS al 1%. Los plásmidos se recuperaron de 20 placas entre las numerosas señales positivas y se determinaron sus secuencias de nucleótidos mediante el uso de un cebador inverso (Takara). Estos mostraron una alta homología con los genes DFR de otras plantas incluida la petunia. Se determinó la secuencia total de nucleótidos del ADNc en el clon denominado

15 pSPB709. La secuencia de nucleótidos se enumera como la SEQ ID NO: 11 y la secuencia de aminoácidos correspondiente se enumera como la SEQ ID NO: 12.

Un fragmento de ADN de aproximadamente 3,9 kb obtenido mediante la digestión del pSPB580 con BamHI y XhoI se ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb obtenido mediante la digestión del pSPB709 con BamHI y XhoI para obtener el plásmido pSPB910. Después de la digestión del AscI y el tratamiento de desfosforilación del pSPB910, se

20 ligó con un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kb obtenido mediante la digestión del pSPB910 con AscI y se obtuvo un plásmido con transcripción del gen DFR de Nierembergia en la misma dirección en la que se obtuvo el gen nptII que se denominó pSPB920 (FIG. 9). Se espera que este plásmido permita la transcripción del gen DFR de Nierembergia y el gen F3′S′H #40 del pensamiento en la rosa, al tiempo que suprima la expresión del gen DFR de la rosa debido a la transcripción del ARN bicatenario. El plásmido se transfirió a Agrobacterium tumefaciens Ag10.

25 El plásmido pSPB920 (FIG. 9) se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” y se obtuvieron 56 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 23 de las 24 plantas cuyo pigmento se analizó (tablas 30). El contenido de delfinidina fue de un 100% como máximo (promedio: 43%). El color de la flor se alteró del 186c de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) al 85b (grupo violeta).

TABLA 30

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

69,5 0,025 0, 002 0,081 2,265 0,066

2

85,4 0,024 0,004 0,114 1,355 0,032

3

71,8 0,006 0,002 0,043 0,781 0,027

4

100,0 0,012 0,000 0,414 0,283 0,030

5

88,2 0,015 0,002 0,506 0,126 0,030

6

100,0 0,013 0,000 0,430 0, 123 0,008

7

33,3 0, 019 0,038 na na na

8

37,3 0,012 0,020 n a na na

9

48,2 0,012 0,013 na na na

10

18,9 0,011 0,049 0,053 1,023 0,022

11

39,7 0,037 0,056 0,120 1,157 0,035

12

9,4 0,010 0,095 na na na

13

11,0 0,008 0,062 na na na

14

24 ,4 0,017 0,054 0,128 1,852 0,181

15

12,4 0,015 0,102 na na na

16

89,7 0,089 0,010 0,53 0 1,424 0,165

17

15 ,4 0,006 0,035 na na na

18

22,3 0,006 0 ,019 0,018 1,286 0,038

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

19

10,4 0,007 0,058 0,03 9 1,673 0,045

20

28 ,3 0,006 0,015 0,028 0,932 0,025

21

35,2 0,015 0,028 0,105 0,743 0,028

22

16,0 0,010 0,052 na na na

23

0, 0 0,000 0,018 0,013 1,764 0,027

24

13,7 0,007 0,042 0,033 1,469 0,041

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 28. Herencia de rasgos en la progenie

El cruzamiento se llevó a cabo mediante el uso de un transformante (LA/919-2-13) obtenido mediante la transferencia del pSPB919 (FIG. 8) a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” como progenitor de polen y la WKS77 o WKS133 no recombinante como progenitora madre (Suzuki, S,, “Bara, Hanazufu”, Shogakkann, p, 256-260, 1990). El fruto se

5 recolectó en el 100º día después de la polinización. La producción de semillas se logró en primer lugar mediante el pelado del fruto, la reducción del aquenio, el pelado del aquenio y después la extracción de la célula germinativa y su colocación en un papel de filtro humedecido en un plato. Para la producción de semillas se utilizó agua esterilizada que contenía 1 ml/l PPM™ (Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology, Inc.) y 50 mg/l kanamicina y las plántulas se cultivaron mediante el enmacetamiento únicamente de las plantas con brotes.

10 La acumulación de delfinidina se confirmó en las 40 progenies transformantes cuyo pigmento se analizó (tablas 31 y 32). El contenido de delfinidina fue de un 99% como máximo (promedio: 46%).

TABLA 31 TABLA 32

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g)

1

89,8 0,494 0,056 0,000 0,000

2

96,1 3,900 0,153 0,005 0,000

3

55,9 0,836 0,660 0,000 0,000

4

24,6 0,041 0,127 0,00 0 0,000

5

23,5 1,108 3,605 0,009 0,002

6

25,9 0,191 0,545 0,003 0,000

7

0,5 0,013 2,552 0,012 0,002

8

75,8 0,283 0,090 0,000 0,000

9

9 5,9 1,420 0,061 0,000 0,000

10

30,8 0,862 1,841 0,007 0,105

11

13,3 0,068 0,441 0,004 0,000

12

23,9 0,529 1,667 0,023 0,000

13

43,7 0,280 0,362 0,00 0 0,000

14

19,3 0,035 0,145 0,000 0,000

15

0,6 0,008 1,418 0,021 0,000

16

20,8 0,048 0,183 0,000 0,000

17

92,5 2,257 0,1 77 0,007 0,000

18

66,4 2,496 1,247 0,015 0 ,000

19

42,4 0,369 0,497 0,004 0,000

20

75,6 0,597 0,183 0,010 0,000

21

19,6 0 ,271 1,103 0,008 0,000

22

71,0 0,107 0,044 0,000 0,000

23

0,6 0,006 0,850 0,004 0,000

No. de Planta

Contenido Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) Peo (mg/g)

24

16,7 0,053 0,263 0,000 0,000

25

71,8 0,211 0,083 0,000 0,000

26

18,6 0, 177 0,769 0,003 0,000

27

1,3 0,009 0,652 0 ,004 0,000

28

59,7 0,183 0,124 0,000 0,000

29

39,6 0,124 0,187 0,003 0,000

30

21,4 0,187 0,684 0,003 0,000

31

0,6 0,005 0,763 0,004 0,000

32

38,8 0,226 0,353 0,003 0,000

33

50,5 0,154 0,151 0,000 0,000

34

28,0 0,267 0,682 0,00 3 0,000

35

83,9 0,204 0,039 0,000 0,000

36

64,9 0,380 0,205 0,000 0,000

37

78, 8 0,239 0,064 0,000 0,000

38

97,4 0,614 0, 016 0,000 0,000

39

98,7 0,805 0,011 0,000 0,000

40

54,9 0,083 0,068 0,000 0,000

Ejemplo 29. Expresión del gen F3

′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR del lirio y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en WKS140

El plásmido pSPB919 se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “WKS140” y se obtuvieron 89 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 74 de las 79 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 100% como máximo (promedio: 68%). El color de la flor se alteró del 186d de la tabla de colores de la RHS (grupo púrpura grisáceo) fundamentalmente al 84c (grupo violeta).

TABLA 33 na: no hubo análisis/medición

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

0,0% 0,0000 0 ,0423 0,0000

2

89,9% 0,0242 0,0027 na

3

90,0% 0,0245 0,0027 na

4

88,6% 0,0093 0,0012 na

5

43,5% 0,0042 0 ,0054 na

6

91,2% 0, 0118 0,0011 na

7

81 ,2% 0,0027 0,0006 na

8

81,0% 0,0173 0,0041 na

9

73,9% 0,0733 0,025 9 na

10

62,9% 0,032 1 0,0190 na

11

91,9 % 0,0962 0,0084 na

12

99,1% 0,1606 0,0015 na

13

94,7% 0,0588 0,003 3 na

14

100,0% 0,08 39 0,0000 na

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

15

0,0 % 0,0000 0,0005 na

16

98,4% 0,0296 0,0005 na

17

80,4% 0,1748 0,045 1 na

18

94,6% 0,019 0 0,0000 na

19

0,0% 0,0000 0,0714 na

2 0

34,3% 0,0099 0,0191 na

21

30,9% 0,0126 0,0282 na

22

65,6% 0,0294 0,0154 na

23

24,1% 0,0205 0,0646 na

Ejemplo 30. Expresión del gen F3

′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR del lirio y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en WKS77

El plásmido pSPB919 se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-púrpura oscuro “WKS77” y se obtuvieron 50 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 21 de las 23 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 81% como máximo (promedio: 19%). El color de la flor se alteró del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 77b (grupo púrpura).

TABLA 34

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

26,0% 1,2028 3,4033 0,0117

2

41,5% 0,6473 0,9093 0,0048

3

80,8% 0,2210 0,0526 na

4

68,0% 0,1865 0,0878 na

5

68,5% 0,2090 0,0951 0,0010

6

1,5% 0,0119 0,7731 0,0051

7

1,5% 0,0114 0,7304 0,0041

8

0,2% 0,0069 2,926 6 0,0063

9

0,2% 0,0 017 1,0791 0,0062

10

0,0% 0,0000 0,5013 0,0043

11

0,1% 0,0028 2,3418 0,0110

12

0,4% 0,0091 2,4603 0,0126

13

0,2% 0,0040 1,7766 0,0096

14

0,3% 0,0026 0,9046 0,0 052

15

0,0% 0,0000 1,6063 0,0100

16

22,2% 0,3279 1,1392 0,0049

17

24,0% 0,2638 0,8288 0,0052

18

1,4% 0,0240 1,67 77 0,0118

19

1,1% 0 ,0186 1,6352 0,0101

20

26,7% 0,2645 0,7230 0,0037

21

22,7% 0,2200 0,7460 0,0046

22

40,1% 0,89 29 1,3374 0,0071

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 31. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR de Nierembergia y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en WKS77

El plásmido pSPB920 se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-púrpura oscuro “WKS77” y se obtuvieron 30 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 26 de las 27 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 98% como máximo (promedio: 60%). El color de la flor se alteró del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 77b (grupo púrpura).

TABLA 35

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

93,9% 0,1679 0,0110 0,0000

2

97,6% 0,2311 0,0058 na

3

96,3% 0,1684 0,0065 na

4

97,1% 0,1012 0,0017 na

5

9,6% 0,0946 0 ,7810 0,1104

6

21,9% 0,1462 0,5166 0,0034

7

12,7% 0,1097 0,7495 0,0049

8

97,9% 0,1942 0,0042 na

9

98,1% 0,1228 0,0024 na

10

3,2% 0,0360 1,0689 0,0035

11

3,1% 0,0267 0,9587 0,0032

12

4,8% 0,1138 2,2 562 0,0049

13

6,2% 0,1066 1,5999 0,0080

14

96,5% 0,3541 0,0132 na

15

2,1% 0,0173 0,7852 0,0068

16

94,7% 0,2898 0,0160 0,0000

17

96, 7% 0,0819 0,0020 0,0000

18

95,8% 0,6969 0,0309 na

19

96,4% 0,4868 0,0181 na

20

64,3% 0,3092 0,1724 na

21

26,9% 0,2740 0,7431 0,0025

22

19,9% 0,3760 1,5028 0,0071

23

88,2% 0,0316 0,0042 na

24

94,2% 0,0259 0,0016 na

25

90,4% 0,0481 0,0051 na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 32. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y el gen DFR de la petunia y supresión del gen DFR endógeno de la rosa en WKS77

10 El plásmido pSPB921 se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-púrpura oscuro “WKS77” y se obtuvieron 15 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 12 de las 13 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 98% como máximo (promedio: 60%). El color de la flor se alteró del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 72b (grupo rojo-púrpura).

TABLA 36

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

90,0% 0,0549 0,0061 na

2

38,4% 0 ,3397 0,5402 0,0041

3

56,9% 0,7834 0,5824 0,0099

4

58,5% 0,0196 0,0139 na

5

90,3% 0,1336 0,0144 na

6

90,9% 0,1251 0,0126 na

7

86,7% 0,1771 0,0274 na

8

91,6% 0,0113 0,0010 na

9

97,5% 0,0864 0,0022 na

10

9,5% 0 ,2687 2,6591 0,0000

11

8,8% 0,1421 1,4598 0,0071

12

0,4% 0,0060 1,3554 0,0053

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 33. Herencia de rasgos en la progenie

El cruzamiento se llevó a cabo de la misma forma que en el ejemplo 28, mediante el uso del transformante (LA/919-4-10) obtenido mediante la transferencia del pSPB919 a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” como progenitor 5 de polen y a la variedad de rosa “Black Baccara” no recombinante como progenitora madre. El fruto se recolectó en el 100º día después de la polinización. La producción de semillas se logró en primer lugar mediante el pelado del fruto, la recolección del aquenio, el pelado del aquenio y luego la extracción de la célula germinativa y su colocación en un papel de filtro humedecido en un plato. El agua utilizada para la producción de semillas fue agua esterilizada que contenía 1 ml/l PPM™ (Plant Preservative Mixture, Plant Cell Technology, Inc.) y 50 mg/l kanamicina y las plántulas se cultivaron

10 mediante el enmacetamiento únicamente de las plantas con brotes.

La acumulación de delfinidina se confirmó en las 18 progenies transformantes cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 99,8% como máximo (promedio: 98,7%).

TABLA 37

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g)

1

97,8% 0,6633 0,0142 0,0009

2

99,0% 0,9002 0,0096 na

3

98,5% 0,5385 0,0080 na

4

99,5% 2,0561 0,0087 0,0016

5

99,8% 1,6556 0,0034 na

6

96,6% 0,5601 0,0200 na

7

99,0% 0,6148 0,0063 na

8

98,9% 1,6867 0,0193 na

9

95,0% 0,5740 0,0304 na

10

96,9% 0,1152 0,0036 na

11

99,3% 0,0683 0,0005 na

12

99,6% 0,1248 0,0005 na

13

99,5% 0,3574 0,0010 0,0000

14

99,6% 0,5500 0,0021 na

15

99,6% 1,2322 0,0049 na

16

99,7% 1,4384 0,0042 na

17

99,8% 0,5117 0,0010 na

18

98,3% 0,8073 0,0140 na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 34. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y supresión del gen F3′H endógeno de la rosa en

WKS77

El plásmido pSPB1106 (FIG. 10) se transfirió a la variedad de rosa de color rojo-púrpura oscuro “WKS77” y se obtuvieron 40 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en las 26 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido

5 de delfinidina fue de un 80,0% como máximo (promedio: 30,5%). El color de la flor experimentó una alteración significativa del 57a de la tabla de colores de la RHS (grupo rojo-púrpura) al 83d (grupo violeta).

TABLA 38

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

68,7% 0,5497 0,2275 0,0241 na na na

2

78,8% 0,3449 0,0830 0,0096 na na na

3

80,0% 0,6949 0,1604 0,0 144 na na na

4

71,2% 0,4377 0,1563 0,0214 na na na

5

72,7% 0,5260 0,1715 0,0266 0,3812 0,2275 1,7669

6

70 ,7% 0,3829 0,1449 0,0146 na na na

7

10,3% 0,0358 0,3031 0,0071 na n a na

8

15,6% 0,1847 0,9530 0,0444 na na na

9

4,8% 0,0739 1 ,4586 0,0149 na na na

10

1,1% 0,0114 1,0411 0,0144 na na na

11

54,0% 1,3206 1,1166 0,0 092 na na na

12

57,8% 0,8842 0,6410 0,0056 na na na

13

0,9 % 0,0242 2,5500 0,0168 na na na

14

23,0% 0,2087 0,6909 0,0062 na na na

15

12,7% 0,1645 1,1271 0,0058 na na na

16

26,4% 0,5275 1,4645 0,0132 na na na

17

18,7% 0,3555 1,5310 0,0109 na na na

18

24,2% 0,4388 1,3687 0,0072 na na na

19

64,7% 0,4029 0,1945 0,0249 0,6368 0,3949 2,0567

20

0,1% 0,0021 1,8646 0,0077 na na na

21

0,0% 0,0000 0,9708 0,0062 na na na

22

0,1% 0,0022 2,6049 0,0127 na na na

23

0,4% 0, 0066 1,8002 0,0066 na na na

24

0,5% 0,0079 1,4670 0,0056 0,0000 1,3096 0,2414

25

17,3% 0,1000 0,4671 0,0099 na na na

26

18,3% 0,1232 0,5418 0,0052 na na na

na: no hubo análisis/medición

Ejemplo 35. Expresión del gen F3′5′H (#40) del pensamiento y supresión del gen F3′H endógeno de la rosa en Lavande

El plásmido pSPB1106 se transfirió a la variedad de rosa de color violeta claro “Lavande” y se obtuvieron 40 transformantes. La acumulación de delfinidina se confirmó en 23 de las 25 plantas cuyo pigmento se analizó. El contenido de delfinidina fue de un 98,3% como máximo (promedio: 46,9%).

TABLA 39

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

1

76,8% 0,0732 0,0188 0,0032 0,5705 0,1595 0,3073

2

80,1% 0,1441 0,0296 0,0061 0,5298 0,1881 4,3294

3

3,7% 0,0086 0,2174 0,0027 na na na

4

4,4% 0,0079 0,1691 0,0034 na na na

5

8,8% 0,0158 0,1557 0,0070 na na na

6

39,0% 0,0212 0,0128 0,0204 0,0000 0,0363 1,3107

7

44,4% 0,0089 0,0027 0,0084 0,0756 0,0573 1,3689

8

40,4% 0,0165 0,0071 0,0172 0,0365 0,0592 2,5211

9

42,0% 0,0087 0,0036 0,0084 0,0752 0,0596 1,2661

10

13,5% 0,0153 0,0939 0,0040 0,1288 1,0594 0,5440

11

81,6% 0,2252 0,0447 0,0061 0,3947 0,1401 0,3947

12

78,8% 0,1022 0,0239 0,0036 0,6700 0,2137 0,5847

13

81,7% 0,2125 0,0438 0,0036 1,3616 0,4621 0,7478

14

80,9% 0,1829 0,0388 0,0044 0,4100 0,2405 0,0567

15

70,9% 0,0664 0,0204 0,0069 0,4230 0,1221 0,1788

16

0,0% 0,0000 0,0844 0,0000 na na na

17

98,0% 0,2363 0,0048 0,0000 0,0000 1,0613 0,2698

18

98,3% 0,1398 0,0025 0,0000 0,0479 0,7060 0,1299

No. de Planta

Del (%) Del (mg/g) Cia (mg/g) Pel (mg/g) M (mg/g) Q (mg/g) K (mg/g)

19

4,2% 0,0078 0,1724 0,0040 0,0000 0,8627 0,2075

20

0,0% 0 ,0000 0,1696 0,0043 na na na

21

60,0% 0,0333 0,0115 0,0107 0,0000 0,0740 1,8678

22

14,3% 0,0091 0,0454 0,0088 0,1096 0,530 5 0,6453

23

15,1% 0 ,0082 0,0408 0,0053 na na na

24

17,6% 0,0082 0,0324 0,0059 na na na

25

24,4% 0,0147 0, 0375 0,0080 0,0000 0,2147 0, 9765

na: no hubo análisis/medición

Estos resultados demuestran que el gen exógeno transferido se heredó y expresó en la progenie y que el rasgo de la producción de delfinidina que no se encuentra en los pétalos de rosas comunes se expresó con éxito en la progenie de rosa. Por tanto, este gen puede utilizarse para el cultivo por cruzamiento de rosas con alteración en su color para crear rosas con nuevos colores, incluidos el azul y el púrpura.

5 Aplicabilidad industrial

Mediante la supresión artificial de la función de la vía metabólica endógena como, por ejemplo, la expresión de la dihidroflavonol reductasa, en la rosa, y la expresión del gen que codifica la flavonoide 3′,5′ -hidroxilasa del pensamiento y el gen que codifica la dihidroflavonol reductasa de especies diferentes a la rosa, es posible crear rosas de color azul a violeta. Estos genes son heredados por las generaciones posteriores y el rasgo de la rosa azul puede utilizarse para el

10 cruzamiento.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir una rosa caracterizado por la supresión artificial de la ruta de síntesis flavonoide de la rosa y la expresión del gen del pensamiento que codifica la flavonoide 3',5'-hidroxilasa que presenta la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEQ ID No 1 ó 3, donde la vía de síntesis flavonoide de la rosa

   5 se suprime mediante

   (i)

   la supresión artificial de la expresión de la dihidroflavonol reductasa endógena de la rosa; o

   (ii)

   la supresión artificial de la expresión de la flavonoide 3'-hidroxilasa endógena de la rosa.

2. 2. Un procedimiento para producir una rosa de conformidad con la reivindicación I (i), que comprende además la expresión del gen que codifica la dihidroflavonol reductasa derivada de una planta que no sea la rosa.

   10 3. Un procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, donde la planta que no es la rosa es el lirio, la Nierembergia

   o la petunia.
3. 4. Una rosa obtenida mediante el procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o su progenie o tejido que tiene las mismas propiedades que la rosa.
4. 5. Una rosa obtenida mediante el procedimiento de producción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 3 o su progenie o tejido que tiene las mismas propiedades que la rosa, donde el color de los pétalos de la rosa es violeta.

5. 6.

   Una rosa de conformidad con la reivindicación 5 o su progenie o tejido que tiene las mismas propiedades que la rosa, donde el color de los pétalos de la rosa pertenece al “grupo violeta” de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC).

6. 7.

   Una rosa de conformidad con la reivindicación 6 o su progenie o tejido que tiene las mismas propiedades que la rosa,

   20 donde el color de los pétalos de la rosa pertenece al “grupo violeta” 8Sa u 85b de conformidad con la tabla de colores de la Real Sociedad de Horticultura (RHSCC).