KR20140135789A

KR20140135789A - 신규 캄파눌라 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 유전자 및 그의 사용

Info

Publication number: KR20140135789A
Application number: KR1020147027030A
Authority: KR
Inventors: 요시카즈 다나카; 유키히사 가쓰모토
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2012-04-16
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2014-11-26
Also published as: CO7131376A2; RU2640248C2; CA2870428A1; RU2014145832A; JPWO2013157502A1; JP6157454B2; WO2013157502A1; EP2845901A1; EP2845901A4; CN104245934A; KR101540074B1; US20150074855A1

Abstract

신규 캄파눌라 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 유전자 및 이 유전자를 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에 포함하는 플라스미드의 제공.

Description

신규 캄파눌라 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 유전자 및 그의 사용{NOVEL CAMPANULA FLAVONOID 3',5'-HYDROXYLASE GENE AND USE OF SAME}

본 발명은 식물 세포에 외래의 유전자를 도입하여 유전자 조작을 하는 기술에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 신규 캄파눌라 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 유전자 및 이 유전자를 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에 포함하는 플라스미드, 이 플라스미드를 이용한 아그로박테리움법에 따른 형질 전환에 의한, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량을 현저하게 높일 수 있는 원예종 장미 식물의 제조 방법에 관한 것이다.

식물의 품종 개량 방법에는 (i) 수술과 암술을 교배시키는 교잡, (ii) 자연적으로 또는 인위적으로 생기는 돌연 변이, (iii) 유전자 재조합 등의 방법이 있다. 이 중, 유전자 재조합 기술을 이용하면, 그 종이 가진 유전적 제약에 속박되지 않고, 유용한 유전자를 목적으로 하는 식물에서 발현시킴으로써, 그 식물에 새로운 형질을 부여하는 것이 가능해진다. 이와 같이 하여 제작된 유전자 재조합 식물은 이미 세계적으로 광범위하게 재배되고 있다.

꽃의 색의 성분에는 안토시아닌, 카르테노이드, 베타레인 등이 있다. 안토시아닌은 플라보노이드로 총칭되는 2차 대사물 중 하나인데, 페닐알라닌으로부터 많은 효소의 작용에 의하여 합성된다. 안토시아닌의 색은 그 구조에 의존한다. 즉, 안토시아닌의 발색단인 안토시아니딘의 B환의 수산기의 수가 증가할수록 파랗게 된다. 주요한 안토시아니딘인 델피니딘, 시아니딘, 펠라르고니딘은 이 순서대로 B환의 수산기의 수가 많다. 많은 파란 꽃에는 델피니딘에 유래하는 안토시아닌이 축적되어 있다. 또한, 안토시아닌을 수식하는 방향족 아실기 (쿠마로일기, 카페오일기 등)의 수가 증가하면 안토시아닌의 색은 파랗게 되고 (즉, 흡수 최대 값이 장파장으로 시프트한다), 또한, 안토시아닌의 안정성이 증가하는 것이 알려져 있다. 특히, 복수의 방향족 아실기가 결합된 안토시아닌은 폴리아실화 안토시아닌으로 불리고, 용담이나 접두화 등이 파란 꽃잎에 포함된다 (Plant J. 54, 737-749, 2008 참조). 안토시아닌의 그의 생합성에 관련되는 효소나 그것을 코드하는 유전자는 이미 많은 식물로부터 단리되어 있다 (Plant J. 54, 737-749, 2008 참조). 안토시아닌의 색은 그것이 국부적으로 존재하는 액포의 pH나, 그 밖의 플라보노이드, 금속 이온 등의 존재에도 의존한다. 즉, 안토시아닌은 액포의 pH가 낮으면 붉고, 중성이면 파랗게 변화한다. 플라본이나 플라보놀은 코피그먼트라고도 불리는데, 안토시아닌과 공존하면 안토시아닌을 파랗게 보이게 하는 효과가 있다. 또한, 철이나 알루미늄 이온은 안토시아닌의 B환의 수산기에 배위함으로써, 안토시아닌을 파랗게 하는 것이 알려져 있다.

식물은 다양한 색의 꽃을 피우지만, 모든 색이 꽃을 피울 수 있는 종은 적다. 이것은 종에 의하여 합성할 수 있는 색소가 유전적으로 정해져 있기 때문이다. 예를 들면, 장미, 카네이션, 국화, 백합, 거베라 등에는, 천연에는 파란색이나 보라색의 품종은 없다. 그 큰 이유는 이 식물들은 델피니딘을 합성하기 위하여 필요한 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 (이하, 「F3＇5＇H」라고도 한다.) 유전자를 가지고 있지 않기 때문이다. F3＇5＇H 유전자를 꽃잎 중에서 발현시킴으로써, 델피니딘을 생산하여, 꽃의 색을 파랗게 하고자 하는 시도가 몇가지 보고되어 있다. 이 연구들로부터, 꽃잎 중의 델피니딘 함유율을 높여 꽃의 색을 파란 방향으로 바꾸려면, 이하에 설명하는 바와 같이, 종마다 적절한 프로모터와 적절한 F3＇5＇H 유전자를 선택하는 것이 중요하다는 것을 알 수 있지만, 그 선택은 예측하기가 곤란하다.

F3＇5＇H가 결손되어 있는 페튜니아에 있어서 F3＇5＇H 유전자를 발현시키면 델피니딘에 유래하는 안토시아닌량이 증가한다 (Nature, 1993, 366, 276-279, FEBS Lett. 1999, 461, 241-245). 또한, 시아니딘을 축적하는 담배 (Nicotiana tabacum)에서 F3＇5＇H 유전자를 발현시키면, 델피니딘이 합성되어 꽃의 색은 약간 파란색을 띤다 (FEBS Lett. 1999, 461, 241-245).

이하의 비특허 문헌 1에는 담배에 있어서, 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에서 캄파눌라, 리시안셔스, 페튜니아 유래의 F3＇5＇H 유전자를 발현시켰을 경우, 캄파눌라 F3＇5＇H 유전자가 가장 효율적으로 델피니딘을 제조하는 것이 기재되어 있다 (상기 비특허 문헌 1의 요약 참조).

특허 문헌 1에는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에서 페튜니아 유래의 F3＇5＇H 유전자를 장미에 도입하였다고 하는 기재가 있지만 ( 동 특허 문헌의 실시예 9 참조), 캄파눌라 유래의 F3＇5＇H 유전자는 담배에 있어서 도입되어 있는 것에 지나지 않고, 장미 식물체나 장미 꽃잎에서의 델피니딘의 생산, 꽃의 색의 변화에 대하여는 기재되어 있지 않다.

또한, 이하의 비특허 문헌 2에는 접두화과 바베나의 F3＇5＇H 유전자를 바베나에서 발현시켰을 경우, 접두화 유래의 유전자를 발현시켰을 경우가 델피니딘 제조 양이 많고, 꽃의 색도 명료하게 변화한 것이 기재되어 있다.

또한, 이하의 특허 문헌 2에는 페튜니아, 용담, 접두화, 사이네리아, 리시안셔스, 팬지, 라벤더 유래의 F3＇5＇H 유전자를 장미에서 발현시켰는데, 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자를 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 또는 장미 유래의 카르콘 합성 효소 유전자의 프로모터의 제어하에서 발현시켰을 경우에, 총안토시아니딘의 수십%의 델피니딘이 생성되고, 장미에서는 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자가 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 또는 장미 유래의 카르콘 합성 효소 유전자의 프로모터의 제어하에서 양호하게 기능하는 것이 기재되어 있다.

이하의 비특허 문헌 3에는 인핸서가 부가된 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S (El2 35S) 프로모터는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터보다, 외래 유전자를 고효율로 발현하는 것이 기재되어 있다. El2 35S 프로모터의 제어하에 있는 팬지 F3＇5＇H 유전자를 도입한 장미는 델피니딘을 생산하고, 꽃의 색은 변화한다. 도입하는 품종에 따라서는 델피니딘을 총 안토시아니딘 양의 95% 이상 포함하고, 꽃의 색이 청보라색으로 변화한 장미를 얻을 수 있으며, 이들 중 하나는 이미 시판되고 있다 (품종 등록 번호 제20992호).

또한, 이하의 특허 문헌 3에는 El2 35S 프로모터의 제어하에 있는 팬지 F3＇5＇H 유전자와 El2 35S 프로모터의 제어하에 있는 아이리스 디히드로 플라보놀 4-환원 효소 (이하,「DFR」이라고 한다.) 유전자와 장미 DFR의 2중(二重) 사슬 RNA를 전사하는 카세트를 도입한 장미에서는 도입 장미 품종 중에 있어서는 품종에 구애받지 않고, 델피니딘의 함유율이 100%에 가깝게 되고, 꽃의 색도 변화한 것이 기재되어 있다.

상품으로서 제공할 수 있는 장미의 꽃 색을 변화시키려면, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 많아지는 것은 당연하게 요구되지만, 장미의 생육에 악영향을 주지 않는 것이 중요하다. 이것은 델피니딘을 높게 발현하는 유전자 재조합 장미를 부모로서 사용하여 교배 육종할 때에도 중요하다. 바꾸어 말하면, 생육이 좋은 장미 원예종에 있어서, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량을 가능한 한 높일 수 있다, 즉, F3'5'H를 높게 발현할 수 있는 특정의 고발현 프로모터와 특정 배열을 가진 F3'5'H의 특정의 조합을 포함하는 형질 전환용 플라스미드를 필요로 한다.

그런데, 이하의 특허 문헌 4에는 국화 품종 임프루브드 레이간, 다크스프렌디드 레이간에 대하여는 장미의 카르콘 신타제 프로모터를 사용하여 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자를 전사시킴으로써, 델피니딘이 50% 이상 축적하고, 꽃의 색이 푸르게 변화한 유전자 재조합 국화를 얻을 수 있는 것이 기재되어 있다.

이하의 특허 문헌 5에 있어서는 국화 품종 94-765에 있어서는 캄파눌라, 바베나, 사이네리아, 팬지, 페튜니아, 로베리아 유래의 F3'5＇H 유전자를 국화 유래의 플라바논 3-수산화 효소 유전자 유래의 프로모터와 담배 알코올 디히드로게나제 유전자의 5＇ 비번역 영역을 이용하여 발현하였더니, 캄파눌라, 바베나, 사이네리아, 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자가 비교적 양호하게 기능하고, 총 안토시아니딘의 25% 이상의 델피니딘을 생성하였다. 상기 특허 문헌 5에는 이들 중에서 캄파눌라 유래의 F3＇5＇H 유전자가 국화에서는 가장 양호하게 기능하여, 50% 이상의 델피니딘을 생성한 것이 기재되어 있다.

구성적인 프로모터인 Mac1 프로모터, 꽃잎 특이적인 프로모터인 금어초 유래의 카르콘 합성 효소 유전자의 프로모터, 꽃잎 특이적인 프로모터인 페튜니아 유래의 카르콘 합성 효소 유전자의 프로모터가 페튜니아의 F3＇5＇H 유전자를 카네이션에서 발현시키기 위하여 사용되고 있다. 이 경우, 상기한 꽃잎 특이적인 2종의 프로모터는 Mac1 프로모터보다 많은 델피니딘을 생성하였다 (이하의 특허 문헌 6 참조). 카네이션의 꽃잎에 있어서는, 페튜니아 DFR 유전자의 프로모터나 안토시아니딘 합성 효소 유전자의 프로모터는 외래 유전자를 전사시키는 데 유효하다는 것이 나타나 있다 (각각, 이하의 특허 문헌 7과 8 참조). 그 밖의 꽃잎 특이적인 프로모터로서 팬지의 F3＇5＇H 유전자의 프로모터 (이하의 특허 문헌 9 참조), 차조기의 안토시아닌 3-아실기 전이 효소 유전자 프로모터 (이하의 특허 문헌 10 참조), 사이네리아 F3＇5＇H 유전자의 프로모터 (이하의 특허 문헌 11)가 보고되어 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 이종(異種)의 식물에 있어서 F3＇5＇H 유전자를 발현시켜서, 델피니딘을 제조시킬 수 있으나, 목적으로 하는 식물에 어느 식물 유래의 F3＇5＇H 유전자를 어느 프로모터를 이용하여 발현시키면 좋은 지를 예상하기는 곤란하며, 델피니딘을 고효율로 제조시키는, 즉, 전체 안토시아니딘의 양 중에서 델피니딘 함유율을 80% 이상, 좋기로는 85% 이상, 더 좋기로는 90% 이상, 더욱 좋기로는 95% 이상으로 하려면 시행 착오나 복잡 고도한 실험 등이 필요하다.

또한, 일반적으로, 꽃의 색을 파랗게 변화시키려면 델피니딘의 함유율을, 총안토시아니딘량의 50% 이상, 좋기로는 60% 이상, 더 좋기로는 70% 이상, 더 좋기로는 80% 이상, 더 좋기로는 85% 이상, 더 좋기로는 90% 이상, 더 좋기로는 95% 이상, 더 좋기로는 99% 이상, 가장 좋기로는 100%로 상승시킬 필요가 있는데, 그렇게 하기 위하여는 단지 F3＇5＇H 유전자를 과잉 발현시키는 것만으로는 불충분한 경우가 많다. 예를 들면, 카네이션의 경우에는 디히드로플라보놀 4-환원 효소 (DFR)가 결손되어 있는 흰 카네이션에, F3＇5＇H 유전자와 페튜니아 DFR 유전자를 발현시킴으로써 델피니딘은 약 100%가 되어, 꽃의 색도 파랗게 변화한 재조합 카네이션이 얻어졌다 (이하의 특허 문헌 12 참조). 장미에 있어서는 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자와 아이리스 유래의 DFR 유전자를 과잉 발현시키는 동시에, 장미의 DFR 유전자의 발현을 억제함으로써, 델피니딘 함유율이 거의 100%가 되고, 꽃의 색이 파랗게 변화한 재조합 장미가 얻어졌다 (이하의 특허 문헌 3 참조). 국화에 있어서는 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자를 과잉 발현시키는 동시에, 국화의 F3＇H 유전자의 발현을 억제함으로써, 델피니딘의 함유율을 상승시켰다 (이하의 특허 문헌 4 참조).

[특허 문헌 1] 일본 특허 제3403196호 공보 (WO93/18155) [특허 문헌 2] WO2004/020637 [특허 문헌 3] WO2005/017147 [특허 문헌 4] WO2009/062253 [특허 문헌 5] WO2010/122849 [특허 문헌 6] WO94/28140 [특허 문헌 7] WO96/036716 [특허 문헌 8] WO2009/062259 [특허 문헌 9] WO2010/122850 [특허 문헌 10] PCT/JP2010/053886 [특허 문헌 11] PCT/JP2010/070516 [특허 문헌 12] WO06/36716

[비특허 문헌 1] Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (1), 161-165, 2003 [비특허 문헌 2] Plant Biotechnology 2006, 23, 5-11 [비특허 문헌 3] Plant Cell Physiol. (1996) 37: 49-59

이와 같은 상황하에서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생육이 좋은 장미 원예종에 있어서, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량을 가능한 한 높일 수 있는, 즉, F3'5'H를 높게 발현할 수 있는 특정의 고발현(高發現) 프로모터와 특정 배열을 가진 F3'5'H의 특정의 조합을 포함한 형질 전환용 플라스미드를 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결할 수 있도록, 본원 출원인들은 예의 검토하여, 실험을 거듭한 결과, 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에 특정 배열을 가진 캄파눌라 유래의 F3＇5＇H 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 아그로박테리움법에 의하여 특정 품종의 장미 식물을 형질 전환한 결과, 꽃잎에서 고함유율의 델피니딘을 축적하는 형질 전환 장미 식물을 얻을 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같은 것이다.

［1］이하의 (a) 내지 (d), 즉

(a) 배열 번호 1의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와,

(b) 배열 번호 1의 염기 배열 또는 그 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 적어도 97% 이상의 배열 동일성을 가지고, 또한, 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와,　

(c) 배열 번호 2의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와,

(d) 배열 번호 2의 아미노산 배열에 대하여 적어도 97% 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가지고, 또한, 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.

［2］컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에, 상기 ［1］에 기재된 폴리뉴클레오티드가 작용 가능한 상태로 연결된 플라스미드.

［3］작용 가능한 상태로 nos 터미네이터가 더 연결되어 있는, 상기 ［2］에 기재된 플라스미드.

［4］장미 원예종 (Rosa hybrida)을, 상기 ［2］또는［3］에 기재된 플라스미드를 사용하여 아그로박테리움법에 의하여 형질 전환하고, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 80% 이상인 형질 전환 장미 식물 또는 그 자손을 제조하는 방법.

［5］상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 85% 이상인 것인, 상기 ［4］에 기재되어 있는 방법.

［6］상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 90% 이상인 것인, 상기 ［5］에 기재되어 있는 방법.

［7］상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 95% 이상인 것인, 상기 ［6］에 기재되어 있는 방법.

［8］상기 ［4］ 내지 ［7］의 어느 하나의 항에 기재되어 있는 방법에 의하여 제조된 형질 전환 장미 식물 또는 그 자손.

본 발명의 캄파눌라 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 유전자를 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에 포함하는 플라스미드를 사용하여 아그로박테리움법에 의하여 형질 전환하면, 장미 원예종의 꽃잎 중의 델피니딘 함유량을 현저하게 높일 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 (배열 번호 1)는 캄파눌라 유래의 F3＇5＇H를 코드하고, 521 잔기로 이루어진다. 본 명세서 중에서, 용어 「폴리뉴클레오티드」는 DNA 또는 RNA를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 배열 번호 1의 염기 배열, 또는 그의 상당하는 아미노산 배열 (배열 번호 2)로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 것에 한정되지 않고, 해당 염기 배열 또는 그 상보 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 또는 해당 아미노산 배열과 특정의 배열 상동성, 좋기로는 배열 동일성을 가지고, 또한, 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터도 선택된다. 적어도 97% 이상의 배열 동일성을 가진 폴리뉴클레오티드가 좋다.

본 발명의 폴리펩티드에는 배열 번호 1의 염기 배열과 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 DNA 분자도 포함된다. 이 때, 본 명세서 중에서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란, 예를 들면 배열 번호 1의 염기 배열 또는 그 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻을 수 있는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리다이제이션의 방법으로서는, 예를 들면 문헌 ["Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"] 등에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있다.

본 명세서 중에서, 「스트린젠트한 조건」이란, 낮은 스트린젠트 조건, 중간 스트린젠트 조건 및 높은 스트린젠트 조건 중 어느 것이라도 좋다. 「낮은 스트린젠트 조건」은 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한, 「중간 스트린젠트 조건」은 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「높은 스트린젠트 조건」은 예를 들면, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃, 특히, 0.1×SSC, 0.1%SDS, 65℃, 또는 0.1×SSC, 0.1%SDS, 70℃의 조건이다. 이 조건들에 있어서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 가진 DNA를 효율적으로 얻을 수 있는 것을 기대할 수 있다. 다만, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 주는 요소로서는, 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염 농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있는데, 당업자이면 이들 요소를 적절하게 선택함으로써 그와 같은 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의하여 코드되는 아미노산 배열은 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 활성이 유지되는 한, 하나 또는 몇 가지 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가되어 있어도 된다.

본 명세서 중, 용어 「동일성」 및 「상동성」이란, 폴리펩티드 배열 (또는 아미노산 배열) 또는 폴리뉴클레오티드 배열 (또는 염기 배열)에 있어서의 2개의 사슬 사이에 이 사슬을 구성하고 있는 각 아미노산 잔기끼리 또는 각 염기끼리의 서로의 적합 관계에 있어서 동일하다고 결정할 수 있는 것의 양 (수)을 의미하고, 2 개의 폴리펩티드 배열 또는 2 개의 폴리뉴클레오티드 배열간의 배열 상관성의 정도를 의미하는 것이고, 「동일성」및 「상동성」은 용이하게 산출할 수 있다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 배열 또는 폴리펩티드 배열간의 상동성을 측정하는 방법은 수없이 알려져 있고, 용어 「동일성」및 「상동성」은 당업자에게는 주지이다 (예를 들면, Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 등 참조).

또한, 본 명세서에 기재되는 「동일성」및 「상동성」의 수치는 특별히 명시하였을 경우를 제외하고는, 당업자에게 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여 산출되는 수치이어도 좋지만, 좋기로는 MacVector 어플리케이션 (version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England)의 ClustalW 프로그램을 이용하여 산출되는 수치이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 (핵산, 유전자)는 주목하는 단백질을 「코드하는」 것이다. 이 때, 「코드한다」라는 것은 주목하는 단백질을 그 활성을 구비한 상태로 발현시키는 것을 의미한다. 또한, 「코드한다」라는 것은 주목하는 단백질을 연속하는 구조 배열 (엑손)로서 코드하는 것, 또는 개재 배열 (인트론)을 매개하여 코드하는 것의 양자의 의미를 포함하고 있다.

생래의 염기 배열을 가진 유전자는 이하의 실시예에 기재하는 바와 같이, 예를 들면, DNA 시퀀서에 의한 해석에 의하여 얻을 수 있다. 또한, 수식된 아미노산 배열을 가진 효소를 코드하는 DNA는 생래의 염기 배열을 가진 DNA를 기초로 하여 상용의 부위 특정 변이 유발이나 PCR법을 사용하여 합성할 수 있다. 예를 들면, 수식하고자 하는 DNA 단편을 생래의 cDNA 또는 게놈 DNA의 제한 효소 처리에 의하여 얻고, 이것을 주형으로 하여, 소망하는 변이를 도입한 프라이머를 사용하여 부위 특정 변이 유발이나 PCR법을 실시하여, 소망하는 수식한 DNA 단편을 얻는다. 그 후, 이 변이를 도입한 DNA 단편을 목적으로 하는 효소의 다른 부분을 코드하는 DNA 단편과 연결하면 된다.

또는, 단축된 아미노산 배열로 이루어지는 효소를 코드하는 DNA를 얻으려면, 예를 들면, 목적으로 하는 아미노산 배열보다 긴 아미노산 배열, 예를 들면, 전장 아미노산 배열을 코드하는 DNA를 소망하는 제한 효소에 의하여 절단하고, 그 결과, 얻은 DNA 단편이 목적으로 하는 아미노산 배열의 전체를 코드하고 있지 않은 경우에는, 부족 부분의 배열로 이루어지는 DNA 단편을 합성하여 연결하면 된다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터와 함께 플라스미드에 삽입된다. 35S 프로모터로서 식물 형질 전환체에서 범용되는 35S 프로모터에 인핸서 배열을 2개 탠덤으로 나란히 연결함으로써 발현이 강화된 El2 35S 프로모터 (상기한 것)가 좋다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 35S 프로모터는 작동 가능한 상태가 되도록 연결되어, 예를 들면 프로모터의 하류에 주목하는 폴리뉴클레오티드가 배치된다. 본 발명의 플라스미드는 장미 원예종의 형질 전환에 사용된다.

본 발명 중에서, 용어 「장미 원예종」이란, 분류학상의 위치로는 장미과 장미속의 식물 (학명：Rosa hybrida)을 말한다. 장미 원예종은 수형과 꽃의 크기에 따라서 주로 하이브리드 티계, 플로리분다계, 폴리앤서계 등으로 나눌 수 있는데, 어느 계통에서도 꽃잎에 포함되는 주요한 색소 (안토시아닌)는 시아니딘형과 펠라르고니딘형의 2 종류뿐이다. 본 발명은 장미의 꽃잎에 포함되는 주된 안토시아닌을 델피니딘형으로 변환하는 기술이며, 이 종들이나 계통에 매우 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명은 시아니딘형의 품종 (예를 들면, 쿨 워터, 오션 송, 페임 등), 또는 펠라르고니딘형의 품종 (예를 들면, 노블레스, 토플리스, 피치 아바란체 등)의 어느 것에도 적용할 수 있다.

본 발명의 플라스미드는 프로모터 이외의 인자, 예를 들면 터미네이터, 폴리아데닐화 시그널 배열, 복제 기점 배열 (ori) 등의 조절 배열；약제 내성 마커, 형광 단백질 마커, 효소 마커, 세포 표면 리셉터 마커 등의 선택 마커를 추가로 포함하여도 된다. 터미네이터는 nos 터미네이터가 좋으며, 주목하는 폴리뉴클레오티드의 하류에 배치된다. 본 명세서 중에서 「nos 터미네이터」란, 아그로박테리움 투메페이션스 (Agrobacterium tumefaciens) 의 Ti 플라스미드 유래의 노파린 합성 효소 유전자의 터미네이터 배열을 말한다.

[실시예]

이하, 실시예에 따라서 본 발명을 구체적으로 설명한다.

［실시예 1：캄파눌라 F3＇5＇H cDNA의 단리］

DNA 데이터베이스 GenBank에 등록되어 있는 캄파눌라 (Campanula medium)의 F3'5'H cDNA (억세션 번호 D14590)의 번역 배열에 기초하여 2종의 프라이머 CamF1 (5＇-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3＇,배열 번호 3)와 CamR1 (5＇-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3', 배열 번호 4)를 합성하였다. 시판되는 캄파눌라 봉오리의 꽃잎으로부터 RNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN사)를 이용하여 RNA를 추출하고, RT-PCR 세트를 이용하여 1st strand DNA를 합성하였다. 이 1st strand DNA를 주형으로, 상기 프라이머를 사용하여 PCR를 실시하였다. 얻은 DNA 단편을 pCR-TOPO II에 클로닝하였다. 이 중에서, 클론 ＃4 (pSPB2561)의 염기 배열을 DNA 시퀀서의 해석에 의하여 결정하였다 (배열 번호 1). 억세션 번호 D14590에 등록되어 있는 F3＇5＇H가 523 잔기로 이루어지는 데 대하여, 클론 ＃4가 코드하는 F3＇5＇H는 521 잔기로 이루어지고, D14590에 등록되어 있는 F3＇5＇H에 대하여 96%의 배열 동일성을 나타내었다.

［참고예 1：장미 품종 「쿨 워터」로의 pSPB130의 도입 (팬지 유래 F3＇5＇H 유전자와 토레니아 유래 5 AT 유전자의 구성적 발현)］

특허 문헌 3에 기재된 바이너리 벡터 pSPB130 (팬지의 F3＇5＇H 유전자와 토레니아의 안토시아닌 5-아실기 전이 효소 유전자를 식물 중에서 구성적으로 발현시키는 벡터)를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) Ag10에 도입하였다. 이 형질 전환된 아그로박테리움을, 특허 문헌 3에 기재되어 있는 방법으로, 연보라색계의 장미 품종 「쿨 워터」에 도입하고, 164개의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎 중의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 164 개체 중에서 51 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였는데, 델피니딘 함유율은 최고 76.1% (평균 36.6%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석값을 이하의 표 1에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 2：장미 품종 「쿨 워터」로의 pSPB2564의 도입 (E12 35S 프로모터 제어하에서의 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자의 발현)］

실시예 1에서 취득한 캄파눌라의 F3＇5＇H 유전자 cDNA를, 특허 문헌 3에 기재된 El2 35S 프로모터와 노파린 신타제 터미네이터 (nos 터미네이터)의 사이에 삽입한 발현 카세트를 바이너리 벡터 pBinPLUS (van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995)에 삽입하여, 얻은 플라스미드를 pSPB2564로 하였다. pSPB2564를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) Ag10에 도입하였다. 이 형질 전환된 아그로박테리움을 이용하고, 특허 문헌 3에 기재되어 있는 방법으로, 연보라색계의 장미 품종 「쿨 워터」를 형질 전환하여, 55개의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎 중의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하여, 55 개체 중에서 48 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였는데, 델피니딘 함유율은 최고 97.3% (평균 61.22%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석값을 이하의 표 2에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 3：장미 품종 「페임」으로의 pSPB2564의 도입 (E12 35S 프로모터 제어하에서의 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자의 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 핑크계의 장미 품종 「페임」을 형질 전환하여, 114개의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎 중의 안토시아니딘 색소 분석을 실시한 107 개체 중에서 46 개체에서 델피니딘의 축적을 확인하였는데, 델피니딘 함유율은 최고 98.9% (평균 51.2%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 3에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 4：장미 품종 「페임」으로의 pSPB2564의 도입 (El2 35S 프로모터 제어하에서 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자를 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 핑크계의 장미 품종 「페임」을 형질 전환하고, 55 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 55 개체 중 28 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 98.9% (평균 51.4%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 4에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 5：장미 품종 「노블레스」로의 pSPB2564의 도입 (El2 35S 프로모터 제어하에서 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자를 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 서몬 핑크계의 장미 품종 「노블레스」를 형질 전환하여, 3 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 3 개체 모두에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 98.9% (평균 51.4%)이었다.

형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 5에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 6：장미 품종 「오션 송」으로의 pSPB2564의 도입 (El2 35S 프로모터 제어하에서 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자를 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 연보라색계의 장미 품종 「오션 송」을 형질 전환하고, 40 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 40 개체 중에서 33 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 99.2% (평균 39.7%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 6에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 7：장미 품종 「피치 아바란체」에의 pSPB2564의 도입 (El2 35S 프로모터 제어하에서 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자를 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 옅은 서몬 핑크계의 장미 품종 「피치 아바란체」를 형질 전환하고, 11 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 11 개체 중에서 1 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 99.3%이었다.

델피니딘을 제조가 확인 된 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 7에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［실시예 8：장미 품종 「토플송」로의 pSPB2564의 도입 (El2 35S 프로모터 제어하에서 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자를 발현)］

pSPB2564를 도입한 아그로박테리움을 사용하여 서몬 핑크계의 장미 품종 「토플리스」를 형질 전환하고, 11 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎의 안토시아니딘 색소 분석을 실시하였더니, 11 개체 중에서 10 개체에서 델피니딘의 축적을 확인할 수 있었고, 델피니딘 함유율은 최고 99.4% (평균 64.4%)이었다.

델피니딘 제조가 확인된 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 8에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

［참고예 2：장미 품종 「페임」으로의 pSPB5202의 도입 (팬지 유래 F3＇5＇H프로모터 제어하에서의 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자의 발현)］

특허 문헌 9에 기재된 플라스미드 pSFL620를 HindIII와 PstI로 소화하여 얻은 팬지 유래 F3＇5＇H프로모터 배열과, 실시예 1에서 얻은 캄파눌라의 cDNA 배열과, 플라스미드 pRI201-AN (다카라바이오가부시키가이샤) 유래의 열 쇼크 단백질 터미네이터를 연결하고, 바이너리 벡터 pBinPlus에 삽입하였다. 얻은 바이너리 벡터를 pSPB5202로 하였다. pSPB5202를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) Agl0에 도입하였다. 이 형질 전환된 아그로박테리움을 사용하여, 특허 문헌 3에 기재되어 있는 방법으로, 핑크계의 장미 품종 「페임」을 형질 전환하여, 56개의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎 중의 안토시아니딘 색소 분석을 실시한 52 개체 중에서, 델피니딘의 축적을 확인할 수 있던 것은 4 개체뿐이었고, 델피니딘 함유율은 최고 10.8% (평균 3.9%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 9에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

팬지 유래 F3＇5＇H프로모터는 팬지 유래의 F3＇5＇H 유전자를 장미에 있어서 양호하게 발현시키고 (특허 문헌 9 참조), 또한, 열 쇼크 단백질 터미네이터는 이종 유전자의 식물에의 발현에 극히 유효한 (Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332) 것으로 되어 있음에도 불구하고, 형질 전환 장미 꽃잎에서는 델피니딘의 생산이 인정된 것은 매우 적어서, 캄파눌라 F3＇5＇H 유전자가 충분히 기능하지 않았던 것이 시사되었다. 이는 특정의 장미 품종에서 델피니딘을 효율적으로 생산하려면 특정의 프로모터와 특정의 F3＇5＇H 유전자의 조합, 또는 특정의 프로모터와 특정의 F3＇5＇H 유전자와 특정의 터미네이터 유전자의 조합의 선택이 필요한 것을 나타낸다.

［참고예 3：장미 품종 「페임」으로의 pSPB5204의 도입 (차조기 유래 3 AT 프로모터 제어하에서의 캄파눌라 유래 F3＇5＇H 유전자의 발현)］

특허 문헌 10에 기재된 플라스미드 pSFL205를 HindIII와 BamHI로 소화함으로써, 차조기 유래 안토시아닌 3-아실기 전이 효소의 프로모터 부분을 포함하는 약 1.1 kb의 DNA 단편을 회수하고, HindIII와 BamHI로 소화한 pBinPlus과 연결하여, pSPB3756를 얻었다. 또한, 특허 문헌 10에 기재된 플라스미드 pSPB3311를 주형으로 하고, 3종의 합성 뉴클레오티드 프라이머, Pf3AT-FW-Sal (5＇-ATGTCGACTAAATGTATGTAATTAAC-3＇,배열 번호 5), Pf3ATt-R1 (5＇-ACTCAACACTTTATTAATTG-3＇,배열 번호 6), Pf3ATt-F1 (5＇-ATGTAACAATTAATTAAGTG-3＇,배열 번호 7)를 사용한 PCR에서, 차조기 유래 안토시아닌 아실기 전이 효소의 터미네이터 부분의 5＇말단에 제한 효소 SalI 인식 배열을 부가하고, 동 터미네이터부분에 있는 PacI 인식 부위 중 5'측에 있는 PacI 인식 부위를 파괴하였다. PCR로 얻은 DNA 단편을 pTOPO에 클로닝하였다. 얻은 플라스미드를 KpnI와 PacI로 소화하여 얻은 DNA 단편과 pSPB3756를 KpnI와 PacI로 소화하여 얻은 DNA 단편을 연결하고, pSPB5201로 하였다. SmaI와 SpeI로 소화한 pSPB5201와 실시예 1에서 얻은 캄파눌라 cDNA를 연결하고, 얻은 바이너리 벡터를 pSPB5204로 하였다. pSPB5204를 아그로박테리움 (Agrobacterium tumefaciens) Ag10에 도입하였다. 이 형질 전환된 아그로박테리움을 이용하고, 특허 문헌 3에 기재되어 있는 방법으로, 핑크계의 장미 품종 「페임」을 형질 전환하고, 63 개체의 형질 전환체를 얻었다. 꽃잎 중의 안토시아니딘 색소 분석을 실시한 61 개체 중에서, 델피니딘의 축적을 확인할 수 있던 것은 8 개체뿐이고, 델피니딘 함유율은 최고 2.8% (평균 1.3%)이었다.

대표적인 형질 전환체의 분석 값을 이하의 표 10에 나타낸다.

Del：델피니딘, Cya：시아니딘, Pel：펠라르고니딘

델피니딘 함유율：총 안토시아니딘 중의 델피니딘의 비율

차조기 유래 안토시아닌 3-아실기 전이 효소 프로모터는 차조기 유래 안토시아닌 3-아실기 전이 효소 유전자를 장미, 페튜니아, 국화에서 양호하게 발현시켰음(특허 문헌 9 참조)에도 불구하고, 형질 전환체의 장미 꽃잎에서는 델피니딘의 제조가 인정된 것은 매우 적어서, 캄파눌라 F3＇5＇H 유전자가 충분히 기능하지 않았던 것이 시사되었다. 이것은 장미에서 델피니딘을 효율적으로 생산하려면 특정의 프로모터와 특정의 F3＇5＇H 유전자의 조합, 또는 특정의 프로모터와 특정의 F3＇5＇H 유전자와 특정의 터미네이터 유전자의 조합의 선택이 필요한 것을 나타내고 있다.

본 발명의 캄파눌라 플라보노이드-3＇,5＇-수산화 효소 유전자를 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에 포함하는 플라스미드를 사용하여 아그로박테리움법에 의하여 형질 전환하면, 특정 품종의 장미 식물의 꽃잎 중의 델피니딘 함유량을 현저하게 높일 수 있다. 따라서, 본 발명은 꽃의 색이 변경된 장미 식물의 제조에 매우 적합하게 이용 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> Suntory Holdings Limited <120> Novel Campanula F3'5'H gene and use thereof <130> SP2012-0132(AB587) <150> JP2012-092716 <151> 2012-04-16 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1585 <212> DNA <213> Campanula medium <220> <221> misc_feature <223> F3'5'H Clone 4 <220> <221> CDS <222> (12)..(1574) <400> 1 gtgaagccac c atg tct ata gac ata acc att ctc tta tgt gaa ctt gtt 50 Met Ser Ile Asp Ile Thr Ile Leu Leu Cys Glu Leu Val 1 5 10 gct gca att tca ctc tac tta tta acc tac tat ttc att tgt ttc ctc 98 Ala Ala Ile Ser Leu Tyr Leu Leu Thr Tyr Tyr Phe Ile Cys Phe Leu 15 20 25 ttc aaa ccc tct cat cat cac cac cac ctc cct ccc ggc cca acc gga 146 Phe Lys Pro Ser His His His His His Leu Pro Pro Gly Pro Thr Gly 30 35 40 45 tgg ccg atc att gga tcc ctt cct ctc tta ggc act atg cca cat gtt 194 Trp Pro Ile Ile Gly Ser Leu Pro Leu Leu Gly Thr Met Pro His Val 50 55 60 tcc tta gcc gac atg gcc gta aaa tac ggg cct ata atg tac cta aaa 242 Ser Leu Ala Asp Met Ala Val Lys Tyr Gly Pro Ile Met Tyr Leu Lys 65 70 75 ctt ggt tca aag ggc acc gtc gtg gcc tca aat cca aaa gcc gcc cga 290 Leu Gly Ser Lys Gly Thr Val Val Ala Ser Asn Pro Lys Ala Ala Arg 80 85 90 gca ttc ttg aaa tcc cat gat gcc aat ttt tct aac cgt ccg att gat 338 Ala Phe Leu Lys Ser His Asp Ala Asn Phe Ser Asn Arg Pro Ile Asp 95 100 105 ggg ggg ccc acc tac ctc gcg tat aat gca caa gac atg gtt ttt gca 386 Gly Gly Pro Thr Tyr Leu Ala Tyr Asn Ala Gln Asp Met Val Phe Ala 110 115 120 125 gaa tat ggc cca aaa tgg aag ctt ttg cga aag cta tgt agc ttg cac 434 Glu Tyr Gly Pro Lys Trp Lys Leu Leu Arg Lys Leu Cys Ser Leu His 130 135 140 atg tta ggc ccg aag gca ctc gag gat tgg gct cat gtc aga gtt tca 482 Met Leu Gly Pro Lys Ala Leu Glu Asp Trp Ala His Val Arg Val Ser 145 150 155 gag gtc ggt cat atg ctc aaa gaa atg tac gag caa tcg agt aag tcc 530 Glu Val Gly His Met Leu Lys Glu Met Tyr Glu Gln Ser Ser Lys Ser 160 165 170 gtg cca gtg gtg gtg cca gag atg tta act tat gcc atg gct aat atg 578 Val Pro Val Val Val Pro Glu Met Leu Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met 175 180 185 att gga cga atc ata ctc agt cga cgc cct ttt gtt atc acg agc aaa 626 Ile Gly Arg Ile Ile Leu Ser Arg Arg Pro Phe Val Ile Thr Ser Lys 190 195 200 205 tta gac tcg tct gct tct gct gct tct gtt agt gaa ttc caa tat atg 674 Leu Asp Ser Ser Ala Ser Ala Ala Ser Val Ser Glu Phe Gln Tyr Met 210 215 220 gtt atg gag ctc atg agg atg gca ggg ttg ttc aat att ggt gat ttc 722 Val Met Glu Leu Met Arg Met Ala Gly Leu Phe Asn Ile Gly Asp Phe 225 230 235 ata cca tat att gcg tgg atg gat ttg caa ggc att caa cgc gat atg 770 Ile Pro Tyr Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Gln Arg Asp Met 240 245 250 aag gtt ata cag caa aag ttt gat gtc ttg ttg aac aaa atg atc aag 818 Lys Val Ile Gln Gln Lys Phe Asp Val Leu Leu Asn Lys Met Ile Lys 255 260 265 gaa cat aca gaa tcc gct cat gat cgt aaa gat aat cct gat ttt ctt 866 Glu His Thr Glu Ser Ala His Asp Arg Lys Asp Asn Pro Asp Phe Leu 270 275 280 285 gat att ctt atg gcg gct acc caa gaa aac acg gag gga att cag ctt 914 Asp Ile Leu Met Ala Ala Thr Gln Glu Asn Thr Glu Gly Ile Gln Leu 290 295 300 aat ctc gta aat gtt aag gcg ctt ctt ttg gat tta ttc acg gcg ggc 962 Asn Leu Val Asn Val Lys Ala Leu Leu Leu Asp Leu Phe Thr Ala Gly 305 310 315 acg gat aca tcg tcg agt gtg atc gaa tgg gca cta gcc gaa atg ttg 1010 Thr Asp Thr Ser Ser Ser Val Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Leu 320 325 330 aac aat cga cag atc cta aac cgg gcc cac gaa gaa atg gac caa gtc 1058 Asn Asn Arg Gln Ile Leu Asn Arg Ala His Glu Glu Met Asp Gln Val 335 340 345 att ggc aga aac aga aga cta gaa caa tct gac ata cca aac ttg cca 1106 Ile Gly Arg Asn Arg Arg Leu Glu Gln Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro 350 355 360 365 tat ttc caa gcc ata tgc aaa gaa aca ttc cga aaa cac cct tcc acg 1154 Tyr Phe Gln Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr 370 375 380 ccc tta aac ctc cca aga atc tca aca gaa gaa tgt gaa gtc gaa gga 1202 Pro Leu Asn Leu Pro Arg Ile Ser Thr Glu Glu Cys Glu Val Glu Gly 385 390 395 ttt cgc ata ccc aaa aac act aga cta ata gtg aac ata tgg gca ata 1250 Phe Arg Ile Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ile Val Asn Ile Trp Ala Ile 400 405 410 ggg aga gac cct aaa gtg tgg gaa aat cca ttg gat ttt acc ccg gaa 1298 Gly Arg Asp Pro Lys Val Trp Glu Asn Pro Leu Asp Phe Thr Pro Glu 415 420 425 cga ttc ttg agt gaa aaa cac gcg aaa att gat ccg cga ggt aat cat 1346 Arg Phe Leu Ser Glu Lys His Ala Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn His 430 435 440 445 ttt gag tta atc cca ttt ggg gcg gga cgg agg ata tgt gca ggg gct 1394 Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Ala 450 455 460 aga atg gga gcg gcc tcg gtc gag tac att tta ggt aca ttg gtg cac 1442 Arg Met Gly Ala Ala Ser Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His 465 470 475 tca ttt gat tgg aaa ttg cct gat gga gtt gtg gaa gtt aat atg gaa 1490 Ser Phe Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Val Val Glu Val Asn Met Glu 480 485 490 gag agc ttt ggg ata gca ttg cag aaa aag atg cct ctt tct gct att 1538 Glu Ser Phe Gly Ile Ala Leu Gln Lys Lys Met Pro Leu Ser Ala Ile 495 500 505 gtt act cca aga ttg cct cca agt gct tac act gtc 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Met Ala Asn Met Ile Gly Arg 180 185 190 Ile Ile Leu Ser Arg Arg Pro Phe Val Ile Thr Ser Lys Leu Asp Ser 195 200 205 Ser Ala Ser Ala Ala Ser Val Ser Glu Phe Gln Tyr Met Val Met Glu 210 215 220 Leu Met Arg Met Ala Gly Leu Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile Pro Tyr 225 230 235 240 Ile Ala Trp Met Asp Leu Gln Gly Ile Gln Arg Asp Met Lys Val Ile 245 250 255 Gln Gln Lys Phe Asp Val Leu Leu Asn Lys Met Ile Lys Glu His Thr 260 265 270 Glu Ser Ala His Asp Arg Lys Asp Asn Pro Asp Phe Leu Asp Ile Leu 275 280 285 Met Ala Ala Thr Gln Glu Asn Thr Glu Gly Ile Gln Leu Asn Leu Val 290 295 300 Asn Val Lys Ala Leu Leu Leu Asp Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr 305 310 315 320 Ser Ser Ser Val Ile Glu Trp Ala Leu Ala Glu Met Leu Asn Asn Arg 325 330 335 Gln Ile Leu Asn Arg Ala His Glu Glu Met Asp Gln Val Ile Gly Arg 340 345 350 Asn Arg Arg Leu Glu Gln Ser Asp Ile Pro Asn Leu Pro Tyr Phe Gln 355 360 365 Ala Ile Cys Lys Glu Thr Phe Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu Asn 370 375 380 Leu Pro Arg Ile Ser Thr Glu Glu Cys Glu Val Glu Gly Phe Arg Ile 385 390 395 400 Pro Lys Asn Thr Arg Leu Ile Val Asn Ile Trp Ala Ile Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Lys Val Trp Glu Asn Pro Leu Asp Phe Thr Pro Glu Arg Phe Leu 420 425 430 Ser Glu Lys His Ala Lys Ile Asp Pro Arg Gly Asn His Phe Glu Leu 435 440 445 Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Ala Arg Met Gly 450 455 460 Ala Ala Ser Val Glu Tyr Ile Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe Asp 465 470 475 480 Trp Lys Leu Pro Asp Gly Val Val Glu Val Asn Met Glu Glu Ser Phe 485 490 495 Gly Ile Ala Leu Gln Lys Lys Met Pro Leu Ser Ala Ile Val Thr Pro 500 505 510 Arg Leu Pro Pro Ser Ala Tyr Thr Val 515 520 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer CamF1 <400> 3 gtgaagccac catgtctata g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer CamR1 <400> 4 gcatttgcct agacagtgta ag 22 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Pf3AT FW Sal <400> 5 atgtcgacta aatgtatgta attaac 26 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial 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Claims

이하의 (a) 내지 (d), 즉
(a) 배열 번호 1의 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와,
(b) 배열 번호 1의 염기 배열 또는 그 상보적인 염기 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 적어도 97% 이상의 배열 동일성을 가지고, 또한 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와,
(c) 배열 번호 2의 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드와,
(d) 배열 번호 2의 아미노산 배열에 대하여 적어도 97% 이상의 배열 동일성을 가진 아미노산 배열을 가지고, 또한, 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 활성을 가진 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드
로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어하에, 제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드가 동작 가능한 상태로 연결된 플라스미드.
제2항에 있어서, 작용 가능한 상태로 nos 터미네이터가 더 연결되어 있는 플라스미드.
장미 원예종 (Rosa hybrida)을, 제2항 또는 제3항에 기재된 플라스미드를 사용하여 아그로박테리움법에 의하여 형질 전환하고, 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 80% 이상인 형질 전환 장미 식물 또는 그 자손을 제조하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 85% 이상인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 90% 이상인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 꽃잎 중의 델피니딘 함유량이 95% 이상인 것인 방법.
제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재되어 있는 방법에 의하여 제조 된 형질 전환 장미 식물 또는 그 자손.