JP5144347B2 - 花色を改変したコチョウランの製造方法 - Google Patents
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Description
花の色は主にアントシアニン、カロテノイド、ベタレインの3種の色素に起因する。その内、アントシアニンは赤色から青色を司る、極大吸収波長幅が最も広い色素である。アントシアニンはフラボノイドの一種で図1に示した代謝経路で生合成される。アントシアニンの色調は、その化学構造、特にB環の水酸基の数に大きく依存する。そのB環の水酸化は、フラボノイド3'−水酸化酵素(F3'H)およびフラボノイド3',5'−水酸化酵素(F3'5'H)によって触媒される。花弁細胞内にて、F3'H活性とF3'5'H活性がない場合にはペラルゴニジン(橙色)が合成され、F3'H活性がある場合はシアニジン(赤色)が合成され、F3'5'H活性がある場合はデルフィニジン(青色)が合成される。そのため、赤い花色の作出には、F3'Hが大きな役割を果たすと考えられてきた。
遺伝子を用いて花色を改変した事例としては、パンジーのF3'5'H遺伝子を用いて青い色のバラを製造する方法(特許文献1)がある。
一方、コチョウランに関しては、内在遺伝子の過剰発現によりピンク色の花色を赤紫色に改変した報告がある。(非特許文献1)
すなわち、本発明は、フラバノン3−水酸化酵素をコードする遺伝子、フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子、ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子並びにアントシアニジン合成酵素をコードする遺伝子をコチョウランに導入し、発現させることを特徴とする花色が改変されたコチョウランの製造方法に関する。
また、本発明は、上記の方法により得られる花色が改変されたコチョウラン若しくは、改変された花色と同じ性質を有するその子孫またはその組織に関する。
本発明の上記方法において、F3'Hをコードする遺伝子としてコチョウラン又はガーベラの遺伝子を、DFRをコードする遺伝子としてガーベラ又はトレニアの遺伝子を用いると、花色は更に濃い赤色を呈するので、好ましい。
具体的には、各遺伝子は、プロモーター配列の3'下流に連結され、さらにその3'下流には、転写終結配列が付加されていることが望ましい。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。本発明における花弁細胞で遺伝子を発現させる方法としては、例えば、遺伝子銃法、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、PEG法、ウイルス法などが挙げられる。アグロバクテリウム法を用いてコチョウランの形質転換を行うためのベクターの一例を、図7及び図8に示す。
遺伝子の発現という用語は、その最も広い意味で用いられ、RNAの産生、またはRNAおよびタンパク質の両方の産生が含まれる。また、植物における遺伝子の発現は、構成的、あるいは発達的、またあるいは誘導的のいずれであってもよく、全身的、または組織特異的であってもよい。
(1)F3'Hをコードする遺伝子がコチョウラン又はガーベラの遺伝子である。
(2)F3'Hをコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子である。
(3)DFRをコードする遺伝子がガーベラ又はトレニアの遺伝子である。
(4)DFRをコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子である。
(5)F3'Hをコードする遺伝子がコチョウラン又はガーベラの遺伝子であり、DFRをコードする遺伝子がガーベラ又はトレニアの遺伝子である。
(6)F3'Hをコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子であり、DFRをコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子である。
(7)F3Hをコードする遺伝子が配列番号9の塩基配列で表される遺伝子であり、F3'Hをコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子であり、DFRをコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子であり、ANSをコードする遺伝子が配列番号11又は13の塩基配列で表される遺伝子である。
なお、DNA の切断、連結、大腸菌の形質転換、遺伝子の塩基配列決定、PCR等一般の遺伝子組換えに必要な方法は、各操作に使用する市販の試薬、機械装置等に添付されている説明書や、実験書(例えば「Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Third Edition,Sambrook and Russell,2001,Cold Spring Harbor Laboratory Press) 」)に基本的に従った。PCR反応には、GeneAmp PCR system 9700(PE Applied Biosystems)を使用した。機器の操作は、他に詳細に記載するもの以外は、機器に添付される説明書に記載される標準的な操作方法に従った。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
本明細書の実施例に特に記述が無い場合は、以下に述べる遺伝子導入方法を用いて、コチョウラン花弁に各種遺伝子を導入し、その機能を評価した。全ての遺伝子は、5'側にプロモーターを、3'側にターミネーターを連結したDNA構造をとり、花弁細胞内で発現する形状で導入された。
コチョウランのつぼみを、1%次亜塩素酸ナトリウム水溶液で5分間滅菌し、滅菌水で3回洗浄した後、このつぼみを分解して、ラテラルセパル、ドーサルセパル、ペタルをNDM塩(Tokuhara and Mii, Plant Cell Reports (1993) 13: 7-11.)と0.6%アガロースを含む寒天培地上に置床した。尚、つぼみは、白色コチョウランPhal. amabilisの長さ15mm程度のものを使用した。
導入するDNAはHi Speed Plasmid Midi Kit(QIAGEN)を用いて精製し、該遺伝子は遺伝子銃法にて遺伝子導入を行なった。尚、複数の遺伝子を同時導入する際は、該DNA溶液同士を均等に混ぜたものを用意し、導入用のDNA溶液とした。その際の金粒子とDNAの吸着は、以下の割合で行った。20μlのTE bufferに溶解したDNA(遺伝子が含まれるプラスミドDNA一種につき2μgを混ぜて溶解したもの)を50μlの金粒子混濁液(粒子直径は1.0μm、60mg/ml 50%グリセロール)と混ぜ、この混合液70μlに50μlの 2.5M塩化カルシウムと10μlの0.2Mスペルミジンを加えて懸濁し、DNAを金粒子に吸着させた。次に、遠心操作により、上清を除去し、70%エタノールと100%エタノールで粒子を洗浄した後、得られた該沈殿物に60μlの100%エタノールを加えた懸濁液を試料溶液とし、その10μlを一回の遺伝子導入に用いた。遺伝子銃は、IDERA GIE-III(TANAKA Co. Ltd.)を用いた。遺伝子導入条件は、銃口から試料までの距離12cm、−80kPaの減圧下、0.3MPaのヘリウムガス圧、0.025秒の噴射時間の条件下で行なった。
遺伝子導入後の花弁は、NDM塩寒天培地上に置床し、明暗サイクル下(光強度23μmol/m2/秒、明期16時間、暗期8時間)、25℃で培養した。
pBS-P35T35はpBluescriptIISK-(Stratagene)内にカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター(Hohn et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1982) 96: 194-236.)と、タバコモザイクウイルスのオメガ配列(Gallie et al., Nucleic Acids Research (1987) 15: 3257-3273.)、制限酵素SwaIサイト、そしてカリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーターをこの順に有するプラスミドである(図2)。このpBS-P35T35と実質的に機能が同等であるプラスミドは、以下のように構築可能である。
オリゴヌクレオチドSAS-S(5'- CTAGCTAGCGGCGCGCCTGCAGGATATCATTTAAATCCCGGG -3';配列番号:17)とオリゴヌクレオチドSAS-AS(5'- CCCGGGATTTAAATGATATCCTGCAGGCGCGCCGCTAGCTAG -3';配列番号:18)を熱変性後、徐々に室温に戻したものをNheI処理し、pBluescriptIISK-(Stratagene)のXbaI−EcoRVサイトへ連結し、制限酵素サイトを改変したプラスミドDNAであるpBS-SASを作製した。カリフラワーモザイクウイルスのゲノムDNA(GenBank accession V00140)を鋳型として、プライマーT-CaMV35S-SseI-F(5'- AACCTGCAGGAAATCACCAGTCTCTCTCTA-3';配列番号:19)と、プライマーT-CaMV35S-AscI-R(5'- GGCGCGCCATCGATAAGGGGTTATTAG -3';配列番号:20)を用いたPCRによって増幅される領域を制限酵素Sse8387IとAscIによって処理した。この断片をpBS-SASのSse8387I−AscIサイトへ連結し、pBS-T35Sを作製した。pJD301(Leon et al., Plant Physiology (1991) 95: 968-972.)より、HindIIIとHincIIによって切り出されるカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとタバコモザイクウイルスのオメガ配列をpBS-T35SのHindIII−SmaIサイトに連結し発現ベクター(pBS-P35T35)を作製した。
(1)コチョウランのCHS遺伝子(PhCHS3)の単離
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、コチョウラン(Dtps. Sogo Vivien×Dtps. Sogo Yenlin)開花直前の花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、SuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のコチョウランCHS遺伝子(PhCHS)の配列(GenBank accession No.:DQ089652)から設計したPhCHS3 F1(5'- AAGCTTGTGAGAGACGACGGA -3';配列番号:21)とPhCHS3 R1(5'- TGGCCCTAATCCTTCAAATT -3';配列番号:22)である。反応は、94℃を30秒、55℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。この反応液を鋳型に再度同条件で反応産物を増幅させた。得られた反応産物はpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし、p35PhCHS3を得た。次に、p35PhCHS3に含まれるコチョウランCHS遺伝子の全長塩基配列を決定した(PhCHS3、配列番号:23)。p35PhCHS3は、植物細胞内でコチョウランCHS遺伝子を発現するDNAである。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、コチョウラン(Dtps. Sogo Vivien×Dtps. Sogo Yenlin)開花直前の花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、SuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。CHI遺伝子は、様々な植物で報告があり(GenBank accession No.:AY700850, AY086088, DQ160231, AJ004902, AF474923, XM_470129, U03433, AB187026)、PCR反応に用いたプライマーは既知のCHI遺伝子の配列から設計したCHI-dgF1(5'- TTYCTCGSYGGBGCMGGYGWVMGVGG -3';配列番号:25)とCHI-dgR1(5'- CMGGIGAIACVSCRTKYTYICCRATVAT -3';配列番号:26)を用いた。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーCHI-dgF3(5'- TMIKYWCMGGISMITTYGARAARYT -3';配列番号:27)とプライマーCHI-dgR3(5'- TYICCRATVATIGWHTCCARIAYBGC -3';配列番号:28)を用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhCHIfrag16を得て、PhCHIfrag16に含まれる部分配列の塩基配列を決定した(PhCHI部分配列)。
PhCHI部分配列から3'下流側の配列と5'上流側の配列をRACE法にて解析した。
3'RACE法は、PhCHI部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhCHI-GSP F1(5'- ATGCTGCTGCCATTAACGGGTCA -3';配列番号:29)とGeneRacer 3'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーPhCHI-GSP F2(5'- TCCGAGAAGGTCTCCGGGAACT -3';配列番号:30)とGeneRacer 3' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhCHI3'RACE23を得て、PhCHI3'RACE23に含まれる3'下流側の配列の塩基配列を決定した(PhCHI 3'RACE配列)。
5'RACE法は、PhCHI部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhCHI-GSP R1(5'- GCATTCGTCAGCTTCTTGCTCTCT -3';配列番号:31)とGeneRacer 5'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーPhCHI-GSP R2(5'- ATCACATCAGTCTCAGCCACA -3';配列番号:32)とGeneRacer 5' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhCHI5'RACE54を得て、PhCHI5'RACE54に含まれる5'上流側の配列の塩基配列を決定した(PhCHI 5'RACE配列)。
PhCHI 3'RACE配列とPhCHI 5'RACE配列を基にコチョウランCHI遺伝子(PhCHI)の全長のクローニングを行った。上記のcDNAと、プライマーPhCHI init(5'- ATGGCAGAAACAGTGGCGACGCCCA -3';配列番号:33)とPhCHI term(5'- TCAAACGACTCCATCTTGCTC -3';配列番号:34)を用いてPCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を1.5分のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物はpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし、p35PhCHI1を得た。次に、p35PhCHI1に含まれる全長のコチョウランCHI遺伝子の塩基配列を決定した(PhCHI1、配列番号:35)。尚、コチョウランから見出された本配列の遺伝子は新規の遺伝子である。該塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、相同性解析よりチャのCHI遺伝子がコードするアミノ酸配列(GenBank accession No.:DQ120521)と54%の相同性を有する。p35PhCHI1は、植物細胞内でコチョウランCHI遺伝子を発現するDNAである。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、コチョウラン(Dtps. Sogo Vivien×Dtps. Sogo Yenlin)開花直前の花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、SuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。F3H遺伝子は、様々な植物で報告があり(GenBank accession No.:DQ394303, AY221246, AJ493133, AY641730, AF184270, AB078956, AB201760, AY669324, AF036093, AB211958, AB187027, AB234905)、PCR反応に用いたプライマーは既知のF3H遺伝子の配列から設計したプライマーF3H-dgF1(5'- TIVGIGAYGARGABGARMGBCCIAA -3';配列番号:37)とプライマーF3H-dgR1(5'- ACBGCYYGRTGRTCHGCRTTCTTRAA -3';配列番号:38)を用いた。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーF3H-dgF3(5'- AARYTBRGKTTYGAYATGWCHGGIG -3';配列番号:39)とプライマーF3H-dgR3(5'- GGHWSRACVGTDATCCAIGWBTT -3';配列番号:40)を用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3Hfrag26を得て、PhF3Hfrag26に含まれる部分配列の塩基配列を決定した(PhF3H部分配列)。
PhF3H部分配列から3'下流側の配列と5'上流側の配列をRACE法にて解析した。
3'RACE法は、PhF3H部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhF3H-GSPF1(5'- TTCTCATACCCAATCGGGAG -3';配列番号:41)とGeneRacer 3'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーPhF3H-GSPF2(5'- AATCGGGAGCCGCGATTACT -3';配列番号:42)とGeneRacer 3' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3H3'RACE33を得て、PhF3H3'RACE33に含まれる3'下流側の配列の塩基配列を決定した(PhF3H 3'RACE配列)。
5'RACE法は、PhF3H部分配列より設計できるオリゴヌクレオチドと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhF3H-GSPR1(5'- TCTGTGTGGCGCTTCAGGCC -3';配列番号:43)とGeneRacer 5'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応液と、PhF3H-GSPR2(5'- TGAGGTCCGGTTGCGGGCATTTT -3';配列番号:44)とGeneRacer 5' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3H5'RACE86を得て、PhF3H5'RACE86に含まれる5'上流側の配列の塩基配列を決定した(PhF3H 5'RACE配列)。
PhF3H 3'RACE配列とPhF3H 5'RACE配列を基にコチョウランF3H遺伝子の全長のクローニングを行った。上記のcDNAと、プライマーPhF3H init.(5'- ATGGCCCCAATACCATTCCTACCGA -3';配列番号:45)とPhF3H term.(5'- CCTTAAGCTAAAATCTCATTTAATGCCTTTGCTCC -3';配列番号:46)を用いてPCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を1.5分のステップを40サイクル繰り返した。得られた反応産物はpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし、p35PhF3H1を得た。次に、p35PhF3H1に含まれる全長のコチョウランF3H遺伝子の塩基配列を決定した(PhF3H1、配列番号:9)。尚、コチョウランから見出された本配列の遺伝子は新規の遺伝子である。該塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、相同性解析よりBromheadia finlaysonianaのF3H遺伝子がコードするアミノ酸配列(GenBank accession No.:X89199)と86%の相同性を有する。p35PhF3H1は、植物細胞内でコチョウランF3H遺伝子を発現するDNAである。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN社)を用いて、コチョウラン(Dtps. Queen Beer 'Mantenkou')のツボミの花弁より全RNAを抽出した。このRNAを鋳型として、GeneRacer kit(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。F3'H遺伝子は、様々な植物で報告がある(AAG49298, ABA64468, BAE47004, BAE47005, BAE47006, BAE71221, BAE72874, CAI54278, NP_920627)。PCR反応に用いたプライマーは、前述のF3'H遺伝子の配列から設計したF3HDF3(5'- GCITAYAAYTAYCARGAYYTIGTNTT -3';配列番号:47)とF3HD-R4-2(5'- GCICKYTGIARIGTNARNCC -3';配列番号:48)を用いた。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を1分のステップを40サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーF3HDF4(5'- GAYYTIGTNTTYGCICCNTAYGG -3';配列番号:49)とプライマーF3HD-R3-2(5'- DATICKICKICCIGCNCCRAANGG -3';配列番号:50)を用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を1分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーF3HDF5(5'- GARTTYAARIIIATGGTIGTIGARYTNATG -3';配列番号:51)とプライマーF3HD-R1-3(5'- GGRTCICKNGCDATNGCCC -3';配列番号:52)を用いて再度Nested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を30秒のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3'H-D/pCR4と命名した。PhF3'H-D/pCR4に含まれる部分配列の塩基配列を決定した(PhF3'H部分配列)。
上記PhF3'H部分配列から、3'下流側の配列と5'上流側の配列をRACE法にて解析した。
3'RACE法は、PhF3'H部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhF3dH-F7(5'- AGGGCGAAGTTAATGGTGGAGGCAGTGATA -3';配列番号:53)とGeneRacer 3'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を2分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、70℃を2分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を2分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーPhF3dH-F8(5'- AAGTTAATGGTGGAGGCAGTGATATGCTGA -3';配列番号:54)、GeneRacer 3' Nested プライマーとを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を2分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3'H 3'RACE /pCR4と命名した。PhF3'H 3'RACE /pCR4に含まれる3'下流側の配列の塩基配列を決定した(PhF3'H3'RACE配列)。
5'RACE法は、PhF3'H部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhF3dH-R6(5'- CACTGCCTCCACCATTAACTTCGCCCTTCT -3';配列番号:55)とGeneRacer 5'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーPhF3dH-R5(5'- CCTCCACCATTAACTTCGCCCTTCTCTATT -3';配列番号:56)とGeneRacer 5' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3'H 5'RACE/pCR4と命名した。PhF3'H 5'RACE/pCR4に含まれる5'上流側の配列の塩基配列を決定した(PhF3'H5'RACE配列)。
上記PhF3'H3'RACE配列とPhF3'H5'RACE配列を基にPhF3'H遺伝子の全長のクローニングを行った。上記のRNAと、ランダムヘキサマー、プライマーPhF3dH-F11E4(5'- AAGAAGCAAATGGCATTCTTAACCTACCTG -3';配列番号:57)とプライマーPhF3dH-R7G11(5'- TTATCACTGCCTCCACCATTAACTTCGCCC -3';配列番号:58)、そしてReady-To-Go You Prime First Strand Beads(Amersham Biosciences社)を用いて、RT-PCRを行った。反応は、98℃を10秒、68℃を30秒、72℃を1.5分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhF3'H/pCR4と命名した。PhF3'H/pCR4に含まれるPhF3'H遺伝子の塩基配列を決定した(PhF3'H;配列番号:1)。尚、コチョウランから見出された本配列の遺伝子は新規の遺伝子である。該塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、相同性解析より Sorghum bicolor のF3'H遺伝子がコードするアミノ酸配列(GenBank accession No.:DQ787855)と59%の相同性を示した。PhF3'H/pCR4をEcoRIで切断してプラスミドからDNA断片を切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化した。このDNA断片を、pBS-P35T35をSwaIで切断して生じた部位に挿入して、センス方向にcDNAが挿入されたクローンを選抜し、pBS-35S-PhF3'Hを構築した。pBS-35S-PhF3'Hは、植物細胞内でコチョウランF3'H遺伝子を発現するDNAである。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、コチョウラン(Dtps. Queen Beer 'Mantenkou')のツボミの花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、GeneRacer kit(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。DFR遺伝子は、様々な植物で報告がある(GenBank accession No.:AAB62873, AAC17843, AAD49343, AAQ83576, AAU93766, AAY32600, AAY32601, AAY32602, BAB40789, BAE79202)。PCR反応に用いたプライマーは、前述のDFR遺伝子の配列から設計したDFRD-F1(5'- TTYCAYGTIGCIACNCCNATG -3';配列番号:59)とDFRD-R1(5'- DATNGCRTCRTCRAACATYTC -3';配列番号:60)を用いた。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を1分のステップを40サイクル繰り返した。得られた反応液を鋳型にして、プライマーDFRD-F2(5'- ATGAAYTTYCARWSIRARGAYCC -3';配列番号:61)とプライマーDFRD-R2(5'- RCAIATRTAICKNCIRTTNGC -3';配列番号:62)を用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を1分のステップを40サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーDFRD-F3(5'- GARAAYGARGTNATHAARCC -3';配列番号:63)とプライマーDFRD-R3(5'- RTCRTCIARRTGNACRAAYTG -3';配列番号:64)を用いて再度Nested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、48℃を30秒、72℃を30秒のステップを40サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhDFR-D/pCR4を得て、PhDFR-D/pCR4に含まれる部分配列の塩基配列を決定した(PhDFR部分配列)。
PhDFR部分配列から3'下流側の配列と5'上流側の配列をRACE法にて解析した。
3'RACE法は、PhDFR部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhDFR-F1(5'- GGTCATGCAAAAGGTCGGGCAGCGTAA -3';配列番号:65)とGeneRacer 3'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、PhDFR-F2(5'- GTGATCTTCACATCTTCCGCAGGAACAGT -3';配列番号:66)とGeneRacer 3' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4/TOPO10(Invitrogen)にクローニングし、PhDFR 3'RACE/pCR4を得て、PhDFR 3'RACE/pCR4に含まれる3'下流側の配列の塩基配列を決定した(PhDFR3'RACE配列)。
5'RACE法は、PhDFR部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhDFR-R4(5'- ATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCACTACAA -3';配列番号:67)とGeneRacer 5'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、70℃を1分のステップを5サイクル繰り返し、続いて94℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーPhDFR-R3(5'- AACCATGCATAATAAAGCAGATGTGTAAAT -3';配列番号:68)とGeneRacer 5' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を30秒、65℃を30秒、72℃を1分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhDFR 5'RACE/pCR4を得、PhDFR 5'RACE/pCR4に含まれる5'上流側の配列の塩基配列を決定した(PhDFR 5'RACE配列)。
PhDFR 3'RACE配列とPhDFR 5'RACE配列を基にコチョウランDFR遺伝子の全長のクローニングを行った。上記のRNAと、プライマーPhDFR-F8A5(5'- AAAAAATGGAGGATGTGAGGAAGGGTCCTGTT -3';配列番号:69)とPhDFR-R5(5'- ACATGATTCATTAAAAATCCGAAAAAAAGACCA -3';配列番号:70)、そしてReady-To-Go You Prime First Strand Beads(Amersham Biosciences社)を用いて、RT-PCRを行った。反応は、98℃を30秒、68℃を30秒、72℃を1.5分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpBS-P35T35にクローニングし、p35PhDFRを得た。次に、p35PhDFRに含まれる全長のDFR遺伝子の塩基配列を決定した(PhDFR、配列番号:15)。尚、コチョウランから見出された本配列の遺伝子は新規の遺伝子である。該塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、相同性解析よりBromheadia finlaysonianaのDFR遺伝子がコードするアミノ酸配列(GenBank accession No.:AF007096)と86%の相同性を有する。p35PhDFRは、植物細胞内でコチョウランDFR遺伝子を発現するDNAである。
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、コチョウラン(Dtps.Sogo Vivien×Dtps.Sogo Yenlin)開花直前の花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、SuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは既知のANS遺伝子の配列から設計したANS-dgF2(5'- TICARGGBTAYGGIAGYARRYTIGCIRMYA -3';配列番号:71)とANS-dgR2(5'- GGYTCRCARAAIAYIRCCCAIGADA -3';配列番号:72)を用いた。反応は、94℃を30秒、60℃を30秒、72℃を1.5分のステップを40サイクル繰り返した。得られた反応液を鋳型に再度同じプライマーを用いて、94℃を30秒、56℃を30秒、72℃を1分のステップ30サイクルの反応を行った。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhANSfrag10を得て、PhANSfrag10に含まれる部分配列の塩基配列を決定した(PhANS部分配列)。
PhANS部分配列から3'下流側の配列と5'上流側の配列をRACE法にて解析した。
3'RACE法は、PhANS部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhANS3RACEGSP1(5'- GCCCACACCGACGTCAGCTCCCTCTCCT -3';配列番号:73)とGeneRacer 3'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1.5分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1.5分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、70℃を30秒、72℃を1.5分のステップを25サイクル繰り返した。更に、得られた反応液を鋳型にして、プライマーPhANS3RACEGSP2(5'- CGTCGGGGATGCGCTCGAGATCCTCAGC -3';配列番号:74)とGeneRacer 3' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を10秒、58℃を10秒、72℃を1分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhANS3'RACE37を得て、PhANS3'RACE37に含まれる3'下流側の配列の塩基配列を決定した(PhANS 3'RACE配列)。
5'RACE法は、PhANS部分配列より設計できるプライマーと、上記のRNA、そしてGeneRacer kit(Invitrogen)を用いて行った。PCR反応に用いたプライマーは、PhANS5RACEGSP1(5'- AGTCCGCGGGTTCAGTCGGCCAGATGGT -3';配列番号:75)とGeneRacer 5'プライマーである。反応は、94℃を30秒、72℃を1.5分のステップを5サイクル、94℃を30秒、70℃を1.5分のステップを5サイクル行った後、94℃を30秒、70℃を30秒、72℃を1.5分のステップを25サイクル繰り返した。得られた反応液と、プライマーPhANS5RACEGSP2(5'- CCGTCTTCTCCGGCGGGTAGACGAGGTG -3';配列番号:76)とGeneRacer 5' Nested プライマーを用いてNested PCRを行った。反応は、94℃を10秒、58℃を10秒、72℃を1分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpCR4-TOPO(Invitrogen)にクローニングし、PhANS5'RACE15を得て、PhANS5'RACE15に含まれる5'上流側の配列の塩基配列を決定した(PhANS 5'RACE配列)。
PhANS 3'RACE配列とPhANS 5'RACE配列を基にコチョウランANS遺伝子の全長のクローニングを行った。上記のcDNAと、プライマーPhANS init(5'- ATGGCCACCAAAGCAATCCCACC -3';配列番号:77)とPhANS term(5'- TCAATCCACAGGCGCCTTCT -3';配列番号:78)を用いてPCRを行った。反応は、94℃を30秒、69℃を30秒、72℃を1.5分のステップを35サイクル繰り返した。得られた反応産物はpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし、p35PhANS1を得た。次に、p35PhANS1に含まれる全長のANS遺伝子(PhANS1)の塩基配列を決定した(PhANS1、配列番号:11)。尚、コチョウランから見出された本配列の遺伝子は新規の遺伝子である。該塩基配列でコードされるアミノ酸配列は、相同性解析よりアンスリウムのANS遺伝子がコードするアミノ酸配列(GenBank accession No.:EF079869)と58%の相同性を有する。p35PhANS1は、植物細胞内でコチョウランANS遺伝子を発現するDNAである。
(1)ガーベラのF3'H遺伝子(GerF3'H)の単離
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、市販のガーベラハイブリッドのツボミの花弁より全RNAを抽出し、このRNAを鋳型として、SuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)の配列(GenBank accession No.:Z17221)から設計したGerF3H-F(5'- ATGACGCCTTTAACGCTCCT -3';配列番号:79)とGerF3H-R(5'- CTAGACCTTAGTCGTCTCATATACATG -3';配列番号:80)である。反応は、98℃を10秒、55℃を10秒、72℃を1分30秒のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物をpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし(p35GerF3'H)、ガーベラF3'H遺伝子を得た(配列番号:3)。p35GerF3'Hは、植物細胞内でガーベラF3'H遺伝子を発現するDNAである。
上記実施例4(1)のcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のガーベラDFR遺伝子(GerDFR)の配列(GenBank accession No.:Z17221)から設計したGerDFR-F(5'- ATGGAAGAGGATTCTCCGGC -3';配列番号:81)とGerDFR-R(5'- CTATTGGCCTTCTTTTGAACAACAAA -3';配列番号:82)である。反応は、98℃を10秒、55℃を10秒、72℃を1分30秒のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物をpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし(p35GerDFR)、ガーベラDFR遺伝子を得た(配列番号:7)。p35GerDFRは、植物細胞内でガーベラDFR遺伝子を発現するDNAである。
上記実施例4(1)のcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のガーベラANS遺伝子(GerANS)の配列(GenBank accession No.:AY997842)から設計したGerANS-F(5'- ATGGTGATTCAAGCAACCACA -3';配列番号:83)とGerANS-R(5'- CTAGTTTTGCATCACTTCGTCTTTAT -3';配列番号:84)である。反応は、94℃を30秒、56℃を30秒、72℃を1分10秒のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物をpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし(p35GerANS)、ガーベラANS遺伝子を得た(配列番号:13)。p35GerANSは、植物細胞内でガーベラANS遺伝子を発現するDNAである。
(1)トレニアのF3'H遺伝子(TorF3'H)の単離
RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)を用いて、市販のトレニア(Torenia fournieri)のツボミの花弁より全RNAを抽出し、このSuperscriptII First-Strand Synthesis System(Invitrogen)を用いてcDNAを調製した。次にこのcDNAを鋳型としてRT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のトレニアF3'H遺伝子(TorF3'H)の配列(GenBank accession AB057672)から設計したTorF3H1-F(5'- ATGAGTCCCTTAGCCTTGATGAT -3';配列番号:85)とTorF3H1-R(5'- TTAATAGACATGAGTGGCCAACC -3';配列番号:86)である。反応は、94℃を30秒、55℃を30秒、72℃を1分10秒のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物をpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし(p35TorF3'H)、トレニアのF3'H遺伝子を得た(配列番号:87)。p35TorF3'Hは、植物細胞内でトレニアF3'H遺伝子を発現するDNAである。
上記実施例5(1)のcDNAを鋳型として、RT-PCRを行った。PCR反応に用いたプライマーは、既知のトレニアDFR遺伝子(TorDFR)の配列(GenBank accession AB012924)から設計したオリゴヌクレオチドTorDFR-F(5'- ATGAGCATGGAAGTAGTAGTACCA -3';配列番号:89)とTorDFR-R(5'- CTATTCTATCTTATGTTCTCCATGG -3';配列番号:90)である。反応は、94℃を30秒、56℃を30秒、72℃を1分10秒のステップを45サイクル繰り返した。得られた反応産物をpBS-P35T35のSwaIサイトにクローニングし(p35TorDFR)、トレニアのDFR遺伝子を得た(配列番号:5)。p35TorDFRは、植物細胞内でトレニアDFR遺伝子を発現するDNAである。
花弁及び花弁細胞の着色は、実体顕微鏡SZX12(オリンパス)及び肉眼観察により行なった。花弁の着色程度の基準は、肉眼で確認可能なものを"III"、実体顕微鏡の倍率32倍以下にて確認可能なものを"II"、倍率32倍以上でないと確認できないものを"I"、着色が確認できないものを"−"とした。
実施例1の方法に従い白色コチョウラン(Phal. amabilis)の花弁に下記四種の遺伝子セットを導入した後、実施例6の方法により着色の程度を観察して、花色改変に必要な遺伝子を特定した。
(1)ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
(2)コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
(3)コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
(4)コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
上記遺伝子セットをPhal. amabilisの花弁に遺伝子導入し、それぞれの花弁細胞の着色を観察した結果、(1)以外の群で花弁に赤色の細胞が出現した(図3)。この結果より、花弁を赤色に改変するためにはF3'H遺伝子+DFR遺伝子+ANS遺伝子の導入では不十分であり、少なくともF3H遺伝子を加えた4種の遺伝子の導入が花色の改変には必要であることが分かった。
白色コチョウランの赤色への改変に関して、最良のF3'H遺伝子、DFR遺伝子及びANS遺伝子を見出すべく植物由来の異なる遺伝子を導入し、比較検討した。
白色のコチョウラン(Phal. amabilis)の花弁にF3'H遺伝子のみ異なる下記三種の遺伝子セットを導入し、着色の程度を観察した。
(1)コチョウランF3'H遺伝子(PhF3'H)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+トレニアDFR遺伝子(TorDFR) +コチョウランANS遺伝子(PhANS1)
(2)ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+トレニアDFR遺伝子(TorDFR) +コチョウランANS遺伝子(PhANS1)
(3)トレニアF3'H遺伝子(TorF3'H)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+トレニアDFR遺伝子(TorDFR) +コチョウランANS遺伝子(PhANS1)
その結果、全ての群の花弁で赤色の細胞が出現した。それぞれ10枚の花弁の着色の濃さを比較した結果を図4に示す。赤色の着色程度はコチョウラン(PhF3'H)、ガーベラ(GerF3'H)、トレニア(TorF3'H)の順で、濃い赤の花色を作出するには、コチョウランのF3'H遺伝子(PhF3'H)が適していると考えられる。
白色のコチョウラン(Phal. amabilis)の花弁にDFR遺伝子のみ異なる下記三種の遺伝子セットを導入し、着色の程度を観察した。
(1)コチョウランDFR遺伝子(PhDFR)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
(2)ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
(3)トレニアDFR遺伝子(TorDFR) +コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラANS遺伝子(GerANS)
その結果、全ての群で赤色の細胞が出現した。それぞれ36枚の花弁の着色の濃さを比較した結果を図5に示す。赤色の着色程度は、トレニア(TorDFR)、ガーベラ(GerDFR)、コチョウラン(PhDFR)の順で、濃い赤の花色を実現するには、コチョウランの内在DFR遺伝子(PhDFR)よりも、好ましくはガーベラのDFR遺伝子(GerDFR)が、より好ましくはトレニアのDFR遺伝子(TorDFR)が適していると考えられる。
白色のコチョウラン(Phal. amabilis)の花弁にANS遺伝子のみ異なる下記二種の遺伝子セットを導入し、着色の程度を観察した。
(1)コチョウランANS遺伝子(PhANS1)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)
(2)ガーベラANS遺伝子(GerANS)+コチョウランCHS遺伝子(PhCHS3)+コチョウランCHI遺伝子(PhCHI1)+コチョウランF3H遺伝子(PhF3H1)+ガーベラF3'H遺伝子(GerF3'H)+ガーベラDFR遺伝子(GerDFR)
その結果、全ての試料で同程度の赤色の細胞が出現した。それぞれ16枚の花弁について出現した赤色の細胞の着色の濃さを比較した結果を図6に示す。
市販の純白色の大型コチョウラン(Phal. White Lady)の長さ1.7cmのつぼみの花弁に、コチョウラン由来のCHS(PhCHS3)、CHI(PhCHI1)、F3H(PhF3H1)の各遺伝子と、そしてガーベラ由来のF3'H遺伝子(GerF3'H)、DFR遺伝子(GerDFR)並びにANS遺伝子(GerANS)を共導入したところ、花弁に赤色の細胞が多数出現した。
遺伝子銃法だけでなく、アグロバクテリウム法を用いてもコチョウランの形質転換は可能である(Belarmino and Mii, Plant Cell Reports (2000) 19:435-442.、Mishiba et al., Plant Cell Reports (2005) 24: 297-303.)。これらの方法に従って遺伝子組換え体を得るために形質転換用DNAの構築を行った。それぞれのプラスミドの地図と作製手順を図7と図8に示す。
(1)pBI-SAS1の構築
国際出願番号PCT/JP02/12268に記載されるpBI-RHLをNotIとHindIIIで切断した部位へ、実施例2のpBS-SASをNotIとHindIIIで切断して生じる短い断片をサブクローニングし、pBI-SAS1を構築した。pBI-SAS1は、アグロバクテリウムを用いて植物の形質転換を行い、植物にハイグロマイシン耐性を付与できるプラスミドである。
(2)pBS-35S-FTの構築
コチョウランは花が咲くまでに1年以上の期間を要するため、花芽誘導遺伝子FT (Kobayashi et al., Science (1999) 286: 1960-1962.)をコチョウランで発現させるDNAを構築した。
FTcDNAはシロイヌナズナ全植物体から調整した全RNAからRT-PCRにより増幅して調製した。PCRにはAtFT 2nd-F(5'- GAAACCACCTGTTTGTTCAAGA -3';配列番号:91)とAtFT 2nd-R(5'- TCAATTGGTTATAAAGGAAGAAGC -3';配列番号:92)をプライマーに用い、分離できたFT cDNAをpBS-P35T35をSwaIで切断して生じた部位に挿入して、センス方向にcDNAが挿入されたクローンを選抜し、pBS-P35S-FTを構築した。pBS-35S-FTはCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35SターミネーターでFTの転写が制御されるプラスミドである。
PhF3'H cDNA内にある2箇所のSphI切断部位にアミノ酸置換を伴わない塩基置換を導入して、SphIで切断されないcDNAを作成し、pBS-P35T35に挿入した。塩基置換にはPhF3dH-367F (5'- CGGTGCGCGGTGGCGTATGCTGAGGCGT -3';配列番号:93)とPhF3dH-394R (5'- ACGCCTCAGCATACGCCACCGCGCACCG -3';配列番号:94)をプライマーに用い、pBS-35S-PhF3'Hを鋳型としてPCRを行った。得られたPCR産物はKlenow断片で処理して環状化した。この環状化DNAを鋳型とし、PhF3dH-F11E4 (配列番号:57)とPhF3dH-R7G12 (5'- CACCCTTTGCATAAATTTATGACATCAAGC -3';配列番号:95)をプライマーとして用いてPCRを行なった。得られたPCR産物をpBS-P35T35をSwaIで切断して生じた部位に挿入して、センス方向にcDNAが挿入されたクローンを選抜し、pBS-35S-mPhF3'Hを構築した。
(4)pBS-35S-mPhCHS3の構築
PhCHS3 cDNA内にあるSphI切断部位にアミノ酸置換を伴わない塩基置換を導入して、SphIで切断されないcDNAを作成した。塩基置換はPhCHS3-1038F (5'- GTAACATGTCGAGCGCTTGCGTTCTTTTCATACTCG -3';配列番号:96)とPhCHS3-1073R (5'- CGAGTATGAAAAGAACGCAAGCGCTCGACATGTTAC -3';配列番号:97)をプライマーとして用い、p35PhCHS3を鋳型にしてPyrobest(タカラバイオ)を用いてDNA合成を行なった。その後、DpnI処理によって鋳型プラスミドを消化し、pBS-35S-mPhCHS3を構築した。
(5)pBS-35S-UP1の構築
p35PhCHI1をAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、p35PhF3H1をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-UP1を構築した。pBS-35S-UP1はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがPhCHI1、PhF3H1の順に連結されたプラスミドである。
p35GerANSをAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、p35GerDFRをXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya1を構築した。pBS-35S-Cya1はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerANS、GerDFRの順に連結されたプラスミドである。
(7)pBS-35S-Cya2の構築
p35GerF3'HをAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-Cya1をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya2を構築した。pBS-35S-Cya2はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerF3'H 、GerANS、GerDFRの順に連結されたプラスミドである。
(8)pBS-35S-Cya3の構築
pBS-35S-Cya2をAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-UP1をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya3を構築した。pBS-35S-Cya3はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerF3'H 、GerANS、GerDFR、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたプラスミドである。
(9)pBS-35S-Cya4の構築
pBS-35S-Cya3をAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-mPhCHS3をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya4を構築した。pBS-35S-Cya4はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerF3'H 、GerANS、GerDFR、PhCHI、PhF3H、mPhCHS3の順に連結されたプラスミドである。
(10)pBS-35S-Cya10の構築
pBS-35S-mPhF3'HをAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-FTをXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya10を構築した。pBS-35S-Cya10はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがmPhF3'H、FTの順に連結されたプラスミドである。
p35TorDFRをAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、p35PhANS1をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Del16を構築した。pBS-35S-Del16はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがTorDFR、PhANS1の順に連結されたプラスミドである。
(12)pBS-35S-UP4の構築
pBS-35S-Del16をAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-UP1をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-UP4を構築した。pBS-35S-UP4はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがTorDFR、PhANS1 、PhCHI1、PhF3H1の順に連結されたプラスミドである。
(13)pBS-35S-Cya11の構築
pBS-35S-mPhF3'HをAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-UP4をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya11を構築した。pBS-35S-Cya11はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがmPhF3'H、TorDER、PhANS 、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたプラスミドである
(14)pBS-35S-Cya12の構築
pBS-35S-Cya10をAscIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBS-35S-UP4をXbaIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにSphIで切断して生じた部位に挿入してpBS-35S-Cya12を構築した。pBS-35S-Cya12はCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがmPhF3'H、FT、TorDER、PhANS 、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたプラスミドである。
(15)pBIH-35S-Cya3の構築
pBS-35S-Cya3をSphIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにAscIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBI-SAS1をAscIとSwaIで切断して生じた部位に挿入してpBIH-35S-Cya3を構築した。pBIH-35S-Cya3は選抜マーカーであるHPTとCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerF3'H 、GerANS、GerDFR、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたT-DNA領域を持つバイナリーベクターである。
pBS-35S-Cya4をSphIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにAscIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBI-SAS1をAscIとSwaIで切断して生じた部位に挿入してpBIH-35S-Cya4を構築した。pBIH-35S-Cya4は選抜マーカーであるHPTとCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがGerF3'H 、GerANS、GerDFR、PhCHI、PhF3H、mPhCHS3の順に連結されたT-DNA領域を持つバイナリーベクターである。
(17)pBIH-35S-Cya11の構築
pBS-35S-Cya11をSphIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにAscIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBI-SAS1をAscIとSwaIで切断して生じた部位に挿入してpBIH-35S-Cya11を構築した。pBIH-35S-Cya11は選抜マーカーであるHPTとCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがmPhF3'H、TorDER、PhANS 、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたT-DNA領域を持つバイナリーベクターである。
(18)pBIH-35S-Cya12の構築
pBS-35S-Cya12をSphIで切断後、Klenow断片で突出末端を平滑化し、さらにAscIで切断してプラスミドからDNA断片を切り出した。このDNA断片を、pBI-SAS1をAscIとSwaIで切断して生じた部位に挿入してpBIH-35S-Cya12を構築した。pBIH-35S-Cya12は選抜マーカーであるHPTとCaMV 35Sプロモーター、CaMV 35Sターミネーターで転写が制御される各cDNAがmPhF3'H、FT、TorDER、PhANS 、PhCHI、PhF3Hの順に連結されたT-DNA領域を持つバイナリーベクターである。
バイナリベクターに構築された実施例12のDNA(pBIH-35S-Cya3、pBIH-35S-Cya4、pBIH-35S-Cya11、そしてpBIH-35S-Cya12)とアグロバクテリウムEHA101株を用いて作製された形質転換コチョウランは、50mg/mlのハイグロマイシンで選抜される。その結果、実施例12で示した遺伝子が染色体上に組み込まれたコチョウランを得ることができる。
得られた形質転換コチョウランからは、花茎の腋芽など植物体の一部を利用してPLBを誘導し、クローン増殖が可能である。得られた形質転換コチョウランを交配親に用いて、交配育種を行い、導入遺伝子を有する後代を得ることができる。
以上のようにF3H、F3'H、DFR、ANSの各遺伝子を共導入した白いコチョウランから、赤色の花弁を持つ新しい品種を作出することができる。
SEQ ID NO: 2, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar flavonoid 3'-hydroxylase
SEQ ID NO: 3, Nucleotide sequence encoding Gerbera hybrid cultivar flavonoid 3'-hydroxylase
SEQ ID NO: 4, Amino acid sequence of Gerbera hybrid cultivar flavonoid 3'-hydroxylase
SEQ ID NO: 5, Nucleotide sequence encoding Torenia fournieri dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 6, Amino acid sequence of Torenia fournieri dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 7, Nucleotide sequence encoding Gerbera hybrid cultivar dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 8, Amino acid sequence of Gerbera hybrid cultivar dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 9, Nucleotide sequence encoding Doritaenopsis hybrid cultivar flavanone 3-hydroxylase
SEQ ID NO: 10, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar flavanone 3-hydroxylase
SEQ ID NO: 11, Nucleotide sequence encoding Doritaenopsis hybrid cultivar anthocyanidin synthase
SEQ ID NO: 12, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar anthocyanidin synthase
SEQ ID NO: 13, Nucleotide sequence encoding Gerbera hybrid cultivar anthocyanidin synthase
SEQ ID NO: 14, Amino acid sequence of Gerbera hybrid cultivar anthocyanidin synthase
SEQ ID NO: 15, Nucleotide sequence encoding Doritaenopsis hybrid cultivar dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 16, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar dihydroflavonol 4-reductase
SEQ ID NO: 17, Oligonucleotide SAS-S
SEQ ID NO: 18, Oligonucleotide SAS-AS
SEQ ID NO: 19, Primer T-CaMV35S-SseI-F
SEQ ID NO: 20, Primer T-CaMV35S-AscI-R
SEQ ID NO: 21, Primer PhCHS3 F1
SEQ ID NO: 22, Primer PhCHS3 R1
SEQ ID NO: 23, Nucleotide sequence encoding Doritaenopsis hybrid cultivar chalcone synthase
SEQ ID NO: 24, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar chalcone synthase
SEQ ID NO: 25, Primer CHI-dgF1
SEQ ID NO: 26, Primer CHI-dgR1
SEQ ID NO: 27, Primer CHI-dgF3
SEQ ID NO: 28, Primer CHI-dgR3
SEQ ID NO: 29, Primer PhCHI-GSP F1
SEQ ID NO: 30, Primer PhCHI-GSP F2
SEQ ID NO: 31, Primer PhCHI-GSP R1
SEQ ID NO: 32, Primer PhCHI-GSP R2
SEQ ID NO: 33, Primer PhCHI init
SEQ ID NO: 34, Primer PhCHI term
SEQ ID NO: 35, Nucleotide sequence encoding Doritaenopsis hybrid cultivar chalcone isomerase
SEQ ID NO: 36, Amino acid sequence of Doritaenopsis hybrid cultivar chalcone isomerase
SEQ ID NO: 37, Primer F3H-dgF1
SEQ ID NO: 38, Primer F3H-dgR1
SEQ ID NO: 39, Primer F3H-dgF3
SEQ ID NO: 40, Primer F3H-dgR3
SEQ ID NO: 41, Primer PhF3H-GSPF1
SEQ ID NO: 42, Primer PhF3H-GSPF2
SEQ ID NO: 43, Primer PhF3H-GSPR1
SEQ ID NO: 44, Primer PhF3H-GSPR2
SEQ ID NO: 45, Primer PhF3H init.
SEQ ID NO: 46, Primer PhF3H term.
SEQ ID NO: 47, Primer F3HDF3
SEQ ID NO: 48, Primer F3HD-R4-2
SEQ ID NO: 49, Primer F3HDF4
SEQ ID NO: 50, Primer F3HD-R3-2
SEQ ID NO: 51, Primer F3HDF5
SEQ ID NO: 52, Primer F3HD-R1-3
SEQ ID NO: 53, Primer PhF3dH-F7
SEQ ID NO: 54, Primer PhF3dH-F8
SEQ ID NO: 55, Primer PhF3dH-R6
SEQ ID NO: 56, Primer PhF3dH-R5
SEQ ID NO: 57, Primer PhF3dH-F11E4
SEQ ID NO: 58, Primer PhF3dH-R7G11
SEQ ID NO: 59, Primer DFRD-F1
SEQ ID NO: 60, Primer DFRD-R1
SEQ ID NO: 61, Primer DFRD-F2
SEQ ID NO: 62, Primer DFRD-R2
SEQ ID NO: 63, Primer DFRD-F3
SEQ ID NO: 64, Primer DFRD-R3
SEQ ID NO: 65, Primer PhDFR-F1
SEQ ID NO: 66, Primer PhDFR-F2
SEQ ID NO: 67, Primer PhDFR-R4
SEQ ID NO: 68, Primer PhDFR-R3
SEQ ID NO: 69, Primer PhDFR-F8A5
SEQ ID NO: 70, Primer PhDFR-R5
SEQ ID NO: 71, Primer ANS-dgF2
SEQ ID NO: 72, Primer ANS-dgR2
SEQ ID NO: 73, Primer PhANS3RACEGSP1
SEQ ID NO: 74, Primer PhANS3RACEGSP2
SEQ ID NO: 75, Primer PhANS5RACEGSP1
SEQ ID NO: 76, Primer PhANS5RACEGSP2
SEQ ID NO: 77, Primer PhANS init
SEQ ID NO: 78, Primer PhANS term
SEQ ID NO: 79, Primer GerF3H-F
SEQ ID NO: 80, Primer GerF3H-R
SEQ ID NO: 81, Primer GerDFR-F
SEQ ID NO: 82, Primer GerDFR-R
SEQ ID NO: 83, Primer GerANS-F
SEQ ID NO: 84, Primer GerANS-R
SEQ ID NO: 85, Primer TorF3H1-F
SEQ ID NO: 86, Primer TorF3H1-R
SEQ ID NO: 87, Nucleotide sequence encoding Torenia fournieri flavonoid 3'-hydroxylase
SEQ ID NO: 88, Amino acid sequence of Torenia fournieri flavonoid 3'-hydroxylase
SEQ ID NO: 89, Primer TorDFR-F
SEQ ID NO: 90, Primer TorDFR-R
SEQ ID NO: 91, Primer AtFT 2nd-F
SEQ ID NO: 92, Primer AtFT 2nd-R
SEQ ID NO: 93, Primer PhF3dH-367F
SEQ ID NO: 94, Primer PhF3dH-394R
SEQ ID NO: 95, Primer PhF3dH-R7G12
SEQ ID NO: 96, Primer PhCHS3-1038F
SEQ ID NO: 97, Primer PhCHS3-1073R
Claims (9)
- フラバノン3−水酸化酵素をコードする遺伝子、フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子、ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子並びにアントシアニジン合成酵素をコードする遺伝子をコチョウランに導入し、発現させることを特徴とする花色が改変されたコチョウランの製造方法。
- フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子がコチョウラン又はガーベラの遺伝子である請求項1に記載の方法。
- フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子である請求項1に記載の方法。
- ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子がガーベラ又はトレニアの遺伝子である請求項1に記載の方法。
- ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子である請求項1に記載の方法。
- フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子がコチョウラン又はガーベラの遺伝子であり、ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子がガーベラ又はトレニアの遺伝子である請求項1に記載の方法。
- フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子であり、ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子である請求項1に記載の方法。
- フラバノン3−水酸化酵素をコードする遺伝子が配列番号9の塩基配列で表される遺伝子であり、フラボノイド3'−水酸化酵素をコードする遺伝子が配列番号1又は3の塩基配列で表される遺伝子であり、ジヒドロフラボノール4−還元酵素をコードする遺伝子が配列番号5又は7の塩基配列で表される遺伝子であり、アントシアニン合成酵素をコードする遺伝子が配列番号11又は13の塩基配列で表される遺伝子である請求項1に記載の方法。
- 請求項1の方法により得られる花色改変コチョウラン若しくは、改変された花色と同じ性質を有するその子孫またはその組織。
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