CN104245934A - 新型风铃草类黄酮3’,5’-羟化酶基因及其使用 - Google Patents
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Abstract
本发明在于提供新型风铃草类黄酮3’，5’-羟化酶基因及在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下包含该基因的质粒。
Description
【技术领域】
本发明涉及在植物细胞中导入外来基因从而进行基因操作的技术。更详细而言，本发明涉及新型风铃草类黄酮3’，5’-羟化酶基因及在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下包含该基因的质粒、通过使用该质粒的农杆菌法进行转化从而可显著提高花瓣中的花翠素含量的园艺品种月季植物的生产方法。
【背景技术】
植物的品种改良方法有(i)雄蕊与雌蕊交配杂交、(ii)自然或人为产生的突变、(iii)基因重组等的方法。其中，利用基因重组技术时，不受其种类所具有的遗传制约的束缚，而通过使有用的基因在目标植物中表达，可赋予该植物新的形质。这样制作的基因重组植物在世界中已被广范围栽培。
花色成分中有花色素苷、类胡萝卜素、甜菜素(Betalain)等。花色素苷是被统称为类黄酮的次级代谢产物的成员，从苯丙氨酸通过多种酶发挥功能而被合成。花色素苷的颜色依赖于其结构。即，伴随着作为花色素苷发色团的花色素B环羟基数目的增加而变蓝。作为主要花色素的花翠素、花青素、花葵素按照上述顺序B环的羟基数目增多。很多蓝色的花中蓄积有来自花翠素的花色素苷。此外，已知修饰花色素苷的芳香族酰基(香豆酰基、咖啡酰基等)的数目增加时，花色素苷的颜色变蓝(即，最大吸收波长向长波长方向移动)，而且，花色素苷的稳定性增加。特别是，多个芳香族酰基键合的花色素苷被称作聚酰化花色素苷，包含于龙胆、蝶豆等的蓝色花瓣(参照Plant J.54,737-749,2008)。涉及花色素苷生物合成的酶、编码该酶的基因已从很多植物中被单独分离(参照Plant J.54,737-749,2008)。花色素苷的颜色也依赖于其所在液泡的pH、其他的类黄酮、金属离子等的存在。即，花色素苷在液泡的pH低时变红，为中性时变蓝。黄酮、黄酮醇也被称作辅色素，与花色素苷共存时具有使花色素苷显蓝色的效果。此外，已知通过使铁、铝离子配位于花色素苷B环的羟基，可使花色素苷变蓝。
植物可开出各种各样颜色的花，但能够开出全部颜色的花的种类很少。这是因为不同种类可合成的色素受遗传决定。例如，月季、康乃馨、菊花、百合、非洲菊等中没有天然的蓝色、紫色的品种。其主要理由是上述植物不具有用于合成花翠素所需的类黄酮3’，5’-羟化酶(以下，也称作“F3’5’H”。)基因的原因。据报道有以下几种尝试，即通过使F3’5’H基因在花瓣中表达，产生花翠素而使花的颜色变蓝。从上述研究可看出为了提高花瓣中的花翠素含有率，使花的颜色向蓝色方向改变，如下所述的那样，选择每个种类适合的启动子和适合的F3’5’H基因尤为重要，但其选择难以预测。
在F3’5’H缺损的矮牵牛中使F3’5’H基因表达时，来自花翠素的花色素苷的量增加(Nature，1993,366,276-279,FEBS Lett.1999,461,241-245)。此外，在蓄积有花青素的烟草(Nicotianatabacum)中使F3’5’H基因表达时，花翠素被合成，花色稍微带有蓝色(FEBS Lett.1999,461,241-245)。
在以下的非专利文献1中记载有，在烟草中在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下使来自风铃草、洋桔梗、矮牵牛的F3’5’H基因表达时，风铃草F3’5’H基因最高效地产生花翠素(参照非专利文献1的说明书摘要)。
在专利文献1中有在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下将来自矮牵牛F3’5’H基因导入月季这样的记载(参照专利文献1的实施例9)，但只不过是将来自风铃草的F3’5’H基因导入到烟草中，关于月季植物体、月季花瓣中花翠素的产生、花色的变化并没有记载。
此外，在以下的非专利文献2中记载有使蝶豆与马鞭草的F3’5’H基因在马鞭草中表达时，在使来自蝶豆的基因表达的情况下花翠素的产生量多，花色也发生明显的变化。
此外，在以下的专利文献2中记载有使来自矮牵牛、龙胆、蝶豆、瓜叶菊、洋桔梗、三色堇、薰衣草的F3’5’H基因在月季中表达时，在使来自三色堇的F3’5’H基因在花椰菜花叶病毒35S启动子或来自月季的查尔酮合成酶基因的启动子的控制下表达的情况下生成了总花色素数量10％的花翠素，在月季中来自三色堇的F3’5’H基因在花椰菜花叶病毒35S启动子或来自月季的查尔酮合成酶基因的启动子的控制下良好地发挥功能。
在以下的非专利文献3中记载有附加了增强子的花椰菜花叶病毒35S(El2 35S)启动子比花椰菜花叶病毒35S启动子更高效地表达外来基因。导入了El2 35S启动子控制下的三色堇F3’5’H基因的月季产生花翠素且花的颜色发生变化。根据导入的品种，可得到包含总花色素量的95％以上的花翠素且花的颜色变为蓝紫色的月季，其中之一已有市售(品种注册号第20992号)。
此外，在以下的专利文献3中记载有在导入了在El2 35S启动子的控制下的三色堇F3’5’H基因、在El2 35S启动子的控制下的鸢尾二氢黄酮醇4-还原酶(以下，称为“DFR”。)基因和转录月季DFR双链RNA的表达盒的月季中，在导入月季品种之中不管品种如何，花翠素的含有率接近100％，花的颜色也发生了变化。
为了使作为商品可提供的月季的花色改变，当然需要提高花瓣中的花翠素含量，然而，重要的是不对月季的生育带来不良影响。这对于将高表达花翠素的基因重组月季作为亲代使用来进行交配育种时也很重要。换言之，在生育良好的现代月季中，需要可尽可能提高花瓣中的花翠素含量即可高表达F3'5'H的包含具有特定高表达启动子和特定序列的F3'5'H的特定组合的转化用质粒。
可是，在以下的专利文献4中记载有在菊花品种ImprovedReagan、艳玫(Dark Splendid Reagan)中，通过使用月季的查尔酮合成酶启动子使来自三色堇的F3’5’H基因转录，可得到花翠素蓄积50％以上且花色变蓝的基因重组菊花。
在以下的专利文献5中，在菊花品种94-765中，将来自风铃草、马鞭草、瓜叶菊、三色堇、矮牵牛、山梗菜的F3'5’H基因利用来自菊花的来自黄烷酮3-羟化酶基因的启动子和烟草乙醇脱氢酶基因的5’非翻译区进行表达时，来自风铃草、马鞭草、瓜叶菊、三色堇的F3’5’H基因比较良好地发挥功能且生成了总花色素的25％以上的花翠素。在专利文献5中记载了在它们之中来自风铃草的F3’5’H基因在菊花中最为良好地发挥功能且生成了50％以上的花翠素。
作为组成型启动子的Mac1启动子、作为花瓣特异性启动子的来自金鱼草查尔酮合成酶基因的启动子、作为花瓣特异性启动子的来自矮牵牛查尔酮合成酶基因的启动子被用于使矮牵牛的F3’5’H基因在康乃馨中表达。此时，所述花瓣特异性的两种启动子比Mac1启动子更多地生成花翠素(参照以下的专利文献6)。显示出在康乃馨的花瓣中，矮牵牛DFR基因的启动子、花色素合成酶基因的启动子对使外来基因的转录有效(分别参照以下的专利文献7和8)。作为其他的花瓣特异性启动子，报道了三色堇F3’5’H基因的启动子(参照以下的专利文献9)、紫苏的花色素苷3-酰基转移酶基因启动子(参照以下的专利文献10)、瓜叶菊F3’5’H基因的启动子(以下的专利文献11)。
如上所述，虽然可在不同种类的植物中使F3’5’H基因表达从而产生花翠素，然而难以预测在目标植物中将来自何种植物的F3’5’H基因利用哪种启动子表达好，为了高效产生花翠素即总花色素量中的花翠素含有率成为80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上，需要进行反复试验、复杂高度的实验等。
此外，通常为了使花的颜色变蓝，需要使花翠素的含有率上升到总花色素量的50％以上、优选60％以上、更优选70％以上、更优选80％以上、更优选85％以上、更优选90％以上、更优选95％以上、更优选99％以上、最优选100％，因此，仅单单使F3’5’H基因过剩表达，不充分的情况很多。例如，在为康乃馨的情况下，通过在二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)缺损的白色康乃馨中使F3’5’H基因和矮牵牛DFR基因表达，可得到花翠素成为大致100％，花色也变蓝的重组康乃馨(参照以下的专利文献12)。在月季中，通过使来自三色堇的F3’5’H基因和来自鸢尾的DFR基因过剩表达，同时抑制月季的DFR基因的表达，可得到花翠素含有率成为大致100％，花色变为蓝色的重组月季(参照以下的专利文献3)。在菊花中，通过使来自三色堇的F3’5’H基因过剩表达，同时抑制菊花的F3’H基因的表达，可使花翠素的含有率上升(参照以下的专利文献4)。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：日本专利第3403196号公报(WO93/18155)
专利文献2：WO2004/020637号公报
专利文献3：WO2005/017147号公报
专利文献4：WO2009/062253号公报
专利文献5：WO2010/122849号公报
专利文献6：WO94/28140号公报
专利文献7：WO96/036716号公报
专利文献8：WO2009/062259号公报
专利文献9：WO2010/122850号公报
专利文献10：PCT/JP 2010/053886号公报
专利文献11：PCT/JP 2010/070516号公报
专利文献12：WO06/36716号公报
【非专利文献】
非专利文献1：Biosci.Biotechnol.Biochem.，67(1)，161-165,2003
非专利文献2：Plant Biotechnology 2006,23,5-11
非专利文献3：Plant Cell Physiol.(1996)37:49-59
【发明内容】
在相关情况下，本发明欲解决的课题在于提供在生育良好的现代月季中可尽可能提高花瓣中的花翠素含量，即可高表达F3'5'H的包含具有特定高表达启动子和特定序列的F3'5'H的特定组合的转化用质粒。
为了解决上述课题，本申请申请人进行了深入研究、反复实验，结果发现，在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下使用包含具有特定序列的来自风铃草的F3’5’H基因的质粒，通过农杆菌法来转化特定品种的月季植物，结果可得到在花瓣中蓄积了高含有率的花翠素的转化月季植物，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示。
[1]一种多核苷酸，其特征在于，选自以下(a)～(d)：
(a)多核苷酸，由序列号1的碱基序列组成；
(b)多核苷酸，与由序列号1的碱基序列或其互补的碱基序列组成的多核苷酸具有至少97％以上的序列同一性，且编码具有类黄酮3’、5’-羟化酶活性的蛋白质；
(c)多核苷酸，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；及
(d)多核苷酸，编码具有与序列号2的氨基酸序列具有至少97％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有类黄酮3’、5’-羟化酶活性的蛋白质。
[2]一种质粒，其特征在于，在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下，在所述[1]所述的多核苷酸可作用的状态下被连接。
[3]根据所述[2]所述的质粒，其特征在于，在可作用的状态下进一步连接有nos终止子。
[4]一种方法，其特征在于，将现代月季(Rosa hybrida)使用所述[2]或[3]所述的质粒通过农杆菌法进行转化来生产花瓣中的花翠素含量为80％以上的转化月季植物或其后代。
[5]根据所述[4]所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为85％以上。
[6]根据所述[5]所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为90％以上。
[7]根据所述[6]所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为95％以上。
[8]一种转化月季植物或其后代，其特征在于，根据所述[4]～[7]中任一项所述的方法来生产。
只要使用在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下包含本发明的风铃草类黄酮-3’,5’-羟化酶基因的质粒并通过农杆菌法进行转化，即可显著提高现代月季花瓣中的花翠素含量。
【具体实施方式】
本发明的多核苷酸(序列号1)编码来自风铃草的F3’5’H，由521个残基组成。在本说明书中，用语“多核苷酸”意味着DNA或RNA。本发明的多核苷酸并不限定于序列号1的碱基序列或由编码由与其相当的氨基酸序列(序列号2)组成的蛋白质的多核苷酸组成，也可选自由该碱基序列或其互补序列组成的多核苷酸，或者编码与该氨基酸序列具有特定的序列同源性、优选序列同一性，且具有类黄酮-3’、5’-羟化酶活性的蛋白质的多核苷酸。优选至少具有97％以上序列同一性的多核苷酸。
在本发明的多肽中还包含下述DNA分子，即与序列号1的碱基序列在严谨的条件下杂交，且编码具有类黄酮-3’、5’-羟化酶活性的蛋白质。在此，在本说明书中，“在严谨的条件下杂交的多核苷酸”是指例如将由序列号1的碱基序列或其互补的碱基序列组成的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等所得到的多核苷酸。作为杂交的方法，例如可利用“Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol.3，Cold Spring Harbor，Laboratory Press 2001”、“Ausubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons 1987-1997”等中记载的方法。
在本说明书中，“严谨的条件”可为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”例如为5×SSC、5×登哈特溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。此外，“中严谨条件”例如为5×SSC、5×登哈特溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严谨条件”例如为5×SSC、5×登哈特溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃，特别是0.1×SSC、0.1％SDS、65℃或0.1×SSC、0.1％SDS、70℃的条件。在上述条件中，越提高温度越可期待能够高效得到具有高同源性的DNA。其中，作为影响杂交严谨性的要素，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员通过适当选择上述要素即可实现相同的严谨性。
由本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列只要可维持类黄酮-3’、5’-羟化酶活性，则1或数个的氨基酸也可发生缺失、取代及/或附加。
在本说明书中，用语“同一性”及“同源性”意味着在多肽序列(或氨基酸序列)或者多核苷酸序列(或碱基序列)中的2条链之间，可决定构成该链的各氨基酸残基彼此或各碱基彼此的相互适合关系中相同的物质的量(数目)，意味着两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间序列相关性的程度，“同一性”及“同源性”可容易地计算。已知有数目众多的测定两个多核苷酸序列或多肽序列间同源性的方法，用语“同一性”及“同源性”为本领域技术人员所周知(例如，参照Lesk，A.M.(Ed.)，Computational Molecular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，D.W.(Ed.)，Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Academic Press，New York，(1993)；Grifin，A.M.&Grifin，H.G.(Ed.)，Computer Analysis of Sequence Data：Part I，Human Press，New Jersey，(1994)；von Heinje，G.，SequenceAnalysis in Molecular Biology，Academic Press,New York，(1987)；Gribskov，M.&Devereux，J.(Ed.)，Sequence Analysis Primer，M-Stockton Press，New York，(1991)等)。
此外，本说明书中记载的“同一性”及“同源性”的数值除特别明示的情况外，可为本领域技术人员使用公知的使用同源性检索程序计算的数值，优选使用MacVector应用程序(version 9.5，Oxford MolecularLtd.，Oxford，England)的ClustalW程序计算的数值。
本发明的多核苷酸(核酸、基因)“编码”着眼的蛋白质。在此，“编码”意味着使着眼的蛋白质在具备其活性的状态下表达。此外，“编码”包含下述双方的含义，将着眼的蛋白质作为连续的结构序列(外显子)来编码或介由间隔序列(内含子)来编码。
如以下的实施例所记载的那样，具有天然的碱基序列的基因例如可通过由DNA测序仪进行解析来得到。此外，编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的DNA能够以具有天然的碱基序列的DNA作为基础，使用常用的部位特定诱导突变法、PCR法来合成。例如，将欲修饰的DNA片段通过天然的cDNA或基因组DNA的限制酶处理来得到，并以其为模板使用导入了所期望的突变的引物来实施部位特定诱导突变法、PCR法，从而得到所期望的修饰的DNA片段。其后，只要将导入了该突变的DNA片段与编码成为目标的酶的其他部分的DNA片段进行连接即可。
或者为了得到编码由缩短的氨基酸序列组成的酶的DNA，例如，将编码比成为目标的氨基酸序列长的氨基酸序列，例如，全长氨基酸序列的DNA通过所期望的限制酶进行切割，其结果所得到的DNA片段未编码成为目标的氨基酸序列整体时，只要合成由不足部分的序列组成的DNA片段并进行连接即可。
本发明的多核苷酸与花椰菜花叶病毒35S启动子一起被插入到质粒中。作为35S启动子，优选通过在植物转化体中通用的35S启动子中串联排列连接2个增强子序列从而表达被强化的El2 35S启动子(上述)。本发明的多核苷酸与35S启动子被连接成可作用的状态，例如在启动子的下游配置着眼的多核苷酸。本发明的质粒被用于现代月季的转化。
在本发明中，用语“现代月季”是指在分类学上的定位中月季科月季属的植物(学名：Rosa hybrida)。根据树形和花的大小，现代月季主要分为杂交茶香月季(Hybrid Tea)类、丰花月季类、西洋樱草类等，但在任一种系统中花瓣所包含的主要色素(花色素苷)仅有花青素型与花葵素型的2种。本发明为可将月季花瓣所包含的主要花色素苷转换为花翠素型的技术，可适合地用于上述种类、系统。本发明还可应用于花青素型的品种(例如，冷水(cool water)、海洋之歌(oceansong)、Fame等)或花葵素型的品种(例如，贵族(Noblesse)、topless、蜜桃雪山(Peach Avalanche)等)中的任一种。
本发明的质粒还可进一步包含除启动子以外的因子，例如终止子、多聚腺苷化信号序列、复制起点序列(ori)等的调控序列；抗药性标记、荧光蛋白质标记、酶标记、细胞表面受体标记等的选择性标记。终止子优选nos终止子，被配置于着眼的多核苷酸的下游。在本说明书中，“nos终止子”是指来自Agrobacterium tumefaciens的Ti质粒的胭脂碱合成酶基因的终止子序列。
【实施例】
以下，根据实施例对本发明进行具体地说明。
【实施例1：风铃草F3’5’H cDNA的单独分离】
基于DNA数据库GenBank中注册的风铃草(Campanulamedium)F3'5'HcDNA(检索号D14590)的翻译序列来合成2种引物CamF1(5’-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3’、序列号3)和CamR1(5’-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3'、序列号4)。从市售的风铃草花蕾的花瓣使用RNeasy Mini Plant Kit(QIAGEN公司)来提取RNA，并使用RT-PCR试剂盒合成1st strand DNA。以该1st strandDNA为模板使用上述引物来实施PCR。将所得到的DNA片段克隆成pCR-TOPO II。在其内部，克隆#4(pSPB2561)的碱基序列通过DNA测序仪进行解析来确定(序列号1)。注册为检索号D14590的F3’5’H由523个残基组成，相对于此，克隆#4编码的F3’5’H由521个残基组成，相对于注册为D14590的F3’5’H显示出96％的序列同一性。
【参考例1：向月季品种“冷水”进行pSPB130的导入(来自三色堇F3’5’H基因与来自蓝猪耳5AT基因的组成型表达)】
将专利文献3所记载的双元载体pSPB130(使三色堇的F3’5’H基因与蓝猪耳的花色素苷5-酰基转移酶基因在植物中组成型表达的载体)导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Agl0中。将该经转化的农杆菌通过专利文献3所记载的方法导入淡紫色系的月季品种“冷水”中，从而得到了164个转化体。在进行花瓣中的花色素色素分析时，在164个转化体的51个转化体中确认到花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为76.1％(平均36.6％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表1所示。
【表1】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例2：向月季品种“冷水”进行pSPB2564的导入(在E12 35S启动子控制下来自风铃草F3’5’H基因的表达)】
将在专利文献3所记载的El2 35S启动子与胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)之间插入了实施例1取得的风铃草F3’5’H基因cDNA的表达盒插入到双元载体pBinPLUS(van Engelen et al.TransgenicResearch 4,288-290,1995)中，并将得到的质粒作为pSPB2564。将pSPB2564导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Agl0中。使用该经转化的农杆菌通过专利文献3记载的方法将淡紫色系的月季品种“冷水”进行转化，从而得到了55个转化体。在进行花瓣中的花色素色素分析时，在55个转化体的48个转化体中确认到花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为97.3％(平均61.22％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表2所示。
【表2】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例3：向月季品种“Fame”进行pSPB2564的导入(在E1235S启动子控制下来自风铃草F3’5’H基因的表达)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌将粉色系月季品种“Fame”进行转化，从而得到了114个转化体。在进行了花瓣中的花色素色素分析的107个转化体的46个转化体中确认到花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为98.9％(平均51.2％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表3所示。
【表3】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例4：向月季品种“Fame”进行pSPB2564的导入(在El2 35S启动子控制下表达来自风铃草的F3’5’H基因)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌将粉色系的月季品种“Fame”进行转化，从而得到了55个转化体。进行花瓣的花色素色素分析时，在55个转化体的28个转化体中可确认花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为98.9％(平均51.4％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表4所示。
【表4】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例5：向月季品种“贵族”进行pSPB2564的导入(在El2 35S启动子控制下表达来自风铃草的F3’5’H基因)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌将橙红色系的月季品种“贵族”进行转化，从而得到了3个转化体。进行花瓣的花色素色素分析时，在3个转化体中均可确认花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为98.9％(平均51.4％)。
转化体的分析值如以下的表5所示。
【表5】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例6：向月季品种“海洋之歌”进行pSPB2564的导入(在El2 35S启动子控制下表达来自风铃草的F3’5’H基因)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌将淡紫色系的月季品种“海洋之歌”进行转化，从而得到了40个转化体。进行花瓣的花色素色素分析时，在40个转化体的33个转化体中可确认花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为99.2％(平均39.7％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表6所示。
【表6】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例7：向月季品种“蜜桃雪山”进行pSPB2564的导入(在El2 35S启动子控制下表达来自风铃草的F3’5’H基因)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌将淡橙红色(salmon pink)系的月季品种“蜜桃雪山”进行转化，从而得到了11个转化体。进行花瓣的花色素色素分析时，在11个转化体的1个转化体中可确认花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为99.3％。
可确认产生花翠素的转化体的分析值如以下的表7所示。
【表7】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【实施例8：向月季品种“topless”进行pSPB2564的导入(在El235S启动子控制下表达来自风铃草的F3’5’H基因)】
使用导入了pSPB2564的农杆菌对橙红色系的月季品种“topless”进行转化，从而得到了11个转化体。进行花瓣的花色素色素分析时，在11个转化体的10个转化体中可确认花翠素的蓄积，花翠素含有率最高为99.4％(平均64.4％)。
可确认产生花翠素的转化体的分析值如以下的表8所示。
【表8】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
【参考例2：向月季品种“Fame”进行pSPB5202的导入(在来自三色堇F3’5’H启动子的控制下来自风铃草F3’5’H基因的表达)】
连接将专利文献9所记载的质粒pSFL620通过HindIII和PstI酶解所得到的来自三色堇的F3’5’H启动子序列、通过实施例1所得到的风铃草cDNA序列和来自质粒pRI201-AN(TaKaRa Bio株式会社)的热休克蛋白质终止子，并插入到双元载体pBinPlus中。将所得到的双元载体作为pSPB5202。将pSPB5202导入农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)Agl0中。使用该经转化的农杆菌通过专利文献3所记载的方法将粉色系的月季品种“Fame”进行转化，从而得到了56个转化体。在进行了花瓣中的花色素色素分析的52个转化体中，可确认花翠素蓄积的仅有4个转化体，花翠素含有率最高也仅为10.8％(平均3.9％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表9所示。
【表9】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
来自三色堇的F3’5’H启动子使来自三色堇的F3’5’H基因在月季中良好地表达(参照专利文献9)，此外，尽管热休克蛋白质终止子对在不同种基因的植物中的表达极为有效(Plant Cell Physiol(2010)51,328-332)，但在上述转化月季花瓣中可看到产生花翠素的极少，提示风铃草F3’5’H基因未充分发挥功能。这显示出为了在特定的月季品种中高效地产生花翠素，需要选择特定的启动子和特定的F3’5’H基因的组合，或者特定的启动子、特定的F3’5’H基因和特定的终止子基因的组合。
【参考例3：向月季品种“Fame”进行pSPB5204的导入(在来自紫苏3AT启动子的控制下来自风铃草F3’5’H基因的表达)】
通过将专利文献10所记载的质粒pSFL205由HindIII和BamHI进行酶解，回收包含来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶启动子部分的约1.1kb的DNA片段，并与由HindIII和BamHI酶解的pBinPlus进行连接，从而得到pSPB3756。此外，将在专利文献10中所记载的质粒pSPB3311作为模板，通过使用了3种合成核苷酸引物Pf3AT-FW-Sal(5’-ATGTCGACTAAATGTATGTAATTAAC-3’、序列号5)、Pf3ATt-R1(5’-ACTCAACACTTTATTAATTG-3’、序列号6)、Pf3ATt-F1(5’-ATGTAACAATTAATTAAGTG-3’、序列号7)的PCR，在来自紫苏的花色素苷酰基转移酶的终止子部分的5’末端附加限制酶SalI识别序列，并损坏位于该终止子部分的PacI识别部位中5'侧的PacI识别部位。将通过PCR所得到的DNA片段克隆成pTOPO。连接将所得到的质粒由KpnI和PacI酶解所得到的DNA片段和将pSPB3756由KpnI和PacI酶解所得到的DNA片段，并作为pSPB5201。连接由SmaI和SpeI酶解的pSPB5201和实施例1所得到的风铃草cDNA，并将所得到的双元载体作为pSPB5204。将pSPB5204导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Agl0中。使用该经转化的农杆菌通过专利文献3所记载的方法将粉色系的月季品种“Fame”进行转化，从而得到了63个转化体。在进行了花瓣中的花色素色素分析的61个转化体中，可确认花翠素蓄积的仅有8个转化体，花翠素含有率最高也仅为2.8％(平均1.3％)。
代表性的转化体的分析值如以下的表10所示。
【表10】
Del：花翠素、Cya：花青素、Pel：花葵素
花翠素含有率：总花色素中的花翠素的比例
尽管来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶启动子使来自紫苏的花色素苷3-酰基转移酶基因在月季、矮牵牛、菊花中良好地表达(参照专利文献9)，但在上述转化体的月季花瓣中可看到产生花翠素的极少，提示风铃草F3’5’H基因未充分发挥功能。这显示出为了在月季中高效产生花翠素，需要选择特定的启动子和特定的F3’5’H基因的组合，或者特定的启动子、特定的F3’5’H基因和特定的终止子基因的组合。
【产业上的利用可能性】
只要使用在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下包含本发明的风铃草类黄酮-3’，5’-羟化酶基因的质粒并通过农杆菌法进行转化，则可显著提高特定品种月季植物花瓣中的花翠素含量。因此，本发明可适合地用于花色被改变的月季植物的生产。
Claims (8)
1.一种多核苷酸，其特征在于，选自以下(a)～(d)：
(a)多核苷酸，由序列号1的碱基序列组成；
(b)多核苷酸，与由序列号1的碱基序列或其互补的碱基序列组成的多核苷酸具有至少97％以上的序列同一性，且编码具有类黄酮3’、5’-羟化酶活性的蛋白质；
(c)多核苷酸，编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质；及
(d)多核苷酸，编码具有与序列号2的氨基酸序列具有至少97％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有类黄酮3’、5’-羟化酶活性的蛋白质。
2.一种质粒，其特征在于，在花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下，在权利要求1所述的多核苷酸可作用的状态下被连接。
3.根据权利要求2所述的质粒，其特征在于，在可作用的状态下进一步连接有nos终止子。
4.一种方法，其特征在于，将现代月季即Rosa hybrida使用权利要求2或3所述的质粒通过农杆菌法进行转化来生产花瓣中的花翠素含量为80％以上的转化月季植物或其后代。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为85％以上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为90％以上。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述花瓣中的花翠素含量为95％以上。
8.一种转化月季植物或其后代，其特征在于，根据权利要求4～7中任一项所述的方法来生产。
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