ES2365261T3 - Flavenoide metiltransferasa a partir de la torenia y sus usos. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT), en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende: (i) una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:11; (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:11; (iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con SEQ ID NO:11 o su forma complementaria; (iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12; (v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:12; (vi) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con la secuencia de nucleótidos en (iv) o (v) o su forma complementaria.

Description

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

�� La presente invención se refiere a una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de metiltransferasa y el uso de la secuencia genética y/o el polipéptido para modificar una o más características fenotípicas de una planta. La metiltransferasa de la presente invención actúa sobre los flavonoides, preferiblemente cuando el flavonoide es una antocianina. Más particularmente, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad s-adenosil-l-metionina: antocianina 3’ -o-metiltransferasa o s-adenosil-l-metionina: antocianina 3’, 5’-o-

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metiltransferasa. La presente invención se refiere aún más a una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad de metiltransferasa, derivada de torenia. Las moléculas antisentido y sentido correspondientes a toda o parte de la secuencia genética sujeto, se describen así como plantas genéticamente modificadas así como flores cortadas, partes, extractos y tejido reproductivo de dichas plantas.

Descripción de la técnica anterior

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Los detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas por el autor en esta especificación se recolectan en el final de la descripción.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debe ser tomada como, una aceptación o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

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La industria de las flores o las plantas ornamentales se esfuerza por desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una forma efectiva de crear dichas variedades novedosas es a través de la manipulación del color de la flor. Las técnicas clásicas de reproducción han sido utilizadas con cierto éxito para producir un amplio rango de colores para la mayoría de las variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles en la actualidad. Este enfoque ha sido limitado, sin embargo, por las limitaciones de la reserva genética de una especie particular y por esta razón, es

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raro que una única especie tenga el espectro completo de variedades de color. Por ejemplo, el desarrollo de novedosas variedades de color de las plantas o partes de las plantas tales como flores, hojas y tallos debería ofrecer una oportunidad significante en ambos los mercados de flores de corte y ornamentales. En la industria de flores o plantas ornamentales, el desarrollo de novedosas variedades de color de las principales especies de flores tales como rosas, crisantemos, tulipanes, lirios, claveles, gérberas, orquídeas, lisianthus, begonias, torenia, geranios, petunias,

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nierembergia, pelargonium, impatiens y ciclamino sería de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa o gérbera azul para el mercado de la flor de corte.

Además, el desarrollo de novedosas variedades de color de partes de plantas tales como vegetales, frutas y semillas debería ofrecer significantes oportunidades en la agricultura. Por ejemplo, novedosas semillas de color deberían ser útiles como etiquetas de propiedad para las plantas. Adicionalmente, las modificaciones a los flavonoides comunes a

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las bayas incluyendo uvas y sus jugos incluyendo el vino, tienen el potencial para impartir características de estilo alterado de valor a dicha fruta y la industria de subproductos.

El color de la flor se debe predominantemente a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y aportan un rango de colores de amarillo a rojo a azul. Las moléculas de flavonoides que hacen la mayor contribución al color de la flor son las antocianinas, que son derivados glucosilados de

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la cianidina y su derivado metilado peonidina, delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas se localizan en la vacuola de las células epidérmicas de los pétalos o vacuola de células sub-epidérmicas de las hojas.

Los pigmentos de flavonoides son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética de los pigmentos de flavonoides (ruta flavonoide) se establece bien, (Holton and Cornish, Planta Cell 7: 1071-1083;. 1995; Mol et al., Trends Planta Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Planta Physiol. 126: 485-493, 2001 a) y Winkel-Shirley, Planta Physiol. 127: 1399-1404, 2001 b) y se muestran en las Figuras 1A y B. Tres reacciones y enzimas se involucran en la conversión de la fenilalanina a p-coumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en las rutas flavonoides. Las enzimas son fenilalanina amonio- liasa (PAL), cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4-coumarato: CoA ligasa (4CL). La

�� primera etapa comprometida en la ruta involucra la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionada por la acción de la acetil CoA carboxilasa (ACC) sobre la acetil CoA y CO2) con una molécula de p-coumaroil-CoA. Esta reacción se cataliza por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta reacción, 2’,4,4’,6’, tetrahidroxichalcona, normalmente se isomeriza rápidamente por la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI) para producir la naringenina. La naringenina posteriormente se hidroxila en la posición 3 del anillo central por la flavanona 3-hidroxilasa

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(F3H) para producir dihidrocampferol (DHK).

El anillo-B de DHK puede ser hidroxilado, ya sea, en la posición 3’, o ambas posiciones 3’ y 5’, para producir la dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina (DHM), respectivamente. El patrón de hidroxilación del anillo-B juega un papel clave en la determinación del color del pétalo, con DHK por lo general conduce a la producción de los pigmentos basados en pelargonidina rojo ladrillo, DHQ por lo general conduce a los pigmentos basados en cianidina rosa/rojo y

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DHM por lo general conduce a los pigmentos basados en delfinidina azul/violeta.

Los dihidroflavonoles (DHK, DHQ y DHM) también pueden actuar por flavonol sintasa para producir los flavonoles campferol, quercetina y miricetina. Los flavonoles son incoloros pero actúan como copigmentos con las antocianinas para realzar el color de la flor.

La siguiente etapa en la ruta, conduce a la producción de las antocianinas de color a partir de los dihidroflavonoles,

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involucra el dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) con la producción de las leucoantocianidinas. Estas moléculas de flavonoides son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y la glicosilación en la posición-3, a través de la acción de glicosiltransferasas, estabiliza la molécula antocianidina permitiendo así la acumulación de las antocianinas. En general, las glicosiltransferasas transfieren las fracciones de azúcar a partir de azúcares UDP y muestran altas especificidades para la posición de la glicosilación y relativamente bajas especificidades para los sustratos aceptor

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(Seitz and Hinderer, Anthocyanins. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. and Vasil, I.K. (eds.), Academic Press, New York, USA, 5: 49-76, 1988). Las antocianinas pueden ocurrir como 3-monosidos, 3biosidos y 3-triosidos así como 3, 5-diglicósidos y 3, 7-diglicósidos asociados con los azúcares glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y xilosa (Strack and Wray, In: The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harbome, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22,1993).

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Las glicosiltransferasas implicadas en la estabilización de la molécula antocianidina incluyen UDP glucosa: flavonoide 3-glucosiltransferasa (3GT), que transfiere una fracción glucosa de la UDP glucosa con la 3-O-posición de la molécula antocianidina para producir el antocianidina 3-O-glucósido.

En las petunias y pensamientos (entre otros), estas antocianinas luego se pueden glicosilar por otra glicosiltransferasa, UDP ramnosa: antocianidina 3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT), cuyos ácidos un grupo ramnosa con la glucosa-O

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3-unida de la molécula de antocianina para producir la antocianidina 3-rutinosidos, y una vez acilado, se puede además modificar por la UDP: glucosa antocianina 5 glucosiltransferasa (5GT).

Muchos glucósidos de la antocianidina existen en la forma de derivados poliacetilados. La acilación puede ser importante para la reabsorción de antocianinas en las vacuolas como fue demostrado por Hopp and Seitz (Planta 170: 74-85, 1987). Los grupos acil que modifican los glucósidos de la antocianidina pueden ser divididos en dos principales

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clases basándose en su estructura. Los grupos acil alifáticos incluyen ácido malónico o ácido succínico y la clase aromática incluye los ácidos hidroxil cinámicos tales como ácido p-coumárico, ácido cafeico y ácido ferúlico y los ácidos benzoicos tales como el ácido p-hidroxibenzoico.

La acilación de los antocianidina 3-rutinosidos con ya sea el ácido p-coumárico o el ácido cafeico (Griesbach et al., Phytochemistry 30: 1729-1731, 1991) ocurre en Petunia hybrida. En otros sistemas de plantas, la acilación de

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flavonoides por los ácidos alifáticos, tales como ácido malónico, ácido succínico y ácido acético también ocurre (Goto, Tetrahedron 27: 2413-2416, 1987; Stafford, Flavonoid Metabolism. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida, USA, 1990).

La metilación en las posiciones 3’ y 3’, 5’ del anillo-B de antocianidina 3-(p-coumaroil) rutinósido-5-glucósidos ocurre en la petunia. Se ha demostrado en extracto libre de células de brotes de flores de P. hybrida que la S-adenosil-Lmetionina es el donante de metilo y la O-metiltransferasa actúa sobre el antocianidina 3(p-coumaroil) rutinósido-5glucósido. Bajo las condiciones utilizadas, ninguna actividad de metilación fue detectada cuando las antocianidinas,

�� antocianidina 3-glucósidos, antocianidina 3-rutinosidos, ácido cafeico o ácido p-coumárico fueron utilizados como sustratos (Jonsson et al., Phytochemistry 21 (10): 2457-2460, 1982).

La metilación del anillo B de las antocianinas se controla por los locus Mt1, Mt2, Mf1 y Mf2 en petunia (Jonsson et al., Theor. Appl. Genet. 68: 459-466, 1984b). Las cuatro enzimas pensadas para ser codificadas por cada gen se han descrito. Ellas catalizan ambas 3’ y 5’ O-metilación del anillo B. La actividad de la metilación 3’5’ es más pronunciada

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con las enzimas codificadas Mf1 y Mf2 (Jonsson et a/., 1984b, supra).

Los locus Mt fueron pensados para codificar la S-adenosil-L-metionina:antocianina 3’ -O-metiltransferasa (3’FMT) y el locus Mf para codificar la actividad S-adenosil-L-metionina:antocianina 3’, 5’-O- metiltransferasa (3’5’FMT) y que las enzimas solo metilan la antocianina 3-(p-coumaroil) rutinósido-5-glucósido. (Jonsson et al., 1982 supra; Jonsson et al., Planta 160: 174-179, 1984a; Jonsson et al., 1984b, supra). Se pensó originalmente que los genes Mf1 y Mf2 solo se

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podrían expresar si al menos uno de los genes Mt1 o Mt2 se representa por su alelo dominante. Sin embargo, desde entonces estudios bioquímicos han contradicho estos hallazgos, demostrando que ambas enzimas fueron capaces de metilar los delfinidina 3-(p-coumaroil)-rutinósido-5-glucósidos con el pigmento de malvidina correspondiente en ensayos in vitro (Jonsson et al., Theor. Appl. Genet. 66: 349-355, 1983). Adicionalmente, se pensó que la acción de Mf1 y Mf2 se restringe a los miembros de la corola (Wiering, Hort. Genen. Phaenen. 17: 117-134, 1974).

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La presencia de pigmentos de antocianina metilados han sido reportados en Petunia sp..(Sink (ed), Petunia, Springer-Verlag, Berlin, 1984; Ando et al., Biochemical systematics and ecology, 27: 623-650, 1999), Plumbago sp. (inter alia, Harborne, Phytochemistry, 6: 1415-1428, 1967; Harbome, Arch Biochem Biophys, 96: 171-178, 1962), Vitis sp. (Cachio et al., American J of Ecology and Viticulture, 43: 244-248, 1992), Babiana stricta (Toki et al., Phytochemistry, 37: 885887, 1994), Pinus sp. (Andersen, Biochemical systematics and ecology, 20: 145-148, 1992), Picea sp., Larix, sp.,

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Phaseolus sp. (Hungria et al., Planta Physiology, 97: 751-758, 1991; Takeoka et al., Journal de Agricultural and Food Chemistry, 45: 3395-3400, 1997), Solanum sp. (Lewis et al., J. of the Science of Food and Agriculture, 77: 45-57, 1998) , Vaccinium sp. (Ballington et al., Can. J. of Planta Sci., 68: 241-246, 1988; Skrede et al., J of Food Science, 65: 357364, 2000), Cyclamen sp. (Webby and Boase, Phytochemistry, 52: 939-941, 1999), Iris sp. (Yabuya et al., Euphytica,

98: 163-167, 1997; Yabuya and Noda, Euphytica, 103: 325-328, 1998), Pelargonium sp. (Mitchell et al., Phytochemistry,

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47: 355-361, 1998; Kobayashi et al., Breeding Science, 48: 169-176, 1998), Geranium sp. (Andersen, et al., Pytochemistry, 38: 153-1517, 1995), Pisum sp. (Crowden, Phytochemistry, 21: 2989-2990, 1982), Lathyrus sp. (Rat’kin et al., Zh Obshch Biol, 41: 685-699, 1980), Clitorai sp (Srivastava and Pande, Planta Med, 32: 138-140, 1977)., Catharanthus sp. (Carew and Krueger, Phytochemistry, 15: 442, 1976), Malvia sp. (Takeda et al., Phytochemistry, 28: 499-500, 1989), Mucuna sp. (Ishikura and Shibata, Bot Mag (Tokyo), 86: 1-4, 1973), Vicia sp. (Catalano et al., J.

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Agricultural and Food Chemistry, 49: 4568-4570; 1998; Nozzolillo et al., Canadian Journal of Botany, 67: 1600-1604, 1989), Saintpaulia sp:(Griesbach, Phytochemistry, 48: 829-830, 1998), Lagerstroemia sp. (Toki and Katsuyama J. Jap Soc Hortic. Sci., 63:853-861, 1995), Tibouchina sp. (Francis et al., JAm Soc Hortic.Sci, 107: 789-791, 1982, Terahara et al., J. Natural Productos, 56: 335-340, 1993), Hypocalyptus sp. (Van Wyk et al., Biochemical systematics and ecology,

23: 295-297, 1995), Rhododendron sp., Linum sp., Macroptilium sp. (Imrie and Hutton, J. Hered., 69: 5.4-56 1978),

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Hibiscus sp. (Kim et al., Phytochemistry, 28: 1503-1506, 1989; Kim and Fujieda, J. Kor. Soc. Hortic. Sci., 32: 247-255, 1991), Hydrangea sp. (Takeda et al., Phytochemistry, 29: 1089-1091, 1990), Ipomoea sp. (Saito et al., Phytochemistry 41:1,607-1611, 1996), Cymbidium sp. (Woltering and Somhorst; J. Planta Physiol., 136: 295-299, 1990), Millettia sp. (Parvez and Ogbeide, Phytochemistry, 29: 2043-2044, 1990), Hedysarum sp. (Chriki and Harborne, Phytochemistry, 22:2322-2323, 1983; Chriki, Agronomie, 10: 553-540, 1990), Lespedeza sp., Antigonon sp. (Tiwari and Minocha,

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Vijnana Parishad Anusandhan Patrika, 23: 305-308, 1980) y Pisum sp. (Crowden, Phytochemistry, 21: 2989-2990, 1982).

Esta lista describe las especies de que pigmentos de antocianina metilados han sido reportados. Sin embargo, se espera que estos pigmentos estén presentes en muchas otras especies.

Las O-metiltransferasas dependientes de S-adenosil-L-metionina (SAM-OMTs) de las plantas son enzimas claves en

��� las rutas metabólicas tales como síntesis de fenilpropanoide y flavonoide. Estas enzimas facilitan la transferencia del

grupo metilo de S-adenosil-L -metionina (SAM) al grupo hidroxilo de una molécula aceptor con la formación de su derivado metil éter y S-adenosil-L-homocisteina como productos. Los mecanismos químicos de las reacciones de transferencia del metilo son idénticos. Sin embargo, SAM-OMTs difieren en su selectividad con respecto a la estereoquímica de la molécula aceptor del metilo, así como el patrón de sustitución de sus grupos hidroxi fenólicos. La

�� metilación de diferentes sustratos es por lo general catalizado por diferentes SAM-OMTs. Sin embargo, algunas enzimas tienen un amplio rango de sustrato aunque por lo general tendrán una preferencia de un sustrato específico o grupo de compuestos.

En la actualidad, existen más de 87 secuencias derivadas de plantas codificantes de SAM-OMTs en la base de datos GenBank. De manera práctica todas estas secuencias contienen tres motivos consenso altamente conservados

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(motivos A, B y C) mostrando una configuración espacial específica (Joshi and Chiang, Planta Mol. Biol. 37: 663-674, 1998; Ibrahim and Muzac, In Recent advances of phytochemistry. Evolution of metabolic pathways. Elsevier Science Ltd. 34: 349- 385, 2000). Dado que estos motivos están presentes en la mayoría de SAM-OMTs de plantas independientemente de la especificidad de sustrato, se cree que son esenciales para el enlace de SAM.

Considerando la longitud de la proteína codificada y las relaciones espaciales entre los motivos A y B y los motivos B y

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C, las SAM-OMTs de plantas se pueden agrupar en dos diferentes clases. El grupo I contiene todas las CCoAOMTs (cafeoil-CoA SAM-OMTs) y muestra una configuración espacial específica de 19 Aminoácidos entre los motivos A y B, y 24 aminoácidos entre los motivos B y C. El grupo II contiene proteínas con una distancia de 52 residuos entre los motivos A y B y 30 residuos entre B y C. El grupo II de SAM-OMTs incluye COMTs ( OMTs del ácido cafeico), F3’OMT (flavonoide 3’-OMT) (Gauthier et al., Planta Mol. Biol. 32: 1163-1169, 1996), IOMTs (OMTs de isoflavona) (He and

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Dixon, Plant Mol. Biol. 36: 43-54, 1998), 2’OMTs (isoliquiritigenina 2’-OMT) (Maxwell, Plant J. 4(6): 971-981, 1993), IMT (inositol OMT) (Rammesmeyer et al., Arch. Biochem. Biophys. 322(1): 183-188, 1995), y F7OMT (flavonoide 7-OMT) (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 36: 219-227, 1998), entre otros. Es importante señalar en este punto que aquellas enzimas para las cuales el análisis del sustrato se ha realizado y para los cuales la función ha sido asignada por lo general se prueban con un rango limitado de sustratos. Las secuencias de flavonoide SAM-OMT, que se han aislado

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hasta la fecha todas se han implicado en respuestas de defensa, con ninguna de ellas que mostrara tener actividad sobre las antocianinas y pertenecer al Grupo II de SAM-OMTs.

Las proteínas de CCoAOMT, o Grupo I de SAM-OMTs, varían de longitud entre 231-248 aminoácidos y por lo general necesitan cationes divalentes, tales como Mg2+, para la actividad catalítica. El grupo II de SAM-OMTs por lo general tienen alrededor de 344-383 aminoácidos de longitud y no necesitan cationes divalentes. Los dos grupos comparten

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aproximadamente 20- 30 % de identidad de aminoácidos.

Además de las modificaciones anteriores, el pH y la copigmentación con otros flavonoides tales como flavonoles y flavones pueden afectar el color del pétalo. Los flavonoles y flavones también pueden ser aromáticamente acilados (Brouillard and Dangles, In:The Flavonoids - Advances in Research since 1986. Harbome, J.B. (ed), Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993).

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La capacidad de controlar la actividad de flavonoide metiltransferasas (de ahora en adelante denominados como "FMT") específicamente las antocianinas metiltransferasas proporcionarían un medio de manipulación del color del pétalo, permitiendo de tal modo que una sola especie exprese un amplio espectro de colores de la flor. Tal control puede ser mediante la modulación del nivel de producción de una enzima indígena o por la introducción de una enzima no-indígena.

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RESUMEN DE LA INVENCIÓN

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto necesite otra cosa, la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento indicado o número entero o grupos de elementos o números enteros pero no la exclusión de ningún otro elemento o número entero o grupo de elementos o números enteros.

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Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos se denominan por el número identificador de la secuencia (SEQ ID NO:). Los SEQ ID NOs: corresponden numéricamente a los identificadores de la secuencia <400>1 (SEQ ID NO:1),

<400>2 (SEQ ID NO:2), etc. Un resumen de los identificadores de la secuencia se proporciona en la Tabla 1. Una lista de las secuencias se proporciona después de las reivindicaciones.

Se ha determinado que los pigmentos basados en la malvidina parecen "más azules" que los pigmentos basados en la delfinidina en el mismo fondo de pétalos. Una clase de metiltransferasas que actúa sobre los flavonoides y en particular

�� las antocianinas se han aislado y sorprendentemente se encontró que pertenecen al grupo SAM-OMT de Clase I, en lugar de la SAM-OMT de Clase II, como puede haber sido pronosticado de la literatura. "Estas son las que se denominan en este documento como flavonoide metiltransferasas (FMT o FMTs). Ejemplos de estas novedosas metiltransferasas incluyen, pero no se limitan a, 3’ FMT y 3’5’ FMT. Estas novedosas FMTs se pueden derivar de muchas especies, por ejemplo, Petunia sp., Torenia sp. Plumbago sp. y Fuchsia sp.

���

Las moléculas del ácido nucleico aisladas que codifican las FMTs descritas en este documento se proponen por ser útiles en la manipulación del color de las plantas o partes de las plantas tales como flores, frutas, nueces, raíces, tallos, hojas y semillas. La modificación genética de las plantas con las moléculas del ácido nucleico descritas en este documento además permite plantas alteradas, en donde los extractos de estas son útiles como aditivos aromatizantes

o de alimentos o productos para la salud incluyendo productos de bebidas o jugos. Estas bebidas incluyen pero no se

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limitan a vinos, licores, té, café, leche y productos lácteos.

Las moléculas de ácido nucleico a partir de la Petunia (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 26), Torenia (SEQ ID NO:11) y Fuchsia (SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 43) han sido identificadas y se revelan. Las secuencias de aminoácidos correspondientes se representan por SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7 (todas de Petunia), SEQ ID NO: 12 (Torenia) y SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44 (ambas de Fuchsia).

���

Un resumen de los identificadores de las secuencias utilizadas, en toda la especificación se proporciona en la Tabla 1.

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT), en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO: 11;

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(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:11;

(iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones muy rigurosas a la SEQ ID NO:11 o su forma complementaria;

(iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12,

���

(v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO: 12;

(vi)

una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor a la secuencia de nucleótidos en

(iv)

o (v) o su forma complementaria.

Además, una construcción genética y una planta modificada genéticamente o parte de esta o células de la misma que

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comprende un ácido nucleico de la invención forma otro aspecto de la invención. Las flores cortadas o separadas de la planta modificada genéticamente de la invención o progenie, la descendencia de progenie o las líneas propagadas de manera vegetativa que comprenden una molécula de ácido nucleico no-indígena de la invención también se proporcionan.

���

FMT indígena, reducida o existente, dicho método que comprende:

Un método para producir una planta modificada genéticamente capaz de sintetizar una FMT, o con una actividad de (a) con el fin de producir una planta capaz de sintetizar FMT, que transforme establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico;

�� (b) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida que transforme establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico; o

(c) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, que altere un gen codificante

���

de FMT a través de la modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga a partir de un ácido nucleico alterado de forma apropiada introducido en la célula de la planta, y regenerar la planta modificada genéticamente a partir de la célula proporcionada por la invención, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico de la invención

Además, la invención proporciona un método para producir una planta modificada genéticamente con niveles alterados

���

de FMT codificados en una molécula de ácido nucleico de la invención dicho método que comprende introducir en una célula o células de dicha planta una secuencia genética seleccionada de:

(i)

una secuencia antisentido para ARNm de FMT;

(ii)

una secuencia sentido para ADN de FMT; y/o

(iii) una secuencia que induce ARNi Específico de ARNm de FMT; y regenerar una planta modificada genéticamente a

���

partir de dicha célula.

Adicionalmente, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una FMT o parte de esta o que lleva una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm opcionalmente transcribible cuando se requiere para realizar la regulación de una FMT, dicho método que comprende transformar establemente una célula de

���

una planta apropiada con la molécula de ácido nucleico aislada de la invención, cuando sea necesario, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

También se proporciona por la invención una secuencia de oligonucleótidos aislada enunciada en SEQ IP NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33, una FMT recombinante aislada codificada por una molécula de ácido

���

nucleico de la invención, una molécula de ácido nucleico de FMT recombinante aislada de la invención que comprende una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas, un organismo procariota o eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de FMT de la invención extracromosomalmente en forma de plásmido y el uso de una molécula de ácido nucleico de la invención en la fabricación de una planta modificada genéticamente.

TABLA 1

Resumen de identificadores de la secuencia

SECUENCIA ID NO:

NOMBRE DESCRIPCIÓN

1

Petunia difE nt secuencia nucleótido de ADNc

2

Petunia difE aa seq secuencia traducida de ADNc

3

’GAGATTT’ oligonucleótido

4

Petunia E20 nt seq nucleótido de ADNc

5

Petunia E20 aa secuencia traducida de ADN

6

Petunia E33 nt nucleótido de ADNc

7

Petunia E33 corregido aa aminoácido de ADNc (corregido)

8

1903 F oligonucleótido específico de FMT

9

1907BamHI F oligonucleótido específico de FMT

10

1907Pst R oligonucleótido específico de FMT

11

Torenia TMT5.nt nucleótido de ADNc

12

Torenia TMT5. aa. secuencia traducida de ADNc

13

TMT5.BamHI.F oligonucleótido

14

TMT5.PstI.R oligonucleótido

15

OMTIf2 oligonucleótido específico de FMT

16

OMTIf4 oligonucleótido específico de FMT

17

OMTIr3 oligonucleótido específico de FMT

18

OMTIr5 oligonucleótido específico de FMT

19

dT(17)Ad2Ad1 oligonucleótido

20

GI-anchor oligonucleótido

21

Fuchsia FMT nt nucleótido de ADNc

22

Fuchsia FMT aa aminoácido de ADNc

23

OMT1 f1 oligonucleótido específico de FMT

(continuación) (continuación)

Resumen de identificadores de la secuencia

SECUENCIA ID NO:

NOMBRE DESCRIPCIÓN

24

OMT1f3 oligonucleótido específico de FMT

25

OMT1r4 oligonucleótido específico de FMT

26

Petunia E33 nt (corregido) nucleótido de ADNc

27

Ad1 oligonucleótido

28

petD8#1 oligonucleótido

29

petD8#2 oligonucleótido

30

PMT-F oligonucleótido específico de FMT

31

PMT-R oligonucleótido específico de FMT

32

TMT-F oligonucleótido específico de FMT

33

TMT-R oligonucleótido específico de FMT

34

FucR1 oligonucleótido específico de FMT

35

FucR3 oligonucleótido específico de FMT

36

FucR5 oligonucleótido específico de FMT

37

FucR6 oligonucleótido específico de FMT

38

FucF1 oligonucleótido específico de FMT

39

Tor 5’ pos oligonucleótido específico de FMT

40

Tor 5’ neg oligonucleótido específico de FMT

41

Fuchsid FMT(3282).nt nucleótido de ADNc

42

Fuchsia FMT (3282).aa secuencia traducida de ADNc

43

Fuchsia. FMT completa (3289).nt nucleótido de ADNc

44

Fuchsia FMT completa (3289).aa secuencia traducida de ADNc

45

ligador BamHI ligador de oligonucleótido

46

ligador AscII ligador de oligonucleótido

Resumen de identificadores de la secuencia

SECUENCIA ID NO:

NOMBRE DESCRIPCIÓN

47

ligador SalI ligador de oligonucleótido

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

�� Figuras 1A y 1B son representaciones esquemáticas de la ruta de biosíntesis de los pigmentos de flavonoides en petunias. Las enzimas implicadas en la ruta han sido indicadas de la siguiente manera: PAL = Fenilalanina amonioliasa; C4H = Cinamato 4-hidroxilasa; 4CL = 4-coumarato: CoA ligasa; CHS = Chalcona sintasa; CHI = Chalcona flavanona isomerasa; F3H = Flavanona 3-hidroxilasa; DFR = Dihidroflavonol 4-reductasa; ANS = Antocianidina sintasa, 3GT= UDP-glucosa: flavonoide 3-O-glucosiltransferasa; 3RT = UDP ramnosa: antocianidina 3-glucósido

���

ramnosiltransferasa, AR-AT = Antocianidina rutinósido aciltransferasa, SGT = Antocianina 5-glucosiltransferasa; 3’ FMT = Flavonoide 3’ O-metiltransferasa, 3’5’ FMT = Flavonoide 3’, 5’ O - metiltransferasa. Otras abreviaturas incluyen: DHK = dihidrocampferol, DHQ = dihidroquercetina, DHM = dihidromiricetina, P 3-G = pelargonidina 3-glucósido. Algunos de los locus genéticos que controlan estas reacciones en petunia se muestran en cursivas al lado de las enzimas. Los pigmentos con base en miricetina y pelargonidina ocurren raramente en petunia.

���

Figura 2 es una representación diagramática del plásmido pCGP1903 que contiene el clon difE de ADNc a partir de P. hybrid cv. V26. Los fragmentos 32P-marcados del fragmento EcoRI/XhoI de 0.9 kb fueron utilizados para sondear la biblioteca de ADNc de pétalos de Old Glory Blue. Las abreviaturas son las siguientes: Amp = gen de resistencia a la ampicilina que confiere la resistencia al antibiótico ampicilina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ColElori = origen de replicación del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13 utilizado

���

en el análisis de secuencias, -20 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -20 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de restricción seleccionada también se marcan.

Figura 3 es una representación diagramática del plásmido pCGP 1907 que contiene el clon de ADNc E20 a partir de P. hybrida cv. OGB. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ori = origen de replicación

���

del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13 utilizado en el análisis de secuencias, -20 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -20 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de restricción seleccionada también se marcan.

Figura 4 es una representación diagramática del plásmido pCGP1908 que contiene el clon de ADNc E33 de P. hybrid

cv. OGB. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp= el gen de resistencia a la ampicilina que confiere

���

resistencia al antibiótico ampicilina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ori = origen de replicación del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13 utilizado en el análisis de secuencias, -20 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -20 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 5 es una representación diagramática del plásmido pCGP3086 (mut E20 en pQE30) que contiene el clon de

���

ADNc 20 mutado de P. hybrida en el vector de expresión bacteriana pQE30. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, Col E1 ori = origen de replicación del plásmido E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 6 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP1918. El gen E20 antisentido quimérico de pCGP1910 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación tándem con el gen quimérico SuRB.

���

Las abreviaturas son de la siguiente manera: TetR = gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y secuencia terminador

a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S = la región promotora a partir del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), Mac = Híbrido promotor que consiste del promotor a partir del gen mas y una región potenciadora CaMV 35S, mas 3’ = la región terminadora a partir del gen manopina sintasa de Agrobacterium; pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped a partir de un plásmido de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón

�� modificado de pACYC184 a partir de E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 7 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP1919. El gen antisentido quimérico E33 a partir de pCGP19911 se clonó en el vector binario pWTT2132 (DNAP) en una orientación tándem con el gen quimérico SuRB. Las abreviaturas son de la siguiente manera: TetR = el gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y

���

secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S = la región promotora del gen CaMV 35S, Mac = Híbrido promotor que consiste del promotor del gen mas y una región potenciadora CaMV 35S, mas 3’ = la región terminadora a partir del gen manopina sintasa de Agrobacterium; pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped a partir de un plásmido de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón modificado de pACYC184 de E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

���

Figura 8 es una representación diagramática del plásmido pTMT5 que contiene el clon de ADNc de TFMT de Torenia. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp= el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ori = origen de replicación del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13, utilizado en el análisis de secuencias, -20 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -20 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de

���

restricción seleccionados también se marcan.

Figura 9 es una representación diagramática del plásmido pCGP3090 (mut TFMT en pQE30) que contiene el clon mutado de ADNc de TFMT a partir de Torenia en el vector de expresión bacteriana pQE30. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, Col E1 ori = E. coli origen de replicación del plásmido. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

���

Figura 10 es una representación diagramática del plásmido pCGP3097. El clon de FMT de Torenia (TFMT) a partir de pTMT5 se clonó en un casete de expresión de CaMV35S. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, 35S 5’ = la región promotora a partir del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

���

Figura 11 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP3099. El gen quimérico de FMT de Torenia (TFMT) a partir de pCGP3097 (Figura 10) se clonó en el vector binario pCGP1988 (Figura 12) en una orientación tándem con el gen quimérico SuRB. Las abreviaturas son de la siguiente manera: TetR= el gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y la secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S 5’ = la región

���

promotora del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S, pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido a partir de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón modificado de pACYC184 del E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 12 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP1988. El sitio de multi-clonación del vector binario pWTT2132 (DNAP) fue reemplazado con el sitio de multi-clonación a partir de pNEB193 (New England Biolabs).

���

Las abreviaturas son como sigue: TetR= el gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S 5’ = la región promotora del gen CaMV 35S, pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido a partir de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón modificado de pACYC184 del E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

���

Figura 13 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP3254. El gen quimérico F3’5’H de pCGP2092 (Figura 14) se clonó en el plásmido binario pCGP3099 (Figura 11) en una orientación tándem con el gen quimérico SuRB y el gen quimérico TFMT. Las abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H = clon de ADNc de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, TFMT = clon de ADNc de FMT a partir de Torenia, TetR = el gen de resistencia a la

tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S 5’ = la región promotora del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S, pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido a partir de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón modificado de

�� pACYC184 a partir del E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 14 es una representación diagramática del plásmido pCGP2092. El clon F3’5’H de Viola a partir de pCGP1961 se clonó en un casete de expresión CaMV35S. Las abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H = clon de ADNc de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, 35S 5’ = la región promotora del gen CaMV 35S; 35S 3’ = la región terminadora del gen CaMV

���

35S. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 15 es una representación diagramática del plásmido binario pSPB1534. El gen quimérico F3’5’H de Viola a partir de pSPB580 (Figura 16) se clonó en una orientación tándem con el gen quimérico de FMT de Petunia y el gen del marcador genético del plásmido binario Ti de pSPB1531 (Figura 17). Las abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H = clon de ADNc de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, PFMT = clon de ADNc de FMT de Petunia, nptIII

���

= el gen neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico canamicina, nptII = el gen neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia al antibiótico canamicina, e35S 5’ = una región promotora mejorada a partir del gen CaMV 35S, petD8 3’ = la región terminadora a partir del gen de Petunia PLTP, nos 5’ = región promotora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, nos 3’ = región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, RK2 = origen RK2 del plásmido gram-negativo de amplio

���

rango de huésped, LB = borde izquierdo, RB = borde derecho. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 16 es una representación diagramática, del plásmido pSPB580. El clon de ADNc F3’5’H (BP#40) de Viola (a partir de pCGP1961) se clonó entre un fragmento mejorado del promotor 35S CaMV (from pBE2113-GUS) y un fragmento terminador PLTP (D8) de Petunia (a partir de pCGP13ΔBam). Las abreviaturas son de la siguiente manera:

���

F3’5’H = clon de ADNc de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, e35S 5’ = una región promotora mejorada a partir del gen CaMV 35S, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, petD8 3’ = la región terminadora a partir del gen PLTP de Petunia.

Figura 17 es una representación diagramática del plásmido binario pSPB1531. El clon de ADNc quimérico de FMT de Petunia (PFMT) fue amplificado por PCR (a partir de pCGP1907) (Figura 3) y reemplazado por la región codificante

���

GUS del plásmido binario pSPB 176 (Figura 20). Las abreviaturas son de la siguiente manera: nptIII = el gen neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico canamicina, nptII = el gen de neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia al antibiótico canamicina, e35S 5’= una región promotora mejorada a partir del gen CaMV 35S, nos 5’ = región promotora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacteriuin, nos 3’ = región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, RK2 = origen RK2 del plásmido

���

gram-negativo de amplio rango de huésped, LB = borde izquierdo, RB = borde derecho. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 18 es una representación diagramática del plásmido binario pSPB1532. El gen quimérico Viola F3’5’H a partir de pSPB580 (Figura 16) se clonó en una orientación tándem con el gen quimérico de FMT de Petunia y el gen del marcador genético del plásmido binario Ti pSPB1531 (Figura 17). Las abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H

���

= clon de ADNc de flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, TFMT = clon de ADNc de FMT de Torenia nptIII = el gen de neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico canamicina, nptII = el gen de neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia al antibiótico canamicina, e35S 5’ = una región promotora mejorada a partir del gen CaMV 35S, petD8 3’ = la región terminadora a partir del gen de Petunia PLTP, nos 5’ = región promotora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, nos 3’ = región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de

���

Agrobacterium, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, RK2 = origen RK2 del plásmido gram-negativo de amplio rango de huésped, LB = borde izquierdo, RB = borde derecho. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 19 es una representación diagramática del plásmido binario pSPB1530. El clon de ADNc quimérico de FMT de Torenia (TFMT) fue amplificado por PCR (a partir de pTMT5) (Figura 8) y reemplazado de la región codificante GUS del plásmido binario pSPB176 (Figura 20). Las abreviaturas son de la siguiente manera: nptIII = el gen neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico canamicina; nptII = el gen neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia al antibiótico canamicina, e35S 5’ = una región promotora mejorada del gen CaMV 35S, nos 5’ = región promotora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, nos 3’ = región terminadora a partir del gen

�� sintasa nopalina de Agrobacterium, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, RK2 = origen RK2 del plásmido gram-negativo de amplio rango de huésped, LB = borde izquierdo, RB = borde derecho. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 20 es una representación diagramática del plásmido binario pSPB176. Un gen quimérico de GUS (a partir de pBE2113-GUS) se clonó en una orientación tándem al gen del marcador genético nptII del vector binario Ti pBINPlus.

���

Las abreviaturas son de la siguiente manera: nptIII = el gen neomicina fosfotransferasa III que confiere resistencia al antibiótico canamicina, nptII = el gen neomicina fosfotransferasa II que confiere resistencia al antibiótico canamicina, e35S 5’ = una región promotora mejorada a partir del gen CaMV 35S, petD8 3’ = la región terminadora a partir del gen de Petunia PLTP, nos 5’ = región promotora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, nos 3’ = región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium, ColE1 = origen ColE1 del plásmido de E. coli, RK2 =

���

origen RK2 del plásmido gram-negativo de amplio rango de huésped, LB = borde izquierdo, RB = borde derecho. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 21 es una representación diagramática del plásmido pCGP3267. Un clon parcial de Fuchsia FMT fue amplificado utilizando PCR y ADNc de única hebra (preparado a partir del ARN total aislado de pétalos de Fuchsia) como plantilla y se clona en el plásmido pCR2.1. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = el gen de resistencia a la

���

ampicilina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina, Kan = el gen de resistencia a la canamicina que confiere resistencia al antibiótico canamicina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ColE1 ori = origen de replicación del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13 utilizado en el análisis de secuencias, -21 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -21 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

���

Figura 22 es una representación diagramática del plásmido pCGP3289. Una versión de longitud-completa de FMT Fuchsia (Fuchsia FMT completa) se clonó en el plásmido pCR2.1. Las abreviaturas son de la siguiente manera Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, Kan = el gen de resistencia a la canamicina que confiere resistencia al antibiótico canamicina, f1 ori (+) = f1 origen de replicación de fago filamentoso, ColE1 ori = origen de replicación del plásmido, rev = localización aproximada del sitio del cebador reverso M13 utilizado

���

en el análisis de secuencias, -21 = localización aproximada del sitio del cebador M13 -21 utilizado en el análisis de secuencias. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 23 es una representación diagramática del plásmido pCGP3290. El clon de ADNc de FMT de Fuchsia (FFMT) a partir de pCGP3289-(Figura 22) se clonó en un casete de expresión CaMV 35S. Las abreviaturas son de la siguiente manera: Amp = Amp = el gen de resistencia a la ampicilina que confiere resistencia al antibiótico ampicilina, 35S 5’ = la

���

región promotora a partir del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 24 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP2788. El casete de expresión 35S 5’: Torenia FMT: 35S 3’ fue eliminado a partir del plásmido binario pCGP3254 (Figura 13) para dejar un vector binario con el casete de expresión 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’ en tándem con el gen del marcador genético 35S 5’: SuRB. Las

���

abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H = clon de ADNc flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, TetR = el gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S 5’ = la región promotora a partir del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S, pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido a partir de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori =

���

replicón modificado de pACYC184 a partir de E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 25 es una representación diagramática del plásmido binario pCGP3292. El casete de expresión 35S 5’: FFMT: 35S 3’ a partir de pCGP3290 (Figura 23) se clonó en una orientación tándem a los casetes de expresión 35S 5’: SuRB y 35S 5’: F3’5’H:35S 3’ del plásmido binario Ti pCGP2788 (Figura 24). Las abreviaturas son de la siguiente manera: F3’5’H = clon de ADNc del flavonoide 3’, 5’ hidroxilasa a partir de Viola, FFMT = clon de ADNc de FMT de Fuchsia, TetR = el gen de resistencia a la tetraciclina que confiere resistencia al antibiótico tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; SuRB = la región codificante y secuencia terminador a partir del gen acetolactato sintasa del tabaco; 35S 5’ = la región promotora a partir del gen CaMV 35S, 35S 3’ = la región terminadora a partir del gen CaMV 35S,

�� pVS1 = un origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido a partir de Pseuodomonas aeruginosa, pACYC ori = replicón modificado de pACYC184 a partir del E. coli. Los sitios de enzima de restricción seleccionados también se marcan.

Figura 26 muestra un dendograma que ilustra la relación de agrupación entre secuencias deducidas de aminoácidos de FMTs de petunia (pCGP1907.aa), Torenia (pTMT5.aa) y Fuchsia (pCGP3267.aa) con otras O-metiltransferasas (OMT)

��� de planta de longitud completa de ambas Clase I y Clase II encontradas en la base de datos GenBank. Los números de acceso Genbank de cada SAM-OMT en la base de datos se muestran en corchetes.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS

Una secuencia genética que codifica una metiltransferasa y, más particularmente, un flavonoide metiltransferasa (de ahora en adelante denominada como "FMT") ha sido identificada y clonada. La secuencia recombinante permite la

���

modulación de la metiltransferasa cuando se adhiere a una molécula flavonoide. Los sustratos incluyen antocianinas con un grupo hidroxilo adherido a la molécula tal como antocianinas basadas en las antocianidinas delfinidina, cianidina y petunidina incluyendo pero no limitando a delfinidina 3-glucósido, cianidina 3-glucósido, petunidina 3-glucósido, delfinidina 3, 5-diglucósido, cianidina 3, 5-diglucósido, petunidina 3, 5-diglucósido, proporcionando de tal modo un medio para manipular el color del pétalo. Por consiguiente, la presente invención se refiere a la alteración de la

���

actividad de FMT en plantas, que abarca la elevación o reducción (i.e. modulación) de los niveles de actividad existente de FMT, por la introducción de una secuencia como se revela en este documento. La reducción en los niveles de actividad de FMT también se puede denominar como inhibición de la expresión. Adicionalmente, las plantas y partes reproductivas o vegetativas de estas incluyendo flores, semillas, vegetales, hojas, tallos, etc., y más particularmente, modificadas genéticamente o plantas transgénicas ornamentales se describen.

���

Una "planta transgénica" incluye cualquier planta modificada genéticamente y los términos "transgénico" y "modificadas genéticamente" pueden ser utilizados de manera intercambiable a través de la especificación del tema.

Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante, o complementaria a una secuencia que codifica FMT o un derivado funcional de la enzima se describe en este documento.

���

Por conveniencia y por medio de notación abreviada solo, la referencia en este documento a una enzima de metilación de flavonoide incluye FMTs que actúan en los flavonoides tales como antocianinas, flavonoles y/o flavones. Preferiblemente, la enzima de metilación de flavonoide es FMT. La enzima de FMT también se puede considerar que incluyen un polipéptido o proteína que tiene actividad de FMT o actividad similar a FMT. Esta última abarca derivados que tiene actividades de FMT alteradas.

���

Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante, o complementaria a una secuencia que codifica FMT o un mutante funcional, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de FMT se revela.

Los mutantes, derivados, partes, fragmentos, homólogos y análogos pueden o no ser funcionales.

Por el término "molécula de ácido nucleico" se entiende una secuencia genética en una condición que no ocurre

���

naturalmente. Por lo general, esto significa aislado fuera de su estado natural o sintetizado o derivado en un ambiente que no ocurre naturalmente. Más específicamente, incluye moléculas del ácido nucleico formadas o conservadas in vitro, incluyendo fragmentos de ADN genómico recombinantes o moléculas sintéticas y ácidos nucleicos en combinación con ácidos nucleicos heterólogos. También se extiende al ADN genómico o ADNc o parte de esta FMT codificante o una parte de esta en orientación reversa en relación con tal u otro promotor. Además se extiende a

���

secuencias que ocurren naturalmente después de al menos una purificación parcial con respecto a otras secuencias de ácidos nucleicos.

El término "secuencias genéticas" se utiliza en este documento en su sentido más general y abarca cualquier serie contigua de bases de nucleótidos que especifica directamente, o vía una serie de bases complementarias, una secuencia de aminoácidos en una enzima de FMT. Dicha secuencia de aminoácidos puede constituir una FMT parcial tal como se enuncia en SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:42 o una FMT de longitud completa tal como se enuncia en SEQ

�� ID NO:2 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:44 o una forma truncada activa de estas o puede corresponder a una región particular tal como un N-terminal, C-terminal o porción interna de la enzima. Una secuencia genética también se puede denominar como una secuencia de nucleótidos o una secuencia de nucleótidos e incluye una fusión recombinante de dos o más secuencias.

La secuencia genética también se puede someter al uso de codón modificado para mejorar o por otra parte facilitar la

���

expresión en una célula huésped particular.

Se revela, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de nucleótidos complementaria sustancialmente como se enuncia en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 SEQ NO:41 o SEQ ID NO:43 o que tiene al menos aproximadamente 50% de similitud a esta o capaz de hibridizar a la secuencia enunciada en SEQ ID NO: 1 bajo condiciones de baja severidad.

���

El porcentaje de similitud alternativo incluye al menos aproximadamente 60% o al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90% o más, tal como aproximadamente 95% o aproximadamente 96% o aproximadamente 97% o aproximadamente 98% o aproximadamente 99%.

Por lo tanto, se revela una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de nucleótidos complementaria sustancialmente como se enuncia en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ

���

ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 que tiene al menos aproximadamente 50% de similitud a esta o capaz de hibridizar a la secuencia enunciada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 o hebras complementarias de cualquiera bajo condiciones de baja severidad, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de FMT.

���

Con el fin de determinar el nivel de severidad para definir las moléculas del ácido nucleico capaces de hibridizar a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO:43, la referencia en este documento a una baja severidad incluye y abarca por lo menos aproximadamente 0% a al menos aproximadamente 15% v/v de formamida y por lo menos aproximadamente 1M a al menos aproximadamente 2M de sal de hibridación, y al menos aproximadamente 1M a al menos aproximadamente 2M de sal de condiciones de

���

lavado. Por lo general, baja severidad es de aproximadamente 25-30˚C a aproximadamente 42˚C. La temperatura puede ser modificada y temperaturas más altas se utilizan para reemplazar la formamida y/o para dar condiciones de severidad alternativas. Las condiciones de severidad alternativas se pueden aplicar cuando sea necesario, tal como medio de severidad, que incluye y abarca por lo menos aproximadamente 16% v/v a al menos aproximadamente 30% v/v de formamida y por lo menos aproximadamente 0.5M a al menos aproximadamente 0.9M de sal de hibridación, y al

���

menos aproximadamente 0.5M a al menos aproximadamente 0.9M de sal de condiciones de lavado, o alta severidad, que incluye y abarca por lo menos aproximadamente 31% v/v a al menos aproximadamente 50% v/v de formamida y por lo menos aproximadamente 0.01M a al menos aproximadamente 0.15M de sal de hibridación, y al menos aproximadamente 0.01M a al menos aproximadamente 0.15M de sal de condiciones de lavado. En general, el lavado se lleva a cabo Tm = 69.3 + 0.41 (G+C)% (Marmur and Doty, J. Mol. Biol. 5:109, 1962). Sin embargo, la Tm de un ADN

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dúplex disminuye en 1˚C con cada incremento de 1% en el número de pares de base de apareamiento erróneo (Bonner and Laskey, Eur. J. Biochem. 46: 83, 1974). La formamida es opcional en estas condiciones de hibridación. Por consiguiente, los niveles de severidad particularmente preferidos se definen de la siguiente manera: baja severidad es 6 x solución reguladora SSC, 1.0% peso/v de SDS a 25-42˚C; una severidad moderada es 2 x solución reguladora SSC, 1.0% de peso/v SDS a una temperatura en el rango 20˚C a 65˚C; alta severidad es 0.1 x solución reguladora

���

SSC, 0.1% peso/v de SDS a una temperatura de al menos 65˚C.

Además se revela, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se enuncia en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:44 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de similitud a esta.

El término de similitud como se utiliza en este documento incluye identidad exacta entre secuencias comparadas al nivel de nucleótido o aminoácido. Dónde no hay identidad en el nivel de nucleótido, la similitud incluye diferencias entre las secuencias que resultan en diferentes aminoácidos que sin embargo se relacionan entre sí en los niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. Dónde no hay identidad en el nivel de aminoácido, la

�� similitud incluye aminoácidos que sin embargo se relacionan entre sí en los niveles estructurales, funcionales, bioquímicos y/o conformacionales. En una modalidad particularmente preferida, comparaciones de nucleótidos y secuencias se hacen en el nivel de identidad en lugar de la similitud.

Los términos utilizados para describir relaciones de secuencias entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos incluyen "secuencia de referencia", “ventana de comparación", "secuencia de similitud", "identidad de secuencia", "porcentaje de

���

similitud de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", "sustancialmente similar" y "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" tiene al menos 12 pero frecuentemente 15 a 18 y por lo general al menos 25 o más, tal como 30 unidades de monómero, inclusive de residuos de nucleótidos y aminoácidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden cada uno comprender (1) una secuencia (i.e. solo una porción de la secuencia del polinucleótido completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los

���

dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos por lo general se realizan mediante la comparación de secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de por lo general 12 residuos contiguos que se compara con una secuencia de referencia. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (i.e. huecos) de aproximadamente 20% o menos en

���

comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para la alineación de una ventana de comparación se puede llevar a cabo por implementaciones computarizadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Grupo, 575 Science Drive Madison, WI, USA) o por la inspección y la mejor alineación (i.e. resultando en el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de

���

comparación) generada por cualquiera de los diferentes métodos seleccionados. También se puede hacer referencia a la familia BLAST de programas como, por ejemplo, los revelados por Altschul et al. (Nucl. Acids Res. 25: 3389, 1997). Una discusión detallada de análisis de secuencias, se puede encontrar en Unit 19.3 of Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15, 1998).

Los términos "similitud de secuencia" e "identidad de secuencia" como se utiliza en este documento se refiere al grado

���

que las secuencias son idénticas o funcional o estructuralmente similares en una base nucleótido-por-nucleótido o una base aminoácido-por-aminoácido sobre una ventana de comparación. Por lo tanto, un "porcentaje de identidad de secuencia", por ejemplo, se calcula mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima en la ventana: de comparación, la determinación del número de posiciones en las cuales la base del ácido nucleico idéntica (por ejemplo A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe,

���

Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación (i.e., el tamaño de ventana), y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. A los efectos de la presente invención, "identidad de secuencia" se entenderá que significa el "porcentaje de apareamiento" calculado por el programa de ordenador DNASIS (Versión 2.5 para windows; disponible de Hitachi

���

Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USA) utilizando valores predeterminados estándar como se utiliza en el manual de referencia acompañante del software. Lo mismo puede decirse en relación con la similitud de secuencia.

Las secuencias del ácido nucleico revelados en este documento también abarca oligonucleótidos útiles como sondas genéticas para reacciones de amplificación o como moléculas antisentido o sentido capaces de regular la expresión del

���

gen correspondiente en una planta. Una molécula de antisentido como se revela en este documento también puede abarcar una construcción genética que comprende el gen genómico estructural o de ADNc o parte de este, en orientación reversa con respecto a su promotor u otro. También puede abarcar una secuencia genética homóloga. Una molécula antisentido o sentido también se puede dirigir a porciones terminales o internas del gen codificante de un polipéptido que tiene actividad de FMT o a combinaciones de las anteriores de tal manera que la expresión del gen se

���

reduce o elimina.

En este aspecto se revela un oligonucleótido de 5-50 nucleótidos que tiene sustancial similitud o complementariedad a una parte o región de una molécula con una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 o una forma complementaria de estas. Por sustancial similitud o complementariedad en este contexto, se entiende una similitud

�� hibridizable bajo condiciones bajas, alternativa y preferiblemente medias y alternativamente y más preferiblemente condiciones de alta severidad específicas para hibridación de oligonucleótidos (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989). Tal oligonucleótido es útil, por ejemplo, en la detección de secuencias genéticas de FMT a partir de varias fuentes o para el monitoreo de una secuencia genética introducida en una planta transgénica. El oligonucleótido preferido se dirige a la secuencia genética

���

de FMT conservada o una secuencia conservada dentro de un género de la planta, especie de planta y/o variedad de planta.

El oligonucleótido puede corresponder en el extremo 5’ o el 3’ de la secuencia genética de FMT. Por conveniencia, el extremo 5’ se considera en este documento para definir una región sustancialmente entre el codón de iniciación del gen estructural a una porción central del gen, y el extremo 3’ se considera en este documento para definir una región

���

sustancialmente entre la porción central del gen y el codón de terminación del gen estructural. Es evidente, por lo tanto, que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridizar al extremo 5’ o el extremo 3’ o a una región común a ambos los extremos 5’ y 3’.

La secuencia de ácido nucleico que codifica una FMT o varios derivados funcionales de esta pueden ser utilizados para reducir el nivel de una FMT endógena (por ejemplo vía co-supresión) u otros procesos de silenciamiento del gen post

���

transcripcionales (PTGS) incluyendo ARNi o alternativamente la secuencia del ácido nucleico que codifica esta enzima

o varios derivados o partes de estas pueden ser utilizados en la orientación antisentido para reducir el nivel de FMT. El uso de cadenas codificantes, cadena doble o parcialmente única, tal como construcciones con bucles horquillados es particularmente útil en inducir una respuesta de PTGS. En otra alternativa, los ribozimas podrían ser utilizados para inactivar secuencias diana de ácidos nucleicos.

���

Adicionalmente, la inhibición post-transcripcional puede reducir la traducción en el material de polipéptido.

La referencia en este documento a la alteración de actividad de FMT se relaciona con una elevación o reducción en actividad de hasta 30% o más preferiblemente de 30-50%, o incluso más preferiblemente 50-75% o aún más preferiblemente 75% o más por encima o por debajo de los niveles de actividad existentes o endógenos normales. Tal elevación o reducción se puede denominar como modulación de enzima de actividad de FMT. Por lo general, la

���

modulación está en el nivel de transcripción o traducción de las secuencias genéticas de FMT.

Los ácidos nucleicos revelados en este documento pueden ser un ácido ribonucleico o ácidos desoxiribonucleicos, de cadena lineal o sencilla y moléculas circulares cerradas covalentemente o lineales. La molécula de ácido nucleico puede ser un ADNc. También se revelan otras moléculas de ácido nucleico que se hibridizan bajo condiciones bajas, preferiblemente medias y más preferiblemente bajo condiciones de alto rigor con las moléculas del ácido nucleico

���

reveladas en este documento y en particular con la secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 o una parte

o región de estas. Una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 o una molécula que tiene al menos 40%, más preferiblemente al menos 45%, incluso más preferiblemente al menos 55%,

���

aún más preferiblemente al menos 65%-70%, y todavía aún más preferiblemente mayor de 85% de similitud en el nivel de secuencia de nucleótido o aminoácido a al menos una o más regiones de la secuencia enunciada en SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:43 en donde el ácido nucleico codifica o es complementario a una secuencia que codifica una enzima que tiene actividad de FMT, se revela. Cabe señalar; sin embargo, que las secuencias de nucleótidos o aminoácidos pueden tener similitudes

���

por debajo de los porcentajes proporcionados anteriormente y todavía aún codificar la actividad de FMT. Las moléculas de ácido nucleico en la forma de sondas o cebadores de oligonucleótidos capaces de hibridizar a una porción de las moléculas del ácido nucleico contempladas anteriormente se revelan, y en particular aquellas enunciadas en SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:4 y/o SEQ ID NO:6 y/o SEQ ID NO:11 y/o SEQ ID NO:21 y/o SEQ ID NO:26 y/o SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:43, bajo condiciones bajas, preferiblemente medias y más preferiblemente bajo condiciones de alto

���

rigor. La porción puede corresponder al extremo 5’ o 3’ del gen. Por conveniencia, el extremo 5’ se considera en este

documento para definir una región sustancialmente entre el codón de iniciación de la secuencia genética estructural a una porción central del gen, y el extremo 3’ se considera en este documento para definir una región sustancialmente entre la porción central del gen y el codón de terminación de la secuencia genética estructural. Es evidente, por lo tanto, que los oligonucleótidos o sondas pueden hibridizar con el extremo 5’ o el extremo 3’ o con una región común a

�� ambos el extremo 5’ y el extremo 3’.

El término gen se utiliza en su sentido más amplio e incluye el ADNc correspondiente a los exones de un gen. Por consiguiente, la referencia en este documento a un gen se debe tomar para incluir:

(i) un gen genómico clásico que consiste de secuencias reguladoras transcripcionales y/o translacionales y/o una región codificante y/o secuencias no-traducidas (i.e. intrones, secuencias no traducidas 5’- y 3’-); o

���

(ii) ARNm o ADNc correspondiente a las regiones codificantes (i.e. exones) y secuencias no traducidas 5’- y 3’- del gen.

El término "gen" también se utiliza para describir moléculas sintéticas o de fusión que codifican toda o parte de un producto de expresión. En modalidades particulares, el término "molécula de ácido nucleico" y "gen" puede ser utilizado de manera intercambiable.

���

El ácido nucleico o su forma complementaria puede codificar la enzima de longitud completa o una parte o derivado de esta. Por "derivado" se entiende cualquiera de las sustituciones, deleciones, y/o adiciones de aminoácidos múltiples o simples con respecto a la enzima que ocurre naturalmente y que retiene la actividad de FMT. En este sentido, el ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos que ocurre naturalmente que codifica FMT o puede contener sustituciones, deleciones y/o adiciones de nucleótidos múltiples o sencillos a dicha secuencia que ocurre naturalmente. El ácido

���

nucleico descrito en este documento o su forma complementaria también puede codificar una "parte" de la FMT, ya sea activa o inactiva, y tal molécula de ácido nucleico pueden ser útil como una sonda de oligonucleótido, cebador de reacciones de cadena de polimerasa o en varias técnicas mutagénicas, o para la generación de moléculas antisentido.

La referencia en este documento a una "parte" de una molécula de ácido nucleico, secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácido, preferiblemente se relaciona con una molécula que contiene al menos aproximadamente 10

���

nucleótidos contiguos o cinco aminoácidos contiguos, según corresponda.

Los derivados insercionales de aminoácidos de la FMT incluyen fusiones terminales amino y/o carboxilo así como inserciones intra-secuencia de aminoácidos múltiples o simples. Las variantes de secuencias de aminoácidos insercionales son aquellas en las cuales uno o más residuos de aminoácidos se introducen en un sitio predeterminado en la proteína aunque la inserción aleatoria también es posible con apropiada detección del producto resultante. Las

���

variantes de deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos a partir de la secuencia. Las variantes de aminoácidos sustitucionales son aquellas en las cuales al menos un residuo en la secuencia ha sido eliminado y un residuo diferente se inserta en su lugar. Las sustituciones típicas son aquellas realizadas de acuerdo con la Tabla 2.

TABLA 2

Residuos apropiados de sustituciones de aminoácidos

RESIDUO ORIGINAL

SUSTITUCIONES EJEMPLARES

Ala

Ser

Arg

Lys

Asn

Gln; His

(continuación)

Residuos apropiados de sustituciones de aminoácidos

RESIDUO ORIGINAL

SUSTITUCIONES EJEMPLARES

Asp

Glu

Cys

Ser

Gln

Asn; Glu

Glu

Asp

Gly

Pro

His

Asn; Gln

Ile

Leu; Val

Leu

Ile; Val

Lys

Arg; Gln; Glu

Met

Leu; Ile; Val

Phe

Met; Leu; Tyr

Ser

Thr

Thr

Ser

Trp

Tyr

Tyr

Trp; Phe

Val

Ile; Leu; Met

Cuando la FMT se derivatiza por sustitución de aminoácidos, los aminoácidos por lo general se reemplazan por otros

�� aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, electronegatividad, cadenas laterales voluminosas y similares. Las sustituciones de aminoácidos son por lo general de residuos simples. Las inserciones de aminoácidos por lo general estarán en el orden de aproximadamente 1-10 residuos de aminoácidos y las deleciones variarán de aproximadamente 1-20 residuos. Preferiblemente, las deleciones o inserciones se hacen en pares adyacentes, i.e. una deleción de dos residuos o inserción de dos residuos.

���

Las variantes de aminoácidos mencionadas anteriormente pueden fácilmente ser hechos utilizando técnicas de péptidos sintéticos bien conocidas en el oficio, tales como síntesis de péptidos de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964) y similares, o por manipulaciones de ADN recombinante. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en el sitio predeterminado en ADN que tiene secuencia conocida o parcialmente conocida son bien conocidas e incluyen, por ejemplo, mutagénesis M13. La manipulación de la secuencia de ADN para producir variantes

���

de proteínas que se manifiestan como variantes sustitucionales, insercionales o delecionales se describen convenientemente, por ejemplo, en Sambrook et al., (1989), supra.

Otros ejemplos de mutantes recombinantes o sintéticos y derivados de la enzima de FMT revelados en este documento incluyen sustituciones, deleciones y/o adiciones múltiples o simples de cualquier molécula asociada con la enzima tal como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o polipéptidos.

Los términos "análogos" y "derivados" también se extienden a cualquier equivalente químico funcional de FMT y

�� también a cualquier derivado de aminoácido descrito anteriormente. Por conveniencia, la referencia a FMT en este documento incluye referencia a cualquier mutante funcional, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de esta.

Las secuencias de ácido nucleico derivado de Petunia, Torenia o Fuchsia se revelan en este documento. La invención se relaciona con secuencias de Torenia. Sin embargo, alguien de habilidad en el oficio apreciará inmediatamente que secuencias similares se pueden aislar de cualquier número de fuentes tales como otras plantas o ciertos ��� microorganismos. Ejemplos de otras apropiadas fuentes de genes de FMT codificantes incluyen, pero no se limitan a Petunia sp., Plumbago sp., Vitis sp., Babiana stricta, Pinus sp., Picea sp., Larix sp., Phaseolus sp., Solanum sp., Vaccinium sp., Cyclamen sp., Iris sp., Pelargonium sp., Geranium sp., Pisum sp., Lathyrus sp., Clitoria sp., Catharanthus sp., Malvia sp., Mucuna sp., Vicia sp., Saintpaulia sp., Lagerstroemia sp., Tibouchina sp., Hypocalyptus sp., Rhododendron sp., Linum sp., Macroptilium sp., Hibiscus sp., Hydrangea sp., Ipomoea sp.;. Cymbidium sp.,

��� Millettia sp., Hedysarum sp., Lespedeza sp., Antigonon sp., Pisum sp., etc.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica FMT puede ser introducida y ser expresada en una planta transgénica en cualquier orientación proporcionando así un medio ya sea para convertir sustratos apropiados, si se sintetiza en la célula de la planta, en última instancia en derivados de peonidina, petunidina o malvidina u otros metil-flavonoides, o alternativamente para inhibir tal conversión de metabolitos por la reducción o eliminación endógena o actividad

���

existente de FMT. La producción de estas antocianinas u otros flavonoides modificarán el color del pétalo y pueden contribuir a la producción de un color más azul. La expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta puede ser constitutiva, inducible o de desarrollo y también puede ser específica de tejido. La palabra "expresión" se utiliza en su sentido más amplio para incluir la producción de ARN o de ambos ARN y proteína. También se extiende a expresión parcial de una molécula de ácido nucleico.

���

Los términos "planta modificada genéticamente" y "planta transgénica" se refiere a cualquier planta o progenie o posterior descendencia de estas o planta nueva propagada de manera vegetativa, que se ha transformado después de la introducción de novedosa secuencia de ácido nucleico utilizando apropiadas técnicas de biología molecular. Los dos términos se utilizan de manera intercambiable a través de toda la especificación. La secuencia de ácido nucleico puede ser derivada a partir de la misma o una diferente especie de planta a la que está siendo transformada. Se contempla

���

que el ácido nucleico podría codificar un polipéptido o ser complementario a una secuencia que codifica un polipéptido

o un mutante, derivado, parte, fragmento o porción de esta. De manera alternativa la secuencia de ácido nucleico puede ser de la región no-codificante de un genoma.

Las plantas modificadas genéticamente o transgénicas reveladas en este documento incluyen especies de horticultura y agricultura.

���

El término "especie de planta de horticultura" incluye pero no se limita a plantas de floricultura (por ejemplo, flores de corte, plantas con flores en macetas), plantas ornamentales (por ejemplo, plantas de hojas ornamentales) y todas las otras formas de horticultura (tales como, plantones, plantas de macetas, plantas de jardín).

El término "especie de planta de agricultura" incluye pero no se limita a alimentos extensivos y cultivos no-alimentos (por ejemplo, trigo, maíz, algodón, maíz, pasto), fruta, nuez y cultivos vegetales (por ejemplo manzanas, naranjas,

���

bananas, almendras, nueces, macadamias, zanahorias, guisantes, patatas, berenjenas, uvas, tomates) y viticultura.

De acuerdo con los conocimientos actuales existirá algún solapamiento entre las especies de plantas de horticultura y de agricultura.

Un método para producir una planta transgénica, tales como pero no limitando a, una planta de flores transgénica, capaz de sintetizar FMT se revela, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta

��� apropiada con una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicha FMT bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácido nucleico, la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico. La planta transgénica puede así producir FMT no-indígena a niveles elevados con respecto a la cantidad expresada en una planta no-transgénica comparable.

Adicionalmente un método para producir una planta transgénica con actividad de FMT existente o indígena reducida se

�� revela, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica una actividad de FMT, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico.

Un método para producir una planta modificada genéticamente con actividad de FMT existente o indígena reducida,

���

también se revela, dicho método que comprende alterar el gen de FMT a través de la modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga a partir de un gen de FMT alterado de forma apropiada o derivado o parte de este introducido en la célula de la planta, y regenerar la planta modificada genéticamente a partir de la célula.

Como se utiliza en este documento una enzima "indígena" es una, que es nativa o expresada naturalmente en una célula particular. Una enzima "no-indígena" es una enzima no nativa a la célula pero expresada a través de la

���

introducción de material genético en una célula de la planta; por ejemplo, a través de un transgen. Una enzima "endógena" es una enzima producida por una célula pero que puede o no ser indígena a aquella célula.

Un método para producir una planta transgénica, tal como pero no limitando a una planta de flores transgénica, que muestra propiedades de inflorescencia alteradas además se revela, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con una secuencia de ácido nucleico descrita en este documento,

���

regenerar una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia del ácido nucleico en una FMT. De manera alternativa, dicho método puede comprender transformar establemente una célula de una planta apropiada con una secuencia de ácido nucleico descrita en este documento o su secuencia complementaria, la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes

���

para alterar el nivel de actividad de la FMT indígena o existente. Preferiblemente el nivel alterado debería ser menor que el nivel de actividad de FMT indígena o existente en una planta no-transgénica comparable. Sin querer limitar la presente invención, una teoría de modo de acción es que la reducción de la actividad de FMT indígena necesita la expresión de la secuencia de ácido nucleico introducida o su secuencia complementaria. Sin embargo, la expresión de la secuencia genética introducida o su complemento no puede ser necesario para lograr el efecto deseado: es decir,

���

una planta de flores que muestra propiedades de inflorescencia alteradas.

El término "inflorescencia" como se utiliza en este documento se refiere a la parte de floración de una planta. Como se indica anteriormente, la referencia a una "planta transgénica" también se puede leer como una "planta modificada genéticamente".

Un método para producir una planta tal como pero no limitando a una planta de flores transgénica, que muestra

���

propiedades de inflorescencia alteradas, dicho método que comprende la alteración del gen de FMT a través de la modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga a partir de un gen de FMT alterado de forma apropiada o derivado o parte de este, introducido en la célula de la planta, y la regeneración de la planta modificada genéticamente a partir de la célula también se revela.

Preferiblemente, la inflorescencia modificada incluye la producción de diferentes tonos de flores azules o rojos u otros

���

colores, dependiendo del genotipo y las condiciones fisiológicas de la planta receptora.

Otro método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una FMT o parte de esta o que lleva una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm opcionalmente transcribible cuando se requiere para realizar la regulación de una FMT se revela, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con la molécula de

���

ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante, o complementaria a una secuencia que codifica, una FMT, cuando sea necesario bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula. Por "planta apropiada" se

entiende una planta capaz de producir antocianidina 3-glucósidos y que posee las propiedades fisiológicas apropiadas necesarias para el desarrollo del color deseado. Ejemplos de plantas apropiadas incluyen pero no se limitan a Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Catharanthus, Pelogonium, Orchid, grape, Euphorbia o Fuchsia

Alguien de habilidad en el oficio reconocerá inmediatamente las variaciones aplicables a los métodos revelados en este

�� documento, tales como incremento o disminución de la expresión de la enzima presente naturalmente en una planta diana conduce a diferentes tonos de colores tales como diferente tonos de azul, púrpura o rojo.

Las plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen toda o parte de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento, o las formas antisentido de estas y/o cualquier homólogo o forma relacionada de esta y, en particular, aquellas plantas transgénicas que muestran

���

propiedades de inflorescencia alteradas pueden ser producidas. Las plantas transgénicas pueden contener una molécula de ácido nucleico introducida que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica una FMT. Por lo general, el ácido nucleico sería introducido de forma estable en el genoma de la planta, aunque una secuencia de nucleótidos de FMT dentro de una secuencia de ácido nucleico de replicación de forma autónoma tales como un virus de ADN o ARN capaz de replicar dentro de la célula de la planta puede ser

���

introducida. Se revelan las semillas a partir de tales plantas transgénicas. Tales semillas, especialmente si son de color, son útiles como etiquetas de propiedad de las plantas.

Además, las plantas transgénicas o partes de plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento, o formas antisentido de estas y/o cualquier homólogos o forma relacionada de estas y, en particular, aquellas plantas transgénicas que

���

muestran partes aéreas modificadas de la planta tales como sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovarios, anteras o propiedades del tallo pueden ser producidos.

Uso de los extractos a partir de las plantas transgénicas o partes de las plantas transgénicas o progenie de las plantas transgénicas que contienen todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en este documento y, en particular, los extractos a partir de aquellas plantas transgénicas cuando se utilizan como un aditivo de alimentos o

���

aromatizante o producto para la salud o bebida o jugo o colorante, se revela.

Las partes de plantas reveladas incluyen flores, frutas, nueces, raíces, tallos, hojas o semillas.

Los extractos revelados pueden ser derivados a partir de las plantas o parte de la planta en un número de diferentes formas incluyendo extracción química o extracción por calor o filtración o exprimido o pulverización.

La planta, parte de planta o extracto puede ser utilizado en cualquier número de formas diferentes, como para la

���

producción de un aroma (por ejemplo una esencia de alimento), un aditivo de alimento (por ejemplo un estabilizador, un colorante) un producto para la salud (por ejemplo un antioxidante, una tableta) una bebida (por ejemplo vino, licor, té) o un jugo (por ejemplo jugo de fruta) o colorante (por ejemplo colorante para alimentos, colorante de fibras, tinte, pintura).

Las formas recombinantes de FMT también se revelan. Las formas recombinantes de la enzima proporcionarán una fuente de material para investigar el desarrollo, por ejemplo, enzimas más activas y pueden ser útiles para desarrollar

���

sistemas in vitro de producción de compuestos coloreados.

Las secuencias genéticas descritas en este documento pueden ser utilizados en la fabricación de una construcción genética capaz de expresar una FMT o reducir la expresión de una enzima de FMT indígena en una planta.

Un organismo procariota o eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una FMT de forma extracromosomal en forma de plásmido puede ser producido.

��� Adicionalmente, se revela un polipéptido recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se enuncia en SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:42

o SEQ ID NO:43 o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de similitud a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:12 o SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO:43 o un derivado de dicho polipéptido.

Un "polipéptido recombinante" significa un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos introducido en una célula directa o indirectamente por intervención humana o en un padre u otro pariente o precursor de la célula. Un polipéptido recombinante también se puede hacer utilizando sistemas de transcripción in vitro, libres de células. El término "polipéptido recombinante" incluye un polipéptido aislado o cuando está presente una célula o preparación de

�� células. También puede estar en una planta o partes de una planta regenerada a partir de una célula que produce dicho polipéptido.

Un "polipéptido" incluye un péptido o proteína y se abarca por el término "enzima".

El polipéptido recombinante también puede ser una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácidos heterólogas.

���

La presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT), en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende:

(i)

una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:11;

(ii)

una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad, después de la alineación óptima con SEQ ID

���

NO:11;

(iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor a SEQ ID NO:11 o su forma complementaria;

(iv)

una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12;

(v)

tener una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos al menos 70% de identidad

���

después de la alineación óptima con SEQ ID NO:12;

(vi)

una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor a la secuencia de nucleótidos en

(iv)

o (v) o su forma complementaria.

Además, una construcción genética y una planta modificada genéticamente o parte de esta o células de la misma que comprende un ácido nucleico de la invención, forma otro aspecto de la invención.

���

Las flores cortadas o separadas de la planta modificada genéticamente de la invención o progenie, la descendencia de progenie o líneas propagadas de manera vegetativa que comprenden una molécula de ácido nucleico no-indígena de la invención también se proporcionan.

Un método para producir una planta modificada genéticamente capaz de sintetizar FMT, o con una actividad de FMT indígena, reducida o existente, dicho método que comprende:

���

(a) con el fin de producir una planta capaz de sintetizar FMT, transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácido nucleico, la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico;

(b) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, transformar establemente una

���

célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario, cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico; o

(c) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, alterar un gen codificante de FMT a través de la modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga a partir de un ácido nucleico

���

alterado de forma apropiada introducido en la célula de la planta, y la regeneración de la planta modificada

genéticamente a partir de la célula se proporciona por la invención, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico de la invención.

Además, la invención proporciona un método para producir una planta modificada genéticamente con niveles alterados de FMT codificados en una molécula de ácido nucleico de la invención, dicho método que comprende introducir en una

�� célula o células de dicha planta una secuencia genética seleccionada de:

(i)

una secuencia antisentido para ARNm de FMT;

(ii)

una secuencia sentido para ADN de FMT; y/o

(iii) una secuencia que induce ARNi específico para ARNm de FMT; y la regeneración de una planta modificada genéticamente a partir de dicha célula.

���

Adicionalmente, la invención proporciona un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica una FMT o parte de esta o que lleva una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm opcionalmente transcribible cuando se requiere para realizar la regulación de una FMT, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con la molécula de ácido nucleico aislada de la invención cuando sea necesario bajo condiciones

���

que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y la regeneración de una planta transgénica a partir de la célula.

También se proporciona por la invención, una secuencia de oligonucleótidos aislada enunciada en SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33, una FMT recombinante aislada codificada por una molécula de ácido nucleico de la invención, una molécula de ácido nucleico de FMT recombinante aislada de la invención que comprende

���

una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas, un organismo procariota o eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de FMT de la invención extracromosomalmente en forma de plásmido y uso de una molécula de ácido nucleico de la invención en la fabricación de una planta modificada genéticamente.

La presente invención además se describe por los siguientes Ejemplos no-limitantes y Ejemplos comparativos.

EJEMPLO 1

��� Material vegetal

Las variedades de Petunia hybrida utilizadas se presentan en la Tabla 3.

TABLA 3

Genotipos de variedades de Petunia hybrida

Variedad de planta

Propiedades Fuente/Referencia

V23

An1, An2, An3, An4, An6, An8, An9, An10, ph1, Hf1, Hf2, ht1, Rt, po, Bl, Fl Wallroth et al. (Mol. Gen. Genet. 202: 6-15, 1986) Doodeman et al. (Theor. Appl. Genet. 67: 357-366, 1984)

R51

An1, An2, An3, an4, An6, An8, An9, An10, An11, Ph1, hf1, hf2, Ht1, rt, Po, bl, fl Wallroth et al. (1986), supra Doodeman et al.(1984), supra

VR

V23 x R51 F1 Híbrido

(continuación)

Genotipos de variedades de Petunia hybrida

Variedad de planta

Propiedades Fuente/Referencia

Br140

An1, An2, an4, an6/An6* Ph1, Ph2, Ph5, Hf1, Ht1, Rt, po, Mt1, mf1, mf2, Gf, fl INRA

Br140w

An1, An2, an4, an6*, Ph1, Ph2, Ph5, Hf1, Ht1, Rt, po, Mt1, mf1, mf2, plantas de flores blancas de una Br140 self Gf, fl

Br140p

An1, An2, an4, an6/An6*, Ph1, Ph2, Ph5, Hf1, Ht1, Rt, po, Mt1, mf1, mf2, Gf, fl plantas de flores púrpuras de un Br140 self

Old Glory Blue (OGB)

F1 Híbrido (variedad comercial) Ball Seed, USA

V26

An1, An2, An3, an4, An6, An8, An9, An10, An11, Ph1, ph2, Ph5, Hf1, hf2, Ht1, Rt, po, Bl, Gf, Mt1, Mt2, mf1, mf2, Fl INRA

W162

an1 Vrije Universiteit, Amsterdam

INRA = Instituto Nacional de Investigación Agronómica, Cedex, France

Plantas de petunia de OGB fueron cultivadas en cámaras de crecimiento especializados con una longitud de 14 hr por

�� día a una intensidad de luz de 10,000 lux y una temperatura de 22 a 26˚C. Las flores OGB fueron cosechadas en etapas de desarrollo definidas de la siguiente manera:Etapa 1: Brote cerrado, sin pigmentar (< 25 mm de longitud).

Etapa 2: Brote cerrado, pigmentado, (25-35 mm de longitud). Etapa 3: Brote púrpura oscuro con corola emergente (> 35 mm de longitud).

��� Etapa 4: Flor abierta púrpura oscuro antes de la dehiscencia de las anteras (> 50 mm de longitud). Etapa 5: Flor completamente abierta con toda la dehiscencia de las anteras.

EJEMPLO 2

Métodos Generales

En general, los siguientes métodos fueron como se describe en Sambrook et al. (1989), supra.

��� Transformación de E. coli

Las cepas de Escherichia coli utilizadas fueron:DH5� supE44, Δ(lacZYA-ArgF)U169, (ø801acZΔM15), hsdR17(rk -, mk +), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, deoR. (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557, 1983 and. Bethesda Res. Lab. Focus. 8(2): 9, 1986).

XLl-=Blue supE44, hsdR17(rk-, mk+), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, relA1, lac-,[F’proAB, lacIq, lacZΔM15, Tn10(tetR)] (Bullock et al., Biotechniques 5: 376, 1987).

�� PLK-F’ recA, hsdR17(rk-, mk+), mcrA, mcrB- lac-, supE44, galK2, galT22, metB1, [F’ proAB, laclq, lacZΔM15, Tn10 (tetR)) (Stratagene).

M15 E. coli se deriva de E. coli K12 y tiene el fenotipo Nals, Strs, Rifs, Thi-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+, Uvr+, Lon+

Los vectores de clonación pBluescript, pBluescribe y PCRscript fueron obtenidos de Stratagene. pCR 2.1 fue obtenido de Invitrogen.

��� Los vectores de expresión bacteriana pQE-30 y pREP4 fueron obtenidos de QIAGEN.

La transformación de las cepas E. coli fue llevada a cabo de acuerdo con el método de Inoue et a/., (Gene 96: 23-28, 1990).

Ligaciones de ADN

Las ligaciones de ADN se llevaron a cabo utilizando el Kit Amersham Ligation de acuerdo con los procedimientos

��� recomendados por el fabricante.

Aislamiento y purificación de los fragmentos

Los fragmentos por lo general se aislaron sobre un gel de agarosa al 1% peso/v y se purificaron utilizando el kit QIAEX II Gel Extraction (QIAGEN).

Reparación de los extremos salientes después de la digestión de restricción

��� Los extremos salientes 5’ fueron reparados utilizando ADN polimerasa (fragmento Klenow) de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989, supra). Los extremos salientes 3’ fueron reparados utilizando polimerasa de ADN T4 de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989, supra).

Eliminación de grupos fosforil de ácidos nucleicos

Fosfatasa alcalina del camarón (SAP) (USB) por lo general fue utilizado para eliminar los grupos fosforil a partir de los

��� vectores de clonación para prevenir la re-circularización de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Marcación de 32P de Sondas de ADN

Fragmentos de ADN (50 a 100 ng) fueron marcados radioactivamente con 50 µCi de [�-32P]-dCTP utilizando un kit Gigaprime (Geneworks). [�-32P]-dCTP no incorporado fue eliminado por cromatografía en una columna Sephadex G-50 (Fina).

��� Aislamiento del Plásmido

Se utilizó Helper phage R408 (Stratagene) para remover fagemidos pBluescript que contiene insertos de ADNc de petunia a partir de las bibliotecas de ADNc λZAP amplificadas utilizando métodos descritos por el fabricante. E. coli XL1-Blue fueron transfectados con la mezcla de fagemidos y las colonias se sembraron en placas sobre placas LB (Sambrook et al., 1989, supra) que contiene 100 µg/mL de ampicilina. Las colonias únicas fueron analizadas por

��� insertos de ADNc mediante el cultivo en caldo LB (Sambrook et al., 1989, supra) con ampicilina (100 µg/mL) (u otro antibiótico apropiado) y aislamiento del plásmido utilizando el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook et al., 1989, supra) o utilizando el sistema de purificación de ADN WizardPlus SV minipreps (PROMEGA). Una vez que la presencia de un inserto de ADNc ha sido determinado, grandes cantidades de ADN del plásmido fueron preparadas a partir de 50 mL de cultivo durante la noche utilizando un kit QIAfilter Plásmido midi (QIAGEN).

Análisis de Secuencia de ADN

La secuenciación de ADN fue llevada a cabo utilizando los Kits Primer Cycle Sequencing ABI PRISM (marca comercial

�� registrada) BigDye (marca comercial) de Applied Biosystems. Fueron seguidos los protocolos suministrados por el fabricante. Las reacciones de secuenciación por ciclos fueron realizadas utilizando un equipo de PCR Perkin Elmer (GeneAmp PCR System 9600). Las corridas de secuenciación fueron realizadas por AGRF (Australian Genome Research Facility) en WEHI (The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research) en Melbourne, Australia.

Las búsquedas de homología contra bases de datos Genbank, SWISS-PROT y EMBL fueron realizadas utilizando los

���

programas FASTA y TFASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448, 1988) o programas BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Los porcentajes de similitud de la secuencia fueron obtenidos utilizando el programa LFASTA (Pearson and Lipman, 1988, supra). En todos los casos, valores ktup de 6 para comparaciones de secuencias de nucleótidos y dos para comparaciones de secuencias de aminoácidos fueron utilizados, a menos que se especifique de otra manera.

���

Las alineaciones de secuencia múltiples y registro de dendogramas fueron producidos utilizando ClustalW (Thompson et al., Nucl. Acids Res. 2: 4673-4680, 1994).

EJEMPLO 3

Transformaciones de la planta

Transformaciones de agrobacterium tumefaciens

���

La cepa desactivada de Agrobacterium tumefaciens utilizada fue AGL0 (Lazo et al., Bioltechnology 9: 963-967, 1991).

El ADN del plásmido fue introducido en la cepa Agrobacterium tumefaciens AGL0, adicionando 5 µg de ADN del plásmido a 100 µL de células AGLO competentes preparadas mediante la inoculación de 50 mL de cultivo LB (Sambrook et al., 1989, supra) e incubación durante 16 horas con agitación a 28˚C. Las células a continuación fueron peletizadas y resuspendidas en 0.5mL de 85% v/v de CaCl2 100mM/15% v/v de glicerol. La mezcla ADN-Agrobacterium

���

fue congelada, mediante la incubación en N2 líquido durante 2 minutos y luego se dejan descongelar mediante la incubación a 37˚C durante 5 minutos. La mezcla ADN/bacteria, luego se coloca sobre hielo por otros 10 minutos. Las células, luego se mezclaron con 1 mL de medio LB (Sambrook et al., 1989 supra) y se incuban con agitación durante 16 horas a 28˚C. Las células de A. tumefaciens que llevan el plásmido fueron seleccionadas en placas de agar LB que contienen apropiados antibióticos tales como 50 µg/mL de tetraciclina o 100 µg/mL de gentamicina o 30 µg/mL de

���

canamicina. La confirmación del plásmido en A. tumefaciens se realizó mediante el mapeo de endonucleasas de restricción de ADN aislado a partir de los transformantes resistentes a los antibióticos.

Transformaciones de petunia hybrida

Como se describe en Holton et al. (Nature, 366: 276-279,1993) o Brugliera et al., (Planta J. 5, 81-92, 1994) por cualquier otro método bien conocido en el oficio.

��� (a) Material Vegetal

El tejido de hojas a partir de plantas maduras de P. hybrida cv VR fue tratado con 1.25% peso/v de hipoclorito de sodio durante 2 minutos y luego se aclara tres veces en agua estéril. El tejido de hojas, luego se cortó en cuadrados de 25 mm2 y se precultivó sobre medio MS (Murashige and Skoog, Physiol. Planta 15: 73-97, 1962) suplementado con 0.05 mg/L de quinetina y 1.0 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) durante 24 horas.

��� (b) Co-cultivo de Tejido de Agrobacterium y Petunia

La cepa de A. tumefaciens AGL0 (Lazo et al., 1991, supra) que contiene el vector binario fueron conservados a 4˚C sobre placas de agar de MG/L (Garfinkel and Nester, J. Bacteriol. 144:732-743, 1980) o LB (Sambrook et al., 1989, supra) (que contiene el antibiótico apropiado. Una sola colonia utilizada para inocular un cultivo líquido durante la noche que contiene 1% peso/v de Bacto-peptona, 0.5% peso/v de Bacto-extracto de levadura y 1% peso/v de NaCl. Una

�� concentración final de 5 x 108 células/mL se preparó el siguiente día por dilución en medio MS líquido que contiene vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158, 1968) y 3% peso/v sacarosa (BPM). Los discos de hojas se sumergen durante 2 minutos en BPM que contiene la AGL0 transformada como se describe anteriormente. Los discos de hojas luego fueron transferidos secos y se colocaron en medio de co-cultivo durante 4 días. El medio de co-cultivo consiste de medio SH (Schenk and Hildebrandt, Can. J. Bot. 50: 199-204, 1972) suplementado con 0.05 mg/L de

��� quinetina y 1.0 mg/L de 2,4-D e incluye una capa alimentadora de suspensión de células de tabaco esparcida sobre el medio de co-cultivo con un papel de filtro colocado sobre la parte superior de la suspensión de células de tabaco.

(c) Recuperación de plantas transgénicas de petunia

Después del co-cultivo, los discos de hojas fueron transferidos a medio -MS suplementado con 3% peso/v de sacarosa, 1 mg/L de (�-benzilaminopurina (BAP), 0.1 mg/L de ácido acético �-naftaleno (NAA), 2 pg/L de Clorsulfuron (Chem

���

Service), 350 mg/L de cefotaxima y 0.3% peso/v de Gelrite Gellan Gum (Schweizerhall) (medio de selección). La explantes de regeneración fueron transferidos a medio de selección fresco después de 4 semanas. Los brotes espontáneos que sobrevivieron la selección de Clorsulfuron fueron aislados y transferidos a BPM que contiene 2 mg/L de Chlorsulfuron (Chem Service) y 200 mg/L de cefotaxima para la inducción de raíces. Todos los cultivos fueron conservados bajo un fotoperiodo de 16 hr (60 mmol. m-2, s-1 luz fluorescente blanca fría) a 23 ± 2˚C. Cuando las

���

raíces alcanzaron 2-3 cm de longitud las plántulas de petunia transgénicas fueron transferidas a una mezcla para macetas autoclavada Debco 51410/2 en tubos de 8 cm. Después de 4 semanas las plantas fueron transferidas en macetas de 15 cm utilizando la misma mezcla para macetas y se mantuvieron a 23˚C bajo un fotoperiodo de 14 horas (300 mmol m-2, s-1 luz de halogenuro de mercurio).

Transformaciones de rosa hybrida

��� Como se describe en U.S. Patent No. 542,841 (PCT/US91/04412) o Robinson and Firoozabady (Scientia Horticulturae,

55: 83-99, 1993), Rout et al. (Scientia Horticulturae, 81: 201-238, 1999) o Marchant et al. (Molecular Breeding 4: 187194, 1998) o por cualquier otro método bien conocido en el oficio.

Los cortes de Rosa hybrida por lo general fueron obtenidos a partir de Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria, Australia o Keisei Roses, Japan

��� Codificación del color

La Carta de Color de Royal Horticultural Society (Kew, UK) se utilizó para proporcionar una descripción del color observado. Proporcionan un medio alternativo por el cual describir los fenotipos de color observados. Los números designados, sin embargo deberían ser tomados solo como una guía para los colores percibidos y no debería ser vista como limitante de los colores posibles, que se pueden obtener.

��� Preparaciones de la Construcción

TABLA 4 Abreviaturas utilizadas en la construcción de las preparaciones

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

35S 5’

~0.2 kb que incorpora el fragmento Bg/II que contiene la región promotora a partir del gen 35S del Virus Mosaico del Coliflor (CaMV 35S) (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980, Guilley et al., Cell, 30: 763-773. 1982)

(continuación)

ABREVIATURA

DESCRIPCIÓN

e35S 5’

Fragmento de ~0.7 kb que incorpora un promotor 35S CaMV mejorado (Mitsuhashi et al. Planta Cell Physiol. 37: 49-59, 1996)

GUS

secuencia codificante �-glucuronidasa (Jefferson, et al., EMBO J. 6: 3901-3907, 1987)

Mac

Promotor híbrido que consiste del promotor a partir del gen mas y una región potenciadora CaMV35S (Comai et al., Planta Mol. Biol. 15:373-381, 1990)

nos 5’

Región promotora, a partir del gen sintasa nopalina de A. tumefaciens (Depicker, A. et al., J Mol. and Appl. Genetics, 1: 561-573, 1982)

nos3’

Región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de A. tumefaciens (Depicker, A. et al., 1982, supra)

nptII

Gen de resistencia de la canamicina (codifica la neomicina fosfotransferasa que desactiva los antibióticos aminoglucósidos tales como canamicina, neomicina y G418)

ocs 3’

Región terminadora a partir del gen sintasa octopina de A. tumefaciens (descrito en Klee et al., Bio/Technology 3: 637-642, 1985)

petD8 3’

Fragmento de ~0.8 kb que incorpora la región terminadora a partir del gen de proteína de transferencia de fosfolípido (D8) de Petunia hybrida cv. OGB (Holton, 1992, supra)

SuRB

Gen de resistencia del clorsulfuron (codifica Acetolactato Sintasa) con su propio terminador a partir de Nicotiana tabacum (Lee et al., EMBO J. 7: 1241-1248, 1988)

BP#40 o Viola F3’5’H

Fragmento de ~1.7kb que contiene clon de ADNc F3’5’H a partir de Viola sp. cultivar black Pansy. (Australian Provisional Patent Applications No. 2002951088 y 2002952835 titulada "Genetic Sequences and uses therefor", 2002)

PFMT

Fragmento de ~1.0 kb que incorpora el clon de ADNc E20 Petunia flavonoide metiltransferasa (inter alia)

TFMT

Fragmento ~1.0 kb que incorpora el clon de ADNc Torenia flavonoide metiltransferasa (inter alia)

FFMT

Fragmento ~1.0 kb que incorpora el clon de ADNc Fuchsia flavonoide metiltransferasa (inter alia)

EJEMPLO 4

�� Incubación de pétalos removidos por incisión con precursores o productos de terminación

Los reportes en la literatura sugieren que de las seis antocianidinas que ocurren principalmente encontradas en la naturaleza (Tabla 5), el grado de "azulado" de una antocianidina individual se influencia por el patrón de hidroxilación y/o metilación en el anillo de la antocianina "B". Sin embargo, en soluciones de HCl/MeOH al 0.01% (v/v) la delfinidina tiene un valor de λmax mayor que la peonidina o malvidina y parece así la más azul de las seis antocianidinas.

TABLA 5

Valores λmax (en nm) de las principales antocianidinas

ANTOCIANIDINA

λmax nm*

Pelargonidina

520

Cianidina

535

Peonidina

532

Delfinidina

546

Petunidina

543

Malvidina

542

λmax nm* longitud de onda de absorción máxima en 0.01% de HCl/MeOH (v/v)

Los datos revisados por Haslam (Practical Phenolics. From structure to molecular recognition and physiological action. Cambridge University Press, UK, 1998).

�� Los experimentos fueron establecidos para determinar si, la producción de la delfinidina o su derivado metilado, malvidina darían lugar a nuevos colores en pétalos de rosas. Para determinar si los pétalos de rosa contenían las enzimas necesarias para la conversión de dihidromiricetina a delfinidina, experimentos de alimentación del precursor con dihidromiricetina fueron iniciados.

Los segmentos de pétalos de una selección de variedades comerciales de rosas (Toplesse, Lambada, Medeo, Pamela,

���

Sonia, Oceana, Mystique) se colocaron en soluciones de 1-2 mg/mL de dihidromirectina o agua sola y se incuban por alrededor de 16 horas en un cuarto de crecimiento a una temperatura de alrededor de 23˚C. Los colores rosa/púrpura fueron observados cerca de los bordes cortados de los pétalos (Tabla 6). El análisis de TLC de las antocianidinas en los segmentos rosa/púrpura reveló la producción de delfinidina. Estos resultados confirmaron que las enzimas de la ruta de antocianina de rosas fueron capaces de convertir la dihidromiricetina a delfinidina.

���

TABLA 6

Colores producidos en pétalos de rosas después de la incubación en dihidromiricetina (el precursor de pigmentos basados en la delfinidina)

Variedad de rosa

Color de pétalos de rosas Color en el borde del corte después de la incubación en DHM

Toplesse

rosa rosa/púrpura

Lambada

naranja rosa/púrpura

Medeo

albaricoque pálido rosa/púrpura

(continuación)

Colores producidos en pétalos de rosas después de la incubación en dihidromiricetina (el precursor de pigmentos basados en la delfinidina)

Variedad de rosa

Color de pétalos de rosas Color en el borde del corte después de la incubación en DHM

Pamela

blanco/rosa pálido rosa/púrpura

Sonia

albaricoque/rosa rosa/púrpura

Oceana

crema rosa/púrpura

Mystique

albaricoque rosa/púrpura

DHM = dihidromiricetina

Los pétalos de rosas a partir de Toplesse y Lambada, posteriormente fueron incubados con malvidina 3, 5-diglucósido

�� para determinar el color que se puede obtener si esta nueva antocianina se produjera en una rosa vía la introducción de un gen de flavonoide 3’ 5’ hidroxilasa de producción de pigmentos basados en la delfinidina y un gen del flavonoide 3’ 5’ metiltransferasa (o los genes flavonoide 3’ metiltransferasa y flavonoide 5’ metiltransferasa) para la posterior conversión a pigmentos basados en malvidina.

Los segmentos de pétalos de rosas se colocaron en soluciones de 1-2 mg/mL de malvidina 3, 5-diglucósido, 1-2 mg/mL

���

de dihidromirectina o agua solo y se incubaron por alrededor de 16 horas en un cuarto de crecimiento a una temperatura de alrededor de 23˚C. La producción de colores en el rango púrpura fue observada cerca de los bordes cortados de los pétalos bajo incubación con dihidromirectina o malvidina 3, 5-diglucósido (Tabla 7). Sin embargo una comparación directa de los colores observados con la producción de delfinidina en los pétalos de rosa a la acumulación de malvidina en el mismo fondo de rosa sorprendentemente reveló que los pigmentos de malvidina resultaron en

���

colores más azules.

TABLA 7

Colores observados en pétalos de rosas después de la incubación en dihidromiricetina (el precursor de pigmentos basados en la delfinidina) o en malvidina 3, 5-diglucósido

Variedad de rosa

Color de pétalos Color en el borde del corte bajo la producción de delfimidina Color en el borde del corte después de la incubación con malvidina

Toplesse

rosa rosa/púrpura violeta/púrpura

Lambada

naranja rosa/púrpura violeta/púrpura

Experimentos de reconstrucción

Los experimentos de reconstrucción con extractos de pétalos de rosa y varias antocianinas fueron realizadas para

��� predecir el color que debería ser producido en rosas bajo la producción de delfinidina o pigmentos basados en la malvidina.

La variedad de rosa Medeo por lo general produce flores de color crema a albaricoque pálido (RHSCC 158C a 159A). El análisis HPLC de las antocianidinas y flavonoles acumulados en pétalos de rosa Medeo reveló que los pétalos acumulan altos niveles de flavonoles (2.32 mg/g de campferol, 0.03 mg/g de quercetina) y muy bajos niveles de antocianinas (0.004 mg/g de cianidina, 0.004 mg/g de pelargonidina). El pH vacuolar estimado de pétalos de Medeo es

�� alrededor de 4.6. El jugo de pétalos de rosas de Medeo fue extraído moliendo un pétalo con 50 µL de agua utilizando un mortero y mano de mortero. El jugo de pétalo se recolectó y mezcló con 10-20 µL de 1-2 mg/g de delfinidina 3glucósido, delfinidina 3,5-diglucósido y malvidina 3, 5-diglucósido. Los colores observados fueron descritos de acuerdo con the Royal Horticultural Society Color Charts (RHSCC) (The Royal Horticultural Society, London) (Tabla 8).

TABLA 8

Colores observados tras la adición de delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3, 5-diglucósido o malvidina 3, 5diglucósido al jugo de pétalo extraído de pétalos de rosa Medeo

ANTOCIANINA

pH # RHSCC COLOR

D3G

4.9 74A rojo-púrpura

D35G

4.9 88A violeta

D35G

4.6 88A violeta

M35G

4.9 90A violeta-azul

M35G

4.6 88A/90A violeta-azul

D3G = delfinidina 3-glucósido, D35G = delfinidina 3, 5-diglucósido M35G = malvidina 3, 5-diglucósido

Basándose en el valor λmax (Tabla 5), se asumió que la producción de los pigmentos de delfinidina en pétalos de rosas resultarían en un color más azul que la producción de pigmentos de malvidina. Sin embargo, a partir de los experimentos de alimentación y reconstrucción detallada anteriormente es claro que la producción de pigmentos basados en la malvidina en pétalos de rosas conducirá a colores más azules aquellos de los pigmentos basados en la

��� delfinidina.

EJEMPLO 5

Aislamiento de un clon de ADNc S-adenosil-L-metionina: flavonoide metiltransferasa (FMT) parcial a partir de Petunia hybrida

Construcción y detección de una biblioteca de ADNc de pétalos de P. hybrida cy. V26

���

Una biblioteca de ADNc fue construida basándose en ARNm a partir de tejido de la extremidad de la corola de la línea V26 (An1+) (Kroon et al., Plant J 5: 69-80, 1994). Alrededor de 30,000 ufp de la biblioteca de ADNc floral V26 se sembraron en placas a una densidad de 800 ufp por placa de 90 mm. Las elevaciones por duplicado de estas fueron tomadas en Hybond-N membranas (Amersham) y se trataron según las recomendaciones del fabricante. Los filtros fueron hibridizados con primera cadena de ADNc a partir de una línea An1+ + (V26) y una an1- (W162). Las

���

condiciones de hibridación incluyeron una etapa de prehibridación en 50% v/v de formamida, 5 x SSPE, 5 x de Denhardt, 0:1% peso/v de SDS, 100 µg/mL de ADN de esperma de arenque a 42˚C durante 3 horas. Para la hibridación 1.0 x 108 cpm de primera cadena de ADNc 32P-etiquetada y 100 µg de poly (A) fueron adicionados y la

incubación se continúo durante 16-48 horas a 42˚C. Los filtros se lavaron en 1 x SSC/0.1% peso/v de SDS a 60˚C por 30 minutos y luego se exponen a película Kodak XAR durante 3 a 4 días. Doscientos setenta unidades formadoras de placas (ufp) de 30,000 mostraron hibridación sustancialmente más fuerte para la sonda An1+ ADNc que para la sonda an1- ADNc. De estas, 35 que no hibridizaron a los genes de pigmentación clonados previamente (chs, chi y dfr) se

�� purificaron a homogeneidad. Las hibridaciones de parejas cruzadas demostraron que estos 35 clones representaron 7 diferentes clases de genes-difA, difC, dijE, difF, difG, difH y difI. El gen difG posteriormente se ha demostrado que representa el gen Rt de Petunia hybrida (Kroon et al., 1994, supra). Se demostró que los perfiles de expresión de las 6 clases restantes mostraron un control espacial, temporal y genético similar al de difG (Kroon et al., 1994, supra).

Posteriormente se demostró que el clon difC representa el gen de antocianidina 3-rutinósido aciltransferasa (AR-AT) de

���

Petunia hybrida (International Application No. PCT/AU01/00358; International Publication No. WO 01/72984).

Se demostró que el clon difE era alrededor de 1kb y el plásmido se le asignó la designación pCGP1903 (Figura 2). La secuencia completa del clon de ADNc difE (SEQ ID NO:1) (contenido en pCGP1903) se determinó mediante la compilación de secuencias de diferentes subclones pUC18 obtenidos utilizando procedimientos estándar para la generación de clones solapantes aleatoriamente (Sambrook et al., 1989, supra). Las búsquedas Blast contra

���

secuencias en la base de datos GenBank revelaron similitudes a mARNs de cafeoil-CoA O-metiltransferasa. (por ejemplo 84% de identidad sobre un lapso de 92 bp de cafeoil-CoA O-metiltransferasa Mesembryanthemum crystallinum (AF053553)).

El análisis RFLP indicó que el clon difE fue ligado a los locus Hf2 y Po (5 cruces de las 33 plantas con el locus Po y 8 cruces con Hf2 de 34 plantas) en el cromosoma V y así fue un candidato para el gen Mt2 o Mf2. Las transferencias en

���

gel de ARN posteriormente se llevaron a cabo en varias mutantes Mf y Mt y se demostró que cuatro-mutantes dobles (mf1-, mf2-, mtl-, mt2-) carecen de transcripciones que hibridizan a difE, mientras que las líneas dominantes de uno o más de estos locus contuvieron transcripciones difE. Esto sugiere que el clon difE codificado de un flavonoide metiltransferasa y que las diferentes transcripciones de FMT hibridizan en cruz. El clon difE fue seleccionado para otros análisis.

���

EJEMPLO 6

Aislamiento de un clon de ADNc de FMT de longitud completa a partir de Petunia hybrida cv Old Glory Blue (OGB)

Construcción de biblioteca de ADNc de Pétalo de OGB

ARN total fue aislado a partir del tejido de pétalo de la etapa P. hybrida cv Old Glory Blue (OGB) 3 a 4 flores utilizando

���

el método de Turpen and Griffith (BioTechniques 4: 11-15, 1986). Poly(A)+ ARN fue seleccionada del ARN total por tres ciclos de cromatografía de oligo-dT celulosa (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408, 1972).

Dos microgramos de poly(A)+ARN fueron transcritos en reverso en un volumen de reacción de 20µL que contiene 1 x Superscript (marca comercial) solución reguladora de reacción ditiotreitol 10 µM, dATP 500 µM, dGTP 500 µM, dTTP 500 µM, 5-metil-dCTP 500 µM, 0.75 µg de oligonucleótido (5’

���

GAGAGAGAGAGAGAGAGAGATCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT) [SEQ ID NO:3] y 2 µL de Superscript (marca comercial) transcriptasa reversa (BRL). La mezcla de reacción se incubó a 37˚C durante 50 minutos, 44˚C por 10 minutos y luego se colocó sobre hielo.

Una segunda mezcla de reacción de cadena (140 µL) fue adicionada a la primera mezcla de reacción de cadena. La segunda mezcla de reacción de cadena consistió de Tris-HCl 21 mM, KCl 104 mM, MgCl2 5.3 mM, �-NAD 171 µM , ��� (NH4)2SO4 11.4 mM, dATP 214 µM, dCTP 642 µM, dGTP 214 µM, dTTP 214 µM, 4 mM DTT, 10 �Ci 32P-dCTP (3000 Ci/mMole), 15 unidades de ligasa de ADN de E. coli, 40 unidades de polimerasa I de ADN de E. coli (Boehringer) y 0.8 unidades de RNAsa H. La mezcla final se incubó durante 150 minutos a 16˚C. Para fabricar el ADNc de doble cadena romo, 10 unidades de polimerasa de ADN T4 fueron adicionadas, y la reacción continúa por otros 15 minutos a 16˚C. La reacción se detuvo y el ADNc se purificó por extracción fenol/cloroformo, seguido por extracción con cloroformo y

���

precipitación con etanol.

Los adaptadores EcoRI (Promega) fueron ligados con el ADNc y luego quinasa utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. Las enzimas fueron desnaturalizadas por calor (70˚C, 20 minutos) y el ADN se purificó por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El ADNc fue digerido con 50 unidades de endonucleasa de restricción XhoI (Boehringer Mannheim) en un volumen de reacción de 100 µL, utilizando las condiciones

�� recomendadas por el fabricante. La enzima fue muerta por calor (70˚C, 20 minutos) y la mezcla se pasó a través de una columna S400 spin (Pharmacia) que ha sido equilibrada en solución reguladora STE (Sambrook et al., 1989, supra). El eluato fue extraído con fenol/cloroformo y precipitado con etanol. Después de la microcentrifugación a 4˚C durante 30 minutos el pellet de ADNc resultante se aclaró con 70% v/v de etanol, se secó al ambiente y se resuspendió en 10 µL de solución reguladora TE (Tris-HCl 1 mM (pH 7.5), 1 mM EDTA).

���

Una alícuota de 2.5 µL de la mezcla de ADNc resuspendida fue ligada con 1 µg de vector tratado λZAPII EcoRI/XhoI/CIAP (fosfatasa alcalina intestinal de bovino) (Stratagene) en 5 µL de solución reguladora de reacción que consiste de Tris-HCl 50 mM (pH 7.0), MgCl2 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 1 mM y 2 unidades de ligasa de ADN T4. La reacción se llevó a cabo a 4˚C durante 4 días.

Después de una posterior incubación a temperatura ambiente por dos horas, la mezcla de reacción de ligación fue

���

empacada utilizando el sistema Packagene (Promega). El número total de recombinantes fue 1 x 106 ufp.

Después de la transfección de las células PLK-F’, el λZAPII/ADNc empacado se sembró en placas a 50,000 ufp por placa de petri de 15 cm de diámetro. Las placas se incubaron a 37˚C por ocho horas, y el fago fueron eluidos en NaCl 100 mM, MgSO4 8 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0, 0.01% de gelatina (Solución reguladora de Almacenamiento de Fago (PSB)). El cloroformo fue adicionado y el fago se almacenó a 4˚C como una biblioteca amplificada.

���

40,000 ufp de la biblioteca amplificada se sembraron en placas, en placas NZY (Sambrook et al., 1989, supra) a una densidad de 20,000 ufp por placa de 15 cm después de la transfección de las células XL1-Blue MRF’, y se incuban a 37˚C durante 8 horas. Después de una posterior incubación a 4˚C durante la noche, las elevaciones por duplicado fueron tomadas en filtros Colony/Plaque Screen (marca comercial) (DuPont) que luego fueron tratados según las recomendaciones del fabricante.

���

Selección de biblioteca OGB

Antes de la hibridación, las elevaciones de placas por duplicado se lavaron en solución de pre-lavado (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, 0.1% peso/v de sarcosina) a 65˚C durante 30 minutos; despojado en hidróxido de sodio

0.4 M a 65˚C durante 30 minutos; luego se lavaron en una solución de Tris-HCl 0.2 M pH 8.0, 0.1 X SSC, 0.1% peso/v de SDS a 65˚C durante 30 minutos y finalmente se enjuaga en 2 x SSC, 1.0% peso/v de SDS.

���

Las elevaciones por duplicado a partir de la biblioteca de ADNc de pétalos de OGB fueron seleccionados con los fragmentos 32P-marcados de un fragmento EcoRI/ XhoI difE a partir de pCGP1903 (Figura 2).

Las condiciones de hibridación incluyeron una etapa de prehibridación en 50% v/v de formamida, NaCl 1 M, 10% peso/v de dextrán sulfato, 1% peso/v de SDS a 42˚C por al menos 1 hora. Los fragmentos 32P-etiquetada (a 1 x 106 cpm/mL) luego fueron adicionados a la solución de hibridación y la hibridación se continuó a 42˚C por otras 16 horas.

���

Los filtros luego se lavaron en 2 x SSC, 1% peso/v de SDS a 42˚C por 2 x 30 minutos seguido por un lavado en 0.2 x SSC, 1% peso/v de SDS a 65˚C durante 30 minutos y se expone a una película de Kodak XAR con una pantalla de intensificación a -70˚C durante 4 horas.

Cuarenta y cinco placas de hibridación (designadas como E1 a E45) fueron recogidas en PSB. Estas se volvieron a seleccionar para aislar clones puros, utilizando las condiciones de hibridación como se describe para la selección inicial

���

de la biblioteca de ADNc. El contenido de plásmidos en el vector bacteriofago λZAP fue rescatado y los datos de secuencia fueron generados a partir de los extremos 3’ y 5’ de los insertos de ADNc. De estas E20 y E33 representan los mayores clones de ADNc (~1.0kb y 0.9kb, respectivamente) y los plásmidos fueron designados pCGP1907 y pCGP1908 (Figuras 3 y 4, respectivamente).

���

pCGP1907 y pCGP1908, respectivamente) se determinó mediante la compilación de secuencia generada utilizando

La secuencia de nucleótidos completa de los clones de ADNc E20 y E33 (SEQ ID NOs:4 y 6) (contenidos en cebadores M13 -21 y reverso M13 disponibles comercialmente junto con un cebador específico de MT de Petunia 1903F (5’ CTT GCT TTG CCA GAA GAT GG 3’) [SEQ ID NO:8]. El clon de ADNc E20 fue 888 bp de longitud y contenido a marco de lectura abierto putativa de 789 bases que codifican un polipéptido putativo de 263 aminoácidos (SEQ ID NO:5). La secuencia E20 fue idéntica a la secuencia difE de más de 822 bp con el clon de ADNc E20 que

�� tiene un extra de 27bp de secuencia 5’ no traducida y una reducción de 96 bp de secuencia no traducida 3’ en comparación con la secuencia difE.

La secuencia de E33 tuvo 1076 bp de longitud y contenía un codón de terminación en marco en la posición 469 (SEQ ID NO:6). La secuencia de E20 comparte 82% de identidad sobre 797 bp con la secuencia E33 en el nivel de nucleótido. Una alineación de la secuencia de nucleótidos E33 con aquella de la secuencia E20 reveló una deleción

���

aparente de 2 nucleótidos ("CT") en la secuencia E33 resultando en un codón de terminación en marco. Puede ser que el clon E33 en el cultivo de OGB fue derivado a partir de un gen mutado. Con el fin de examinar la presunta secuencia de aminoácidos deducida del gen no-mutado representado por el clon E33, 2 nucleótidos ("CT") fueron adicionados a la secuencia E33 para producir la secuencia de nucleótidos corregida de E33 (SEQ ID NO:26). La secuencia de aminoácidos deducida se representa por SEQ ID NO:7. La secuencia de aminoácidos corregida de E33 comparte un

���

82% de identidad con la secuencia E20 sobre un solapamiento de 243 aminoácidos.

Una comparación de la secuencia de nucleótidos traducida de E20 con las secuencias en la base de datos GenBank reveló la similitud con varias cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasas. Por ejemplo, 60% de identidad en 227 aminoácidos con Cafeoil-CoA 3-O-metiltransferasa a partir de Populus kitakamiensis (Genbank número de acceso AB000408) y 53% de identidad en 238 aminoácidos de una trans-cafeoil-CoA 3-O-metiytransferasa (CCOFMT) (CCOAOMT) a partir de

���

Petroselinum crispum (Genbank número de acceso A40975).

EJEMPLO 7

Actividad de metiltransferasa del clon de ADNc de FMT de Petunia (E20) expresado en E. coli

Para confirmar si el clon de ADNc de E20 de Petunia codificado de una FMT funcional fue expresado en un sistema de expresión E. coli y se evalúa por actividad de FMT.

��� Clonación de E20 en vector de expresión de E. coli pQE30 (Construcción de pCGP3086)

Con el fin de clonar el clon E20 de la Petunia (PFMT) en un vector de expresión de E. coli, pQE30 (QIAGEN), un sitio de endonucleasa de restricción BamHI fue necesario en el ATG iniciador de la traducción y un sitio de endonucleasa de restricción PstI fue necesario inmediatamente 3’ al codón de terminación putativo.

Los oligonucleótidos 1907BamHI F [SEQ ID NO:9] y 1907PstI R (SEQ ID NO:10) (Tabla 9) fueron utilizados como

���

cebadores con pCGP1907 como plantilla para amplificar el clon de FMT de Petunia (E20) con un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción BamHI en lugar del inicio AUG y un sitio de endonucleasa de restricción -PstI de reconocimiento justo después del codón de terminación putativo. Las condiciones de PCR incluyeron 5 µL 10 x PfuTurbo solución reguladora de Polimerasa de ADN (Stratagene), 2 µL dNTPs 10 mM, 2 µL de 20µ/µL de 1907BamHI F [SEQ.ID NO:9], 2 µL 20 µ/uL de 1907PstI R [SEQ ID NO: 10], 1 µL de 1 µg/µL de pCGP1907 plantilla, 37 µL de agua

���

pura y 1 µL de Polimerasa de ADN PfuTurbo (Stratagene). La PCR se incubó a 95˚C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94˚C durante 30 segundos, 60˚C durante 30 segundos y 72˚C por 1 minuto y luego una incubación final a 72˚C durante 10 minutos con un posterior almacenamient a 4˚C.

TABLA 9

Oligonucleótidos utilizados en la clonación del clon de ADNc de E20 en el vector de expresión bacteriana pQE30

SEQ ID NO:

NOMBRE SECUENCIA

9

1907BamHI F GCATGGATCCACAGGCAAAACCGCCCACCCTG

10

1907PstI R GCAT CTG CAG CTA GGA GAG ACG CCT GCA AAG

Los productos de PCR resultantes fueron sometidos a electroforesis a través de un gel de agarosa 1% peso/v y una banda de 0.72 kb fue aislada y se purificó utilizando un kit de Extracción de Gel QIAEX II (QIAGEN) de acuerdo con las

�� recomendaciones del fabricante. Los productos aislados luego fueron digeridos con la endonucleasa de restricción PstI. El producto de digestión se purificó utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) y luego fue digerido con la endonucleasa de restricción BamHI. Los productos digeridos BamHI/PstI finalmente se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) y posteriormente se liga con los extremos BamHI/PstI del vector pQE30 (QIAGEN) utilizando un Kit de Ligación de ADN (Amersham) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los

���

transformantes fueron analizados para la presencia del inserto específico de 0.72 kb utilizando los digeridos de endonucleasa de restricción BamHI/PstI. La secuencia del inserto fue confirmada por análisis de secuencias utilizando un pQE Sequencing-Primer Set (QIAGEN). El plásmido resultante fue denominado pCGP3086 (mut-E20 in pQE30) (Figura 5).

Como consecuencia del uso de los oligonucleótidos 1.907BamHI F [SEQ ID NO: 9] y 1907PstR [SEQ ID NO: 10] como

���

cebadores en la PCR y de la clonación posterior del producto en pQE30, la secuencia del clon de E20 de Petunia fue modificado alrededor de la metionina de inicio putativa de los polipéptidos codificados. Como consecuencia los aminoácidos esperados alrededor de la metionina de inicio putativa fueron cambiados de "M T G K T A H P" a "M R G S H H H H H H G S T G K T A H P".

De acuerdo con el fabricante, "el 6 x His-tag es mucho más pequeño que otros tags de afinidad y no tiene carga a pH

���

fisiológico. Rara vez altera o contribuye a la inmunogenicidad de la proteína, rara vez interfiere con la estructura o función de la proteína, no interfiere con la secreción, no requiere la eliminación por división de la proteasa, y es compatible con sistemas de solución reguladora desnaturalizante". (QIAGEN website, http://www.qiagen.com).

Para el análisis de actividad de la metiltransferasa del clon E20, pCGP3086 posteriormente fue introducido en células de E. coli M15 (pREP4) (QIAGEN) de acuerdo con el método de Inoue et al., 1990, supra 10 mL de LB que contiene

���

ampicilina a 100 µg/mL (LB/Amp100) fue inoculado con una sola colonia de pCGP3086 en células M15/pREP4 y se incuban a 37˚C con agitación durante 16 horas. Un mililitro de este cultivo luego fue utilizado para inocular 25 mL LB/Amp100. El cultivo se incubó a 37˚C con agitación durante alrededor de 2 horas hasta que la Absorbancia a 600 nm (A600) fue entre 0.5 a 0:7. Luego fue adicionada IPTG (iso-propil-�-D-tiogalactosida) a una concentración final de 1 mM y el cultivo además se incubó a 37˚C con agitación, con alícuotas de 1.5 mL que se retiran a 0, 1, 2 y 5 horas después

���

de la adición de IPTG.

El contenido de células en cada alícuota posteriormente fue peletizado por centrifugación y luego se resuspendió en 50 µL de solución reguladora de desnaturalización urea 8M (urea 8M, NaH2PO4 0.1.M, Tris-HCl 0.01M, pH 8). Los lisados fueron centrifugados a 14,000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para peletizar los restos celulares. Los extractos de proteína cruda fueron desnaturalizados por ebullición en 10% de glicerol, 3% peso/v de sodio dodecil

��� sulfato (SDS), 3% de �-mercaptoetanol (BME) y 0.025% de azul de bromofenol y luego se somete a electroforesis a través de geles de SDS PAGE prefabricados (12% de resolución, 4% de gel de carga) (Ready Gels, BIORAD) en una solución reguladora de corrida compuesta por Tris-HCl 25 mM, pH 8.3, glicina 192 mM, 0.1% peso/v de SDS a 120V durante 80 min. Los estándares incluyeron marcadores de Rango Bajo preteñidos (BIORAD) que contienen muestras de proteína estándar de 116 kDa, 80 kDa, 51.8 kDa y 34.7 kDa.

Las proteínas fueron visualizadas por la tinción con Azul Brillante de Coomassie (CBB) (0.25% peso/v de CBB, 45% v/v de metanol. 10% v/v de ácido acético). Una banda teñida fuertemente del tamaño esperado para una fusión His-Tag de proteína de FMT de Petunia (E20) fue detectado a 27.5 kDa. Las proteínas sobre un gel de SDS-PAGE por duplicado para aquel descrito anteriormente también fueron electro-transferidos a una membrana Immun-blot PVDF (BIORAD) a

�� 4˚C en una solución reguladora de Tris-HCl 25 mM pH 8.3, 20% de metanol y glicina 192 mM a 100V durante 60 min. La presencia del His-tag fusionado a la proteína específica codificada por el clon de ADNc E20 en pCGP3086 fue confirmada por la detección con un conjugado Ni-NTA-AP (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Fue detectada una banda de proteína teñida fuertemente, se estimó que era de 27.5 kDa confirmando la presencia y un alto nivel de expresión de la proteína E20 recombinante. Ninguna de las bandas fue visible en el control pQE30, bajo

��� estas condiciones de detección.

Preparación de extractos de proteína cruda

10 mLs de ampicilina que contiene LB a 100 µg/mL y canamicina a 25 µg/mL (LB/Amp100 + Kan25) fueron inoculados con una sola colonia de pCGP3086 o pQE30 en células M15 (pREP4). El cultivo se incubó a 30˚C con agitación durante 16 horas. 2.5 mL de este cultivo luego fueron adicionados a 25 mL de LB/Amp100+Kan25 fresco y el cultivo inoculado

���

recientemente se incubó a 30˚C con agitación hasta que una A600 de 0.5 a 0.7 fue alcanzada. A continuación fue adicionada IPTG a una concentración final de 1mM y el cultivo además se incubó a 30˚C con agitación durante 8 horas. Las células fueron peletizadas por centrifugación a 3500 rpm durante 10 minutos a 4˚C. El pellet se volvió a resuspender en 1 mL de NaPi 0.1 M, pH 7.5, MgCl2 4 mM. El lisozima preparado recientemente luego fue adicionado a una concentración final de 1mg/mL y la mezcla se incubó sobre hielo durante 30 minutos. La mezcla luego fue sonicada

���

durante dos estallidos de 10 segundos en la salida 2-3 y luego se incuban sobre hielo durante 30 minutos. Los residuos celulares fueron peletizados por centrifugación a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4˚C. El sobrenadante se pasó a través de una columna NAP-10 (Pharmacia) y 1.5mL de la muestra se recolectó en NaPi 0.1M, pH7.5, MgCl2 4mM.

Actividad de metiltransferasa

La actividad de la enzima del clon E20 de Petunia contenido en pCGP3086 inicialmente fue evaluado utilizando los

��� sustratos delfinidina 3’-glucósido y delfinidina 3-rutinósido bajo las condiciones de ensayo descritas en Jonsson et al. (1983), supra.

Los ensayos de metiltransferasa fueron establecidos de acuerdo con la Tabla 10 en un volumen de reacción total de 50 µL.

TABLA 10:

Composición de ensayo de metiltransferasa utilizando homogenatos crudos a partir de cultivos bacterianos que contienen los plásmidos pCGP3086 (E20) o pQE30 (control).

#

Plásmido Homogenato crudo (µL) 3 mg/mL D3R (µL) 3 mg/mL D3G (µL) 14C-SAM µL (µL) Solución reguladora (µL)

1

pQE30 20 5 0 5 20

2

pQE30 20 - 5 5 20

3

pQE30 20 5 0 0 25

4

pQE30 20 0 5 0 25

5

pQE30 20 0 0 5 25

(continuación)

Composición de ensayo de metiltransferasa utilizando homogenatos crudos a partir de cultivos bacterianos que contienen los plásmidos pCGP3086 (E20) o pQE30 (control).

6

ninguno 0 5 0 5 40

7

ninguno 0 0 5 5 40

8

pCGP3086 20 5 0 5 20

9

pCGP3086 20 - 5 5 20

10

pCGP3086 20 5 0 0 25

11

pCGP3086 20 0 5 0 25

# = número de tubo, D3G = delfinidina 3-glucósido, D3R = delfinidina 3-rutinósido, 14C-SAM = 14C-SAM 0.6 M (13 µCi/mmol) (Amersham Pharmacia), Solución reguladora = NaPi 0.1 M, pH 7.5, MgCl2 4 mM

Las reacciones de ensayo se incubaron a 30˚C durante 30 minutos. Cincuenta microlitros de una mezcla de cloroformo

�� (CHCl3:metanol/1% de HCl, 2:1) fue adicionada y la mezcla luego fue sometida a agitación vorticial para detener las reacciones. Las fases se separaron por centrifugación a 13,000 rpm durante 5 minutos y 50 µL de la fase superior fueron transferidas a un tubo limpio y los contenidos posteriormente se hidrolizaron, mediante la adición de 12.5 µL de HCl 10M. El tubo luego fue colocado en un baño de agua a ebullición durante 30 minutos y los contenidos posteriormente se desecaron bajo vacío. El residuo se volvió a resuspender en 2-3 µL de metanol/1% de HCl y se

��� sembraron en puntos sobre una placa de TLC al lado de muestras estándar de petunidina, malvidina y delfinidina. Las antocianidinas se separaron en un sistema Forestal (HOAc: agua: HCl; 30: 10: 3) (Markham, Techniques of flavonoid identification., Academic Press, London, 1982) y la TLC fue expuesta a una película autoradiográfica (Kodak) durante 16 horas a -70˚C.

TABLA 11

Resultados de ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contienen vector pCGP3086 o control pQE30 utilizando delfinidina 3-glucósido o delfinidina 3-rutinósido como sustrato y 14C-SAM como donante de metilo

#

Plásmido Homogenato Crudo D3R D3G 14C-SAM Petunidina Malvidina

1

pQE30 + + - + no no

2

pQE30 + - + + no no

3

pQE30 + + - - no no

(continuación)

Resultados de ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contienen vector pCGP3086 o control pQE30 utilizando delfinidina 3-glucósido o delfinidina 3-rutinósido como sustrato y 14C-SAM como donante de metilo

4

pQE30 + - + - no No

5

pQE30 + - - + no no

6

ninguno - + - + no no

7

ninguno - - + + no no

8

pCGP3086 + + - + si si

9

pCGP3086 + - + + si si

10

pCGP3086 + + - - no no

11

pCGP3086 + - + - no no

# = número de tubo, D3G G = delfinidina 3-glucósido, D3R = delfinidina 3-rutinósido, 14C-SAM = S-adenosil-L-metionina 14C-marcado (Amersham Biosciences), + = presente en la mezcla de reacción - = ausente de la mezcla de reacción si = detección de producto en TLC, no = no se observa reacción según se determina por la ausencia del producto.

Los derivados metilados de delfinidina, petunidina y malvidina, fueron detectados en reacciones de ensayo utilizando

�� homogenatos crudos a partir de las células pCGP3086 junto con los sustratos D3R o D3G (Tubos 8 y 9, Tabla 11). No hubo producción detectable de petunidina y malvidina en reacciones de ensayo utilizando homogenatos crudos a partir de células pQE30 (Tubos 1 a 5, Tabla 11) o que no tiene homogenatos crudos adicionados (Tubos 6 y 7, Tabla 11) o en reacciones de ensayo sin la adición de 14C-SAM (Tubos 10 y 11, Tabla 11). Los resultados obtenidos con la expresión del clon de ADNc de E20 en un sistema de expresión de E. coli además proporciona la evidencia para

��� sugerir que el clon de ADNc de E20 de la Petunia codifica para una FMT que es capaz de metilar la delfinidina 3glucósido y delfinidina 3-rutinósido utilizando SAM como un donante de metilo para producir el derivado 3’-metilado, petunidina y el derivado 3’ 5’-metilado, malvidina.

EJEMPLO 8

Expresión antisentido de FMT en plantas

Los clones de FMT de Petunia (E20 y E33) cada uno fue clonado en una orientación antisentido detrás de un promotor Mac (Comai et al., 1990, supra) e introducido en la línea petunia híbrida VR de flores púrpuras.

Construcción de pCGP40

El plásmido pCGP40 fue construido, mediante la eliminación del gen GUS (Jefferson et al., EMBO J. 6(13): 3901-3907,

�� 1987) como un fragmento de endonucleasa de restricción BamHI-SacI a partir de pCGN7334 y reemplazándolo con el fragmento de endonucleasa de restricción BamHI-SacI a partir de pBluescribeM13- que incluye el sitio de multiclonación. El plásmido pCGN7334, obtenido de Calgene Inc. (CA, USA), fue construido por la inserción del fragmento que contiene la fusión del gen Mac: GUS: mas 3’ en el sitio de endonucleasa de restricción XhoI de pCGN7329 (Comai et al., Planta Molecular Biology 15: 373-381, 1990).

��� Construcción de pCGP1910 y pCGP1911

Los plásmidos pGGP1910 y pCGP1911 fueron construidos por la clonación de los respectivos insertos de ADNc a partir de pCGP1907 y pCGP1908 (Figura 3 y 4) en una orientación antisentido detrás del promotor Mac (Comai et al., 1990, supra) de CGP40. La región codificante GUS en pCGP40 fue eliminado por digestión con endonucleasas de restricción SacI/Asp718. El vector que contiene el promotor Mac y el terminador mas se purificó utilizando el Kit GeneClean

���

(Bresatec) y se ligó con extremos de la endonucleasa de restricción SacI/Asp718 de los fragmentos de ADNc E20 y E33 de Petunia liberados de pCGP1907 y pCGP1908 respectivamente. La inserción correcta de los insertos de E20 y E33 en pCGP1910 y pCGP1911 fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción SacI/Asp718 de ADN aislado a partir de transformantes resistentes al cloranfenicol.

Los plásmidos pCGP1918 (Figura 6) y pCGP1919 (Figura 7) fueron construidos por la clonación de los respectivos

���

casetes de expresión Mac: Petunia E20: mas 3’ y Mac: Petunia E33: mas 3’ a partir de los plásmidos pCGP1910 y pCGP1911 en, el vector binario Ti pWTT2132 (DNAP). Los genes quiméricos E20 y E33 de Petunia fueron aislados a partir de pCGP1910 y pCGP1911 de la digestión de endonucleasa de restricción del plásmido con BglII y el resultante 5’ saliente fue, reparado utilizando el fragmento Klenow de ADN polimerasa I. Los genes quiméricos de E20 y E33 de Petunia se purificaron utilizando un Kit Bresaclearr (Bresatec) y luego se liga con extremos desfosforilados SmaI del

���

vector binario pWTT2132. La ligación corregida de los fragmentos fue establecida por digestión de endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes de E. coli resistentes a la tetraciclina. Los plásmidos resultantes fueron designados pCGP1918 (Figura 6) y pCGP1919 (Figura 7), respectivamente.

Supresión antisentido de la actividad de FMT en P. hybrida

Los plásmidos pCGP1918 (Figura 6) y pCGP1919 (Figura 7) fueron cada uno introducido en la cepa Agrobacterium

��� tumefaciens AGL0 por separado. El contenido de T-ADN en los plásmidos pCGP1918 (Figura 6) y en pCGP1919 (Figura 7) fueron introducidos en experimentos separados en P. hybrida cv. VR vía transformación mediada por el Agrobacterium.

El análisis transgénico de plantas de Petunia pCGP1918/VR y pCGP1919/VR

Las plantas transgénicas independientes fueron producidas y cultivadas a floración. Una selección de plantas produjo

��� flores con colores rosa oscuro, que difieren del control VR de color púrpura. Una selección de colores de la flor observada se muestra en la Tabla 12. Los pigmentos acumulados en las flores de las plantas transgénicas fueron analizados por HPLC (Tabla 13).

TABLA 12

Colores de pétalos de flores transgénicas VR, 1918/VR y 1919/VR

NÚMERO DE ACCESO

VARIEDAD/ CONSTRUCCIÓN CÓDIGO RHSCC COLOR DE PÉTALO

9339

VR/1918 64C, 67A rosa oscuro

9724

VR/1918 64B, 67A rosa oscuro

10161

VR/1918 78A púrpura

10167

VR/1918 78A púrpura

10169

VR/1918 78A púrpura

10171

VR/1918 78A púrpura

9349

VR/1919 78A púrpura

9463

VR/1919 78A púrpura

10177

VR/1919 74A rojo/púrpura

10178

VR/1919 78A púrpura

10183

VR/1919 78A púrpura

12704

control VR 78A púrpura

RHSCC = Royal Horticultural Society Color Chart (Kew, UK).

Extracción de antocianidinas

Antes del análisis por HPLC, las moléculas de antocianina y flavonol presentes en extractos de pétalos y estambres

�� fueron hidrolizados con ácido para eliminar las fracciones glucosil a partir del núcleo de antocianidina o flavonol. Los estándares de antocianidina y flavonol fueron utilizados para ayudar a identificar los compuestos presentes en los extractos florales.

Las antocianidinas en la mezcla de reacción fueron analizadas por HPLC vía elución con gradiente utilizando las condiciones de gradiente de 50% de B a 60% de B durante 10 minutos, luego 60% de B por 10 minutos y finalmente

���

60% de B a 100% de B durante 5 minutos donde el solvente A consistió de TFA: H2O (5:995) y el solvente B consistió de acetonitrilo: TFA: H2O (500:5:495). Una columna cartucho Asahi Pac ODP-50 (250 mm x 4.6 mm ID) se utilizó para las separaciones por cromatografía de fase reversa. La velocidad de flujo fue de 1 mL/min y la temperatura fue 40˚C. La detección de los compuestos antocianidina se llevó a cabo utilizando un detector Shimadzu SPD-M6A tri dimensional a 400-650 nm.

���

Los picos de antocianidina fueron identificados por referencia a estándares conocidos, a saber delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina y peonidina.

TABLA 13

Niveles del porcentaje de antocianidinas detectados en los pétalos de transgénicos VR/1918 y VR/1919 mediante el análisis de HPLC

# Acc

# pCGP Color Antocianidina (%)

Del

Cya Pet Peo Mal

9724

1918 rosa oscuro 51.7 6.0 34.5 0.0 7.8

10161

1918 púrpura 1.2 0.6 0.6 0.3 97.3

10167

1918 púrpura 0.6 0.2 4.7 0.3 94.2

10169

1918 púrpura 0.4 0.1 4.7 0.3 94.4

10171

1918 púrpura 0.5 0.1 5.4 0.3 93.7

9349

1919 púrpura 0.6 0.0 5.6 0.2 93.6

9463

1919 púrpura 0.8 0.1 7.9 0.3 90.9

10177

1919 rojo-púrpura 36.8 0.0 38.7 0.0 24.5

10178

1919 púrpura 1.2 0.0 14.5 0.2 84.1

10183

1919 púrpura 0.5 0.0 4.4 0.3 94.8

12704

VR control púrpura 0.3 0.0 3.8 15.7 80.1

Acc# = Número de acceso de planta, pCGP# = Número de plásmido, Del = Delfinidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, Cya = Cianidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, Pet = Petunidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, Peo = Peonidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, Mal = Malvidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas

La expresión antisentido de E20 de Petunia (en pCGP1918) y E33 (en pCGP1919) conduce a un cambio en color de la flor de púrpura a rosa oscuro o rojo-púrpura con un cambio concomitante en la composición de antocianina. En general,

�� las flores de petunia VR control predominantemente acumulan malvidina (los 3’, 5’ derivados metilados de delfinidina) (alrededor de 80% de antocianidina total) (Tabla 13). La línea transgénica 9724 que contiene el gen antisentido E20 de Petunia produjo flores con un color rosa oscuro con la antocianina predominante siendo la delfinidina, lo que sugiere que la expresión del gen E20 antisentido ha impactado sobre la actividad de metiltransferasa 3’ 5’. La línea transgénica 10177 que contiene el gen antisentido E33 de Petunia produjo flores con un color rojo-púrpura con la antocianina predominante siendo la delfinidina y petunidina lo que sugiere que la expresión del gen antisentido E33 también ha impactado en la actividad de metiltransferasa 3’ 5’.

EJEMPLO 9

Aislamiento de clon de ADNc de FMT a partir de Torenia

�� Preparación de una biblioteca de ADNc de pétalos de Torenia

Un kit λZAPII (EcoRI/XhoI direccional) (Stratagene) se utilizó para preparar una biblioteca de ADNc a partir de ARN aislado de pétalos de los brotes abiertos de Torenia hybrida. cv. Summerwave (Suntory Ltd.) de acuerdo con las condiciones recomendadas por el fabricante.

Aproximadamente 200,000 ufps fueron seleccionadas con el clon de ADNc FMT de Petunia (E20) DIG-marcado a partir

���

de pCGP1907 (Figura 3) utilizando condiciones de baja severidad según se describe por Tanaka et al., (Planta Cell Physiol 37: 711-716, 1996). Veinte placas de hibridación fueron recogidas en PSB. Se volvieron a seleccionar para aislar las placas purificadas, utilizando las condiciones de hibridación como se describe para la selección inicial de la biblioteca de ADNc. El contenido de plásmidos en el vector bacteriofago λZAPII fueron rescatados y los datos de secuencia fueron generados a partir de los extremos 3’ y 5’ de los insertos de ADNc. De estas TFMT representan el

���

clon de ADNc más grande (~1 kb) y el plásmido fue designado como pTMT5 (Figura 8).

La secuencia completa del clon de ADNc de FMT de Torenia (TFMT) [SEQID NO:11] fue determinado mediante la compilación de secuencia a partir de diferentes subclones pUC18 obtenidos utilizando procedimientos estándar para la generación de clones solapantes aleatoriamente (Sambrook et al., 1989, supra). Se determinó que la secuencia tenía 1012 bases de longitud y contenía un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido putativo de 240 aminoácidos

���

[SEQ ID NO:12]. El clon TFMT compartió 50% de identidad con la secuencia de E20 de Petunia [SEQ ID NO:4] en el nivel del nucleótido y 51% de identidad con la secuencia de E33 de Petunia [SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:26]. La secuencia de aminoácidos deducida del clon de FMT de Torenia (TFMT) compartió 56% de identidad y 70% de similitud en el nivel de aminoácido con aquella del clon de FMT de Petunia (E20) [SEQ ID NO:5]. La secuencia de aminoácidos deducida del clon de FMT de Torenia (TFMT) compartió 69% de identidad y 82% de similitud en el nivel

���

aminoácido con aquella del clon de FMT de Petunia (E33-corregido) [SEQ ID NO: 7].

Actividad de metiltransferasa del clon de ADNc de FMT de Torenia expresada en E. coli

El clon de ADNc de FMT de Torenia (TFMT) también fue expresado en un sistema de expresión E. coli (análogo al utilizado en el Ejemplo 7) y se evalúa para la actividad de FMT.

Clonación de FMT de Torenia en el vector de expresión de E. coli pQE30 (Construcción de pCGP3090)

���

Con el fin de clonar el clon de ADN de FMT de Torenia en un vector de expresión de E. coli, pQE30 (QIAGEN), un sitio de endonucleasa de restricción BamHi fue necesario en el iniciador de la traducción-ATG y un sitio de endonucleasa de restricción PstI fue necesario inmediatamente 3’ al putativo.

Los oligonucleótidos TMT5.BamHI.F [SEQ ID NO:13] y TMT5.PstI.R [SEQ ID NO:14] (Tabla 14) fueron utilizados como cebadores con pTMT5 como plantilla para amplificar el clon de ADNc de FMT de Torenia con un sitio de

���

reconocimiento de endonucleasa de restricción BamHI en lugar del AUG de inicio y un sitio de endonucleasa de restricción PstI de reconocimiento inmediatamente 3’ al codón de terminación putativo.

Las condiciones de PCR incluyeron 5 µL 10 x solución reguladora de Polimerasa de ADN PfuTurbo (Stratagene), 2 µL de 10 mM dNTPs, 2 µL de 20 µ/µL TMT5.BamHI.F [SEQ ID NO:13], 2 µL de 20 µ/µL de TMT5.PstI.R [SEQ ID NO:14]; 1 µL de 1 µg/µL de pTMT5 plantilla, 37 µL de agua pura y 1 µL de Polimerasa de ADN PfuTurbo (Stratagene). La PCR se

���

incubó a 95˚C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94˚C durante 30 segundos, 60˚C durante 30 segundos y 72˚C por 1 minuto y a continuación una incubación final a 72˚C durante 10 minutos con un posterior almacenamiento a 4˚C.

TABLA 14

Oligonucleótidos utilizados en la clonación del clon de ADNc de TFMT en el vector de expresión bacteriana pQE30

SEQ ID No:

CEBADOR SECUENCIA (5’ a 3’)

13

TMT5.BamHI.F GCA TGG ATC CAA AGA TAA GTT CTA TGG CAC CAT TTT G

14

TMT5.PstI.R GCA TCT GCA GTT ATT TGA GAC GTT TGC ACA AGG TG

Los productos de PCR resultantes fueron sometidos a electroforesis a través de un gel de agarosa al 1% peso/v y una banda de 0.72 kb fue aislada y se purificó utilizando un kit de Extracción QIAEX II Gel (QIAGEN) de acuerdo con las

�� recomendaciones del fabricante. Los productos aislados luego fueron digeridos con la endonucleasa de restricción PstI. El producto de digestión se purificó utilizando un kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN) y luego fue digerido con la endonucleasa de restricción BamHI. Los productos digeridos BamHI/PstI finalmente se purificaron utilizando un kit de purificación QIAquick PCR (QIAGEN) y posteriormente se ligaron con los extremos BamHI/PstI del vector pQE30 (QIAGEN) utilizando el Kit de Ligación de ADN (Amersham) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Los

���

transformantes fueron analizados para la presencia del inserto específico de 0.72 kb utilizando la endonucleasa de restricción BamHI/PstI digerida. La secuencia del inserto fue confirmada por el análisis de secuencias utilizando pQE Sequencing-Primer Set (QIAGEN). El plásmido resultante fue denominado pCGP3090 (mut-TFMT in pQE30) (Figura 9).

Como consecuencia del uso de los oligonucleótidos TMT5.BamHI.F [SEQ ID NO:13] y TMT5.PstI.R [SEQ ID NO:14] como cebadores en la PCR y de la posterior clonación del producto en pQE30, la secuencia del clon de FMT de

���

Torenia fue fallado cerca de la metionina de inicio putativa de los polipéptidos codificados. Como consecuencia de los aminoácidos esperados alrededor de la metionina de inicio putativa fueron cambiados de "M K D K F Y GT" a "M R G S H H H H H H G S K D K F Y G T".

Para el análisis de actividad de la metiltransferasa de la FMT de Torenia, el plásmido pCGP3090 posteriormente fue introducido en E. coli de células M15 (pREP4) (QIAGEN) de acuerdo con el método de Inoue et al., 1990, supra.

���

La confirmación de la expresión de proteína recombinante y la preparación de extractos de proteína cruda y posterior determinación de la actividad de metiltransferasa fueron como se describe para el análisis del clon de ADNc de E20 de Petunia (PFMT) (descrito anteriormente en el Ejemplo 7).

La actividad de las enzimas de la proteína codificada por el clon de ADNc de FMT de Torenia en pCGP3090 junto con la del clon de FMT de Petunia (E20) en pCGP3086 fueron evaluadas utilizando los sustratos delfinidina 3-glucósido y

���

delfinidina 3-rutinósido bajo las condiciones de ensayo como se describe en Jonsson et al. (1983), supra y en el Ejemplo 7 de esta especificación.

Los ensayos de metiltransferasa fueron establecidos de acuerdo con la Tabla 15 en un volumen de reacción total de 50 µL.

TABLA 15

Composición de ensayos de metiltransferasa utilizando homogenatos crudos a partir de cultivos bacterianos que contienen los plásmidos pCGP3086 (PFMT) o pCGP3090 (TFMT) o pQE30 (control)

#

Plásmido Homogenato crudo (µL) 3 mg/mL D3R (µL) 3 mg/mL D3G (µL) SAM (µL) Solución reguladora (µL)

1

pQE30 20 ’ 5 0 5 20

2

pQE30 20 0 5 5 20

3

pQE30 20 5 0 0 25

4

pQE30 20 0 5 - 25

5

pQE30 20 0 - 5 25

6

ninguno 0 5 0 5 40

7

ninguno 0 0 5 5 40

8

pCGP3086 20 5 0 5 20

9

pCGP3086 20 0 5 5 20

10

pCGP3086 20 5 0 0 25

11

pCGP3086 20 0 5 0 25

12

pCGP3090 20 0 5 5 20

13

pCGP3090 20 0 5 0 25

# = número de tubo, D3G = delfinidina 3-glucósido, D3R = delfinidina 3-rutinósido, 14C-SAM = 14C-SAM 0.6mM (13 µCi/mmol) (Amersham Pharmacia), Solución reguladora = NaPi 0.1 M, pH7.5, MgCl2 4 mM

Las condiciones de reacción fueron como se describe previamente (Ejemplo 7).

TABLA 16

Resultados de ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contienen el vector pCGP3086, pCGP3090 o control pQE30 utilizando delfinidina 3-glucósido o delfinidina 3-rutinósido como sustrato y 14CSAM como donante de metilo

#

Plásmido Homogenato crudo D3R D3G SAM Petunidina Malvidina

1

pQE30 + + - + no no

2

pQE30 + + + no no

3

pQE30 + + - - no no

4

pQE30 + - + - no no

5

pQE30 + - - + no no

6

ninguno - + - + no no

7

ninguno - - + + no no

8

pCGP3086 + + - + si si

9

pCGP3086 + - + + si si

10

pCGP3086 + + - - no no

11

pCGP3086 + - + - no no

12

pCGP3090 + - + + si si

13

pCGP3090 + - + - no no

# = Número de tubo, D3G = delfinidina 3-glucósido, D3R = delfinidina 3-rutinósido, 14C-SAM = S-adenosil-L-metionina 14C-marcado (Amersham Biosciences), + = presente en la mezcla de reacción - = ausente de la mezcla de reacción si = detección del producto en TLC, no = no se observa reacción según se determina por la ausencia de producto.

La petunidina y malvidina, los derivados metilados de delfinidina, fueron detectados en reacciones de ensayo utilizando homogenatos crudos de pCGP3090 (que contiene TFMT) y D3G (Tubo 12, Tabla 15). No hubo producción detectable

�� de petunidina y malvidina en reacciones de ensayo utilizando homogenatos crudos a partir de células pQE30 (Tubos 1 a 5, Tabla 15) o que no tiene homogenatos crudos adicionados (Tubos 6 y 7, Tabla 15) o en reacciones de ensayo sin la adición de 14C-SAM (Tubos 10, 11 y 13, Tabla 15). Los homogenatos crudos a partir de pCGP3086 (que contiene PFMT) fueron utilizados como controles positivos (Tubos 8 y 9, Tabla 16).

Los resultados obtenidos con la expresión del clon de ADNc de FMT de Torenia (TFMT) en un sistema de expresión E.

�� coli además proporciona la evidencia para sugerir que el clon de ADNc de TFMT codifica para una FMT que es capaz de metilar la delfinidina 3-glucósido utilizando SAM como un donante de metilo para producir los derivados 3’metilados, petunidina y los derivados 3’ 5’ metilados, malvidina.

EJEMPLO 10

Ensayo HPLC de actividad de metiltransferasa de clones de FMT de Petunia y Torenia

���

La actividad de las enzimas de los péptidos codificados por clones de ADNc de FMT de Petunia y Torenia en pCGP3086 y pCGP3090, respectivamente además fueron evaluadas utilizando los sustratos delfinidina 3-glucósido y delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3, 5-diglucósido bajo las condiciones de ensayo como se describe previamente (Tabla 15, Ejemplo 9) excepto que el SAM 14C-marcado fue reemplazado con SAM no radioactivo a 2 mg/mL y los sustratos (delfinidina 3-glucósido y delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3, 5-diglucósido) a 2 mg/mL.

���

TABLA 17

Identificación de productos (en mg/g) por HPLC a partir de ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contiene el vector pCGP3086, pCGP3090 o control pQE30 utilizando delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3rutinósido y delfinidina 3, 5-diglucósido como sustrato y SAM como donante de metilo

No. de Tubo

Sustrato Plásmido Antocianidinas (mg/g) Actividad de FMT predominante

Del

Cya Pet Peo Mal

1a 1b

D3R ninguno 17.6 19.9 0.6 0.6 0 0.6 0 0 0 0 ninguno

2a 2b

D3R pQE30 16.9 21.9 0.6 0.6 0.6 0.6 0 0 0 0 ninguno

3a 3b

D3R pCGP3086 3.7 4.5 0.4 0.5 10.2 11.9 0.2 0.2 2.9 3.6 3’FMT

4a 4b

D3R pCGP3090 2.5 2.8 0 0 0.8 0.8 0.4 0.4 15.6 15.1 3’5’FMT

5a 5b

D3G ninguno 7.8 9.8 1.7 1.9 0.9 0.9 0 0 0 0 ninguno

6a 6b

D3G pQE30 17.1 22.1 2.5 2.7 1.2 1.3 0 0 0 0 ninguno

(continuación)

Identificación de productos (en mg/g) por HPLC a partir de ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contiene el vector pCGP3086, pCGP3090 o control pQE30 utilizando delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3, 5-diglucósido como sustrato y SAM como donante de metilo

No. de Tubo

Sustrato Plásmido Antocianidinas (mg/g) Actividad de FMT predominante

Del

Cya Pet Peo Mal

7a 7b

D3G pCGP3086 7.1 6.4 2.4 2.0 8.8 10.0 0.5 0.6 1.2 1.3 3’FMT

8a 8b

D3G pCGP3090 1.8 1.9 1.0 0.9 1.2 1.3 2.0 1.9 17.1 18.1 3’5’FMT

9a 9b

D3,5G ninguno 4.2 17.1 0 0 0 0 0 0 0 0 ninguno

10a 10b

D3,5G pQE30 5.3 16.0 0 0 0 0 0 0 0 0 ninguno

11a 11b

D3,5G pCGP3086 2.9 10.5 0 0.4 2.7 6.7 0 0 0.7 1.1 3’FMT

12a 12b

D3,5G pCGP3090 2.4 5.4 0 0 0.7 0.8 0 0 7.3 12.4 3’5’FMT

No. de Tubo = Número de tubos ("a" y "b" se refiere a mediciones del producto duplicado) 3’FMT = flavonoide 3’ metiltransferasa, 3’5’FMT = flavonoide 3’ 5’ metiltransferasa, Del = delfinidina, Cya = cianidina, Pet = petunidina, Peo = peonidina, Mal = malvidina.

TABLA 18

Productos (expresados como porcentaje de antocianidina total) de los ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contienen vector pCGP3086, pCGP3090 o control pQE30 utilizando delfinidina 3glucósido, delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3,5-diglucósido como sustrato y SAM como donante de metilo

No. de Tubo

Sustrato Plásmido % de antocianidina detectado

del

cya pet peo mal

1a 1b

D3R ninguno 97.0 94.3 3.0 2.7 0.0 3.0 0.0 0.0 0.0 0.0

2a 2b

D3R pQE30 93.2 94.7 3.4 2.5 3.4 2.8 0.0 0.0 0.0 0.0

3a 3b

D3R pCGP3086 (PFMT) 21.2 21.7 2.5 2.5 58.5 57.4 1.2 1.1 16.6 17.4

4a 4b

D3R pCGP3090 (TFMT) 13.2 14.6 0.0 0.0 4.0 4.3 1.9 1.9 80.9 79.1

5a 5b

D3G ninguno 75.3 77.7 16.5 15.2 8.2 7.1 0.0 0.0 0.0 0.0

6a 6b

D3G pQE30 82.5 85.0 12.0 10.2 5.6 4.8 0.0 0.0 0.0 0.0

7a 7b

D3G pCGP3086 (PFMT) 35.5 31.4 11.8 9.7 44.0 49.4 2.7 3.0 6.0 6.5

8a 8b

D3G pCGP3090 (TFMT) 7.8 7.8 4.5 3.6 5.1 5.4 8.5 8.0 74.0 75.2

9a 9b

D3,5G ninguno 100.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0. 0 0.0 0.0

10a 10b

D3,5G pQE30 100.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0

(continuación)

Productos (expresados como porcentaje de antocianidina total) de los ensayos de metiltransferasa de extractos de E. coli que contienen vector pCGP3086, pCGP3090 o control pQE30 utilizando delfinidina 3glucósido, delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3,5-diglucósido como sustrato y SAM como donante de metilo

No. de Tubo

Sustrato Plásmido % de antocianidina detectado

del

cya pet peo mal

11a 11b

D3,5G pCGP3086 (PFMT) 45.6 55.9 0.0 2.2 43.4 35.9 0.0 0.0 11.0 6.0

12a 12b

D3,5G pCGP3090 (TFMT) 22.9 28.9 0.0 0.0 7.1 I 4.3 0.0 0.0 70.0 66.9

No. de Tubo = Número de tubos ("a" y "b" se refiere a mediciones del producto duplicado) del = delfinidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, cya = cianidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, pet = petunidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, peo = peonidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas, mal = malvidina, expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas.

Bajo las condiciones del ensayo, el clon de ADNc de FMT de Petunia (E20) contenido en pCGP3086 conduce a una

�� actividad del flavonoide metiltransferasa que utilizó delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3-rutinósido o delfinidina 3, 5diglucósido como sustrato para producir predominantemente petunidina y a un grado menor, malvidina.

Los datos publicados previamente en las actividades de metiltransferasa en extractos de proteína cruda de flores de petunia sugieren que las metiltransferasas de Petunia no pueden utilizar antocianidina 3-glucósido o antocianidina 3rutinosidos como sustratos (Jonsson et al., 1982, supra). Bajo nuestras condiciones de ensayo, sin embargo, la

��� actividad de metiltransferasa de Petunia producida por el clon E20 de Petunia en pCGP3086 fue capaz de metilar cada uno de delfinidina 3-glucósidos, delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3,5-diglucósido.

El clon de ADNc de FMT de Torenia contenido en pCGP3090 también resultó en una actividad del flavonoide metiltransferasa que utilizó la delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3-rutinósido y delfinidina 3, 5-diglucósido como sustrato para producir predominantemente la malvidina y a un grado menor, petunidina.

��� EJEMPLO 11

Transformación de rosa para producir pigmentos basados en la malvidina.

La antocianina predominante en rosas cultivadas comercialmente tienden a ser 3-glucósidos o 3, 5-diglucósidos de cianidina o pelargonidina (Mikanagi et al., Biochem. System and Ecol. 23: 183-200, 1995, Mikanagi et al., Biochem. System and Ecol. 28: 887-902, 2000). Con el fin de producir pigmentos basados en la malvidina en estas rosas, sería

��� necesario que sea introducido un gen F3’5’H para producir inicialmente los precursores de pigmentos de malvidina, delfinidina 3-glucósidos o delfinidina 3, 5 diglucósidos. Para permitir que luego la conversión a pigmentos de malvidina, un flavonoide metiltransferasa con actividad 3’ y 5’ y la capacidad de utilizar los 3-glucósidos o 3, 5-diglucósidos de delfinidina sería necesaria.

Los plásmidos de vector binario pCGP3254 (Figura 13), pSPB1534 (Figura 15) y pSPB1532 (Figura 18) que contienen un gen quimérico F3’ 5’H junto con unos genes de FMT de Petunia o Torenia fueron, por lo tanto, construidos para ser introducidos en rosa para permitir la producción de petunidina y/o pigmentos basados en la malvidina y modificar así el color de la flor. Estos plásmidos binarios también se introducen en una especie que normalmente no produce

�� pigmentos basados en la delfinidina y no contienen un flavonoide metiltransferasa capaz de metilar antocianidinas, específicamente delfinidina. Tales plantas pueden incluir pero no se limitan a claveles, crisantemos, gérberas, orquídeas, Euphorbia, Begonia.

Construcción del vector binario pCGP3254 (35S 5’: TFMT: 35S 3’; 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’; 35S 5’: SuRB)

El plásmido pCGP3254 contiene un casete de expresión 35S 5’: Viola F3’5’H; 35S 3’ (de pCGP2092) (Figura 14) y un

��� casete de expresión 35S 5’: Torenia FMT: 35S 3’ (de pCGP3099) (Figura 11) en orientación tándem con el gen del marcador genético del vector binario Ti pCGP1988 (Figura 12).

(1) Construcción de plásmidos intermedios para pCGP3254

(i) Construcción de pCGP3097 (casete de expresión 35S 5’: TFMT: 35S 3’)

El plásmido pCGP3097 (Figura 10) fue construido mediante la clonación del clon de ADNc de FMT de Torenia a partir

���

de pTMT5 en un casete de expresión CaMV 35S.

El plásmido pRTppoptcAFP se utilizó como una fuente de un promotor CaMV 35S y fragmento terminador. Fue inicialmente digerido con XbaI, los extremos 5’ salientes fueron reparados y luego el plásmido fue restringido con EcoRI para liberar el vector de 3.3kb que contiene el casete de expresión CaMV 35S. El vector de 3.3 kb fue aislado y purificado.

���

pTMT5 fue digerido inicialmente con la endonucleasa de restricción Asp718 y los extremos salientes 5’ resultantes fueron reparados. El plásmido linearizado a continuación fue restringido con la endonucleasa de restricción EcoRI para liberar el fragmento de ADNc de 1.0kb de FMT de Torenia que fue aislado, purificado y luego se ligó con los extremos XbaI (romo)/ EcoRI del vector pRTppoptc (descrito anteriormente). La ligación corregida de los fragmentos fue establecida por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, ClaI, XhoI, PstI, y SphI) del ADN del plásmido aislado

���

a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue denominado pCGP3097 (Figura 10).

(ii) Construcción de pCGP3099 (35S 5’: TFMT: 35S 3’; 35S 5’: SuRB expresión binaria)

El plásmido pCGP3099 (Figura 11) fue construido, mediante la clonación del gen quimérico de FMT de Torenia a partir de pCGP3097 (Figura 10) en el vector binario Ti pCGP1988. El vector binario pCGP1988 (Figura 12) se basa en el vector binario pWTT2132 (DNAP) pero contiene el sitio de multi-clonación a partir de pNEB193 (New England Biolabs).

���

El casete de expresión 35S 5’: Torenia FMT: 35S 3’ de pCGP3097 (Figura 10) fue liberado mediante la digestión con la endonucleasa de restricción PstI. Un fragmento de 1.66 kb que contiene el gen quimérico de FMT de Torenia posteriormente fue aislado y ligado con los extremos PstI de pCGP1988. La ligación corregida del gen quimérico en tándem con el gen 35S 5’: SuRB de pCGP3099 fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, XhoI, PstI, Asp718, EcoRI, y EcoRV) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la

���

tetraciclina. El plásmido resultante fue denominado pCGP3099 (Figura 11).

(iii) Construcción de pCGP2092 (casete de expresión 35S 5’: Viola F3’5’H (BP#40): 35S 3’)

El plásmido pCGP2092 (Figura 14) fue construido, mediante la clonación del clon de ADNc F3’5’H aislado a partir de Viola sp. como un fragmento XbaI/EcoRI de 1.6 kb a partir de pCGP1961 detrás del promotor CaMV 35S contenido en pRTppoptc.

��� El plásmido pCGP1961 (Australian Provisional Patent Applications No. 2002951088 y 2002952835, 2002, supra) inicialmente fue digerido con la endonucleasa de restricción Asp718 y después de la reparación de los extremos 5’ salientes fue digerido con la endonucleasa de restricción EcoRI para liberar un fragmento de 1.6 kb que contiene el gen quimérico F3’5’H. El fragmento fue aislado y ligado con los extremos XbaI (romo)/EcoRI del vector pRTppoptc de 3.3kb (descrito anteriormente). La ligación corregida del clon de ADNc de Viola F3’5’H (BP#40) en el casete de expresión CaMV 35S fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, XhoI, PstI) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue designado como pCGP2092

�� (Figura 14).

Construcción de pCGP3254

El gen quimérico F3’5’H posteriormente fue liberado de pCGP2092 por restricción con la endonucleasa de restricción PstI seguido por el tratamiento con polimerasa de ADN T4 para reparar los extremos 3’ salientes. El fragmento fue aislado y ligado con los extremos SmaI de pCGPJ099 (descrito anteriormente). La inserción correcta del gen quimérico

��� F3’5’H en tándem con el gen 35S 5’: SuRB y el gen del casete de expresión 35S 5’: Torenia FMT: 35S 3’ fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, XhoI, NcoI, SalI, EcoRI, EcoRV) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue denominado pCGP3254 (Figura 13).

Transformación de la planta con pCGP3254

���

El vector binario pCGP3254 (Figura 13) fue introducido en la cepa de A. tumefaciens AGL0 y el contenido de T-ADN en pCGP3254 posteriormente fue introducido en la variedad de rosas Medeo y Sonia vía transformación mediada del Agrobacterium.

(2)

Construcción de los vectores binarios

(a)

pSPB1534 (e35S 5’: BP#40: pet D8 3’; e35S 5’: PFMT: nos 3’) y (b) pSPB1532 (e35S 5’: BP#40: pet D8 3’; e35S

���

5’: TFMT: nos 3’)

(a) El plásmido del vector binario pSPB1534 (Figura 15) contiene un casete de expresión e35S 5’: Viola F3’5’H (BP#40): pet D8 3’ (a partir de pSPB580 (Figura 16)) en orientación tándem con un casete de expresión e35S: PFMT: nos 3’ (a partir de pSPB1531 (Figura 17)). Ambos genes quiméricos están en una orientación tándem con el casete del gen del marcador genético nos 5’: nptII: nos 3’ del vector binario Ti pBINPlus (van Engelen et al., Transgenic Research,

���

4: 288-290, 1995).

(b) El plásmido del vector binario pSPB1532 (Figura 18) contiene un casete de expresión e35S 5’: Viola F3’5’H (BP#40): pet D8 3’ (a partir de pSPB580 (Figura 16)) en orientación tándem con un casete de expresión e35S 5’: TFMT: nos 3’ (a partir de pSPB1530 (Figura 19)). Ambos genes quiméricos están en una orientación tándem con el casete del gen del marcador genético nos 5’: nptII: nos 3’ del vector binario Ti pBINPlus (van Engelen et al., 1995, supra).

���

TABLA 19

Oligonucleótidos utilizados como cebadores en la construcción de los vectores binarios pSPB1534 y pSPB1532

SEQ ID NO:

NOMBRE SECUENCIA (5’ A 3’)

28

petD8 #1 CCCTCGAGTTTCTATTTTGTGTGTGTTG

29

petD8#2 GGG AAT TCT AGA GCT CGA GGA TCA CG

30

PMT-F ACT ACC AAG GAT CCT ACT GAA GCA

31

PMT-R CTC GAA TGA AGC TTT TGT TA

(continuación)

Oligonucleótidos utilizados como cebadores en la construcción de los vectores binarios pSPB1534 y pSPB1532

SEQ ID NO:

NOMBRE SECUENCIA (5’ A 3’)

32

TMT-F CAT AAA TAG GAT CCG CAG CAG CAA

33

TMT-R AGT CTC ATA AGC TTC TCT AT

Construcción de plásmidos intermedios para pSPB1534 y pSPB1532

�� (i) Construcción de pSPB580 (e35S 5’: BP#40: pet D8 3’)

El plásmido pSPB580 (Figura 16) contiene el clon de ADNc Viola F3’5’H entre un fragmento promotor mejorado 35S CaMV (e35S 5’) y un fragmento terminador de Petunia PLTP (petD8 3’). (1) Aislamiento del clon F3’5’H a partir de Viola sp.

El aislamiento de un clon de ADNc F3’5’H a partir de pensamiento negro de variedad Viola sp. ha sido descrito en

���

Australian Provisional Patent Application Nos. 2002951088 y 2002952835, supra). El plásmido pCGP 1961 (Australian Provisional Patent Application Nos. 2002951088 y 2002952835, supra) fue linearizado bajo digestión con la endonucleasa de restricción BamHI. Un fragmento de ADN de ~1.7 kb que contiene un clon de ADNc F3’5’H (BP#40) a partir de Pensamiento Negro Viola sp. cv.. fue recuperado de la digestión parcial con la endonucleasa de restricción, XhoI.

���

(2) Aislamiento de un fragmento del promotor 35S CaMV mejorado

El vector binario, pBE2113-GUS contiene un gen GUS bajo el control de un promotor 35S CaMV mejorado (e35S 5’) con una región terminadora a partir del gen sintasa nopalina de Agrobacterium (nos 3’) (Mitsuhashi et al. Plant cell Physiol. 37: 49-59, 1996). El plásmido pBE2113-GUS fue digerido con la endonucleasa de restricción SnaBI y un ligador BamHI (5’-GGGATCCC-3’) [SEQ ID NO:45] a continuación fue ligado con los extremos salientes para producir

��� pBE2113-ΔGUS. Un fragmento de ~0.7 kb que contiene el promotor 35S CaMV mejorado (e35S 5’) luego fue liberado bajo digestión de pBE2113-ΔGUS con la endonucleasas de restricción HindIII y BamHI.

(3) Aislamiento de un fragmento terminador a partir del gen de Petunia PLTP (D8) (petD8 3’)

Un fragmento terminador a partir del gen de la proteína de transferencia del fosfolípido de Petunia (PLTP) (petD8 3’) (Holton, 1992, supra) fue amplificado por PCR. Los cebadores pet D8 #1 [SEQ ID NO: 28] (Tabla 19) y pet D8 #2 [SEQ

��� ID NO: 29] (Tabla 19) junto con la plantilla del plásmido pCGP13ΔBam (Holton, 1992, supra) fueron utilizados para amplificar el fragmento terminador de Petunia PLTP (petD8 3). El fragmento amplificado de aproximadamente 0.8 kb luego fue digerido con la endonucleasas de restricción EcoRI y XhoI.

(4) Construcción de pUCAP Asc- (un vector de clonación lanzadera)

El plásmido pUCAP se basa en el vector de clonación pUC19 (NEB) pero contiene un sito de clonación múltiple

��� extendido (VanEngelen et al., Transgenic Res.4: 288-290, 1995). pUCAP fue digerido con la endonucleasa de restricción PacI. Los extremos salientes fueron reparados y luego se ligan con el ligador AscI (5’-GGCGCGCC-3’) [SEQ ID NO:46] para producir pUCAPAsc (similar a pUCAP sin un sitio de reconocimiento PacI y con 2 secuencias de reconocimiento AscI en cualquiera de los extremos del sitio de clonación múltiple).

(5) Construcción de pSPB580 (e35S: BP#40: pet D8 3’)

El fragmento BamHI/XhoI de 1.7 kb que contiene el clon de ADNc de Viola F3’5’H (BP#40) (aislamiento descrito anteriormente) fue ligado con el fragmento del vector BamHI/EcoRI de 2.7 kb obtenidos a partir de pUCAPAsc (descrito anteriormente) y el fragmento EcoRI/XhoI que contiene el terminador de a Petunia PLTP (petD8 3’) (descrito anteriormente). La inserción correcta de los fragmentos fue establecida por el análisis de endonucleasa de restricción

�� de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue denominado pSPB51

El fragmento HindIII/BamHI de 0.7 kb que contiene la región promotora mejorada CaMV 35S (descrita anteriormente) fue ligado con los extremos HindIII/BamHI del plásmido pSPB51. La inserción correcta del fragmento fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la

��� ampicilina. El plásmido resultante fue denominado pSPB580 (Figura 16).

(ii) Construcción del vector binario pSPB176 (e35S 5’: GUS: nos 3’; nos 5’: nptII: nos 3’)

El vector binario pSPB176 (Figura 20) contiene un casete de expresión e35S 5’: GUS: nos 3’ en una orientación tándem al casete del gen del marcador genético del vector binario Ti pBINPlus (van Engelen et al., 1995, supra).

El plásmido pBE2113-ΔGUS (descrito anteriormente) fue digerido con SacI. Los extremos 3’ salientes fueron reparados

���

y luego se ligan con un ligador StalI (5’-GGTCGACC-3’) [SEQ ID NO:47] para producir pBE2113-ΔGUSs. Un fragmento que contiene el casete de expresión e35S 5’: GUS: nos 3’ fue liberado de pBE2113-ΔGUSs bajo la digestión con las endonucleasas de restricción HindIII y EcoRI. El fragmento HindIIII/EcoRI, a continuación se ligó con los extremos HindIII/EcoRI del vector binario Ti pBinPLUS (VanEngelen et al., 1995, supra). La inserción correcta del fragmento fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes

���

resistentes a la canamicina. El plásmido resultante fue denominado pSPB 176 (Figura 20).

(iii) Construcción del vector binario pSPB1531 intermedio (e35S 5’: PFMT: nos 3’; nos 5’: nptII: nos 3’)

El plásmido del vector binario pSPB1531 (Figura 17) contiene el clon de ADNc de FMT de Petunia (con una región nocodificante 5’ reducida en comparación con el clon E20) entre un fragmento del promotor 35S CaMV mejorado (e35S 5’) y un fragmento terminador nos (nos 3’) en tándem con el casete del gen del marcador genético nos 5’: nptII: nos 3’

���

del vector binario Ti pBINPlus (van Engelen et al., 1995, supra).

La región 5’ del clon de ADNc de FMT de Petunia contenido en pCGP1907 (Figura 3) fue amplificado por PCR utilizando los cebadores PMT-F [SEQ ID NO: 30] y PMT-R [SEQ ID NO: 31] y 10 ng del plásmido pCGP1907 como plantilla. El oligonucleótido PMT-F [SEQ ID NO:30] fue diseñado para amplificar a partir de la posición 43-66) de SEQ ID NO:4 y se incorpora una secuencia de reconocimiento BamHI para facilitar la clonación. El cebador PMT-R [SEQ ID

���

NO: 31] fue diseñado para amplificar a partir de la posición 192-173 de SEQ ID NO:4 y se incorpora una secuencia de reconocimiento HindIII para facilitar la clonación. El fragmento amplificado parcial 5’ de FMT de Petunia luego fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y HindIII y ligado con el fragmento parcial 3’ de FMT de Petunia HindII/XhoI de 0.7 kb aislado a partir del plásmido pCGP1907 (Figura 3) y los extremos BamHI/SalI del vector binario Ti pSPB176 (Figura 20). La inserción correcta de los fragmentos fue establecido por análisis de endonucleasa de

���

restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la canamicina. El plásmido resultante fue denominado pSPB1531 (Figura 17).

(iv) Construcción del vector binario pSPB1530 intermedio (e35S 5’: TFMT: nos 3’; nos 5’: nptII: nos 3’)

El plásmido del vector binario pSPB1530 (Figura 19) contiene el clon de ADNc de FMT de Torenia (con una región 5’ no-codificante reducida en comparación con el clon TFMT) entre un fragmento del promotor 35S CaMV mejorado (e35S

���

5’) y un fragmento terminador nos (nos 3’) en tándem con el casete del gen del marcador genético nos 5’: nptII: nos 3’ del vector binario Ti pBINPlus.

La región 5’ del clon de ADNc de FMT de Torenia contenido en pTMT5 fue amplificado por PCR utilizando los cebadores TMT-F [SEQ ID NO:32] y TMT-R [SEQ ID NO:33] (Tabla 19) y 10 ng de pTMT5 como la plantilla. El oligonucleótido TMT-F [SEQ ID NO:32] (Tabla 19) fue diseñado para amplificar a partir de la posición 34-53 de SEQ ID

���

NO:11 y se incorpora una secuencia de reconocimiento BamHI para facilitar la clonación. El cebador TMT-R [SEQ ID

NO: 33] (Tabla 19) fue diseñado para amplificar a partir de la posición 214-190 de SEQ ID NO:11 y se incorpora una secuencia de reconocimiento HindIII para facilitar la clonación. El fragmento parcial 5’ de FMT de Torenia amplificado, luego fue digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y HindIII y ligado con un fragmento parcial 3’ HindIII/XhoI de FMT de Torenia de ~0.6 kb aislado a partir de los extremos pTMT5 y BamHI/SalI del vector binario Ti

�� pSPB176 (Figura 20). La inserción correcta de los fragmentos fue establecida por análisis de endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la canamicina. El plásmido resultante fue denominado pSPB1530 (Figura 19).

(v) Construcción del vector binario pSPB1534 (e35S 5’: BP#40: pet D8 3’; e35S 5’: PFMT: nos 3’; nos 5’: nptII: nos3’)

���

Un fragmento de ADN de ~3.1kb que contiene el casete de expresión e35S 5’: Viola F3’5’H (BP40): pet D8 3’ fue aislado a partir del plásmido pSPB580 (Figura 16) bajo la digestión con la endonucleasa de restricción AscI. El fragmento purificado fue ligado con los extremos AscI del plásmido binario Ti pSPB11531 (Figura 17). La inserción correcta del fragmento en una orientación tándem con el casete de FMT de Petunia y el casete del marcador genético, fue establecida por análisis de endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes

���

resistentes a la canamicina. El plásmido resultante fue denominado pSPB1534 (Figura 15).

Transformación de la planta con pSPB1534

El plásmido del vector binario pSPB 1534 (Figura 15) fue introducido en la cepa de A. tumefaciens AGL0 y el T-ADN contenido en pSPB1534 fue introducido en la variedad de Rosa hybrida WKS124 vía transformación mediada de Agrobacterium.

��� Construcción del vector binario pSPB1532(e35S 5’: BP#40: petD83’;e35S5’:TFMT:nos3’;nos5’: nptII:nos3’)

Un fragmento de ADN de ~3.1kb que contiene el casete e35S: Viola F3’5’H (BP#40): pet D8 3’ fue aislado a partir del plásmido pSPB580 (Figura 16) bajo la digestión con la endonucleasa de restricción AscI. El fragmento purificado fue ligado con los extremos AscI del plásmido binario Ti pSPB 1530 (Figura 19). La inserción correcta del fragmento en una orientación tándem con el casete de FMT de Torenia y el casete del marcador genético, fue establecida por análisis de

��� endonucleasa de restricción de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la canamicina. El plásmido resultante fue denominado pSPB1532 (Figura 18).

Transformación de la planta con pSPB1532

El plásmido del vector binario pSPB1532 (Figura 18) fue introducido en la cepa de A. tumefaciens AGL0 y el T-ADN contenido en pSPB1532 fue introducido en variedad de Rosa hybrida Lavande y WKS124 vía transformación mediada

��� de Agrobacterium.

Análisis Transgénico de pétalos de rosa

Las plantas transgénicas independientes fueron producidas y cultivadas a floración (Tabla 20). El color de pétalos de la flor fue medido con el espectrofotómetro CM-2002 (Minolta, Japan) instalado con el software SpectraMagic (Minolta, Japan) con el fin de obtener su tono y reflactancia (Tablas 21, 22 y 23). El tono (0-360˚) es el color básico de un objeto

���

tal como rojo, verde, púrpura, etc., y se define por su posición angular en un espacio de color cilíndrico, o en una Rueda de Color. Rojo puro y azul son 0 y 270 grados, respectivamente. Cuanto más cerca este el tono a 270˚, el color es más azul. La reflactancia (%) es el porcentaje de la luz que se refleja a partir de un objeto. Los espectrofotómetros miden una reflactancia del objeto a varios intervalos a lo largo del espectro visible para determinar la curva de espectro de color del objeto. Un valor de reflactancia inferior sugiere un color más oscuro. Royal Horticultural Society Colour Charts

���

(RHSCC) también fueron utilizadas para definir el color de los pétalos (Tablas 21, 22 y 23). Análisis de transferencia de ARN fue llevado a cabo en una selección de flores para confirmar la presencia de las transcripciones transgénicas. El análisis HPLC de las antocianidinas acumuladas en los pétalos de las rosas transgénicas se utilizó para detectar la producción de las novedosas antocianinas, petunidina y malvidina en flores de rosas (Tablas 21, 22 y 23).

TABLA 20

Número de eventos independientes de rosas transgénicas, producidos a partir de la transformación con T-ADNs contenido en los plásmidos pCGP3254, pSPB1532 y pSPB1534’

Variedad

Color Plásmido Genes # # de flores # col mod

Sonia

Albaricoque pCGP3254 F3’5’H y TFMT 36 8 5

Medeo

Albaricoque pálido pCGP3254 F3’5’H y TFMT 2 0 na

Lavande

Rosa pSPB1532 F3’5’H y TFMT 140 126 30

WKS124

Albaricoque pSPB1532 F3’5’H y TFMT 90 75 75

WKS124

Albaricoque pSPB1534 F3’5’H y PFMT 60 48 46

# se refiere al número de eventos transgénicos independientes producidos # de flores se refiere al número de eventos independientes que tienen flores hasta la fecha # col mod se refiere al número de eventos transgénicos independientes que producen flores con un color modificado del pétalo en comparación con el control

Las antocianinas de las flores de las rosas transgénicas fueron extraídas y las antocianidinas derivadas a partir de las antocianinas fueron analizadas por un sistema de HPLC como se describe en Fukui et al., (Phytochemistry, 47: 1409

�� 1416, 1998). Los derivados metilados de delfinidina, malvidina y petunidina fueron detectados en un número de flores de rosas transgénicas con color modificado de la flor (Tablas 21, 22 y 23). Peonidina, el derivado metilado de la cianidina también fue detectado en las flores de rosas transgénicas (Tablas 21, 22 y 23).

TABLA 21

Niveles de las antocianidinas detectadas en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. WKS124 transformados con el T-ADN en pSPB1532 que contiene genes quiméricos de FMT de Torenia y Viola F3’5’H

Del

Cya Pet Pel Peo Mal Total ref DP M Mal Metil Color del Pétalo

código

(mg/g) (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� tono (%)� (%)� (%)� (%)� RHSC C

5-1

0.22 0.02 0.18 0.07 0.06 0.64 1.19 341.86 3.51 92 57 78 72a púrpura

5-2

0.20 0.03 0.18 0.01 0.10 0.80 1.32 341.31 2.32 89 60 82 72a rojo-púrpura

7-1

0.45 0.07 0.32 0.01 0.14 0.82 1.81 352.50 0.89 88 45 71 61a rojo-púrpura

7-4

0.22 0.02 0.19 0.00 0.11 1.02 1.56 345.43 1.45 91 65 84 72a púrpura

12-1

0.13 0.01 0.11 0.00 0.07 0.86 1.18 343.56 1.49 93 73 88 78a púrpura

12-2

0.14 0.01 0.14 0.00 0.06 1.12 1.47 347.08 0.84 95 76 90 78a púrpura

12-3

0.22 0.03 0.16 0.00 0.04 0.27 0.72 346.05 2.96 90 37 64 64b rojo-púrpura

25-1

0.22 0.01 0.19 0.00 0.09 0.83 1.34 345.03 0.79 92 62 83 78a púrpura

25-2

0.25 0.01 0.19 0.00 0.06 1.24 1.3 342.77 0.87 96 71 85 78a púrpura

control

0 0.01 0 0.07 0 0 0.08 31.14 30.8 1 0 0 0 38b Albaricoque

(continuación)

Niveles de las antocianidinas detectadas en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. WKS124 transformados con el T-ADN en pSPB1532 que contiene genes quiméricos de FMT de Torenia y Viola F3’5’H

Del

Cya Pet Pel Peo Mal Total ref DP M Mal Meti l Color del Pétalo

código

(mg/g) (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� (mg/g)� tono (%)� (%)� (%)� (%)� RHSC C

Código = el número de acceso de la planta transgénica, Del, Cya, Pet, Pel, Peo, Mal (mg/g) se refiere a la cantidad de la antocianidina específica detectada en mg/g donde Del = delfinidina, Cya = cianidina, Pet = petunidina, Pel = pelargonidina, Peo = peonidina, Mal = malvidina DPM (%) = delfinidina o sus derivados metilados, petunidina y malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Mal (%) = malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Metil (%) = antocianidinas metiladas (petunidina, peonidina, malvidina) expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Total = las cantidades totales de antocianidinas detectadas (delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina, peonidina, pelargonidina) en mg/g RHSCC = colores observados descritos de acuerdo con the Royal Horticultural Society Color Charts tono = describe el color básico en grados, según se mide por un espectrofotómetro con software SpectraMagic (Minolta, Japan) Ref (%) = describe el porcentaje de luz reflejada, según se mide por un espectrofotómetro con software SpectraMagic (Minolta, Japan)

TABLA 22

Niveles de las antocianidinas detectados en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. Lavande transformadas con el T-ADN en pSPB1532 que contiene genes quiméricos de FMT de Torenia y Viola F3’5’H

código

Del (mg/g) Cya (mg/g) Pet(mg/ g) Pel(m g/g) Peo( mg/g) Mal( mg/g ) Tota l(mg /g) tono (˚) Ref (%) DPM (%) Mal (%) Metil (%) RHS CC Color del Pétalo

13-3

0.13 0.03� 0.04� 0� 0.01� 0.04� 0.25� 333.81 19.99� 82� 15� 36� 75a púrpura pálido

13-5

0.09 0.01 0.04 0 0,02 0.17 0.33 333.32 10.44 90 52 70 77b púrpura oscuro

(continuación)

Niveles de las antocianidinas detectados en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. Lavande transformadas con el T-ADN en pSPB1532 que contiene genes quiméricos de FMT de Torenia y Viola F3’5’H

código

Del (mg/g) Cya (mg/g) Pet(m g/g) Pel(m g/g) Peo( mg/g) Mal( mg/g ) Tota l(mg /g) tono (˚) Ref (%) DPM (%) Mal (%) Metil (%) RHSC C Color del Pétalo

17-1

0.11 0.05 0.04 0 0.07 0.09 0.36 344.08 13.07 67 26 57 186b Rosa

17-2

0.04 0.02 0.02 0 0.04 0.05 0.17 343.90 17.50 65 30 65 186c rosa

24-2

0.02 0.02 0.01 0 0.03 0.03 0.11 333.23 29.49 63 31 66 77d púrpura pálido

34-1

0 0.04 0 0 0.08 0 0.12 339.82 17.45 0 0 68 186c rosa

Control LA

0 0.08 0 0 0 0 0.08 345.25 16.75 0 0 0 186c rosa

Código = el número de acceso de la planta transgénica, Del, Cya, Pet, Pel, Peo, Mal (mg/g) se refiere a la cantidad de la antocianidina específica detectada en mg/g donde Del = delfinidina, Cya = cianidina, Pet = petunidina, Pel = pelargonidina, Peo = peonidina, Mal = malvidina DPM (%) = delfinidina o sus derivados metilados, petunidina y malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Mal (%) = malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Metil (%) = antocianidinas metiladas (petunidina, peonidina, malvidina) expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Total = las cantidades totales de antocianidinas detectadas (delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina, peonidina, pelargonidina) en mg/g RHSCC = colores observados descritos de acuerdo con the Royal Horticultural Society Color Charts tono = describe el color básico en grados según se mide por un espectrofotómetro con software SpectraMagic (Minolta, Japan) Ref (%) = describe el porcentaje de luz reflejada según se mide por un espectrofotómetro con software SpectraMagic (Minolta, Japan)

TABLA 23

Niveles de las antocianidinas detectados en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. WKS124 transformadas con el T-ADN en pSPB1534 que contiene genes quiméricos de FMT Viola F3’5’H y Petunia

código

Del (mg/g) Cya (mg/g) Pet(mg/ g) Pel( mg/g ) Peo(m g/g) Mal( mg/ g) Total( mg/g) tono (˚) Ref (%) DPM (%) Mal (%) Metil (%) RHSC C Color del Pétalo

02-2

0.44 0.06� 0.01� 0.02� 0� 0� 0.53� 347.53 10.15� 85� 0.0� 2� 64c rojo-púrpura

02-3

0.59 0.09� 0.01� 0.01� 0� 0� 0.7� 346.64 8.51� 85� 0.0� 2� 64c rojo-púrpura

07-1

0.91 0.10� 0.02� 0.03� 0� 0� 1.06� 352.44 7.26� 87� 0.0� 2� 71b rojo-púrpura

08-3

1.76 0.06� 0.03� 0.00� 0� 0� 1.85� 350.34 1.56� 97� 0.0� 2� 61b rojo-púrpura

08-6

1.34 0.06� 0.03� 0� 0� 0� 1.43� 354.15 1.11� 96� 0.0� 2� 61a rojo-púrpura

08-7

1.22 0.11� 0.02� 0.01� 0� 0� 1.36� 351.48 1.55� 92� 0.0� 2� 64b rojo-púrpura

11-2

1.60 0.17� 0.02� 0.01� 0� 0� 1.80� 357.44 1.14� 90� 0.0� 1� 61a rojo-púrpura

14-3

1.35 0.10� 0.03� 0.00� 0� 0� 1.48� 352.54 2.58� 93� 0.0� 2� 64b rojo-púrpura

14-5

1.11 0.04� 0.03� 0� 0� 0� 1.18� 352.52 1.78� 97� 0.0� 2� 64b rojo-púrpura

15-1

1.04 0.04� 0.02� 0� 0� 0� 1.10� 351.85 1.72� 97� 0.0� 2� 64b rojo-púrpura

15-2

1.25 0.06� 0.03� 0� 0� 0� 1.34� 347.89 3.77� 96� 0� 2� 64b rojo-púrpura

control

0 0.01� 0� 0.07� 0� 0� 0.08� 31.14 30.81� 0� 0� 0� 38b Albaricoque

(continuación)

Niveles de las antocianidinas detectados en una selección de flores a partir de eventos transgénicos independientes de R. hybrida cv. WKS124 transformadas con el T-ADN en pSPB1534 que contiene genes quiméricos de FMT Viola F3’5’H y Petunia

código

Del (mg/g) Cya (mg/g) Pet(mg/ g) Pel( mg/g ) Peo(m g/g) Mal( mg/ g) Total( mg/g) tono (˚) Ref (%) DPM (%) Mal (%) Metil (%) RHSC C Color del Pétalo

Código = el número de acceso de la planta transgénica, Del, Cya, Pet, Pel, Peo, Mal (mg/g) se refiere a la cantidad de la antocianidina específica detectada en mg/g donde Del = delfinidina, Cya = cianidina Pet = petunidina, Pel =pelargonidina, Peo = peonidina, Mal = malvidina DPM (%) = delfinidina o sus derivados metilados, petunidina y malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Mal (%) = malvidina expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Metil (%) = antocianidinas metiladas (petunidina, peonidina, malvidina) expresada como un porcentaje de antocianidinas totales detectadas Total = las cantidades de antocianidinas totales detectadas (delfinidina, petunidina, malvidina, cianidina, peonidina, pelargonidina) en mg/g RHSCC = colores observados descritos de acuerdo con la Royal Horticultural Society Color Charts tono = describe el color básico en grados según se mide por un espectrofotómetro con Software SpectraMagic (Minolta, Japan) Ref (%) = describe el porcentaje de luz reflejada según se mide por una espectrofotómetro con software SpectraMagic (Minolta, Japan)

Análisis de Transferencia de ARN

�� Las flores de 7 plantas transgénicas WKS124/pSPB1532 (líneas 5-1, 5-2, 7-1, 7-4, 12-1, 12-3) y 7 plantas transgénicas Lavande/1532 (líneas 13-2, 13-3,13-5, 17-1, 24-2, 34-1) junto con flores a partir de controles no-transgénicos WKS124 y Lavande fueron analizados para la presencia de transcripciones de los transgenes de Viola F3’5’H y FMT de Torenia introducidos.

ARN total fue aislado a partir de pétalos de rosa transgénicos con el uso de RNAeasy (Qiagen) siguiendo el protocolo

���

del fabricante. Veinte mg de ARN fueron separados a través de 1.2 % de gel de agarosa y transferidos a Hybond-N (Amersham) siguiendo el Manual de Instrucción del Kit DIG Northern Starter (Roche). Las sondas de ARN que hibridizan con ARNm de Viola F3’5’H (BP#40) y FMT de Torenia fueron preparados utilizando los plásmidos, pCGP1961 (que contiene el clon de ADNc Viola F3’5’H (BP#40)) (Australian Provisional Patent Applications No. 2002951088 y 2002952835, 2002, supra) y pTMT5 (Figura 8) que ha sido cada uno digerido con la endonucleasa de

���

restricción BamHI, como la plantilla de transcripción y el oligonucleótido T7 como el cebador de transcripción siguiendo el Manual de Instrucción del Kit DIG Northern Starter (Roche). Otra hibridación y detección también fueron llevadas a cabo siguiendo el Manual de Instrucción del Kit DIG Northern Starter (Roche).

Bajo las condiciones utilizadas, transcripciones de ~1.7kb fueron detectadas con la sonda Viola F3’5’H en la mayoría de las líneas analizadas excepto para la línea 34-1 (Lavande/pSPB1532). Una transcripción de ~1.0kb fue detectada con

���

la sonda TFMT en todas las 14 líneas transgénicas analizadas. Bajo las condiciones utilizadas, no se detectaron transcripciones de hibridación en los pétalos control de WKS124 y Lavande con la sondas Viola F3’5’H y TFMT.

Rosas transgénicas WKS124

La variedad de rosa WKS124 por lo general produce flores de color albaricoque (RHSCC 38b). El análisis HPLC de las antocianidinas revelan que la pelargonidina (0.07mg/g de pelargonidina) es la antocianidina predominante acumulada con los niveles bajos de cianidina presente también (0.01 mg/g de cianidina) (Tabla 21).

�� La introducción del gen quimérico Viola F3’5’H junto con la FMT de Torenia tuvo un impacto dramático en el color de las flores producido y en la composición de antocianidina en los pétalos. En una selección de pétalos con el cambio de color más dramático, los pigmentos 3’5’ hidroxilados (delfinidina, petunidina y malvidina) predominaron, siendo la malvidina, la antocianina más predominante (Tabla 21).

La introducción del gen quimérico Viola F3’5’N junto con la FMT de Petunia conduce a la producción de la antocianidina

���

3’5’ hidroxilada, delfinidina en una selección de pétalos de rosa. La actividad de la Viola F3’5’H introducida conduce a la producción de niveles de delfinidina relativamente altos (Tabla 23). Sin embargo la actividad resultante de la FMT de Petunia introducida en los pétalos de rosa WKS124 fue baja y solo una pequeña cantidad de la antocianidina metilada, la petunidina acumulada (Tabla 23). Puede ser que las condiciones fisiológicas dentro del pétalo de rosa WKS124 no sean ideales para que la FMT de Petunia trabaje eficientemente.

���

La producción de pigmentos predominantemente de delfinidina en un fondo de pétalos de WKS124 (WKS124/pSPB1534) conduce a un incremento en las antocianidinas totales producidas (a partir de 0.08mg/g en las flores control para 0.5-1.9 mg/g en las flores transgénicas). Esta producción de pigmentos predominantemente de delfinidina en pétalos WKS124 resultó en un cambio de color de albaricoque (flor control) a colores en los rangos de rosa oscuro a rojo-púrpura (Tabla 23). Un incremento similar en las antocianidinas totales fue observado en los pétalos

���

transgénicos WKS124/pSPB1532 (Tabla 21). Sin embargo, la delfinidina producida fue convertida a la petunidina metilada y los pigmentos basados en la malvidina y esto conduce a otro azulado del color de la flor en el rango de colores púrpura, resultando en novedosas flores de rosas coloreadas.

Los valores de matices de pétalos WKS124/1532 por lo general son más cercanos que aquellos de los pétalos WKS/1534 a 270˚, lo que indica que la producción de la malvidina o la metilación de antocianinas contribuye al azulado

���

del color de la flor. En otras palabras, los genes de FMT son útiles para modificar los colores de la flor, especialmente, pero no se limitan, hacia el azul.

Los valores de reflactancia de los pétalos WKS124/1532 son por lo general inferiores que aquellos de los pétalos WKS/1534, lo que indica que la producción de la malvidina o la metilación de antocianinas contribuye al oscurecimiento del color de la flor. En otras palabras, los genes de FMT son útiles para modificar los colores de la flor, especialmente,

���

pero no se limitan, hacia el color más oscuro. Además con estos cambios de color de la flor, las líneas WKS124/1532 que acumulan grandes cantidades de malvidina fueron más vivas y brillantes en apariencia. Tal modificación del color de la flor también se muestra por los cambios de RHSCC. Estos resultados demostraron claramente que los genes de FMT son útiles para modificar el color de la flor.

Rosas transgénicas Lavande

���

La variedad de rosa Lavande por lo general produce flores de rosas (RHSCC186c). El análisis de HPLC de las antocianidinas reveló que la cianidina (0.08 mg/g de cianidina) es la antocianidina predominante acumulada (Tabla 22).

La introducción del gen quimérico de Viola F3’5’H junto con la FMT de Torenia tuvo un impacto dramático en el color de las flores transgénicas Lavande producidas y en la composición de antocianidina en los pétalos. En una selección de pétalos con el cambio de color más dramático, los pigmentos 3’5’ hidroxilados (delfinidina, petunidina y malvidina)

���

predominaron, siendo la malvidina, la antocianina más predominante (Tabla 22).

La introducción de los genes de FMT de Viola F3’5’H y Torenia en Lavande conduce a un incremento en el nivel total de antocianidinas acumuladas en pétalos de rosas (a partir de 0.08 mg/g en las flores control a 0.11-0.36 mg/g en las transgénicas) (Tabla 22).

En este fondo de pétalo el cambio de color más dramático y cambio a azul (a color púrpura 77b) fue observado en una flor que contiene una alta proporción (90% de sus antocianidinas totales) de pigmentos basados en la delfinidina (delfinidina, petunidina y malvidina) con el 52% de las antocianidinas totales acumuladas siendo la malvidina.

En la línea 34-1 (Tabla 22), la delfinidina no fue producida lo que indica ausencia de actividad del gen F3’5’H

�� introducido. El análisis de transferencia de ARN no reveló hibridación de la transcripción Viola F3’5’H en esta línea. Sin embargo, una fuerte hibridación de la transcripción FMT de Torenia fue detectada y la actividad de FMT de Torenia fue confirmada mediante la producción de peonidina (el derivado metilado de la cianidina). Este resultado puso de relieve que la FMT de Torenia también fue capaz de metilar los pigmentos con base en cianidina.

EJEMPLO 12

��� Aislamiento de clones de ADNc de FMT a partir de Fuchsia spp

PCR de secuencias de FMT a partir de Fuchsia

El diseño CODEHOP de cebadores para PCR de secuencias de FMT a partir de Fuchsia

Con el fin de aislar las secuencias FMT a partir de Fuchsia, oligonucleótidos cebadores fueron diseñados a áreas de similitud de la secuencia de aminoácidos entre la FMT de Petunia (esta especificación) y la publicada (base de datos

���

GenBank) cafeoil CoA OMTs (V. vinifera (Z54233), S. longipes (L22203), P. tremuloides (U27116), P. kitakamiensis (AB00048), P. crispum (Z54183), E. gunnii (Y12228), N. tabacum (U38612), M. crystallinum (AF053553), A. thaliana (L40031)).

26: 1628-1635, 1998) (se indica en http://blocks.fhcrc.org/codehop.html), se utilizó. El programa CODEHOP diseña una

���

mezcla de cebadores que contiene todos los posibles 11- o 12-mers para una región "núcleo" redundante 3’ y que tiene el nucleótido más probable pronosticado para cada posición en una región “clamp” no-redundante 5’ (Tabla 24).

La estrategia de CODEHOP (COnsensus-DEgenerate Híbrido Oligonucleotide Primers) (Rosa et al., Nucl Acids Res,

TABLA 24

Oligonucleótidos diseñados a áreas de similitud de secuencia entre secuencias de metiltransferasa identificadas por el programa CODEHOP

SEQ ID NO:

CEBADOR SECUENCIA (5’ A 3’)

15

OMTIf2 ACC ATC GAG ATC GGC GTN TTY CAN GG

16

OMTIf4 GGACTTCGCCTTCGTGGAYGC NGA YAA

17

OMTIr3 TGA AGT TGA TCT TGT GCT CCA CNC CNG CYT T

18

OMTIr5 CGC CGG CAG AAG GTG ANN CCR TCN CC

donde R = A o G,Y = C o T,M = A o C,K = G o T,S = G o C,W = A o T,H = A o C o T,B = G o C o T,V = A o G o C,D = A

��� o G o T,N = A o G o Co T,I = deoxiinosina.

TABLA 25

Otros oligonucleótidos diseñados para uso en PCR de secuencias de FMT

SEQ ID

CEBADOR SECUENCIA (5’ A 3’) NO:

19

dT(17)Ad2Ad1

20

GI-anchor

27

Ad1 CTG AGA GAA CTA GTC TCG AG

I = deoxiinosina

ARN total fue aislado a partir de brotes de pétalos de Fuchsia utilizando el kit Plant RNAeasy (QIAGEN). Un microgramo de ARN se utilizó como una plantilla para sintetizar ADNc utilizando Superscript II (Stratagene) y el

�� oligonucleótido dT(17)Ad2Ad1 [SEQ ID NO: 19] (Tabla 25) bajo condiciones según las recomendaciones del fabricante. El ADNc se purificó pasándolo a través de una columna de purificación de PCR (QIAGEN) y eluyendo en 50 µL de Tris-HCl 10Mm, pH 8.5. El ADNc fue posteriormente cola-C utilizando transferasa terminal de Timo de Becerro (Boehringer Mannheim) utilizando condiciones recomendadas por el fabricante. El ADNc cola-C luego fue purificado a través de una columna de purificación de PCR (QIAGEN) y se eluyó en 50 µL de Tris-HCl 10 mM, pH8.5.

���

El ADNc cola-C (1 µL) posteriormente fue utilizado como plantilla en un PCR con 2.5 µL de 10 x solución reguladora HofSTAR (marca comercial) Taq QIAGEN, 4 µL de dNTP 1.25 mM, 5 µL de 50 ng/mL de cebador OMTIf2 [SEQ ID NO: 15], 5 µL de 50 ng/µL de cebador Ad1 [SEQ ID NO: 27] (Tabla 25), 2 µL de agua pura y 0.5 µL de polimerasa de ADN Taq HotSTAR (marca comercial) (QIAGEN). La reacción se calentó a 95˚C durante 15 minutos luego se corre a través de 35 ciclos de 94˚C durante 30 segundos, 50˚C durante 30 segundos, 72˚C por 90 segundos, seguido por 72˚C

���

durante 10 minutos.

Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis a través de un 1% peso/v de gel de agarosa y los productos esperados de alrededor de 0.8 kb de longitud fueron extraídos, se purificaron y ligaron con pCR 2.1 (Invitrogen). Una selección aleatoria de transformantes fue analizada para la presencia de insertos por digestión con la endonucleasa de restricción EcoRI. Los transformantes que contienen insertos de 0.8 kb fueron secuenciados utilizando los cebadores

���

Reverso M13 y Hacia adelante M13-21. Un ejemplo de secuencias resultantes de Fuchsia que muestran similitud a FMTs se encuentra en el plásmido designado pCGP3267 (Figura 21).

La FMT de Fuchsia (SEQ ID NO: 21) contenido en pCGP3267 mostró 66% y 64% de identidad en el nivel de nucleótido con la FMT de Petunia [SEQ ID NO:4] y Torenia [SEQ ID NO:11] cuando se compara la secuencia codificante correspondiente solo con la longitud del clon de FMT Fuchsia parcial. La secuencia de aminoácidos deducida de la

���

codificada por el clon de FMT de Fuchsia en pCGP3267 mostraron 81% de similitud con ambas la FMT de Petunia [SEQ ID NO:5] y Torenia [SEQ ID NO:12] otra vez considerando solo la región comparable a la longitud del clon de Fuchsia parcial.

Generación del clon de FMT de Fuchsia de longitud completa

Una estrategia genómica fue empleada para generar secuencia arriba del clon de ADNc de FMT de Fuchsia [SEQ ID

��� NO: 21] contenido en el plásmido pCGP3267 (Figura 21).

Aislamiento de ADN genómico a partir de Fuchsia

Construcción de la biblioteca genómica del plásmido

El AND genómico (ADNg) fue extraído de 1 g de material fresco de hojas jóvenes de variedad Fuchsia hybrida Derby Imp utilizando el kit Qiagen DNeasy maxi y siguiendo la instrucciones del fabricante. Aproximadamente 1.2 mg de ADNg luego fue digerido con la endonucleasa de restricción, TaqI. Los fragmentos digeridos de ADN genómico, a continuación fueron ligados (utilizando kit Amersham ligation) con extremos EcoRV desfosforilados del vector

�� pBluescript II (Stratagene). La mezcla de ligación luego fue utilizada como una plantilla en PCR.

El cebador OMTIf1 [SEQ ID NO: 23] junto con el cebador FucR1 [SEQ ID NO: 34] (Tabla 26) que fue diseñado para el clon de ADNc de FMT de Fuchsia contenido en pCGP3267 fueron utilizados en un PCR utilizando ADN genómico de Fuchsia como plantilla. Los productos amplificados se purificaron y ligaron en el vector pCR2.1. El análisis de secuencia de un fragmento de 274 bp (designado como el fragmento amplificado "OMTIf1/FucR1") reveló que este

���

fragmento incluyó 51 bp de secuencia solapante con el clon de ADNc de FMT de Fuchsia en el plásmido pCGP3267, otro de 74 bp de nueva secuencia arriba codificante de este punto, un intrón que tuvo 88 bp de longitud y otro de 61 bp de nueva secuencia arriba codificante a partir del intrón.

Además de esto una combinación del par del cebador anidado (FucR5 [SEQ ID NO:36] y FucR6 [SEQ ID NO:37] luego fue diseñada para la secuencia que fue secuencia arriba a partir del intrón. Los cebadores FucR5 [SEQ ID NO:36] y

���

FucR6 [SEQ ID NO:37] fueron utilizados en ADNg de Fuchsia que ha sido digerido con la endonucleasa de restricción, TaqI. Los productos que se amplificaron fueron ligados con los extremos AccI del vector pBluescript KS (Stratagene). Una primera ronda de amplificación por PCR fue llevada a cabo utilizando los cebadores FucR5 [SEQ ID NO:36] y M13rev (NEB) y ADNg de Fuchsia como plantilla. Los productos se purificaron utilizando una columna Qiaquick (QIAGEN) y luego se adicionaron como plantilla a la segunda ronda de amplificación por PCR con los cebadores

���

FucR6 [SEQ ID NO:36] y T3 (Stratagene). Los productos amplificados se purificaron y ligaron en el vector pCR2.1. El análisis de secuencia de un fragmento de 247 bp (designado "fragmento amplificado FucR6/T3") reveló otros 24 bp de una nueva secuencia arriba codificante de aquella obtenida con el "fragmento amplificado OMTlf1/FucR1". El resto de la secuencia consistió de otro intrón que tuvo 223 bp de longitud y no otra secuencia codificante podría ser identificada secuencia arriba de esta. Otros 51 a 54 bp de secuencia (i.e. 17 o 18 aminoácidos) fueron necesarios para alcanzar la

���

presunta metionina inicial según se determina mediante la comparación con las secuencias de FMT de Torenia y Petunia. Por consiguiente, una estrategia fue desarrollada para utilizar la secuencia 5’ del clon de ADNc de FMT de Torenia y ligar esta con el producto de PCR más largo de FMT de Fuchsia para generar un clon de ADNc de FMT de Fuchsia de longitud completa y funcional.

Un cebador (FucF1) [SEQ ID NO:38] fue diseñado en el extremo 5’ de la secuencia codificante encontrada en el

���

fragmento FucR6/T3 amplificado (descrito anteriormente). El cebador Fuck [SEQ ID NO:381 y el cebador Ad1 [SEQ ID NO:27] fueron utilizados en un PCR con ADNc de Fuchsia como plantilla (síntesis de ADNc de Fuchsia descrito anteriormente). El producto amplificado se clonó en pCR2.1 y el plásmido resultante fue denominado pCGP3282. El plásmido pCGP3282, se utilizó como plantilla en un PCR con los cebadores Ad1 [SEQ ID NO:27] y Tor-5’pos [SEQ ID NO: 39] y Taq polimerasa de ADN HotSTAR taq (QIAGEN). El uso del Taq polimerasa de ADN, HotSTAR taq

���

(QIAGEN) deja un 3’-A saliente en el producto amplificado. El producto amplificado resultante (definido como "fragmento amplificado Tor-5’ pos/Adl") luego fue digerido con la endonucleasa de restricción, SpeI. (una secuencia de reconocimiento SpeI se localiza dentro del cebador Ad1 en el extremo 3’ del clon de ADNc).

Los cebadores Tor-5’pos [SEQ ID NO:391’y Tor-5’neg [SEQ ID NO:40] fueron hibridizados juntos bajo incubación a 75˚C durante 5 minutos, seguido por un enfriamiento lento a 37˚C durante 30 minutos. Estos cebadores fueron

���

diseñados de manera que una vez hibridizados habría un saliente "T" en el extremo 3’ de la secuencia y la secuencia saliente compatible con una secuencia de reconocimiento EcoRI en el extremo 5’. El oligonucleótido hibridizado fue ligado con los extremos SpieI del "fragmento amplificado Tor-5’ pos/Ad1". Estos productos ligados luego fueron utilizados como plantilla en un PCR utilizando los oligonucleótidos Tor-5’pos [SEQ ID NO:39] y Ad1 [SEQ ID NO:27] como cebadores. El producto PCR a continuación se ligó con el vector de clonación pCR2.1. El plásmido resultante fue

���

denominado pCGP3289 (Figura 22).

La FMT de Fuchsia [SEQ ID NO: 43] contenida en pCGP3289 mostraron 51%, 48% y 56% de identidad en el nivel de nucleótido con la FMT de Petunia E20 [SEQ ID NO:4], Petunia E33 [SEQ ID NO:26] y Torenia [SEQ ID -NO 11], respectivamente. La secuencia de aminoácidos deducida codificada por el clon de FMT de Fuchsia en pCGP3289 [SEQ ID NO:44] mostró 67%, 80% y 82% de similitud con la FMT de Petunia E20 [SEQ ID NO:5], Petunia E33 [SEQ ID

���

NO:7] y Torenia [SEQ ID NO:12]; respectivamente.

TABLA 26

Cebador

SEQ ID NO:

NOMBRE SECUENCIA 5’ A 3’

34

FucR1 GCA AGT GCA GTG CAA AGA AGA G

35

FucR3 GAT CTT ATG TTC CAC TCC GC

36

FucR5 GAG AGA TCT GAC CAG TAA GG

37

FucR6 GGA TAT TTT TCG GCC GTG ACC TCC

38

FucF1 ATC TTA GAG ACG ACT OCT TAT CCC

39

Tor-5’pos

40

Tor-5’ neg imagen1

Construcción de pCGP3292 (35S 5’: FFMT: 35S 3’; 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’; 35S 5’: SuRB vector binario)

El plásmido binario pCGP3292 (Figura 25) fue construido para permitir la producción de derivados de delfinidina

�� metilados tales como petunidina y malvidina en una línea que normalmente no produce pigmentos basados en la delfinidina y no contiene un flavonoide metiltransferasa capaz de metilar antocianinas basadas en delfinidina.

El plásmido binario pCGP3292 (Figura 25) contiene un casete de expresión 35S 5’: FFMT: 35S 3’ (a partir del plásmido pCGP3290 (Figura 23)) y un casete de expresión 35S 5’: Viola F3’5’H: 35 3’, ambos en tándem con el casete del marcador genético 35S 5’:SuRB del vector binario Ti de pCGP 1988 (Figura 12).

��� Construcción de plásmidos intermedios

(i) Construcción de pCGP3290 (casete de expresión 35S 5’ FFMT: 35S 3’)

El plásmido pCGP3290 (Figura 23) fue construido, mediante la clonación del clon de ADNc de FMT de Fuchsia (FFMT) a partir de pCGP3289 (Figura 22) en el casete de expresión CaMV 35S.

El plásmido pRTppoptcAFP se utilizó como una fuente de un promotor CaMV 35S y fragmentos terminadores. Fue

���

inicialmente digerido con la endonucleasa de restricción XbaI, los extremos 5’ salientes fueron reparados y luego el plásmido fue digerido con la endonucleasa de restricción EcoRI para liberar el vector de 3.3kb que contiene el casete de expresión CaMV 35S. El fragmento de 3.3 kb fue aislado y purificado.

El plásmido pCGP3289 (Figura 22) fue digerido inicialmente con la endonucleasa de restricción SpeI y los extremos salientes 5’ resultantes fueron reparados. El plásmido linearizado a continuación fue restringido con la endonucleasa de

���

restricción EcoRI para liberar un fragmento de ADNc de FMT de Fuchsia de 1.0 kb, el cual fue aislado, purificado y luego se ligo con los extremos XbaI (romo)/EcoRI del vector pRTppoptc (descrito anteriormente). La ligación corregida de los fragmentos fue establecida por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, XhoI, y PstI,) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la ampicilina. El plásmido resultante fue denominado pCGP3290 (Figura 23).

���

(ii) Construcción de pCGP2788 (vector binario 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’; 35S 5’: SuRB)

El plásmido binario pCGP2788 (Figura 24) contiene el casete de expresión 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’ (a partir de pCGP3254 (Figura 13) en tándem con el casete del marcador genético 35S 5’: SuRB del plásmido binario Ti pCGP1988 (Figura 12).

El plásmido binario pCGP3254 (Figura 13) fue digerido con la endonucleasa de restricción PstI para liberar el casete de

�� expresión 35S 5’: FMT de Torenia; 35S 3’ y el esqueleto del vector de expresión binario. Los fragmentos resultantes fueron precipitados con etanol (Sambrook et al., 1989, supra) y la mezcla de fragmentos se vuelve a ligar. La ligación corregida del esqueleto del vector que contiene el gen 35S 5’: SuRB y el gen quimérico Viola F3’5’H sin el casete 35S 5’:Torenia FMT: 35S 3’ fue establecido por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, EcoRV, PstI, EcoRI, y NcoI) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue

��� denominado pCGP2788 (Figura 24).

Construcción de pCGP3292 (35S 5’: FFMT: 35S 3’; 35S 5’: Viola F3’5’H: 35S 3’: 35S 5’: SuRB expresión binaria)

El plásmido pCGP3292 (Figura 25) fue construido, mediante la clonación del gen quimérico de FMT de Fuchsia a partir de pCGP3290 (Figura 23) en el vector binario Ti pCGP2788 (Figura 24).

El casete de expresión 35S 5’: FFMT. 35S 3’ a partir de pCGP3290 (Figura 23) fue liberado por la digestión con la

���

endonucleasa de restricción PstI. Un fragmento de 1.66 kb que contiene el gen quimérico de FMT de Fuchsia posteriormente fue aislado y ligado con los extremos PstI del vector binario, pCGP2788 (Figura 24). La ligación corregida del gen quimérico en tándem con el gen 35S 5’: SuRB y el gen quimérico F3’5’H de pCGP2788 fue establecida por análisis de endonucleasa de restricción (HinDIII, XhoI, PstI, EcoRI, y NcoI) de ADN del plásmido aislado a partir de transformantes resistentes a la tetraciclina. El plásmido resultante fue denominado pCGP3292 (Figura 25).

���

Transformación de la planta con pCGP3292

El plásmido del vector binario pCGP3292 fue introducido en la cepa de A. tumefaciens AGL0 y el contenido de T-ADN en pCGP3292 se introduce en osa hybrida vía transformación mediada de Agrobacterium para producir pigmentos basados en petunidina y malvidina y conducir a las modificaciones del color de la flor (como se detalla en el Ejemplo 11)

��� EJEMPLO 13

Dendograma de metiltransferasas de plantas

Un dendograma fue construido utilizando el paquete de software ClustalW (Thompson et al., 1994, supra) (Figuras 26). Las secuencias de aminoácidos deducidas de FMTs de Petunia (pCGP1907.aa), Torenia (pTMT5.aa) y Fuchsia (pCGP3267.aa), fueron alineadas con otras O-metiltransferasas de planta de longitud completa de ambas Clase I y

���

Clase II encontradas en la base de datos GenBank. El dendograma (Figura 26) muestra la relación de agrupación entre estas secuencias. Todas las secuencias SAMOMT de Clase I se agrupan juntas debido a su nivel de similitud de secuencia global. Las secuencias de FMT de Petunia, Torenia y Fuchsia se agrupan con SAM-OMTs de Clase I. Sin embargo, se diferencian a partir del grupo principal. Esto indica que estas secuencias se relacionan entre sí pero comparten un nivel de identidad inferior de secuencia y de similitud con otras SAM-OMTs dentro de esta clase. Las

���

otras SAM-OMTs de Clase I han sido identificadas como CCoAOMTs ya sea por la prueba de la actividad correspondiente de la enzima con sustratos fenilpropanoide CoA-activados derivados a partir de ácido cafeico, o por similitud de secuencia con las entradas de base de datos. Las secuencias de una CCoAOMT de A. thaliana (GenBank L40031) y una CCoAOMT de Populus kitakamiensis (GenBank AB000408) se encontraron en un grupo adyacente a aquellas de las FMTs descritas en este documento. Estas secuencias son más similares a las FMTs que otras

���

CCoAOMTs. Sin embargo, no existe evidencia experimental de estos clones respecto a la actividad de la enzima o sustratos que se metilan. Las ramas restantes del dendograma se forman por agrupaciones de SAM-OMTs de Clase II. Estas incluyen COMTs (OMTs del ácido cafeico), F3’OMT (flavonoide 3’-OMT; Gauthier et al., 1996, supra), IOMTs (OMTs de isoflavona; He and Dixon, 1998, supra), 2’OMTs .(isoliquiritigenina 2’-OMT; Maxwell et al., 1993, supra), IMT (inositol OMT; Rammesmeyer et al., 1995, supra), y F7OMT (flavonoide 7-OMT;, Christensen et al., 1998, supra), entre

���

otros. Dada la variedad de sustratos utilizados por los miembros de Clase II SAMOMTs, y la capacidad de algunas de estas proteínas actuar en compuestos flavonoide que estructuralmente se relacionan con las antocianinas, fue

inesperado que las FMTs aisladas a partir de Petunia, Torenia y Fuchsia no caen en esta categoría de SAM-OMTs. Revisiones en la literatura (Ibrahim and Muzac, 2000, supra; Schroder et al., Phtochemistry. 59: 1-8, 2002) han sugerido que las metiltransferasas que actúan en los flavonoides y específicamente en las antocianinas debería caer en las SAM-OMTs de Clase II. Sorprendentemente las secuencias de FMT reveladas en esta especificación se asemejan

�� a las CCoAOMTs en Clase I más íntimamente que los miembros de las SAM-OMTs de Clase II. Las CCoAOMTs se conocen para utilizar eficientemente solo un par de sustratos CoA-activados, cafeoil-CoA (CCoA) y 5-hidroxiferuloil-CoA (HFCoA). Estos compuestos fenilpropanoide se derivan directamente a partir de ácido cafeico (CA) y ácido 5hidroxiferulico (HFA) que se utilizan eficientemente por proteínas COMT de SAM-OMTs de Clase II. La estructura básica del anillo de estos flavonoides y antocianinas es similar, la diferencia principal con las antocianinas es la

���

presencia de grupos laterales de acil y azúcar que forman agregados voluminosos a la molécula. Se piensa que estos grupos pueden imponer diferentes requisitos estéricos de las enzimas implicadas en la modificación de antocianina en comparación con, por ejemplo, moléculas de flavanona e isoflavonoides. Por lo tanto, en lo que respecta a los compuestos de antocianina, los grupos laterales de acil y azúcar pueden imitar el grupo CoA grande adherido a estas moléculas imponiendo un requisito estérico similar en las proteínas SAM-OMT que actúan sobre estas.

���

EJEMPLO 14

Aislamiento de ADNcs de FMT a partir de otra especie

Las antocianinas metiladas tales como pero no limitando a peonidina, petunidina y malvidina se producen en Petunia sp., Plumbago sp., Vitis sp., Babiana stricta, Pinus sp., Picea sp., Larix sp., Phaseolus sp., Solanum sp., Vaccinium sp., Cyclamen sp., Iris sp., Pelargonium sp., Geranium sp., Pisum sp., Lathyrus sp., Clitoria sp., Catharanthus sp., Malvia

��� sp., Mucuna sp., Vicia sp., Saintpaulia sp., Lagerstroemia sp., Tibouchina sp., Hypocalyptus sp., Rhododendron sp., Linum sp., Macroptilium sp., Hibiscus sp., Hydrangea sp., Ipomoea sp., Cymbidium sp., Millettia sp., Hedysarum sp., Lespedeza sp., Antigonon sp., Pisum sp., etc..

Se espera que un número de estas plantas contengan flavonoide metiltransferasas (FMT).

Las antocianinas metiladas raras (tales como 5-metil delfinidina, 5-metil petunidina y 5-metil malvidina) se han aislado a

���

partir de flores de plantas en la familia Plumbaginaceae Harbome, 1967, supra). Se ha reportado que las flores de Plumbago contienen una antocianina rara que es metilada en la posición 5-O de malvidina. Esta molécula fue descrita como capensinidina (5-O-metil malvidina) (Harbome, 1962, 1967, supra). El copigmento flavonol presente fue descrito como azaleina (quercetina 5-metil éter 3-O-ramnósido) (Harborne, 1962, 1967, supra). Otro análisis del capsensis Plumbago de jardín común (también conocida como Plumbago auriculata) ha revelado que la antocianina metilada fue

���

5, 7-di-O-metil malvidina (S. Bloor, resultados no publicados). Se espera que las flores a partir de plantas en la familia Plumbaginaceae tal como Plumbago son una fuente apropiada de secuencias FMT que codifican FMTs que metilarían las antocianinas en las posiciones 3’, 5’, 3’ y 5’ así como las posiciones 5-O y 7-O.

El aislamiento de ADNcs de FMT a partir de la plantas enumeradas anteriormente y otras se logran por la detección de respectivas bibliotecas de ADNc con SEQ ID NO:1 y/o 4 y/o 6 y/o 11 I y/o 21 y/o 26 y/o 41, y/o 43 utilizando

���

condiciones de hibridación de baja severidad tales como aquellas descritas en el Ejemplo 9 o en la introducción de la especificación instantánea.

De manera alternativa, el aislamiento de los fragmentos de ADNc de FMT se logran utilizando la reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores CODEHOP como se enumera en la Tabla 24 (Ejemplo 11 ) o cebadores redundantes como se enumera en la Tabla 27, a continuación. Un ejemplo de las combinaciones de pares de

���

cebadores que pueden ser utilizadas se muestran en la Tabla 28, a continuación. Los productos de amplificación de amplificación se clonan en vectores de plásmidos bacterianos y Fragmentos de ADN utilizados como sondas para seleccionar las respectivas bibliotecas de ADNc para aislar, clones de ADNc de FMT más grandes y de longitud completa. La funcionalidad y especificidad de los clones de ADNc se determinan utilizando métodos descritos en los Ejemplos 7, 8, 9, 10 y 11.

TABLA 27

Cebadores más redundantes diseñados para áreas de similitud de secuencia de aminoácidos entre metiltransferasas que actúan sobre las antocianinas

SEQ ID NO:

CEBADOR SECUENCIA (5’ A 3)

23

OMTIf1 CCGGGAGCACGAGCACYTNAARGARYT

24

OMTIf3. GGCCTGCCCTTCATCCARAARGCNGGNG

25

OMTIr4 CGTGGTAGTTCCCGTAGTTGCTCTTRT CNG CRT C

donde R=A o G,Y=C o T,M=A o C,K = G o T,S = G o C,W = A o T,H = A o C o T, B =G o C o T, V =A o G o C, D = A o G o T, N = A o G o C o T, I = deoxiinosina.

�� TABLA 28

Pares de cebadores que se utilizan en el aislamiento de otros fragmentos de ADNc de FMT a partir de diferentes plantas

Cebador hacia adelante

SEQ ID NO: Cebador reverso SEQ ID NO: Fragmento esperado (bp)

OMTIf1

21 OMTIr3 ’ 17 285

OMTIf1

21 OMTIr4 23 399

OMTIf1

21 QMTIr5 18 609

OMTIf1

21 Ad1 27 620+3’UTR

OMTIf2

15 OMTIr3 17 159

OMTIf2

15 OMTIr4 23 273

OMTIf2

15 OMTIr5 18 483

OMTIt2

15 Ad1 27 492+3’UTR

OMTIf3

22 OMTIr4 23 162

OMTIf3

22 OMTIr5 18 372

OMTIf3

22 Ad1 27 381+ 3’UTR

OMTIf4

16 OMTIrS 18 258

OMTIf4

16 Ad1 27 267 + 3’UTR

OMTIr3

17 GI-anchor 20 375 + 5’UTR

(continuación)

Pares de cebadores que se utilizan en el aislamiento de otros fragmentos de ADNc de FMT a partir de diferentes plantas

Cebador hacia adelante

SEQ ID NO: Cebador reverso SEQ ID NO: Fragmento esperado (bp)

OMTIr4

23 GI-anchor 20 489 + 5’UTR

OMTIr5

18 GI-anchor 20 699 + 5’UTR

+ 3’UTR = más la secuencia no traducida 3’, + 5’UTR = más la secuencia no traducida 5’

Las estimaciones del tamaño esperado de fragmento se basan en la secuencia de FMT de Petunia (E20) [SEQ ID

�� NO:4]. Los tamaños obtenidos utilizando ADNc como plantilla a partir de diferentes especies sería esperado que varíe.

EJEMPLO 15

Uso de FMTs

Con el fin de producir pigmentos de delfinidina metilada en plantas que normalmente no producen pigmentos basados en la delfinidina y no contienen un flavonoide metiltransferasa capaz de metilar las antocianidinas, específicamente la

���

delfinidina, construcciones que contienen la combinación de un gen F3’5’H (tales como pero no limitando al gen quimérico Viola F3’5’H) y un gen de FMT (tales como, pero no limitando a aquellos aislados a partir de Petunia, Fuchsia, Torenia, Plumbago) se introducen en una especie que normalmente no produce pigmentos basados en la delfinidina. Tales plantas pueden incluir pero no se limitan a claveles, crisantemos, gérberas, orquídeas, Euphorbia, Begonia y manzana.

���

Con el fin de producir pigmentos metilados en especies o variedades de especies que producen delfinidina o cianidina pero que no tienen un flavonoide metiltransferasa capaz de metilar estas antocianinas, genes de FMT se introducen en especies de plantas o variedades de especies específicas que no producen pigmentos de antocianina metilados. Tales plantas incluyen pero no se limitan a pensamiento, Nierembergia, lisianthus, variedades de vid y lirios.

Con el fin de reducir o bloquear la producción de pigmentos metilados indígenas, una variedad de estrategias se

���

pueden emplear incluyendo pero no limitando a tecnologías de PTGS, ARNi, antisentido, co-supresión. Las estrategias incluyen la introducción de secuencias de FMT en la especie de planta o variedades de especie que producen pigmentos de antocianina metilados tales como petunidina, malvidina, peonidina, capsenidina u otra antocianina metilada. Tales especies incluyen aquellas descritas en el Ejemplo 14, tales como Impatiens, Catharanthus, ciclamino, Torenia, Petunia, Fuchsia, Plumbago, Pelargonium y ciertas variedades de vid.

���

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���

Yabuya et al., Euphytica, 98: 163-167, 1997. LISTA DE SECUENCIAS

<110> International Flower Developments Pty Ltd Brugliera, Filippa (US only) Demelis, Linda (US only)

���

Koes, Ronald (US only) Tanaka, Yoshikazu (US only)

<120> Secuencias genéticas y sus usos

<130> 2606090/EJH

<140> No disponible aún

<141> 2003-01-24

<150> AU PS0174/02

<151> 2002-01-25

<160> 47

�� <170> Patente En versión 3.1

<210> 1

<211> 969

<212> ADN

<213> DifE

��� <400> 1

imagen1

<210> 2 <211> 251

<212> PRT

<213> DifE

<400> 2

imagen2

imagen1

<210> 3

<211> 45

<212> ADN

�� <213> oligonucleótido

<400> 3 gagagagaga gagagagaga tctcgagttt tttttttttt ttttt 45

<210> 4

<211> 888

��� <212> ADN

<213> E20

<400> 4

imagen1

<210> 5

<211> 263

��

<212> PRT

<213> E20

<400> 5

<210> 6

<211> 1077

<212> ADN

��

<213> E33

<400> 6

<210> 7

<211> 244

��

<212> PRT

<213> E33

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> ADN

��

<213> oligonucleótido

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<400> 8 cttgctttgc cagaagatgg 20

<210> 9

<211> 32

���

<212> ADN

<213> oligonucleótido

<400> 9 gcatggatcc acaggcaaaa ccgcccaccc tg 32

<210> 10

���

<211> 31

<212> ADN <213> oligonucleótido

<400> 10 gcatctgcag ctaggagaga cgcctgaaa g 31

<210> 11

�� <211> 1006

<212> ADN

<213> TMT5.

<400> 11

imagen1

��� <210> 12

<211> 239

<212> PRT

<213> TFMT5

<400> 12

imagen1

imagen1

<210> 13

<211> 37

<212> ADN

��

<213> TMTS.BamHI.F

<400> 13 gcatggatcc aaagataagt tctatggcac cattttg 37

<210> 14

<211> 35

<212> ADN

<213> TMT5.PstI.R

��

<400> 14 gcatctgcag ttatttgaga cgtttgcaca aggtg 35

<210> 15

<211> 26

<212> ADN

���

<213> OMTIf2

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> N= A o G o C o T

���

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> N= A o G o C o T

<400> 15

���

accatcgaga tcggcgtntt ycangg 26

<210> 16

<211> 27

<212> ADN

<213> OMTIf4

���

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> Y = C o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> N= A o G o C o T

�� <220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> Y = C o T

<400> 16

���

cgacttcgcc ttcgtggayg cngayaa 27

<210> 17

<211> 31

<212> ADN

<213> OMTIr3

���

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> N= A o G o C o T

<220>

���

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> N= A o G o C o T

<220>

<221> misc_feature

���

<222> (29).. (29)

<223> Y = C o T

<400> 17 tgaagttgat cttgtgcrcc acnccngcyt t 31

<210> 18

<211> 26

<212> ADN

<213> OMTIr5

�� <220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> N= A o G o C o T

<220>

���

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> R= A o G

<220>

<221> misc_feature

���

<222> (24)..(24)

<223> N= A o G o C o T

<400> 18 cgccggcaga aggtganncc rtcbcc 26

<210> 19

���

<211> 45

<212> ADN

<213> dT(17)Ad2Ad1

<400> 19 ctgagagaac tagtctcgag ctctagaaca agcttttttt ttttt 45

���

<210> 20

<211> 36

<212> ADN

<213> GI anchor

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> I = deoxiinosina

�� <220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> I = deoxiinosina

<220>

���

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> I = deoxiinosina

<400> 20 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36

���

<210> 21

<211> 780

<212> ADN

<213> FMT Fuchsia

<400> 21

imagen3

imagen1

<210> 22

<211> 166

<212> PRT

��

<213> FMT Fuchsia

<400> 22

<210> 23

<211> 27

<212> ADN

��

<213> OMTIf1

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Y = C o T

<220>

<221> misc_feature

��

<222> (19)...(19)

imagen1

<223> N= A o G o C o T

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

���

<223> R= A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> R= A o G

���

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Y = C o T

<400> 23

���

ccgggagcac gagcacytna argaryt 27

<210> 24

<211> 28

<212> ADN

<213> OMTIf3

���

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> R= A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> R= A o G

�� <220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> N= A o G o C o T

<220>

���

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> N= A o G o C o T

<400> 24 ggcctgccct tcatccaraa rgcnggng 28

���

<210> 25

<211> 34

<212> ADN

<213> OMTIr4

<220>

���

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> R= A o G

<220>

<221> misc_feature

���

<222> (32)..(32)

<223> R= A o G

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> N= A o G o C o T

<400> 25 cgtggtagtt cacgtagttg ctcttrtcng crtc 34

��

<210> 26

<211> 1079

<212> ADN

<213> E.33

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Ad1

<400> 27

��

ctgagagaac tagtctcgag 20

imagen3

<210> 28

<211> 28

<212> ADN

<213> petD8#1

���

<400> 28 ccctcgagtt tctattttgt gtgtgttg 28

<210> 29

<211> 26

<212> ADN

���

<213> petD8#2

<400> 29 gggaattcta gagctcgagg atcacg 26

<210> 30

<211> 24

���

<212> ADN

<213> PMT-F

<400> 30 actaccaagg atcctactga agca 24

<210> 31

���

<211> 20

<212> ADN

<213> PMT-R

<400> 31 ctcgaatgaa gcttttgtta 20

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

�� <213> TMT-F

<400> 32 cataaatagg atccgcagca gcaa 24

<210> 33

<211> 20

���

<212> ADN

<213> TMT-R

<400> 33 agtctcataa gcttctctat 20

<210> 34

���

<211> 22

<212> ADN

<213> FucR1

<400> 34 gcaagtgcag tgcaaagaag ag 22

���

<210> 35

<211> 20

<212> ADN

<213> FucR3

<400> 35

���

gatcttatgt tccactccgc 20

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> FucR5

<400> 36 gagagatctg accagtaagg 20

<210> 37

�� <211> 24

<212> ADN

<213> FucR6

<400> 37 ggatattttt cggccgtgac ctcc 24

���

<210> 38

<211> 24

<212> ADN

<213> FucF1

<400> 38

���

atcttagaga cgactgctta tccc 24

<210> 39

<211> 68

<212> ADN

<213> Tor-5’ pos

���

<400> 39

<210> 40

<211> 63

<212> ADN

���

<213> Tor-5’ neg

imagen1

<400> 40 <210> 41 <211> 841

imagen1

<212> ADN

<213> FMT Fuchsia (3282)

�� <400> 41

imagen1

<210> 42

<211> 218

��� <212> PRT

<213> FMT Fuchsia (3282)

<400> 42

imagen1

<210> 43

<211> 943

<212> ADN

<213> FMT Fuchsia completa (3289)

�� <400> 43

imagen1

<210> 44

<211> 236

���

<212> PRT

<213> FMT Fuchsia completa (3289)

<400> 44

<210> 45

<211> 8

<212> ADN

<213> oligonucleótido

<400> 45

<210> 46

<211> 8

<212> ADN

<213> oligonucleótido

���

<400> 46

<210> 47

<211> 8

<212> ADN

���

<213> oligonucleótido

imagen1

imagen2

imagen1

<400> 47

imagen1

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCION

Esta lista de referencias citada por el aspirante es solamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la patente Europea. Aún cuando se ha tenido gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad a este respecto.

�� Documentos de patentes citadas en la descripción

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AU 2002952835 [0135] [0217] [0222] [0241] [0287]

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Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica un flavonoide metiltransferasa (FMT), en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende:

   �� (i) una secuencia de nucleótidos enunciada en SEQ ID NO:11;

   (ii) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:11;

   (iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con SEQ ID NO:11 o su forma complementaria;

   ���

   (iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos enunciada en SEQ ID NO:12;

   (v)

   una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad después de la alineación óptima con SEQ ID NO:12;

   (vi)

   una secuencia de nucleótidos capaz de hibridizar bajo condiciones de alto rigor con la secuencia de nucleótidos en

   (iv)

   o (v) o su forma complementaria.

   ���

   2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, en donde la FMT modula o por otra parte facilita la metilación de una antocianina.

2. 3.

   La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 o 2, en donde la FMT es una S-adenosil-L-metionina-Ometiltransferasa (SAM-OMTs) de Clase I.

3. 4.

   La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la FMT es una 3’FMT o

   ���

   3’S’FMT.

4. 5.

   La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en donde la molécula de antocianina es un derivado de delfinidina o un derivado de petunidina o cianidina.

5. 6.

   La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 o 5, en donde la molécula de antocianina es la delfinidina 3-glucósido, delfinidina 3, 5-diglucósido o delfinidina 3-rutinósido.

   ���

   7. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2, en donde la metilación de una molécula de antocianina da lugar a la producción de un derivado de petunidina, malvidina o peonidina.

6. 8.

   La molécula de ácido nucleico aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la molécula es de origen Torenia.

7. 9.

   Una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico, como se define en cualquiera de las

   ���

   reivindicaciones 1 a 8.

8. 10.

   Una planta modificada genéticamente o parte de esta o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico no-indígena como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

9. 11.

   La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 10, en donde dicha planta o parte de esta o las células de la misma es a partir de una especie de flor cortada, una especie de planta

   ���

   de horticultura o una especie de planta de agricultura.

10. 12.

    La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 11, en donde la planta de horticultura o agricultura muestra flores o inflorescencia alteradas.

11. 13.

    La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de la reivindicación 11 o 12 en donde dicha parte modificada es un sépalo, bráctea, pecíolo, pedúnculo, ovario, antera, tallo, hojas, raíces, flor, semilla, fruta, nuez, bayas o vegetales.

12. 14.

    La planta modificada genéticamente o parte de esta o las células de la misma de cualquiera de las reivindicaciones

    �� 11 a 13, en donde la planta se selecciona de una rosa, claveles, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gérberas, crisantemos, Torenia, Begonia, Cyclamen, Nierembergia, Cathoranthus, Pelargonium, Orchid, uva, Euphorbia o Fuchsia.

13. 15.

    Las flores cortadas o separadas de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.

14. 16.

    La progenie, la descendencia de progenie o líneas propagadas de manera vegetativa de la planta modificada

    ���

    genéticamente de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde dicha progenie, la descendencia de progenie o líneas propagadas de manera vegetativa comprenden una molécula de ácido nucleico no-indígena como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

15. 17. Un método para producir una planta modificada genéticamente capaz de sintetizar una FMT, o con una actividad de FMT indígena, reducida o existente, dicho método que comprende:

    ���

    (a) con el fin de producir una planta capaz de sintetizar FMT, transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión eventual, de dicha secuencia de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y el cultivo de dicha planta transgénica durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácido nucleico;

    ���

    (b) con el fin de, producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, transformar establemente una célula de una planta apropiada con una molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cuando sea necesario, cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico; o

    (c) con el fin de producir una planta con actividad de FMT existente o indígena reducida, alterar una gen codificante de

    ���

    FMT a través de una modificación de las secuencias indígenas vía recombinación homóloga de un ácido nucleico alterado de forma apropiada, introducido en la célula de la planta, y regenerar la planta modificada genéticamente a partir de la célula; en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

16. 18. Un método para producir una planta modificada genéticamente con niveles alterados de FMT codificados en una

    ���

    molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, dicho método que comprende introducir en una célula o células de dicha planta una secuencia genética seleccionada de:

    (i)

    una secuencia antisentido para un ARNm de FMT;

    (ii)

    una secuencia sentido para un ADN de FMT; y/o

    (iii) una secuencia que induce ARNi específica para un ARNm de FMT;

    ���

    y regenerar una planta modificada genéticamente a partir de dicha célula.

17. 19. Un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen codificante recombinante de una FMT o parte de esta o que lleva una secuencia de ácido nucleico que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de ARNm opcionalmente transcribible, cuando sea necesario, para realizar la regulación de una FMT, dicho método que comprende transformar establemente una célula de una planta apropiada con la molécula de ácido

    ���

    nucleico aislada, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, cuando sea necesario, bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula.

18. 20.

    El método de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la planta muestra una inflorescencia modificada.

19. 21.

    Una secuencia de oligonucleótidos aislada enunciada en SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33.

20. 22.

    Una FMT recombinante aislada codificada por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones

    �� 1 a 8.

21. 23.

    La FMT recombinante de la reivindicación 22, en donde la FMT recombinante es una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácidos heterólogas.

22. 24.

    Una molécula de ácido nucleico de FMT recombinante aislada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas.

    ��� 25. Un organismo procariota o eucariota que lleva una secuencia genética que codifica una molécula de FMT de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de manera extracromosomal en forma de plásmido.

23. 26.

    Uso de una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la fabricación de una planta modificada genéticamente.

24. 27.

    Uso de la reivindicación 26, en donde la planta modificada genéticamente muestra flores o inflorescencia alteradas.