RU2640248C2 - Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение - Google Patents
Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2640248C2 RU2640248C2 RU2014145832A RU2014145832A RU2640248C2 RU 2640248 C2 RU2640248 C2 RU 2640248C2 RU 2014145832 A RU2014145832 A RU 2014145832A RU 2014145832 A RU2014145832 A RU 2014145832A RU 2640248 C2 RU2640248 C2 RU 2640248C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- content
- dolphinidin
- petals
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 title claims description 13
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 title claims description 13
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 title claims description 13
- 241000332371 Abutilon x hybridum Species 0.000 title 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 claims abstract description 60
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 44
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 13
- 244000154511 Rosa hybrid cultivar Species 0.000 claims abstract description 3
- 235000002315 Rosa hybrid cultivar Nutrition 0.000 claims abstract description 3
- 229930014669 anthocyanidin Natural products 0.000 claims description 28
- 235000008758 anthocyanidins Nutrition 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N flavylium Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=C(C=CC=C2)C2=[O+]1 NWKFECICNXDNOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 20
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010062650 Flavonoid 3',5'-hydroxylase Proteins 0.000 abstract description 64
- GCPYCNBGGPHOBD-UHFFFAOYSA-N Delphinidin Natural products OC1=Cc2c(O)cc(O)cc2OC1=C3C=C(O)C(=O)C(=C3)O GCPYCNBGGPHOBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- FFNDMZIBVDSQFI-UHFFFAOYSA-N delphinidin chloride Chemical compound [Cl-].[O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 FFNDMZIBVDSQFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 26
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 26
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 26
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 26
- VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O cyanidin cation Chemical compound [O+]=1C2=CC(O)=CC(O)=C2C=C(O)C=1C1=CC=C(O)C(O)=C1 VEVZSMAEJFVWIL-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 235000004031 Viola x wittrockiana Nutrition 0.000 description 17
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 14
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 13
- 235000007336 cyanidin Nutrition 0.000 description 12
- 235000007242 delphinidin Nutrition 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 12
- 241001533590 Junonia Species 0.000 description 11
- 241000207748 Petunia Species 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 241000723353 Chrysanthemum Species 0.000 description 9
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000047670 Viola x wittrockiana Species 0.000 description 6
- 150000001452 anthocyanidin derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- 108010044229 Dihydroflavanol 4-reductase Proteins 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 5
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 5
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 5
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 5
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150002919 DFR gene Proteins 0.000 description 4
- 241000182534 Pericallis hybrida Species 0.000 description 4
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 4
- 235000007212 Verbena X moechina Moldenke Nutrition 0.000 description 4
- 240000001519 Verbena officinalis Species 0.000 description 4
- 235000001594 Verbena polystachya Kunth Nutrition 0.000 description 4
- 235000007200 Verbena x perriana Moldenke Nutrition 0.000 description 4
- 235000002270 Verbena x stuprosa Moldenke Nutrition 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 3
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- HBQJTBXZMPSVBP-UHFFFAOYSA-N Cyanidine Natural products OC1=CC(=C2/Oc3cc(O)cc(O)c3C=C2O)C=CC1=O HBQJTBXZMPSVBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001071795 Gentiana Species 0.000 description 2
- 102000044467 Grifin Human genes 0.000 description 2
- 108700036695 Grifin Proteins 0.000 description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101001018064 Homo sapiens Lysosomal-trafficking regulator Proteins 0.000 description 2
- 241001609513 Hyacinthoides Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033472 Lysosomal-trafficking regulator Human genes 0.000 description 2
- 244000038561 Modiola caroliniana Species 0.000 description 2
- 235000010703 Modiola caroliniana Nutrition 0.000 description 2
- 235000011449 Rosa Nutrition 0.000 description 2
- 235000010295 Rosa x kordesii Nutrition 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003029 clitoris Anatomy 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 101150029296 grifin gene Proteins 0.000 description 2
- NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N pemoline Chemical compound O1C(N)=NC(=O)C1C1=CC=CC=C1 NRNCYVBFPDDJNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 240000001436 Antirrhinum majus Species 0.000 description 1
- 101100226484 Arabidopsis thaliana CYP75B1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000123667 Campanula Species 0.000 description 1
- 241000565648 Campanula medium Species 0.000 description 1
- 241000703121 Campanula rotundifolia Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000735332 Gerbera Species 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 244000178870 Lavandula angustifolia Species 0.000 description 1
- 235000010663 Lavandula angustifolia Nutrition 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 241000208672 Lobelia Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101100494423 Oryza sativa subsp. japonica CYP75B3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150031366 P3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 241000229722 Perilla <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000001528 Rosa X rehderiana Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N SJ000286395 Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)CC1C1=CC=CC=C1 ZONYXWQDUYMKFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 aluminum ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010031387 anthocyanidin synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000005200 bud stage Effects 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006103 coloring component Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229930003949 flavanone Natural products 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 235000011981 flavanones Nutrition 0.000 description 1
- 150000002208 flavanones Chemical class 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002213 flavones Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N flavonol Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C(O)=C1C1=CC=CC=C1 HVQAJTFOCKOKIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002216 flavonol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011957 flavonols Nutrition 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000001102 lavandula vera Substances 0.000 description 1
- 235000018219 lavender Nutrition 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
- C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения трансформированного растения розы, имеющего повышенное содержание в лепестках дельфинидина по сравнению с нетрансформированным растением розы, включающему стадию трансформации разновидности садовой розы (Rosa hybrida) плазмидой, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы, и 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с указанным полинуклеотидом. Также изобретение относится к трансформированному растению розы, которое содержит высокое количество дельфинидина в лепестках по сравнению с нетрансформированным растением розы. Изобретение позволяет эффективно получать растение розы с высоким содержанием дельфинидина в лепестках по сравнению с нетрансформированным растением розы. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 10 табл., 8 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к методу генетической инженерии, в котором экзогенный ген вводится в растительные клетки. Более конкретно, изобретение относится к новому гену флавоноид 3',5'-гидроксилазы колокольчика, к плазмиде, содержащей ген под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, и к способу получения растения садовой розы со значительно повышенным содержанием дельфинидина в лепестках, путем трансформации с использованием плазмиды способа с Agrobacterium.
Предшествующий уровень техники
Способы кроссбридинга растений включают (i) гибридизацию путем скрещивания тычинки и пестика, (ii) естественную или искусственную мутацию, и (iii) генную рекомбинацию. Из этих способов только технология генной рекомбинации может быть использована для придания новых признаков растениям путем экспрессии полезных генов в растениях-мишенях, без стеснения генетическими ограничениями видов. Широкий спектр растений с рекомбинантными генами, созданных таким образом, уже выращиваются по всему миру.
Компоненты окраски цветка включают антоцианины, каротеноиды и беталаины. Антоцианины являются представителями вторичных метаболитов общей группы соединений, названных флавоноидами, и они синтезируются из фенил ал анина под действием многочисленных ферментов. Цвет антоцианина зависит от его структуры. В частности, цвет становится более синим при увеличении количества гидроксильных групп на кольце анотицианидина В, которое является хромофорной группой антоцианина. В ряду основных антоцианидинов, состоящем из дельфинидина, цианидина и пеларгонидина, количество гидроксильных групп на В-кольце растет в указанном порядке. Антоцианины, полученные из дельфинидина, накапливаются в большинстве голубых цветов. Также известно, что при росте количества ароматических ацильных групп (кумарароильных групп, кафеоильных групп и т.п.), модифицирующих антоцианины, происходит усиление синего цвета антоцианинов (при котором максимум абсорбции смещается к длинноволновому концу), что соответствует повышенной стабильности антоцианинов. В частности, антоцианины, к которым присоединено множество ароматических ацильных групп, известные как полиацилированные антоцианины, присутствуют в синих лепестках горечавки, клитории и т.п.(см. Plant J. 54, 737-749, 2008). Ферменты, вовлеченные в биосинтез антоцианинов, и гены, кодирующие их, были выделены из множества растений (см. Plant J. 54, 737-749, 2008). Цвета антоцианинов зависят от локального рН вакуолей, и от присутствия других флавоноидов, металлических ионов и т.п. В частности, антоцианины демонстрируют красную окраску при низком рН вакуолей, и синюю окраску при нейтральном значении. Флавоны и флавонолы относятся к копигментам, и они обладают способностью делать антоцианины синими, когда они присутствуют вместе с антоцианинами. Также известно, что ионы железа и алюминия, координированные гидроксильными группами В-кольца антоцианина, делают антоцианин синим.
Цветки растений имеют большой спектр различных окрасок, но не существует разновидности, в которой были бы цветки всех цветочных окрасок. Это происходит из-за того, что пигменты, которые могут быть синтезированы разновидностью, определены генетически. Например, розы, гвоздики, хризантемы, лилии, герберы и т.п. не имеют естественных синих или фиолетовых разновидностей. Основная причина этого заключается в том, что эти растения не имеют гена для флавоноид 3',5'-гидроксилазы (далее «F3'5'H»), который необходим для синтеза дельфинидина. В нескольких сообщениях зафиксированы попытки экспрессировать ген F3'5'H в лепестках для выработки дельфинидина и получения синей цветочной окраски. Такое исследование основано на важности выбора соответствующего промотора и соответствующего гена F3'5'H для каждого разновидности, как описано ниже, в целях повышения содержания дельфинидина в лепестках и смещения цветочной окраски к синей.
При экспрессии гена F3'5'H в петуниях, которые не имеют F3'5'H, повышается уровень антоцианинов, полученных из дельфинидина (Nature, 1993, 366, 276-279, FEBS Lett. 1999, 461, 241-245). Также, экспрессия гена F3'5'H в табаке (Nicotiana tabacum), который накапливает цианидин, приводит к синтезу дельфинидина и придает слабосинюю окраску цветкам (FEBS Lett. 1999,461, 241-245).
В NPL 1 сообщается, что когда гены F3'5'H, полученные из колокольчика, гиацинтоидеса неописанного и петунии, экспрессировали в табаке под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, наиболее эффективная выработка дельфинидина была получена с геном F3'5'H колокольчика (см. реферат публикации).
Также в PTL 1 описывается введение полученного из петунии гена F3'5'H в розу под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (см. Пример 9), но там же ген F3'5'H, полученный из колокольчика, вводили просто в табак, при этом ничего не упоминая относительно выработки дельфинидина и изменения окраски растения розы или лепестков розы.
В NPL 2 также описывается экспрессия генов F3'5'H клитории и вербены в вербене, при этом отмечается, что экспрессия гена, полученного из клитории, приводит к большей выработке дельфинидина и четко измененной окраске цветов.
В PTL 2 также утверждается, что при экспрессии в розе генов F3'5'H, полученных из петунии, горечавки, цинерарии, гиацинтоидеса, анютиных глазок и лаванды, экспрессия гена F3'5'H, полученного из анютиных глазок, под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты, или промотора гена халькон синтазы, полученного из розы, приводит к выработке дельфинидина, составляющей несколько десятков процентов от общего содержания антоцианидинов, при этом полученный из анютиных глазок ген F3'5'H удовлетворительно функционирует в розе под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты или промотора гена халькон синтазы, полученного из розы.
В NPL 3 сообщается о том, что дополненный энхансером 35S промотор вируса мозаики цветной капусты дает более эффективную экспрессию экзогенных генов, чем 35S промотор вируса мозаики цветной капусты. Роза, обладающая геном F3'5'H анютиных глазок, введенного под контролем E12 35S промотора, вырабатывает дельфинидин и имеет измененную окраску цветков. В зависимости от хозяйской разновидности возможно получить розу, содержащую дельфинидин с 95% или большим содержанием от общего количества антоцианидинов, и имеющую окраску цветков измененную до фиолетовой, и одна такая разновидность уже продается (учетный номер разновидности No. 20992).
Более того, в PTL 3 сообщается, что в розе, в которую введена кассета, которая переносит ген F3'5'H анютиных глазок под контролем промотора Е12 35S, ген дигидрофлавонол 4-редуктазы (далее «DFR») под контролем промотора Е12 35S, и двухцепочечную РНК DFR розы, содержание дельфинидина составляет около 100%, а окраска цветка изменилась в интродуцированных разновидностях розы, вне зависимости от разновидности.
Для изменения окраски цветка розы, имеющей товарную ценность, естественно желательно повысить содержание дельфинидина в лепестках, но также важно не оказывать нежелательного воздействия на рост розы. Также существенно проведение перекрестного скрещивания с использованием в качестве родителя розы, рекомбинантной по гену высокой экспрессии дельфинидина. Другими словами, для разновидности жизнеспособной садовой розы необходима трансформация плазмидой содержащей специфическую комбинацию специфического высокоэкспрессирующего промотора, позволяющего осуществить высокую экспрессию F3'5'H, и F3'5'H, имеющего специфическую последовательность, которые позволяют максимизировать содержание дельфинидина в лепестках.
Также в PTL 4 описывается перенос гена F3'5'H, полученного из анютиных глазок, в разновидности хризантемы Improved Reagan и Dark Splendid Reagan с использованием промотора халькон синтазы розы, на основании чего была получена рекомбинантная хризантема, в которой запасалось 50% и более дельфинидина, и имеющая окраску цветков, измененную на синий.
В PTL 5, при экспрессии генов F3'5'H, полученных из колокольчика, вербены, цинерарии, анютиных глазок, петунии и лобелии, в хризантемах разновидности 94-765, с использованием промотора гена флаванон 3-гидролазы хризантемы и 5'-нетранслируемой области гена алкогольдегидрогеназы табака, гены F3'5'H, полученные из колокольчика, вербены, цинерарии и анютиных глазок, функционируют относительно удовлетворительно, вырабатывая дельфинидин на уровне 25% или больше от общего количества антоцианидинов. В той же публикации утверждается, что среди них, ген F3'5'H, полученный из колокольчика, в хризантеме функционирует наиболее удовлетворительно, вырабатывая 50% и больше дельфинидина.
Mac 1-промотор, который является конститутивным промотором, промотор гена халькон синтазы из львиного зева, который является промотором, специфичным для лепестков, и промотор гена халькон синтазы из петунии, который является промотором, специфичным для лепестков, были использованы для экспрессии гена F3'5'H петунии в гвоздике. В данном случае, два различных промотора, специфичных для лепестков, вырабатывают большие количества дельфинидина, чем промотор Macl (см. PTL 6). Было продемонстрировано, что в лепестках гвоздики промотор гена DFR петунии или промотор гена антоцианидин синтазы являются эффективными для переноса экзогенных генов (см. PTL 7 и 8). В качестве других промоторов, специфичных для лепестков, сообщали о промоторе гена F3'5'H анютиных глазок (см. PTL 9), промоторе гена трансферазы антоцианин 3-ацильных групп (см. PTL 10) и промоторе гена F3'5'H цинерарии (см. PTL 11).
Как упоминалось выше, хотя для выработки дельфинидина ген F3'5'H может быть экспрессирован в различных разновидностях растений, трудно спрогнозировать, какой промотор должен быть использован для экспрессии полученного из растений гена F3'5'H в клетке-мишени для выработки дельфинидина с высокой эффективностью, т.е. с содержанием дельфинидина 80% или больше, предпочтительно 85% или больше, более предпочтительно 90% или больше, еще более предпочтительно 95% или больше, от общего количества антоцианидинов, и необходимо проводить эксперименты методом проб и ошибок или достаточно сложную экспериментальную работу.
Кроме того, для изменения окраски цветов на синий, в общем, необходимо увеличить содержание дельфинидина на 50% или больше, предпочтительно, на 60% или больше, более предпочтительно на 70% или больше, более предпочтительно на 80% или больше, более предпочтительно на 85% или больше, более предпочтительно на 90% или больше, более предпочтительно на 95% или больше, более предпочтительно на 99% или больше, и наиболее предпочтительно на 100%, от общего количества антоцианидинов, а простая сверхэкспрессия гена F3'5'H, как правило, недостаточна для данной цели. В случае гвоздики, например, экспрессия гена F3'5'H и гена DFR петунии в белой гвоздике, которая утратила дигидрофлавонол 4-редуктазу (DFR), дает в результате около 100% дельфинидина, с получением рекомбинантной гвоздики с окраской цветов, измененной на синий (см. PTL 12). Сверхэкспрессия полученного из анютиных глазок гена F3'5'H и полученного из ириса гена DFR в розе, одновременно с подавлением экспрессии гена DFR розы, дает в результате содержание дельфинидина около 100% с получением рекомбинантной розы, с окраской цветов измененной на синюю (см. PTL 3). Повышение содержания дельфинидина также было достигнуто путем сверхэкспрессии полученного из анютиных глазок гена F3'5'H в хризантеме, с одновременным подавлением экспрессии гена F3'H хризантемы (см. PTL 4).
Список процитированной литературы
Документы Патентной Литературы
[PTL 1] Патентная Публикация Японии No. 3403196 (WO 93/18155)
[PTL 2] WO 2004/020637
[PTL 3] WO 2005/017147
[PTL 4] WO 2009/062253
[PTL 5] WO 2010/122849
[PTL 6] WO 94/28140
[PTL 7] WO 96/036716
[PTL 8] WO 2009/062259
[PTL 9] WO 2010/122850
[PTL 10] PCT/JP2010/053886
[PTL 11] PCT/JP2010/070516
[PTL 12] WO 06/36716
[Непатентная литература]
[NPL 1] Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(1), 161-165, 2003
[NPL 2] Plant Biotechnology 2006, 23, 5-11
[NPL 3] Plant Cell Physiol. (1996) 37: 49-59
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблемы, решаемые изобретением
В свете данных обстоятельств, проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в обеспечении трансформационной плазмиды, содержащей специфическую комбинацию специфического высокоэкспрессирующего промотора, позволяющего осуществить высокую экспрессию F3'5'H, и F3'5'H, имеющего специфическую последовательность, которая позволяет максимизировать содержание дельфинидина в лепестках в жизнеспособной разновидности садовой розы. Средства решения проблем
Авторы провели много исследований и экспериментов, направленных на решение данной проблемы, и в результате реализовали изобретение, обнаружив, что можно получить растение трансформированной розы, запасающей в лепестках дельфинидин на высоком уровне, путем трансформации специфической разновидности растений розы способом с Agrobacterium с использованием плазмиды, содержащей ген F3'5'H колокольчика, имеющего специфическую последовательность, под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты.
В частности, настоящее изобретение представляет собой следующее.
[1] Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из нижеследующих (а)-(d):
(a) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1;
(b) полинуклеотид, идентичный, по меньшей мере, на 97% по последовательности полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1, или комплементарной ему нуклеотидной последовательности, кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы,
(c) полинуклеотид, кодирующий белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 2; и
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 97% аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 2, и имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы.
[2] Плазмида, с которой функционально связан полинуклеотид по [1] выше под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты.
[3] Плазмида по [2] выше, с которой дополнительно функционально связан nos-терминатор.
[4] Способ получения трансформированного растения розы или его потомства, имеющего содержание дельфинидина 80% или больше в лепестках, путем трансформации разновидности садовой розы (Rosa hybrida) методом с Agrobacterium с использованием плазмиды по [2] или [3] выше.
[5] Способ по [4] выше, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет 85% или больше.
[6] Способ по [5] выше, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет 90% или больше.
[7] Способ по [6] выше, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет 95% или больше.
[8] Растение трансформированной розы или ее потомство, полученное способом по любому из [4]-[7] выше. Эффект изобретения
Путем трансформации с использованием плазмиды, содержащей ген флавоноид 3',5'-гидроксилазы колокольчика по изобретению под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты способом с Agrobacterium, возможно значимо повысить содержание дельфинидина в лепестках разновидностей садовой розы. Лучший вариант осуществления изобретения
Полинуклеотид по изобретению (SEQ ID NO: 1) кодирует полученный из колокольчика F3'5'H, и состоит из 521 остатка. По всему настоящему описанию термин «полинуклеотид» относится к ДНК или РНК. Полинуклеотид изобретения не ограничен полинуклеотидом с нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1 или кодирующей белок, содержащий соответствующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2), и может быть выбран среди полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность или комплементарную ей последовательность, или полинуклеотиды, кодирующие белки, имеющие гомологию к конкретной последовательности и предпочтительно идентичность последовательности, с аминокислотной последовательностью, и обладающий активностью флавоноид 3',5'-гидролазы. Предпочтительно это полинуклеотид, последовательность которого идентична, по меньшей мере, на 97%.
Полинуклеотид изобретения является молекулой ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1 в жестких условиях и которая кодирует белок с активностью флавоноид 3',5'-гидролазы. В данном документе термин «полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях» при использовании по всему настоящему описанию означает полинуклеотид, полученный, например, методом гибридизации на колониях, методом гибридизации бляшек или методом гибридизации по Саузерну, с использованием в качестве зонда всего или части полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1 или комплементарную ей нуклеотидную последовательность. Используемый способ гибридизации может быть, например, способом, описанным в «Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001» or «Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997".
Термин «жесткие условия», используемый по всему настоящему описанию, может быть слабо-жесткими условиями, умеренно жесткими условиями или сильно жесткими условиями. В данном документе «слабо жесткие условия» являются, например, условиями 5 × SSC, 5 × раствора Денхарта, 0,5% SDS, 50% формамида, 32°С. Также «умеренно жесткие условия» являются, например, условиями 5 × SSC, 5 × раствора Денхарта, 0,5% SDS, 50% формамида, 42°С. «Сильно жесткие условия» являются, например, условиями 5 × SSC, 5 × раствора Денхарта, 0,5% SDS, 50% формамида, 50°С, а особенно 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°С или 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 70°C. В таких условиях можно ожидать, что ДНК, имеющая высокую гомологию, будет получена более эффективно с ростом температуры. Однако есть много потенциальных факторов влияющих на жесткость гибридизации, включая температуру, концентрацию зонда, длину зонда, ионную силу, время и концентрацию соли, и схожие условия жесткости могут быть созданы путем соответствующего выбора этих факторов специалистом в данной области.
Аминокислотная последовательность, кодируемая полинуклеотидом изобретения, может иметь делению, замену и/или вставку одной или нескольких аминокислот, при условии, что активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы сохраняется.
По всему настоящему описанию, термин «идентичность» и «гомология» означают для полипептидных последовательностей (или аминокислотных последовательностей) или полшгуклеотидных последовательностей (или нуклеотидных последовательностей) количество (число) аминокислотных остатков или нуклеотидов, составляющих их, которые могут быть определены как идентичные между двумя цепями, с точки зрения взаимного соответствия между ними, что означает степень корреляции последовательности между двумя полипептидными последовательностями или двумя полинуклеотидными последовательностями, а «идентичность» и «гомология» могут быть легко рассчитаны. Известны многочисленные способы измерения гомологии между двумя полинуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями и термины «идентичность» и «гомология» хорошо известны специалистам (например, см. Lesk, A.M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D.W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A.M. & Grifin, H.G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) и другие источники).
Также численные величины для «идентичность» и «гомология», используемые в настоящем описании, если не указано иное, могут быть числовыми значениями, рассчитанными с использованием программы поиска гомологии, известной специалистам в данной области, но предпочтительно они являются числовыми значениями, рассчитанными с использованием программы ClustalW из Mac Vector Application (версия 9.5, Oxford Molecular Ltd., Оксфорд, Англия).
Полинуклеотид (нуклеиновая кислота, ген) изобретения «кодирует» представляющий интерес белок. Здесь «кодирует» означает возможность осуществления экспрессии представляющего интерес белка в состоянии, в котором он проявляется свою активность. Также термин «кодирует» включает как кодирование структурной последовательности (экзона), который является непрерывным участком представляющего интерес белка, так и кодирование через промежуточную последовательность (интрона).
Ген, имеющий естественную нуклеотидную последовательность, может быть получен путем анализа с помощью ДНК-секвенатора, например, как описано в примере ниже. Также ДНК, кодирующие ферменты, обладающие модифицированной аминокислотной последовательностью, могут быть синтезированы с использованием сайт-специфического мутагенеза или ПЦР, на основе ДНК, имеющей естественную нуклеотидную последовательность. Например, модифицируемый фрагмент ДНК может быть получен обработкой рестрикционными ферментами естественной кДНК или геномной ДНК, и использован в качестве матрицы для сайт-специфического мутагенеза или ПЦР с использованием праймеров с искомой мутацией, для получения фрагмента ДНК, обладающего искомой модификацией. Фрагмент ДНК, имеющий мутацию, затем может быть связан с ДНК-фрагментом, кодирующим другую часть целевого фермента.
В ином случае, для получения ДНК, кодирующей фермент, содержащий укороченную аминокислотную последовательность, например, аминокислотная последовательность, которая длиннее, чем целевая аминокислотная последовательность, например, ДНК, кодирующая полноразмерную аминокислотную последовательность, разрезается выбранными рестрикционными ферментами, и если полученный фрагмент ДНК не кодирует целую аминокислотную последовательность, ДНК-фрагмент, содержащий утраченную часть последовательности может быть синтезирован и связан с ним.
Полинуклеотид изобретения вставляется в плазмиду вместе с 35S промотором вируса мозаики цветной капусты. 35S промотор предпочтительно является Е12 35S промотором (выше) обладающим повышенной экспрессией из-за связывания с двумя энхансерными последовательностями в тандеме с 35S промотором, обычно используемым в растительных трансформантах. Полинуклеотид изобретения и 35S промотор связаны функциональным образом, например, с представляющим интерес полинуклеотидом, расположенным за промотором. Плазмида изобретения используется для трансформации разновидности садовой розы.
Для целей изобретения термин «разновидность садовой розы» относится к растениям Rosa из семейства Rosaceae (научное название: Rosa hybridd) в рамках таксономической классификации. Разновидности садовой розы главным образом классифицируются как розы Hybrid Tea, Floribunda и Polyantha на основании их трех форм и размера цветка, при этом основной пигмент (антоцианин) в лепестках во всех линиях принадлежит к двум типам, цианидину и пеларонидину. Изобретение является методом преобразования основного антоцианина в лепестках розы в тип дельфинидина, и такие разновидности и линии пригодны для использования. Изобретение может быть применено к разновидностям цианидинового типа (например, Cool Water, Ocean Song и Fame), или разновидностям пеларгонидинового типа (например, Noblesse, Topless и Peach Avalanche).
Плазмида изобретения может дополнительно содержат непромоторные факторы, например, регуляторные последовательности, такие как терминаторы, последовательности сигналов полиаденилирования и последовательности начала репликации (ori); и селективные маркеры, такие как маркеры лекарственной устойчивости, флуоресцентные белковые маркеры, ферментативные маркеры и маркеры-рецепторы клеточной поверхности. Терминатор предпочтительно является nos-терминатором, расположенным за представляющим интерес полинуклеотидом. По всему настоящему описанию «nos-терминатор» относится к терминаторной последовательности гена нопалин-синтазы из Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens.
Примеры
Настоящее изобретение далее будет объяснено более подробно с помощью примеров.
Пример 1: выделение кДНК F3'5'H Колокольчика
Два праймера CamF1 (5'-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3', SEQ ID NO: 3) и CamR1 (5'-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3', SEQ ID NO: 4) синтезировали на основе транслированной последовательности кДНК F3'5'H колокольчика (Campanula medium), зарегистрированной в базе данных GenBank (Учетный номер D14590). РНК экстрагировали из лепестков в стадии бутонизации коммерчески доступного колокольчика с использованием набора «RNeasy Mini Plant Kit» (Qiagen), а набор для OT-ПЦР использовали для синтеза 1-й цепи ДНК. 1-ю цепь ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с использованием вышеупомянутых праймеров. Полученный фрагмент ДНК клонировали в pCR-TOPO II. Нуклеотидную последовательность Клона #4 (pSPB2561) анализировали на ДНК-секвенаторе (SEQ ID NO: 1). Хотя F3'5'H, зарегистрированный с учетным номером D14590, состоит из 523 остатков, F3'5'H, кодируемый клоном #4, состоит из 521 остатка, и, таким образом, демонстрирует 96% идентичность последовательности с F3'5'H, зарегистрированной как D14590.
Эталонный Пример 1: Введение pSPB130 в разновидность розы «Cool Water» (Конститутивная экспрессия полученного из анютиных глазок гена F3'5'H и полученного из торении гена 5AT)
Бинарный вектор pSPB130, описанный в PTL 3 (вектор, конститутивно экспрессирующий в растениях ген F3'5'H из анютиных глазок и ген антоцианин 5-ацилтрансферазы из торении) вводили в Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) Agl0. Трансформированные Agrobacterium вводили в разновидность розы розовато-лилового цвета «Cool Water», способом, описанным в PTL 3, с получением 164 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 51 из 164 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 76,1% (среднее: 36,6%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 1 ниже.
Del: дельфинидин, Cya: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 2: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Cool Water» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Экспрессирующую кассету, содержащую кДНК гена колокольчика F3'5'H, полученную в Примере 1, и вставленную между промотором Е12 35S, описанным в PTL 3, и терминатором нопалинсинтазы (nos-терминатором), вставляли в бинарный вектор pBinPLUS (van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995), и полученную плазмиду обозначали как pSPB2564. Эту pSPB2564 вставляли в Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) Agl0. Трансформированные Agrobacterium использовали для трансформации разновидности роз розовато-лилового цвета «Cool Water», способом, описанным в PTL 3, с получением 55 трансформантов. Анализ антопианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 48 из 55 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 97,3% (среднее: 61,22%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 2 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 3: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Fame» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации розовой разновидности розы «Fame», с получением 114 трансформантов. Запасание дельфинидина было подтверждено в 46 из 107 индивидуумов, подвергнутых анализу пигментов антиоцианидинов в лепестках, с максимальным содержанием дельфинидина 98,9% (среднее: 51,2%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 3 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 4: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Fame» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации розовой разновидности розы «Fame», с получением 55 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 28 из 55 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 98,9% (среднее: 51,4%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 4 ниже.
Del: дельфинидин, Cya: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 5: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Noblesse» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации оранжево-розовой разновидности розы «Noblesse», с получением 3 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина во всех 3 индивидуумах, с максимальным содержанием дельфинидина 98,9% (среднее: 51,4%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 5 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 6: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Ocean Song» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации разновидности роз розовато-лилового цвета «Ocean Song», с получением 40 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 33 из 40 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 99,2% (среднее: 39,7%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 6 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 7: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Peach Avalanche» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации светло оранжево-розовой разновидности розы «Peach Avalanche», с получением 11 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 1 из 11 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 99,3%.
Значения анализа для трансформантов, в которых выработка дельфинидина был подтверждена, показаны в Таблице 7 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Пример 8: Введение pSPB2564 в разновидность розы «Topless» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора Е12 35S)
Agrobacterium с введенной pSPB2564 использовали для трансформации оранжево-розовой разновидности розы «Topless», с получением 11 трансформантов. Анализ антоцианидиновых пигментов лепестков подтвердил запасание дельфинидина в 10 из 11 индивидуумов, с максимальным содержанием дельфинидина 99,4% (среднее: 64,4%).
Значения анализа для трансформантов, в которых выработка дельфинидина был подтверждена, показаны в Таблице 8 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Эталонный Пример 2: Введение pSPB5202 в разновидность розы «Fame» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора F3'5'H, полученного из анютиных глазок)
Последовательность промотора F3'5'H из анютиных глазок, полученная расщеплением плазмиды pSFL620, описанной в PTL 9, с помощью HindIII и PstI и кДНК последовательность из колокольчика, полученную в Примере 1, объединяли с терминатором белка теплового шока из плазмиды pRI201-AN (Takara Bio, Inc.) и вставляли в бинарный вектор pBinPlus. Полученный бинарный вектор был обозначен как pSPB5202. Этот pSPB5202 вставляли в Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) Agl0. Трансформированные Agrobacterium использовали для трансформации разновидности розы розовато-лилового цвета «Fame», способом, описанным в PTL 3, с получением 56 трансформантов. Запасание дельфинидина могло быть подтверждено в 4 из 52 индивидуумов, подвергнутых анализу пигмента антиоцианидина в лепестках, с максимальным содержанием дельфинидина 10,8% (среднее: 3,9%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 9 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Несмотря на то, что промотор F3'5'H из анютиных глазок удовлетворительно экспрессирует ген F3'5'H из анютиных глазок в розе (см. PTL 9), а терминатор белка теплового шока очень эффективен для экспрессии инородных белков в растениях (Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332), в трансформированных лепестках розы были обнаружены только очень низкие уровни выработки дельфинидина, что подтверждает, что ген F3'5'H колокольчика не может функционировать достаточным образом. Это указывает на то, что для эффективной выработки дельфинидина в конкретных разновидностях розы необходимо выбрать комбинацию специфического промотора и специфического гена F3'5'H, или комбинацию специфического промотора, специфического гена F3'5'H и специфического терминатора гена.
Эталонный Пример 3: Введение pSPB5204 в разновидность розы «Fame» (Экспрессия полученного из колокольчика гена F3'5'H под контролем промотора F3'5'H, полученного из периллы)
В результате расщепления плазмиды pSFL205, описанной в PTL 10, HindIII и BamHI, был извлечен примерно 1,1 тыс.о. ДНК-фрагмент, содержащий полученный из периллы участок промотора антоцианин 3-ацилтрансферазы, который соединяли с pBinPlus, гидролизованной HindIII и BamHI, с получением pSPB3756. Также с помощью ПНР с использованием плазмиды pSPB3311, описанной в PTL 10, в качестве матрицы и трех различных синтетических нуклеотидных праймеров: Pf3AT-FW-Sal (5'-ATGTCGACTAAATGTATGTAATTAAC-3', SEQ ID NO: 5), Pf3ATt-R1 (5'-ACTCAACACTTTATTAATTG-3', SEQ ID NO: 6) and Pf3ATt-F1 (5'-ATGTAACAATTAATTAAGTG-3', SEQ ID NO: 7), добавляли участок распознавания рестрикционного фермента Sali на 5'-конец полученного из периллы участка терминатора антоцианин ацилтрансферазы, а участок распознавания Paci на 5'-конце в том же участке терминатора разрушали. Фрагмент ДНК, полученный с помощью ПЦР, клонировали в рТОРО. Фрагмент ДНК, полученный расщеплением полученной плазмиды с помощью ΚpnΙ и PacI, связали с фрагментом ДНК, полученным расщеплением pSPB3756 с фрагментом ДНК, полученным расщеплением pSPB3756 с ΚpnΙ и PacI, с получением pSPB5201. Плазмиду pSPB5201, расщепленную SmaI и SpeI, связывали с кДНК колокольчика, полученной в Примере 1, и полученный бинарный вектор обозначили как pSPB5204. Этот pSPB5204 вводили в Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) Agl0. Трансформированные Agrobacterium использовали для трансформации розовой разновидности розы «Fame» способом, описанным в PTL 3, с получением 63 трансформантов. Запасание дельфинидина могло быть подтверждено только в 8 из 61 индивидуумов, подвергнутого анализу пигмента в лепестках, с максимальным содержанием дельфинидина 2,8% (среднее: 1,3%).
Значения анализа для репрезентативных трансформантов показаны в Таблице 10 ниже.
Del: дельфинидин, Суа: цианидин, Pel: пеларгонидин
Содержание дельфинидина: Доля дельфинидина от общего количества антоцианидинов.
Несмотря на то, что промотор антоцианин 3-ацилтрансферазы из периллы удовлетворительно экспрессирует ген антоцианин 3-ацилтрансферазы из периллы в розе, петунии и хризантеме (см. PTL 9), в лепестках таких трансформантов розы вырабатывались только очень низкие уровни дельфинидина, что подтверждает, что ген F3'5'H колокольчика не может функционировать достаточным образом. Это указывает на то, что для эффективной выработки дельфинидина в розе необходимо выбрать комбинацию специфического промотора и специфического гена F3'5'H, или комбинацию специфического промотора, специфического гена F3'5'H и специфического терминатора гена.
Промышленная применимость
Путем трансформации с использованием плазмиды, содержащей ген флавоноид 3',5'-гидроксилазы колокольчика по изобретению под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты с помощью способа с Agrobacterium, можно значимо повысить содержание дельфинидина в лепестках разновидностей садовой розы. Таким образом, изобретение может быть соответствующим образом использовано для получения растений розы с измененной окраской цветка.
Claims (20)
1. Способ получения трансформированного растения розы, имеющего повышенное содержание в лепестках дельфинидина по сравнению с нетрансформированным растением розы, включающий стадию трансформации разновидности садовой розы (Rosa hybrida) методом с Agrobacterium с использованием плазмиды, содержащей полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а)-(d):
(a) полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1;
(b) полинуклеотид, имеющий последовательность, по меньшей мере на 97% идентичную полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1, и кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы,
(c) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 2; и
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 97% аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 2, и имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы,
и 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
2. Способ по п. 1, в котором указанная плазмида дополнительно содержит терминатор nos, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 85% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
4. Способ по п. 3, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 90% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
5. Способ по п. 4, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 95% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
6. Трансформированное растение розы, которое содержит высокое количество дельфинидина в лепестках по сравнению с нетрансформированным растением розы, содержащее полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из следующих (а)-(d):
(a) полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1;
(b) полинуклеотид, имеющий последовательность, по меньшей мере на 97% идентичную полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 1, и кодирующий белок, имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы,
(c) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO: 2; и
(d) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 97% аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO: 2, и имеющий активность флавоноид 3',5'-гидроксилазы,
и 35S промотор вируса мозаики цветной капусты, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
7. Трансформированное растение розы по п. 6, дополнительно содержащее терминатор nos, функционально связанный с указанным полинуклеотидом.
8. Трансформированное растение розы по п. 6 или 7, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 85% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
9. Трансформированное растение розы по п. 8, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 90% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
10. Трансформированное растение розы по п. 9, в котором содержание дельфинидина в лепестках составляет от 95% или до около 100% от общего содержания антоцианидинов.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012-092716 | 2012-04-16 | ||
| JP2012092716 | 2012-04-16 | ||
| PCT/JP2013/061116 WO2013157502A1 (ja) | 2012-04-16 | 2013-04-12 | 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2014145832A RU2014145832A (ru) | 2016-06-10 |
| RU2640248C2 true RU2640248C2 (ru) | 2017-12-27 |
Family
ID=49383459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014145832A RU2640248C2 (ru) | 2012-04-16 | 2013-04-12 | Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20150074855A1 (ru) |
| EP (1) | EP2845901A4 (ru) |
| JP (1) | JP6157454B2 (ru) |
| KR (1) | KR101540074B1 (ru) |
| CN (1) | CN104245934A (ru) |
| CA (1) | CA2870428A1 (ru) |
| CO (1) | CO7131376A2 (ru) |
| RU (1) | RU2640248C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013157502A1 (ru) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6782450B2 (ja) | 2015-07-01 | 2020-11-11 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 青系花色を有するキクの作出方法 |
| CN108777947B (zh) * | 2016-03-31 | 2022-11-11 | 三得利控股株式会社 | 具有蓝色系花色的植物及其制作方法 |
| JP7246314B2 (ja) * | 2017-10-03 | 2023-03-27 | サントリーホールディングス株式会社 | 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法 |
| CN113862288B (zh) * | 2021-10-25 | 2023-06-20 | 杭州市农业科学研究院 | 三叶青ThF3’5’H基因及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2130491C1 (ru) * | 1988-03-08 | 1999-05-20 | Новартис Аг | Фрагмент днк (варианты), слитый фрагмент днк для экспрессии в растениях и способ получения трансгенного растения и его потомков |
| WO2012036290A1 (ja) * | 2010-09-17 | 2012-03-22 | サントリーホールディングス株式会社 | 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3403196B2 (ja) | 1992-03-02 | 2003-05-06 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規植物遺伝子 |
| CA2163220A1 (en) | 1993-05-20 | 1994-12-08 | Timothy Albert Holton | Transgenic flowering plants |
| AUPN298895A0 (en) | 1995-05-16 | 1995-06-08 | International Flower Developments Pty Ltd | Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same |
| ES2426757T3 (es) | 2002-08-30 | 2013-10-25 | Suntory Holdings Limited | Secuencias genéticas de flavonoide 3',5'-hidroxilasa y usos de las mismas |
| SG146636A1 (en) | 2003-08-13 | 2008-10-30 | Int Flower Dev Pty Ltd | Process for producing rose with modified color |
| US7268889B2 (en) | 2004-09-22 | 2007-09-11 | Corning Incorporated | Phase-resolved measurement for frequency-shifting interferometry |
| JP5582504B2 (ja) * | 2007-11-15 | 2014-09-03 | サントリーホールディングス株式会社 | 遺伝子改変キク |
| AU2008323629B2 (en) | 2007-11-15 | 2014-06-05 | Suntory Holdings Limited | Genetically modified plants with altered inflorescence |
| JP2010053886A (ja) | 2008-08-26 | 2010-03-11 | Jtekt Corp | スラストころ軸受の保持器 |
| JP5303229B2 (ja) | 2008-09-19 | 2013-10-02 | 花王株式会社 | 油性固形アイライナー組成物 |
| CN102421904B (zh) | 2009-04-24 | 2014-09-17 | 三得利控股株式会社 | 生产花瓣中含有经过修饰的花色素苷的菊花植物的方法 |
| EP2423312B1 (en) * | 2009-04-24 | 2016-10-19 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization | Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals |
-
2013
- 2013-04-12 CA CA2870428A patent/CA2870428A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-12 KR KR1020147027030A patent/KR101540074B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-12 CN CN201380020230.8A patent/CN104245934A/zh active Pending
- 2013-04-12 JP JP2014511199A patent/JP6157454B2/ja active Active
- 2013-04-12 WO PCT/JP2013/061116 patent/WO2013157502A1/ja active Application Filing
- 2013-04-12 US US14/394,329 patent/US20150074855A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-12 EP EP13777591.2A patent/EP2845901A4/en not_active Withdrawn
- 2013-04-12 RU RU2014145832A patent/RU2640248C2/ru active
-
2014
- 2014-11-13 CO CO14251782A patent/CO7131376A2/es unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2130491C1 (ru) * | 1988-03-08 | 1999-05-20 | Новартис Аг | Фрагмент днк (варианты), слитый фрагмент днк для экспрессии в растениях и способ получения трансгенного растения и его потомков |
| WO2012036290A1 (ja) * | 2010-09-17 | 2012-03-22 | サントリーホールディングス株式会社 | 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KATSUMOTO Y. et al., Engineering of the Rose Flavonoid Biosynthetic Pathway Successfully Generated Blue-Hued Flowers Accumulating Delphinidin, Plant Cell Physiol, 2007, Vol.48, N.11, pp.1589-1600. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140135789A (ko) | 2014-11-26 |
| JP6157454B2 (ja) | 2017-07-05 |
| CA2870428A1 (en) | 2013-10-24 |
| KR101540074B1 (ko) | 2015-07-28 |
| CN104245934A (zh) | 2014-12-24 |
| CO7131376A2 (es) | 2014-12-01 |
| EP2845901A1 (en) | 2015-03-11 |
| RU2014145832A (ru) | 2016-06-10 |
| EP2845901A4 (en) | 2016-01-27 |
| WO2013157502A1 (ja) | 2013-10-24 |
| JPWO2013157502A1 (ja) | 2015-12-21 |
| US20150074855A1 (en) | 2015-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0929676B1 (en) | Genetic sequences encoding flavonoid pathway enzymes and uses therefor | |
| EP2143322B1 (en) | Method for production of moth orchid having modified flower color | |
| EP2423312B1 (en) | Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals | |
| RU2640248C2 (ru) | Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение | |
| TWI471090B (zh) | Commelina and other flavonoids 3 ', 5'-hydroxylase gene | |
| EP2123750A1 (en) | Novel protein having acyltransferase activity and gene encoding the same | |
| RU2590722C2 (ru) | Способ получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин | |
| JPWO2006057462A1 (ja) | 花弁の有色体へ移行するペプチド及び該ペプチドを用いる黄色系の花弁を有する植物の作成方法 |