WO2013157502A1 - 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用 - Google Patents

新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用 Download PDF

Info

Publication number
WO2013157502A1
WO2013157502A1 PCT/JP2013/061116 JP2013061116W WO2013157502A1 WO 2013157502 A1 WO2013157502 A1 WO 2013157502A1 JP 2013061116 W JP2013061116 W JP 2013061116W WO 2013157502 A1 WO2013157502 A1 WO 2013157502A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
delphinidin
gene
promoter
rose
polynucleotide
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/061116
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
田中　良和
幸久 勝元
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サントリーホールディングス株式会社 filed Critical サントリーホールディングス株式会社
Priority to JP2014511199A priority Critical patent/JP6157454B2/ja
Priority to US14/394,329 priority patent/US20150074855A1/en
Priority to KR1020147027030A priority patent/KR101540074B1/ko
Priority to CA2870428A priority patent/CA2870428A1/en
Priority to RU2014145832A priority patent/RU2640248C2/ru
Priority to EP13777591.2A priority patent/EP2845901A4/en
Priority to CN201380020230.8A priority patent/CN104245934A/zh
Publication of WO2013157502A1 publication Critical patent/WO2013157502A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/825—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving pigment biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13088—Flavonoid 3',5'-hydroxylase (1.14.13.88)

Definitions

  • the present invention relates to a technique for gene manipulation by introducing a foreign gene into a plant cell. More specifically, the present invention relates to a novel campanula flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase gene, a plasmid containing the gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, and transformation by the Agrobacterium method using the plasmid Relates to a method for producing horticultural rose plants in which the delphinidin content in petals is significantly increased.
  • Plant breeding methods include methods such as (i) crossing of oshibe and shishibe, (ii) naturally or artificially generated mutations, and (iii) genetic recombination. Of these, when genetic recombination technology is used, it is possible to give a new trait to a plant by expressing a useful gene in the target plant without being restricted by the genetic constraints of the species. . Genetically modified plants produced in this way are already cultivated extensively all over the world.
  • Flower-colored components include anthocyanins, carotenoids and betalains.
  • Anthocyanins are members of secondary metabolites collectively called flavonoids and are synthesized from phenylalanine by the action of many enzymes.
  • the color of anthocyanins depends on its structure. That is, the color becomes blue as the number of hydroxyl groups on the B ring of anthocyanidin, which is an anthocyanin chromophore, increases.
  • the main anthocyanidins, delphinidin, cyanidin, and pelargonidin have a large number of B-ring hydroxyl groups in this order. Many blue flowers accumulate anthocyanins derived from delphinidin.
  • anthocyanins combined with a plurality of aromatic acyl groups are called polyacylated anthocyanins, and are contained in blue petals such as gentian and sturgeon (see Plant J. 54, 737-749, 2008). Enzymes involved in the biosynthesis of anthocyanins and the genes encoding them have already been isolated from many plants (see Plant J. 54, 737-749, 2008).
  • anthocyanins also depends on the pH of the vacuole where it is localized and the presence of other flavonoids, metal ions, and the like. That is, anthocyanins turn red when the pH of the vacuole is low and turn blue when neutral. Flavon and flavonol are also called pigments, and when they coexist with anthocyanins, they have the effect of making anthocyanins appear blue. It is also known that iron or aluminum ions turn anthocyanins blue by coordinating to the hydroxyl group of the B ring of anthocyanins.
  • Plants can blossom in a variety of colors, but few species can blossom in all colors. This is because the pigments that can be synthesized by the species are genetically determined. For example, roses, carnations, chrysanthemums, lilies, gerberas, etc. do not naturally have blue or purple varieties. The main reason is that these plants do not have the flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase (hereinafter also referred to as "F3'5'H”) gene necessary for synthesizing delphinidin. .
  • F3'5'H flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase
  • Several attempts have been reported to produce delphinidin and to make the flower color blue by expressing the F3'5'H gene in the petals. From these studies, select the right promoter and the right F3'5'H gene for each species, as described below, to increase the delphinidin content in the petals and change the color of the flowers to blue. However, the choice is difficult to predict.
  • F3'5'H gene increases the amount of anthocyanins derived from delphinidin (Nature, 1993, 366, 276-279, FEBS Lett. 1999, 461, 241 -245).
  • F3′5′H gene is expressed in tobacco (Nicotiana tabacum) that accumulates cyanidin, delphinidin is synthesized and the flower color is slightly bluish (FEBS Lett. 1999, 461, 241-245).
  • Non-patent Document 1 when the F3'5'H gene derived from campanula, eustoma and petunia is expressed under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, the campanula F3'5'H gene is most efficient. It is described that delphinidin is often produced (see the summary in the same book).
  • Patent Document 1 describes that a petunia-derived F3′5′H gene was introduced into rose under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter (see Example 9 in the same document), but Campanula-derived F3′5′H. Genes are only introduced in tobacco, and there is no description of production of delphinidin in rose plants and rose petals, and changes in flower color.
  • Non-patent document 2 below shows that when the F3'5'H gene of butterfly and verbena is expressed in verbena, the amount of delphinidin produced is larger and the flower color is clear when the gene derived from butterfly is expressed. It is described that changed.
  • Patent Document 2 when F3'5'H gene derived from petunia, gentian, pea, cineraria, eustoma, pansy, lavender is expressed in rose, the F3'5'H gene derived from pansy is cauliflower.
  • the mosaic virus 35S promoter or the promoter of a rose-derived chalcone synthase gene When expressed under the control of the mosaic virus 35S promoter or the promoter of a rose-derived chalcone synthase gene, tens of percent of the total anthocyanidins are produced, and in rose, the F3'5'H gene derived from pansy is the cauliflower mosaic. It has been described that it functions well under the control of the viral 35S promoter or the promoter of rose-derived chalcone synthase gene.
  • Non-Patent Document 3 describes that the cauliflower mosaic virus 35S (El2 35S) promoter with an enhancer expresses a foreign gene with higher efficiency than the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • Roses introduced with the pansy F3'5'H gene under the control of the El2 35S promoter produce delphinidin, and the color of the flower changes.
  • One of these is already commercially available (variety registration number no. 20992).
  • pansy F3′5′H gene under the control of the El2 35S promoter and the iris dihydroflavonol 4-reductase under the control of the El2 35S promoter (hereinafter referred to as “DFR”).
  • DFR iris dihydroflavonol 4-reductase under the control of the El2 35S promoter
  • Patent Document 4 in chrysanthemum cultivar Improved Reagan and Dark Splendid Reagan, 50% delphinidin is obtained by transcribing the pansy-derived F3'5'H gene using the rose chalcone synthase promoter. It is described that a genetically modified chrysanthemum that has accumulated and flower color changed to blue was obtained.
  • the constitutive promoter Mac1 promoter, petal-specific promoter chalcone synthase gene promoter, petunia-derived chalcone synthase gene promoter is petunia F3'5 ' Used to express H gene in carnation.
  • the two petal-specific promoters described above produced more delphinidin than the Mac1 promoter (see Patent Document 6 below).
  • the petunia DFR gene promoter and the anthocyanidin synthase gene promoter are effective for transcription of foreign genes (see Patent Documents 7 and 8 below, respectively).
  • petal-specific promoters include pansy F3'5'H gene promoter (see Patent Document 9 below), perilla anthocyanin 3-acyltransferase gene promoter (see Patent Document 10 below), Cineraria F3 A '5'H gene promoter (Patent Document 11 below) has been reported.
  • F3'5'H gene can be expressed in different plants and delphinidin can be produced, but which promoter is used for which plant F3'5'H gene is derived from the target plant. It is difficult to predict whether it should be expressed, and delphinidin is produced with high efficiency, that is, the delphinidin content in the total amount of anthocyanidins is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90%. In order to achieve more than%, more preferably more than 95%, trial and error, complicated advanced experiments, etc. are required.
  • the content of delphinidin is 50% or more of the total anthocyanidin amount, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more Preferably, it should be increased to 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100%, but for that purpose, simply F3'5'H It is often insufficient to overexpress genes.
  • F3'5'H gene and petunia DFR gene in white carnation lacking dihydroflavonol 4-reductase (DFR) results in almost 100% delphinidin and flower color.
  • Patent Document 12 Recombinant carnations that are also blue have been obtained (see Patent Document 12 below).
  • rose overexpression of bungee-derived F3'5'H gene and iris-derived DFR gene and suppression of rose DFR gene expression resulted in a delphinidin content of almost 100% and a blue flower color.
  • An altered recombinant rose has been obtained (see Patent Document 3 below).
  • chrysanthemum the content of delphinidin is increased by overexpressing the pansy F3'5'H gene and suppressing the expression of chrysanthemum F3'H gene (Patent Document 4 below). reference).
  • the problem to be solved by the present invention is to increase the delphinidin content in the petals as much as possible in the well-growing rose horticultural species, that is, to be able to express F3′5′H highly. It is intended to provide a plasmid for transformation comprising a specific combination of F3′5′H having a high expression promoter and a specific sequence.
  • the present invention is as follows. [1] The following (a) to (d): (A) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1; (B) a protein having at least 97% sequence identity with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary nucleotide sequence thereof and having flavonoid-3 ′, 5′-hydroxylase activity (C) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; and (d) an amino acid sequence having at least 97% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. And a polynucleotide encoding a protein having flavonoid-3 ′, 5′-hydroxylase activity; A polynucleotide selected from the group consisting of:
  • [2] A plasmid in which the polynucleotide described in [1] is linked in a state capable of acting under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • Delphinidin-containing petals in rose horticultural species when transformed by the Agrobacterium method using a plasmid containing the campanula flavonoid-3 ', 5'-hydroxylase gene of the present invention under the control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter The amount can be significantly increased.
  • polynucleotide of the present invention encodes F3'5'H derived from campanula and consists of 521 residues.
  • polynucleotide means DNA or RNA.
  • the polynucleotide of the present invention is not limited to a polynucleotide encoding a protein consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 2), and consists of the base sequence or a complementary sequence thereof.
  • polynucleotides having at least 97% sequence identity are preferred.
  • the polypeptide of the present invention also includes a DNA molecule that hybridizes with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein having flavonoid-3 ', 5'-hydroxylase activity.
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions means, for example, a probe of all or part of a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary nucleotide sequence thereof.
  • a polynucleotide obtained by using a colony hybridization method a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like.
  • Hybridization methods include, for example, “Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", “Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 1997” Can be used.
  • stringent conditions may be any of low stringent conditions, medium stringent conditions, and high stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • the “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C.
  • “High stringent conditions” include, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C., in particular 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C., or 0.1 ⁇ SSC, 0.1 The conditions are% SDS and 70 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNA having higher homology can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. Can achieve the same stringency.
  • the amino acid sequence encoded by the polynucleotide of the present invention may have one or several amino acids deleted, substituted and / or added as long as the flavonoid-3 ′, 5′-hydroxylase activity is maintained. Good.
  • the terms “identity” and “homology” constitute a chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or polynucleotide sequence (or base sequence). Means the amount (number) of each amino acid residue or base that can be determined to be identical in each other's fitness, and the sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences It means a degree, and “identity” and “homology” can be easily calculated. Many methods for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences are known, and the terms “identity” and “homology” are well known to those skilled in the art (see, for example, Lesk, A. M.
  • the numerical values of “identity” and “homology” described in this specification may be numerical values calculated using a homology search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified. Preferably, it is a numerical value calculated using the ClustalW program of the MacVector application (version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England).
  • the polynucleotide (nucleic acid, gene) of the present invention “encodes” a protein of interest.
  • encode means that the protein of interest is expressed in a state having the activity.
  • encode includes both the meaning of encoding the protein of interest as a continuous structural sequence (exon) or encoding via an intervening sequence (intron).
  • a gene having a native base sequence can be obtained, for example, by analysis using a DNA sequencer as described in the following examples.
  • DNA encoding an enzyme having a modified amino acid sequence can be synthesized using conventional site-directed mutagenesis or PCR based on DNA having a native base sequence.
  • a DNA fragment to be modified is obtained by restriction enzyme treatment of native cDNA or genomic DNA, using this as a template, site-directed mutagenesis or PCR method is performed using a primer into which a desired mutation is introduced, A modified DNA fragment is obtained. Thereafter, the DNA fragment into which this mutation has been introduced may be ligated with a DNA fragment encoding another part of the target enzyme.
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, an amino acid sequence longer than the target amino acid sequence
  • a DNA encoding a full-length amino acid sequence is cleaved with a desired restriction enzyme, and the result When the obtained DNA fragment does not encode the entire target amino acid sequence, a DNA fragment consisting of the missing portion sequence may be synthesized and ligated.
  • the polynucleotide of the present invention is inserted into a plasmid together with the cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • the 35S promoter the El2 35S promoter (described above) whose expression is enhanced by connecting two enhancer sequences in tandem to the 35S promoter commonly used in plant transformants is preferable.
  • the polynucleotide of the present invention and the 35S promoter are linked so as to be operable, and for example, the polynucleotide of interest is placed downstream of the promoter.
  • the plasmid of the present invention is used for transformation of rose horticultural species.
  • the term “rose garden species” refers to a plant belonging to the genus Rosaceae (scientific name: Rosa hybrida) in the taxonomic position. Rose horticultural varieties are mainly divided into hybrid tea, floribunda, and polyanthus depending on tree shape and flower size.
  • the main pigments (anthocyanins) contained in the petals of all strains are cyanidin type and pelargonidin.
  • the present invention is a technique for converting main anthocyanins contained in rose petals into delphinidin type, and can be suitably used for these species and strains.
  • the present invention can be applied to any of cyanidin type varieties (for example, cool water, ocean song, fame, etc.) or pelargonidin type varieties (for example, knobless, topless, peach varance, etc.).
  • the plasmid of the present invention further comprises factors other than the promoter, for example, regulatory sequences such as terminator, polyadenylation signal sequence, origin of replication sequence (ori); selection markers such as drug resistance markers, fluorescent protein markers, enzyme markers, cell surface receptor markers, etc. May be included.
  • the terminator is preferably a nos terminator and is located downstream of the polynucleotide of interest.
  • nos terminator refers to a terminator sequence of a nopaline synthase gene derived from a Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens.
  • Example 1 Isolation of Campanula F3'5'H cDNA
  • Two primers CamF1 5'-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3 ', SEQ ID NO: 3
  • GenBank And CamR1 5′-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3 ′, SEQ ID NO: 4
  • RNA was extracted from the petal of a commercially available campanula using RNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN), and 1st strand DNA was synthesized using RT-PCR kit.
  • PCR was performed using this 1st strand DNA as a template and the above primers.
  • the obtained DNA fragment was cloned into pCR-TOPO II.
  • the base sequence of clone # 4 (pSPB2561) was determined by analysis of a DNA sequencer (SEQ ID NO: 1).
  • F3'5'H registered in accession number D14590 consists of 523 residues
  • F3'5'H encoded by clone # 4 consists of 521 residues
  • F3 'registered in D14590 It showed 96% sequence identity to 5'H.
  • Example 2 Introduction of pSPB2564 into rose cultivar “cool water” (expression of campanula-derived F3′5′H gene under the control of E12 35S promoter)]
  • An expression cassette obtained by inserting the campanula F3′5′H gene cDNA obtained in Example 1 between the El2 35S promoter and the nopaline synthase terminator (nos terminator) described in Patent Document 3 is a binary vector pBinPLUS (van Engelen). et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995) and the resulting plasmid was designated as pSPB2564.
  • pSPB2564 was introduced into Agrobacterium tumefaciens Agl0.
  • Example 5 Introduction of pSPB2564 into rose variety “Noblesse” (expressing F3′5′H gene derived from campanula under the control of El2 35S promoter)] Agrobacterium into which pSPB2564 was introduced was transformed into a salmon pink rose variety “Noblesse” to obtain three transformants. When anthocyanidin pigment analysis of petals was performed, accumulation of delphinidin was confirmed in all three individuals, and the delphinidin content rate was a maximum of 98.9% (average 51.4%). The analysis values of the transformants are shown in Table 5 below.
  • Example 7 Introduction of pSPB2564 into rose cultivar “Pichia baranche” (expressing F3′5′H gene derived from campanula under the control of El2 35S promoter)] Using Agrobacterium into which pSPB2564 was introduced, a thin salmon pink rose variety “Pichia barranche” was transformed to obtain 11 transformants. When anthocyanidin pigment analysis of petals was performed, accumulation of delphinidin was confirmed in 1 out of 11 individuals, and the delphinidin content was a maximum of 99.3%. The analysis values of the transformants confirmed to produce delphinidin are shown in Table 7 below.
  • Example 8 Introduction of pSPB2564 into rose variety “Topless” (expressing Campanula-derived F3′5′H gene under the control of El2 35S promoter)] Salmon pink rose variety “Topless” was transformed with Agrobacterium into which pSPB2564 was introduced, and 11 transformants were obtained. When anthocyanidin pigment analysis of petals was performed, accumulation of delphinidin was confirmed in 10 out of 11 individuals, and the delphinidin content was 99.4% (average 64.4%). The analysis values of the transformants in which delphinidin production was confirmed are shown in Table 8 below.
  • pSPB5202 was introduced into Agrobacterium tumefaciens Agl0. Using this transformed Agrobacterium, a pink rose variety “Fame” was transformed by the method described in Patent Document 3, and 56 transformants were obtained. Of the 52 individuals that analyzed the anthocyanidin pigment in petals, only 4 individuals were able to confirm the accumulation of delphinidin, and the delphinidin content was 10.8% (average 3.9%) at most. The analysis values of representative transformants are shown in Table 9 below.
  • Pansy F3'5'H promoter allows pansy F3'5'H gene to be expressed well in roses (see Patent Document 9), and heat shock protein terminator is extremely effective for the expression of heterologous genes in plants. (Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332), however, these transformed rose petals produced very little delphinidin, and Campanula F3'5 ' It was suggested that the H gene did not function sufficiently.
  • a specific promoter and a specific F3'5'H gene combination or a specific promoter and a specific F3'5'H gene and a specific terminator This indicates that it is necessary to select a combination of genes.
  • the DNA fragment obtained by PCR was cloned into pTOPO.
  • a DNA fragment obtained by digesting the obtained plasmid with KpnI and PacI and a DNA fragment obtained by digesting pSPB3756 with KpnI and PacI were ligated to obtain pSPB5201.
  • PSPB5201 digested with SmaI and SpeI was ligated with the campanula cDNA obtained in Example 1, and the resulting binary vector was designated as pSPB5204.
  • pSPB5204 was introduced into Agrobacterium tumefaciens Agl0. Using this transformed Agrobacterium, the pink rose variety “Fame” was transformed by the method described in Patent Document 3 to obtain 63 transformants. Of 61 individuals subjected to anthocyanidin pigment analysis in petals, only 8 individuals were able to confirm the accumulation of delphinidin, and the delphinidin content was 2.8% (average 1.3%) at the maximum.
  • the perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase promoter is capable of expressing the perilla-derived anthocyanin 3-acyltransferase gene well in rose, petunia and chrysanthemum (see Patent Document 9). Very little delphinidin production was observed in rose petals, suggesting that the campanula F3'5'H gene did not function well. This means that in order to efficiently produce delphinidin in roses, a combination of a specific promoter and a specific F3'5'H gene, or a specific promoter and a specific F3'5'H gene and a specific terminator gene This indicates that it is necessary to select a combination.
  • the present invention can be suitably used for the production of rose plants whose flower color has been changed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子、及び該遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドの提供。

Description

新規カンパニュラフラボノイド３’，５’－水酸化酵素遺伝子及びその使用
　本発明は、植物細胞に外来の遺伝子を導入して遺伝子操作をする技術に関する。より詳しくは、本発明は、新規カンパニュラフラボノイド３’，５’－水酸化酵素遺伝子、及び該遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミド、該プラスミドを用いたアグロバクテリウム法による形質転換による、花弁中のデルフィニジン含有量が著しく高められた園芸種バラ植物の生産方法に関する。
　植物の品種改良方法には、（ｉ）オシベとメシベを掛け合わせる交雑、（ｉｉ）自然に又は人為的に生じる突然変異、（ｉｉｉ）遺伝子組換えなどの方法がある。このうち、遺伝子組換え技術を利用すると、その種のもつ遺伝的制約に束縛されることなく、有用な遺伝子を目的植物で発現させることにより、その植物に新しい形質を付与することが可能となる。このようにして作製された遺伝子組換え植物はすでに世界中で広範囲に栽培されている。
　花色の成分には、アントシアニン、カロテノイド、ベタレインなどがある。アントシアニンは、フラボノイドと総称される二次代謝物のメンバーで、フェニルアラニンから多くの酵素の働きにより合成される。アントシアニンの色はその構造に依存する。すなわち、アントシアニンの発色団であるアントシアニジンのＢ環の水酸基の数が増加する程青くなる。主要なアントシアニジンであるデルフィニジン、シアニジン、ペラルゴニジンは、この順に、Ｂ環の水酸基の数が多い。多くの青い花にはデルフィニジンに由来するアントシアニンが蓄積している。また、アントシアニンを修飾する芳香族アシル基（クマロイル基、カフェオイル基など）の数が増加するとアントシアニンの色は青くなり（すなわち、吸収極大値が長波長にシフトする）、また、アントシアニンの安定性が増すことが知られている。特に、複数の芳香族アシル基が結合したアントシアニンはポリアシル化アントシアニンと呼ばれ、リンドウやチョウマメなどの青い花弁に含まれる（Plant J. 54, 737-749, 2008参照）。アントシアニンのその生合成に関わる酵素やそれをコードする遺伝子は既に多くの植物から単離されている（Plant J. 54, 737-749, 2008参照）。アントシアニンの色は、それが局在する液胞のｐＨや、その他のフラボノイド、金属イオンなどの存在にも依存する。すなわち、アントシアニンは液胞のｐＨが低いと赤く、中性であると青く変化する。フラボンやフラボノールはコピグメントとも呼ばれ、アントシアニンと共存するとアントシアニンを青く見せる効果がある。また、鉄やアルミニウムイオンはアントシアニンのＢ環の水酸基に配位することにより、アントシアニンを青くすることが知られている。
　植物は多様な色の花を咲かせるが、全ての色の花を咲かせることができる種は少ない。これは種によって合成できる色素が遺伝的に決まっているからである。例えば、バラ、カーネーション、キク、ユリ、ガーベラなどには、天然には、青や紫色の品種がない。その大きな理由は、これらの植物は、デルフィニジンを合成するために必要なフラボノイド３’，５’－水酸化酵素（以下、「F3’5’H」ともいう。）遺伝子を持っていないからである。F3’5’H遺伝子を花弁中で発現させることにより、デルフィニジンを生産させ、花の色を青くしようとする試みがいくつか報告されている。これらの研究から、花弁中のデルフィニジン含有率を高め、花の色を青い方向に変えるためには、以下に述べるように、種毎に適切なプロモーターと適切なF3’5’H遺伝子を選択することが重要であることが伺えるが、その選択は予測困難である。
　F3’5’Hが欠損しているペチュニアにおいてF3’5’H遺伝子を発現させるとデルフィニジンに由来するアントシアニン量が増加する（Nature, 1993, 366, 276-279, FEBS Lett. 1999, 461, 241-245）。また、シアニジンを蓄積するタバコ（Nicotiana tabacum）においてF3’5’H遺伝子を発現させるとデルフィニジンが合成され、花色はやや青みを帯びる（FEBS Lett. 1999, 461, 241-245）。
　以下の非特許文献１には、タバコにおいて、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下でカンパニュラ、トルコギキョウ、ペチュニア由来のF3’5’H遺伝子を発現させた場合、カンパニュラF3’5’H遺伝子が最も効率よくデルフィニジンを生産することが記載されている（同書要約参照）。
　特許文献１には、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下でペチュニア由来のF3’5’H遺伝子をバラに導入したという記載があるが（同書実施例９参照）、カンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子はタバコにおいて導入されているに過ぎず、バラ植物体やバラ花弁でのデルフィニジンの生産、花色の変化については記載されていない。
　また、以下の非特許文献２には、チョウマメとバーベナのF3’5’H遺伝子をバーベナで発現させた場合、チョウマメ由来の遺伝子を発現させた場合の方がデルフィニジン生産量が多く、花色も明瞭に変化したことが記載されている。
　また、以下の特許文献２には、ペチュニア、リンドウ、チョウマメ、サイネリア、トルコギキョウ、パンジー、ラベンダー由来のF3’5’H遺伝子をバラにおいて発現させたところ、パンジー由来のF3’5’H遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はバラ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターの制御下で発現させた場合に、総アントシアニジンの数１０％のデルフィニジンが生成し、バラではパンジー由来のF3’5’H遺伝子がカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター又はバラ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターの制御下で良好に機能することが記載されている。
　以下の非特許文献３には、エンハンサーが付加されたカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（El2 35S）プロモーターは、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターよりも、外来遺伝子を高効率で発現することが記載されている。El2 35Sプロモーターの制御下にあるパンジーF3’5’H遺伝子を導入したバラは、デルフィニジンを生産し、花の色は変化する。導入する品種によっては、デルフィニジンを総アントシアニジン量の95%以上含み、花の色が青紫色に変化したバラを得ることができ、これらの内の１つは既に市販されている（品種登録番号第２０９９２号）。
　また、以下の特許文献３には、El2 35Sプロモーターの制御下にあるパンジーF3’5’H遺伝子とEl2 35Sプロモーターの制御下にあるアイリスジヒドロフラボノール４－還元酵素（以下、「DFR」という。）遺伝子とバラDFRの二本鎖RNAとを転写するカセットを導入したバラでは、導入バラ品種の中においては品種に拘らず、デルフィニジンの含有率が１００％に近くなり、花の色も変化したことが記載されている。
　商品として提供しうるバラの花色を変化させるためには、花弁中のデルフィニジン含有量が高くなることは当然に求められるものの、バラの生育に悪影響を与えないことが重要である。これは、デルフィニジンを高発現する遺伝子組換えバラを親として用いて交配育種する際にも重要である。換言すれば、生育の良いバラ園芸種において、花弁中のデルフィニジン含有量をできるだけ高めることができる、すなわち、F3'5'Hを高発現することができる特定の高発現プロモーターと特定配列を有するF3'5'Hの特定の組合せを含む形質転換用プラスミドが必要とされている。
　ところで、以下の特許文献４には、キク品種インプルーブドレーガン、ダークスプレンデッドレーガンにおいては、バラのカルコンシンターゼプロモーターを用いてパンジー由来のF3’5’H遺伝子を転写させることにより、デルフィニジンが５０％以上蓄積し、花色が青く変化した遺伝子組換えキクが得られたことが記載されている。
　以下の特許文献５においては、キク品種94-765においては、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー、ペチュニア、ロベリア由来のF3'5’H遺伝子をキク由来のフラバノン３－水酸化酵素遺伝子由来のプロモーターとタバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’非翻訳領域を利用して発現したところ、カンパニュラ、バーベナ、サイネリア、パンジー由来のF3’5’H遺伝子が比較的良好に機能し、総アントシアニジンの２５％以上のデルフィニジンを生成した。同書には、これらのうちカンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子がキクではもっとも良好に機能し、５０％以上のデルフィニジンを生成したことが記載されている。
　構成的なプロモーターであるMac1プロモーター、花弁特異的なプロモーターであるキンギョソウ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター、花弁特異的なプロモーターであるペチュニア由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーターは、ペチュニアのF3’5’H遺伝子をカーネーションにおいて発現させるために用いられている。この場合、前記した花弁特異的な二種のプロモーターは、Mac1プロモーターよりも多くのデルフィニジンを生成した（以下の特許文献６参照）。カーネーションの花弁においては、ペチュニアＤＦＲ遺伝子のプロモーターやアントシアニジン合成酵素遺伝子のプロモーターは、外来遺伝子を転写させるのに有効であることが示されている（それぞれ、以下の特許文献７と８参照）。その他の花弁特異的なプロモーターとして、パンジーのF3’5’H遺伝子のプロモーター（以下の特許文献９参照）、シソのアントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子プロモーター（以下の特許文献１０参照）、サイネリアF3’5’H遺伝子のプロモーター（以下の特許文献１１）が報告されている。
　以上に述べたように、異種の植物においてF3’5’H遺伝子を発現させ、デルフィニジンを生産させることはできるものの、目的の植物にどの植物由来のF3’5’H遺伝子をどのプロモーターを利用して発現させればよいかは、予想することは困難であり、デルフィニジンを高効率で生産させる、すなわち全アントシアニジン量のうちのデルフィニジン含有率を８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上にするためには、試行錯誤や複雑高度な実験などが必要である。
　また、一般に、花の色を青く変化させるためには、デルフィニジンの含有率を、総アントシアニジン量の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％に上昇させる必要があるが、そのためには、単にF3’5’H遺伝子を過剰発現させるだけでは不十分なことが多い。例えば、カーネーションの場合には、ジヒドロフラボノール４－還元酵素（DFR）が欠損している白いカーネーションに、F3’5’H遺伝子とペチュニアDFR遺伝子を発現させることによりデルフィニジンがほぼ１００％になり、花色も青く変化した組換えカーネーションが得られている（以下の特許文献１２参照）。バラにおいては、バンジー由来のF3’5’H遺伝子とアイリス由来のDFR遺伝子を過剰発現させるとともに、バラのDFR遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジン含有率がほぼ１００％になり、花色が青く変化した組換えバラが得られている（以下の特許文献３参照）。キクに置いては、パンジー由来のF3’5’H遺伝子を過剰発現させるとともに、キクのF3’H遺伝子の発現を抑制することにより、デルフィニジンの含有率を上昇させている（以下の特許文献４参照）。
特許第３４０３１９６号公報（ＷＯ９３／１８１５５） ＷＯ２００４／０２０６３７ ＷＯ２００５／０１７１４７ ＷＯ２００９／０６２２５３ ＷＯ２０１０／１２２８４９ ＷＯ９４／２８１４０ ＷＯ９６／０３６７１６ ＷＯ２００９／０６２２５９ ＷＯ２０１０／１２２８５０ ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０５３８８６ ＰＣＴ／ＪＰ２０１０／０７０５１６ ＷＯ０６／３６７１６
Biosci. Biotechnol. Biochem., 67(1), 161-165, 2003 Plant Biotechnology 2006, 23, 5-11 Plant Cell Physiol. (1996) 37 : 49-59
　かかる状況下、本発明が解決しようとする課題は、生育の良いバラ園芸種において、花弁中のデルフィニジン含有量をできるだけ高めることができる、すなわち、F3'5'Hを高発現することができる特定の高発現プロモーターと特定配列を有するF3'5'Hの特定の組合せを含む形質転換用プラスミドを提供することである。
　上記課題を解決すべく、本願出願人らは鋭意検討し、実験を重ねた結果、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に特定配列を有するカンパニュラ由来のF3’5’H遺伝子を含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により特定品種のバラ植物を形質転換した結果、花弁で高含有率のデルフィニジンを蓄積する形質転換バラ植物を得ることができることを発見し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りのものである。
　［１］以下の（ａ）～（ｄ）：
　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
　（ｂ）配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９７％以上の配列同一性を有し、かつ、フラボノイド－３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
　（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイド－３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
　［２］カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に、前記［１］に記載のポリヌクレオチドが作用可能な状態で連結されたプラスミド。
　［３］作用可能な状態でｎｏｓターミネーターがさらに連結されている、前記［２］に記載のプラスミド。
　［４］バラ園芸種（Rosa hybrida）を、前記［２］又は［３］に記載のプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換して、花弁中のデルフィニジン含有量が８０％以上である形質転換バラ植物又はその子孫を生産する方法。
　［５］前記花弁中のデルフィニジン含有量が８５％以上である、前記［４］に記載の方法。
　［６］前記花弁中のデルフィニジン含有量が９０％以上である、前記［５］に記載の方法。
　［７］前記花弁中のデルフィニジン含有量が９５％以上である、前記［６］に記載の方法。
　［８］前記［４］～［７］のいずれかに記載の方法により生産された形質転換バラ植物又はその子孫。
　本発明のカンパニュラフラボノイド－３’，５’－水酸化酵素遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換すれば、バラ園芸種の花弁中のデルフィニジン含有量を著しく高めることができる。
　本発明のポリヌクレオチド（配列番号１）はカンパニュラ由来のF3’5’Hをコードしており、521残基からなる。本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列、又はその相当のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチド、あるいは当該アミノ酸配列と特定の配列相同性、好ましくは配列同一性を有し、かつ、フラボノイド－３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からも選択される。少なくとも９７％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドが好ましい。
　本発明のポリペプチドには、配列番号１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつフラボノイド－３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子も含まれる。ここで、本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得ら れるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001"、"Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997"などに記載されている方法を利用することができる。
　本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリン ジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃、特に、0.1×SSC、0.1％SDS、65℃、又は0.1×SSC、0.1％SDS、70℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現 することが可能である。
　本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列は、フラボノイド－３’、５’－水酸化酵素活性が維持される限り、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよい。
　本明細書中、用語「同一性」及び「相同性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」及び「相同性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」及び「相同性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
　また、本明細書に記載される「同一性」及び「相同性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（version 9.5, Oxford Molecular Ltd., Oxford, England）のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。
　本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
　生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
　あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
　本発明のポリヌクレオチドはカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターとともにプラスミドに挿入される。３５Ｓプロモーターとして、植物形質転換体で汎用される３５Ｓプロモーターにエンハンサー配列を２つタンデムに並べて連結することにより発現を強化されたEl2 35Sプロモーター（上掲）が好ましい。本発明のポリヌクレオチドと３５Ｓプロモーターは作用可能な状態となるよう連結され、例えばプロモーターの下流に着目のポリヌクレオチドが配置される。本発明のプラスミドはバラ園芸種の形質転換に使用される。
　本発明中、用語「バラ園芸種」とは、分類学上の位置付けではバラ科バラ属の植物（学名：Rosa hybrida）のことをいう。バラ園芸種は、樹形と花の大きさにより主にハイブリッド・ティー系、フロリバンダ系、ポリアンサ系などに分けられるが、いずれの系統でも花弁に含まれる主要な色素（アントシアニン）はシアニジン型とペラルゴニジン型の２種類のみである。本発明は、バラの花弁に含まれる主なアントシアニンをデルフィニジン型に変換する技術であり、これらの種や系統に好適に用いることができる。本発明は、シアニジン型の品種（例えば、クールウォーター、オーシャンソング、フェイムなど）、又はペラルゴニジン型の品種（例えば、ノブレス、トップレス、ピーチアヴァランチェなど）のいずれにも適用できる。
　本発明のプラスミドはプロモーター以外の因子、例えばターミネーター、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等の調節配列；薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーを更に含んでもよい。ターミネーターはｎｏｓターミネーターが好ましく、着目のポリヌクレオチドの下流に配置される。本明細書中、「ｎｏｓターミネーター」とは、Agrobacterium tumefaciens のTiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列をいう。
　以下、実施例に従って本発明を具体的に説明する。
［実施例１：カンパニュラF3’5’H cDNAの単離］
　DNAデータベースGenBankに登録されているカンパニュラ（Campanula medium）のF3'5'H cDNA（アクセション番号D14590）の翻訳配列に基づいて２種のプライマーCamF1 (5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’、配列番号３)とCamR1 (5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'、配列番号４)を合成した。市販のカンパニュラの蕾の花弁からRNeasy Mini Plant Kit (QIAGEN社)を用いてRNAを抽出し、RT-PCRキットを用いて1st strand DNAを合成した。この1st strand DNAを鋳型に、上記プライマーを用いてPCRを実施した。得られたDNA断片をpCR-TOPO IIにクローニングした。この内、クローン＃４（pSPB2561）の塩基配列をＤＮＡシークエンサーの解析により決定した（配列番号１）。アクセション番号D14590に登録されているF3’5’Hが523残基からなるのに対し、クローン＃４がコードするF3’5’Hは521残基からなり、D14590に登録されているF3’5’Hに対し９６％の配列同一性を示した。
［参考例１：バラ品種「クールウォーター」へのpSPB130の導入（パンジー由来F3’5’H遺伝子とトレニア由来5AT遺伝子の構成的発現）］
　特許文献３に記載されたバイナリーベクターpSPB130（パンジーのF3’5’H遺伝子とトレニアのアントシアニン５－アシル基転移酵素遺伝子を植物中で構成的に発現させるベクター）をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを、特許文献３に記載された方法で、藤色系のバラ品種「クールウォーター」に導入し、１６４個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行ったところ、１６４個体のうち５１個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高７６．１％（平均３６．６％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例２：バラ品種「クールウォーター」へのpSPB2564の導入（E12 35Sプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
　実施例１で取得したカンパニュラのF3’5’H遺伝子ｃDNAを、特許文献３に記載されたEl2 35Sプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター（ｎｏｓターミネーター）の間に挿入した発現カセットをバイナリーベクターpBinPLUS（van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995）に挿入し、得られたプラスミドをpSPB2564とした。pSPB2564をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、藤色系のバラ品種「クールウォーター」を形質転換し、５５個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行ったところ、５５個体のうち４８個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高９７．３％（平均６１．２2％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例３：バラ品種「フェイム」へのpSPB2564の導入（E12 35Sプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、１１４個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った１０７個体のうち４６個体でデルフィニジンの蓄積を確認し、デルフィニジン含有率は最高９８．９％（平均５１．２％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例４：バラ品種「フェイム」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、55個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、55個体のうち28個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高98.9％（平均51.4％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例５：バラ品種「ノブレス」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてサーモンピンク系のバラ品種「ノブレス」を形質転換し、３個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、3個体すべてでデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高98.9％（平均51.4％）であった。
　形質転換体の分析値を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例６：バラ品種「オーシャンソング」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いて藤色系のバラ品種「オーシャンソング」を形質転換し、40個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、40個体のうち33個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.2％（平均39.7％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例７：バラ品種「ピーチアバランチェ」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いて薄サーモンピンク系のバラ品種「ピーチアバランチェ」を形質転換し、11個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、11個体のうち１個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.3％であった。
　デルフィニジンを生産が確認された形質転換体の分析値を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［実施例８：バラ品種「トップレス」へのpSPB2564の導入（El2 35Sプロモーター制御下でカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子を発現）］
　pSPB2564を導入したアグロバクテリウムを用いてサーモンピンク系のバラ品種「トップレス」を形質転換し、11個体の形質転換体を得た。花弁のアントシアニジン色素分析を行ったところ、11個体のうち10個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.4％（平均64.4％）であった。
　デルフィニジン生産が確認された形質転換体の分析値を以下の表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
［参考例２：バラ品種「フェイム」へのpSPB5202の導入（パンジー由来F3’5’Hプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
　特許文献９に記載されたプラスミドpSFL620をHindIIIとPstIで消化して得られるパンジー由来F3’5’Hプロモーター配列と、実施例１で得られたカンパニュラのｃDNA配列と、プラスミドpRI201-AN（タカラバイオ株式会社）由来の熱ショック蛋白質ターミネーターを連結して、バイナリーベクターpBinPlusに挿入した。得られたバイナリーベクターをpSPB5202とした。pSPB5202をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、ピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、５６個の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った５２個体のうち、デルフィニジンの蓄積が確認できたのは４個体のみで、デルフィニジン含有率は最高でも１０．８％（平均３．９％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
　パンジー由来F3’5’Hプロモーターは、パンジー由来のF3’5’H遺伝子をバラにおいて良好に発現させ（特許文献９参照）、また、熱ショック蛋白質ターミネーターは異種遺伝子の植物での発現にきわめて有効である（Plant Cell Physiol（2010） 51, 328-332）とされているにもかかわらず、これらの形質転換バラ花弁ではデルフィニジンの生産が認められたのはごく僅かであり、カンパニュラF3’5’H遺伝子が十分に機能しなかったことが示唆された。これは、特定のバラ品種でデルフィニジンを効率よく生産させるためには、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子の組み合わせ、あるいは特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子と特定のターミネーター遺伝子の組み合わせの選択が必要であることを示している。
［参考例３：バラ品種「フェイム」へのpSPB5204の導入（シソ由来３ＡＴプロモーター制御下でのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子の発現）］
　特許文献１０に記載されたプラスミドpSFL205をHindIIIとBamHIで消化することにより、シソ由来アントシアニン3-アシル基転移酵素のプロモーター部分を含む約１．１ｋｂのDNA断片を回収し、HindIIIとBamHIで消化したpBinPlusと連結し、pSPB3756を得た。また、特許文献１０に記載されたプラスミドpSPB3311を鋳型にして、３種の合成ヌクレオチドプライマー、Pf3AT-FW-Sal（5’-ATGTCGACTAAATGTATGTAATTAAC-3’、配列番号５）、Pf3ATt-R1（5’-ACTCAACACTTTATTAATTG-3’、配列番号６）、Pf3ATt-F1（5’-ATGTAACAATTAATTAAGTG-3’、配列番号７）を用いたＰＣＲで、シソ由来アントシアニンアシル基転移酵素のターミネーター部分の５’末端に制限酵素SalI認識配列を付加し、同ターミネーター部分にあるPacI認識部位のうちの5'側にあるPacI認識部位を破壊した。PCRで得られたDNA断片をpTOPOにクローニングした。得られたプラスミドをKpnIとPacIで消化して得られるDNA断片と、pSPB3756をKpnIとPacIで消化して得られるDNA断片とを連結し、pSPB5201とした。SmaIとSpeIで消化したpSPB5201と実施例１で得たカンパニュラｃDNAとを連結し、得られたバイナリーベクターをpSPB5204とした。pSPB5204をアグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）Agl0に導入した。この形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、特許文献３に記載された方法で、ピンク系のバラ品種「フェイム」を形質転換し、６３個体の形質転換体を得た。花弁中のアントシアニジン色素分析を行った６１個体のうち、デルフィニジンの蓄積が確認できたのは８個体のみで、デルフィニジン含有率は最高でも２．８％（平均１．３％）であった。
　代表的な形質転換体の分析値を以下の表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 Del：デルフィジニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
デルフィニジン含有率：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合
　シソ由来アントシアニン３－アシル基転移酵素プロモーターは、シソ由来アントシアニン３－アシル基転移酵素遺伝子をバラ、ペチュニア、キクにおいて良好に発現させた（特許文献９参照）にも拘らず、これらの形質転換体のバラ花弁ではデルフィニジンの生産が認められたのはごく僅かであり、カンパニュラF3’5’H遺伝子が十分い機能しなかったことが示唆された。このことは、バラでデルフィニジンを効率よく生産させるためには、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子の組み合わせ、あるいは、特定のプロモーターと特定のF3’5’H遺伝子と特定のターミネーター遺伝子の組み合わせの選択が必要であることを示している。
　本発明のカンパニュラフラボノイド－３’，５’－水酸化酵素遺伝子をカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーターの制御下に含むプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換すれば、特定品種のバラ植物の花弁中のデルフィニジン含有量を著しく高めることができる。したがって、本発明は、花色が変更されたバラ植物の生産に好適に利用可能である。

Claims (8)

  1. 　以下の（ａ）～（ｄ）：
    　（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
    　（ｂ）配列番号１の塩基配列又はその相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９７％以上の配列同一性を有し、かつ、フラボノイド３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    　（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
    　（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボノイド３’、５’－水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
    からなる群から選ばれるポリヌクレオチド。
  2. 　カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの制御下に、請求項１に記載のポリヌクレオチドが作用可能な状態で連結されたプラスミド。
  3. 　作用可能な状態でｎｏｓターミネーターがさらに連結されている、請求項２に記載のプラスミド。
  4. 　バラ園芸種（Rosa hybrida）を、請求項２又は３に記載のプラスミドを用いてアグロバクテリウム法により形質転換して、花弁中のデルフィニジン含有量が８０％以上である形質転換バラ植物又はその子孫を生産する方法。
  5. 　前記花弁中のデルフィニジン含有量が８５％以上である、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記花弁中のデルフィニジン含有量が９０％以上である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記花弁中のデルフィニジン含有量が９５％以上である、請求項６に記載の方法。
  8. 　請求項４～７のいずれか１項に記載の方法により生産された形質転換バラ植物又はその子孫。
PCT/JP2013/061116 2012-04-16 2013-04-12 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用 WO2013157502A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014511199A JP6157454B2 (ja) 2012-04-16 2013-04-12 新規カンパニュラフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子及びその使用
US14/394,329 US20150074855A1 (en) 2012-04-16 2013-04-12 Novel campanula flavonoid 3',5'-hydroxylase gene and its use
KR1020147027030A KR101540074B1 (ko) 2012-04-16 2013-04-12 신규 캄파눌라 플라보노이드 3＇,5＇-수산화 효소 유전자 및 그의 사용
CA2870428A CA2870428A1 (en) 2012-04-16 2013-04-12 Novel campanula flavonoid 3',5'-hydroxylase gene and its use
RU2014145832A RU2640248C2 (ru) 2012-04-16 2013-04-12 Новый ген флавоноид 3,5-гидроксилазы колокольчика и его применение
EP13777591.2A EP2845901A4 (en) 2012-04-16 2013-04-12 NOVEL CAMPANULA FLAVONOID-3 ', 5'-HYDROXYLASE GENE AND USE THEREOF
CN201380020230.8A CN104245934A (zh) 2012-04-16 2013-04-12 新型风铃草类黄酮3’,5’-羟化酶基因及其使用

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012-092716 2012-04-16
JP2012092716 2012-04-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013157502A1 true WO2013157502A1 (ja) 2013-10-24

Family

ID=49383459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/061116 WO2013157502A1 (ja) 2012-04-16 2013-04-12 新規カンパニュラフラボノイド３'，５'－水酸化酵素遺伝子及びその使用

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20150074855A1 (ja)
EP (1) EP2845901A4 (ja)
JP (1) JP6157454B2 (ja)
KR (1) KR101540074B1 (ja)
CN (1) CN104245934A (ja)
CA (1) CA2870428A1 (ja)
CO (1) CO7131376A2 (ja)
RU (1) RU2640248C2 (ja)
WO (1) WO2013157502A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7246314B2 (ja) * 2017-10-03 2023-03-27 サントリーホールディングス株式会社 青系花色を有する形質転換植物及びその作出方法
CN113862288B (zh) * 2021-10-25 2023-06-20 杭州市农业科学研究院 三叶青ThF3’5’H基因及其应用

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018155A1 (en) 1992-03-02 1993-09-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel plant gene
WO1994028140A1 (en) 1993-05-20 1994-12-08 International Flower Developments Pty. Ltd. Transgenic flowering plants
WO1996036716A1 (en) 1995-05-16 1996-11-21 International Flower Developments Pty. Ltd. Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
WO2004020637A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 International Flower Developments Pty. Ltd. Flavonoid 3',5'hydroxylase gene sequences and uses therefor
WO2005017147A1 (ja) 2003-08-13 2005-02-24 International Flower Developments Proprietary Limited 花色が変更されたバラの製造方法
WO2006036716A1 (en) 2004-09-22 2006-04-06 Corning Incorporated Phase-resolved measurement for frequency-shifting interferometry
WO2009062253A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified chrysanthemums
WO2009062259A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified plants with altered inflorescence
JP2010053886A (ja) 2008-08-26 2010-03-11 Jtekt Corp スラストころ軸受の保持器
JP2010070516A (ja) 2008-09-19 2010-04-02 Kao Corp 油性固形アイライナー組成物
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2010122849A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2012036290A1 (ja) * 2010-09-17 2012-03-22 サントリーホールディングス株式会社 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI891054A (fi) * 1988-03-08 1989-09-09 Ciba Geigy Ag Kemiskt reglerbara dna-sekvenser och gener samt olika anvaendningar daerav.

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3403196B2 (ja) 1992-03-02 2003-05-06 協和醗酵工業株式会社 新規植物遺伝子
WO1993018155A1 (en) 1992-03-02 1993-09-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel plant gene
WO1994028140A1 (en) 1993-05-20 1994-12-08 International Flower Developments Pty. Ltd. Transgenic flowering plants
WO1996036716A1 (en) 1995-05-16 1996-11-21 International Flower Developments Pty. Ltd. Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
JP2006512057A (ja) * 2002-08-30 2006-04-13 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド フラボノイド３’，５’ヒドロキシラーゼ遺伝子配列およびその使用法
WO2004020637A1 (en) 2002-08-30 2004-03-11 International Flower Developments Pty. Ltd. Flavonoid 3',5'hydroxylase gene sequences and uses therefor
WO2005017147A1 (ja) 2003-08-13 2005-02-24 International Flower Developments Proprietary Limited 花色が変更されたバラの製造方法
WO2006036716A1 (en) 2004-09-22 2006-04-06 Corning Incorporated Phase-resolved measurement for frequency-shifting interferometry
WO2009062253A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified chrysanthemums
WO2009062259A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 International Flower Developments Pty Ltd Genetically modified plants with altered inflorescence
JP2010053886A (ja) 2008-08-26 2010-03-11 Jtekt Corp スラストころ軸受の保持器
JP2010070516A (ja) 2008-09-19 2010-04-02 Kao Corp 油性固形アイライナー組成物
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2010122849A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 デルフィニジンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2012036290A1 (ja) * 2010-09-17 2012-03-22 サントリーホールディングス株式会社 花弁にデルフィニジンを含有するユリの生産方法

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Biocomputing: Informatics and Genome Projects", 1993, ACADEMIC PRESS
"Computational Molecular Biology", 1988, OXFORD UNIVERSITY PRESS
"Computer Analysis of Sequence Data: Part I", 1994, HUMAN PRESS
"Sequence Analysis Primer", 1991, M-STOCKTON PRESS
AUSUBEL: "Current Protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY & SONS
BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 67, no. 1, 2003, pages 161 - 165
FEBS LETT., vol. 461, 1999, pages 241 - 245
HEINJE, G.: "Sequence Analysis in Molecular Biology", 1987, ACADEMIC PRESS
NATURE, vol. 366, 1993, pages 276 - 279
PLANT BIOTECHNOLOGY, vol. 23, 2006, pages 5 - 11
PLANT CELL PHYSIOL, vol. 51, 2010, pages 328 - 332
PLANT CELL PHYSIOL., vol. 37, 1996, pages 49 - 59
PLANT J., vol. 54, 2008, pages 737 - 749
SAMBROOK; RUSSELL: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", vol. 3, 2001, COLD SPRING HARBOR, LABORATORY PRESS
See also references of EP2845901A4
VAN ENGELEN ET AL., TRANSGENIC RESEARCH, vol. 4, 1995, pages 288 - 290

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10870861B2 (en) 2015-07-01 2020-12-22 Suntory Holdings Limited Creation of chrysanthemum with blue flower color
US11299742B2 (en) 2016-03-31 2022-04-12 Suntory Holdings Limited Plant having blue flower color and breeding method therefor

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140135789A (ko) 2014-11-26
EP2845901A4 (en) 2016-01-27
JPWO2013157502A1 (ja) 2015-12-21
JP6157454B2 (ja) 2017-07-05
CO7131376A2 (es) 2014-12-01
CN104245934A (zh) 2014-12-24
RU2640248C2 (ru) 2017-12-27
RU2014145832A (ru) 2016-06-10
EP2845901A1 (en) 2015-03-11
KR101540074B1 (ko) 2015-07-28
CA2870428A1 (en) 2013-10-24
US20150074855A1 (en) 2015-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6774285B1 (en) Nucleic acid sequences encoding flavonoid 3′-hydroxylase and methods of altering flower color therewith
EP2423312B1 (en) Method for production of chrysanthemum plant having delphinidin-containing petals
EP2143322B1 (en) Method for production of moth orchid having modified flower color
EP2602324B1 (en) Method for production of chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
JP6157454B2 (ja) 新規カンパニュラフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子及びその使用
TWI471090B (zh) Commelina and other flavonoids 3 ', 5'-hydroxylase gene
RU2590722C2 (ru) Способ получения лилий, содержащих в лепестках делфинидин
JP2009153402A (ja) 新規の４クマロイルＣｏＡリガーゼ活性を有するタンパク質とそれをコードするＤＮＡ

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13777591

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014511199

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147027030

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2870428

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14394329

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013777591

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013777591

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14251782

Country of ref document: CO

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014145832

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A