ES2313732T3 - Secuencias geneticas que codifican enzimas de la ruta de los flavonoides y usos de las mismas. - Google Patents
Secuencias geneticas que codifican enzimas de la ruta de los flavonoides y usos de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A SECUENCIAS GENETICAS QUE CODIFICAN PARA LAS ENZIMAS METABOLICAS DE LA VIA FLAVONOIDE Y, MAS ESPECIFICAMENTE, PARA LA FLAVONOIDE 3'' HIDROXILASA (DENOMINADA A PARTIR DE AHORA F3''H) O PARA DERIVADOS DE LA MISMA, Y A SU UTILIZACION EN LA MANIPULACION DE LA PIGMENTACION EN PLANTAS Y OTROS ORGANISMOS.
Description
Secuencias genéticas que codifican enzimas de la
ruta de los flavonoides y usos de las mismas.
La presente invención se refiere de forma
general a secuencias genéticas que codifican enzimas metabolizadoras
de la ruta de biosíntesis de los flavonoides y, más
particularmente, a la flavonoide 3'-hidroxilasa
(denominada de aquí en adelante en este documento "F3'H") o
sus derivados y su uso en la manipulación de la pigmentación en
plantas y otros organismos.
Las citas bibliográficas de las publicaciones
referidas por el autor en esta memoria descriptiva son recogidas al
final de la descripción. Los Números de Identidad de Secuencia (SEQ
ID NO) para las secuencias de nucleótidos y aminoácidos referidas
en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son definidos
después de la bibliografía. Un sumario de los SEQ ID NO, y las
secuencias a las cuales se refieren, se proporciona antes de los
Ejemplos.
En todas partes de esta memoria descriptiva, a
no ser que el contexto requiera otra cosa, la palabra
"comprenden", o variaciones tales como "comprende" o
"que comprende", serán entendidas para implicar la inclusión de
un elemento indicado o número entero o grupo de elementos o números
enteros, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o número
entero o grupo de elementos o números enteros.
La sofisticación del rápido desarrollo de la
tecnología del ADN recombinante facilita enormemente la
investigación y el desarrollo en el espectro de industrias
relacionadas con la biotecnología. La industria hortícola se ha
vuelto un reciente beneficiario de esta tecnología que ha
contribuido a desarrollos en la resistencia a enfermedades en
plantas y flores exhibiendo un envejecimiento retardado después de
su corte. También se ha prestado cierta atención a la manipulación
del color de la flor.
En la industria floral existe un esfuerzo por
desarrollar nuevas y diferentes variedades de plantas con flores.
Un modo eficaz de crear tales nuevas variedades es a través de la
manipulación del color de la flor. Se han usado técnicas de cultivo
clásicas con algún éxito para producir un amplio rango de colores
para la mayor parte de las variedades comerciales de flores. Este
enfoque está limitado, sin embargo, por las limitaciones del grupo
génico de la especie particular y, por esta razón, es raro que una
sola especie tenga un espectro completo de variedades coloreadas.
Además, las técnicas de cultivo tradicionales carecen de precisión.
El atractivo estético de la flor es una combinación de muchos
factores tales como la forma, el olor y el color; la modificación
de un carácter por la hibridación puede ser a cargo, a menudo, de
otra característica igualmente valiosa. La capacidad de modificar
genéticamente cambios exactos en el color de la flor cortada y la
especie ornamental ofrecería ocasiones comerciales significativas
en una industria que tiene un rápido cambio de los productos y
donde la novedad es una característica importante del merca-
do.
do.
El color de la flor es debido predominantemente
a dos tipos de pigmentos: los flavonoides y los carotenoides. Los
flavonoides contribuyen a un rango de colores desde el amarillo al
rojo al azul. Los carotenoides imparten un tono naranja o amarillo
y son comúnmente el pigmento principal en las flores amarillas o
naranjas. Las moléculas flavonoides que hacen la contribución
principal al color de la flor son las antocianinas que son los
derivados glicosilados de cianidina, delfinidina, petunidina,
peonidina, malvidina y pelargonidina, y que se localizan en las
vacuolas. Las diferentes antocianinas pueden producir diferencias
marcadas en los colores. El color de la flor está también bajo la
influencia de la co-pigmentación con los flavonoides
incoloros, complejación metálica, glicosilación, acilación y pH
vacuolar (Forkmann, 1991).
La ruta biosintética para los pigmentos
flavonoides (denominados de aquí en adelante en este documento como
la "ruta de biosíntesis de los flavonoides") es bien conocida y
se muestra en las Figuras 1a y 1b (Ebel y Hahlbrock, 1988;
Hahlbrock y Grisebach, 1979; Wiering y De Vlaming, 1984; Schram
et al., 1984; Stafford, 1990; Van Tunen y Mol, 1990; Dooner
et al., 1991; Martin y Gerats, 1993; Holton y Cornish, 1995).
La primera etapa comprometida en la ruta implica la condensación de
tres moléculas de malonil-CoA con una molécula de
p-coumaroil-CoA. Esta reacción es catalizada
por la enzima chalcona sintasa (CHS). El producto de esta reacción,
2',4,4',6'-tetrahidroxi-chalcona, es
normalmente isomerizado rápidamente para producir naringenina por
la enzima chalcona flavanona isomerasa (CHI). La naringenina es
posteriormente hidroxilada en la posición 3 del anillo central por
la flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir
dihidrokaempferol (DHK).
El modo de hidroxilación del anillo B de DHK
juega un papel clave en la determinación del color de los pétalos.
El anillo B puede ser hidroxilado en las posiciones 3', o en ambas
3' y 5', para producir dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina
(DHM), respectivamente. Dos enzimas claves implicadas en esta ruta
son la flavonoide 3'-hidroxilasa y la flavonoide
3',5'-hidroxilasa, ambas de la clase citocromo P450.
Las enzimas citocromo P450 están ampliamente extendidas en la
naturaleza y sus genes han sido aislados y secuenciados de
vertebrados, insectos, levaduras, hongos, bacterias y plantas.
La flavonoide 3'-hidroxilasa
actúa sobre la DHK para producir DHQ y sobre la naringenina para
producir el eriodictiol. La reducción y la glicosilación de la DHQ
produce los pigmentos de cianidina-glicósido y
peonidin-glicósido que, en muchas especies de
plantas (por ejemplo rosa, clavel y crisantemo), contribuyen al
color de la flor rojo y rosa. La síntesis de estas antocianinas
también puede generar otros colores en la flor. Por ejemplo, los
acianos azules contienen cianina. La capacidad de controlar la
actividad de la flavonoide 3'-hidroxilasa, u otras
enzimas implicadas en la ruta de biosíntesis de los flavonoides, en
plantas con flores proporcionaría el medio para manipular el color
de los pétalos. Podrían así ser generadas diferentes versiones
coloreadas de un cultivo singular y, en algunos casos, una sola
especie sería capaz de producir un espectro más amplio de
colores.
Se ha clonado una secuencia de nucleótidos
(denominada en este documento SEQ ID NO:26) que codifica a una
flavonoide 3'-hidroxilasa de petunia (véase la
solicitud de patente internacional Nº. PCT/AU93/00127 [documento WO
93/20206]). Sin embargo, esta secuencia era ineficaz en su capacidad
de modular la producción de antocianinas
3'-hidroxiladas en plantas. Hay una necesidad, por
lo tanto, de identificar otras secuencias genéticas que codifiquen
las flavonoide 3'-hidroxiladas que modulen de manera
eficiente la hidroxilación de compuestos flavonoides en plantas.
Más particularmente, hay una necesidad de identificar otras
secuencias genéticas que codifiquen las flavonoide
3'-hidroxiladas que modulen de manera eficiente la
producción de antocianinas 3'-hidroxiladas en
plantas.
Conforme a la presente invención, han sido
identificadas y clonadas secuencias genéticas que codifican la
flavonoide 3'-hidroxilasa. Las secuencias genéticas
recombinantes de la presente invención permiten la modulación de la
expresión de genes que codifican esta enzima, por ejemplo, por la
expresión de novo, sobrexpresión, supresión, inhibición
antisentido y la actividad de ribozimas. La capacidad de controlar
la síntesis de flavonoide 3'-hidroxilasa en plantas
permite la modulación de la composición de antocianinas individuales
así como la alteración de niveles relativos de flavonoles y
antocianinas, permitiendo así la manipulación del color de tejidos,
tales como pétalos, hojas, semillas y frutos. La presente invención
se describe en lo sucesivo en relación con la manipulación del
color de la flor pero esto se hace entendiendo que se extiende a la
manipulación de otros tejidos de la planta, tales como hojas,
semillas y frutos.
En consecuencia, un aspecto de la presente
invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa, en el que dicha molécula comprende
una secuencia de nucleótidos como la expuesta en SEQ ID NO:1 o que
tiene al menos una identidad del 60% con ésta o una secuencia de
nucleótidos capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID
NO:1 o su secuencia de nucleótidos complementaria en condiciones de
baja estringencia, en el que dicha flavonoide
3'-hidroxilasa es capaz de producir un cambio de
color rosa en al menos el polen y la(s) antera(s) de
la planta Petunia hybrida Fl línea Skr4 X Sw63 cuando se
expresa en dicha planta. Las moléculas de ácido nucleico preferidas
comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia
de aminoácidos como la expuesta en SEQ ID NO:2 o una secuencia de
aminoácidos que tiene al menos un 50% de identidad con ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa o su derivado, en el que dicha
flavonoide 3'-hidroxilasa o su derivado es capaz de
una modulación más eficaz de la hidroxilación de compuestos
flavonoides en plantas, que es una flavonoide
3'-hidroxilasa codificada por la secuencia de
nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:26.
La eficacia, según se usa en este documento, se
refiere a la capacidad de la enzima flavonoide
3'-hidroxilasa frente a compuestos flavonoides
hidroxilados en una célula de planta. Esto provee a la planta con
sustratos adicionales para otras enzimas de la ruta de biosíntesis
de los flavonoides capaces de modificar más esta molécula, vía, por
ejemplo, glicosilación, acilación y ramnosilación, para producir
varias antocianinas que contribuyen a la producción de un rango de
colores. Así se permite la modulación de antocianinas
3'-hidroxiladas. La eficacia es evaluada
convenientemente mediante uno o varios parámetros seleccionados a
partir de: grado de transcripción, como se determina por la
cantidad del mARN producido; grado de hidroxilación de naringenina
y/o DHK; grado de traducción de mARN, como se determina por la
cantidad de producto de traducción producido; grado de producción
de los derivados de antocianina de DHQ o DHM; grado de efecto sobre
el color de tejidos, tales como flores, semillas, hojas o
frutas.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
nucleótidos que representa al locus genético denominado Hf1 o
Hf2 en petunia, o equivalente a tales loci en otras especies
de plantas con flores, y en el que dicha molécula de ácido nucleico
aislada codifica, o es complementaria con, una secuencia que
codifica a una flavonoide 3'-hidroxilasa.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de
nucleótidos que corresponde al locus genético denominado Hf1
o Hf2 en petunia, o a loci en otras especies de plantas con
flores que contienen las secuencias que controlan la producción de
flavonoides 3'-hidroxiladas, y en el que dicha
molécula de ácido nucleico aislada codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa o su derivado que es capaz de
convertir más eficientemente DHK en DHQ en plantas que es la
flavonoide 3'-hidroxilasa expuesta en SEQ ID
NO:26.
Conforme a los aspectos anteriores de la
presente invención se proporciona una molécula de ácido nucleico
que comprende una secuencia de nucleótidos o la secuencia de
nucleótidos complementaria sustancialmente como se expone en
adelante en SEQ ID NO:1 o que tiene una identidad de al menos
aproximadamente el 60% con ésta o es capaz de hibridarse a la
secuencia expuesta en SEQ ID NO:1 en condiciones de estringencia
baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:3 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:3 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:5 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:5 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:7 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en el SEQ ID NO:7 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:9 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% respecto a su
región de codificación o es capaz de hibridarse a la secuencia
expuesta en SEQ ID NO:9 en condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:14 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:14 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:16 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:16 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:18 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:18 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:20 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:20 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:22 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:22 en
condiciones de estringencia baja.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos o la secuencia de nucleótidos complementaria
sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID NO:24 o que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60% con ésta o es
capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID NO:24 en
condiciones de estringencia baja.
En una realización particularmente preferida, se
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos o la secuencia de nucleótidos
complementaria sustancialmente como se expone en adelante en SEQ ID
NO:1 o que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 60%
con ésta o es capaz de hibridarse a la secuencia expuesta en SEQ ID
NO:1 en condiciones de estringencia baja, en el que dicha secuencia
de nucleótidos representa al locus genético denominado Hf1 o
Hf2 en petunia, o es equivalente a tales loci en otras
especies de planta con flores, y en el que dicha molécula de ácido
nucleico aislada codifica, o es complementaria, a una secuencia que
codifica una flavonoide 3'-hidroxilasa.
La referencia en este documento a una
estringencia baja a 42ºC incluye y abarca desde al menos
aproximadamente el 1% a al menos aproximadamente 15% de formamida y
desde al menos aproximadamente 1 M a al menos aproximadamente 2 M
de la sal para la hibridación, y desde al menos aproximadamente 1 M
a al menos aproximadamente 2 M de la sal para las condiciones de
lavado. Pueden ser aplicadas condiciones de estringencia
alternativas cuando sea necesario, tal como una estringencia media,
que incluye y abarca desde al menos aproximadamente formamida al
16% a al menos aproximadamente al 30% y desde al menos
aproximadamente sal 0,5 M a al menos aproximadamente 0,9 M para la
hibridación, y desde al menos aproximadamente sal 0,5 M a al menos
aproximadamente 0,9 M para las condiciones de lavado, o una alta
estringencia, lo que incluye y abarca desde al menos aproximadamente
formamida al 31% a al menos aproximadamente al 50% y desde al menos
aproximadamente sal 0,01 M a al menos aproximadamente 0,15 M para
la hibridación, y desde al menos aproximadamente sal 0,01 M a al
menos aproximadamente 0,15 M para las condiciones de lavado. La
hibridación puede ser llevada a cabo a temperaturas diferentes y,
cuando esto ocurra, pueden ser ajustadas de acuerdo con esto otras
condiciones.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente
como se expone en adelante en SEQ ID NO:2 o una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos aproximadamente el
50% con ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica a una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:4 o una secuencia de aminoácidos que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:6 o una secuencia de aminoácidos que
tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en la SEQ ID NO:8 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12 o
SEQ ID NO:13 o una secuencia de aminoácidos que tiene una semejanza
de al menos aproximadamente el 50% con ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:15 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:17 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:19 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:21 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:23 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia que
codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se
expone en adelante en SEQ ID NO:25 o una secuencia de aminoácidos
que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el 50% con
ésta.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización particularmente preferida se
proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende
una secuencia de nucleótidos que codifica o es complementaria a una
secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos sustancialmente
como se expone en adelante en SEQ ID NO:2 o una secuencia de
aminoácidos que tiene una semejanza de al menos aproximadamente el
50% con ésta, en el que dicha secuencia de nucleótidos representa
al locus genético denominado Hf1 o Hf2 en petunia, o es
equivalente a tales loci en otras especies de plantas con
flores, y en el que dicha molécula de ácido nucleico aislada
codifica, o es complementaria a una secuencia que codifica, una
flavonoide 3'-hidroxilasa o sus derivados.
El término "semejanza" como se usa en este
documento incluye la identidad exacta entre secuencias comparadas,
a nivel de aminoácidos o de nucleótidos. Cuando no hay identidad a
nivel de nucleótidos, la "semejanza" incluye las diferencias
entre las secuencias que causan los diferentes aminoácidos que sin
embargo están relacionados entre sí a niveles estructural,
funcional, bioquímico y/o conformacional. Cuando no hay identidad a
nivel de aminoácidos, la "semejanza" incluye los aminoácidos
que sin embargo están relacionados entre sí a niveles estructural,
funcional, bioquímico y/o conformacional.
La molécula de ácido nucleico definida por SEQ
ID NO:1 codifica una flavonoide 3'-hidroxilasa de
petunia. Los ejemplos de otros genes de F3'H adecuados son de
clavel (SEQ ID NO:3), boca de dragón (SEQ ID NO:5), arabidopsis
(SEQ ID NO:7), clon de ADN genómico de arabidopsis (SEQ ID NO:9),
rosa (SEQ ID NO:14), crisantemo (SEQ ID NO:16), torenia (SEQ ID
NO:18), aguinaldo azul claro (SEQ ID NO:20), genciana (SEQ ID NO:22)
y lisianthus (SEQ ID NO:24). Aunque la presente invención esté
ejemplificada particularmente por los genes F3'H anteriormente
mencionados, el objeto de la invención se extiende a los genes de
F3'H de cualquier especie de planta a condición de que el gen de
F3'H tenga una semejanza de al menos aproximadamente el 60% a nivel
de nucleótidos respecto a una molécula de ácido nucleico
seleccionada de SEQ ID NO:1, o una semejanza de al menos
aproximadamente el 50% a nivel de aminoácidos respecto a una
molécula de aminoácido seleccionada de SEQ ID NO:2.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente
invención son generalmente secuencias genéticas artificiales.
Generalmente, esto significa aisladas desde su estado natural o
sintetizadas o derivadas de un ambiente artificial. Más
específicamente, esto incluye moléculas de ácidos nucleicos formadas
o mantenidas in vitro, incluyendo fragmentos de ADN
genómico, moléculas recombinantes o sintéticas y ácidos nucleicos en
combinación con ácidos nucleicos heterólogos. Esto también se
extiende al ADN genómico o cADN o sus partes que codifican F3'H o
sus partes en una orientación inversa en relación con su promotor u
otro. Esto además se extiende a secuencias naturales después de al
menos una purificación parcial en relación con otras secuencias de
ácido nucleico.
La expresión "molécula de ácido nucleico"
incluye un aislado de ácido nucleico y una secuencia genética y se
usa en este documento en su sentido más general y abarca cualquier
serie contigua de bases de nucleótidos especificamente y
directamente, o vía una serie complementaria de bases, una secuencia
de aminoácidos en una F3'H. Tal secuencia de aminoácidos puede
constituir una F3'H de cadena entera o su forma truncada activa o
puede corresponder a una región particular tal como un extremo
N-terminal, extremo C-terminal o la
parte interna de la enzima. Las moléculas de ácidos nucleicos
contempladas en este documento también abarcan oligonucleótidos
útiles como sondas genéticas o como moléculas "antisentido"
capaces de regular la expresión de un gen correspondiente en una
planta. Una "molécula antisentido" como se usa en este
documento también puede abarcar un constructo génico que comprende
la genómica estructural o el gen de cADN o sus partes en orientación
inversa en relación a su propio promotor u otros. En consecuencia,
las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser
adecuadas para su uso como moléculas de
co-supresión, moléculas de ribozimas, moléculas
sentido y moléculas antisentido para modular los niveles de
antocianinas 3'-hidroxiladas.
En una realización, la molécula de ácido
nucleico que codifica F3'H o sus diversos derivados se usa para
reducir la actividad de una F3'H endógena, o de forma alternativa
la molécula de ácido nucleico que codifica esta enzima o varios de
sus derivados se usan en la orientación antisentido para reducir la
actividad de la F3'H. Sin desear limitar la presente invención con
ninguna teoría, es posible que la introducción de la molécula de
ácido nucleico en una célula cause este resultado disminuyendo la
transcripción del gen homólogo endógeno o aumentando el recambio
del mARN correspondiente. Esto puede ser alcanzado usando
constructos génicos que contienen moléculas de ácido nucleico de
F3'H o varios de sus derivados en la orientación sentido o
antisentido. En una alternativa más, podrían ser usadas ribozimas
para inactivar moléculas de ácido nucleico dianas. De forma
alternativa, la molécula de ácido nucleico codifica una F3'H
funcional y esto se usa para elevar los niveles de esta enzima en
plantas. La referencia en este documento a la modificación de la
actividad de la F3'H flavonoide se refiere a una elevación o
reducción de la actividad de hasta el 30% o más preferiblemente del
30-50%, o aún más preferiblemente del
50-75% o todavía más preferiblemente del 75% o más
por encima o por debajo de los niveles endógenos normales o
existentes de actividad. El nivel de actividad puede ser analizado
fácilmente usando una versión modificada del método descrito por
Stotz y Forkmann (1982) (véase el Ejemplo 7) o analizando la
cantidad de producto F3'H, tal como quercetina, cianidina o
peonidina como se expone en adelante en el Ejemplo 5.
La presente invención describe además moléculas
de ácido nucleico en forma de cebadores de oligonucleótido o sondas
capaces de hibridarse a una parte de las moléculas de ácido nucleico
contempladas anteriormente y, en particular, las seleccionados a
partir de las moléculas de ácido nucleico expuestas en adelante en
SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24 bajo condiciones
de estringencia altas, preferiblemente medias y lo más
preferiblemente bajas. Preferiblemente la parte corresponde al
extremo 5' o 3' del gen de F3'H. Por conveniencia, el extremo 5',
según se considera en este documento, define una región
sustancialmente entre el extremo 5' del transcripto primario
respecto a una parte central del gen, y el extremo 3', según se
considera en este documento, define una región sustancialmente
entre la parte central del gen y el extremo 3' del transcripto
primario. Está claro, por lo tanto, que los oligonucleótidos o las
sondas se pueden hibridar al extremo 5' o al extremo 3' o a una
región común tanto al extremo 5' como al 3'.
La molécula de ácido nucleico o su forma
complementaria pueden codificar la enzima de cadena entera o su
parte o derivado. Por "derivado" se propone cualquier
sustitución de aminoácido simple o múltiple, deleciones, y/o
adiciones en relación con la enzima natural e incluye partes,
fragmentos, porciones, moléculas de fusión, homólogos y análogos.
En cuanto a esto, el ácido nucleico incluye la secuencia de
nucleótidos natural y codifica F3'H o puede contener sustituciones
de nucleótido simples o múltiples, deleciones y/o adiciones a dicha
secuencia natural. Una molécula de fusión puede ser una fusión
entre secuencias de nucleótidos que codifican dos o más F3'H, o una
fusión entre una secuencia de nucleótidos que codifica una F3'H y
una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier otra molécula
proteica. Las moléculas de fusión son útiles en la modificación de
la especificidad del sustrato.
Un derivado de la molécula de ácido nucleico o
su forma complementaria, o de una F3'H, de la presente invención
también puede incluir una "parte", tanto activa como inactiva.
Una molécula de ácido nucleico activa o funcional es la que
codifica una enzima con actividad de F3'H. Una molécula activa o
funcional abarca además una molécula parcialmente activa; por
ejemplo, una F3'H con una menor especificidad de sustrato sería
considerada como parcialmente activa. Un derivado de una molécula
de ácido nucleico puede ser útil como una sonda de oligonucleótido,
como cebador para reacciones en cadena de la polimerasa o en varias
técnicas con mutágenos, para la generación de moléculas antisentido
o en la construcción de ribozimas. También pueden ser útiles en el
desarrollo de constructos de cosupresión. La molécula de ácido
nucleico de acuerdo con este aspecto de la presente invención puede
o no codificar una F3'H funcional. Una "parte" puede ser
derivada a partir del extremo 5' o extremo 3' o una región común
tanto a los extremos 5' como 3' de la molécula de ácido
nucleico.
Los derivados insercionales del aminoácido de la
F3'H de la presente invención incluyen fusiones del extremo amino
y/o carboxilo terminal así como inserciones intrasecuencia de
aminoácidos simples o múltiples. Las variantes de secuencia de
aminoácidos insercionales son aquellas en las cuales uno o varios
residuos de aminoácidos son introducidos en un sitio predeterminado
en la proteína aunque sea también posible la inserción aleatoria
con un rastreo adecuado del producto resultante. Las variantes
delecionales están caracterizadas por la eliminación de uno o
varios aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácido
sustitutivas son aquellas en las cuales al menos un residuo en la
secuencia ha sido eliminado y un residuo diferente ha sido insertado
en su lugar. Las sustituciones típicas son aquellas hechas conforme
la Tabla 1 más abajo.
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Cuando la F3'H se derivatiza por la sustitución
de aminoácidos, los aminoácidos generalmente son sustituidos por
otros aminoácidos que tienen propiedades similares, tales como
hidrofobia, hidrofilia, electronegatividad, cadenas laterales
voluminosas y similares. Las sustituciones de aminoácidos son
típicamente de residuos solos. Las inserciones de aminoácidos por
lo general estarán en el orden de aproximadamente
1-10 residuos de aminoácidos y las deleciones
estarán en el intervalo de aproximadamente 1-20
residuos. Preferiblemente, las deleciones o inserciones son hechas
en pares adyacentes, es decir, una deleción de dos residuos o
inserción de dos residuos.
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Las variantes de aminoácidos mencionadas
anteriormente también pueden hacerse fácilmente usando técnicas
sintéticas de péptidos conocidas en la técnica, tales como síntesis
de péptidos en fase sólida (Merrifield, 1964) y similares, o por
manipulaciones de ADN recombinante. Las técnicas para hacer
mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que
tienen una secuencia conocida, o parcialmente conocida, son
conocidas e incluyen, por ejemplo, mutagénesis M13. La manipulación
de la secuencia de ADN para producir proteínas de variante que se
manifiestan como variantes sustitutivas, insercionales o
delecionales son descritas convenientemente, por ejemplo, en
Sambrook et al. (1989).
Otros ejemplos de mutantes recombinantes o
sintéticos y derivados de la F3'H de la presente invención incluyen
sustituciones simples o múltiples, deleciones y/o adiciones de
cualquier molécula asociada a la enzima tales como carbohidratos,
lípidos y/o proteínas o polipéptidos.
Los términos "análogos" y "derivados"
también se extienden a cualquier equivalente químico de la F3'H,
funcional o no, y también a cualquier derivado de aminoácido
descrito anteriormente. Cuando los "análogos" y los
"derivados" de este aspecto de la presente invención no son
funcionales, pueden actuar como agonistas o antagonistas de la
actividad de F3'H. Por conveniencia, la referencia a "F3'H" en
este documento incluye la referencia a cualquiera de sus derivados,
incluyendo partes, mutantes, fragmentos, homólogos o análogos.
La presente invención se ilustra usando
secuencias de ácido nucleico derivadas de petunia, clavel, rosa,
boca de dragón, arabidopsis, crisantemo, lisianthus, torenia,
aguinaldo azul y genciana, ya que éstas representan las fuentes más
convenientes y preferidas de material hasta el momento. Sin embargo,
cualquier experto en la técnica inmediatamente apreciará que pueden
ser aisladas secuencias similares a partir de cualquier número de
fuentes tales como otras plantas o ciertos microorganismos. Los
ejemplos de otras plantas incluyen, pero no están limitados con,
maíz, tabaco, aciano, pelargonium, manzana, gerbera y violeta
africana. Todas tales secuencias de ácido nucleico que codifican
directamente o indirectamente una enzima de la ruta de biosíntesis
de los flavonoides y en particular F3'H, independientemente de su
fuente, están incluidas según la presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico contempladas en
este documento pueden existir en una sola orientación o en
combinación con una molécula vector, por ejemplo un vector de
expresión. La expresión molécula vector es usada en su sentido más
amplio para incluir cualquier vehículo intermedio para la molécula
de ácido nucleico, capaz de facilitar la transferencia del ácido
nucleico en la célula de planta y/o facilitar la integración en el
genoma de la planta. Un vehículo intermedio, por ejemplo, puede ser
adaptado para su uso en electroporación, bombardeo con
microproyectiles, transferencia mediada por Agrobacterium o
inserción vía virus de ARN o ADN. El vehículo intermedio y/o la
molécula de ácido nucleico contenida allí pueden o no que ser
integrados establemente en el genoma de la planta. Tales moléculas
vector también pueden replicarse y/o expresarse en células
procariotas. Preferiblemente, las moléculas vector o sus partes son
capaces de integrarse en el genoma de la planta. La molécula de
ácido nucleico además puede contener una secuencia promotora capaz
de dirigir la expresión de la molécula de ácido nucleico en una
célula de planta. La molécula de ácido nucleico y el promotor
también pueden ser introducidos en la célula por cualquier número de
medios, como los descritos anteriormente.
Un aspecto aún más de la presente invención
proporciona un constructo genético capaz de reducir la expresión de
un gen endógeno que codifica una flavonoide 3'hidroxilasa o aumentar
la expresión de F3'H en una planta, comprendiendo dicho constructo
genético una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria;
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria;
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de
nucleótidos es capaz de realizar un cambio de color rosa en al menos
el polen y la(s) antera(s) de la planta Petunia
hybrida FI linea Skr4X Sw63 cuando se expresa en dicha
planta.
Conforme a la presente invención, una molécula
de ácido nucleico que codifica una F3'H o su derivado o parte puede
ser introducida en una planta en una orientación para consentir,
permitir o, de otra manera, facilitar la manipulación de niveles de
producción de mARN en el citoplasma y/o la producción de enzima a
partir del mARN, proporcionando así un medio para convertir DHK y/u
otros sustratos adecuados, de ser sintetizados en la célula de
planta, en última instancia en derivados de antocianina de
antocianidinas tales como cianidina y/o peonidina o, de forma
alternativa, inhibir tal conversión de metabolitos reduciendo o
eliminando la actividad endógena o existente de F3'H. La producción
de mARN en el citoplasma y/o la producción de enzima a partir del
mARN, se refiere en este documento como "expresión". La
producción de antocianinas contribuye a la producción de un color
de flor rojo o azul. La expresión de la molécula de ácido nucleico
en la orientación en la planta puede ser constitutiva, inducible o
del desarrollo, y también puede ser específica de tejido.
De acuerdo con este aspecto de la presente
invención se proporciona un método para producir una planta
transgénica capaz de sintetizar F3'H o sus derivados funcionales,
comprendiendo dicho método transformar establemente una célula de
una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico de la
invención en condiciones que permiten la expresión eventual de
dicha molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a
partir de la célula y hacer crecer dicha planta transgénica durante
un tiempo y en condiciones suficientes para permitir la expresión
de la molécula de ácido nucleico. La planta transgénica puede así
producir niveles elevados de actividad de F3'H en relación con la
cantidad expresada en una planta no transgénica comparable.
Otro aspecto de la presente invención contempla
un método para producir una planta transgénica con menor actividad
endógena o existente de F3'H, comprendiendo dicho método transformar
establemente una célula de una planta adecuada con una molécula de
ácido nucleico de la invención o su forma complementaria, regenerar
una planta transgénica a partir de la célula y, cuando sea
necesario, hacer crecer dicha planta transgénica en condiciones
suficientes para permitir la expresión de la molécula de ácido
nucleico.
Aún otro aspecto de la presente invención
contempla un método para producir una planta genéticamente
modificada con menos actividad endógena o existente de F3'H,
comprendiendo dicho método modificar el gen de F3'H a través de la
modificación de las secuencias endógenas vía recombinación homóloga
de un gen de F3'H modificado de manera apropiada o su derivado o
parte, introducido en la célula de la planta, y regenerar la planta
genéticamente modificada a partir de la célula.
Conforme a estos aspectos de la presente
invención, las moléculas de ácido nucleico preferidas
sustancialmente son como las expuestas en adelante en SEQ ID NO:1 o
tienen al menos aproximadamente una identidad del 60% con ésta, o
son capaces de hibridarse a ésta en condiciones de estringencia
baja.
En una realización preferida, la presente
invención contempla un método para producir una planta con flores
transgénica que exhibe un cambio del color de la flor, comprendiendo
dicho método transformar establemente una célula de una planta
adecuada con una molécula de ácido nucleico de la presente
invención, regenerar una planta transgénica de la célula y hacer
crecer dicha planta transgénica durante un tiempo y en condiciones
suficientes para permitir la expresión de la molécula de ácido
nucleico en la enzima F3'H. De forma alternativa, dicho método
puede comprender transformar establemente una célula de una planta
adecuada con una molécula de ácido nucleico de la presente
invención o su secuencia complementaria, regenerar una planta
transgénica de la célula y hacer crecer dicha planta transgénica
durante un tiempo y en condiciones suficientes para modificar el
nivel de actividad de F3'H endógeno o existente. Preferiblemente, el
nivel modificado sería menos que el nivel endógeno o existente de
la actividad de F3'H en una planta no transgénica comparable.
En una realización relacionada, la presente
invención contempla un método para producir una planta con flores
que exhiba un cambio del color de la flor, comprendiendo dicho
método la modificación del gen de F3'H a través de la modificación
de las secuencias endógenas vía recombinación homóloga a partir de
un gen de F3'H modificado de manera apropiada o su derivado,
introducido en la célula de la planta y regenerar la planta
genéticamente modificada de la célula.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente
invención pueden o no ser reguladas en el desarrollo.
Preferiblemente, la modulación de los niveles de antocianinas
3'-hidroxiladas conduce a un color de flor
modificado que incluye la producción de flores rojas u otras
sombras en el color dependiendo de las condiciones fisiológicas de
la planta receptora. Por "planta receptora" se propone una
planta capaz de producir un sustrato para la enzima F3'H, o
producir la enzima F3'H por sí misma, y poseer las propiedades
fisiológicas apropiadas y el genotipo requerido para el desarrollo
del color deseado. Esto puede incluir, pero no está limitado, a
petunia, clavel, crisantemo, rosa, boca de dragón, tabaco, aciano,
pelargonium, lisianthus, gerbera, manzana, iris, lirio, violeta
africana, genciana, torenia y aguinaldo azul claro.
En consecuencia, la presente invención se
extiende a un método para producir una planta transgénica capaz de
modular los niveles de antocianinas 3'-hidroxiladas,
comprendiendo dicho método transformar establemente una célula o
grupo de células de una planta adecuada con una molécula de ácido
nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica, o
es complementaria a una secuencia que codifica, F3'H o sus
derivados, y regenerar una planta transgénica de dicha célula o
células.
Cualquier experto en la técnica reconocerá
inmediatamente las variaciones aplicables a los métodos de la
presente invención, tales como el aumento o la disminución del
nivel de la actividad enzimática de la enzima natural presente en
una planta diana lo que conduce a diferentes sombras de colores.
La presente invención, por lo tanto, se extiende
a todas las plantas transgénicas que contienen todo o parte del
módulo de ácido nucleico de la presente invención y/o cualquier
homólogo o sus formas relacionadas o formas antisentido de
cualquiera de estos y en particular aquellas plantas transgénicas
que exhiben un color de la flor modificado. Las plantas
transgénicas pueden contener una molécula de ácido nucleico
introducida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
o es complementaria a una secuencia que codifica F3'H. Generalmente,
el ácido nucleico es introducido establemente en el genoma de la
planta, aunque la presente invención también se extiende a la
introducción de la secuencia de nucleótidos de F3'H dentro de una
secuencia de ácido nucleico que se replica autónomamente tal como
un virus de ADN o ARN capaz de replicarse dentro de la célula de
planta. La invención también se extiende a las semillas de tales
plantas transgénicas. Tales semillas, especialmente de ser
coloreadas, serán útiles como marcadores de las propiedades para
plantas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un aspecto más de la invención proporciona una
planta transgénica que tiene un tejido que exhibe un color
modificado, comprendiendo dicha planta transgénica una molécula de
ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos
seleccionada a partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria;
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria,
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo unas condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de
nucleótidos es capaz de efectuar un cambio de color rosa en al menos
el polen y la(s) antera(s) de la planta Petunia
hybrida F1 línea Skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha
planta.
Un aspecto más de la presente invención se
refiere a formas recombinantes de F3'H. Las formas recombinantes de
las enzimas proporcionarán una fuente de material para la
investigación para desarrollar, por ejemplo, enzimas más activas y
que puedan ser útiles en el desarrollo de sistemas in vitro
para la producción de compuestos coloreados.
Todavía un aspecto más de la presente invención
contempla el uso de las secuencias genéticas descritas en este
documento en la fabricación de un constructo genético capaz de
usarse en la modulación de los niveles de antocianinas
3'-hidroxiladas en una planta o células de una
planta.
Un aspecto más de la invención proporciona el
uso de una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa y seleccionada a partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria,
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria;
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo unas condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de nucleótidos es
capaz de efectuar un cambio de color rosa en al menos el polen y
la(s) antera(s) de la planta Petunia hybrida F1 Iinea
Skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha planta,
en la fabricación de un constructo genético
capaz de modular la hidroxilación de compuestos flavonoides en una
planta o células de una planta.
Aún un aspecto más de la presente invención
proporciona flores y, en particular, flores de corte a partir de
las plantas transgénicas descritas en este documento, que exhiben un
color de flor modificado.
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a una molécula de ácido nucleico de la presente invención que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica o es
complementaria a una secuencia que codifica una F3'H o sus
derivados, en el que dicha molécula de ácido nucleico es capaz de
expresarse en una célula de planta. El término "expresado" es
equivalente al término "expresión" como se define
anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con
este y otros aspectos de la invención consienten, permiten o, de
otra manera, facilitan una mayor eficacia en la modulación de
antocianinas 3'-hidroxiladas en relación con la
eficacia del inserto de cADN de pCGP619 contenido en el plásmido
pCGP809, descrito en la solicitud de patente internacional Nº.
PCT/AU93/00127 [documento WO 93/20206]. La expresión "célula de
planta" incluye una célula de planta sola o un grupo de células
de planta tal como en un callo, plántula o planta, o sus partes,
incluyendo flores y semillas.
También se describe en este documento una
molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica o es complementaria a una secuencia de
nucleótidos que codifica una F3'H, en el que la translación de
dicha molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de
aminoácidos RPPNSGA. Preferiblemente, la translación de dicha
molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de aminoácidos
RPPNSGAXHXAYNYXDL y todavía más preferiblemente, en aún un aspecto
más de la invención, la translación de dicha molécula de ácido
nucleico comprende la secuencia de aminoácidos
RPPNSGAXHXAYNYXDL[X]_{n}GGEK, donde X representa
cualquier aminoácido y [X]_{n} representa una secuencia de
aminoácidos de 0 a 500 aminoácidos.
La presente invención se describe además en
cuanto a las Figuras siguientes no limitantes y los Ejemplos.
En las Figuras:
Las Figuras 1a y 1b son representaciones
esquemáticas de las rutas de biosíntesis de flavonoides en flores
P. hybrida que muestran las enzimas y los loci
genéticos implicados en las conversiones. Las enzimas implicadas en
la ruta han sido indicadas como sigue: PAL = fenilalanina
amoníaco-liasa; C4H = cinamato
4-hidroxilasa; 4CL = 4-coumarato:
CoA ligasa; CHS = chalcona sintasa; CHI = chalcona isomerasa; F3H =
flavanona 3-hidroxilasa; F3'H = flavonoide
3'-hidroxilasa; F3'5'H = flavonoide
3'5'-hidroxilasa; FLS = flavonol sintasa; DFR =
dihidroflavonol-4-reductasa; ANS =
antocianina sintasa; 3GT = UDP-glucosa:
antocianina-3-glucosido; 3RT =
UDP-rhamnosa:
antocianidina-3-glucosido
rhamnosiltransferasa; ACT =
antocianidina-3-rutinosido
aciltransferasa; 5GT = UDP-glucosa: antocianina
5-glucosiltransferasa; 3' OMT = antocianina
O-metiltransferasa; 3',5' OMT=antocianina 3',5'
O-metiltransferasa. Tres flavonoides en la ruta son
indicadas como: P-3-G =
pelargonidin-3-glucosido; DHM =
dihidromiricetina; DHQ = dihidroquercetina. El flavonol,
miricetina, sólo es producido a niveles bajos y la antocianina,
pelargonidina, raras veces es producida en P. hybrida.
La figura 2 es una representación esquemática
del plásmido pCGP161 que contiene un clon de cADN (F1) que
representa la
cinnamato-4-hidroxilasa de P.
hybrida. Los fragmentos ^{32}P-marcados del
fragmento de 0,7 kb de EcoRI/XhoI fueron usados para sondar la
genoteca de cADN de pétalo de aspidistra roja. Para más detalles,
refiérase al Ejemplo 4. Las abreviaturas son como sigue: Amp = el
gen de resistencia a la ampicilina; ori = origen de replicación; T3
= secuencia de reconocimiento para la T3 ARN polimerasa; T7 =
secuencia de reconocimiento para la T7 ARN polimerasa. Los sitios
de la enzima de restricción también son marcados.
La figura 3 es una representación esquemática
del plásmido pCGP602 que contiene un clon de cADN (617) que
representa una flavonoide 3'5'-hidroxilasa (Hf1) de
P. hybrida. Los fragmentos ^{32}P-marcados
del fragmento de 1,6 kb de BspHI/EspI que contiene la región de
codificación de Hf1 fueron usados para sondar la genoteca de cADN
de pétalo de aspidistra roja. Para más detalles, refiérase al
Ejemplo 4. Las abreviaturas son como sigue: Amp = el gen de
resistencia a la ampicilina; ori = origen de replicación; T3 =
secuencia de reconocimiento para T3 ARN polimerasa; T7 = secuencia
de reconocimiento para T7 ARN polimerasa. Los sitios de la enzima de
restricción también son marcados.
La figura 4 es una representación esquemática
del plásmido pCGP175 que contiene un clon de cADN (H2) que
representa una flavonoide 3'5' hidroxilasa (Hf2) de P.
hybrida. Los fragmentos ^{32}P-marcados de los
fragmentos de 1,3 kb de EcoRI/XhoI y 0,5 kb de XhoI que contienen
juntos la región de codificación de Hf2 fueron usados para sondar
la genoteca de cADN de pétalo de aspidistra roja. Para más detalles,
refiérase al Ejemplo 4. Las abreviaturas son como sigue: Amp = el
gen de resistencia a la ampicilina; ori = origen de replicación; T3
= secuencia de reconocimiento para T3 ARN polimerasa; T7 = secuencia
de reconocimiento para T7 ARN polimerasa. Los sitios de la enzima
de restricción también son marcados.
La figura 5 es una representación esquemática
del plásmido pCGP619 que contiene el clon de cADN 651 que representa
una citocromo P450 de P. hybrida. Los fragmentos
^{32}P-marcados del fragmento de 1,8 kb de
EcoRI/XhoI fueron usados para sondar la genoteca de cADN de pétalo
de aspidistra roja. Para más detalles, refiérase al Ejemplo 4. Las
abreviaturas son como sigue: Amp = el gen de resistencia a la
ampicilina; ori = origen de replicación; T3 = secuencia de
reconocimiento para T3 ARN polimerasa; T7 = secuencia de
reconocimiento para T7 ARN polimerasa. Los sitios de la enzima de
restricción también son marcados.
La figura 6 es una representación de una
autoradiografía de un ARN de transferencia sondado con los
fragmentos ^{32}P-marcados del clon de cADN
OGR-38 contenido en pCGP1805 (véase el Ejemplo 6).
Cada banda contenía una muestra de 20 \mug de ARN total aislado
de las flores o las hojas de las plantas de una población de
retrocruzamiento V23 (hfl/hfl) x VR (HfI/hfl). Un transcrito de 1,8
kb fue detectado en las flores tipo VR (Hfl/hfl) que contenían
altos niveles de quercetina (Q+) (bandas 9 - 14). El mismo
transcrito de tamaño fue detectado a niveles muy inferiores en las
flores tipo V23 (hf1/hf1) que contenía poca o ninguna quercetina
(Q-) (bandas 3-8). Un nivel reducido de transcrito
también fue detectado en hojas de VR (banda 1) y pétalos de V23
(banda 2). Esto es descrito en el Ejemplo 5.
La figura 7 es una representación esquemática
del plásmido de expresión de levadura pCGP1646 (véase el Ejemplo
7). El inserto de cADN de OGR-38 de pCGP1805 fue
clonado en una orientación "sentido" detrás del promotor de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura (PGAP) en el vector de expresión pYE22m.
TRP1 = el gen de Trp1, IR1 = la repetición invertida de plásmido de
2 \mum, TGAP = secuencia del terminador del gen de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura. Los sitios de la enzima de restricción
también son marcados.
La figura 8 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP1867 (descrito en el Ejemplo 8). El
inserto de cADN de Hf1 (OGR-38) de pCGP1805 fue
clonado en una orientación "sentido" detrás del promotor Mac
en el vector de expresión de pCGP293. Las abreviaturas son como
sigue: LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; Gm = el gen de
resistencia a la gentamicina; 35S = la región del promotor del gen
35S del virus del mosaico de la coliflor; nptII = el gen de
neomicina fosfotransferasa II; tml3' = la región del terminador del
gen tm1 de Agrobacterium; mas3' = la región del terminador
del gen de manopina sintasa de Agrobacterium; ori pRi = un
origen de replicación de amplio rango de huésped de un plásmido de
Agrobacterium rhizogenes; oriColE1 = un alto origen de copia
de replicación de un plásmido de Colcinin E1. Los sitios de la
enzima de restricción también son marcados.
La figura 9 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP1810, cuya preparación se describe en el
Ejemplo 13. El inserto de cADN KC-1 de pCGP1807
(véase el Ejemplo 12) fue clonado en una orientación "sentido"
detrás del promotor Mac en el vector de expresión de pCGP293. Las
abreviaturas son como sigue: LB = borde izquierdo; RB = borde
derecho; Gm = el gen de resistencia a la gentamicina; 35S = la
región del promotor del gen 35S del virus del mosaico de la
coliflor; nptll = el gen de neomicina fosfotransferasa II; tml3' =
la región del terminador del gen tml de Agrobacterium; mas3'
= la región del terminador del gen de manopina sintasa de
Agrobacterium; ori pRi = un origen de replicación de amplio
rango de huésped de un plásmido de Agrobacterium rhizogenes;
oriColE1 = un alto origen de copia de replicación de un plásmido de
Colcinin E1. Los sitios de la enzima de restricción también son
marcados.
La figura 10 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP1813, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 14. El inserto de cADN KC-1 de pCGP1807
(véase el Ejemplo 12) fue clonado en una orientación "sentido"
entre el promotor Mac y el terminador mas. El casete de expresión
Mac: KC-1: mas posteriormente fue clonado en el
vector binario pWTT2132. Las abreviaturas son como sigue: Tet = el
gen de resistencia a la tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB=
borde derecho, surB= la región de codificación y la secuencia del
terminador del gen de acetolactato sintasa; 35S = la región del
promotor del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor, mas3' =
la región del terminador del gen de manopina sintasa de
Agrobacterium; pVS1 = un origen de replicación de amplio
rango de huésped del plásmido de Pseodomonas aeruginosa,
pACYCori = replicón modificado de pACYC184 de E. coli. Los
sitios de la enzima de restricción también son marcados.
La figura 11 es una representación de una
autoradiografía de una transferencia Southern sondada con los
fragmentos ^{32}P-marcados del fragmento de la
PCR de expresión diferencial de Am3Ga (como se describe en el
Ejemplo 16). Cada banda contenía una muestra de 10 \mug de ADN
genómico EcoRV-digerido aislado a partir de N8
(Eos^{+}), K16 (eos^{-}) o las plantas de una población K16 x
N8 F2. Las bandas de hibridación fueron detectadas en el ADN
genómico de plantas que producían cianidina (indicado con "+")
(Bandas 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12 y 15). Ninguna hibridación
específica fue observada en las muestras de ADN genómico a partir de
plantas que no producían cianidina (indicado con "-") (Bandas
2, 8, 11, 13 y 14).
La figura 12 es una representación de una
autoradiografía de un ARN de transferencia sondado con fragmentos
^{32}P-marcados del fragmento de la PCR de
expresión diferencial de Am3Ga. Cada banda contenía una muestra de
10 \mug de ARN total aislado de flores u hojas de plantas de una
población N8 (Eos^{+}) x K16 (eos^{-}) F2. Una transcrito de
1,8 kb fue detectado en las flores K16 x N8 F2 que producían
cianidina (cianidina +) (plantas Nº. 1, Nº. 3, Nº. 4, Nº. 5 y Nº.
8). Ningún transcrito fue detectado en las flores K16 x N8 F2 que
no producían cianidina (cianidina-) (plantas Nº. 6, Nº. 11, Nº. 12)
o en una muestra de hoja (Nº. 13L) de una planta K16 x N8 F2 que
producía cianidina en las flores. Los detalles son proporcionados en
el Ejemplo 17.
La figura 13 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP250, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 20. El inserto de cADN sdF3'H, que contiene los nucleótidos
1 al 1711 (SEQ ID NO:5) de pCGP246 (véase el Ejemplo 18), fue
clonado en una orientación "sentido" detrás del promotor Mac en
el vector de expresión de pCGP293. Las abreviaturas son como sigue:
LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; Gm = el gen de resistencia
a la gentamicina; 35S = la región del promotor del gen 35S del
virus del mosaico de la coliflor; nptII = el gen de la neomicina
fosfotransferasa II; tml3' = la región del terminador del gen tml de
Agrobacterium; mas3' = la región del terminador del gen de
manopina sintasa de Agrobacterium; ori pRi = un origen de
replicación de amplio rango de huésped de un plásmido de
Agrobacterium rhizogenes; oriColEl = un alto origen de copia
de replicación del plásmido Colcinin E1. Los sitios de la enzima de
restricción también son marcados.
La figura 14 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP23 1, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 20. El inserto de cADN sdF3'H, que contiene los nucleótidos
104 al 1711 (SEQ ID NO:5) de pCGP246, fue clonado en una
orientación "sentido" detrás del promotor Mac en el vector de
expresión de pCGP293. Las abreviaturas son como sigue: LB = borde
izquierdo; RB = borde derecho; Gm = el gen de resistencia a la
gentamicina; 35S = la región del promotor del gen 35S del virus del
mosaico de la coliflor; nptII = el gen de neomicina
fosfotransferasa II; tml3' = la región del terminador del gen tml de
Agrobacterium; mas3 ' = la región del terminador del gen de
manopina sintasa de Agrobacterium; ori pRi = un origen de
replicación de amplio rango de huésped de un plásmido de
Agrobacterium rhizogenes; oriColEl = un alto origen de copia
de replicación de un plásmido de Colcinin E1. Los sitios de la
enzima de restricción también son marcados.
La figura 15 es una representación esquemática
del plásmido binario pBI-Tt7-2. El
fragmento genómico EcoRI/SaII Tt7 de 6,5 kb de E-5
fue clonado en EcoRI/SaII-recorte pBI101,
sustituyendo al gen residente GUS. La orientación del gen Tt7
(F3'H) como se indica (de 5' a 3') fue determinada por la
secuenciación del ADN. Las abreviaturas son como sigue: LB = borde
izquierdo; RB = borde derecho; nos 5' = la región del promotor del
gen de nopalina sintasa de Agrobacterium, nptII = la región
de codificación del gen de neomicina fosfotransferasa II; nos 3' =
la región del terminador del gen de nopalina sintasa de
Agrobacterium; nptl = la región de codificación del gen de
neomicina fosfotransferasa I. Los sitios de la enzima de restricción
también son marcados.
La figura 16 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP2166, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 26. El inserto de cADN Nº. 34 de rosa de pCGP2158 (véase el
Ejemplo 25) fue clonado en una orientación "sentido" detrás
del promotor Mac en el vector de expresión de pCGP293. Las
abreviaturas son como sigue: LB = borde izquierdo; RB = borde
derecho; Gm = el gen de resistencia a la gentamicina; 35S = la
región del promotor del gen 35S del virus del mosaico de la
coliflor; nptII = el gen de neomicina fosfotransferasa II; tml3' =
la región del terminador del gen de tml de Agrobacterium;
mas3' = la región del terminador del gen de manopina sintasa de
Agrobacterium; ori pRi = un origen de replicación de amplio
rango de huésped de un plásmido de Agrobacterium rhizogenes;
oriColEl = un alto origen de copia de replicación de un plásmido de
Colcinin E1. Los sitios de la enzima de restricción también son
marcados.
La figura 17 es una representación esquemática
del plásmido binario pCGP2169 cuya construcción se describe en el
Ejemplo 27. El inserto de cADN Nº. 34 de rosa de pCGP2158 fue
clonado en una orientación "sentido" entre el promotor CaMV35S
y el terminador ocs. El casete de expresión 35S: Nº. 34 de rosa: ocs
fue clonado posteriormente en el vector binario pWTT2132. Las
abreviaturas son como sigue: Tet = el gen de resistencia a la
tetraciclina; LB = borde izquierdo; RB = borde derecho; surB = la
región de unión y la secuencia del terminador del gen de
acetolactato sintasa; 35S = la región del promotor del gen 35S del
virus del mosaico de la coliflor, ocs = región del terminador del
gen de octopina sintasa de Agrobacterium; pVSl = un amplio
origen de replicación de huésped de un plásmido de Pseodomous
aeruginosa, pACYCori = replicón modificado de pACYC184 de E.
coli. Los sitios de la enzima de restricción también son
marcados.
La figura 18 es una representación esquemática
del plásmido binario pLN85, cuya construcción se describe en el
Ejemplo 28. El inserto de cADN RM6i de crisantemo de pCHRM1 fue
clonado en una orientación "antisentido" detrás del promotor
del gen 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S). Otras
abreviaturas son como sigue: LB = borde izquierdo; RB = borde
derecho; ocs3' = la región del terminador del gen de la octopina
sintasa de Agrobacterium; pnos:nptII:nos 3' = el casete de
expresión que contiene la región del promotor del gen de la
nopalina sintasa de Agrobacterium; la región de codificación
del gen de la neomicina fosfotransferasa II y la región del
terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium;
oriT = origen de transferencia de replicación; trfA* = una función
de replicación trans-actuante; oriColEl = un alto
origen de copia de replicación de un plásmido de Colcinin E1;
Tn7SpR/StR = los genes de resistencia a la espectinomicina y a la
estreptomicina del transposón Tn7; oriVRK2 = un origen de
repli-
cación de amplio rango de huésped del plásmido RK2. Los sitios de la enzima de restricción también son marcados.
cación de amplio rango de huésped del plásmido RK2. Los sitios de la enzima de restricción también son marcados.
La figura 19 es una representación esquemática
del plásmido de expresión de levadura pYTHT6, cuya construcción se
describe en el Ejemplo 30. El inserto de cADN THT6 de pTHT6 fue
clonado en una orientación "sentido" detrás del promotor de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura (PGAP) en el vector de expresión pYE22m.
Las abreviaturas son como sigue: TRP1 = el gen de Trp1; IR1 =
repetición invertida de un plásmido de 2 \mum; TGAP = la
secuencia del terminador del gen de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura. Los sitios de la enzima de restricción
también son marcados.
Las abreviaturas de los aminoácidos usados en
todas partes de la memoria descriptiva son mostradas en la Tabla 2,
más abajo.
La tabla 3 proporciona un sumario de las SEQ ID
NO asignadas a las secuencias referidas en este documento:
La cepa desactivada del microorganismo
Agrobacterium tumefaciens AGLO que contiene separadamente los
plásmidos pCGP1867, pCGP1810 y pCGP231 fueron depositados en los
laboratorios analíticos del gobierno australiano, Calle Suakin, 1,
Pymble, Nueva Gales del Sur, 2037, Australia el 23 de febrero de
1996 y se les proporcionó los N^{os}. de depósitos 96/10967,
96/10968 y 96/10969, respectivamente.
Las variedades de Petunia hybrida usadas
se presentan en la Tabla 4.
Fueron cultivadas plantas en cuartos de
crecimiento especializados con una longitud de día de 14 horas a una
intensidad de luz de 10.000 lux y una temperatura de 22ºC a
26ºC.
Fueron obtenidas flores de Dianthus
caryophyllas cv. Kortina Chanel de Van Wyk and Son Flower
Supply, Victoria.
Fueron recolectadas flores de Dianthus
caryophyllus en las etapas de desarrollo siguientes:
- Etapa 1:
- Brote cerrado, pétalos no visibles.
- Etapa 2:
- Abertura de capullos: puntas de los pétalos visibles.
- Etapa 3:
- Las puntas de casi todos los pétalos expuestas. "Etapa de pincel".
- Etapa 4:
- Pétalos externos en un ángulo de 45º respecto al tallo.
- Etapa 5:
- Flor totalmente abierta.
Las líneas de Antirrhinum majus usadas
fueron derivadas de las líneas madre K16 (eos^{-}) y N8
(Eos^{+}). Existe una correlación estricta entre la actividad de
F3'H y el gen Eos que se sabe que controla la
3'-hidroxilación de flavonas, flavonoles y
antocianinas (Forkmann y Stotz, 1981). K16 es un mutante
homocigótico recesivo que carece de actividad de F3'H mientras que
N8 es del tipo silvestre para la actividad de F3'H. Estas líneas
son similares, aunque no isogénicas. Tanto las líneas madre como la
semilla de una planta autopolinizada (K16 x N8) F1 fueron obtenidas
del Doctor C. Martin (Centro John Innes, Norwich, Reino Unido).
Las líneas de Arabidopsis thaliana
Colombia (Tt7), Landsberg erecta (Tt7) y NW88 (tt2) fueron obtenidas
del centro de reserva de Arabidopsis de Nottingham. Las semillas de
A. thaliana (Tt7) silvestre tienen un característico color
marrón. Las semillas de los mutantes tt7 tienen semillas palo
marrones y las plantas están caracterizadas por un menor contenido
de antocianina en las hojas (Koornneef et al., 1982). Las
plantas tt7 producen cianidina mientras que los mutantes tt7
acumulan pelargonidina, indicando que el gen tt7 controla la
flavonoide 3'-hidroxilación.
Fueron obtenidas flores de Rosa hybrida
cv. Kardinal de Van Wyk and Son Flower Supply, Victoria.
Las etapas de desarrollo de la flor Rosa
hybrida fueron definidas como sigue:
- Etapa 1:
- Brote no pigmentado, bien cerrado (10-12 mm de alto; 5 mm de ancho).
- Etapa 2:
- Brote pigmentado, bien cerrado (15 mm de alto; 9 mm de ancho).
- Etapa 3:
- Brote pigmentado, cerrado; sépalos justo comenzando a abrirse (20-25 mm de alto; 13-15 mm de ancho)
- Etapa 4:
- Capullo comenzando a abrirse; pétalos fuertemente pigmentados; los sépalos se han separado (el brote tiene 25-30 mm de alto y 18 mm de ancho).
- Etapa 5:
- Sépalos completamente desplegados; algún rizo. Los pétalos están fuertemente pigmentados y desplegados (el brote tiene 30-33 mm de alto y 20 mm de ancho).
Las etapas de desarrollo de la flor
Crysanthemum fueron definidas como sigue:
- Etapa 0:
- Ningún capullo visible.
- Etapa 1:
- Capullo visible: flósculos completamente cubiertos por las brácteas.
- Etapa 2:
- Abertura de capullos: puntas de flósculos visibles.
- Etapa 3:
- Flósculos fuertemente solapados.
- Etapa 4:
- Las puntas de casi todos los flósculos expuestas; abertura de flósculos externa pero ninguno horizontal.
- Etapa 5:
- Flósculos externos horizontales.
- Etapa 6:
- Alcanzando la madurez de la flor.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de Escherichia coli usadas
fueron:
- DH5\alpha
- \underline{sup}E44, \Delta(\underline{lac}ZYA-\underline{Arg}F)U169, \diameter80\underline{lac}Z\DeltaM15, \underline{hsd}R17 (r_{k-}, m_{k+}), \underline{rec}A1, \underline{end}A1, \underline{gyr}A96, \underline{thi}-1, \underline{rel}A1, \underline{deo}R (Hanahan, 1983 y BRL, 1986).
- XL1-Blue MRF'
- \Delta(\underline{mcr} A)183, \Delta(\underline{mcr}CB- \underline{hsd}SMR-\underline{mrr})173, \underline{end}A1, \underline{sup}E44, \underline{thi}-1, \underline{rec}A1, \underline{gyr}A96, \underline{rel}A1, \underline{lac}[F' \underline{pro}AB, \underline{lac}IqZ\DeltaM15, Tn10(\underline{Tet}^{r})]^{c} (Stratagene)
- XL1-Blue
- \underline{sup}E44, \underline{hsd}R17 (r_{k-}, m_{k+}), \underline{rec}A1, \underline{end}A1, \underline{gyr}A96, \underline{thi}-1 \underline{rel}A1, \underline{lac}[F' \underline{pro}AB, \underline{lac}Iq, lacZ\Delta M15, Tn10(\underline{tet}^{r})]
- SOLR
- e14-(\underline{mcr}A), \Delta(\underline{mcr}CB-\underline{hsd}SMR-\underline{mrr})171, \underline{sbc}C, \underline{rec}B, \underline{rec}J, \underline{umu}C::Tn5(\underline{kan}^{r}), \underline{uvr}C,lac, \underline{gyr} A96, \underline{thi}-1, \underline{rel}A1, [F'\underline{pro}AB, \underline{lac}IqZ\DeltaM15], Su^{-} (no supresor) (Stratagene)
- DH10 B(Zip)
- F-\underline{mcr}A, \Delta(\underline{mrr}-\underline{hsd}RMS-\underline{mcr}BC), \diameter80d \underline{lac}Z\DeltaM15, \Delta\underline{lac}X74, \underline{deo}R, \underline{rec}A1, \underline{ara}D139, \Delta(ara, leu)7697, \underline{gal}U, \underline{gal}Kl^{\lambda}, \underline{rep}L, \underline{nup}G
- Y1090r-
- \Delta\underline{lac}U169, (\Delta\underline{lon})?, \underline{ara}D139, \underline{str}A, \underline{sup}F, \underline{mcr}A, \underline{trp}C22::Tn10(Tet^{r}) [pMC9 Amp^{r}, Tet^{r}], \underline{mcr} B, \underline{hsd}R
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa desactivada de Agrobacterium
tumefaciens AGL0 (Lazo et al., 1991) fue obtenida de R.
Ludwig (Departamento de Biología, Universidad de California, Santa
Cruz, EE.UU.).
El vector de clonación pBluescript fue obtenido
de Stratagene.
La transformación de células DH5\alpha de la
cepa de E. coli fue realizada de acuerdo con el método de
Inoue et al. (1990).
Fueron radiactivamente marcados fragmentos de
ADN (de 50 a 100 ng) con 50 \muCi de
[\alpha-^{32}P]-dCTP usando un
kit de oligomarcaje (Bresatec). Fue eliminado el
[\alpha-^{32}P]-dCTP no
incorporado por cromatografía en una columna G-50
Sephadex (Fine).
La secuenciación de ADN fue realizada usando los
kits de secuenciación PRISM® Ready Reaction Dye Primer Cycle de
Applied Biosystems. Fueron seguidos los protocolos proporcionados
por el fabricante. Las reacciones de secuenciación de ciclo fueron
realizadas usando una máquina PCR de Perkin Elmer (GeneAmp PCR
System 9600) y fueron realizadas en un secuenciador de ADN
automatizado 373A (Applied Biosystems).
Las búsquedas de homología frente al Genbank,
bases de datos SWISS-PROT y EMBL fueron realizadas
usando los programas FASTA y TFASTA (Pearson y Lipman, 1988) o
programas BLAST (Altschul et al., 1990). El porcentaje de
las semejanzas de secuencia fueron obtenidas usando el programa
LFASTA (Pearson y Lipman, 1988). En todos los casos, fueron usados
valores ktup de 6 para comparaciones de secuencias de nucleótidos y
2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, a no ser que se
especifique de otra manera.
Fueron realizadas múltiples alineaciones de
secuencia (valor ktup de 2) usando el programa ClustalW incorporado
en la aplicación MacVector® 6.0 (Oxford Molecular Ltd.).
Para aislar un clon de cADN que estaba unido al
locus de Hf1 y que representaba la flavonoide
3'-hidroxilasa (F3'H) en la ruta de biosíntesis de
los flavonoides de petunia, fue preparada una genoteca de cADN de
pétalo a partir del ARN aislado de las etapas 1 a 3 de flores de
petunia de aspidistra roja (OGR). Las flores OGR contienen
pigmentos basados en cianidina y tienen altos niveles de actividad
de flavonoide 3'hidroxilasa. La genoteca de cADN de OGR fue
rastreada con una mezcla de fragmentos
^{32}P-marcados aislados a partir de tres clones
de cADN de citocromo P450 conocidos que están implicados en la ruta
de biosíntesis de los flavonoides y a partir de un clon de cADN de
citocromo P450 (651) que tenía actividad de flavonoide 3'hidroxilasa
en levadura. Estos incluyeron un clon de cADN de petunia que
representa la cinamato-4-hidroxilasa
(C4H) y dos clones de cADN de petunia (codificados por los
loci de Hf1 y Hf2) que representan la flavonoide
3'5'-hidroxilasa (F3'5'H) (Holton et al.,
1993).
El ARN total fue aislado a partir de tejido de
pétalo de flores P. hybrida cv OGR en etapa 1 a 3 usando el
método de Turpen y Griffith (1986). Fue seleccionado el ARN de
Poli(A)^{+} a partir del ARN total, usando
oligotex-dT® (Qiagen).
Fue usado un kit de clonación
ZAP-cADN Gigapack III Gold (Stratagene) para
construir una genoteca de cADN de pétalo direccional en
\lambdaZAP usando 5 \mug del ARN de Poli(A)^{+}
aislado de las etapas 1 a 3 de OGR como plantilla. El número total
de recombinantes obtenidos fue 2,46 x 10^{6}.
Después de la transfección de células
XL1-Blue MRF', la mezcla cADN empaquetado fue puesta
en placa a 50.000 pfu por placa de 15 cm de diámetro. Las placas
fueron incubadas a 37ºC durante 8 horas, y el bacteriófago fue
eluido en NaCI 100 mM, MgSO_{4} 8 mM, Tris-HCl 50
mM, pH 8,0, gelatina al 0,01% (p/v) (tampón de almacenamiento de
bacteriófagos (PSB)) (Sambrook et al., 1989). Fue añadido
cloroformo y el bacteriófago fue almacenado a 4ºC como una genoteca
amplificada.
Fueron puestos en placa 100.000 pfu de la
genoteca amplificada en placas NZY (Sambrook et al., 1989) a
una densidad de 10.000 pfu por placa de 15 cm después de la
transfección de células XL1-Blue MRF', y fueron
incubados a 37ºC durante 8 horas. Después de la incubación a 4ºC de
la noche a la mañana, las suspensiones duplicadas fueron puestas en
filtros de Colony/Plaque Screen® (DuPont) y fueron tratadas como se
recomienda por el fabricante.
Las dos flavonoide
3',5'-hidroxiladas correspondientes a los
loci de Hf1 o Hf2 aislados como se describe en Holton et
al. (1993) y la patente de EE.UU. Nº. 5.349.125 fueron usados en
el procedimiento de rastreo.
Fueron aislados varios clones de cADN de
citocromo P450 en el procedimiento de rastreo usado para aislar los
dos clones de cADN de flavonoide 3',5'-hidroxilasa
correspondientes a los loci de Hf1 o Hf2 (Holton et
al., 1993; patente de EE.UU. Nº. 5.349.125). Uno de estos clones
de cADN (F1) (contenido en pCGP161) (Figura 2) fue identificado
como que representaba una cinamato 4-hidroxilasa
(C4H), basado en la identidad de secuencia con un clon de C4H antes
caracterizado de judía mung (Mizutani et al., 1993). Los
datos de secuencia fueron generados a partir de 295 nucleótidos en
el extremo 5' del clon de cADN F1 de petunia. Hubo una semejanza
del 83,1% con el clon de C4H de judía mung en los 295 nucleótidos
secuenciados y del 93,9% en la secuencia de aminoácidos
predicha.
El aislamiento y la identificación del clon de
cADN 651 contenido en pCGP619 (Figura 5) fueron descritos en la
solicitud de patente internacional, que tiene el número de
publicación W093/20206. Un extracto de proteína de levadura que
contiene el clon de cADN 651 en el control del promotor de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura de pYE22m (Tanaka et al., 1988)
exhibió actividad de F3'H.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron lavadas en solución prelavadora
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCI 1 M, EDTA 1 mM,
sarcosina al 0,1% (p/v)) a 65ºC durante 30 minutos; fueron depuradas
en hidróxido de sodio 0,4 M a 65ºC durante 30 minutos; después fue
lavado en una solución de Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0,
0,1 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 65ºC durante 30 minutos y finalmente
fue aclarado en 2 x SSC, SDS al 1,0% (p/v).
Las suspensiones de la genoteca de cADN de OGR
fueron rastreadas con los fragmentos
^{32}P-marcados de (1) un fragmento EcoRI/XhoI de
0,7 kb de pCGP161 que contiene el clon de cADN C4H (Figura 2), (2)
un fragmento BspHI/EspI de 1,6 kb de pCGP602 que contiene el clon
de cADN de Hfl (Figura 3), (3) un fragmento EcoRI/XhoI de 1,3 kb y
un fragmento XhoI de 0,5 kb de pCGP175 que contiene la región de
codificación del clon de cADN de Hf2 (Figura 4) y (4) un fragmento
EcoRI/XhoI de 1,8 kb pCGP619 que contiene el clon de cADN de 651
(Figura 5).
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en formamida al 10% (v/v), NaCl 1 M,
sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 1% (p/v) a 42ºC durante al
menos 1 hora. Los fragmentos ^{32}P-marcados
(cada uno a 1x10^{6} cpm/mL) fueron añadidos entonces a la
solución de hibridación y la hibridación fue seguida a 42ºC durante
16 horas más. Los filtros entonces fueron lavados en 2 x SSC, SDS al
1% (p/v) a 42ºC durante 2 x 1 hora y fueron expuestos a una
película XAR de Kodak con una pantalla de intensificación a -70ºC
durante 16 horas.
Doscientos treinta placas fuertemente
hibridantes fueron escogidas en PSB. De éstas, 39 fueron rastreadas
de nuevo para aislar las placas purificadas, usando las condiciones
de hibridación que se describen para el rastreo inicial de la
genoteca de cADN. Los plásmidos contenidos en el vector de
bacteriófago \lambdaZAP fueron rescatados y los datos de
secuencia fueron generados a partir de los extremos 3' y 5' de los
insertos de cADN. Basado en la homología de secuencia, 27 de los 39
eran idénticos al clon de cADN de cinamato
4-hidroxilasa de petunia, 2 de los 39 eran
idénticos al clon de cADN Hf1 y 7 de los 39 no representaron la
citocromo P450. Los 3 clones de cADN restantes (designados como
OGR-27, OGR-38 y
OGR-39) representaban los "nuevos" citocromos
P450, comparado con los clones de citocromo P450 usados en el
procedimiento de rastreo, y después fueron caracterizados.
Hay dos loci genéticos en P.
hybrida, Ht1 y Ht2, que controlan la actividad de flavonoide
3'-hidroxilasa (Tabak et al., 1978; Wiering
y Vlaming, 1984). Ht1 es expresado tanto en la rama como en la
corola de flores P. hybrida y crece a niveles más altos de
actividad de F3'H que lo hace Ht2 que sólo se expresa en la corola.
La F3'H es capaz de convertir dihidrokaempferol y naringenina en
dihidroquercetina y eriodictiol, respectivamente. En una flor que
produce pigmentos basados en delfinidina, la actividad de F3'H se
enmascara por la actividad de F3'5'H. Por lo tanto, el ensayo de
F3'H/F3'5'H (Stotz y Forkmann, 1982) es inútil en la determinación
de la presencia o la ausencia de la actividad de F3'H. La enzima
flavonol sintasa es capaz de convertir el dihidrokaempferol en
kaempferol y la dihidroquercetina en quercetina (Figura 1a). La
miricetina, el flavonol 3',5'-hidroxilado, es
producida a bajos niveles en flores de petunia. Por lo tanto,
analizando las flores para el flavonol
3'-hidroxilado, quercetina, se deduce la presencia
de la actividad de F3'H.
El análisis del polimorfismo de longitud de
fragmento de restricción (RFLP) del ADN aislado de plantas
individuales en un retrocruzamiento de VR (Ht1/ht1) x V23 (ht1/ht1)
fue usado para determinar si alguno de los clones de cADN que
representan las P450 estaban unidos al locus de Ht1. El
análisis Northern del ARN aislado de estas plantas también fue
usado para detectar la presencia o la ausencia de una transcrito en
estas líneas.
Las flores de una población de retrocruzamiento
VR (Ht1/ht1) x V23 (ht1/ht1) fueron analizadas por la presencia de
los flavonoles, kaempferol y quercetina. Las flores VR (Ht1/ht1)
acumulan quercetina y bajos niveles de kaempferol mientras que las
flores V23 (ht1/ht1) acumulan kaempferol, pero poca o ninguna
quercetina. Las plantas individuales del retrocruzamiento VR
(Ht1/ht1) x V23 (ht1/ht1) fueron designadas como tipo VR (Ht1/ht1),
si era detectado un nivel sustancial de quercetina en los extractos
de flor, y tipo V23 (ht1/ht1), si era detectada poca o ninguna
quercetina pero con niveles sustanciales de kaempferol en los
extractos de flor (véase la Figura 6).
Fue aislado ADN del tejido de hoja esencialmente
como se describe por Dellaporta et al., (1983). Las
preparaciones de ADN fueron purificadas después por centrifugación
por densidades de CsCl flotante (Sambrook et al., 1989).
El ADN genómico (10 \mug) fue digerido durante
16 horas con 60 unidades de EcoRI y fue sometido a electroforesis a
través de un gel de agarosa al 0,7% (p/v) en tampón de corrido de
TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 50 mM). El ADN
entonces fue desnaturalizado en solución desnaturalizante (NaCl 1,5
M/NaOH 0,5 M) durante 1 a 1,5 horas, fue neutralizado en
Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5)/NaCl 1,5 M durante 2 a 3
horas y luego fue transferido a un filtro Hybond N (Amersham) en 20
x SSC.
El ARN total fue aislado a partir del tejido de
pétalo de flores P. hybrida cv OGR en etapa 1 a 3 usando el
método de Turpen y Griffith (1986).
Las muestras de ARN fueron sometidas a
electroforesis a través de formaldehído 2,2 M/geles de agarosa al
1,2% (p/v) usando tampón de corrido que contiene ácido
morfolino-propano-sulfónico 40 mM
(pH 7,0), acetato de sodio 5 mM, EDTA 0,1 mM (pH 8,0). El ARN fue
transferido a filtros Hybond-N (Amersham) como se
describe por el fabricante.
Las transferencias Southern y de ARN fueron
sondadas con el fragmento de cADN ^{32}P-marcado
(10^{8} cpm/\mug, 2 x 10^{6} cpm/mL). Las prehibridaciones (1
hora a 42ºC) y las hibridaciones (16 horas a 42ºC) fueron llevadas
a cabo en formamida al 50% (v/v), NaCl 1 M, SDS al 1% (p/v), sulfato
de dextrano al 10% (p/v). Los filtros fueron lavados en 2 x SSC,
SDS al 1% (p/v) a 65ºC durante 1 a 2 horas y luego 0,2 x SSC, SDS al
1% (p/v) a 65ºC durante 0,5 a 1 horas. Los filtros fueron expuestos
a una película XAR de Kodak con una pantalla de intensificación a
-70ºC durante 16 horas.
El análisis RFLP fue usado para investigar la
unión de los genes correspondientes a los clones de cADN
OGR-27, OGR-38 y
OGR-39 al locus de Ht1.
Los fragmentos ^{32}P-marcados
de los clones de cADN OGR-27, OGR-38
y OGR-39 fueron usados para sondar transferencias
de ARN y transferencias Southern de ADN genómico aislado de plantas
individuales en la población de retrocruzamiento VR x V23. El
análisis de ADN genómico digirido de EcoRI aislado a partir de una
población de retrocruzamiento VR x V23 reveló un RFLP para la sonda
de OGR-38 que estaba unida a Ht1. Además, fue
detectado un nivel muy reducido de transcrito en las líneas del
tipo V23, cuando se comparaba con los altos niveles de transcrito
detectado en las líneas tipo VR (Figura 6).
Los datos proporcionaron fuertes pruebas de que
el clon de cADN OGR-38, contenido en el plásmido
pCGP1805, correspondía al locus Htl y representaba un
F3'H.
El análisis RFLP fue usado para investigar la
unión del gen correspondiente al cADN de OGR-38
respecto a los loci genéticos conocidos.
El análisis de unión de RFLP fue realizado
usando una versión 2.0 de Macintosh del programa de mapeo MapMaker
(Du Pont) (Lander et al., 1987). Una puntuación de LOD de 3,0
fue usada para el umbral de unión.
El análisis del ADN genómico digerido de EcoRI o
XbaI aislado a partir de una población V23 x R51 F2 reveló un RFLP
para la sonda de OGR-38 que estaba unida a PAc4.
PAc4, un clon de cADN de actina de petunia (Baird y Meagher, 1987),
es un marcador molecular para el cromosoma III y está unido al
locus de Ht1 (McLean et al., 1990). Hubo
co-segregación de los RFLP de OGR-38
y PAC4 para 36 de 44 plantas V23 x R51 F2. Esto representa una
frecuencia de recombinación del 8% que es similar a una frecuencia
de recombinación publicada del 16% entre el locus de Ht1 y
PAc4 (Cornu et al., 1990).
Los perfiles de expresión de desarrollo en
pétalos de OGR, así como en otros tejidos de OGR, fueron
determinados usando los fragmentos
^{32}P-marcados del inserto de cADN de
OGR-38 como una sonda contra un ARN de transferencia
que contiene 20 \mug del ARN total aislado de cada uno de cinco
etapas de desarrollo de pétalo de OGR de petunia así como de hojas,
sépalos, raíces, tallos, pedúnculos, ovarios, anteras y estilos. La
sonda de OGR-38 se hibridó con un transcrito de 1,8
kb que alcanzaba su punto máximo en las etapas más jóvenes de 1 a 3
del desarrollo de la flor. El transcrito de hibridación de
OGR-38 era el más abundante en los pétalos y ovarios
y también fue detectado en los sépalos, pedúnculos y anteras de la
planta de OGR. También fue detectado en los tallos un nivel bajo de
transcrito. En las condiciones usadas, ningún transcrito de
hibridación fue detectado por análisis Northern del ARN total
aislado de la hoja, el estilo o las raíces.
La secuencia completa del clon de cADN
OGR-38 (SEQ ID NO:1) fue determinada por la
compilación de secuencia a partir de diferentes subclones de pUC18
obtenidos usando procedimientos estándar para la generación de
clones sobrelapantes aleatoriamente (Sambrook et al., 1989).
La secuencia contenía un marco de lectura abierto de 1536 bases que
codificaba un supuesto polipéptido de 512 aminoácidos.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas de OGR-38 (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2)
fueron comparadas con las sondas del citocromo P450 usadas en el
procedimiento de rastreo y con otras secuencias de citocromo P450
de petunia (patente de EE.UU. 5.349.125) usando un alineamiento
Ifasta (Pearson y Lipman, 1988). La secuencia de nucleótidos de
OGR-38 era la más similar a la secuencia de ácidos
nucleicos de las flavonoide 3'5'-hidroxiladas que
representan los loci de Hf1 y Hf2 de P. hybrida
(Holton et al., 1993). El clon de Hf1 mostró una semejanza
del 59,6% para el clon de cADN OGR-38, más de 1471
nucleótidos, y una semejanza del 49,9%, unos 513 aminoácidos,
mientras que el clon de Hf2 mostró una semejanza del 59,1% para el
clon de cADN OGR38, más de 1481 nucleótidos, y una semejanza del
49,0%, unos 511 aminoácidos.
El plásmido pCGP1646 (Figura 7) fue construido
clonando el inserto de cADN de OGR-38 de pCGP1805 en
una orientación "sentido" detrás del promotor de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura de pYE22m (Tanaka et al.,
1988).
El plásmido pCGP1805 fue linealizado por la
digestión con Asp718. Los extremos 5' sobresalientes fueron
"rellenados" usando la ADN polimerasa (fragmento Klenow) de
acuerdo con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). El
fragmento de 1,8 kb de cADN OGR-38 fue liberado en
la digestión con SmaI. El fragmento de cADN fue aislado y
purificado usando el kit Bresaclean (Bresatec) y fue ligado con los
extremos de EcoRI romos de pYE22m. El plásmido pYE22m había sido
digerido con EcoRI y los extremos 5' sobresalientes fueron
eliminados usando la ADN polimerasa (fragmento Klenow) de acuerdo
con protocolos estándar (Sambrook et al., 1989). La unión
fue llevada con el kit de unión de Amersham usando 100 ng del
fragmento de 1,8 kb OGR-38 y 150 ng del vector de
levadura preparado, pYE22m. La inserción correcta del inserto en
pYE22m fue establecida por el análisis de la enzima de restricción
XhoI/SalI del ADN de plásmido aislado a partir de transformantes
resistentes a la ampicilina.
La cepa de levadura G-1315 (Mat
\alpha, trpl) (Ashikari et al., 1989) fue transformada con
pCGP1646 de acuerdo con Ito et al. (1983). Los
transformantes fueron seleccionados por su capacidad de restaurar
la G-1315 a la prototrofia de triptófano.
Un aislado solo de
G-1315/pCGP1646 fue usado para inocular 50 mL del
medio de Burkholder modificado (20,0 g/L de dextrosa, 2,0 g/L de
L-asparagina, 1,5 g/L de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/L
de MgSO_{4}.7H_{2}O, 0,33 g/L de CaCl_{2}, 2 g/L de
(NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,1 mg/L de KI, 0,92 g/L de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{2}4,4H_{2}O, 0,1 g/L de ácido
nitrilotriacético, 0,99 mg/L de FeSO_{4}.7H_{2}O, 1,25 mg/L de
EDTA, 5,47 mg/L de ZnSO_{4}.7H_{2}O, 2,5 mg/L de
FeSO_{4}.7H_{2}O, 0,77 mg/L de MnSO_{4}.7H_{2}O, 0,196 mg/L
de CuSO_{4}.5H_{2}O, 0,124 mg/L de
Co(NH_{4})_{2}(SO_{4})_{2}.6H_{2}O,
0,088 mg/L de Na_{2}B_{4}O_{7}.10H_{2}O, 0,2 mg/L de
tiamina, 0,2 mg/L de piridoxina, 0,2 mg/L de ácido nicotínico, 0,2
mg/L de pantotenato, 0,002 mg/L de biotina, 10 mg/L de inositol)
que fue incubado posteriormente hasta que el valor a OD_{600} fue
1,8 a 30ºC. Las células fueron recogidas por centrifugación y
resuspendidas en Tampón 1 [tampón Tris-HCl 10 mM (pH
7,5) que contiene sorbitol 2 M, DTT 0,1 mM, EDTA 0,1 mM, fluoruro
de fenilmetilsulfonilo 0,4 mM (PMSF) y 5 mg/mL de enzima lítica de
levadura]. Después de la incubación durante 1 hora a 30ºC con
agitación suave, las células fueron granuladas por centrifugación y
lavadas en Tampón 2 enfriado en hielo [Tris-HCI 10
mM (pH 7,5) que contenía sorbitol 0,65 M, DTT 0,1 mM, EDTA 0,1 mM,
PMSF 0,4 mM]. Las células fueron entonces resuspendidas en Tampón 2
y fueron sonicadas usando seis ráfagas de 15 segundos con un
Sonicador 250 de Branson en un ciclo de trabajo del 30% y un
control de salida del 10%. La suspensión sonicada fue centrifugada a
10.000 rpm durante 30 minutos y el sobrenadante fue centrifugado a
13.000 rpm durante 90 minutos. El pelete microsomal fue resuspendido
en tampón de ensayo (fosfato de potasio 100 mM (pH 8), EDTA 1 mM,
2-mercaptoetanol 20 mM) y fueron analizados 100
\muL para medir la actividad.
La actividad enzimática de F3'H fue medida
usando una versión modificada del método descrito por Stotz y
Forkmann (1982). La mezcla de la reacción de ensayo contenía
típicamente 100 \muL de extracto de levadura, 5 \muL de NADPH
50 mM en tampón de ensayo (fosfato de potasio 100 mM (pH 8,0), EDTA
1 mM y 2-mercaptoetanol 20 mM) y 10 \muCi de
[^{3}H]-naringenina y fue hecha hasta un volumen
final de 210 \muL con tampón de ensayo. Después de la incubación
a 23ºC durante 2-16 horas, la mezcla de reacción fue
extraída con 0,5 mL de acetato de etilo. La fase de acetato de
etilo fue secada bajo el vacío y luego fue resuspendida en 10 \muL
de acetato de etilo. Las moléculas de flavonoide tritiadas fueron
separadas en placas de capa fina de celulosa (Merck Art 5577,
Alemania) usando un sistema de disolventes de cloroformo: ácido
acético: agua (10:9:1 v/v). Los productos de reacción fueron
localizados por autoradiografía y fueron identificados por
comparación con estándares de naringenina no radiactiva y
eriodictiol que fueron pasados junto a los productos de reacción y
fueron visualizados bajo luz UV.
La actividad de F3'H fue detectada en extractos
de G1315/pCGP1646, pero no en extractos de levadura no transgénica.
A partir de esto fue concluido que el inserto de cADN de pCGP1805
(OGR38), que fue unido al locus de Ht1, codificaba una
F3'H.
El plásmido pCGP1867 (Figura 8) fue construido
clonando el inserto de cADN a partir de pCGP1805 en una orientación
"sentido" detrás del promotor Mac (Comai et al., 1990)
de pCGP293 (Brugliera et al., 1994). El plásmido pCGP1805
fue digerido con XbaI y XpnI para liberar el inserto de cADN. El
fragmento de cADN fue aislado y purificado usando el kit Bresaclean
(Bresatec) y fue ligado con los extremos de XbaI/KpnI del vector
binario pCGP293. La unión fue llevada a cabo usando el kit de unión
de Amersham. La inserción correcta del fragmento en pCGP1867 fue
establecida por el análisis de la enzima de restricción XbaI/Kpnl de
ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la
gentamicina.
Para determinar rápidamente si el fragmento de
cADN OGR-38 en pCGP1867 representaba una F3'H
funcional en plantas, fue llevado a cabo un estudio de expresión
transitorio. Los pétalos del mutante P. hybrida línea Skr4 x
Sw63 fueron bombardeados con partículas de oro (1 \mum de
diámetro) revestidas con el ADN de pCGP1867.
Los microvehículos de oro fueron prelavados 3
veces en etanol del 100% y fueron resuspendidos en agua estéril.
Para cada inyección, fueron mezclados con agitación durante 2
minutos 1 \mug del ADN de pCGP1867, 0,5 mg de microvehículos de
oro, 10 \muL de CaCl_{2} 2,5 M y 2 \muL de espermidina 100 mM
(sin base). Las partículas de oro revestidas de ADN fueron
granuladas por centrifugación, lavadas dos veces con etanol del 100%
y finalmente resuspendidas en 10 \muL de etanol del 100%. La
suspensión fue colocada directamente en el centro del macrovehículo
y se dejó secar.
Las flores de Skr4 x Sw63 en etapas 1 y 2 fueron
cortadas verticalmente en mitades y fueron parcialmente embebidas
en medio sólido MS (sacarosa al 3% (p/v), 100 mg/L de
mio-inositol, sales 1xMS, 0,5 mg/L de
piridoxina-HCl, 0,1 mg/L de
tiamina-HCl, 0,5 mg/L de ácido nicotínico y 2 mg/L
de glicina). Los pétalos fueron colocados de modo que el interior
de los capullos estaban hacia arriba. Un sistema biolístico
PDS-1000/He (Bio-Rad), usando una
presión de gas Helio de 900 psi y un vacío de cámara de 28 pulgadas
de mercurio, fue usado para proyectar a los microvehículos de oro
en el tejido de pétalo. Después de 6-12 horas bajo
luces en un cuarto de crecimiento de plantas controlado a 22ºC,
fueron observadas transferencias de antocianina roja sobre la capa
epidérmica superior del tejido del pétalo bombardeado con
partículas revestidas con pCGP1867. Ninguna transferencia coloreada
fue observada en el pétalo de control bombardeado con partículas de
oro solas. Estos resultados indicaron que el clon de cADN
OGR-38 en el control del promotor Mac era funcional,
al menos transitoriamente, en el tejido de pétalo.
El plásmido pCGP1867 (Figura 8) fue introducido
en la cepa de Agrobacterium tumefaciens AGL0 añadiendo 5
\mug de ADN de plásmido a 100 \muL de células competentes AGL0
preparadas inoculando un cultivo de 50 mL de MG/L (Garfinkel y
Nester, 1980) y dejándolo crecer durante 16 horas con agitación a
28ºC. Las células entonces fueron granuladas y resuspendidas en 0,5
mL de CaCl_{2} 100 mM al 85% (v/v)/glicerol al 15% (v/v). La
mezcla de ADN-Agrobacterium fue congelada por incubación en
N_{2} líquido durante 2 minutos y luego se dejó descongelarse por
incubación a 37ºC durante 5 minutos. La mezcla de ADN/bacteriano
entonces fue colocada en hielo durante 10 minutos más. Las células
entonces fueron mezcladas con 1 mL de medio LB (Sambrook et
al., 1989) y fueron incubadas con agitación durante 16 horas a
28ºC. Las células de A. tumefaciens que llevaban pCGP1867
fueron seleccionadas en placas de agar LB que contenían 10 g/mL de
gentamicina. El análisis Southern confirmó la presencia de pCGP1867
del ADN aislado a partir de los transformantes resistentes a la
gentamicina.
El tejido de hoja de las plantas maduras de
P. hybrida cv Skr4 x Sw63 fue tratado en hipoclorito de sodio
al 1,25% (p/v) durante 2 minutos y luego fue aclarado tres veces en
agua estéril. El tejido de hoja entonces fue cortado en cuadrados
de 25 mm^{2} y fue precultivado en medio MS (Murashige y Skoog,
1962) suplementado con 0,05 mg/L de quinetina y 1,0 mg/L de ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)
durante 24 horas.
La cepa de A. tumefaciens AGL0 que
contiene el vector binario pCGP1867 (Figura 11) fue mantenida a 4ºC
en placas de agar MG/L con 100 mg/L de gentamicina. Una colonia sola
fue cultivada de noche en medio líquido que contenía
Bacto-peptona al 1% (p/v), extracto de levadura de
Bacto al 0,5% (p/v) y NaCI al 1% (p/v). Una concentración final de
5 x 10^{8} células/mL fue preparada al día siguiente por la
dilución en medio líquido MS que contiene vitaminas B5 (Gamborg
et al., 1968) y sacarosa al 3% (p/v) (BPM). Se bañaron los
discos de hoja durante 2 minutos en BPM que contenía AGL0/pCGP1867.
Los discos de hoja entonces fueron transferidos secos y fueron
colocados en medio de co-cultivación durante 4 días.
El medio de co-cultivación consistió en medio SH
(Schenk y Hildebrandt, 1972) suplementado con 0,05 mg/L de quinetina
y 1,0 mg/L de 2,4D e incluyó una capa de alimentador de suspensión
de célula de tabaco extendida sobre el medio de
co-cultivación con un papel de filtro colocado
sobre la parte superior de la suspensión de células de tabaco.
Después de la co-cultivación,
los discos de hoja fueron transferidos al medio de selección (medio
MS suplementado con sacarosa al 3% (p/v), 2 mg/L\betade
\alpha-bencilaminopurina (BAP), 0,5 mg/L de ácido
\alpha-naftaleno acético (NAA), 300 mg/L de
kanamicina, 350 mg/L de cefotaxima y Goma Gellan Gelrite al 0,3%
(p/v) (Schweizerhall)). Las explantas regenerantes fueron
transferidas a medio de selección reciente después de 4 semanas. Los
disparos adventicios que sobrevivieron a la selección de kanamicina
fueron aislados y transferidos a BPM que contenía 100 mg/L de
kanamicina y 200 mg/L de cefotaxima para la inducción de raíz. Todos
los cultivos fueron mantenidos bajo un fotoperíodo de 16 horas (60
\mumol. m-2, s-1 luz fluorescente
blanca fría) a 23 \pm 2ºC. Cuando las raíces alcanzaron
2-3 cm de longitud las plántulas de petunia
transgénicas fueron transferidas a Debco 51410/2 sometido a
autoclave encapsulando la mezcla en tubos de 8 cm. Después de 4
semanas, las plantas fueron replantadas en tiestos de 15 cm, usando
la misma mezcla de encapsulado, y fueron mantenidas a 23ºC bajo un
fotoperíodo de 14 horas (300 \mumol. m-2,
s-1 luz de haluro de mercurio).
La tabla 5 muestra los diversos fenotipos de
color de pétalos y polen obtenidos con plantas Skr4 x Sw63
transformadas con el plásmido pCGP1867. Las plantas transgénicas
Nº. 593A, 590A, 571A, 589A, 592A y 591A produjeron flores con un
color de pétalo modificado. Además, las anteras y el polen de las
flores de las plantas Nº. 593A, 590A, 589A, 592A y 591A eran rosas,
comparado con las de la planta control Skr4 x Sw63, que eran
blancas. El cambio del color de la antera y el polen, observado en
la introducción del plásmido pCGP1867 en plantas de petunia Skr4 x
Sw63 fue un resultado inesperado. Los códigos de color son tomados
de la carta de colores de la sociedad real hortícola (RHSCC). Ellos
proporcionan un medio alternativo para describir los fenotipos de
color observados. Los números designados, sin embargo, deberían ser
tomados sólo como una guía respecto a los colores percibidos y no
deberían ser considerados como una limitación de los posibles
colores que pueden ser obtenidos.
La expresión del cADN de Ht1 introducido en el
híbrido Skr4 x Sw63 tenía un efecto marcado en el color de la flor.
El tejido del estambre del control no transgénico es blanco,
mientras que el mismo tejido en la mayor parte de las plantas
transgénicas era rosa. Además, la expresión del cADN de Ht1 en el
híbrido Skr4 x Sw63 confería un matiz rosa oscuro a la corola, que
normalmente es lila muy palo.
Las antocianidinas y los flavonoles producidos
en los pétalos y estambres (incluidos el polen, las anteras y los
filamentos) de las plantas Skr4 x Sw63 transformadas con pCGP1867
fueron analizados por TLC.
Antes del análisis TLC, las moléculas de
antocianina y flavonol presentes en los extractos de pétalo y
estambre fueron hidrolizados con ácido para eliminar los restos de
glicosilo del núcleo de antocianidina o flavonol. Los estándares de
antocianidina y flavonol fueron usados para ayudar a identificar los
compuestos presentes en los extractos florales.
Las antocianinas y flavonoles fueron extraídos e
hidrolizados hirviendo entre 100 y 200 mg de hojas de pétalo, o
cinco estambres, en 1 mL de ácido clorhídrico 2 M durante 30
minutos. Las antocianinas y flavonoles hidrolizados fueron
extraídos con 200 \muL de iso-amilalcohol. Esta
mezcla entonces fue secada bajo el vacío y fue resuspendida en un
volumen más pequeño de metanol/HCl al 1% (v/v). El volumen de
metanol/HCl al 1% (v/v) usado estaba basado en el peso inicial
fresco del pétalo de modo que pudieran ser estimados los niveles
relativos de flavonoides en los pétalos. Los extractos de los
estambres fueron resuspendidos en 1 \muL de metanol/HCl al 1%
(v/v). Una alícuota de 1 \muL de los extractos del pCGP1867 en
pétalos y estambres de Skr4 x Sw63 fue distribuida en puntos en una
placa TLC.
Fueron aplicados extractos florales hidrolizados
por ácido a un sistema disolvente Forestal (HOAc:agua:HCI; 30: 10:
3) (Markham, 1982). La tabla 6 muestra los resultados del análisis
TLC de las antocianidinas y flavonoles presentes en algunas de las
flores y los estambres de las plantas de petunia transgénicas Skr4 x
Sw63 transformadas con pCGP1867. Las cantidades relativas
indicativas de los flavonoles y las antocianidinas (designadas con
de "+" a "+++") fueron estimadas comparando las
intensidades de los puntos observados en la placa TLC.
\vskip1.000000\baselineskip
La introducción del clon de cADN de Ht1 en Skr4
x Sw63 condujo a la producción de los flavonoides 3'hidroxilados,
quercetina, peonidina y alguna cianidina en los pétalos. La
peonidina es el derivado metilado de cianidina (Figuras 1a y 1b).
Sólo el kaempferol y una pequeña cantidad de malvidina fueron
detectados en el control de Skr4 x Sw63 no transgénico (Tabla 6).
Aunque Skr4 x Sw63 sea homocigótico recesivo tanto para los genes
Hf1 como para Hf2, estas mutaciones no bloquean completamente la
producción de F3'5'H (véase la patente de EE.UU. Nº. 5.349.125) y
son producidos bajos niveles de malvidina para dar un color lila
palo de la hoja de pétalo.
Los estambres con polen rosa y anteras
producidas por la planta transgénica Nº. 593A contenían peonidina y
quercetina, mientras que el control de Skr4 x Sw63 no transgénico
con polen blanco y anteras contenía kaempferol y un nivel bajo de
quercetina (Tabla 6).
La acumulación de la antocianidina
3'-hidroxilada, peonidina, en los pétalos y los
estambres de las plantas Skr4 x Sw63/pCGP1867 transgénicas se
correlacionaba con los colores rosa y rosa oscuro observados en los
pétalos, anteras y polen de las mismas plantas.
El plásmido pCGP1867 también fue introducido en
P. hybrida cv. aspidistra roja (Ht1) para reducir el nivel
de actividad de F3'H.
Fueron llevadas a cabo transformaciones de
petunia como se describe en el Ejemplo 9, anterior.
Dos de 38 plantas transgénicas produjeron flores
con un fenotipo modificado. OGR normalmente produce flores muy
rojas (RHSCC Nº. 46B). Las dos plantas transgénicas con el color
floral modificado produjeron flores con un matiz rosa claro o rojo
claro (RHSCC Nº. 54B y Nº. 53C).
El análisis Northern en el ARN aislado a partir
de flores producidas por cuatro plantas transgénicas (las dos
transgénicas con un fenotipo modificado y dos transgénicas con las
flores habituales muy rojas) fue realizado para examinar el nivel
de transcritos OGR-38. Diez microgramos de ARN de
pétalo total fueron separados en un gel de agarosa/formaldehído al
1,2% (p/v) (Sambrook et al. 1989) y fueron transferidos a una
membrana de nilón HybondN (Amersham), como se describe antes. El
ARN de pétalo de una flor OGR no transformada también fue incluido
como un control. Los fragmentos ^{32}P-marcados de
los insertos de cADN de OGR-38 fueron usados para
sondar el ARN de transferencia.
La sonda de OGR-38 detectó
transcritos de aproximadamente 2,4 kb y 1,8 kb en las flores de las
plantas transgénicas. Sin embargo, el nivel de ambos transcritos
detectados en las flores rosa claro y rojo claro fue bastante
inferior que el detectado en las flores muy rojas transgénicas. El
transcrito endógeno de 1,8 kb también fue detectado en el ARN de
las flores de OGR no transformadas. Para confirmar que el transcrito
de 2,4 kb era del transgen introducido OGR-38, los
fragmentos ^{32}P-marcados de la región del
terminador mas fueron usados para sondar el mismo ARN de
transferencia. La sonda mas detectó la transcrito de 2,4 kb,
sugiriendo que al menos este transcrito fue derivado del transgen
OGR-38 introducido.
Los niveles de antocianinas en las flores
control y en la flor rosa claro transgénica fueron medidos por
análisis espectrofotométrico.
Las antocianinas y los flavonoles fueron
extraídos de las hojas de pétalo incubando de 200 a 300 mg de hojas
de pétalo en 2 mL de metanol/HCl al 1% (v/v) durante 16 horas a 4ºC.
Cincuenta \muL de esta solución entonces fueron añadidos a
950\beta\muL de metanol/HCl al 1% (v/v) y fue determinada la
absorbancia de la solución diluida a 530 nm. El nivel de
antocianina en nmoles por gramo fue determinado usando la fórmula:
[(Abs (530 nm)/34.000) x volumen de tampón de extracción x factor
de dilución x 10^{6}]/peso en gramos.
La flor rosa claro fue encontrada que contenía
aproximadamente 915 nmoles de antocianina por gramo de tejido de
hoja de pétalo mientras que la flor control contenía alrededor de
4000 nmoles/gramo.
Estos datos sugieren que la introducción del
clon de cADN de F3'H (OGR-38) de petunia en una
orientación sentido en plantas OGR conduce a la
"co-supresión" (es decir, la reducción) tanto
de los transcritos F3'H endógenos como transgénicos. Una
correlación fue observada entre los colores de flor claros, una
producción de antocianina reducida y un nivel de transcrito de F3'H
reducido.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar un clon de cADN de F3'Hde
Dianthus caryophyfluss (clavel), el clon de cADN de F3'H
unido a Ht1 de petunia (OGR-38), contenido en
pCGP1805 (descrito anteriormente), fue usado para rastrear una
genoteca de cADN de pétalo de clavel cv. Kortina Chanel, en
condiciones de estringencia baja.
Veinte microgramos del ARN total aislado (como
se describe antes) de las etapas 1, 2 y 3 de flores Kortina
Chanel fueron retrotranscritos en un volumen de 50 \muL que
contenía tampón de reacción 1 x Superscript®, ditiotreitol 10 mM
(DTI), dATP 500 \muM, dGTP 500 \muM, dTTP 500 \muM,
5-metil-dCTP 500 \muM, 2,8 \mug
de oligo Primer-Linker del kit de clonación
ZAP-cADN Gigapack III Gold (Stratagene) y 2 \muL
de transcriptasa inversa Superscript® (BRL). La mezcla de reacción
fue incubada a 37ºC durante 60 minutos, luego fue colocada en
hielo. Un kit de clonación de Gigapack III Gold
\lambdaZAP-cADN (Stratagene) fue usado para
completar la construcción de la genoteca. El número total de
recombinantes fue 2,4 x 10^{6}.
Un total de 200.000 pfu del cADN empaquetado fue
puesto en placa a 10.000 pfu por placa de 15 cm de diámetro después
de la transfección de células XL1-Blue MRF'. Las
placas fueron incubadas a 37ºC durante 8 horas, luego fueron
almacenadas de la noche a la mañana a 4ºC. Las suspensiones
duplicadas fueron llevadas a filtros Colony/Plaque Screen® (DuPont)
y fueron tratadas como se recomienda por el fabricante.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron tratadas como se describe antes. Las
suspensiones duplicadas de la genoteca de cADN de pétalo de Kortina
Chanel fueron rastreadas con fragmentos
^{32}P-marcados del inserto de 1,8 kb EcoRI/XhoI
de pCGP1805. Fueron usadas condiciones de estringencia baja, como
se describe para el rastreo de la genoteca de cADN de OGR de
petunia.
Una placa de fuerte-hibridación
fue escogida en PSB y fue rastreada de nuevo como se detalla
anteriormente para aislar placas purificadas. El plásmido contenido
en el vector de bacteriófago lZAP fue rescatado y llamado
pCGP1807.
El inserto de cADN KC-1
contenido en pCGP1807 fue liberado bajo la digestión con EcoRI/XhoI
y tiene alrededor de 2 kb. La secuencia completa del clon de cADN
KC-1 fue determinada por compilación de secuencia a
partir de subclones del inserto de cADN KC-1. (La
secuencia parcial que cubre 458 nucleótidos había sido generada
previamente a partir de un fragmento de 800 bp KpnI que cubre la
región 3' de KC-1 que fue subclonada en pBluescript
para dar pCGP1808.) La secuencia completa (SEQ ID NO:3) contenía un
marco de lectura abierto de 1508 bases que codificaba un supuesto
polipéptido de 500 aminoácidos (SEQ ID NO:4).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN KC-1 de clavel fueron
comparadas con las del clon de cADN de F3'H OGR-38
de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2). Las secuencias del clon de
cADN KC-1 de clavel (SEQ ID NO:3 y 4) mostraron una
semejanza del 67,3%, unos 1555 nucleótidos, y una semejanza del
71,5%, unos 488 aminoácidos, con el clon de cADN de F3'H
OGR-38 de petunia.
Una alineación de las secuencias de petunia,
clavel, boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia,
todas las cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios
resúmenes de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en las Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
El plásmido pCGP1810 (Figura 9) fue construido
clonando el inserto de cADN de pCGP1807 en una orientación
"sentido" detrás del promotor Mac (Comai et al., 1990)
de pCGP90 (patente de EE.UU. 5.349.125), un constructo basado en
pCGP293 (Brugliera et al., 1994). El plásmido pCGP1807 fue
digerido con BamHI y Apal para liberar el inserto de cADN
KC-1. El fragmento de cADN fue aislado y purificado
usando el kit Bresaclean (Bresatec). El vector binario pCGP90 fue
digerido con BamHI y Apal para liberar el vector linealizado y el
inserto de cADN Hfl. El vector linealizado fue aislado y purificado
usando el kit Bresaclean (Bresatec) y fue ligado con los extremos
de BamHI/ApaI del clon de cADN KC-1. La unión fue
llevada a cabo usando la unión de Amersham. La inserción correcta
del inserto en pCGP1810 fue establecida por el análisis de la enzima
de restricción BamHI/ApaI de ADN aislado a partir de transformantes
resistentes a la gentamicina.
El vector binario pCGP1810 fue introducido en
células AGL0 de la cepa de A. tumefaciens, como se describe
en el Ejemplo 9. Las células pCGP1810/AGL0 fueron usadas
posteriormente para transformar plantas de petunia Skr4 x Sw63
(también descrito en el Ejemplo 9), para analizar la expresión
estable y la actividad de la enzima codificada por el gen
correspondiente al clon de cADN KC-1.
La expresión del cADN de KC-1
introducido en el híbrido Skr4 x Sw63 tenía un efecto marcado sobre
el color de la flor. Diez de las doce plantas transgénicas
transformadas con pCGP1810 produjeron flores con un color de pétalo
modificado (RHSCC Nº. 73A), comparado con el control de Skr4 x Sw63
(RHSCC Nº. 74C). Además las anteras y el polen de las flores
transgénicas eran rosa, comparado con las de la planta control Skr4
x Sw63, que era blanca. Además, la expresión del cADN de
KC-1 en el híbrido Skr4 x Sw63 confirió un matiz
rosa oscuro a la corola, que normalmente es lila palo. Los códigos
de colores son tomados de la carta de colores de la sociedad real
hortícola (RHSCC). Ellos proporcionan un medio alternativo para
describir los fenotipos observados en el color. Los números
designados, sin embargo, deberían ser tomados sólo como una guía a
los colores percibidos y no deberían ser considerados como una
limitación de los colores posibles que pueden ser obtenidos.
Fueron producidos extractos florales
hidrolizados por ácido (véase el Ejemplo 11) en un sistema
disolvente Forestal (HOAc:agua:HCl; 30: 10: 3) (Markham, 1982). Los
flavonoides 3'-hidroxilados, peonidina y quercetina,
fueron detectados fácilmente en las hojas de pétalo de las plantas
transgénicas. Sólo kaempferol y una pequeña cantidad de malvidina
fueron detectados en el control de Skr4 x Sw63 no transgénico.
La acumulación de la antocianidina
3'-hidroxilada, peonidina, en los pétalos de plantas
transgénicas Skr4 x Sw63/pCGP1810 se correlacionaban con los
colores rosa oscuro observados en los pétalos de las mismas
plantas.
El plásmido pCGP1811 fue construido clonando el
inserto de cADN de pCGPl807 en una orientación "sentido" detrás
del promotor Mac (Comai et al., 1990) de pCGP1958. El
plásmido pCGP1958 contiene al promotor Mac y el terminador de
manopina sintasa (mas) (Comai et al., 1990) en una
estructura pUC19. El plásmido pCGP1807 fue digerido con PstI y XhoI
para liberar el inserto de cADN. Los extremos 5' sobresalientes
fueron rellenados usando la ADN polimerasa (fragmento Klenow)
(Sambrook et al., 1989). El fragmento de cADN fue aislado y
purificado usando el kit Bresaclean (Bresatec) y fue unido con los
extremos Smal del vector pCGP1958 para producir pCGP1811.
El plásmido pCGP1811 fue digerido posteriormente
con PstI para liberar el casete de expresión que contiene al
promotor Mac que conduce el cADN de KC-1 con un
terminador mas, todo lo cual estaba contenido en un
fragmento de 4 kb. El casete de expresión fue aislado y unido con
los extremos de PstI del vector binario pWTT2132 (Corporación de
Tecnología de Planta de ADN; Oakland, California) para producir
pCGP1813 (Figura 10).
El vector binario pCGP1813 fue introducido en
células AGL0de la cepa de A. tumpaciens, como se describe en
el Ejemplo 9. Las células pCGP1813/AGL0 fueron usadas para
transformar plantas de clavel, para reducir la cantidad de
flavonoides 3'-hidroxilados.
Fueron obtenidos recortes de Dianthus
caryophyllus (cv. Kortina Chanel) de Van Wyk y Son Flower
Supply, Victoria, Australia. Las hojas externas fueron eliminadas y
los recortes fueron esterilizados brevemente en etanol al 70% v/v
seguido de hipoclorito de sodio al 1,25% p/v (con Tween 20) durante
6 minutos y fueron aclarados tres veces con agua estéril. Todas las
hojas visibles y brotes auxiliares fueron eliminadas bajo el
microscopio de disección antes de la
co-cultivación.
La cepa AGL0 de Agrobacterium tumefaciens
(Lazo et al., 1991), que contiene el vector binario pCGP1813,
fue mantenido a 4ºC en placas agar de LB con 50 mg/L de
tetraciclina. Una colonia sola fue cultivada de noche en caldo LB
líquido que contenía 50 mg/L de tetraciclina y fue diluida a 5 x
10^{8} células/mL al día siguiente antes de la inoculación. El
tejido de tallo de Dianthus fue co-cultivado
con Agrobacterium durante 5 días en medio MS suplementado
con sacarosa al 3% p/v, 0,5 mg/L de BAP, 0,5 mg/L de ácido
2,4-diclorofenoxi-acético
(2,4-D), acetosiringona 100 mM y Gelrite al 0,25%
p/v (pH 5,7).
Para la selección de tejido de tallo
transformado, 6-8 mm de la parte superior de cada
tallo co-cultivado fueron cortados en segmentos de
3-4 mm, que entonces fueron transferidos al medio MS
(Murashige y Skoog, 1962) suplementado con sacarosa al 0,3% p/v,
0,5 mg/L de BAP, 0,5 mg/L de 2,4-D, 1 \mug/L de
clorosulfuron, 500 mg/L de ticarcilina y Gelrite al 0,25% p/v.
Después de 2 semanas, las explantas fueron transferidas a medio MS
recien preparado que contenía sacarosa al 3%, 0,16 mg/L de
tidiazuron (TDZ), 0,5 mg/L de ácido
indol-3-butírico (IBA), 2 \mug/L
de clorosulfuron, 500 mg/L de ticarcilina y Gelrite al 0,25% p/v y
fueron tomados con cuidado en esta etapa para eliminar los brotes
auxiliares de explantas de tallo. Después de 3 semanas, fueron
transferidos brotes adventicios sanos a medio MS sin hormonas que
contiene sacarosa al 3% p/v, 5 \mug/L de clorosulfuron, 500 mg/L
de ticarcilina, Gelrite al 0,25% p/v. Fueron transferidos brotes que
sobrevivieron a 5 \mug/L de clorosulfuron al mismo medio para la
elongación del brote.
Los brotes alargados fueron transferidos a medio
MS sin hormona que contenía 5 \mug/L de clorosulfuron, 500 mg/L
de ticarcilina y Gelrite al 0,4% p/v, en tarros de vidrio, para la
producción de raíz y la normalización. Todos los cultivos fueron
mantenidos bajo un fotoperíodo de 16 horas (120 mE/m^{2}/s luz
fluorescente blanca fría) a 23 \pm 2ºC. Las plántulas
normalizadas, de aproximadamente 1,5-2 cm de alto,
fueron transferidas a la tierra (turba al 75%/perlita al 25%) para
su aclimatación a 23ºC bajo un fotoperíodo de 14 horas (200
mE/m^{2}/s de luz de haluro de mercurio) durante
3-4 semanas. Las plantas fueron fertilizadas con una
mezcla de clavel que contenía 1 g/L de CaNO_{3} y 0,75 g/L de una
mezcla de microelementos más N:P:K en una relación de
4,7:3,5:29,2.
Fue empleado un nuevo enfoque para aislar una
secuencia de cADN que codificaba F3'H de Antirrhinum mayus
(boca de dragón). Los métodos modificados basados en los protocolos
para (i) el aislamiento de secuencias de citocromo P450 de planta
usando oligonucleótidos redundantes (Holton et al. 1993) y
(ii) la expresión diferencial de ARN mensajero eucariota (Liang y
Pardee, 1992) fueron combinados para comparar las poblaciones del
transcrito de citocromo P450 de pétalo entre líneas de boca de
dragón del tipo silvestre (Eos^{+}) y mutante de F3'H
(eos^{-}). La clonación directa de los fragmentos de cADN
diferencialmente expresados permitió su posterior caracterización
por Northern, RFLP y análisis de secuencia para identificar las
secuencias que codifican la supuesta F3'H. Un cADN de cadena entera
fue obtenido usando el protocolo RACE de Frohman et al.
(1988) y el clon fue mostrado para codificar un F3'H funcional
siguiendo tanto la expresión transitoria como estable en células de
pétalo de petunia.
Las líneas de Antirrhinum majus usadas
fueron derivadas a partir de las líneas madre K16 (eos^{-}) y N8
(eos^{+}). K16 es un mutante recesivo homocigótico que carece de
actividad de F3'H, mientras que N8 es del tipo silvestre para la
actividad de F3'H. Estas líneas son similares, aunque no isogénicas.
La semilla de la cápsula E228^{2} de la planta K16 x N8 F1
autopolinizada (Nº. E228) fue germinada y las plantas resultantes
(plantas K16 x N8 F2) fueron puntuadas según la presencia o la
ausencia de cianidina, un producto de la actividad de F3'H (véanse
las Figuras 1a y 1b). La presencia de cianidina podría ser puntuada
visualmente, ya que las flores eran de un color carmesí, a
diferencia de las plantas del mutante que eran de color rosa (a
partir de pigmentos derivados de pelargonidina). El análisis TLC
confirmó la exactitud de las puntuaciones visuales de las
antocianinas de pétalo, llevado a cabo como se describe en el
Ejemplo 11.
De las 13 plantas generadas a partir de la
semilla de E228^{2}, 9 (Nº. 3, Nº. 4, Nº. 5, Nº. 6, Nº. 7, Nº. 9,
Nº. 10, Nº. 12, Nº. 15) produjeron flores con cianidina
(Eos^{+}/Eos^{+} y Eos^{+}/eos^{-}) mientras que 4 (Nº. 8,
Nº. 11, Nº. 13, Nº. 14) produjeron sólo pigmentos derivados de
pelargonidina (eos^{-}/eos^{-}).
El ARN total fue aislado a partir de hojas de la
planta Nº. 13 y el tejido de pétalos de las plantas Nº. 3, Nº. 5, y
Nº. 12 de la población que segregaba K16 x N8 F2 de A. majus
(E228^{2}) usando el método de Turpen y Griffith (1986). La
contaminación por el ADN fue eliminada tratando 50 \mug del ARN
total con 1 unidad de RQ1 DNasa sin RNasa (Promega) en presencia de
40 unidades del inhibidor de ribonucleasa RNasin® (Promega) durante
3 horas a 37ºC en un tampón recomendado por los fabricantes. El ARN
entonces fue purificado además por la extracción con
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y la precipitación de
etanol subsecuente.
Fueron usados oligonucleótidos Poli (T)
anclados, complementarios a la región corriente arriba de la
secuencia de poliadenilación, para cebar la síntesis de cADN del
ARN de hoja y pétalo de A. mayus. Las secuencias de
oligonucleótidos sintetizadas fueron (5'-3'):
Fueron calentados a 70ºC durante 10 minutos dos
microgramos de ARN total y 100 pmol del oligonucleótido de cebadura
apropiado, luego fueron enfriados en hielo. Los híbridos de
ARN/cebador entonces fueron añadidos a una reacción que contenía 20
unidades de RNasin® (Promega), 25 nM cada dNTP, DTT 10 mM y tampón
de 1xSuperscript® (BRL). Esta reacción fue calentada a 37ºC durante
2 minutos, después fueron añadidas 200 unidades de transcriptasa
inversa Superscript® (BRL) y la reacción se dejó proceder durante 75
minutos, después de lo cual la transcriptasa inversa fue inactivada
calentando la mezcla a 95ºC durante 20 minutos.
Fueron amplificadas secuencias de citocromo P450
usando oligonucleótidos redundantes (diseñados para ser
complementarios a las regiones conservadas cerca del extremo 3' de
secuencias que codifican citocromo P450 de planta) y
oligonucleótidos de poliT anclados. Un enfoque similar fue usado
previamente para generar secuencias de citocromo P450 de Petunia
hybrida y se describe en la patente de EE.UU. Nº. 5.349.125.
Fueron sintetizados cuatro oligonucleótidos
(llamado cebadores corriente arriba). Estos fueron derivados a
partir de regiones de aminoácidos conservadas en secuencias de
citocromo P450 de planta. Los oligonucleótidos (escritos de 5' a
3') fueron como sigue:
Los cebadores corriente arriba fueron usados con
cada uno de los oligonucleótidos poliT anclados para generar
secuencias de citocromo P450 en reacciones de cadena de la
polimerasa usando cADN como plantilla. Cincuenta pmol de cada
oligonucleótido fueron combinados con 2 \muM de cada dNTP,
MgCl_{2} 1,5 mM, tampón 1x PCR (Perkin Elmer),
\alpha-[^{33}P] dATP 5 \muCi (Bresatec, 1500 Ci/mmol), 2,5
unidades de ADN polimerasa de AmpliTaq® (Perkin Elmer) y 1/10 de la
reacción de cADN cebado de poliT-ancla (desde
arriba). Las mezclas de reacción (50 \muL) fueron cicladas 40
veces entre 94ºC durante 15 segundos, 42ºC durante 15 segundos y
70ºC durante 45 segundos, después de una etapa inicial de
desnaturación de 2 minutos a 94ºC. Las reacciones de ciclación
fueron realizadas usando un ciclador térmico Gene Amp 9600 de Perkin
Elmer.
Las secuencias de ADN fueron amplificadas usando
cada uno de la combinación de cebador corriente arriba/ceba-
dor anclado y de la plantilla de cADN cebado de manera apropiada. Cada combinación de cebador fue usada con el cADN a partir de los pétalos de las plantas E228^{2} Nº. 3 y Nº. 5 (flores que producen cianidina) y Nº. 12 (flores que no producen cianidina). También fueron incluidas reacciones que incorporan cADN de hoja a partir de la planta Nº. 13 (flores que producen cianidina), como controles negativos, porque la actividad de F3'H no está presente a un nivel significativo en tejidos de hoja sanos y no estresados.
dor anclado y de la plantilla de cADN cebado de manera apropiada. Cada combinación de cebador fue usada con el cADN a partir de los pétalos de las plantas E228^{2} Nº. 3 y Nº. 5 (flores que producen cianidina) y Nº. 12 (flores que no producen cianidina). También fueron incluidas reacciones que incorporan cADN de hoja a partir de la planta Nº. 13 (flores que producen cianidina), como controles negativos, porque la actividad de F3'H no está presente a un nivel significativo en tejidos de hoja sanos y no estresados.
Fueron visualizados fragmentos de PCR
^{33}P-marcados después de la separación en un gel
desnaturalizante al 5% (p/v) de poliacrilamida/urea (Sambrook et
al. 1989). Una escalera de secuenciación de M13mp18
^{33}P-marcado fue incluida en el gel para servir
como marcador por tamaños. El gel de secuenciación fue secado en
papel 3 MM de Whatman y fue expuesto a una película XAR de Kodak a
temperatura ambiente.
La comparación de bandas entre muestras de
pétalo que producían cianidina y la muestra de pétalo sin cianidina
reveló 11 bandas que representaban los mARN exclusivamente presentes
en los pétalos que producían cianidina. De estas 11 bandas, sólo
dos estaban también presentes (a una intensidad reducida) en la
muestra de hoja.
Fueron purificados los productos de la PCR a
partir del gel de secuenciación seco y fueron amplificados de nuevo
por el método descrito por Liang et al. (1993). Fueron
purificados los cADN amplificados, después de la separación
electroforética en un gel de agarosa/TAE al 1,2% (p/v), usando un
kit Bresaclean (Bresatec). Los fragmentos purificados fueron unidos
entonces directamente en el vector pCR-Script®
(Stratagene) comercialmente preparado o pBluescript®
EcoRV-Iinearizado (Stratagene) que había sido
modificado con una cola T usando el protocolo de Marchuk et
al. (1990).
Cada uno de los once productos de la PCR de
expresión diferencial clonados (con insertos que no excedían los
500 bp) fue secuenciado en ambas cadenas y fue comparado con otras
secuencias de citocromo P450 conocidas implicadas en la biosíntesis
de antocianina, usando el algoritmo FASTA de Pearson y Lipman
(1988).
De los once cADN clonados, dos (Am1Gb y Am3Ga)
expresaron una fuerte homología con la secuencia de F3'H
OGR-38 de petunia (Ejemplos de 4 a 11) y las
secuencias de F3'5'H (Holton et al., 1993). Las secuencias
conservadas entre los clones Am1Gb y Am3Ga sugirieron que
representaban los fragmentos sobrelapantes del mismo mARN. El clon
Am3Ga se extiende desde la secuencia que codifica la región de unión
haem de la molécula (como se reconoce por el oligonucleótido "Pet
Haem-New"; SEQ ID NO:34) a la secuencia de
poliadenilación. El clon Am1Gb se extiende desde la secuencia del
citocromo P450 que codifica el motivo del aminoácido "WAIGRDP"
conservado (complementario con el cebador 1; SEQ ID NO:30 y SEQ ID
NO:31) a un área en la región no traducida 3' que fue reconocida
falsamente por el oligonucleótido del cebador 1
("WAIGRDP").
El análisis de polimorfismo de longitud del
fragmento de restricción (RFLP) fue usado de nuevo para investigar
la unión del gen correspondiente al clon de cADN Am3Ga respecto a la
presencia, o la ausencia, de la actividad que produce cianidina en
pétalos. Un inserto ^{32}P-marcado de Am3Ga fue
usado para sondar las transferencias Southern de ADN genómico
aislado a partir de plantas que segregan K16 x N8 F2 así como las
líneas K16 y N8 madre. El análisis de ADN genómico digerido de
EcoRV a partir de 13 plantas de la población que segregaba K16 x N8
F2 reveló la hibridación sólo a las secuencias de N8 y líneas que
segregaban K16 x N8 F2 que expresaban la producción de cianidina
floral (Figura 11). Las plantas K16 x N8 F2 que produjeron pigmentos
sólo derivados de pelargonidin en sus pétalos (incluyendo la línea
madre, K16) no mostraron ninguna hibridación específica (Figura 11,
bandas 2, 8, 11, 13, 14). Estos datos indican una deleción posible
de las secuencias genómicas correspondientes a Am3Ga en la planta
del mutante K16 y, por lo tanto, al menos una deleción parcial del
gen de F3'H en esta línea.
El análisis Northern fue usado para confirmar
los perfiles de expresión de los supuestos fragmentos de citocromo
P450 como se muestra por expresión diferencial. Diez microgramos de
ARN de pétalo total de ocho de la población que segregaba K16 x N8
F2 fueron separados en un gel de agarosa/formaldehído al 1,2% (p/v)
(Sambrook et al. 1989) y fueron transferidos a una membrana
de nilón HybondN (Amersham). El ARN de la hoja de la planta que
produce cianidina Nº. 13 también fue incluido como un control
negativo en el análisis Northern. Los fragmentos
^{32}P-marcados del inserto de cADN del clon Am3Ga
fueron usados para sondar el ARN de transferencia.
La sonda de Am3Ga reconoció un transcrito de
aproximadamente 1,8 kb que era sólo detectable en los pétalos de
plantas que producían cianidina (plantas Nº. 1, Nº. 3, Nº. 4, Nº. 5,
Nº. 8). Ningún transcrito era detectable en los pétalos que
producían pelargonidina (plantas Nº. 6, Nº. 11, Nº. 12) o en la
muestra de hoja de la planta Nº. 13 (Figura 12).
Estos datos, tomados con los del análisis RFLP,
proporcionan pruebas convincentes de que el clon de Am3Ga
representa un gen de citocromo P450 que es responsable de la
actividad de F3'H en boca de dragón. La carencia total de un
transcrito detectable en los pétalos de líneas que no producen
cianidina apoya las conclusiones del análisis RFLP, que la pérdida
de actividad productora de cianidina en la línea K16 (y las plantas
homocigóticas recesivas de la población que segrega K16 x N8 F2) es
el resultado de una deleción en el gen de F3'H estructural.
El protocolo de amplificación rápida de los
extremos de cADN (RACE) de Frohman et al. (1988) fue empleado
para aislar un clon de cADN de F3'H de cadena entera usando el
conocimiento de secuencia del clon de Am3Ga parcial. Un cebador
génico específico ("SnapredRace A" - complementario a las
secuencias 361 a 334 de Am3Ga) fue sintetizado para permitir la
transcripción inversa del ARN de pétalo. Un cebador de amplificación
3' ("SnapredRace C" - complementario a las secuencias de 283 a
259 de Am3Ga (3'UTR)) también fue sintetizado para unirse justo
corriente arriba de "SnapredRace A". Un cebador "Poli (C)"
fue usado para amplificar las secuencias del extremo 5' de la
molécula de cADN.
\newpage
Las secuencias de oligonucleótidos usadas fueron
(escritas de 5'-3'):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cADN de pétalo "Snapred Race
A-cebado" tenía la cola poli(G) y un
fragmento de cADN de 5' amplificado con los cebadores "Snapred
Race C" y "PoliC Race" usando el método de Frohman et
al. (1988). La ADN polimerasa de Pfu (0,15 unidades)
(Stratagene) fue combinada con 2,5 unidades de ADN polimerasa
AmpliTaq® (Perkin Elmer) para aumentar la fidelidad de la reacción
PCR.
El fragmento de ADN de 1,71 kb resultante
(sdF3'H) fue clonado directamente en el vector pBluescript®
EcoRV-linealizado (Stratagene) que se le había
puesto la cola T usando el protocolo de Marchuk et al.
(1990). Este plásmido fue llamado pCGP246.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron explotados sitios de restricción
convenientes dentro de la secuencia de cADN de sdF3'H de pCGP246
para generar una serie de subclones sobrelapantes cortos en el
vector del plásmido pUC19. La secuencia de cada uno de estos
subclones fue compilada para proporcionar la secuencia de cADN de
RACE de sdF3'H entero. La secuencia de cADN de sdF3'H fue acoplada
con la del clon de Am3Ga para proporcionar la secuencia entera de un
cADN de F3'H de boca de dragón (SEQ ID NO:5). Esto contiene un
marco de lectura abierto de 1711 bases que codifica un polipéptido
supuesto de 512 aminoácidos (SEQ ID NO:6).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de sdF3'H de boca de dragón fueron comparadas
con: las del clon de cADN OGR-38 de petunia (SEQ ID
NO:1 y SEQ ID NO:2); los clones de cADN de F3'5'H Hf1 y Hf2 de
petunia; y otras secuencias de citocromo P450 de petunia aisladas
previamente (patente de EE.UU. Nº. 5.349.125). La secuencia de
sdF3'H era la más similar a la del clon de cADN de F3'H de petunia
(OGR-38) que representaba el locus Hf1 de
P. hybrida, que tiene una semejanza del 69% a nivel del ácido
nucleico, más de 1573 nucleótidos, y una semejanza del 72,2% a
nivel del aminoácido, más de 507 aminoácidos.
El clon de Hf1 mostró una semejanza del 57,3%,
unos 1563 nucleótidos y una semejanza del 49,3%, unos 491
aminoácidos, respecto al clon de sdF3'H de boca de dragón, mientras
que el clon de Hf2 mostró una semejanza del 57,7%, unos 1488
nucleótidos, y una semejanza del 50,8%, unos 508 aminoácidos,
respecto al clon de sdF3'H de boca de dragón.
La secuencia de sdF3'H de boca de dragón
contiene dos codones ATG "en marco" que podrían actuar para
iniciar la translación. La iniciación desde el principio de estos
codones (posición 91 de SEQ ID NO:5) da una proteína con 10
aminoácidos adicionales N-terminal y estaría
favorecida de acuerdo con el modelo de exploración para la
translación (Kozak, 1989).
Una alineación de las secuencias de petunia,
clavel, boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia,
todas las cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios
resúmenes de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria des-
criptiva.
criptiva.
\newpage
El plásmido pCGP250 (Figura 13) fue creado
clonando el inserto de cADN de RACE de sdF3'H entero (de la posición
1 a 1711 (SEQ ID NO:5)) a partir de pCGP246 en la orientación
"sentido" detrás del promotor Mac (Comai et al., 1990)
de pCGP293 (Brugliera et al., 1994). El plásmido pCGP246 fue
digerido con EcoRI para liberar el inserto de cADN. El fragmento de
cADN fue terminado en romo reparando las proyecciones con el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (Sambrook et al.,
1989) y fue purificado, después de la electroforesis del gel de
agarosa, usando un kit Bresaclean (Bresatec). El fragmento de cADN
romo entonces fue ligado en el vector binario pCGP293, que había
sido linealizado con XbaI y romo-terminado usando el
fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. La unión fue llevada a
cabo usando el kit de unión Amersham. La inserción correcta del
inserto en pCGP250 fue establecida por el análi-
sis de la enzima de restricción de BamHI y PstI de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la gentamicina.
sis de la enzima de restricción de BamHI y PstI de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la gentamicina.
El plásmido pCGP231 (Figura 14) fue creado
clonando inserto de cADN de RACE de pCGP246, corriente abajo del
primer codon ATG "en marco" (desde la posición 104 a 1711 (SEQ
ID NO:5), en la orientación "sentido" detrás del promotor Mac
(Comai et al., 1990) de pCGP293 (Brugliera et al.,
1994). El plásmido pCGP246 fue digerido con SspI (que reconoce un
sitio entre los codones ATG candidatos) y SmaI (con un sitio en la
secuencia del poli-ligador del vector) para liberar
un fragmento de cADN romo-terminado que incluye la
región de codificación entera corriente abajo desde el supuesto
segundo codon de iniciación. El fragmento de cADN entonces fue
ligado en el vector binario pCGP293, que había sido linealizado con
XhaI y acabado en romo usando el fragmento Klenow de la ADN
polimerasa I. La unión fue llevada a cabo usando el kit de unión de
Amersham. La inserción correcta del inserto en pCGP231 fue
establecida por el análisis de la enzima de restricción de BamHI y
PstI de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la
gentamicina.
Para determinar rápidamente si las secuencias de
pCGP246 en pCGP231 y pCGP250 codificaban las flavonoide
3'-hidroxiladas activas en plantas, fue emprendido
un estudio de expresión transitorio. Los pétalos del mutante P.
hybrida línea Skr4 X Sw63 fueron bombardeados con partículas de
oro (1 \mum de diámetro) revestidas del ADN del plásmido pCGP231
o pCGP250, usando el método descrito en el Ejemplo 8.
Después de 6-12 horas bajo la
luz en un cuarto de crecimiento de plantas controlado a 22ºC, fueron
observados puntos de antocianina rojas sobre la superficie del
tejido del pétalo bombardeado con partículas revestidas con
pCGP231. No fue observado ningún punto coloreado en los pétalos
bombardeados con pCGP250 o pétalos control bombardeados con
partículas de oro solas. Estos resultados indicaron que la región de
codificación de pCGP246 (comenzando en el segundo ATG, posición 121
de SEQ ID NO:5), en el control del promotor Mac, era funcional en
el tejido de pétalo.
Los vectores binarios pCGP250 y pCGP231 fueron
introducidos en células AGL0 de la cepa de A. tumefaciens,
como se describe en el Ejemplo 9. Las células de pCGP250/AGL0 y
pCGP231/AGL0 fueron usadas para transformar plantas de petunia Skr4
x Sw63 (también descritas en el Ejemplo 9), para analizar la
expresión estable y la actividad de la enzima codificada por el gen
correspondiente al clon de cADN de sdF3'H de boca de dragón.
Tres de las nueve plantas transgénicas
transformadas con pCGP250 produjeron flores con un color de pétalo
ligeramente modificado (RHSCC Nº. 73A), comparado con el control
Skr4 x Sw63 (RHSCC Nº. 75C). De las 11 plantas transgénicas
transformadas con pCGP231, una planta produjo flores con un color de
pétalo modificado (RHSCC Nº. 73B). Las anteras y el polen de las
flores transgénicas eran también blancos, como en el control. Los
códigos son tomados de la carta de colores de la sociedad real
hortícola (RHSCC). Ellos proporcionan un medio alternativo para
describir los fenotipos de color observados. Los números designados,
sin embargo, deberían ser tomados sólo como una guía a los colores
percibidos y no deberían ser considerados como una limitación de
los colores posibles que pueden ser obtenidos.
Fueron pasados extractos florales hidrolizados
por ácido (véase el Ejemplo 11) en un sistema de disolvente
Forestal (HOAc:agua:HCl; 30: 10: 3) (Markham, 1982). La introducción
del clon de cADN de sdF3'H en Skr4 x Sw63 condujo a la producción
de mayores niveles de la flavonoide 3'-hidroxilada,
peonidina, en los pétalos. La peonidina es el derivado metilado de
cianidina (Figuras 1a y 1b).
Para aislar un clon de cADN que representa la
flavonoide 3'-hidroxilasa de Arabidopsis
thatiana, fueron generados fragmentos PCR usando cebadores de
las regiones conservadas de los citocromo P450. Un producto PCR
(p58092. 13) fue encontrado que tenía una alta semejanza de
secuencia con los clones de cADN OGR-38 de petunia
y F3'H de boca de dragón. El fragmento de PCR entonces fue usado,
junto con el inserto de cADN de Ht1 (OGR-38) a
partir de pCGP1805, para rastrear una genoteca de cADN de A.
thaliana.
Fueron diseñados oligonucleótidos degenerados
para la amplificación de ADN por PCR a partir de la secuencia de
aminoácidos consenso de secuencias de citocromo P450 parciales de
Petunia hybrida situadas cerca del dominio de unión de haem.
La degeneración del cebador fue establecida por la inclusión de
desoxinosina (designado como I más abajo) en la tercera base de
cada codon (pares de bases de desoxinosina con una eficacia similar
respecto a A, T, G y C), y la inclusión de bases alternas en las que
las secuencias consenso no eran específicas. Así, fueron diseñados
el cebador direccional amino-terminal "Pet
Haem" (dominio de unión de haem de Petunia), que contiene el
codon del residuo de cisteína crucial para la unión de haem, y el
cebador corriente arriba "WAIGRDP" (véase también el Ejemplo
15).
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico fue aislado a partir de A.
thaliana ecotipo Colombia, usando el método descrito por
Dellaporta et al. (1987). Las reacciones en cadena de la
polimerasa para la amplificación de homólogos de citocromo P450
típicamente contenían 100-200 ng de ADN genómico de
Colombia, Tris HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
gelatina al 0,01 (p/v), 0,2 mM cada dNTP, 312 ng de "WAIGRDP" y
484 ng de "Pet Haem" y 1,25 unidades de Taq polimerasa
(Cetus). Las mezclas de reacción (50 \muL) fueron cicladas 40
veces entre 95ºC durante 50 segundos, 45ºC durante 50 segundos y
72ºC durante 45 segundos.
El tamaño esperado de los productos de
amplificación de la PCR específicos, usando los cebadores
"WAIGRDP" y "Pet Haem" en una plantilla típica del gen de
P450, sin un intrón, es de aproximadamente 150 pares de bases. Los
fragmentos de PCR de aproximadamente 140 a 155 pares de bases fueron
aislados y purificados usando el kit de Mermaid® (BlO 101). Los
fragmentos de PCR fueron amplificados de nuevo para obtener bastante
producto para la clonación y luego fueron reparados por el extremo
usando la ADN polimerasa de Pfu y finalmente fueron clonados en
pCR-Script® Direct SK(+) (Stratagene). El ADN ligado
entonces fue usado para transformar células DH5\alpha competentes
(Inoue et al., 1990).
Fue preparado el ADN del plásmido de 15
transformantes (Del Sal et al., 1989). Los datos de
secuenciación generados a partir de estos fragmentos de PCR
indicaron que 11 de los 15 representaban a clones únicos. Un grupo
distinto de aminoácidos consenso de citocromo P450 también fue
encontrado en la secuencia traducida codificada dentro de los
insertos de PCR de A. thaliana. Las secuencias de los
fragmentos de PCR también fueron comparadas con las del clon de
cADN de F3'H de OGR-38 de petunia y el clon de cADN
de F3'H de boca de dragón. El fragmento de PCR, p58092. 13, era lo
más similar a las secuencias de F3'H tanto de petunia como de boca
de dragón.
Para aislar un clon de cADN del producto de la
PCR p58092.13, una genoteca de cADN de A. thaliana ecotipo
Colombia (Newman et al., 1994; D'Alessio et al., 1992)
fue rastreada con un fragmento ^{32}P-marcado de
p58092.13 junto con un fragmento ^{32}P-marcado
del inserto de cADN de Hfl de petunia (OGR-38),
contenido en pCGP1805.
Un total de 600.000 pfu fueron puestos en placa
a una densidad de 50.000 pfus por placa de 15 cm de diámetro, como
se describe en D'Alessio et al. (1992). Después de hacer
crecer al bacteriófago a 37ºC en placas fue almacenado a 4ºC de la
noche a la mañana, fueron tomadas suspensiones duplicadas en filtros
de Colony/Plaque Screen® (DuPont) y fueron tratadas como se
recomienda por el fabricante.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron lavadas en solución prelavadora
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCI 1 M, EDTA 1 mM,
sarcosina al 0,1% (p/v)) a 65ºC durante 30 minutos; fueron depuradas
en hidróxido de sodio 0,4 M a 65ºC durante 30 minutos; entonces
fueron lavadas en una solución de Tris-HCl 0,2 M,
pH 8,0, 0,1 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 65ºC durante 30 minutos y
finalmente fueron aclaradas en 2 x SSC, SDS al
1,0% (p/v).
1,0% (p/v).
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en formamida al 50% (v/v), NaCl 1 M,
sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 1% (p/v) a 42ºC durante al
menos 1 hora. El fragmento ^{32}P-marcado de
p58092.13 (2 x 10^{6} cpm/mL) entonces fue añadido a la solución
de hibridación y la hibridación fue seguida a 42ºC durante 16 horas
más. Los filtros entonces fueron lavados en 2 x SSC, SDS al 1% (p/v)
a 42ºC durante 2 x 1 hora y fueron expuestos a una película XAR de
Kodak con una pantalla de intensificación a -70ºC durante 16
horas.
Once placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB y fueron
rastreadas de nuevo como se detalla anteriormente, para aislar las
placas purificadas. Estos filtros también fueron sondados con el
fragmento ^{32}P-marcado del inserto de cADN de
Hf1 de petunia (OGR-38), contenido en pCGP1805, en
condiciones de estringencia baja. Las condiciones de estringencia
baja incluyeron la prehibridación y la hibridación a 42ºC en
formamida al 20% (v/v), NaCI 1 M, sulfato de dextrano al 10% (p/v),
SDS al 1% (p/v) y lavando en 6xSSC, SDS al 1% (p/v) a 65ºC
durante
1 hora.
1 hora.
Las sondas de OGR-38 y p58092.13
se hibridaron con placas idénticas. Las 11 placas puras fueron
escogidas en PSB y los vectores del plásmido pZL1 que contenían los
clones de cADN fueron rescatados usando la cepa bacteriana DH10B
(Zip). El ADN del plásmido fue preparado (Del Sal et al.,
1989) y los insertos de cADN fueron liberados bajo la digestión con
BamHI y EcoRI. 11 plásmidos contenían los insertos de cADN de entre
800 bp y 1 kb. Los datos de secuencia generados a partir de la
región 5' de los insertos de cADN sugirieron que nueve de estos
clones eran idénticos. Los datos de secuencia fueron generados a
partir de los extremos 5' de los nueve insertos de cADN y el
extremo 3' de sólo un inserto de cADN. Los datos de secuencia
generados a partir de todos los clones fueron compilados para
producir el nucleótido y la secuencia traducida mostrada como SEQ
ID NO:7 y SEQ ID NO:8.
Las secuencias de F3'H supuestas de A.
thaliana fueron comparadas con las secuencias del clon de cADN
de F3fH de OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID
NO:2) y era un 64,7% similar al clon de cADN de F3'H de petunia,
más de 745 nucleótidosy un 63,7% similar, más de 248
aminoácidos.
Una alineación de las secuencias de petunia,
clavel, boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia,
todas las cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios
resúmenes de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, puede ser
encontrado en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de la
memoria descriptiva.
Para aislar un clon genómico del gen de F3'H de
A. thaliana, fue rastreada una a genoteca de ADN genómico
del ecotipo Landsberg erecta de A. thaliana con fragmentos de
p60606.04 ^{32}P-marcados. La genoteca fue creada
clonando el ADN genómico digerido por Mbol parcial entre los brazos
EMBL4 de bacteriófago lambda digerido por BamHI. La genoteca
primaria, que contenía a 30.000 clones, fue amplificada una vez
antes del rastreo.
El clon de p60606.04, que contenía un fragmento
de 1 kb de cADN de F3'Hde A. thaliana, fue digerido con
BamHI/EcoRI para ejercitar el inserto que fue purificado usando
GeneClean (Bio 101). La sonda fue ^{32}P-marcada
usando el procedimiento de translación de mellas (Sambrook et
al., 1989). Aproximadamente 20.000 placas fueron sondadas a
alta estringencia (formamida al 50% a 37ºC) y los filtros fueron
lavados en: 2x SSPE; 2x SSPE, SDS al 0,1% (p/v); 0,1x SSPE, todo a
65ºC. El rerastreo fue llevado a cabo en las mismas condiciones.
El ADN fue purificado a partir de tres placas
positivas (\lambdaTT7-1,
\lambdaA1T7-5 y \lambdaTT7-6) y
fue representado por la digestión con EcoRI y EcoRI/SalI. Los tres
clones tenían un fragmento de EcoRI en común.
\lambdaTT7-1 y \lambdaTT7-5
tenían sobrelapamientos, pero no modelos de restricción idénticos.
Una transferencia Southern de estas digestiones fue sondada como
antes y, para \lambda1T7-1 y
\lambda157-5, un fragmento de EcoRI/SalI de 6,5
kb común hibridado. Un fragmento más pequeño de EcoRI/SalI en
\lambdaTT7-6 también se hibridó y estaba por lo
visto en el límite del inserto.
Los fragmentos EcoRI/SalI de
ITT7-5 fueron clonados en pBlueScript SK+ y un clon
que contenía el fragmento de 6,5 kb, denominado
E-5, fue identificado por hibridación (como antes) y
el tamaño de inserto. Un mapa de restricción fue compilado para el
fragmento usando EcoRI, Sall, KpnI, HindIll y BglII en varias
combinaciones, y por hibridación a las transferencias Southern de
estas digestiones con el inserto de BamHI/EcoRI del clonde cADN
deF3'H de
A. thaliana.
A. thaliana.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Un fragmento de BamHI de 6,4 kb de
pTt7-2, que contiene la mayor parte del fragmento
genómico Tt7 fue purificado, autoligado, sonicado, reparado en el
extremo, fraccionado por tamaños (de 450 bp a 800 bp) y clonado en
SmaI-cut pUC19 usando técnicas estándar (Sambrook
et al., 1989). Fueron aislados clones recombinantes, y el ADN
del plásmido fue purificado y secuenciado usando los cebadores de
secuenciación inversa de M13-21 o M13. La secuencia
de clones solapantes fue combinada en un fragmento contiguo. La
secuencia de los extremos del fragmento genómico de Tt7 también fue
obtenida secuenciando con los cebadores de -21 y REV. Todas las
secuencias fueron combinadas juntas para obtener la secuencia
completa del fragmento de 6,5 kb de EcoRI/SalI de
E-5 (SEQ ID NO:9).
Las secuencias sobre la región de codificación
del clon genómico de Tt7 de arabidopsis (SEQ ID NO:10, 11, 12 y 13)
fueron comparadas con las del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y 2). La región de
codificación de Tt7 de arabidopsis mostró una semejanza del 65,4%,
unos 1066 nucleótidos, y una semejanza del 67,1%, unos 511
aminoácidos, a la del clon de cADN de F3'H de OGR-38
de petunia.
El fragmento de EcoRI/SalI de
E-5 fue clonado en EcoRI/SalI-cut
pBI101 (Jefferson et al., 1987). Dos clones separados pero
idénticos fueron identificados:
PBI-Tt7-2 (Figura 15) y pBITt74.
Ambos clones fueron usados para la transformación de A.
tumefaciens.
Los plásmidos
pBI-Tt7-2,
pBI-Tt7-4 y pBIl0l fueron
transformados en la cepa de Agrobacterium GV3101 pMP90 por
electroporación. Los transformantes fueron seleccionados en medio
que contenía 50 \mug/mL de kanamicina (y 50 \mug/mL de
gentamicina para seleccionar el pMP90 residente).
El ADN del plásmido, a partir de cuatro colonias
de transformante para cada clon, fue aislado y digerido con
EcoRI/SAIL, fue sometido a electroforesis, Transferencia Southern, y
fue sondado con el inserto de cADN de Tt7. Para
pBI-Tt7-2 y
pBI-Tt74, fue identificada la banda del inserto
esperada.
Una transformante para cada plásmido (es decir:
un control [pBI101 C4], uno cada uno de los dos clones de Tt7
[pBI-Tt7-2-3 y pBI
Tt744]) fue usado al vacío para filtrar la línea del mutante NW88 de
tt7 de A. thaliana (4 tiestos de 10 plantas cada uno para
cada constructo), usando un método esencialmente como se describe
por Bechtold et al. (1993).
La semilla de cada tiesto fue cosechada. Cien mg
de semilla (aproximadamente 5.000) fueron puestos en placa sobre el
medio nutritivo (descrito por Haughn y Somerville, 1986) que
contiene 50 \mug/mL de kanamicina. Los transformantes resistentes
de kanamicina eran visibles después de 7 a 10 días. En el caso de
pBI-Tt7-2-3 y
pBI-Tt744, un total de 11 transformantes fueron
aislados de 5 lotes de semilla diferentes (es decir: los tiestos) y
todos los transformantes resistentes a la kanamicina fueron
visiblemente Tt7 en el fenotipo y exhibieron los pigmentos de
antocianina característicos rojo/púrpura en los márgenes de los
cotiledones y en el hipocótilo. Un solo transformante resistente a
la kanamicina fue aislado a partir de uno sólo de los cuatro tiestos
de transformantes control y que no exhibió un fenotipo Tt2 "tipo
silvestre".
Estos transformantes fueron plantados y
desarrollados e individualmente cosechados para la semilla. En cada
caso, para los transformantes
pBI-Tt7-2-3 y
pBI-Tt74A, las semillas eran visiblemente más
marrones que la semilla palo marrón de las plantas del mutante tt7.
La semilla del transformante control era indistinguible del mutante
parenteral tt7. Esta semilla fue puesta en placa en medio nutritivo
y medio nutritivo con kanamicina añadida, y fue puntuada según el
fenotipo Tt7 (pigmentos de antocianina rojo/púrpura en los márgenes
de los cotiledones y en el hipocótilo) y la resistencia a la
kanamicina. La progenie de al menos un transformante para cada lote
de semilla fue examinada, ya que estos fueron acontecimientos de
transformación claramente independientes.
Sin excepción, los plantones resistentes a la
kanamicina exhibieron el fenotipo Tt7 mientras que los individuos
sensibles a la kanamicina fueron tt7. En algunos casos, la
resistencia a la kanamicina fue débil y variable entre una familia
de semillas y fue difícil determinar inequívocamente si los
individuos eran resistentes a la kanamicina o sensibles a la
kanamicina.
Para aislar un clon de cADN de F3'H de rosa, fue
rastreada una genoteca de cADN de pétalo de Rosa hybrida cv.
Kardinal con fragmentos ^{32}P-marcados del clon
de cADN de Ht1 de petunia (OGR-38), contenido en
pCGP1805, y el clon de cADN de F3'H de boca de dragón (sdF3'H),
contenido en pCGP246.
\global\parskip1.000000\baselineskip
El ARN total fue preparado a partir de brotes de
Rosa hybrida cv. Kardinal en etapa 2. En esta etapa, los
brotes bien cerrados tenían 1,5 cm de alto y aproximadamente 0,9 cm
de ancho con pétalos rosa palo.
El tejido congelado (1-3 g) fue
molido en nitrógeno líquido con un mortero y a mano, fue colocado en
25 mL de Tampón A preenfriado (ácido bórico 0,2 M, EDTA 10 mM (sal
de sodio) (pH 7,6)] y fue homogeneizado brevemente. El extracto fue
mezclado en un agitador rotatorio hasta que alcanzó la temperatura
ambiente y fue añadido un volumen igual de fenol/cloroformo (1:1
v/v), equilibrado con Tampón A. Después de mezclar durante minutos
10 más, la preparación de ARN fue centrifugada a 10.000 g x durante
10 minutos a 20ºC. La fase acuosa superior fue conservada y la
interfase de fenol fue extraída de nuevo como antes. Las fases
acuosas fueron reunidas y ajustadas con acetato de sodio 0,1 M (pH
6,0), fueron añadidos 2,5 volúmenes de etanol al 95% y la mezcla
fue almacenada a -20ºC de la noche a la mañana.
La preparación fue centrifugada a 10.000 g x
durante 10 minutos a 4ºC, el pelete fue disuelto con cuidado en 20
mL de Tampón B [ácido bórico 25 mM, EDTA 1,25 mM (sal de sodio),
NaCl 0,1 M (pH 7,6)] y fueron añadidos 0,4 volúmenes de
2-butoxietanol (2BE). Esta solución fue incubada en
hielo durante 30 minutos. Entonces fue centrifugado a 10.000 g x
durante 10 minutos a 0ºC y el sobrenadante fue recogido con cuidado.
Después de la adición de 1,0 volumen de 2BE y una incubación en
hielo durante minutos 30 más, el sobrenadante fue centrifugado de
nuevo a 10.000 g x durante 10 minutos a 0ºC. El pelete resultante
fue lavado con cuidado con Tampón A:2BE (1:1 v/v), luego con etanol
al 70% (v/v), acetato de potasio 0,1 M y finalmente con etanol al
95%. El pelete fue secado con aire y se disolvió en 1 mL de
pirocarbonato de dietilo (DEPC) - tratado con agua. Esto fue
ajustado con cloruro de litio 3 M, fue dejado en hielo durante 60
minutos y fue centrifugado a 10.000 g x durante 10 minutos a 0ºC.
El pelete fue lavado dos veces con LiCI 3 M y luego con etanol al
70%, acetato de potasio 0,1 M.
El pelete del ARN resultante fue disuelto en 400
\muL de agua tratada con DEPC y fue extraído con un volumen igual
de fenol/cloroformo. La mezcla de ARN entonces fue centrifugada a
10.000 g x durante 5 minutos a 20ºC, la fase acuosa fue recogida y
fueron añadidos acetato de sodio 0,1 M, y 2,5 volúmenes más de
etanol al 95 %. Después de una incubación de 30 minutos en hielo,
la mezcla fue centrifugada a 13.000 revoluciones por minuto (5.000
x g) durante 20 minutos a 20ºC y el pelete de ARN fue resuspendido
con cuidado en 400 \muL de agua tratada con DEPC.
El ARN Poli(A)+ fue seleccionado a partir
del ARN total por Oligotex dT-30 (Takara, Japón)
siguiendo el protocolo del fabricante. El cADN fue sintetizado de
acuerdo con el método de Brugliera et al. (1994) y fue usado
para construir una genoteca de cADN de pétalo no direccional en el
sitio de EcoRI de \lambdaZAPII (Stratagene). El número total de
recombinantes obtenidos fue 3,5 x 10^{5}.
Después de la transfección de células
XL1-Blue, la mezcla de cADN empaquetado fue puesto
en placa a 50.000 pfu por placa de 15 cm de diámetro. Las placas
fueron incubadas a 37ºC durante 8 horas, y el bacteriófago fue
eluido en NaCI 100 mM, MgSO_{4} 8 mM, Tris-HCl 50
mM, pH 8,0, gelatina al 0,01% (p/v) (tampón de almacenamiento de
bacteriófagos (PSB)) (Sambrook et al., 1989). El cloroformo
fue añadido y el bacteriófago fue almacenado a 4ºC como una
genoteca amplificada.
Fueron puestos en placa 200.000 pfus de la
genoteca amplificada en placas de NZY (Sambrook et al., 1989)
a una densidad de 10.000 pfu por placa de 15 cm después de la
transfección de células XL1-Blue MRF', y fueron
incubados a 37ºC durante 8 horas. Después de una incubación a 4ºC de
la noche a la mañana, las suspensiones duplicadas (marcados como
grupo A y grupo B) fueron tomadas en filtros Colony/Plaque Screen®
(DuPont) y fueron tratados como se recomienda por el
fabricante.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron lavadas en solución prelavadora
(Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCI 1 M, EDTA 1 mM,
sarcosina al 0,1% (p/v)) a 65ºC durante 30 minutos; fueron depuradas
en hidróxido de sodio 0,4 M a 65ºC durante 30 minutos; entonces
fueron lavadas en una solución de Tris-HCl 0,2 M,
pH 8,0, 0,1 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 65ºC durante 30 minutos y
finalmente fueron aclaradas a 2 x SSC, SDS al
1,0% (p/v).
1,0% (p/v).
Los filtros del grupo A de las suspensiones
duplicadas de la genoteca de cADN de Kardinal fueron rastreados con
los fragmentos ^{32}P-marcados de un fragmento de
NcoI a partir de pCGP1805 que contenía el cADN del clon de Hf1
(OGR-38) de petunia, mientras que los filtros del
grupo B fueron rastreados con los fragmentos
^{32}P-marcados del fragmento de EcoRI/SspI a
partir de pCGP246 que contenía el clon de F3'H de boca de
dragón.
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en formamida al 10% (v/v), NaCl 1 M,
sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 1% (p/v) a 42ºC durante al
menos 1 hora. El fragmento ^{32}P-marcado
(2x10^{6} cpm/mL) entonces fue añadido a la solución de
hibridación y la hibridación fue seguida a 42ºC durante 16 horas
más. Los filtros entonces fueron lavados a 42ºC en 2 x SSC, SDS al
1% (p/v) durante 2 horas seguido de 1 x SSC, SDS al 1% (p/v)
durante 1 hora y finalmente en 0,2 x SSC/SDS al 1%
(p/v)durante 2 horas. Los filtros fueron expuestos a una
película XAR de Kodak con una pantalla de intensificación a -70ºC
durante 16 horas.
Cuatro placas de
fuerte-hibridación (R1, R2, R3, R4) fueron escogidas
en PSB y rastreadas de nuevo para aislar placas puras. Los
plásmidos contenidos en el vector de bacteriófago \lambdaZAP
fueron rescatados y digeridos con EcoRI para liberar los insertos
de cADN. El clon R1 contenía un inserto de 1,0 kb mientras que los
clones R2, R3 y R4 contenían insertos de aproximadamente 1,3 kb
cada uno. Los datos de secuencia fueron generados a partir de los
extremos 3' y 5' del inserto de cADN de R4.
La secuencia de F3'H supuesta de R4 de rosa fue
comparada con la de la secuencia de F3'H de OGR-38
de petunia. A nivel del nucleótido, el clon de cADN de R4 mostró
una semejanza del 63,2% y 62,1%, unos 389 nucleótidos en el extremo
5' y 330 nucleótidos en el extremo 3', respectivamente. A nivel de
aminoácidos, el clon de R4 mostró una semejanza del 65,4% y 73,9%,
unos 130 aminoácidos en el extremo 5' y 69 aminoácidos en el extremo
3', respectivamente. Basado en la alta semejanza de secuencia del
clon de cADN de R4 de Rosa respecto a la del clon de cADN de F3'H
de petunia (OGR-38), fue aislado un clon de cADN
correspondiente de "cadena entera", como se describe en el
Ejemplo 25, más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar un clon de cADN de F3'H de "cadena
entera" de rosa, fue rastreada una genoteca de cADN de pétalo de
Rosa hybrida cv Kardinal descrita en el Ejemplo 24 con los
fragmentos ^{32}P-marcados del clon de cADN de R4
de rosa, descrito antes.
Fueron puestos en placa en total de 1,9 x
10^{6} pfus de la genoteca amplificada en placas de NZY a una
densidad de 100.000 pfus por placa de 15 cm de diámetro después de
la transfección de células XL1-Blue MRF', y fueron
incubados a 37ºC durante 8 horas. Después de la incubación a 4ºC de
la noche a la mañana, fueron tomadas suspensiones duplicadas en
filtros de Colony/Plaque Screen® (DuPont) y fueron tratados como se
recomienda por el fabricante.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron tratadas como se describe en el Ejemplo
24.
Las suspensiones duplicadas de la genoteca de
cADN de Kardinal fueron rastreadas con fragmentos
^{32}P-marcados de un fragmento de EcoRI a partir
del clon de cADN de R4 de rosa.
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en formamida al 50% (v/v), NaCl 1 M,
sulfato de dextrano al 10% (p/v), SDS al 1% (p/v) a 42ºC durante al
menos 1 hora. El fragmento ^{32}P-marcado del
clon de cADN de R4 de rosa (1x10^{6} cpm/ml) entonces fue añadido
a la solución de hibridación y la hibridación fue seguida a 42ºC
durante 16 horas más. Los filtros entonces fueron lavados a 2 x SSC,
SDS al 1% (p/v) a 42ºC durante 2 x 1 hora y fueron expuestos a una
película XAR de Kodak con una pantalla de intensificación a -70ºC
durante 16 horas.
Setenta y tres placas de
fuerte-hibridación (1-73) fueron
escogidas en 1 mL de PSB y fueron almacenadas a 4ºC de la noche a
la mañana. 100\beta\muL de cada una fueron puestos entonces en
alícuotas en una bandeja de microtítulo como una serie
ordenada.
Fueron añadidas células XL1-Blue
MRF' a 10 mL de agar superior de NZY fundido, fueron vertidas en
placas de NZY (15 cm de diámetro) y se permitió que se
sedimentaran. Un dispositivo de placas de replicas fue usado para
transferir los 73 aislados de bacteriófagos en una serie ordenada en
la placa NZY previamente inoculada con células
XL1-Blue MRF'. Después de la incubación a 37ºC
durante 6 horas seguido de 4ºC de la noche a la mañana, las
suspensiones por triplicado (series 1, 2 y 3) fueron tomadas en
filtros de Colony/Plaque Screen® (DuPont) y fueron tratadas como se
recomienda por el fabricante.
Antes de la hibridación, las suspensiones
duplicadas de placa fueron tratadas como se describe en el Ejemplo
24.
Las 3 series fueron rastreadas con fragmentos
^{32}P-marcados de a) un fragmento de EcoRI/Sall
que cubre el extremo 5' del clon de cADN de R4 de rosa, b) un
fragmento de EcoRI/Clal que cubre el extremo 5' del clon de cADN de
R4 de rosa o c) un fragmento de EcoRI del clon de cADN de R4 de rosa
entero usando las condiciones de hibridación y lavadoras descritas
anteriormente, excepto que el lavado final estaba en 0,1 x SSC, SDS
al 0,1% (p/v) a 65ºC durante 30 minutos. Los filtros fueron
expuestos a una película XAR de Kodak con una pantalla de
intensificación a -70ºC durante 16 horas.
Las 73 placas se hibridaron con el clon de cADN
de R4 completo (fragmento de EcoRI) mientras que un total de sólo
17 se hibridaron con el extremo 5' del clon de cADN de R4
(fragmentos de EcoRI/SalI o EcoRI/ClaI). Los 17 aislados de
bacteriófagos fueron rastreados de nuevo como se describe
anteriormente para aislar placas purificadas. Fueron obtenidas
placas puras de 9 de los 17 (2, 4, 26, 27, 34, 38, 43, 44, 56). Los
plásmidos contenidos en el vector del bacteriófago \lambdaZAP
fueron rescatados y fueron determinados los tamaños de los insertos
de cADN usando una digestión de EcoRI. Los insertos de cADN estaban
en el intervalo de 0,9 kb a 1,9 kb. De los nueve, sólo el Nº. 34
(denominado pCGP2158) y Nº. 38 (denominado pCGP2159) contenía los
insertos de cADN de aproximadamente 1,9 kb. Los datos de secuencia
fueron generados a partir de los extremos 3' y 5' de los insertos
de cADN y mostraron que los clones Nº. 34 y Nº. 38 representaban el
mismo gen.
La secuencia completa del clon de cADN de rosa
(Nº. 34) contenido en el plásmido pCGP2158 fue determinada por la
compilación de secuencia a partir de diferentes subclones de pUC18
obtenidos usando procedimientos estándar para la generación de
clones que se sobrelapan aleatoriamente (Sambrook et al.,
1989). La secuencia (SEQ ID NO:14) contenía un marco de lectura
abierto de 1696 bases que codifica un supuesto polipéptido de 520
aminoácidos (SEQ ID NO:15).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN de F3'H de rosa Nº. 34 (SEQ ID NO:14 y
SEQ ID NO:15) fueron comparadas con las del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2) y el
clon de sdF3'H de boca de dragón (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4). El
clon de cADN de F3'H de rosa Nº. 34 mostró una semejanza del 64,7%,
unos 1651 nucleótidos, y una semejanza del 72,7%, unos 509
aminoácidos, respecto a la del clon de cADN de
OGR-38 de petunia, y una semejanza del 67,2%, unos
1507 nucleótidos, y una semejanza de 68,9%, unos 502 aminoácidos,
respecto a la del clon de sdF3'H de boca de dragón.
Una alineación de las secuencias de petunia,
clavel, boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia,
todas las cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios
resúmenes de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
El plásmido pCGP2166 (Figura 16) fue construido
clonando el inserto de cADN a partir de pCGP2158 en una orientación
"sentido" detrás del promotor Mac (Comai et al., 1990)
de pCGP293 (Brugliera et al., 1994). El plásmido pCGP2158
fue digerido con EcoRI para liberar el inserto de cADN. Los extremos
5' sobresalientes fueron rellenados usando la ADN polimerasa
(fragmento Klenow) (Sambrook et al., 1989). El fragmento de
cADN fue aislado y ligado con los extremos de BamHI rellenos del
vector binario pCGP293. La inserción correcta del fragmento en
pCGP2166 fue establecida por el análisis de la enzima de restricción
de ADN aislado a partir de transformantes resistentes a la
gentamicina.
El vector binario pCGP2166 fue introducido en
células AGL0 de la cepa de A. tumefaciens, como se describe
en el Ejemplo 9. Las células pCGP2166/AGL0 fueron usadas entonces
para transformar plantas de petunia Skr4 x Sw63 (también descritas
en el Ejemplo 9), para analizar la expresión estable y la actividad
de la enzima codificada por el gen correspondiente al clon de cADN
de rosa Nº. 34.
La expresión del cADN de F3'H de rosa
introducido en el híbrido Skr4 x Sw63 tenía un efecto marcado sobre
el color de la flor. El tejido del estambre del control no
transgénico era blanco, mientras que el mismo tejido en la mayor
parte de las plantas transgénicas era rosa. Además, la expresión del
cADN de F3'H de rosa en el híbrido Skr4 x Sw63 le confirió un matiz
rosa oscuro (RHSCC Nº. 64C y 74C) a la corola, que normalmente es
lila palo (RHSCC Nº. 75C). Los códigos con colores son tomados a
partir de la carta de colores de la sociedad real hortícola
(RHSCC). Ellos proporcionan un medio alternativo para describir los
fenotipos en los color observados. Los números designados, sin
embargo, deberían ser tomados sólo como una guía a los colores
percibidos y no deberían ser considerados como una limitación de
los posibles colores que pueden ser obtenidos.
Fueron aplicados extractos florales hidrolizados
por ácido (véase el Ejemplo 11) en un sistema disolvente Forestal
(HOAc:agua:HCl; 30: 10: 3) (Markham, 1982). Los 3' flavonoides
hidroxilados, peonidina y quercetina, fueron detectados fácilmente
en las hojas de pétalo de las plantas transgénicas. Sólo kaempferol
y una pequeña cantidad de malvidina fueron detectados en el control
de Skr4 x Sw63 no transgénico.
La acumulación de la antocianidina
3'-hidroxilada, peonidina y el flavonol, quercetina,
en los pétalos de plantas transgénicas Skr4 x Sw63/pCGP2166 se
correlacionó con los colores rosa y rosa oscuro observados en los
pétalos de las mismas plantas.
El constructo binario pCGP2169 (Figura 17) fue
preparado clonando el inserto de cADN de pCGP2158 en una orientación
"sentido" entre el promotor CaMV35S (Franck et al.,
1980; Guilley et al., 1982) y el terminador ocs (de
Greve et al., 1982). El plásmido pCGP1634 contenía un
promotor CaMV35S, el gen indicador de
\beta-glucuronidasa (GUS) codificado por el
locus de E. coli uidA (Jefferson et al.,
1987) y la región del terminador ocs en un vector pUC19. El
plásmido pCGP2158 fue digerido con NcoI/XbaI para liberar el inserto
de cADN. El plásmido pCGP1634 también fue digerido con NcoI/XbaI
para liberar el vector de estructura que contiene al promotor
CaMV35S y el terminador ocs. Los fragmentos fueron aislados y
ligados juntos para producir pCGP2167. El plásmido pCGP2167 fue
digerido posteriormente con PvuII para liberar el casete de
expresión que contiene al promotor de CaMV35S, el clon de cADN de
F3'H de rosa y el terminador ocs. Este fragmento de casete
de expresión fue aislado y ligado con extremos de Smal del vector
binario pWTT2132 (DNA Plant Technology Corporation; Oakland,
California) para producir pCGP2169 (Figura 17).
El vector binario pCGP2169 fue introducido en
células AGL0 de la cepa de A. tumaciens, como se describe en
el Ejemplo 9. Las células pCGP2169/AGL0 son usadas para transformar
plantas de rosa, para reducir la cantidad de flavonoides
3'-hidroxilados.
Para aislar un clon de cADN de F3'H de
crisantemo, fue rastreada una genoteca de cADN de pétalo de
chrysantemum cv. Red Minstral con fragmentos
^{32}P-marcados del clon de cADN de Ht1 de petunia
(OGR-38), contenido en pCGP1805.
El ARN total fue preparado a partir de los
pétalos (etapas de 3 a 5) de chrysantemum cv. Red Minstral usando
el reactivo Trizol® (Life Technologies) (Chomczynski y Sacchi, 1987)
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN de
Poli(A)+ fue enriquecido a partir del ARN total, usando un
kit de aislamiento de mARN (Pharmacia) que se basa en la
cromatografía de columna hilada de afinidad de oligo-(dT).
Un kit de síntesis de cADN Superscript® (Life
Technologies) fue usado para construir un genoteca de cADN de
pétalo en ZipLox usando 5 \mug de ARN de Poli(A)+ aislado a
partir de las etapas 3 a 5 de Minstral Rojo como plantilla.
Fueron puestos en placa 30.000 pfus de la
genoteca en placas LB (Sambrook et al., 1989) a una densidad
de 3.000 pfus por placa de 15 cm después de la transfección de
Y1090r-, y fueron incubados a 37ºC durante 16 horas. Después de una
incubación a 4ºC durante una hora, fueron tomadas suspensiones
duplicadas en filtros Hybond N+® (Amersham) y fueron tratadas como
se recomienda por el fabricante.
Las suspensiones duplicadas de la genoteca de
cADN de pétalo de Rojo Minstral fueron rastreadas con fragmentos
^{32}P-marcados del inserto de 1,8 kb de
Asp718/BamHI a partir de pCGP1805.
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en EDTA 1 mM (pH 8,0), Na_{2}HPO_{4}
0,5 M (pH 7,2), SDS al 7% (p/v) (Church y Gilberto, 1984) a 65ºC
durante al menos 1 hora. Los fragmentos
^{32}P-marcados (1 x 10^{6} cpm/mL) entonces
fueron añadidos a la solución de hibridación y la hibridación fue
seguida a 65ºC durante 16 horas más. Los filtros entonces fueron
lavados en 2 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 65ºC durante 2 x 1 hora y
fueron expuestos a la película BioMax® de Kodak con una pantalla de
intensificación a -70ºC durante 48 horas.
Ocho placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB (Sambrook
et al., 1989). De estas, 2 (RM6i y RM6ii) fueron rastreadas
de nuevo para aislar placas purificadas, usando las condiciones de
hibridación como se describe para el rastreo inicial de la genoteca
de cADN. Los plásmidos contenidos en el vector de bacteriófago
\lambdaZipLox fueron rescatados de acuerdo con el protocolo del
fabricante y los datos de secuencia fueron generados a partir de
los extremos 3' y 5' de los insertos de cADN. Las secuencias
parciales de los insertos de cADN RM6i y RM6ii fueron comparadas
con la secuencia completa del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia. El clon de cADN de RM6i mostró
una semejanza de secuencia relativamente alta con la del clon de
cADN de OGR-38 de petunia, y después fue
caracterizado.
El inserto de cADN de RM6i contenido en pCHRM1
fue liberado bajo la digestión con EcoRI y tenía aproximadamente
1,68 kb. La secuencia completa del clon de cADN de RM6i (SEQ ID
NO:16) contenida en el plásmido pCHRM1 fue determinada por la
compilación de secuencia a partir de subclones del inserto de cADN
de RM6i.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del inserto de cADN de RM6i de crisantemo (SEQ ID NO:16 y
SEQ ID NO:17) fueron comparadas con las del clon de cADN de F3'H de
OGR38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2). La secuencia del
inserto de cADN de RM6i de crisantemo mostró una semejanza del
68,5%, unos 1532 nucleótidos, y una semejanza del 73,6%, unos 511
aminoácidos, respecto a la del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia.
Una alineación de secuencias de petunia, clavel,
boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia, todas las
cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios resúmenes
de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
El plásmido denominado pLN84 fue construido
clonando el inserto de cADN de RM6i a partir de pCHRM1 en la
orientación "antisentido" detrás del promotor completo CaMV35S
contenido en pART7 (Gleave 1992). El plásmido pCHRMl fue digerido
con NotI para liberar el inserto de cADN. El fragmento de cADN de
RM6i fue acabado romo usando la T4 ADN polimerasa (Sambrook et
al., 1989) y fue purificado, después de la electroforesis de gel
de agarosa y GELase (Epicentre Technologies). El fragmento
purificado fue ligado con extremos de SmaI del vector vehículo de
pART7 para producir pLN84. El plásmido pLN84 fue posteriormente
digerido con NotI para liberar el casete de expresión que contenía
CaMV35S: cADN RM6i: ocs. El casete de expresión fue aislado como un
fragmento solo y ligado con extremos de NotI del vector binario
pART27 (Gleave, 1992) para producir pLN85 (Figura 18). La inserción
correcta del fragmento fue establecida por el análisis de la enzima
de restricción de ADN aislado a partir de transformantes
resistentes a la estreptomicina de E. coli.
El vector binario pLN85 es introducido en
plantas de crisantemo vía la transformación mediada por
Agrobacterium, como se describe en Ledger et al.,
1991), para reducir la cantidad de flavonoides
3'-hidroxilados.
Para aislar un clon de cADN de F3'H de torenia,
fue usado el clon de cADN de F3'H unido a Ht1 de petunia
(OGR-38), contenido en pCGP1805, para rastrear una
genotecade cADN de pétalo de Torenia fournieri cv. Summer
Wave, en condiciones de estringencia baja.
Una genoteca de cADN de pétalo direccional fue
preparada a partir de flores de Summer Wave, esencialmente como se
describe en el Ejemplo 4.
Las suspensiones de un total de 200.000 de la
genoteca de cADN de pétalo de Summer Wave amplificado fueron
rastreadas con fragmentos marcados de DIG del inserto de cADN de 1,8
kb de OGR-38 de pCGP1805. Un kit de marcación DIG
de ADN y de detección de Boehringer-Mannheim fue
usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las hibridaciones fueron llevadas a cabo en
formamida al 30% (v/v), 5 x SSC, SDS al 1% (p/v) a 37ºC durante 16
horas. Los filtros entonces fueron lavados en 5 x SSC, SDS al 1%
(p/v) a 65ºC durante 1 hora.
Las señales fueron visualizadas siguiendo el
protocolo del kit de marcación DIG de ADN y de detección.
Doce placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB y
rastreadas de nuevo para aislar placas puras. Los plásmidos
contenidos en el vector de bacteriófago \lambdaZAPII fueron
rescatados y digeridos con EcoRI/XhoI para liberar los insertos de
cADN. La mayor parte de los doce clones contenían insertos de cADN
de aproximadamente 1,8 kb. Un clon, THT52, contenía la secuencia
más larga de la región no codificante de 5'. La secuencia completa
del clon de cADN de torenia (THT52), contenida en el plásmido
pTHT52, fue determinada por la compilación de secuencia a partir de
diferentes subclones de pUC18 obtenidos usando procedimientos
estándar para la generación de clones aleatoriamente sobrelapantes
(Sambrook et al., 1989). La secuencia (SEQ ID NO:18) contenía
un marco de lectura abierto de 1524 bases que codificaba un
supuesto polipéptido de 508 aminoácidos (SEQ ID NO:19).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN de THT52 de torenia (SEQ ID NO:18 y SEQ
ID NO:19) fueron comparadas con las del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2). El
clon de cADN de THT52 de torenia mostró una semejanza del 63,6%,
unos 1694 nucleótidos, y una semejanza del 67,4%, unos 515
aminoácidos, respecto a la del clon de cADN de
OGR-38 de petunia.
Una alineación de secuencias de petunia, clavel,
boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia, todas las
cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios resúmenes
de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
El plásmido pYTHT6 (Figura 19) fue construido
clonando el inserto de cADN de pTHT6 en una orientación
"sentido" detrás del promotor de
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa de levadura de pYE22m (Tanaka et al., 1988).
El plásmido pTHT6 contenía el clon de cADN de THT6. THT6 es idéntico
a THT52, pero su región no codificante de 5' es 75 bp más
corta.
El inserto de cADN de THT6 de 1,7 kb fue
liberado a partir del plásmido pTHT6 bajo la digestión con
EcoRI/XhI. El fragmento de cADN de THT6 fue aislado, purificado y
ligado con extremos de EcoRI/SAII de pYE22m para producir
pYTHT6.
La transformación de levadura, la preparación de
extractos de levadura y el ensayo de F3'H se describen en el
Ejemplo 6.
La actividad de F3'H fue detectada en los
extractos de G1315/pYTHT6, pero no en los extractos de levadura no
transgénica. A partir de esto fue concluido que el inserto de cADN
de THT6 contenido en pYTHT6, codificaba un F3'H.
Para aislar un clon de cADN de F3'H de
aguinaldo, fue usado el clon de cADN de F3'H unido a Ht1 de petunia
(OGR-38), contenido en pCGP1805, para rastrear una
genoteca de cADN de pétalo de aguinaldo azul claro, en condiciones
de estringencia baja.
La genoteca de cADN de pétalo a partir de
pétalos jóvenes de Pharbitis nil (aguinaldo azul claro) fue
obtenida del Doctor Iida (Instituto Nacional de Biología Básica,
Japón).
Fueron rastreadas suspensiones de un total de
200.000 de la genoteca de cADN de pétalo de aguinaldo azul claro
amplificado con fragmentos marcados con DIG del inserto de cADN de
OGR-38 de 1,8 kb de pCGP1805. Un kit de marcación
DIG de ADN y de detección de Boehringer-Mannheim fue
usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las hibridaciones fueron llevadas a cabo en
formamida al 30% (v/v), 5 x SSC, SDS al 1% (p/v) a 37ºC durante 16
horas. Los filtros entonces fueron lavados en 5 x SSC, SDS al 1%
(p/v) a 65ºC durante 1 hora. Las señales fueron visualizadas
siguiendo el protocolo del kit de marcación DIG de ADN y de
detección.
Veinte placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB y fueron
rastreadas de nuevo para aislar placas puras. Los plásmidos
contenidos en el vector de bacteriófago \lambdaZAPII fueron
rescatados y digeridos con EcoRI/Xhol para liberar los insertos de
cADN. Un clon (MHT85) contenía un inserto de 1,8 kb. La secuencia
completa del clon de cADN de aguinaldo azul claro (MHT85) (SEQ ID
NO:20), contenida en el plásmido pMHTS5, fue determinada por la
compilación de secuencia a partir de diferentes subclones de pUC18
obtenidos usando procedimientos estándar para la generación de
clones sobrelapantes aleatoriamente (Sambrook et al., 1989).
La secuencia de MHT85 parece tener 5 bases de "cadena
entera".
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN de MHT85 de aguinaldo azul claro (SEQ ID
NO:20 y SEQ ID NO:21) fueron comparadas con las del clon de cADN de
F3'H de OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ ID
NO:2). El clon de cADN de MHT85 de aguinaldo azul claro mostró una
semejanza del 69,6%, unos 869 nucleótidos, y una semejanza del
74,8%, unos 515 aminoácidos, respecto a la del clon de cADN de
OGR-38 de petunia.
Una alineación de secuencias de petunia, clavel,
boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia, todas las
cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios resúmenes
de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
Para aislar un clon de cADN de F3'H de genciana,
fue usado el clon de cADN de F3'H de petunia unido a Ht1
(OGR-38), contenido en pCGP1805, para rastrear una
genoteca de cADN de pétalo de Gentiana trifora Pall. var
japonica Hara, en condiciones de estringencia baja.
\vskip1.000000\baselineskip
Una genoteca de cADN de pétalo fue preparada a
partir de flores de Gentiana triflora Pall. var
japonica Hara, como se describe por Tanaka et al.,
1996.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron rastreadas suspensiones de un total de
200.000 de la genoteca de cADN de pétalo de genciana amplificado
con fragmentos marcados con DIG del inserto de cADN de
OGR-38 de 1,8 kb de pCGP1805. Un kit de marcación
DIG de ADN y de detección de Boehringer-Mannheim
fue usado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Las hibridaciones fueron llevadas a cabo en
formamida al 30% (v/v), 5 x SSC, SDS al 1% (p/v) a 37ºC durante 16
horas. Los filtros entonces fueron lavados en 5 x SSC, SDS al 1%
(p/v) a 65ºC durante 1 hora. Las señales fueron visualizadas
siguiendo el protocolo del kit de marcación DIG de ADN y
detección.
Quince placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB y
rastreadas de nuevo para aislar placas puras. Los plásmidos
contenidos en el vector de bacteriófago \lambdaZAPII fueron
rescatados y digeridos con EcoRI/XhoI para liberar los insertos de
cADN. Un clon (GHT13) contenía un inserto de 1,8 kb. La secuencia
del clon de cADN de genciana parcial (GHT13) (SEQ ID NO:22),
contenido en el plásmido pGHT13, fue determinada por la compilación
de secuencia a partir de diferentes subclones de pUC18 obtenidos
usando procedimientos estándar para la generación de clones
sobrelapantes aleatoriamente (Sambrook et al., 1989).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN de GHT13 de genciana (SEQ ID NO:22 y SEQ
ID NO:23) fueron comparadas con las del clon de cADN de F3'H de
OGR-38 de petunia. El clon de cADN de GHT13 de
genciana mostró una semejanza del 68,3%, unos 1519 nucleótidos, y
una semejanza del 71,8%, unos 475 aminoácidos, respecto al clon de
cADN de OGR-38 de petunia.
Una alineación de secuencias de petunia, clavel,
boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia, todas las
cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios resúmenes
de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Para aislar un clon de cADN de F3'H de
lisianthus, fue usado el clon de cADN de F3'H unido a Hfl de petunia
(OGR-38), contenido en pCGP1805, para rastrear una
genoteca de cADN de pétalo de lisianthus, bajo condiciones de
estringencia baja.
\vskip1.000000\baselineskip
Fueron puestos en placa 10.000 pfus de una
genoteca de cADN de pétalo de lisianthus descrita por Davies et
al. (1993) y Markham y Offman (1993) en placas LB (Sambrook
et al., 1989) a una densidad de 3.000 pfus por placa de 15
cm después de la transfección de Y1090r-, y fueron incubados a 37ºC
durante 16 horas. Después de la incubación a 4ºC durante una hora,
fueron tomadas suspensiones duplicadas en filtros Hybond N+®
(Amersham) y fueron tratadas como se recomienda por el
fabricante.
Fueron rastreadas las suspensiones duplicadas a
partir de una genoteca de cADN de pétalo de la línea de lisianthus
Nº. 54 con fragmentos ^{32}P-marcados del inserto
de Asp718/BamHI de 1,8 kb a partir de pCGP1805.
Las condiciones de hibridación incluyeron una
etapa de prehibridación en EDTA 1 mM (pH 8,0), Na_{2}HPO_{4}
0,5 M (pH 7,2), SDS al 7% (p/v) (Church y Gilbert, 1984) a 55ºC
durante al menos 1 hora. Los fragmentos
^{32}P-marcados (1 x 10^{6} cpm/mL) entonces
fueron añadidos a la solución de hibridación y la hibridación fue
seguida a 55ºC durante 16 horas más. Los filtros entonces fueron
lavados en 2 x SSC, SDS al 0,1% (p/v) a 55ºC durante 2 x 15
minutos, y fueron expuestos a la película BioMax de Kodak con una
pantalla de intensificación a -70ºC durante 18 horas.
Doce placas de
fuerte-hibridación fueron escogidas en PSB (Sambrook
et al., 1989) y fueron rastreadas de nuevo para aislar
placas purificadas, usando las condiciones de hibridación como se
describe para el rastreo inicial de la genoteca de cADN. Los datos
de secuencia fueron generados a partir de los extremos 3' y 5' de
los insertos de cADN de cuatro clones.
Basado en comparaciones de secuencia,
pL3-6 mostró semejanza con el clon de cADN de F3'H
de OGR-38 de petunia y después fue
caracterizado.
El inserto de cADN de 2,2 kb, contenido en
pL3-6, fue encontrado posteriormente que contenía 3
clones de cADN truncados, el más largo (L3-6) con
una alta semejanza de secuencia para la secuencia de cADN de
OGR-38 de petunia. La secuencia de este clon de
cADN de L3-6 parcial contenido en el plásmido
pL3-6 fue determinada por la compilación de
secuencia a partir de subclones del inserto de cADN de
L3-6 (SEQ ID NO:24).
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
predichas del clon de cADN de L3-6 de lisianthus
(SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:25) fueron comparadas con las del clon de
cADN de F3'H de OGR-38 de petunia (SEQ ID NO:1 y SEQ
ID NO:2). La secuencia del clon de cADN de L3-6 de
lisianthus mostró una semejanza del 71,4%, unos 1087 nucleótidos, y
una semejanza del 74,6%, unos 362 aminoácidos, respecto a la del
clon de cADN de F3'H de OGR-38 de petunia.
Una alineación de secuencias de petunia, clavel,
boca de dragón, arabidopsis, rosa, crisantemo y torenia, todas las
cuales se describen en esta memoria descriptiva, y varios resúmenes
de las comparaciones de semejanzas de secuencia entre las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos correspondientes, pueden ser
encontrados en la Tabla 7 y en Tablas 8, 9, 10, 11 y 12,
respectivamente. Estas Tablas están en el Ejemplo 34, al final de
la memoria descriptiva.
Otra investigación de los clones restantes
aislados a partir del rastreo de la genoteca de lisianthus
identificó otro supuesto clon de cADN de F3'H
(L3-10), contenido en el plásmido pL310. El inserto
de cADN de L3-10 tiene aproximadamente 1,8 kb y
parece representar a un clon de "cadena entera".
Fueron realizadas múltiples alineaciones de
secuencia usando el programa ClustalW como se describe en el Ejemplo
3. La tabla 7 (más abajo) proporciona una alineación de secuencia
múltiple de las secuencias de aminoácido predichas de
OGR-38 de petunia (A); clavel (B); boca de dragón
(C); región codificante Tt7 de arabidopsis (D); rosa (E) crisantemo
(F); torenia (G); aguinaldo (H); genciana (secuencia parcial) (I);
lisianthus (secuencia parcial) (J) y el cADN 651 de petunia (K). Se
muestran los aminoácidos conservados en mayúsculas negritas y están
encuadrados y oscurecidos. Se muestran los aminoácidos similares con
mayúsculas y sólo ligeramente oscurecidos, y se muestran los
aminoácidos distintos con letras minúsculas.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de
los clones de cADN de F3'H de la especie antedicha y la región de
codificación del clon genómico de arabidopsis fueron comparadas
usando el programa LFASTA, como se describe en el Ejemplo 3. Los
resúmenes de las comparaciones de semejanza son presentados en las
Tablas 8 a 12, más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los expertos en la técnica apreciarán que la
invención descrita en este documento es susceptible de sufrir
variaciones y modificaciones distintas a las específicamente
descritas. Debe ser entendido que la invención incluye todas tales
variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las
etapas, propiedades, composiciones y compuestos referidos o
indicados en esta memoria descriptiva, individualmente o en
conjunto, y alguna y todas las combinaciones de cualquiera de dos o
más de dichas etapas o propiedades.
Altschul, S.F., Gish, W.,
Miller, W., Myers, E.W. y Lipman, D.J. J.
Mol. Biol. 215: 403-410, 1990.
Ashikari, T.,
Kiuchi-Goto, N., Tanaka, Y.,
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Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:
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Baird, W.V. y Meagher, R. B.
EMBO J. 6, 3223-3231, 1987.
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Pelletier, G. C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la
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\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: (EN LUGAR DE NOSOTROS): FLORIGENE LIMITED (SÓLO EE.UU.): Filippa BRUGLIERA, Timothy Albert HOLTON, Michael Zenon MICHAEL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SECUENCIAS GENÉTICAS QUE CODIFICAN ENZIMAS DE LA RUTA DE LOS FLAVONOIDES Y USOS DE LAS MISMAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MELBOURNE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: VICTORIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: AUSTRALIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 3000
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-FEB-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD PREVIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PN8386
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-FEB-1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: HUGHES, DR E JOHN L
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- /NÚMERO DE REFERENCIA/ARCHIVO: EJH/AF
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: +61 3 9254 2777
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: +61 3 9254 2770
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: AA 31787
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1789 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 50..1586
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1745 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 172..1660
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1711 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 91..1629
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 512 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 971 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..811
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 270 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6595 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1478..1927
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2651..3091
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3170..3340
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 3421..3900
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 149 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 147 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.500000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 160 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1748 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 22..1563
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 513 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1660 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4..1528
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 508 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1815 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 107..1631
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 508 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1824 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..1553
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 517 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1667 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1429
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 476 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1214 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2..1091
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 363 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1757 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA :
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 35..1522
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTTTA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTTTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTTTG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGGCIATIG GI(A/C)GIGA(T/C)CC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 ácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAATT (T/C) (A/C)G ICCIGA (A/G) (A/C) GI TT
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCITT(T/C)GGIG CIGGI(A/C)GI(A/C)G IATITG(T/G)(C/G)CI GG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAITT(T/C)IIIC CIGAI(A/C)GITT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACACGAGT AGTTTTGGCA TTTGACCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTTGGACA TCACACTTCA ATCTG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGAATTCCC CCCCCCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCIGG(A/G)CAIA TIC(G/T)(C/T)(C/T)TICC IGCICC(A/G)AAI GG
\hfill32
Claims (12)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa, en el que dicha molécula comprende
una secuencia de nucleótidos como se muestra en este documento en
SEQ ID NO:1 o que tiene al menos una identidad del 60% respecto a
ésta o una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse a la
secuencia expuesta en SEQ ID NO:1 o su secuencia de nucleótidos
complementaria en condiciones de estringencia baja, en el que dicha
flavonoide 3'-hidroxilasa es capaz de realizar un
cambio de color rosa de al menos el polen y la(s)
antera(s) de la planta Petunia hybrida F1 línea Skr4 X
Sw63 cuando se expresa en dicha planta.
2. Una molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como se
muestra en este documento en SEQ ID NO:2 o una secuencia de
aminoácidos que tiene una identidad de al menos el 50% respecto a
ésta.
3. Una molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha secuencia
codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que
comprende el motivo RPPNSGAXHXAYNYXDL
[X]_{n}GGEK, en el que X representa cualquier aminoácido y [X]_{n} representa una secuencia de aminoácidos de 0 a 500 aminoácidos.
[X]_{n}GGEK, en el que X representa cualquier aminoácido y [X]_{n} representa una secuencia de aminoácidos de 0 a 500 aminoácidos.
4. Un constructo genético capaz de reducir la
expresión de un gen endógeno que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa en una planta, comprendiendo dicho
constructo genético una secuencia de nucleótidos seleccionada a
partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria;
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria;
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 60% de identidad con respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de
nucleótidos es capaz de efectuar un cambio de color rosa de al menos
el polen y la(s) antera(s) de la planta Petunia
hybrida F1 línea Skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha
planta.
5. Un constructo genético capaz de aumentar la
expresión de la flavonoide 3'-hidrolasa en una
planta, comprendiendo dicho constructo genético una secuencia de
nucleótidos seleccionada a partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria;
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria; y
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% con respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de
nucleótidos es capaz de efectuar un cambio de color rosa de al menos
el polen y la(s) antera(s) de la planta Petunia
hybrida F1 línea skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha
planta.
6. Un método para producir una planta
transgénica capaz de sintetizar una flavonoide
3'-hidroxilasa, comprendiendo dicho método
transformar establemente una célula de una planta adecuada con una
molécula de ácido nucleico como se define en cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en condiciones que permiten la expresión
eventual de dicha molécula de ácido nucleico, regenerar una planta
transgénica a partir de la célula y hacer crecer dicha planta
transgénica durante un tiempo y en condiciones suficientes para
permitir la expresión de la molécula de ácido nucleico.
7. Un método para producir una planta
transgénica con una actividad reducida de flavonoide
3'-hidroxilasa endógena o existente, comprendiendo
dicho método transformar establemente una célula de una planta
adecuada con una molécula de ácido nucleico como se define en
cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o su forma
complementaria, regenerar una planta transgénica a partir de la
célula y, cuando sea necesario, hacer crecer dicha planta
transgénica en condiciones suficientes para permitir la expresión de
la molécula de ácido nucleico.
8. Un método para producir una planta
transgénica capaz de modular la hidroxilación de compuestos
flavonoides, comprendiendo dicho método transformar establemente
una célula o grupo de células de una planta adecuada con una
molécula de ácido nucleico como se define en cualesquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 o su forma complementaria, y regenerar una
planta transgénica a partir de dicha célula o células.
\newpage
9. Un método de acuerdo con cualesquiera de las
reivindicaciones 6 a 8 en el que la planta receptora es seleccionada
a partir de petunia, clavel, crisantemo, rosa, boca de dragón,
tabaco, aciano, pelargonium, lisianthus, gerbera, manzana, iris,
lirio, gloria africana violeta y aguinaldo azul.
10. Una planta transgénica que tiene un tejido
que exhibe un color modificado, comprendiendo dicha planta
transgénica como transgen una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir
de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria;
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria,
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% con respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de
nucleótidos es capaz de efectuar un cambio de color rosa de al menos
el polen y la(s) antera(s) de la planta Petunia
hybrida F1 línea skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha
planta.
11. Una flor de corte, semilla, fruta u hoja de
una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 10, en el
que dicha flor, semilla, fruta u hoja contiene como transgen una
molécula de ácido nucleico como se define en la reivindicación
10.
12. El uso de una molécula de ácido nucleico que
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flavonoide
3'-hidroxilasa y se selecciona a partir de:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 o su forma complementaria,
- (ii)
- la secuencia de nucleótidos en SEQ ID NO:1 o su forma complementaria,
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos el 60% con respecto a (i) o (ii); y
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones de estringencia baja a (i), (ii) y/o (iii),
en el que dicha secuencia de nucleótidos es
capaz de realizar un cambio de color rosa de al menos el polen y
la(s) antera(s) de la planta Petunia hybrida F1
línea Skr4 X Sw63 cuando se expresa en dicha planta,
en la fabricación de un constructo genético
capaz de modular la hidroxilación de compuestos flavonoide en una
planta o células de una planta.
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97904931T Expired - Lifetime ES2313732T3 (es) | 1996-03-01 | 1997-02-28 | Secuencias geneticas que codifican enzimas de la ruta de los flavonoides y usos de las mismas. |
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