PT89915B - Processo para a preparacao de sequencias de dna regulaveis quimicamente - Google Patents

Processo para a preparacao de sequencias de dna regulaveis quimicamente Download PDF

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Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE DNA REGULÁVEIS QUIMICAMENTE
tais transgénicos contendo estas construções quiméricas. Também são proporcionados uma sequencia de peptideo sinal, genes que codificam esta sequencia e genes de proteir.as PR recentemente identificados no processo do invento.As construções quiméricas e plantas e tecidos vegetais transgénicos podem ser usados num ensaio para novos reguladores quim i cos.
processo para a preparação das referidas sequências de DNA consiste em se activar a expressão no referido sistema de RNA a partir de um gene quimicamente regulável, se isolar o referido RNA, se fazer o despis, te diferencial de uma biblioteca genómica adequada, se isolar o clone genõmico, se subclonar o gene quimicamente regulável e se isolar a sequencia de DNA pretendida.
Campo do Invento presente invento relaciona-se com a regulação química de materiais genéticos e com novos materiais que podem assim ser regulados. Em particular rela ciona-se com sequências de DNA não codificadoras que, na presença de reguladores químicos, regulam a transcrição de outras sequencías de DNA em plantas.
Fundamento do Invento
Os avanços na tecnologia de
DNA recombinante acoplado aos avanços na tecnologia de transformação e regeneração de plantas tornar possível introduzir novo material genético em células vegetais, plantas ou tecidos vegetais, introduzindo assim novas características, e.g. fenótipos, que aumentem o valor da planta ou do tecido vegetal. Demonstrações recentes de plantas alteradas por engenharia genética resistentes a agentes patogénicos (EP-A 240 332 e EP-A 223 452) ou insectos (Vaeck, M. et al., Nature 328, 33 (1987)) e a produção de plantas tolerantes a herbicidas (DeBlock, M. et al., EMBOJ. 6, 2513 (1987 ) )puseram em evidência o potencial para melhoramento de culturas.As culturas alvo podem variar entre árvores e arbustos a flores ornamentais e culturas de campo. De facto é óbvio que a cultura pode ser uma cultura de tecidos vegetais cultivados num bio-reactor como fonte de alguns produtos naturais.
Nalguns casos será desejável controlar o tempo e/ou grau da expressão do material genético introduzido nas plantas, células vegetais ou tecido vegetal. Uma situação ideal séria a regulação da expressão de uma caracteristica introduzida por engenharia genética através
-4λ t
de um intermediário de regulação que pudesse ser fáci Imante aplicado em culturas de campo, arbustos ornamentais, bio-reactores, etc. Esta situação pode agora ser posta em prática pelo presente invento que, entre outras coisas, ê dirigido a um sistema de expressão de genes quiméricos quinu camente reguláveis compreendendo uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável acoplada por exemplo a um gene codificador de uma caracteristica fenotipica , de modo a que a expressão desta caracteristica fique sob o controle do regulador, e.g. de modo a que a expressão do gene regulado seja determinada pela presença ou ausência de um regulador quimico. Este sistema é a primeira demonstração do conceito de regulação química da expressão de genes quiméricos em plantas ou tecidos vegetais. Como tal ele permite a produção de plantas transgénicas ou tecidos vegetais transgénicos e o controle de caracteristicas expressas em função de um regulador quimico.
A. Revisão geral da tecnologia de transformação de plantas
Nesta área são conhecidos vários métodos para conseguir a transformação genética de plantas ou tecidos vegetais (i.e., a introdução estável de DNA estranho em plantas). Estes incluem a transformação por espécies de Agrobacterium e transformação por transferencia directa de genes.
1. Transformações mediadas por Agrobacterium
A. tumefac iens é o agente etiológico da excrecência em coroa, uma doença de uma larga gama de dicoti ledóneas e gimnospérmicas que resulta na formação de tumores ou excrecências em tecidos vegetais no local da infecção. Agrobacterium, que normalmente infecta a planta nos locais de feridas, é portadora de um grande elemento extracromossómico designado plasmideo Ti (j_ndutor de tumores).
Os plasmideos Ti contêm duas regiões necessárias à tumorogénese. Uma região é o T-DNA (DNA transferido) que consiste na sequencia de DNA que no final se encontra estávelmente transferido para o DNA genómico vegetal. A outra região necessária à tumorogénese é a região v i r (virulência) que tem sido implicada no mecanismo de transferencia. Apesar da região vir ser absolutamente necessária para uma transformação estável, o DNA v i r não é de facto transferido para a planta infectada. A transformação de células vegetais mediada pela infecção com Agrobacterium tumefac iens e subsequente transferencia do T-DNA sôzinho tem sido bem documentado. Ver, por exemplo, Bevan. M.W. e Chilton, M-D., Int.Rev. Genet 16, 357 (1982).
Após vários anos de intensa pesquisa em muitos 1aboratórios, o sistema Agrobacterium foi desenvolvido para permitir a transformação de rotina de uma variedade de tecidos vegetais. Tecidos representativos transformados deste modo incluem tabaco, tomate, girassol, algodão, colza, batata, soja e choupo. Se bem que a gama de hospedeiro para a transformação com o plasmideo Ti usando _A· tumef acéns como agente infeccioso seja conhecida como muito larga, o tabaco tem sido o hospedeiro de eleição devido â sua facilidade de manipulação.
Agrobacteri um rh i zogenes também tem sido usado como vector para a transformação de plantas. Aquela bactéria, que induz a formação de raizes em cabeleira em muitas espécies de plantas dicotiledóneas, é portadora de um grande elemento extracromossómico designado plasmideo Ri (indutor de raizes) que funciona de modo análogo ao plasmídeo Ti de A. tumefaciens. A transformação que utiliza A. rh i zogenes desenvolveu-se de modo análogo à de A. tumefac iens e tem sido utilizada com êxito para transformar, por exemplo, alfafa, Sol anum n igrum J_ e choupo.
2. Transferência directa de genes
Têm sido desenvolvidos vários processos da chamada transferencia directa de genes para transformar plantas e tecidos vegetais sem a utilização de um intermediário Agrobacterium. Na transformação directa de protoplastos a internaiização de material genético exógeno num protoplasto pode ser aumentada através do uso de um agente quimico ou campo eléctrico. 0 material exógeno pode então ser integrado no genoma nuclear. 0 trabalho inicial foi conduzido em tabaco onde se demonstrou a introdução de um DNA estranho assim como a sua transmissão às plantas filhas, ver e.g. Paszkowski, J. et al., EMBOJ 3, 2717 (1984); e Potrykus, I. et al. Mol. Gen. Genet 199, 169 (1985).
Protoplastos de monocoti1edóneas também foram transformados por este processo por exemplo em Tr i t i cum , monococcum, Lo 1 i um multiflorum (falso centeio
Italiano), milho e milho doce Black Mexican.
Como alternativa o DNA exógeno pode ser introduzido em células ou protoplastos por microinjecção Uma solução de DNA de plasmideo é injectada directamente na célula com uma agulha de vidro muito fina. Protoplastos de alfafa foram deste modo transformados com uma variedade de plasmidecs, ver e.g. Reich, T.J. et a 1. , Bio/technology 4, 1001 (1986).
Um processo desenvolvido mais recentemente para a transferencia directa de genes envolve o bombardeamento de células com microprojécteis portadores de DNA, ver Klein, T.M. et a 1., Nature 327, 70 (1987).Neste processo partículas de tungsténio revestidas com o DNA exógeno são aceleradas na direcção das células alvo, resultando numa expressão pelo menos transitória no exemplo descrito (cebo 1 a).
B. Regeneração do tecido vegetal transformado
Tal como existe uma variedade de métodos para a transformação de tecidos vegetais, existe uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir de tecidos vegetais. 0 método particular de regenera ção dependerá do tecido vegetal de partida e da espécie vege tal particular a ser regenerada. Nos últimos anos tornou-se possível regenerar muitas espécies de plantas a partir de tecidos de calos derivados de explantes vegetais. As plantas que podem ser regeneradas a partir de calos incluem monocoti1edóneas, tais como milho, arroz, cevada, trigo e centeio, e dicotiledóneas,tais como girassol, soja, algodão, colza e tabaco.
A regeneração de plantas a partir de tecidos transformados com A. tumefaciens foi demonstrada para várias espécies de plantas. Estas incluem girassol, tomate, trevo branco, colza, algodão, tabaco e choupo. Também foi demonstrada a regeneração de alfafa a partir de tecidos transformados com A. rhizogenes. A regeneração de plantas a partir dos protoplastos é uma técnica particularmente útil, ver Evans, D.A. et al., em: Handbook of Plant Cell Cultura, Vol. 1, MacMillan Publ. Ci. 1983, p.124. Quando uma espécie vegetal pode ser regenerada a partir de protoplastos então podem ser util izados os processos de transferencia directa de genes e a transformação não está dependente da utilização de A. tumefac iens.A regeneração de plantas a partir de protoplastos foi demonstrada para o arroz, tabaco, colza, batata, beringela, pepino, choupo e milho.
Os a/anços tecnológicos na tecnologia de transformação e regeneração de plantas evidenciaram o p otencial para o melhoramento de culturas através de de engenharia genética. Foram divulgadas plantas do tabaco e tomateiro alterados por engenharia genética que são resistentes as infecções, por exemplo ao vírus do mosaico do tabaco (TMV) e resistentes a diferentes classes de herbicidas. A resistência a insectos também foi introduzida por engenharia genética e plantas do tabaco e tomateiro.
C . Culturas célula res potencial da engenharia geneética não está limitado às culturas de campo e inclui melhoramento de espécies ornamentais, forragens e árvores.Um objectivo menos óbvio para a biotecnologia de plantas, que inclui apli-9-
cações de engenharia genética e de culturas de tecidos, é o aumento de produção de um vasto arranjod e compostos químicos derivados de plantas incluindo aromas, essências, pigmentos, edulcorantes naturais, alimentos industriais, compostos antimicrobianos e produtos farmaceuticos. As plantas podem produzir tais produtos secundários para afastar predadores potenciais, atrair polinizadores ou combater doenças infecciosas.
Podem ser estabelecidas culturas de células vegetais a partir de um arranjo impressivo de espécies vegetais e podem ser propagadas num bio-reactor. As espécies vegetais tipicas incluem muitas das que produzem produtos secundários de interesse comercial. Tem sido claramente demonstrado que numa série de plantas de importância sob o ponto de vista agrícola, podem ser induzidos e seleccio nados variantes genéticos estáveis derivados da cultura de tecidos de células somáticas vegetais (variação somaclonal). Advêm numerosas vantagens da produção de compostos secundários por culturas de tecidos vegetais. Estas incluem (1) a possibilidade de aumentar a pureza do produto resultante (2) a conversão de precursores pouco dispendiosos em produtos finais caros através da biotransformação e (3) o potencial para fornecer análogos de substratos â cultura para criar novos compostos.
D. Vantagens da expressão controlada de genes
Quer o alvo da engenharia genética de plantas seja uma cultura de campo, arbusto ornamental, flôr árvore ou cultura de tecido para usar num bio-reactor,uma vantagem importante é o controle da expressão do gene quimérico de modo a que ele seja expresso apenas na altura adequada e no grau adequado e, nalgumas situações em partes
particulares da planta. Por exemplo, para se conseguir um fenótipo desejável o gene quimérico pode necessitar de ser expresso em niveis de PZ da proteína total ou mais altos. Isto pode bem ser o caso para a resistência a fungos devido à expressão de quitinase quimérica ou resistência a insectos devido a uma maior expressão de inibidores de proteinases. Nestes casos a energia dispendida a produzir niveis elevados da proteína estranha pode resultar num detrimento para a planta enquanto que se o gene fôr expresso apenas quando se deseja, por exemplo na iminência de uma infestação por fungos ou insectos, o gasto de energia e portanto produção, poderá ser reduzida.
Como alternativa o fenótipo expresso pelo gene quimérico poderá resultar em efeitos adversos para a planta se expresso em alturas inadequadas do desenvolvimento. Por exemplo, se o produto do gene quimérico fôr uma hormona vegetal que induz a queda das vagens, a expressão precoce poderá levar à queda do fruto antes da maturação da semente resultando num decréscimo da produção. Neste caso seria muito mais vantajosos induzir a expressão deste tipo de gene numa altura mais adequada à queda das vagens ou que pelo menos não prejudique a planta.
Para os tecidos em cultura ou num bio-reactor a produção não controlada no tempo de um produto secundário poderá levar a um decréscimo da velocidade de cres cimento da cultura resultando num decréscimo da produção do produto. Portanto, será vantajoso permitir que a cultura cresça sem expressar o produto secundário e então induzir o gene quimérico numa altura adequada para permitir uma expressão optimizada do produto pretendido.
-11Face a considerações como estas, assim como outras, é claro que o controle do tempo, grau e/ou sitio da expressão do gene quimérico em plantas ou tecidos vegetais será altamente desejável. Será de particular valor comercial um controle que possa ser exercido fácil mente num campo, estufa ou bio-reactor.
E. Sistemas conhecidos de expressão regulável de genes em plantas
Conhecem-se vários genes de plantas que são induzidas por vários factores internos e externos incluindo hormonas vegetais, choque térmico, patogénios,ausência de oxigénio e luz. Apesar de poucos destes sistemas terem sido descritos deta1hadamente, no melhor caracterizado uma maior acumulação de mRNA leva a um nível mais alto do produto proteico especifico.
Como exemplo da regulação de genes por uma hormona vegetal, foi demonstrada a indução de mRNA abundantes na embriogénese tardia do algodoeiro pelo ácido abeissico (ABA), ver Galau, G.A. et al.,Plant Mol. Biol 7, 155 (1986). Num outro exemplo, o ácido giDerélico (GA3) induz os mensageiros da ma 1ato-sintetase nas sementes de feijoeiro e isozimas da alfa-amilase em camadas de aleurona da cevada, ver Rodriguez, D. et a 1., Plant Mol. Biol. 9,227 ( 1987) ;Nolan. R.C. etaL, Plant Mol Biol. 8, 13(1 987).
A regulação dos genes das proteínas de choque térmico da soja foi estudada deta1hadamente.0 tratamento de plantas durante várias horas a 40°C resulta na síntese de novo de várias das chamadas proteínas de choque térmico (Key, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78,3526
(1981)). Foram isolados vários destes genes e a sua regulação estudada deta1hadamente. A expressão destes genes é controlada principalmente a nível de transcrição. 0 promotor do gene hsp70 foi fundido ao gene da neomicina-fosfotransferase II(Npt II) e o gene quimérico foi induzido por choque térmico (Spena, A. et a 1., EMBO J. 4, 2736 ( 1985 ))apesar de um nível mais baixo do que os genes de choque térmico endógeno.
Uma outra classe de genes induzíveis em plantas inclui os genes reguladores pela luz, principalmente o gene que codifica a subunidade pequena da ribulose-1,3-bifosfato-carboxilase (RUBISCO). Morelli, G. et a 1, (Nature 315, 200 ( 1985 )) e Herrera-Estrella, L. et a 1., (Nature 310, 115 (1984)) demonstraram que as sequências delimitantes 5' de um gene RUBISCO de ervilha pode conferir (g)acidade de indução pela luz a um gene marcador quando ligado de modo quimérico. Esta observação estendeu-se a outros genes induziveis pela luz como seja a proteína de ligação à c1orof i1 a a/b.
Os genes da á 1 coo 1-desidrogenase (adh) de milho têm sido extensivamente estudados. 0 gene a d hl-s do milho foi isolado e verificou-se que uma porção da sequencia de DNA delimitante 5' foi capaz de induzir a expressão de um gene quimérico (e.g., c1oranfenico1-aceti1 -transferase, CAT) quando o tecido transformado transitóriamente foi sujeito a condições de anaerobiose (Howard. E. et al. , Planta 1 70, 535 ( 1987) ).
Um grupo de químicos conhecidos como seguradores foi desenvolvido para proteger ou segurar colheitas contra aplicações de herbicidas potencialmente prejudiciais. Se bem que não tenha sido desenvolvido um me-
canismo geral para a acção de tais compostos, a regulação de genes naturalmente reguláveis por tais compostos é um possível mecanismo. Foi recentemente descrita a indução de níveis elevados de uma glutationa-S-transferase (GST) em milho tratado com o segurador éster benzilico do ácido 2-cloro-4-(trif1uorometi1)-5-meti1-tiazo 1ecarboxi1ico, ver Wiegand, R.C., et al., Plant Mol. Biol 7, 235(1986). Se bem que o nível de mRNA de GST seja elevado quando do tratamento com o segurador, o mecanismo que conduz à elevação não foi divulgado.
Muitas plantas, quando reagem com hipersensibi1idade aos vários patogénios, são estimulades para produzir um grupo de proteínas de baixo peso molecular, extraíveis com ácidos e relacionadas com a potogénese (PR) (Van Loon, L.C., Plant Mol. Biol. 4,111 (1985)).No entanto, é particularmente interessante a observação que as mesmas proteínas PR acumulam-se em niveis elevados nas plantas tratadas com químicos tais como ácido poliacrílico e ácido acetilsalicilico (Gianinazzi, S. et al., J.Gen. Virol.23,1 (1974) ; Wh ite, R.F. Virology 99 , 410 ( 1979 )). A presença de proteínas PR tem sido correlacionada com a indução de resistência local e sistémica contra uma larga gama de patogénios. Observou-se a expressão constitutiva de proteínas PR num híbrido intereespecifico do tabaco resistente ao virus do mosaico do tabaco (TMV) (Ahl, P. et al., Plant Sei. Lett 26, 173 ( 1982 )). Ainda, a imuno-prec i p itação de produtos de tradu_ç ção in v itro usando mRNA de tabaco infectado com TMV ou quimicaiente tratado (Corne 1 i ssen, B.J.C. et al., EMBO d. 5, (1986);Carr, J.P. et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 82, 7999 (1985) indicou que o nível aumentado de proteína PR foi um resultado da acumulação de RNA. Portanto, a indução de genes da proteína PR por químicos ou patogénios proporciona um método para abordar o problema da regulação química de expressão de genes em plantas e tecidos vegetais.
λ
Sumário do Invento presente invento inclui (a) sequências de DNA quimicamente reguláveis, de preferencia na forma substancialmente pura; (b) uma ou mais sequências de DNA quimicamente reguláveis em combinação com uma ou mais partes mas não a totalidade de qualquer uma das sequências de DNA codificador com as quais as sequências reguláveis estão associadas em genes naturais; (c) genes quiméricos contendo uma ou mais sequências de DNA quimicamente reguláveis;(d) vectores contendo sequências ou genes de (a), (b) e/ou (c); (e) plantas sementes e tecido vegetal contendo os genes quiméricos quimicamente reguláveis; e (f) regulação química de genes quiméricos quimicamente reguláveis em tecidos vegetais. 0 invento inclui ainda um peptideo sinal, uma sequencia de DNA codificadora do peptideo sinal e as formas substancialmente puras de vários genes naturais induzidos quimicamente.
presente invento engloba ainda várias utilizações das sequências de DNA quimicamente reguláveis: (a) regulação de genes quiméricos em células propagadas num bio-reactor (b) um ensaio para reguladores químicos, (c) regulação do desenvolvimento da planta, (d) regulação da esterilidade da planta e (e) regulação da expressão de genes quiméricos e/ou heterólogos numa planta transformada. Outres utilizações e vantagens serão aparentes da descrição detalhada que se segue do invento.
Breve descrição das figuras
Fig. 1 Mapa parcial de endonucleases de restrição de lambda tobchrPR 1013. 0 genoma do fago
-15\
recombinante de 49kb está descrito com os braços direito e esquerdo de lambda indicados. A inserção de 19kb do tabaco está alargada abaixo do mapa de lambda. A localização do gene PR-la (caixa a tracejado) e a direcção de transcrição (seta) estão indicados.
P=Pst, H=HindIII, C=ClaI, R=EcoRI.
Fig. 2. Está apresentada a construção de pBS-PR1013Cla a partir de lambda tobchrPR1013. 0 fragmento de DNA de 19 kb entre os dois sitios Ciai foi subclonado no plasmideo, Bluescript. C = ClaI , LGT agarose = agarose de temperatura de qelificação baixa.
Fig. 3. Está descrita a construção de pBS-PRIO13Eco a partir de lambda tobchrPR1013.0 fragmento EcoRI de 3,6 kb contendo o gene PR-1A derivado de lambda tobchrPR1013 foi subclonado em B1uescript.R=EcoRI, LGT agarose=agarose de gelificação baixa.
Fig. 4. Está apresentada a construção de pBS-PR 1013Eco a partir de pBS-PR1013C1 a.0 fragmento EcoRI de 3,6kb contendo o gene PR-la foi subclonado no sitio EcoRI do plasmideo Bluescript, C=ClaI, R=EcoRI, LGT=agarose de temperatura de gelificação baixa.
Fig. 5. Está apraentada a construção de pBS-PR1013 EcoAPst a partir de p B S-P R10 13 E c o . 0 fragmento PstI de 600 pb foi removido do pBS-PR1013Eco.P = Ps11, R=EcoRI, X=XhoI, S=SalI, LGT agarose=agarose de baixa temperatura de gelificação.
-16Λ
Fig.6. Está apresentada a construção de pBS-PRIO13Eco Pst Xho a partir de pBS-PR1013Eco Pst. 0 fragmento Xhol de 2 kb foi eliminado do plasmideo pBS-PR1013 Eco Pst.R=EcoRi, P=PstI, X=XhoI, S=SalI, LGTagarose=agarose de baixa temperatura de gelificação.
Fig. 7 .Está ilustrada a construção de pCIB270 a partir de pBI101.3 e pBS-PR1013Eco Pst Xho.O fragmento PstI-Xhol contendo parte do gene PR-la e a sequencia delimitante 5' foi subclonado em pBI1013 digerido com SalI-BamHI. Os sítios Xhol e Sall são compatíveis e quando ligados destroem ambos os sítios de restrição. 0 sitio PstI foi adaptado a um sitio BamHI usando um adaptador molecular. X=XhoI, P=PstI, (X/S)=sitio de fusão Xhol e Sall. Nenhuma das enzimas cortará agora neste sitio (X/S).LB= extremo esquerdo do T-DNA, RB=extremo direito do T-DNA. A direcção de transcrição a partir da região indutivel PR-la está representada pela seta em pCIB270. A área a tracejado em pCIB270 representa o sitio de processamento 3' do gene NOS. A área sombreada de pCIB270 representa o gene da neomicinarfosfotrans ferase II. A área com riscas de pCIB270 representa o promotor NOS.
Fig.8. Está apresentada a construção de Μ13mp18-PR1013Eco Pst Xho e Μ13mp19-PR 1013Eco Pst Xho. 0 fragmento Pstl-Asp718 contendo parte da sequencia codificadora de PR-la e a sequencia delimitante 5' foi subclonado a partir de pBS-PR1013Eco Pst Xho ou M13mpl8 ou 19 digerido com Asp 718-PstI. R = EcoRI, H = HindIII, P = PstI,K = KpnI (Asp 718 é um isosquiSómero de Kpnl), LGT agarose=agarose de baixa temperatura de gelificação.
-17Fig. 9 Fluxograma descrevendo a conversão do codão ATG de PR-la num sitio NcoI.O DNA de cadeia simples de Ml3mp18-PR1013Eco Pst Xho está representado por uma linha a cheio. A sequencia TCATGG foi convertida em CCATGG por mutagénese dirigida especifica de sitio.K = Kpm I , X=XhoI, B=BstEII, P=PstI.
Fig. 10. Está apresentada a construção de pCIB268. 0 fragmento BstEII-PstI derivado da forma replicativa de M13mpl8-PR1013Eco Pst Xho. Nco foi subclonado em pBS-PR1013Eco Pst Xho digerido com BsTEII-PstI para formar pCIB268. X = XhoI, B = BstEII, N = NcoI, P = PstI.
Fig. 11 Está apresentada a construção de pcIB269 a partir de pBS-GUSl.2 e pCIB268. X=XhoI, N=NcoI, P=PstI. A caixa a tracejado de pCIB269 descreve as sequências do gene GUS e a caixa sombreada descreve as sequências derivadas do gene PR-la.
Fig. 12.Está apresentada a construção de pBS-GUS1.2 pBS-GUSl.2 foi feito através de ura ligação de três vias a partir de fragmentos derivados de pRAJ265, pB122Ll e pBluescript. S = Sal I, R = EcoRI, N = NcoI.
Fig. 13 Está apresentada a construção de pCIB271 a partir de pCIB269 e pCIB200 X=XhoI,
N=NcoI, R=£coRI, S=SalI, (S/X)=fusão dos sítios Sall e Xhol, LGT agarose = agarose de baixa temperatura de gelificação.
Fig. 14.Mapa de endonuc1eases de restrição do pCIB219. Este plasmideo foi construído pela adição de um adaptador EcoRI/Xhol ao fragmento Xhol/EcoRI de pCIB269 contendo os genes PR-1 e GUS e ligação deste ao pCIB712 cortado com Sa1I.
Fig, 15. Mapa de endonucleases de restrição de pCIB272.Este plasmideo foi construído por ligação de um fragmento Asp718I/BamHI do pCIB282 contendo um gene PR-1/GUS(-833 a + 1 do PR-la) ao pCIB200 cortado com Asp718I/BamHI.
Fig. 16 Mapa de endonuc1eases de restrição de pCIB273. Este plasmideo foi construído por ligação de um fragmento Asp718I/BamHI do pCIB283 contendo um gene PR-1/GUS(-603 a +1 do PR-la) ao pCIB200 cortado com Asp7181/BamH I.
Fig.17. Mapa de endonuc1eases de restrição do pClB1004.Este plasmideo foi construído por ligação de um fragmento Xhol/Ncol do pCIB269 (contendo o promotor PR-la) com o gene BT retirado do pCIB10/35BT(607)como fragmento NcoI/BamHI e pCIB710 digerido com Sal I/BamHI.
Fig. 18 Mapa de endonuc1eases de restrição de pCIB200/PR 1-BT. Este plasmideo foi construído a partir de pCIB1004 e pCIB200.
Fig. 19. Mapa de endonuc1eases de restrição do pCIB1207.Um fragmento Xbal de 5,8kb do clone genómico em lambda contendo o gene AHAS de Arabidopsis foi clonado em Bluescript cortado com Xbal.
Fig. 20.Mapa de endonuc1eases de restrição de pCIB1216.Um fragmento Neol/Xbal de 3,3kb do pCIB1207 foi clonado em pCIB269 que tinha sido cortado com Ncol e Xbal para remover o gene GUS.
Fig. 21. Mapa de endonuc1eases de restrição do pCIB1233. Um fragmento Kpnl/Xbal de 4,2kb foi isolado a partir de pCIB1216 e ligado a pCIB200 que tinha sido cortado com Kpnl e Xbal.
Fig. 22. Mapa de endonuc1eases de restrição de pBSGluc39.1/GUS. Um fragmento de 1462 pb do pBSGluc39.1 foi clonado em pBS-GUSl.2 que tinha sido cortado com Ncol e Kpnl.
Fig. 23.Mapa de endonuc leases de restrição do pClB200/Gluc 39.1.-GUS.Um fragmento Kpnl/Xbal contendo o promotor da β-glucanase e o gene GUS foi isolado a partir de pBSGluc39. 1/GUS e ligado ao pCIB200 cortado com ΚρηI e Xbal.
Fig. 24. Mapa de endonuc leases de restrição do pCIB200/Gluc 39.1-BT. Ligaram-se um fragmento Kpnl/Ncol do pCIB1004 contendo o gene BT, um fragmento Kpnl/Ncol do pBSG1uc39.1/GUS e pCIB200 cortado com Kpnl e tratado com fosfatase alcalina de timo de vitela.
Fig. 25.Mapa de endonuc leases de restrição do pBSGluc39.1/AHAS, construído a partir de um fragmento Ncol/Xbal do pBSGluc 39.1/GUS e um fragmento Ncol/ /Xbal de 3,3kb do pCIB1207 contendo o gene AHAS.
Fig. 26.Mapa de endonucleases de restrição do pCIB200/G1uc 39.1-AHAS.Um fragmento Kpnl/Xbal contendo o promotor da p-glucanase e o gene AHAS foi isolado a partir de pBSGluc 39.1/AHAS e ligado a pCIB200 cortado com Kpnl e Xbal.
Fig. 27 Mapa de endonucleases de restrição do pBSGluc 39.3/GUS.Um fragmento de 1677pb do pBSGluc39.3 foi clonado am pBS-GUSl.2 que tinha sido cortado com Ncol e Kpnl.
Fig. 28.Mapa de endonucleases de restrição do pCIB200/Gluc 39.3-GUS. Um fragmento Kpnl/Xbal contendo o promotor da β-glucanase e o gene GUS foi isolado a partir de pBSGluc 39.3/GUS e ligado ao pCIB200 cortado com Kpnl e Xbal.
Fig. 29.Mapa de endonucleases de restrição do pC IB200/G1uc 39.3-BT. Ligaram-se um fragmento Kpnl/Ncol do pCIB1004 contendo o gene BT, um fragmento Kpnl/Ncol do pBSGluc 39.3/GUS e pCIB200 cortado com Kpnl e tratado com fosfatase alcalina de timo de vitela.
Fig. 30. Mapa de endonucleases de restrição do pBSGluc 39.3/AHAS ccnstruido a partir de um fragmento Ncol/Xbal do pBSGluc 39.3/GUS e de um fragmento Ncol/Xbal de 3,3kb do pCIB1207 contendo o gene AHAS,
Fig. 31. Mapa de endonucleases de restrição do pCIB200/Gluc 39.3-AHAS.Um fragmento Kpnl/Xbal contendo o promotor da β-glucanase e o gene AHAS foi isolado a partir de pBSGluc39.3/AHAS e ligado ao pCIB200 cortado com Kpnl e XBal.
Fig. 32. Mapa de endonuc leases de restrição do pCIB1208.Um fragmento Xbal de 5,8kb do clone genómico em lambda, contendo o gene AHAS de Arabidopsis mutagenizado foi clonado em Bluescript cortado com Xbal.
Fig. 33. Mapa de endonuc 1 eases de restrição do pCIB1230.Um fragmento Ncol/Xbal de 3,3kb do pCIB1208 foi clonado em pCIB269 que tinha sido cortado com Ncol e Xbal para remover o gene GUS.
Fig. 34. Mapa de endonucleases de restrição do pCIB1232. Um fragmento Kpnl/Xbal de 4,2kb foi isolado a partir de pCIB1230 e ligado a pCIB200 que tinha sido cortado com Kpnl e Xbal.
Fig. 35. Mapa de endonucleases de restrição do pBSG1u39.1/AHAS-SuR, construído a partir de um fragmento Ncol/Xbal do pBSGluc 39.1/GUS e de um fragmento Ncol/Xbal de 3,3 kb do pCIB1208 contendo o gene de AHAS.
Fig. 35. Mapa de endonucleases de restrição do pCIB200/Gluc 39.1-AHAS-SuR. Um fragmento Kpnl/ XBal contendo o promotor da β-glucanase e o gene AHAS foi isolado a partir do pBSGluc 39.1/AHAS-SuR e ligado ao pCIB200 cortado com Kpnl e Xbal.
Fig. 37. Mapa de endonucleases de restrição do pBSGluc39.3/AHAS-SuR, construído a partir de um fragmento Ncol/Xbal do pBSGluc 39.3/GUS e de um fragmento Ncol/Xbal de 3,3kb do pCIB1208 contendo o gene AHAS.
I
Fig. 38. Mapa de endonuc1eases de restrição do pC IB200/G1uc.39.3-AHAS-SuR. Um fragmento Kpnl/ /Xbal contendo o promotor da B-glucanase e o gene AHAS foi isolado a partir do pBSGluc39.3/AHAS-SuR e ligado ao pCIB200 cortado com Kpnl e Xbal.
Breve descrição das sequências
A sequencia 1 descreve a sequência de DNA genómico do fragmento de 2kpb entre os sitios Xhol e BglII do gene PR-la do tabaco. A seta no nucleotideo 903 indica a iniciação da transcrição e as setas verticais marcadas 207 e 313 identificam os extremos de dois clones de cDNA independentes. A sequencia de polipeptideos codificada pela porção codificadora do gene também está descrita.
A sequencia descreve a sequencia de DNA genómico do gene PR-1 1 do tabaco e a sequencia de aminoácidos do polipeptideo que é codificado pela região codificadora do gene.
A sequencia 3 descreve cia de cDNA da quitinase PR de pepino e a sequencia ácidos do polipeptideo que é codificado pela região cadora do gene.
a sequer^ de aminocod i f iA sequencia 4 descreve a sequencia de cDNA da forma principal do gene PR-R do tabaco e (49) descreve a sequencia (4) e a sequencia de aminoácidos do polipeptideo que é codificado pela região codificadora do gene.
A sequencia 5 descreve a DNA genómico do gene da β-1,3-g1uca na se básica contida no clone pBSGluc 39.1.
sequencia cfe do tabaco
A sequencia 6 descreve a sequencia de DNA genómico do gene da β-1,3-g1 uca na se básica do tabaco contida no clone pBSGluc 39.3.
A sequencia 7 descreve a sequencia de cDNA do PR-Q de tabaco contida no plasmideo pBSChtl5.
A sequencia 8 descreve a sequencia de DNA de um cDNA isolado contido no plasmideo pBSGlõe. 0 cDNA codifica a forma acidica da β-1,3-g 1 ucanase.
Descrição Detalhada do invento presente invento descreve o isolamento, clonagem e identificação de sequências de DNA que são capazes de regular a transcrição em tecidos vegetais de uma sequencia de DNA associada onde a regulação está dependente de um regulador quimico. Estas sequencías de DNA podem ser utilizadas para construir genes quiméricos em que a expressão do gene pode ser regulada por tais reguladores.
A capacidade para regular a expressão de um gene quimérico numa planta transgénica por um método quimico é útil para se obter expressão adequada da caracteristica fenotipica com efeito adverso minimo no crescimento e desenvolvimento da planta. Esta regulação é importante na produção de produtos secundários ou outros produtos clonados em tecido vegetal em culturas ou bio-reactores.A regulação da sequencia clonada é também importante na regulação de outros produtos de genes por um mecanismo anti-codão.
A expressão de uma dada sequencia codificadora em qualquer altura especifica pode ser regulada através da utilização de um regulador quimico,tipicamente aplicado ao tecido vegetal. Os genes envolvidos no controle de fases distintas de transição do desenvolvimento também podem ser regulados através da associação de uma sequencia de DNA quimicamente regulável com uma sequencia de DNA codificador adequado. Deste modo o desenvolvimento de uma planta pode ser parado numa fase especifica até o nivel do regulador químico ser aumentado ou acelerado a uma velocidade especifica quando o nível do regulador químico é reduzido.
As sequências de DNA quimicamente reguláveis podem ser utilizadas para dirigirem aexpressão de geneí estranhos que, por exemplo, conferem resistência ou tolerância a herbicidas (e.g., tolerância a atrazina em soja),conferem resistência a insectos (e.g. proteínas dos cristais de Bac i11us thur i ng i ens i s em algodoeiro ) ou requerem expressão selectiva (como seja esterilidade masculina ou feminina). As sequências de DNA quimicamente reguláveis podem também ser utilizadas para dirigir a transcrição de uma sequencia de DNA que controlará a expressão de uma segunda sequencia codificadora por um mecanismo anti-codão.
Assim, o presente invento abrange uma série de obj ect i vos :
a. Como principal objectivo, um gene quimérico cuja expressão em tecido vegetal é regulada por um regulador químico.
b. Sequências de DNA quimicamente reguláveis e substancialmente puras capazes de controlar a actividade genética em tecido vegetal de outras sequências de DNA em resposta a um regulador químico.
c. Sequências de DNA quimicamente reguláveis em combinação com parte, mas não a totalidade de qualquer sequencia de DNA codificador com as quais estão associadas em genes natura i s.
d. Vectores contendo as sequências de DNA quimicamente reguláveis com ou sem outras partes de genes naturais em que elas possam ocorrer.
e. Vectores contendo os genes quiméricos que não o principal objecto do invento.
f. Tecido vegetal, plantas e sementes derivadas de células transformadas por estes vectores.
g. Processo de regulação química da expressão de sequências de DNA codificadores associadas com as sequências de DNA quimicamente regu1áveis,por exemplo para regular uma caracteristica fenotípica.
h. Processo para identificação de novos reguladores quimiros usando genes quiméricos deste invento e tecido vegetal contendo-os.
i. Sequências peptidicas sinal em proteínas codificadas por genes quimicamente reguláveis.
j. Genes substancialmente puros de proteínas relacionadas com patogénese.
Outros objectivos são também discerníveis a partir da descrição do invento que se segue.
Def i n i ções
Para proporcionar uma compreensão clara e consistente da especificação e das reivindicações, incluindo o âmbito atribuído a tais termos, são dadas as seguintes definições:
Mecanismo anti-codão: Um mecanismo para a regulação de genes baseado no controle da velocidade de tradução do mRNA para proteína devido á presença numa célula de uma molécula de RNA complementar de pelo menos uma porção do mRNA a ser traduzido.
Sequencia de DNA associada: Uma sequencia de DNA cuja actividade celular (1) regula a activj_ dade de uma outra sequencia de DNA ou (2) é regulada por uma outra sequencia de DNA. Esta definição engloba especificamente, mas não está limitada a, sequências que estão fisica_ mente adjacentes numa cadeia contínua de DNA ou que estão fisicamente separadas. A separação física inclui, por exemplo, separação dentro da mesma cadeia de DNA, localização dentro de cadeias de DNA diferentes ou sequências espalhadas descontinuas(e.g. sequências reguláveis e codificadoras alternadas) numa cadeia.
Sequencia de DNA quimicamente regulável Uma sequencia de DNA que é capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada onde a regulação está dependen te de um regulador quimico. As sequências podem ser de origem natural ou sintética.
Gene quimicamente regulável: Um gene contendo pelo menos uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável e pelo menos uma sequencia de DNA codificador associada. Os genes podem ser naturais,sintéticos ou de origem parcialmente natura 1/pareialmente sintética.
Regulador quimico (para uma sequencia de DNA quimicamente regulável): Uma especie elemental ou molecular que controla (e.g., inicia, termina, aumenta ou reduz) por acção directa ou indirecta, a actividade de uma sequencia de DNA quimicamente regulável num sistema em que o regulador quimico não se encontra normalmente numa forma activa numa quantidade suficiente para efectuar a regulação da transcrição, ao nível e altura pretendida, de uma sequencia de DNA que pode ser transcrita associada à sequencia de DNA quimicamente regulável. Esta terminologia pretende englobar situações em que se pretenda que pouco ou nenhum regulador está presente na altura de transcrição ou em que algum regulador esteja presente mas em que se pretenda uma maior ou menor regulado para efectuar mais ou menos transcrição conforme desejável.
Assim se o sistema contendo a sequencia de DNA quimicamente regulável fôr uma planta, por exemplo uma planta transgénica, um regulador quimico é uma especie não encontrada naturalmente na planta em quantidade suficiente para efectuar a regulação quimica e portanto a transcrição de um gene associado, para o grau pretendido na
altura necessária.
Por acção directa pretende-se significar que a acção do regulador quimico resulte da interacção directa entre o regulador quimico e a sequencia de DNA. Por acção indirecta pretende-se significar que a acção reguladora resulta da interacção directa entre o regulador quimico e qualquer outro componente endógeno ou exógeno no sistema, o resultado final da interacção directa sendo a activação ou supressão da actividade da sequencia de DNA.Por forma activa pretende-se significar que o regulador quimico esteja numa forma necessária para efectuar o controle.
Sequencia ou gene quimérico: Uma sequencia de DNA contendo pelo menos duas partes heterólogas, e.g., partes derivadas das sequências de DNA naturais que não estão associadas nos seus estados naturais, ou contendo pelo menos uma parte que é de origem sintética e não encontrada na natureza.
Sequencia de DNA codificador: Uma sequencia de DNA que quando transcrita é traduzida,resu1 ta na formação de um polipeptideo celular.
Gene: Uma região cromossómica discreta que é responsável por um prcdLito celular discreto.
Sequencia de DNA não codificador:
Uma sequencia de DNA que não é transcrita e traduzida resultando na formação de um polipeptideo celular quando associado a uma sequencia DNA codificador particular. Assim, por exemplo, uma sequencia não codificadora quando associada com uma sequencia codificadora pode de facto estar a codificar quando associada com uma outra sequencia codificadora
ou não codificadora.
Caracteristica fenotipica: Uma propriedade observável resultante da expressão de um gene.
Tecido Vegetal : Qualquer tecido de uma planta em planta ou em cultura. Este termo inclui, mas não está limitado a, planta completa, células vegetais,orgãos de plantas, sementes de plantas, protop1astos, calor, culturas celulares e quaisquer grupos de células vegetais organizadas em unidades estruturais e/ou funcionais. 0 uso deste termo com conjunção ou na ausência de qualquer tipo especifico de tecido vegetal conforme descrito abaixo ou de outro modo incluído por esta definição não se pretende que seja exclusivo de qualquer outro tipo dê tecido vegetal.
PR ou proteínas relacionadas com patogénese: Proteínas expressas em plantas que reagem com hipersensibilidade contra agentes patogénicos.Este termo inclui, mas não está limitado a, formas acidicas e básicas de proteínas PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-11, PR-2, PR-N, PR-O, PR-P, PR-Q, PR-S, PR-R do tabaco, a quitinase que é uma contraparte básica de PR-P ou PR-Q e a beta-1 ,3-g 1 ucanase (glucano-endo- 1 , 3-β-ς1ucosidase, EC 3.3.1.39) que é uma contraparte básica, de PR-2, PR-N ou PR-D e a quitinase induzida por agentes patogénicos do pepino. A reacção de hipersensibi1idade é caracterizada por uma necrose.1 oca 1 dos tecidos imediatamente envolventes do local de infecção pelo agente patogênico e uma subsequente localização do agente patogénico, que contrasta com uma reacção de sensibilidade em que o agente patogénico se espalha por toda a planta. Os agentes patogénicos são por exemplo, vírus ou viroides, e.g.vírus do mosaico do tabaco ou do pepineiro, vírus de manchas anelares ou virus de necrose, vírus do enrolamento das folhas de pe-30-
largónio, virus do marmoreado do trevo, vírus de ramificação do tomateiro e virus similares, fungos e.g. Phythophthora pa ra s i t i ca ou Peronospora tabac i na , bactérias, e.g. Pseudomonas syringae ou PseudomonTs tabac i ou afídeos, e.g. Myzus pers i cae. Esta lista não ê de modo algum 1 imita n te.
Regulação: 0 aumento (indução)ou decréscimo (repressão) do nível de expressão de um gene ou do nível de transcrição de uma sequencia de DNA. A definição não pretende incluir qualquer mecanismo particular.
Sequencia de DNA substancialmente pura: Uma sequencia de DNA isolada numa forma substancialmente pura a partir de uma fonte natural ou não natural. Tal sequencia pode ocorrer num sistema natural, por exemplo em bactérias, virus ou em, plantas células vegetais ou animais, ou podem ser proporcionada por meios sintéticos ou como sequencia de cDNA. Sequências de DNA substancialmente puras são geralmente isoladas na forma de um vector contendo o DNA pretendido. Substancialmente puro significa que outras sequências de DNA além das pretendidas estão presentes apenas em quantidades marginais, por exemplo menos de 5%, menos de 1% de preferencia menos de 0,1%. Sequências de DNA e vectores substancialmente puros podem estar e tipicamente estão, em solução, por exemplo em solução aquosa contendo tampões ou nos meios de cultura usuais.
Homologia de sequências substancial: Homologia substancial de sequências significa relação estrutural muito estreita entre sequências de nucleotideos ou de aminoácidos. Por exemplo, sequências de DNA substancialmente homólogas podem ser 80% homólogas, de preferencia 90% ou 95% homólogas e sequências de aminoãcidos substancialmente homólogas podem tipicamente ser 50% homólogas ou mais. A homologia inclui também uma relação em que uma ou mais se-
quencias de nucleotideos ou aminoácidos faltam, ou subsequên cias com nucleotideos ou aminoácidos adicionais estão intercalados.
A. Sequências de DNA quimicamente reguláveis presente invento diz respeito a sequências de DNA não codificadoras que são capazes de regular, sob a influência de um regulador quimico, a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegeta 1.Especificanente o presente invento engloba uma sequencia de DNA não codificadora capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal sem ore que esta regulação esteja dependente de um regulador quimico. De preferencia as sequências de DNA existem na forma substancialmente pura relativamente ao gene e genoma em que elas ocorrem se provierem de uma fonte natural ou a uma mistura de DNA se existirem numa mistura sintét i ca.
De preferencia as sequencías de DNA quimicamente reguláveis não codificadoras deste invento são aquelas que, quando associadas com uma sequencia de DNA codificadora, regulam a expressão da sequencia codificadora em tecido vegetal, o grau de regulação estando dependente de um regulador quimico. Tais sequencías podem ser sintetizadas de novo ou derivadas (por exemplo, isoladas ou clonadas) de um gene natural quimicamente regulável. Aocorrência de sequencías de DNA quimicamente reguláveis do invento não está limitada a tecidos vegetais;i.e., as sequencías de DNA quimicamente reguláveis podem ser derivadas de uma variedade de fontes naturais, e.g. fontes bacterianas,virais ou animais. Pode ser isolada, por exemplo a partir da região delimitante 5' ou da região delimitante 3' de um gene
natural quimicamente regulável. Como alternativa, a sequência de DNA não codificadora pode ser sintetizada quimicamente ou sintetizada enzimáticamente como cDNA idêntico, ou tendo substancial homologia com a sequencia isolacfe. Através da clonagem a sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável, a sequencia pode ser separada de outras sequências que lhes estão adjacentes no gene natural. Deste modo pode-se obter uma sequencia de DNA substancialmente pura.
No contexto do presente invento,a regulação engloba reguladores químicos que são reguladores indutores ou repressores Exemplos de genes quimicamente reprimíveis, ou seja, genes que são reprimidos por um quimico repressor, incluem por exemplo, genes tais como TrpR ou - AroH onde a adição do repressor triptofano ou do próprio triptofano reprime a expressão destes genes. EXistem muitos outros genes que são regulados por este tipo de repressão por produto final e em todos os casos o produto final actua como um regulador quimico que pode ser usado para reprimir a expressão do gene.O presente invento engloba secções reguláveis de tais genes por si sós ou como partes de construção quiméricas que podem ser reguladas quimicamente para transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal .
São exemplos de genes quimicamente induziveis, ou seja genes que são induzidos por um regulador quimico indutor, as genes das proteínas PR, especialmente os genes das proteínas PR do tabaco, por exemplo os genes PR-la, PR-lb, Pr-lc, PR-1', PR-Q, PR-R e PR-S, o gene da quitinase do pepineiro e os genes das B-1,3-g1ucanases básica e acidica do tabaco. Num aspecto particular o presente invento compreende uma sequencia de DNA substancialmente pura que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável que faz parte de
um gene natural quimicamente regulável, por exemplo de um gene natural quimicamente regulável numa planta ou tecido vegetal de uma monocotiledónia, dicoti ledónia ou gimnospêrmica. De preferencia tal sequencia de DNA é capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal em que a referida sequencia de DNA associada é uma sequencia codificadora. A transcrição da referida sequencia de DNA pode ser regulada por um regulador quimico repressor ou um regulador quimico indutor. São particularmente consideradas as sequências de DNA em que o gene quimicamente regulável é um gene de proteínas PR, por exemplo de uma planta dicotiledónea, e.g. tabaco ou pepineiro. As sequências de DNA mais preferidas são aqplas em que o gene quimicamente regulável é um gene PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-Q ou PR-R de tabaco, um gene da quitinase do pepineiro ou um gene da β-l,3-glucanase básica ou acidica, em particular o gene PR-la e PR-11 do tabaco, mas também o gene da quitinase do pepineiro e os genes das B-1 ,3-g 1 ucanases básica e acidica do tabaco. As mais consideradas são as sequências de DNA em que o gene quimicamente regulável é um gene da β-1 , 3-g 1 ucanase básica ou PR-la do tabaco.
As sequências de DNA quimicamente induziveis da PR preferida e genes relacionados do invento ocorrem aparentemente nas sequências não codificadoras da região 5' delimitante adjacente às sequências codificadoras. Como exemplo representativo, numa sequencia isolada a partir de um fragmento de aproximadamente 6 500 pares de bases de gene PR-la do tabaco contendo parte da região codificadora,a região com cerca de 900 a cerca de 1200 pares de bases, naturalmente adjacente ao sitio de iniciação da transcrição encontrou-se ser induzida quimicamente. A capacidade de ser induzida é mantida num seu fragmento contendo cerca de 500 a cerca de 700 pares de bases naturalmente adjacentes ao sitio de iniciação da tradução. Assim são mais preferidas as sequen-34-
cias de DNA que estão situadas na região delimitante 5' e a referida PR e genes relacionados, por exemplo nos 1200 pares de bases adjacentes ao sitio de iniciação da tradução.
invento inclui ainda um processo para a preparação de uma sequencia de DNA não codificadora capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal em que esta regulação esteja dependente de um regulador quimico e de sequências de DNA tendo homologia substancial com as referidas sequências não codificadoras, caracterizado por o DNA ser isolado a partir de um gene natural numa forma substancialmente pura ou ser sintetizado química ou enzimáticamente.
Em partocular, o invento engloba um processo para a preparação de uma sequencia de DNA quimicamente regulável substancialmente pura a partir de um gene quimicamente regulável num sistema natural contendo aquele gere processo este que se caracteriza pelos passos de:
(a) activação da expressão no referido sistema de RNA a partir do gene quimicamente regulável;
(b) isolamento do referido RNA;
(c) despiste diferencial de uma biblioteca genómica para RNA gerado a partir de RNA isolado do referido sistema activa_ do assim como de RNA gerado a partir de RNA isolado de um sistema de controle que não está activado;
(d) isolamento de um clone genómico;
(e) subclonagem do gene quimicamente regulável a partir do referido clone genómico;e
(f) isolamento da sequencia de DNA quimicamente regulável pretend ida.
Ainda, o invento engloba um processo em que o referido sistema é uma planta, processo esse que compreende os passos de (a) activação da expressão na referida planta de RNA poli A+ a partir do gene quimicamente regulável;
(b) isolamento do referido RNA poli A+;
(c) construção de uma biblioteca de cDNA a partir de RNA poli A+;
(d) despiste diferencial da referida biblioteca de cDNA com cDNA gerado a partir de RNA numa planta testemunha que não está activada;
(e) isolamento dos clones de cDNA que são reguláveis quimicamente;
(f) isolamento de um clone genómico a partir de uma biblioteca genómica da referida planta usando como sonda o clone de cDNA do passo (e);
(g) subclonagem do gene quimicamente regulável a partir do referido clone genómico, e (h) isolamento da sequencia de DNA quimicamente regulável pretendida.
E preferido um processo em que o referido gene quimicamente regulável é um gene quimicamente induzivel, por exemplo um gene da proteína PR, e.g. um gene PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-11, PR-Q ou PR-R do tabaco, um gene da quitinase do pepineiro ou um gene da β-1,3-g1ucanase básica ou acidica do tabaco. E ainda preferido um processo em que o referido gene da proteína PR é activado num passo (a) por um indutor quimico ou um agente patogénico.
invento engloba ainda DNA substancialmente puro preparado pelos processos referidos.
B. Sequencia de DNA quimicamente reguláveis com partes de sequências codificadoras naturais
Além das sequências de DNA quimicamente reguláveis e totalmente não codificadoras descritas atrás na Parte A, este invento também proporciona a sequencia de DNA não codificadora de uma sequencia de DNA natural quimicamente regulável em combinação com parte mas não a totalidade de uma sequencia codificadora com a qual a sequencia regulável está associada num gene natural.Mais especificamente, o presente invento engloba, de preferencia na forma substancialmente pura, uma sequencia de DNA que compreende uma primeira sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável de um gene natural quimicamente regulável, esta primeira sequencia componente sendo capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta regulação está dependente de um regulador quimico, e uma segunda sequencia de DNA componente que é ou tem homologia de sequências substancial com parte mas não a totalidade da sequencia de DNA que pode ser transcri-37-
ta com a qual o primeiro componente está associado no gene natural quimicamente regulável. 0 gene natural quimicamente regulável pode ser de origem vegetal, por exemplo ocorrendo numa planta monocot i 1 edónea ou dicoti1edónea e pode ser regulado por um regulador quimico repressor ou indutor. A segunda sequencia de DNA componente será tipicamente uma sequencia codificadora. Uma segunda sequencia de DNA preferida para o presente invento é uma sequencia que codifica o peptideo sinal de qualquer proteína expressa pelo gene natural quimicamente regulável.
Em particular o invento engliba tal sequencia cfe DNA compreendendo uma primeira sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável e uma segunda sequencia de DNA codificadora de um gene de proteína PR, por exemplo um gene de proteína PR de uma d icnt i 1 edónea , de preferencia do tabaco ou pepineiro, como seja um gene PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-11, PR-Q ou PR-R, um gene da quitinase ou um gene da β-1,3-g1ucanase básica ou ácida.E preferida uma sequencia de DNA de um gene de proteína PR em que a transcrição é regulada por um regulador quimico indutor. Em particular o invento engloba uma sequencia de DNA em que a primeira seq£ncia não codificadora está situada na região delimitante 5' de um dos referidos genes de proteínas PR, por exemplo situado aproximadamente nas 2000 pares de bases adjacentes ao sinal de iniciação da transcrição do referido fene da proteína PR. Mais preferida é uma sequencia de DNA compreendendo uma primeira sequencia não codificadora preferida conforme referido atrás e uma sequencia segunda de DNA codificadora de um peptideo sinal conforme referido atrás.
São mais preferidas as sequências de DNA substarialmente puras como se mostra na Sequencia 1, Sequencia 2, Sequencia 5 e Sequencia 6 e sequências de DNA substancialmente puras tendo substancial homologia de sequências com estas Sequências 1,2,5 e 6. Estas Sequências são exemplos de sequências de DNA quimicamente reguláveis compreendendo uma priíeira sequencia de DNA não codificadora e uma segunda sequencia de DNA codificadora e são derivadas dos genes de proteínas PR do tabaco PR-la,
PR-1* e de duas formas de p-1 , 3-g 1 ucanase básica do tabaco, respectivamente. Sequencia 1 mostra a sequencia do gene PR-la representativo do tabaco. Os nucleotideos 1 até aproximadaiente 1150 são os não codificadores, a sequencia de DNA delimitante 5' quimicamente induzível e parte da sequencia codificadora de PR-la que ocorre naturalmente numa planta do tabaco. Neste caso a sequencia componente quimicamente induzivel é adjacente à sequencia codificadora.Aqueles nucleotideos que codificam os primeiros trinta aminoácidos constituem a sequencia codificadora do peptideo sinal da proteína PR-la.
A sequencia codificadora pode ser removida da sequencia não codificadora para gerar a sequencia de DNA não codificadora quimicamente induzivel sem qualquer sequencia codificadora descrita atrás na Parte A. Tal remoção pode ser conseguida por técnicas convencionais, tais como digestões com enzimas de restrição.
invento engloba ainda um método para a preparação de uma sequencia de DNA que compreende uma priíeira sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável de um gene quimicamente regulável natural, esta primeira sequencia componente sendo capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta
regulação está dependente de um regulador quimico e uma segunda sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com parte mas não a totalidade de uma sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita com a qual o primeiro componente está associado no gene natural quimicamente regulável, caracterizado por o DNA ser usolado a partir de um gene natural na forma substancialmente pura ou ser sintetizado quimica ou enzimáticamente.São preferidos os processos particulares mencionados na Parte A, atrás e as sequências de DNA substancialmente puras assim obtidas.
C. Genes quiméricos contendo sequências de DNA quimicamente reguláveis
Um outro aspecto do presente invento é uma sequencia de DNA quimérica (gene quimérico) contendo pelo menos uma sequencia de DNA quimicamente regu1áve1.Como exemplos são dados dois tipos de tais sequências quiméricas.
A mais simples ou sequencia de DNA quimérica tipo duas partes compreende uma sequencia de DNA quimicamente regulável e uma sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita de modo que o gene quimérico ê capaz de ser expresso em tecido vegetal nas condições adequadas de regulação quimica. Mais especificamente, o invento engloba uma sequencia de DNA quimérica quimicamente regulável compreendendo uma primeira sequencia componente de DNA não codificadora quimicamente regulável que é capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta regulação está dependente de um regulador quimico e uma segunda sequencia de DNA componente capaz de ser transcrita numa planta ou tecido vegetal. As sequências de DNA componentes podem ser derivadas de fontes naturais ou ser preparadas sintéticamente.
A segunda sequencia de DNA pode ser transcrita como um RNA que é capaz de regular a expressão de uma caracteristica fenotipica através de um mecanismo anti-codão. Como alternativa a segunda sequencia de DNA na sequencia de DNA quimérica pode ser transcrita e traduzida, i.e. codificada no tecido vegetal para produzir um polipeptideo resultante numa caracteristica fenotipica. 0 gene quimérico é construído de modo a que a segunda sequencia de DNA esteja adequadamente associada com a sequencia de DNA quimicamente regulável para assegurar a transcrição, tipicamente numa orientação adjacente. A associação é efectuada por técnicas convencionais.
E preferida uma sequencia de DNA quimérica compreendendo um primeiro componente de DNA não codificador quimicamente regulável e um segundo componente de DNA susceptivel de ser transcrito em que a primeira sequencia de DNA não codificador e'uma das sequências de DNA preferidas referidas atrás na Parte A. A primeira sequencia de DNA componente pode ser regulada por um regulador quimico repressor ou indutor. Uma sequencia particular do invento é uma sequencia de DNA quimérica em que a primeira sequencia de DNA componente tem homologia de sequências substancial com uma sequencia de DNA quimicamente regulável num gene natural quimicamente regulável de uma planta.
E preferida uma sequencia de DNA quimérica em que a primeira sequencia de DNA componente é, ou tem substancial homologia de sequências com, uma sequencia de DNA quimicamente regulável num çpie natural quimicamente regulável de uma planta e a segunda sequencia componente de DNA é uma sequencia codificadora que é capaz de ser transcrita e traduzida para produzir um polipeptideo resultante numa caracteristica fenotipica. De preferencia
esta segunda sequencia componente de DNA é adjacente à primeira sequencia de DNA codificadora. E particularmente preferida uma sequencia de DNA quimérica em que a primeira sequencia de DNA componente ê ou tem substancial homologia de sequências com a sequencia de DNA quimicamente induzivel num gene de proteína PR, por exemplo uma proteína PR de uma planta dicoti1edónea como seja tabaco ou pepineiro. Os exemplos estão referidos atrãs na Parte A.
Um segundo tipo exemplificado de sequencia de DNA quimérica contem três sequências de DNA componentes, originárias de duas ou mais fontes. Na exemplificação mais simples esta sequencia de DNA quimérica compreende a sequencia de DNA de duas partes conforme descrito atrás na parte B e uma terceira sequencia de DNA originária pelo menos numa fonte diferente. Mais especificamente, este tipo de sequencia de DNA quimérica compreendendo uma primeira sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável de um gene natural quimicamente regulável, esta primeira sequencia de DNA componente sendo capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal,em que esta regulação está dependente de um regulador quimico, uma segunda sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com parte mas não a totalidade de uma sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita com a qual o primeiro componente está associado no gene natural quimicamente regulável e uma terceira sequencia de DNA componente capaz de ser transcrita numa planta ou tecido vegetal.De preferencia o gene natural quimicamente regulável é um gene vegetal.
-42A segunda e terceira sequências de DNA componentes serão tipicamente codificadoras. 0 terceiro componente de DNA pode ser derivado de uma ou mais fontes naturais e sintéticas. Os dois primeiros componentes de DNA terão tipicamente origem natural. Se a origem fôr uma planta, pode ser uma monocoti 1 edónia , uma dicoti1edónia ou uma gimnospérmica. Numa execução preferida a segunda sequencia de DNA incluirá a sequencia de nucleotideos que codifica o peptideo sinal do gene quimicamente regulável no qual as duas primeiras sequências de DNA ocorreem. Se a sequencia de DNA quimicamente regulável estiver associada com parte da sequencia codificadora do gene da qual derivou a terceira sequencia de DNA não só deve estar na orientação correcta como também na grelha de leitura adequada com a segunda sequencia de DNA.Esta orientação pode ser conseguida por técnicas bem conhecidas.
São preferidas as sequências de DNA quiméricas em que o primeiro e o segundo componentes da sequencia de DNA são os mencionados como preferidos na Parte B atrás. Por exemplo, uma sequencia de DNA quimérica preferida é uma em que a primeira sequencia de DNA componente é ou tem substancial homologia de sequências corn a sequencia de DNA quimicamente induzível num gene de proteína PR de uma planta dicoti 1 edónia, por exemplo do tabaco ou do pepineiro. Foram mencionadas atrás genes de proteínas PR.
Os genes quiméricos descritos atrás englobam uma variedade de possíveis construções.Uma sequencia não codificadora quimicamente regulável pode ser associada com um gene que controle a floração ou o amadurecimento dos frutos; um gene responsável pela tolerância ou resistência a herbicidas ou a muitos tipos de pragas, por exemplo fungos, virus, bactérias, insectos nemátodos ou aracnídeos; um gene que controle a produção de enzimas ou metabo-43-
litos secundários; esterilidade masculina ou feminina; nanismo; aroma; qualidades nutr i c i ona i s ; e s im i 1 a res. Usando o presente invento tais caracteristicas podem ser melhoradas pelo agricultor ou jardineiro, que já não está mais dependente de apenas factores naturais. Uma caracteristica fenotipica de interesse particular para o controle é a produção de metabolitos em cultura de tecidos ou num bio-reactor.
Uma sequencia de DNA quimérica preferida é uma sequencia de dois ou três componentes em que a sequencia de DNA codificador componente codifica uma caracteristica fenotipica, por exemplo uma caracteristica seleccionada do grupo constituido por tolerância ou resistência a um herbicida, fungos, virus, bactéria, insecto, nemátodo ou aracnídeo; produção de metabolitos secundários;esteri1 idade masculina ou feminina; e produção de uma enzima ou outro composto. E particu 1armente preferida uma sequencia de DNA quimérica de dois ou três componentes em que a sequencia componente codificadora codifica tolerância ou resistência a herbicidas, por exemplo codifica aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) selvagem ou resistente a herbicidas ou em que a sequencia componente codificadora codifica resistência a insectos, por exemplo codifica a endotoxina de Baci1lus thuringiensis(B T).
Se a sequencia quimérica se destinar a usar como ensaio de reguladores químicos, a caracteristica fenotipica é de preferencia uma marca ensaiável. Marcas adequadas incluem mas não estão limitadas a luciferase (LUX), c1oranfenico1-aceti1transferase (CAT),neomicina-fosfotransferase (NPT ) ,nopa1ina-sintetase (NOS),octopina-sintetase (OCS), beta-1 , 3-g 1 ucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido sintetase (AHAS) e endotoxinade Bac i11us thuringiens is (BT).
As marcas preferidas são beta-1,3-g1ucuronidase (GUS),aceto-44-hidroxiácido sintetase (AHAS) e endotoxina de Baci11us thuringiensis (B T).
Um exemplo representaiivo de tal sequencia de DNA quimérico, descrita deta1hadamente nos exemplos, é uma sequencia de DNA quimérico de duas partes que contem a sequencia delimitante 5' não codificadora do gene PR-la. Se bem que um dos marcadores exemplificados seja a sequencia codificadora do gene GUS, qualquer uma das marcas atrãs referidas poderá ser usada. A sequencia quimérica de três partes análogas contem parte da sequencia codificadora do gene PR-la. Estas construções são particulameote úteis devido ao efeito da indução química, i.e. actividade da enzima beta-gl ucuronidase, ser fácilmente detectado nas células vegetais ou seus extractos. Outras realizações particulares, por exemplo as que compreendem a sequencia não codificadora de um dos genes da p-1,3-g1ucanase do tabaco e as que compreendem a sequencia codificadora de aceto-hidroxiácido-sintetase selvagem ou resistente a herbicidas ou para a endotoxina de Baci1Ius thuringiensis, estão descritas na parte,Exemp1 os .
As sequências de DNA quimérico preferidas são as sequências de DNA quimérico de dois componentes ou de três componentes em que a primeira sequencia de DNA componente é a região delimitante 5' do gene PR-la do tabaco e contem mais do que aproximadamente 300, por exemplo entre 300 e 2000, de preferencia entre 600 e 1000, pares de bases adjacentes ao sitio de iniciação da transcrição.
E ainda preferida uma sequencia de DNA quimérica compreendendo três componentes em que a segunda sequencia de DNA componente codifica um peptideo sinal, por exemplo em que a segunda sequencia de DNA componente codifica
um peptideo que ê ou tem substancial homologia de sequências com o peptideo sinal de um gene da proteína PR, de preferencia o gene PR-la.
invento ainda englcba um método para a preparação de uma sequencia de DNA quimérica quimicamente regulável compreendendo uma primeira sequencia de DNA componente quimicamente regulável que é capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta regulação está dependente de um regulador químico e uma segunda sequencia de DNA componente capaz de ser transcrita numa planta ou tecido vegetal, caracterizado por as sequências de DNA componentes serem ligadas. De modo semelgante o invento inclui um método para a preparação de uma sequencia de DNA quimérico compreendendo uma primeira sequencia de DNA componente que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia de DNA quimicamente regulável não codificadora de um gene natural quimicamente regulável, esta primeira sequencia de DNA componente sendo capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta regulação está dependente de um regulador químico, uma segunda sequencia de DNA componente que ê ou tem substancial homologia de sequências com parte mas não a totalidade de uma sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita com a qual o primeiro componente está associado no gene natural quimicamente regulável e uma terceira sequencia de DNA componente capaz de ser transcrita numa planta ou tecido vegeta 1,caracterizado por as sequências de DNA componente serem ligadas concorrentemente ou consecutivamente.
D. Vectores
Os vectores, produzidos por técnicas convencionais e compreendendo as sequências de DNA quimicamente reguláveis descritas na Parte A ou B ou as sequências de DNA quimérico descritas na Parte C atrás,representam uma caracteristica adicional do invento. Os vectores são sequências de DNA recombinante que podem ser usadas para fins de isolamento e multiplicação da referida sequencia de DNA e para a transformação de hospedeiros adequados com estas sequências. Os vectores preferidos para isolamento e multiplicação são plasmideos que podem ser propagados num microorganismo hospedeiro adequado, por exemplo em
E. co 1 i. Os vectores preferidos para a transformação são os úteis na transformação de células vegetais ou de Agrobacteri a. Mais particularmente se forem transformadas células vegetais e não protop1astos, então o vector preferido é um vector derivado do plasmideo Ti. Para a transferencia directa de DNA para protoplastos podem ser usados quaisquer dos vectores mencionados. Vectores adequados que podem ser utilizados como materiais de partida são conhecidos no ramo. Vectores adequados para a transformação de tecidos vegetais e protoplastos foram descritos por de Framond, A et a 1. , Bio/Technology J_, 263(1983);An, G et a 1., EMBO J. 4, 277 (1985); Potrykus, I. et a 1., supra; Rothstein, S. J. et a 1. , Gene 53, 153 ( 1987). Além destes muitos outros vectores foram descritos e que são adequados para usar como materiais de partida no presente invento.
Os vectores que contêm apenas sequências de DNA quimicamente reguláveis estão descritos na Parte A ou B atrás podem ser usadas como intermediãrios para a preparação de um vector contendo a sequencia de DNA quimérica como descrito na Parte C atrás. A inserção de
uma sequencia adequada, que é capaz de ser transcrita, num tal vector intermediário resulta num vector compreendendo uma sequencia de DNA quimérica do invento que pode ser então usada para transformar o tecido vegetal protoplasto ou outro hospedeiro pretendido. Como alternativa pode-se preparar uma sequencia de DNA quimérica e inserir-se num vector adequado que é então usado para transformar o tecido vegetal pretendido ou outro hospedeiro.
A construção e multiplicação dos vectores pode ser etectuada num hospedeiro adequado, por exemplo, em E. col i. Estirpes de £. co 1 i. adequadas incluem HB101, JM DH1, DH5oC, LE392 e similares. Os vectores do invento podem ser usados como tal numa transferencia dire£ ta de genes ou numa técnica de microinjecção. Em certos casos, pode ser preferido linearizar o vector antes de ser usado. Como alternativa os vectores podem ser transferidos para uma hospedeiro Agrobacterium. Esta transferencia é conseguida por técnicas convencionais incluindo cruzamento biparental (Simon, R. et al., Bio/Technology 1, 74 (1983)), cruzamento triparental (Ditta, B. et a 1., Proc.
Natl. Acad.Sci. USA 77 , 7347 ( 1980 )) ou transformação (Holters, M. etal., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978)). Estirpes adequadas de Agrobacter i um incluem mas não estão limitados a A. tumefaciens LBA4404, CIB542 e C58Z707.
São preferidos os vectores que compreendem as sequências de DNA preferidas referidas nas Partes A, B e C atrás. Ainda um vector preferido é um que seja funcional em células vegetais ou em Agrobacter i um.
São particularmente preferidos os vectores descritos na Parte L, Exemplos.
E. Tecidos vegetais, plantas e sementes
Um outro aspecto do invento são tecidos vegetais, plantas ou sementes contendo as sequências de DNA quimérico descritas atrás. São preferidos os tecidos vegetais, plantas ou sementes contendo aquelas sequências de DNA quimérico que se mencionarem como sendo as preferidas.
As células de tecido vegetal são transformadas com os vectores descritos atrás por qualquer técnica conhecida incluindo as descritas nas referencias discutidas atrás e por técnicas descritas deta 1 hadamente nos exemplos que se seguem. Estas técnicas incluem infecção directa ou cocultura de plantas ou tecidos vegetais com Agrobacterium . Uma técnica muito adequada é a transformação de discos de folhas descrito por Horsch, R.B. et a 1., Science 225, 1229 (1985). Como alternativa o vector pode ser transferido directamente, por exemplo por electroporação, por microinjecção ou por transformação de protoplastos na presença de po1ietilenog1ico1 (PEG), cloreto de cálcio ou num campo eléctrico, como descrito mais deta 1 hadamente atrás.
As células transformadas podem ser originárias de plantas nrnocot i 1 edón i a s ou dicotiledónias e podem conter um ou mais genes quiméricos quimicamente reguláveis deste invento. Assim, os genes que por exemplo, codificam a resistência ou tolerância a herbicidas e uma variedade de pragas de insectos, virus, bactérias, fungos e outras, esterilidade, tamanho, floração e amadurecimento dos frutos, são introduzidos no tecido vegetal e estas células ou protoplastos são finalmente regeneradas para plantas em que estas caracteristicas podem ser contro-49-
ladas por manipulações com um regulador quimico. Como alternativa as células podem ser propagadas em cultura de tecidos ou num bio-reactor para produzirem enzimas ou metabolitos secundários. Se se pretender um ensaio enzimático, a secção codificadora do gene quimérico pode, por exemplo, compreender um gene LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS ou BT, conforme identificado préviamente. Tais genes quiméricos contendo uma sequencia quimicamente induzivel de um gene PR são uma execução preferida do invento devido à facilidade de aplicação do regulador e à facilidade de detecção do produto enzimátíco.
Após transformação, a célula ou tecido transformado é seleccionado ou despistado por técnicas convencionais. A célula ou tecido vegetal transformado contem a sequencia de DNA quimérica discutida atrás e é então regenerada, caso se pretenda, por processos conhe eidos, incluindo os descritos na referencia discutida atrás e nos exemplos que se seguem para plantas monocoti1edónias e dicoti 1 edónias. As espécies que podem ser regeneradas por estes técnicas incluem, mas não estão limitadas a milho, girassol, colza, trevo, tabaco, cenoura,a 1godoeiro, alfafa, arroz, batata, beringela e pepineiro. As plantas regeneradas são despistadas relativamente à transformação por métodos convencionais. A progénie das plantas regeneradas é continuamente despistada e seleccionada relativamente â presença continua da sequencia de DNA integrada de modo a desenvolver melhores linhas de plantas e sementes. A sequencia de DNA pode ser passada para outras linhas genéticas por uma variedade de técnicas, incluindo cruzamento clássico, fusão de protop1astos , transferencia nuclear e transferencia de cromossomas.
F. Vantagens e utilizações presente invento oferece uma série de vantagens e utilizações com base na expressão regulável fácilmente controlada em plantas ou tecido vegetal dos genes quiméricos contendo sequências de DNA quimicamente reguláveis. E possível a regulação de genes actuando por um mecanismo de anti-codão ou de genes cuja expressão resulta na produção de uma caracteristica fenotipica. São de particular importância a capacidade para controlar o tempo e a taxa de expressão genética e a facilidade de efectuar este controle, quer uniformemente ao longo de toda a planta ou em partes localizadas da planta.
A efectuação do controle pode ser conseguida simplesmente pela aplicação do regulador quimico ao tecido vegetal ou â planta ou parte da planta de tal modo e em tal quantidade que regule o(s)gene(s) quimérico(s) cuja expressão em células vegetais, tecidos vegetais ou plantas se pretende. Por exemplo, se a caracteristica a ser expressa fôr preferencialmente expressa apenas nas folhas, então a vaporização ou pulverização das folhas numa altura que optimize aquela expressão nas folhas e antes de qualquer migração a outras partes da planta pode atingir fácil e eficazmente aquele objectivo. Como alternativa a expressão uniforme ao longo da parte da planta acima do solo pode resultar da aplicação a toda a planta (i.e. caule e ambos os lados das folhas). Se se pretender a expressão nas raizes, a aplicação às sementes ou no soro à volta das sementes ou raizes é um método possível de regulação. A expressão num bio-reactor ê conseguida muito fácilmente, por exemplo, através da aplicação do regulador quimico ao meio em contacto com as células.
A capacidade de controlar a altura, taxa e/ou expressão de novas caracteristicas fenotipicas em plantas transgénicas oferece uma série de vantagens úteis. Por exemplo, se a tolerância por um mecanismo de destoxificação a um herbicida ou outro pesticida fôr introduzido numa planta, aquela caracteristica pode serrraximizada por determinação da altura correcta para a aplicação do regulador quimico. Assim, o regulador pode ser aplicado antes, com ou apôs a aplicação de um herbicida ou outro pesticida, dependendo do método que dã uma tolerância óptima.
E também agora possível regular a produção de compostos cuja biossintese é controlada por genes endógenos ou estranhos. Quando da indução química a produção de tais produtos pode ser iniciada na altura pretendida. 0 processo induzido poderá ser uma biossintese de vários passos ou uma conversão de um metabolito num só passo.
Uma outra vantagem do presente invento surge da capacidade para regular os processos de desenvolvimento em plantas numa altura desejada através da aplicação de um regulador quimico.Por exemplo, pode ser conseguida a sincronização do desenvolvimento da planta (germinação, formação do caule, formação de ramos,formação de flores, antese, amadurecimento dos frutos,emurchecimento, abscissão, etc.
Em adição, pode-se evitar o desenvolvimento normal da planta. Isto pode ser conseguido pela introdução por exemplo, de um gene de toxina que interfirirá com a fase de desenvolvimento pretendida, uma sequencia de DNA que bloquearia a fase de desenvolvimento através de um mecanismo anti-codão ou um gene cuja expressão bloqueia
a transição para uma nova fase do desenvolvimento e que pode ser quimicamente reprimido para permitir que prossiga o desenvolvimento. Uma utilidade adequada é a indução da esterilidade masculina ou feminina na hibridação controlada de culturas.
São vantagens adicionais do presente invento os novos processos de ensaio, de preferencia processos de ensaios enzimáticos. Por exemplo a identificação de novos reguladores químicos pode agora ser conseguida muito fácilmente. Tais métodos de ensaio envolvem o uso de plantas ou células vegetais transformadas que contêm uma sequencia de DNA quimérico deste invento. Um produto químico é aplicado ao hospedeiro transformado e a transcrição da sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita é medida contra um controle; a transcrição é geralmente detectada na forma de um produto de tradução ou como um efeito de tal produto. 0 ensaio pode ser efectuado numa variedade de maneiras, mas tipicamente é efectuado usando plantas regeneradas completas (através da aplicação do produto químico à planta) ou a células ou tecido em cultura (pela aplicação do produto químico às células ou tecidos) e subsequentemente fornecimento de um substrato de actividade enzimática. 0 produto da actividade enzimática é então detectado por métodos convencionais, e.g. medição espectofotométrica.
Em particular o invento engloba um processo para a identificação de um regulador químico que se caracteriza pela transformação de um hospedeiro com uma sequencia de DNA quimérica como descrito atrás na Parte C ou com um vector contendo a referida sequencia de DNA quimérica, aplicação de um regulador químico putativo eo hospedeiro transformado e medição da expressão da caracteris^ tica fenotípica. Um processo preferido ê um em que o hospe-53-
deiro transformado é tecido vegetal ou células vegetais. E aini mais preferido um processo em que a sequencia de DNA quimérico ê uma sequencia mencionada atrás como sendo preferida, por exemplo em que a primeira sequencia de DNA componente do referido DNA quimérico é uma sequencia química, mente induzível que é ou tem substancial homologia de sequências com uma sequencia quimicamente induzível de um gene de proteína PR e em que a caracteristica fenotipica codificada pelo DNA quimérico é uma marca enzimática ensaiável.
Uma outra caracteristica do invento é o desenvolvimento de novos métodos para identificar outras sequências de DNA quimicamente reguláveis. Um vector contendo uma sequencia de DNA quimicamente regulável putativa é preparada., por exemplo, a partir de uma marca seleccionável pelo hospedeiro e uma marca seleccionável ou ensaiáve1.Marcas seleccionáveis adequadas incluem genes de resistência a antibióticos e genes de resistência a herbicidas. Genes de resistência a antibióticos representativos incluem os da higromicina, canamicina, cloranfenicol, bleomicina, puromicina, lincomicina, G418 e metotrexato. Um gene particularmente adequado para a resistência à higromicina é o da aminog1icosido-fosfotransferase IV. Vectores adequados para a transformação de plantas contendo o gene de resistência à higromicina foram descritos por Rothstein, S.J. et a 1., Gene 53, 1 53 ( 1987 ).Exemp1 os de genes de resistência a herbicidas codificam resistência por exemplo a su 1 foni1ureias, glifosato, fosfinotricina e atraz i na.
Marcas ensaiáveis adequadas incluem genes para enzimas, antigénios, imunoglobul inas e similares, assim como genes de resistência a antibióticos.Marcas enzimáticas adequadas incluem LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS e BT. Uma enzima particularmente adequada é a beta-54-
-1,3-g1ucuronidase (GUS) devido à facilidade do ensaio enzimático. A sequencia de DNA codificadora sa marca ensaiável pode ser inserida no vector usando técnicas convencionais.
A sequencia de DNA regulável putativa é tipicamente inserida adjacente ao gene marcador ensaiável de modo a que a expressão do marcador ensaiável esteja sob o controle da sequencia de DNA putativa. 0 vector é então usado para transformar tecido vegetal ou um outro hospedeiro adequado. 0 tecido vegetal ou hospedeiro transformado ê seleccionado com base na marca vegetal seleccionável, tipicamente resistência a antibióticos. Um regulador quimico é então aplicado ao tecido vegetal ou outro hospedeiro após selecção ou após regeneração do tecido transformado. A indução ou repressão do marcador ensaiável após a aplicação do regulador quimico identifica a sequencia de DNA putativa como uma que ê capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA adjacente em que a regulação está dependente de um regulador quimico. 0 ensaio pode ser efectuado em plantas completas regeneradas ou transformadas, por exemplo, através da aplicação do regulador quimico às folhas ou outro tecido vegetal e medição da expressão da marca ensaiável. Como alternativa o ensaio pode ser efectuado em tecido de calos transformados ou outro hospedeiro em culturas de células, através da aplicação do regulador quimico putativo aos calos ou outras culturas e medição da expressão da marca ensaiável.
Em particular o invento engloba um processo para a identificação de uma sequencia de DNA quimicamente regulável que se caracteriza pelos passos de
(a) transformação de um hospedeiro com uma sequencia de DNA quimicamente regulável putativa ou com um vector contendo a referida sequencia, uma segunda sequencia de DNA que é uma marca seleccionável do hospedeiro e uma terceira sequencia de DNA que codifica uma caracteristica fenotipica;
(b) aplicação de um regulador quimico ao referido hospedeiro transformado; e (c) medição da expressão ou selecção da alteração na expressão da caracteristica fenotipica codificada pela terceira sequencia de DNA.
E preferido um processo em que a referida terceira sequencia de DNA é uma marca seleccionável do hospedeiro ou um gene ensaiável e um processo em que a segunda ou terceira sequencia de DNA é uma marca para resistência a herbicidas ou resistência a antibióticos por exemplo seleccionado do grupo constituído por genes de resistência â higromicina, canamicina, c 1 oranf en i co 1 , bleom i c i na, puronicina, lincomicina e metotrexato, e.g. um gene de aminoglicosido-fosfotransferase IV para resistência à higromicina.
E também preferido um processo em que a sequencia de DNA quimicamente regulável putativa está associada ou de preferencia adjacente à traseira sequencia de DNA. E ainda preferido um processo em que o hospedeiro transformado é tecido vegetal ou células vegetais.
E ainda preferido um processo em que θ terceira sequencia de DNA codifica uma marca enzimática ensaiável seleccionada do grupo constituído por lucife-56-
rase (LUX), c1oranfenico1-aceti1transferase(CAT), neomicinafosfotransferase (NPT),nopa1ina-sintetase (NOS),octopina-sintetase (OCS), beta-1,3-g1ucuronidase (GUS), aceto-hidrox i ác i do-si ntetase (AHAS)e endotoxina de Baci 11 us thuringiensis (BT).
Um outro aspecto do invento são sequências de DNA quimicamente reguláveis e substancialmente puras identificadas pelo processo mencionado.
presente invento também proporciona um método para selecção de material vegetal transformado. 0 material vegetal exposto a uma sequencia de DNA exógeno contendo uma sequencia de DNA quimicamente regulável para a qual se conhece um regulador quimico e uma segunda sequencia de DNA para uma caracteristica fenotipica é tratado com o regulador e a expressão da caracteristica fenotipica investigada. A observação da caracteristica confirma que a transformação dos transformantes putativos de facto ocorreu. As caracteristicas fenotipicas para fins deste método incluem marcas se 1 eccionáveis do hospedeiro e marcas ensaiáveis préviamente descritas.
Em particular o invento engloba um método para selecção de células ou tecidos vegetais transformados que tenham sido sujeitos a DNA transformante compreendendo uma primeira sequencia de DNA componente que é quimicamente regulável por um regulador quimico conhecido e uma segunda sequencia de DNA associada codificadora de uma marca fenotipica,processo esse que se caracteriza pelos passos de (a) tratamento de transformantes putativos com o referido regulador quimico conhecido e (b) selecção dos transformantes de acordo com a expressão da caracteristica fenotipica codificada pela segunda sequencia de DNA. Um mé-57-
todo preferido ê aquele em que a referida caracteristica fenotipica é resistência a antibióticos,por exemplo resistência à higromicina, canomicina, c1oranfenico1,b1eomicina , puromicina, lincomicina, G418 e metotrexato ou uma marca enzimática ensaiável, por exemplo seleccionada do grupo constituído por luciferase (LUX), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), neomicina-fosfotransferase (NPT) , nopa1ina-sintetase (NOS),octopina-sintetase(OCS),beta-1,3-glucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) e endotoxina de Baci11us thutingiensis (BT).
G. Peptideos sinal
Um peptideo sinal ou uma sequencia sinal é uma sequencia de aminoácidos N-terminal especial numa proteína que entra no retículo endoplasmático. Tal sequencia em células eucarióticas contem tipicamente cerca de 15 a 40 resíduos de aminoácidos, muitos dos quais são hidrofóbicos. A sequencia ê eventualmente clivada a partir da proteína madura.
No contexto do presente invento o peptideo sinal de um gene quimicamente regulável é útil na construção de construções quiméricas de três partes como descrito acima. Tais construções quiroTcas contêm uma primeira sequencia quimicamente regulável, uma segunda sequencia de DNA codificadora de um peptideo sinal em proteínas e uma terceira sequencia que codifica uma caracteristica fenotipica. De preferencia a caracteristica fenotipica é uma que seja fácilmente detectada, por exemplo oum processo de ensaio. A inclusão na construção quimérica da sequencia de DNA que codifica um peptideo sinal permite que o produto expresso pela terceira sequencia de DNA seja dirigido para fora do retículo endoplasmático da célula hospedeira até ao seu sitio alvo.
Portanto, uma caracteristica adicional do invento é um peptideo sinal da proteína PR-la do tabaco e uma proteína com uma sequencia de aminoácidos tendo substancial homologia de sequências com este peptideo. A sequencia de aminoácidos para aquele peptideo é a seguinte :
MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuVal
SerThrLeuLeuLeuPheLeuValIleSerHisSerCysArgAla.
presente invento também engloba a sequencia de DNA que codifica este peptideo (ver Sequencia 1) e as sequências de DNA tendo substancial homologia de sequências com esta sequencia. Como se notou anteriormente, o invento também engloba (1) sequencia de DNA contendo a sequencia quimicamente regulável em combinação com a sequencia codificadora do peptideo sinal e (2) sequências de DNA quiméricas de três partes contendo o componente quimicamente regulável, a secção codificadora de um peptideo sinal e uma sequencia que é transcrita, de preferencia com tradução.
H. Novos genes PR presente invento também engloba sequências de DNA genómico e de cDNA de PR recentemente isoladas e identificadas a partir dos genes aqui designados como PR-la, PR-1 * e PR-R do tabaco, da quitinase do pepineiro induzivel por agentes patogénicos, PR-Q do tabaco, p-1 , 3-g1uca na se básica 39.1 e 39.3 do tabaco, p-1,3-gluca-59-
nase acidica do tabaco e sequências de DNA tendo substancial homologia de sequências com estes genes. As sequências de DNA destes genes estão representadas nas Sequências 1 a 8.
Os novos genes das Sequências 1,2,5 e 5 (PR-la,PR-l1 e p-1,3-g1ucanase 39.1 e 39.3 respectivamente) também representam realizações particulares de sequências de DNA quimicamer^ te reguláveis não codificadoras do invento conforme mencionado atrás. As novas sequências 3,4,7 e 8 codificam as proteínas PR da quitinase do pepineiro, PR-R do tabaco, PR-Q do tabaco e a forma acidica de β-1,3-g1ucanase do tabaco.
Os detalhes de isolamento e caracter i zação dos genes estão dados nos exemplos.
I. Reguladores químicos
Um regulador quimico é definido como uma sibstancia que regula a expressão de um gene através de uma sequencia de DNA quimicamente regulável sob determinadas circunstâncias como indicado na definição do termo.
A substância, na forma iónica ou neutra, com ou sem solvatação ou outras moléculas complexantes ou aniões,será geralmente exógena relativamente ao sistema contendo o gene quimicamente regulável na altura da regulação pretendida.
uso de reguladores químicos exógenos é preferido devido à facilidade e conveniência de controlar a quantidade de regulador no sistema. No entanto, o invento também inclui o uso de reguladores endógenos, e.g. químicos cujas actividades ou níveis no sistema são artificialmente controlados por outros componentes do sistema ou actuando nele.
Os reguladores químicos incluem produtos químicos conhecidos como indutores de proteínas PR em plantas ou seus derivados muito semelhantes. Estes in-60-
cluem ácido benzoico, ácido salicilico, ácido poliacrilico e seus derivados substituidos;substituintes adequados incluem alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior e halogénio. Quando aplicado a tecidos vegetais tipicamente às folhas de plantas completas desenvolvem-se niveis elaedos de mRNA e proteínas PR no tecido vegetal.
Um grupo adicional de reguladores para sequências de DNA e genes quiméricos quimicamente reguláveis deste invento, baseia-se na estrutura benzo-1,2,3-tiadiazole e inclui, mas não está limitado nos seguintes tipos de compostos:ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, ácido benzo-1,2,3-tiadiazoletiocarboxi 1 ico, cianobenzo-1,2,3-tiadiazole, amida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazolecarboxilico, hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico e seus derivados.
Um grupo preferido de reguladores inclui mas não está limitado ao ácido benzo-1,2,3-tiadiazo1e-7-carboxi1ico, ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1 e-7-tiocarboxilico, 7-cianobenzo-1,2,3-tiadiazo 1, amida do ácido benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxi1ico e hidrazida do ácido benzo- 1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico e seus derivados.
Derivados adequados incluem mas não estão limitados a representantes dos referidos tipos de compostos em que a fracção benzo-1,2,3-tiadiazo 1e não é substituída ou substituída por pequenos substitu intes normalmente usados em sistemas de aneis aromáticos de agroquimicos tais como alquilo inferior, alcoxi inferior, halo alquilo inferior, halo alcoxi inferior, alquiltio inferior,ciano, nitro e halogénio. Derivados adequados incluem ainda, mas não estão limitados a representantes dos referidos compostos benzo-1,2,3-tiadiazole em que o ácido carboxilico, o ácido tiocarboxi1ico, a amida do ácido carboxilico ou o
grupo funcional hidrazida do ácido carboxilico não é substituído ou ê substituído por resíduos a 1 ifáticos , ara 1ifáticos ou aromáticos. Os resíduos adequados incluem mas não estão limitados a a lqui1 o(especia lmente alquilo inferior), a 1coxi(especialmente alcoxi inferior), a 1 coxia 1qui1 o inferior, a 1coxia 1coxia 1qui1 o , cic 1 oa1qui1 o , cic1oa1qui1 a 1qui1 o , feni1 a 1qui1 o (especialmente benzilo), nafti1 a 1qui1 o, fenoxialqui lo, alcenilo e alcinilo, em que a parte alquilo do substituinte não é substituída ou substituída por hidroxilo, halogénio, ciano ou nitro e a parte aromática do substituinte não é substituído ou substituída por pequenos substituintes normalmente usados em sistemas de anéis aromáticos em agroquimicos tais como alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior,a 1qui1 tio inferior, ciano, nitro e halogénio.
Reguladores baseados na estrutura benzo-1 , 2,3-tiadiazole englobam todos os sistemas moleculares capazes de libertar a molécula que actua como regulador.
Um grupo preferido de reguladores baseado na estrutura benzo-1,2,3-1iadiazo 1e inclui ácido benzo-1 ,2,3-tiadiazolecarboxilico, benzo-1,2,3-tiadiazolecarboxilato de alquilo em que o grupo alquilo contem um a seis átomos de carbono e derivados substituídos destes compostos. Substituintes incluem alquilo inferior, alcoxi inferior, alquiltio inferior e halogénio. Em particular,o ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico e os seus ésteres de alquilo, e.g. benzo-1,2,3-tiadiazo 1 e-7-carboxi1 ato de metilo, são indutores preferidos para as sequências de DNA quiméricas compreendendo sequências de DNA quimicamente reguláveis isoladas a partir de genes das proteínas PR.
A síntese dos reguladores químicos mencionados e a sua utilidade como biocidas pode ser vista na Patente Britânica 1176799 e Kirby, P. et al., J. Chem.Soc C 2250(1970).
Os derivados de benzo-1,2,3-tiadiazole que podem ainda ser usados como reguladores de acordo com o presente invento estão descritos no pedido de patente U.S. No. de série 234 241 entregue em 18 de Agosto de 1988, que aqui é incluído como referencia.
Entre as espécies preferidas baseadas na estrutura benzo-1,2,3-1iadiazo 1e podem ser mencionadas, por exemplo, o ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico, benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxilato de metilo, n-propil-benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxilato, benzo-1,2,3-tiadiazo1 e-7-carboxi1 ato de benzilo, sec-buti1-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico e similares.
Um grupo adicional de reguladores para as sequências de DNA quimicamente reguláveis deste invento baseia-se na estrutura ácido carboxilico de piridina,como seja a estrutura do ácido isonicotinico e de preferencia a estrutura do ácido ha loisonicotinico. São preferidos os ácidos dic1 oroisonicotinicos e seus derivados, por exemplo os ésteres de alquilo inferiores. Reguladores adequados desta classe de compostos são, por exemplo, o ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico e os ésteres de alquilo inferior,especialmente o éster de metilo.
Um outro aspecto do invento é portanto um processo para regulação da transcrição de um gene quimicamente regulável, processo esse que se caracteriza pela aplicação de tal regulador quimico a tecido vegetal, plantas ou semente contendo uma sequencia de DNA quimicamente regulável como descrito na Parte A,B ou C acima. E preferido um processo em que o tecido vegetal, planta ou semente contenha uma sequencia de DNA quimicamente regulável referido atrás como sendo preferida.
Os reguladores químicos podem ser aplicados na forma pura, em solução ou suspensão,como pós ou poeiras ou em outras formulações convencionais usadas em agricultura ou em processos de bio-reactores. Tais formulações podem incluir veículos sólidos ou líquidos, ou seja, materiais com os quais o regulador é combinado para facilitar a aplicação à planta, tecido, cultura de células ou de tecidos, ou similares ou para melhorar as propriedades de armazenamento, manipulação ou transporte. Exemplos de tais veículos incluem si1icatos,argi1 as,carbono enxofre, resinas, álcoois, cetonas, hidrocarbonetos aromáticos e similares. Se formulados como pós molháveis convencionais ou emulsão aquosa, a formulação do regulador pode incluir um ou mais tensioactivos convencionais, quer iónicos quer não iónicos, tais como agentes mo 1 hantes,emu1 sionantes ou dispersantes.
Os reguladores podem também ser aplicados a plantas em combinação com um outro agente que se pretende que traga algum beneficio à planta, um beneficio relacionado ou não relacionado com a caracteristica controlada por qualquer gene quimérico que seja regulado pelo regulador. Por exemplo, um regulador pode ser misturado com um fertilizante e aplicado imediatamente antes de se pretender a expressão de uma caracteristica transgénica não relacionada com a ferti1ização. Ou pode ser combinado com um herbicida e aplicado para minimizar o efeito do herbicida na altura em que tal efeito estaria no seu máximo.
Como formulação liquida o regulador pode ser aplicado com um spray nas folhas das plantas, caules ou ramos, nas sementes antes da sementeira ou no solo ou noutro meio de crescimento da planta. Os reguladores podem também ser usados em sistemas de bio-reactores, a regulação sendo conseguida através de uma única adição da
formulação do regulador ao melo de reacção ou por adição gradual durante um período de tempo predeterminado.
regulador é aplicado numa quantidade e durante tempo suficiente para efectuar a regulação pretendida. Um regulador preferido é aquele que não apresente efeito fitotóxico, ou que este seja minimo, ou outro efeito prejudicial para a planta, tecido vegetal ou células vegetais aos quais se aplica na quantidade aplicada.
As sequências de DNA preferidas entre as descritas atrás na Parte A ou B e as sequências de DNA quiméricas preferidas entre as descritas atrás na Parte C são em particular aquelas em que a transcrição é regulada por um regulador quimico mencionado, atrás, por exemplo seleccionado do grupo constituído por ácido benzoico,ácido salicilico, ácido acetilsalicilico, ácido poliacrílico e seus derivados substituídos ou se 1eccionados do grupo constituído por ácido benz-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico,ácido benzo-1 ,2,3-tiadiazoletiocarboxilico, cianobenzo-1 ,2,3-tíadiazole, amida do ácido benzo-1 , 2,3-1iadiazolecarboxi1ico, hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico e seus derivados ou ácido dic1 oroisonicotinico ou um seus derivado. Mais preferidas são aquelas sequências de DNA em que a tran£ trição é regulada pelos reguladores quimicos mencionados como preferidos, por exemplo pelo ácido benzo-1 , 2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico , benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de metilo, benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxi1 ato de n-propilo benzo-1 , 2 , 3-tiadiazo 1 e-7-carboxi1 ato de benzilo, sec-butil-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico, ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico ou 2,6-dic1 oroisonicotinato de metilo, em particular benzo- 1 ,2,3-t i ad i azo 1 e-7-carbox i 1 a to de metilo.
J. Depósitos na ATCC
Na Aierican Type Culture Collection foram depositadas as seguintes bactérias, plasmideos e cultura em suspensão que se seguem:
E. coli ΗB101/pTJS75-Km , ATCC número 67628, depositada em 12 de Fevereiro de 1988;
plasmideo pBS-PR10 13C1 a, ATCC número 40426, depositada em 12 de FEvereiro de 1988;
plasmideo pBS-PR1019, ATCC número 40427, depositado em 12 de Fevereiro de 1988;
cultura em suspensão de Zea mays 6-2717-CG, ATCC número 40326, depositada em 20 de Maio de 1987;
plasmideo pBS-Gluc número 40526, depositado em 29 de Dezembro de plasmideo pBS-Gluc número 40527, depositado em 29 de Dezembro de
39.1, ATCC 1988;
39.3, ATCC 1988;
plasmideo pBS-cucchi/chitinase, ATCC número 40528, depositado em 29 de Dezembro de 1988;
plasmideo pBSGL6e, ATCC número 40535, depositado em 18 de Janeiro de 1989.
-66Κ. Sumário dos protocolos experimentais
Os genes quiméricos do presente invento contêm sequências de DNA quimicamente reguláveis de qualquer fonte, naturais ou sintéticas, em combinação com um ou mais sequências de DNA susceptiveis de serem transcritas; geralmente pelo menos parte da sequencia que pode ser transcrita será traduzida numa caracteristica fenotipica, se bem que o invento também inclua genes quiméricos que operam segundo um mecanismo de anti-codão. Se bem que a descrição que se segue é muito dos exemplos sejam dirigidos a sequências de DNA quimicamente reguláveis encontradas naturalmente num genoma vegetal, este invento aplica-se igualmente a tais sequências que ocorrem noutros sistemas naturais, por exemplo, sistemas bacterianos,virais e animais, uma vez que as técnicas de isolamento de tais sequências a partir dos eus sistemas naturais são bem conhecidas. Ainda, estão também englobadas sequências derivadas de sistemas sintéticos ou outros sistemas não naturais.
Uma sequencia de DNA quimicamente regulável é isolada a partir da fonte em que existe natural ou sinteticamente e, se necessário, caracterizada por métodos convencionais. Se a sequencia de DNA for isolada a partir de um gene natural este gene é activado por um regulador adequado, quer por um químico quer por outro regulador conhecido do gene. 0 RNA resultante daquela activação é isolado e usado para construir uma biblioteca de cDNA.
Esta biblioteca é usada para o despiste diferencial usando cDNA marcado radioactivamente gerado a partir de (1) RNA isolado a partir do sistema activado e (2) RNA isolado a partir de um segundo sistema não activado pelo regulador. Este despiste diferenciai é um aspecto particular do presente invento conforme nenc i onado atrás. Os clones contendo o cDNA quimicamente regulado são então isolados e de preferencia aquenciados nesta altura. Os clones de cDNA são então usados para identificar e isolar um clone genómico a partir de uma biblioteca genómica, clone genómico este que compreende a sequencia de DNA quimicamente regulável. Este gene ê de preferencia sequenciado e a sequencia de DNA quimicamente regulável é mapeada funcionalmente por subclonagem dos fragmentos deste gene, ligando-os a um gene marcador e avaliando a sua actividade em material de plantas transgénicas ou em sistemas de expressão transitória em plantas.
Para os genes da proteína PR do tabaco construiu-se uma biblioteca genómica em lambda usando técnicas convencionais e os clones compreendendo sequências de DNA quimicamente reguláveis foram identificados e purificados. Um destes clones foi caracterizado. Identificaram-se os fragmentos de restrição portadores da sequencia de DNA quimicamente regulável; para o gene PR-la estes fragmentos de genes incluem um fragmento Ciai com cerca de 20 000 pares de bases, um fragmento HindIII de 6500 pa res de bases e um fragiento EcoRI de 3600 pares de bases.0 fragmento HindIII contem cerca de 500 pares de bases codificadoras e cerca de 6000 pares de bases não codificadoras na região delimitante 5' adjacente ao sitio de iniciação da transcrição. Alguns destes fragmentos foram subclonados em plasmideo para usar como fontes de DNA para posterior clonagem e caracterização completa, i.e. mapeamento de restrição sequenciação de DNA e identificação do sitio de iniciação da transcrição do gene. Para o gene PR-la o fragmento EcoRI de 3600 pares de bases foi directamente subclonado a partir de um clone genómico em lanrbda e subsequentemente subclonado para um clone final de cerca de 1200 pares de bases delimitado por sítios Xhol e PstI.Este clone contem uma sequencia de DNA quimicamente induzivel derivada de um gene PR-la e uma porção da região codificadora adja-68-
cente para aquele gene; esta porção inclui a sequencia codificadora do peptideo dinal do gene da proteína PR-la.
De modo semelhante foram isolados clones genómicos que codificam a forma básica da beta-1,3-glucanase. Dois clones designados 39.1 e 39.3 foram caracterizados e identificados os fragmentos de restrição compreendendo sequências de DNA quimicamente reguláreis.
Usando os vectores deste invento; estes clones podem ser usados na preparação de genes quiméricos contendo três partes como discutido atrás. Estas sequecias de DNA quimérico contêm a sequencia quimicamente regulável, parte do DNA capaz de ser transcrito e uma terceira sequencia de DNA de uma fonte estranha. Como alternativa os clones podem ainda ser manipulados, e.g. por mutatjénese dirigida especifica de sitio, para remover todo ou a maioriparte do fragmento codificador do gene parental antes da ligação a uma sequencia codificadora derivada de uma fonte estranha para preparar um gene quimérico de duas partes como descrito atrás. Numa execução preferida a parte do gene quimérico que não é sequencia quimicamente regulável constitui um gene marcador para uma caracteristica fenotipica fácilmente observada ou detectada. Os exemplos que se seguem ilustram os genes da beta-1,3-g1ucuronidase,aceto-hidroxiácido sintetase selvagem ou resistente a herbicidas e endotoxina de Bac i 11 us thuringiensis, mas podem ser usados numa variedade de outros genes marcadores como descrito atrás . Num aspecto ainda mais preferido a sequencia de DNA componente codificadora do gene quimérico codifica tolerância ou resistência a herbicidas ou resistência a insectos.Esta realização é exeipl if içada pelos genes mencionados da aceto-hidroxiácido-sintetase e endotoxina de Bacillus thuringiensis.
Os genes quiméricos e vectores conten do estes genes podem ser introduzidos em células vegetais por uma variedade de técnicas que dão origem a células transformadas, tecido e plantas ou a culturas celulares úteis em bio-reactores. Vãrias técnicas estão descritas deta1hadamente nos exemplos que se seguem, dirigidas tanto a monocoti1edóneas como a dicoti1edónias. Alguns destes métodos aqui incluídos com fins ilustrativos, são assunto de outros pedidos de patentes, em particular o pedido de patente U.S. No. de Série 056 506, entregue em 29 de Maio de 1987 e o pedido de patente U.S. No. de Série 165 665, entregue em 8 de Março de 1988.
material vegetal transformado pode então ser tratado com um regulador quimico e a expressão do gene de marca fenotipica observado e/ou medido.Este tipo de sistema proporciona um sistema fácil de despiste para identificar a actividade reguladora de químicos particu 1 ares. 0 invento também diz respeito a um ensaio melhorado da actividade enzimática da beta - 1,3-g1ucoronid a se (GUS) que permite o despiste de um grande número de amostras com elevada precisão e num período de tempo curto. Em particular este ensaio compreende a reacção de extractos de tecidos vegetais em amostras de menos de 0,5 ml contendo 4-meti1-umbe1iferi 1 -glucuroneto 1,5 a 3 mM aproximadamente 37°C, durante 1 a 5 horas e determinando a concentração do irriicador de fluorescência libertado.
A determinação quantitativa dos níveis estacionários de RNA é um passo essencial na análise da expressão de genes. Com esta finalidade foi desenvolvido um ensaio de prolongamento de iniciadores (primer extension). Este método do invento envolve a marcação de um oligonucleotideo especifico de um gene com uma radioactividade especifica elevada, hibridação do o 1igonuc1eotideo com uma amostra ι
de RNA e prolongamento do hibrido com transcriptase reversa. Os produtos do prolongamento são separados em geis desnaturantes de acrilamida e visualizados por autorradiografia. As vantagens deste método relativamente aos ensaios incluem a facilidade de preparação da sonda, simplicidade do protocolo de ensaio e o tempo necessário para fazer o ensaio.
Este ensaio de prolongamento do iniciador é tão sensível e quantitativo como o mapeamento com Sl.
ensaio de prolongamento do inciador conforme aplicado nas condições de reacção particulares descritas abaixo nos exemplos foi optimizado para a (feterminação do nível de mRNA de PR-1 no RNA total extraído a partir de folhas do tabaco infectadas com TMV. 0 mRNA PR-1 é expresso como 1% do mRNA nestas folhas baseado na análise quantitativa dos dados de prolongamento do iniciador e na frequência de clones de cDNA numa biblioteca de cDNA derivada deste RNA.Os me lhorementos do método do invento relativamente aos préviamente descritos compreendem a marcação do oligonucleotideo com uma actividade especifica alta, o decréscimo da quantidade molar da sonda usada no ensaio (tipicamente cerca de 0,01 a 0,05 pmoles), a hibridação e o tempo de elongação optimizados e as concentrações de trifosfatos de nucleotideos optimizadas.
invento inclui portanto um método pe ra a determinação da quantidade de um RNA especifico numa solução de RNA caracterizado por (a) marcação de um o 1igonuc1eotideo iniciador especifico de RNA com um comprimento entre 12 e 18 nucleotideos para uma radioactividade especifica elevada, (b) hibridação do RNA com o o 1igonuc1eotideo marcado numa concentração entre 0,1 e 20 mM durante entre 2 minutos e horas a uma temperatura de aproximadamente 37°C,
(c) elongação do o 1igonuc1eotideo iniciador com transcriptase reversa na presença de trifosfatos de nucleotideos numa concentração entre 0,003 e lmM durante entre 1 e 120 minutos e (d) separação e visualização dos produtos de elongação com autorrad i ograf i a.
L. EXEMPLOS
Os exemplos que se seguem ilustram ainda o presente invento. Eles não devem ser considerados como uma limitação do âmbito e significado das reivindicações.
As reacções enzimáticas são conduzidas de acordo com os processos recomendados pelo fabricante a menos que de outro modo seja indicado.Os genes quiméricos e vectores do presente invento são construídos usando técnicas bem conhecidas.Foram descritas técnicas adequadas em Maniatis, T. et a 1 . , Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982);Methods in Enzymology, Volumes 68, 100, 101 e 118 (1979, 1983, 1983 e 1986); e DNA Cloning, Glover, D.M. Ed. IRL Press, Oxford (1985).As composições dos meios foram descritas em Miller J.H. Experiments in Molecular Genetics ,Cold Spring Harbor Laboratory,
New York ( 1972 ),assim como as referencias préviamente identificadas.
-72ABREVIATURAS
ATP Trifosfato de adenosina
Pb par de bases
CETAB brometo de hexadeci1trimeti1amônio
2,4-D ácido 2,4-dic1orofenoxiacético
DTT d i t i ot re i to 1
d i camba ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico
EDTA ácido etilenodiamina N,N,N,N1 -tetracético
kb Ki 1 o pares de bases
MES ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico
MU 4-metil-umbeliferil-glucuroneto
PEG polietilenoglicol
p i c lo ram ácido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico
SDS dodeci1su1fato de sódio
TFA ácido trif1uoroacético
TMV vírus do mosaico do tabaco
Tris-HCl hidrocloreto de tris(hidroximeti1 )meti 1 amina
MEIOS
meio SH-O: Meio de Schenk, R.U. et al., Can J.Bot., 50(1972) 199-209; sem hormonas. 0 meio SH pode ser liquido ou solidiD ficado com 0,8% de agar ou com 0,5% de GelRite . 0 meio é normalmente esterilizado pelo calor numa autoclave a 230-250°F durante 15-20 m i n.
meio SH-30: meio SH-0 contendo 30 /jm Dicamba.
meio SH-45: meio SH-0 contendo 45 um Dicamba meio RY-2: meio de Yamada, Y. et al., Plant Cell
Reports, 5, 85-88(1986).
meio OMS: Meio de Murashige, T. e Skoog, F., Physiologia
Plantarum 9, 473 (1968). 0 meio pode ser solidificado com
D
0,8% de agar ou agarose ou com 0,5% de GelRite .
TABELA I Composição dos meios usados
Meios: KM-8pb ’ c ,d
A A
Macroe lementos , microelementos e Fe-EDTA são como dados na Titera tura:meio KM de acordo com Kao, K.N. et al., Planta 126, 105-110 (1965);meio N6 segundo Chu et al., Scientia Sinica 18, 659 (1975).
Meios : KM-8pb,c,d N6
Orgânicos e vitaminas e /mg/ml/:
Bi ot i na 0,01
piridoxina-HCl 1 ,00 0,5
t i am i na-HC1 10,00 0,1
n i cot i nam i da 1,00
ácido nicotinico 0,10 0,5
ácido fó1ico 0,40
D-Ca-pantotenato 1 ,00
ácido p-aminobenzoico 0,02
c1oreto de colina 1,00
riboflavina 0,20
Vitamina B 12 0,02
g1i c i na 0,10 2,0
Acúcares e alcóois de açúcares/g/1/:
sucrose 0,25 30,0
glucose 68,40
man i to 1 0,25
sorb i to 1 0,25
ce 1 ob i ose 0,25
f rutose 0,25
ma nose 0,25
ramnose 0,25
ri bose 0,25
x i 1 ose 0,25
mi o-i nos i to 1 ,10
-75pH Final
5,8
Esteri1ização
f i1tro
5,5 autoclavado
Notas:
a Os macroe1ementos são geralmente feitos numa solução stock concentrada até 10 X e os microelementos como solução stock concentrada a 1000 x.
b Os ácidos cítrico, fumárico e málico (concentração final 40 mg/1 de cada) e piruvato de sódio (concentração final 20 mg/1) são preparados como solução stock 100 X concentrada, ajustados a pH 6,5 com NH^OH e adicionados a este meio.
c Adenina (concentração final 0,1 mg/1) e guanina,timidina, uracilo, hipoxantina e citosina (concentração final 0,03 mg/1 de cada) são preparados como solução stock 1000 X concentrada,aj ustada a pH 6,5 com NH^OH e adicionado a este meio.
d Os aminoácidos que se seguem foram adicionados a este meio usando uma solução stock 10 X (pH 6,5 com NH^OH) para dar as concentrações finais:g1utamina (5,6 mg/l),alanina, ácido g1utâmico(0,6 mg/1 de cada), cisteina (0,2 mg/1), asparagina, ácido aspártico, cistina, histidína, isoleucina, leucina, lisina, metionina, feni1 a 1 anina , prolina, serina, treonina, triptofano,tirosina e valina (0,1 mg/1 de cada).
e Solução stock de vitaminas é normalnente preparada 100 X concentrada.
MATERIAIS
Agarose:A Preparação e purificação de agarose estão descritas por Guiseley e Renn, The Agarose Monograph, Marine Colloids Division FMC Corp., 1975. A agarose ê um dos constituintes do agar. A agar comercial normalmente consiste numa mistura de agarose neutra e agaropectina iónica com um grande número de grupos laterais. Geralmente ficam intactos uma série de cadeias laterais que determinam as propriedades fisicoquimicas da agarose como seja a temperatura de formação e de fusão do gel. A agarose de temperatura de fusão baixa.esD pecialmente a agarose SeaPlaque , é um meio so1idificante prefer i do.
Hidrolisado de caseína: Hidrolisado de Ca seina-Hidro1isado enzimático de leite de vaca, Tipo 1, Sigma Co., PO.Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA.
Ce Iu1 a se RS : Cellulase RS, Yakult Honsha Co. Ltd., 1.1.19 Higashi-Shinbashi, Minato-Ku, Tokyo, 105 Japan.
R
Ge 1Rite : GelRite Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Fiskerville, R.I. 02823, USA.
GeneScreen Plus^: Cat. No. NEF 976, NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA.
Kit de iniciadores ao acaso IBI(random primer Kit:Kit de iniciadores Prime Time, International Biotechnologies Inc., PO.Box 1565, New Haven.CT 07606, USA.
R
Filtro Na 1 gene : Nalge Co., Division of Sybron Corp.
Rochester, N.Y.14602,USA.
Pectoliase Y-23R; Seishin Pharmaceutica 1 Co.Ltd.,4-13 Koami-cho, Nihonbashi, Tokyo.Japan.
R R
Parafilm : Película de laboratório Parafilm -American Can Co. Greenwich, CT 06830, USA.
SSC: 1,54 mM NaCl, citrato de sódio 0,154 mM
Coluna de centrifugação (spin co1umn ) : co 1 una pré-preparada SephadexR G25, Cat No.100402, Bochringer Mannheim Biochemica 1s,Piscataway, NJ, USA.
Tampão TAE e tampão TBE: Tampão tris-acetato e tampão tris-borato, respectivamente-tampões vulgares de electroforese , ver Maniatis et al., supra.
1. Técnicas gerais
Este grupo de exemplos descreve as manipulações gerais usadas na realização dos exemplos detalhados que se seguem:
EXEMPLO 1 Ligação em agarose
Após digestão de restrição do DNA de plasmideo e separação e1ectroforética dos fragmentos num gel TAE de baixa temperatura de fusão, as bandas contendo os fragmentos adequados foram removidas com precisão e aquecidas a 65°C para fundir a agarose.Adicionou-se 2-5 μ 1 a 15 /jl de água e a solução foi deixada a 65°C durante 10 minutos. Esta solução foi arrefecida a 37°C e deixada durante cinco minutos para equilibrar a temperatura.Adicionou-se 2 μ1
V
de tampão ligase 10 X (200 mM Tris, pH 8,0, 100 mM MgCl^, 100 mM DTT, 10 mM ATP) juntamente com 1 /j 1 de DNA ligase de T4 (New England Biolabs) e esta solução foi deixada a solidificar e incubada a 15°C durante a noite.
EXEMPLO 2 Transformação a partir de agarose
A agarose contendo o DNA adequado foi fundida por incubação a 65°C durante 10 minutos. 10 ul desta solução foram adicionados a 38 μ 1 de tampão TE (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA), misturados e deixados em repouso à temperatura ambiente. As células competentes congeladas (E^. co 1 i estirpe DH5 ) foram colocadas em gelo fundente para descongelar. A solução de DNA diluida foi adicionada a 200 /j1 de células e deixada em repouso em gelo durante 20 minutos. Foi então feito um choque térmico às células contendo DNA durante 90 segundos a 41°C. As células foram então deixadas à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionou-se 0,8 ml de meio S0C(Hanahan, D., J. Mol. Biol. 165, 557-580 (1983) e a cultura foi incubada a 37°C durante uma hora. 100 μ\ da cultura foram semeados em placas LB (Miller, supra ) contendo 100 μ 1 /m 1 de ampicilina (L-amp) e as placas foram incubadas durante a noite a 37°C.As colónias positivas foram repicadas para uma segunda placa L-amp e as placas incubadas durante a noite a 37°C.
EXEMPLO 3
Transferências Southern yug de DNA do tabaco foram digeridos com várias enzimas de restrição nas condições sugeridas pelo fornecedor. 0 DNA foi extraído com fenol, precipitado com etanol e depois ressuspenso em tampão de aplicação (15% de ficol, 0,025% de azul de bromofenol, 10 mM EDTA, pH8).
As amostras foram aplicadas e sujeitas a e1ectroforese num gel de 0,5% de agarose a 5V/cm até o azul de bromofenol ter atingido o extremo do gel. 0 DNA foi tranferido para Gene-Screen Plus (Dupont) usando o processo de transferencia alcalina como descrito pelo fornecedor.Pré-hibridação,hibridação e lavagem foram feitas de acordo com as recomendações do fabricante. A hibridação foi detectada por autorradiograf i a.
EXEMPLO 4 Adaptadores moleculares
Uma molécula adaptadora típica ê a sequencia 1 -GGGATCCTGCA-3' para a conversão de um sitio PstI num sitio BamHI. Esta molécula é sintetizada num Applied Biosystems Synthesizer usando química de cianoeti1fosforamideto e purificada por HPLC de fase reversa. Cerca de 2 /jg deste o 1 igonuc 1 eotideo foram fosforilados de acordo com Maniatis et a 1.,supra, p. 125 A solução de o 1igonuc1eotideos foi aquecida a 65°C num banho -maria e deixada arrefecer até à temperatura ambiente durante um período de cerca de 30 minutos. Um excesso molar de aproximadamente 10 vezes deste adaptador emparelhado foi adicionado ao DNA digerido juntamente com tampão ligase 10 X,
-80DNA-1igase de T4 e uma quantidade adequada de água. Uma reacção típica é:
DNA a ser adaptado: 1-2 /j! ( 1 pmole)
Adaptador: 1 /Jl
tampão ligase 10 X : 1 AJl
DNA-ligase de T4: 1 AJl
Agua : 5-6
Esta solução foi incubada a 12-15°C durante 30 minutos e aquecida a 65°C durante 30 minutos para inactivar a ligase. A concentração salina e o volume foram ajustados para uma digestão de restrição adequada e o DNA adaptador foi digerido para expor o extremo coesivo. Os adaptadores não incorporados foram removidos por electroforese num gel de agarose ou por precipitações sequenciadas com isopropano1.
EXEMPLO 5 Mapeamento por prolongamento de iniciadores
A. Síntese e marcação do extremo 5' de iniciadores para o prolongamento de iniciadores.
Os oligómeros iniciadores que se seguem foram sintetizados usando um Applied Biosystems Synthesizer e química de β-cianoeti1fosforamideto:
PR-1 :
GUS :
AHAS :
BT :
5'-ATAGTCTTGTTGAGAGTT-3'
5'-TCACGGGTTGGGGTTTCTAC-3'
5'-AGGAGATGGTTTGGTGGA-3'
5'-ATACGTTCTACTATCATAGT-3'
Os ol igonucleotieos foram purificados por cromatografia liquida de alta pressão de fase reversa (HPLC). 5 pmoles de cada oligómero foram fosforilados (Maniatis, T. et aj_. , supra. , na pág. 125) usando 200 hC i de 32p~ATP (6000 Ci/mmol, 10 fiCi/^l). Após incubação a 37°C durante 30 minutos, a reacção foi diluida para 100 μ 1, extraída com feno1/c1oroformio e depois precipitada três vezes com 50 ug de RNA veiculo. 0 precipitado final foi ressLçienso em tampão de transcriptase reversa 1 X (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 40 mM KC1, 3 mM MgC^Jnuma concentração de 2 mM. A actividade especifica do o 1igonuc1eotideo marca£ do foi determinada como sendo 3x10 (Cvcpm/pmo1.
B. Preparação de RNA total
Preparou-se RNA total essencialmente como descrito por Lagrimini, L.M.et a I.,Proc. Natl.Acad.
Sei.USA 84, 7542 (1987).0 tecido foi triturado em azoto liquido num almofariz.0 tecido triturado foi adicionado a tampão de trituração (Lagrimini et al.,supra) usando 2,5 ml por
\
Λ
grama de tecido. Adicionou-se então um volume igual de fenol e a emulsão foi homogenizada num polytron Brinkman. Adicionou-se um meio do volume de clorofórmio e a emulsão foi suavemente misturada durante 15 minutos. As fases foram separadas por centrifugação e a fase aquosa removida. 0 RNA foi precipitado pela adição de acetato de sódio para 0,3M e 2,5 volumes de etanol.Colheu-se o precipitado por centrifugação e ressuspendeu-se em 2 ml de água estéril. Adicionou-se cloreto de litio para uma concentração final de 3M e deixou-se a 4°C durante a noite. 0 precipitado foi colhido por centrifugação e o sedimento lavado com etanol a 80% arrefecido em gelo. 0 sedimento foi seco e ressuspenso em 500 de água ésteril. A concentração desta preparação de RNA total foi determinada espectofotométricamente. Como alternativa, o RNA ê extraido do calo como descrito atrás exceptuando o tecido do calo ser cortado em cubos de aproximadamente 3 mm de tamanho e adicionado a almofarizes pré-arrefecidos para a trituração em azoto liquido antes do passo do polytron.
C. Prolongamento do iniciador
Num tubo Eppendorf de 500 μ 1
1iofi1izou-se 50 μ 1 de RNA total. 0 RNA foi ressuspenso em 30 pl de solução de sonda marcada radioactivamente e aquecido a 70°C durante 10 minutos.0 tubo foi lentamente arrefecido até 37°C e deixado a incubar durante a noite.
Sem remover o tubo do banho-maria a 37°C, adicionou-se 2 ul de tampão transcriptase reversa 10 X (500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 400 mM KC1 , 30 mM MgCl2) , 1 jj 1 de albumina do soro bovina a 5 mg/ml, 5 μ 1 de ditiotreitol 100 mM, 50 μ 1 de dNTPs 10 X (dNTPs 10 mM cada um em H20), 3 pi de F^O, 2 μ 1 de RNasina (80 unidades) e 2 yU 1 de transcriptase reversa (400 unidades) e a reacção foi incubada a 37°C durante 30
minutos. Para parar a reacção, adicionou-se 5 ai 1 de acetato de sódio 3M, pH 5 e 150 μΐ de etanol absoluto. 0 tubo foi deixado a -20°C durante 30 minutos, o precipitado foi colhido por centrifugação, lavado com etanol a 80% e deixado secar ao ar. Ressuspendeu-se o precipitado em 10-20 /jI de corante de aplicação (90% formamida, 0,005% azul de bromofenol, 0,05% xi1eno-ciano 1, 1 mM EDTA) e os produtos do prolongamento foram separados num gel de sequenciação a 6% (Maniatis, T. et al. , supra). Os produtos de prolongamento foram visua lizados por autorradiografia.
EXEMPLO 6 Mapeamento com nuclease SI plasmideo pBS-PR101 3C1 a foi digerido com SfaNI, desfosfori1ado com fosfatase de intestino de vitela e fosfori1ado com P-ATP. Após extracçao com fenol e precipitação com etanol, o DNA foi digerido com BstEII e o fragmento de 300 pb desde 750 até 1035 da Figura 1 foi isolado após electroforese num gel de agarose de baixa temperatura de gelificação. A sonda foi ressuspensa em tampão de hibridação com formamida (Berk, A.J. et al., Cell 12; 721(1977)) numa concentração de aproximadamente 2 nM. A actividade especifica da sonda é de cerca de 5x10 Cvcpm/pmol.
RNA total liofilizado (50 ug) foi dissolvido em 30 ul da solução de sonda e os tubos foram aquecidos a 65°C durante 10 minutos, depois deixados hibridar durante a noite a 48°C. 0 tratamento com nuclease SI e electroforese em gel foram essencialmente como descrito, usando uma concentração de SI de 400 unidades/ml e uma temperatura de incubação de 30°C. A concentração adequada da nuclease SI foi determinada em experiências piloto.
-84EXEMPLO 7 Mapeamento do sitio de iniciação da transcrição .
sitio de iniciação da transcrição para o gene PR-la foi determinado por uma combinação de mapeamento com nuclease SI e análise de pro 1 ongaiento de iniciadores. Examinou-se uma autorradiograma de uma experiência de prolongamento de iniciadores usando RNA isolado a partir de folhas infectadas com TMV ou um subclone do fragmento Xhol-PstI em mpl9 como molde e um o 1 igonuc 1 eotideo de 17 bases complementar das posições 1025 a 1042 da sequencia PR-la como iniciador eqpecifico. 0 próprio iniciador foi marcado no fosfato 5', portanto o tamanho do produto do prolongamento será idêntico ao tamanho da banda correspondente nas linhas de sequenciação. 0 aparecimento de duas bandas fortes correspondendo às posições 902 e 903 e uma banda fraca na posição 901 do clone genómico sugere a iniciação da transcrição numa destas posições. No entanto, a análise de prolongamento de iniciadores sózinha não pode ser usada para identificar o extremo 5' de um mRNA.Por exemplo, o mRNA pode possuir um extremo 5' que foi cortado de um sitio a montante.
Para determinar conclusivamente o extremo 5', usou-se o mapeamento de alta resilução com SI juntamente com o prolongamento de iniciadores.Um fragmento SfaNI foi marcado no extremo 5' e digerido com BstEII para dar uma sonda especifica de cadeia indo da posição 759 a 1040. Esta sonda foi usada para mapear o extremo 5' dos mensageiros de PR-la em RNA isolado de folhas do tabaco infectadas com TMV. Encontrou-se uma banda principal de 137 + 2 bases que corresponde às posições 901 a 905 do clone genómico. Em experiências de alta resolução com Sl, onde os produtos de digestão foram sujeitos a electroforese
juntamente com padrões de tamanhos das reacções de sequenci^ ção efectuadas na sonda, visualizaram-se três bandas correspondendo às posições 901, 902 e 903. Estes resultados confirmam a análise de prolongamento do iniciador e colocam o extremo 5' do mRNA de PR-1 na posição 901, 902 ou 903. Relativaiente à iniciação da transcrição, uma possível interpre tação destes resultados ê que a RNA-polimerase comece a transcrição na base 901, 902 ou 903 com mais ou menos igual probabilidade. No entanto, uma vez que a transcrição em eucariotas favorece a iniciação num A, uma explicação mais provável para a aparente multiplicidade de extremos 5' é que o mRNA de PR-la comece na posição 903 (um A) e os mRNAs de PR-lb e lc comecem cada um numa das outras posições dos seus correspondentes genes.
2. Identificação e caracterização de proteínas
As proteínas PR importantes para estes exemplos foram isoladas, purificadas e sequenciadas, pela primeira vez nalguns casos e de acordo com processos da literatura noutros, com a finalidade de confirmar a identidade dos seus genes quimicamente induzíveis.
EXEMPLO 8 Purificação das proteínas PR-la e Pr-lb
Plantas de Nicotiana tabacum cv.
Xanth i foram cultivadas numa estufa e infectadas com oito semanas de idade esfregando suavemente as folhas com uma suspensão de uma estirpe vulgar (UI) de TMV (0,5 pg/ml). Colheram-se as folhas sete dias após a infecção e o fluido intracelular (ICF) foi removido das -folhas e colhido de acor-86-
do com Parent, J.G. et al. , Can. J. Bot. 62, 564 (1984).
250 ml de ICF foram concentrados para 50 ml por liofilização e aplicados numa coluna de Ultragel ACA54 equilibrada com Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM EDTA. Os eluatos foram analisados por electroforese em geis de 10% de po1iacri1amida.
As fracções contendo proteínas PR-1, foram reunidas,1iofilizadas e ressuspensas em 3 ml de água e depois dialisadas durante a noite contra água. Esta preparação foi ainda purificada por cromatografia de permuta aniónica HPLC numa coluna TSK-DEAE 5PN. A coluna foi eluida com um gradiente 0-0,6N NaCl em 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA.
As fracções foram analisadas por e1ectroforese em geis de po1iacri1amida (PAGE). PR-lb elui primeiro da coluna a 0,18M NaCl e PR-la elui a 0,28M NaCl. As fracções contendo cada uma das proteínas foram reunidas, dialisadas contra água e 1 iofi 1 izadas. A pureza da preparação de proteínas PR-la e PR-lb foi confirmada por HPLC de fase reversa usando uma coluna Aquapore-pheny1 (2,1 x 100 mm, Brownlee) e eluindo com um gradiente linear de acetonitrilo/isopropanol (1:1) (5-80%) em 0,1% TFA.
EXEMPLO 9
Determinação da sequencia das proteínas
A proteína PR-la purificada e liofilizada foi dissolvida em 6M guanidina-HC 1 contendo 1M Tris-HCl, pH 8,6, 10 mM EDTA. Adicionou-se ditiotreitol para 20 mM e 4-vini 1 piridina para uma concentração final de 50 mM. Incubou-se então uma amostra durante 1,5 horas sob azoto. Ao material piridileti1ado foi removido o sal em HPLC usando uma coluna Aquapore phenyl (2,1 x 100 mm, Brownlee). A coluna foi eluida com um gradiente linear de 5-80% de acetonitri1 o/isopropano1 (1:1) em ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%.
As degradações automáticas de Edman foram efectuadas com um sequenciador de fase gasosa Applied Biosystems 470A. Os feni1tio-hidantoína (PTH)-aminoácidos foram identificados num analisador de PTH Applied Biosystems
120 A.
A clivagem com brometo de cianogénio foi efectuada i n s itu de acordo com Simpson, R.J. et a 1., Biochem. Intl. 8, 787 (1984). A digestão de PR-1 com pirog1utamato-aminopeptidase (Boehringer Mannheim) foi efectuada de acordo com Allen G., Plant Sei Lett 26, 1 73 ( 1982).
PR-la foi digerido com endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) em 0,1M Tris-HCl , pH 8,5 durante 24 horas à temperatura ambiente usando uma proporção de enzima substrato de 1:10. Os peptideos foram isolados por HPLC usando uma coluna Aquapore C-8 (1x22 cm,
Bronlee ) por um gradiente linear de acetonitrilo/isopropanol (proporção 1:1) (0 a 60%) em 0,1% de TFA.
A digestão do peptideo N-terminal Lys-C com tripsina (Cooper) foi efectuada em bicarbonato de amónio 0,lM, pH 8,2, contendo cloreto de cálcio 0,1M durante cinco horas a 37°C usando uma proporção de enzima para substrato de 1:100. Os dois peptideos gerados foram separados em HPLC usando as mesmas condições dos peptideos Lys-C.
EXEMPLO 10 Sequenciação dos peptideos de PR-la
Uma correlação da sequencia de
DNA cts três clones de cDNA com as proteínas PR-la, -lb e -lc foi originalmente estabelecida por Cornelissen, B.J.C.et al., supra, com base numa comparação dos dados de sequenciação de proteínas publicados para os três peptideos derivados de PR-la (Lucas, J. et a 1., EMBO d. 4, 2745 (1985 )) e a estrutura primária da proteína deduzida a partir dos clones de cDNA. No entanto, o clone de cDNA designado como PR-la está truncado no extremo 5' e pode ser comparado a apenas dois dos três peptideos com um resíduo desemparelhado. A sequencia de aminoácidos codificada deduzida a partir do cDNA conforme preparado e analisado atrás e a sequencia de cDNA do PR-la de Ptitzner, U.M. et a 1., supra, não só não coincide com a sequencia da proteína publicada no residuo triptofano como também não coincide em três outras posições da sequencia do extremo amino. Esta anomalia põe em questão a identificação deste clone como sendo PR-la. Portanto,da identidade do clone tobchr PR1013 como sendo o gene PR-la foi verificada por determinação de uma grande parte da estrutura primária da proteína PR-la purificada através da sequenciação de aminoácidos.
Os dados da sequencia de aminoácidos para a proteína PR-la foram comparados com as sequências de aminoácidos deduzidas a partir dos clones de cDNA para PR-la, -lb e -lc. Osresultados das sequências de cDNA usados na análise foram de clones de cDNA isolados atrás e sequências de Pfitzner, U.M. et a 1. , supra, que estão de acordo em todas as posições. Cerca de 80% das sequências da proteína PR-la madura foi determinada e esta sequencia condiz com a sequencia de proteína deduzida para tobchr PR1013. Quando comparada com a sequencia de aminoácidos deduzida derivada dos clones de cDNA putativos de PR-lb e PR-lc
(Corne 1issen , B.J.C. et a 1., supra) verificaram-se setes e seis desempare1hamentos, respectivamente.Assim os dados mos tram claramente que tobchr PR1013 é de facto um clone do gene PR-la.
3. Produção de clones
Este grupo de exemplos descreve clones preparados como resultado do isolamento e identificação de genes das sequências quimicamente reguláveis e genes quiméricos contendo aquelas sequências.
EXEMPLO 11 Preparação de tobch,r P R101 3
Isolaram-se núcleos a partir de folhas de N i cot i ana tabaocum congelando primeiro 35 gramas do tecido em azoto liquido e trituração para se obter um pó fino usando um almofariz. 0 pó foi adicionado a 250 ml de tampão de trituração (sucrose 0,3M, 50 mM Tris, pH 8, cloreto de magnésio 5 mM, bissulfito de sódio 5 mM, 0,5%
NP 40)., e agitado em gelo durante 10 minutos. Esta mistura foi filtrada através de seis camadas de pano de queijo e o liquido transferido para tubos de centrífuga e sujeito a centrifugação a 700 x g durante 10 minutos. Os sedimentos foram ressuspensos em tampão de trituração e recentrifugados. Os sedimentos foram novamente ressuspensos em tampão de trituração e esta suspensão foi colocada sobre uma almofada de 20 ml de sacarose fria contendo 10 mM Tris pH 8, cloreto de magnésio, 1,5 mM, cloreto de sódio 140 mM, 24% sucrose, 1% NP40. Estes tubos foram centrifugados a 17 000 x g durante 10 minutos. Nesta fase os sedimentos contêm essencialmente núcleos e grãos de amido. DNA de alto
peso molecular foi isolado a partir dos núcleos essencialmente de acordo com Maniatis T. et a 1., supra. 0 DNA foi parcialmente digerido com Mbol e ligado ao sitio BamHI do vector de clonagem EMBL3. Foram despistadas aproximadamente 300 000 placas com uma sonda de cDNA de PR-lb marcado. Isolaram-se e caracterizaram-se cinquenta clones positivos. Placas positivas foram purificadas e csracterizadas por análise de restrição. Estes clones foram classificados em oito grupos, distintos por mapeamento de restrição. Um dos clones foi identificado como tobchrPR1013. Na Figura 1 está apresentado um mapa de restrição parcial de tobchrPR1013.0 isolamento do DNA e manipulações de DNA foram essencialmente como descrito por Maniatis, T. et a 1., supra.
EXEMPLO 12 Preparação de pBS-PRl013C 1 a
Um fragmento Ciai do clone tobchrPR1013 foi subclonado no plasmideo Bluescript (Stratagene Cloning Systems), resultando em pBS-PR1013C1 a (Ver Figura 2). 0 fragrrento Xhol-BglII de 2 kb do pBS-PR1013
Cia foi sequenciado e encontrou-se as posições 913 a 1711, (Sequencia 1) condizem perfeitamente com a sequencia de um clone de cDNA de PR-la, isolado por Pfitzner, U.M. et a 1., supra. Possíveis rearranjos do DNA do tabaco durante o processo de clonagem foram excluídos pela análise dos fragmentos de restrição previstos derivados de DNA genómico.
Com base na informação de sequências e num mapa de restrição de pBS-PR 1013C1 a, a digestão de DNA genómico do tabaco com EcoRI, HindIII, Xhol + BglII ou HindIII+PstI deverá gerar fragrentos de 3,2 kb, 6,7 kb, 2,okb ou 6,4 kb respectivamente, os quais contem o gene PR-la. Para testar esta previsão, 3 ug de DNA cromossómico do tabaco foram digeridos com as enzimas adequadas e sujeitos a electroforese num
gel de 97% de agarose. 0 DNA foi transferido para uma membrana de nylon e testado por hibridação com um fragmento de restrição Xhol-BstEII marcado derivado do gene PR-la.
Como testemunha o DNA do pBS-PRl013C1 a foi digerido e sujeito a electroforese no mesmo gel. Conforme previsto, os produtos da digestão com EcoRI, HindIII, Xhol + BglII e HindIII + PstI produzem bandas com o peso molecular esperado que comigram com as bandas testemunhas. Portanto, o DNA contido no clone tobchrPR1013 representa um pedaço conQ guo de DNA no genoma do tabaco.
EXEMPLO 13 Preparação de pBS-PR 1013Eco
A. 0 plasmideo pBS-PR1013Eco foi construído por subclonagem do fragmento EcoRI de 3,6 kb contendo o gene PR-la do tobchrPR1013 (Exemplo 9) no único sitio EcoRI do plasmideo Bluescript. 0 plasmideo Bluescript (no. de catálogo 21203) foi adquirido à Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Califórnia. A estrutura do pBS-PR1013Eco foi confirmada por mapeamento de restrição e sequenciação de DNA. Esta construção do plasmideo está apresentada na Figura 3.
B. Como alternativa, o plasmideo pBS-PR 1013C1 a foi digerido com EcoRI e o fragmento de3,6 kb contendo o gene PR-la foi isolado. 0 Bluescript foi digerido com EcoRI, misturado e ligado com o fragmento EcoRI de 3,6kb isolado préviamente. Esta construção do plasmideo está apresentada na Figura 4.
EXEMPLO 14 Preparação do pBS-PE 10 13EcoAps t plasmídeo pBS-PRl013Eco foi digerido com PstI e os fragmentos de DNA separados num gel de 2,5% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 fragmento grande contendo o vector Bluescript e um fragmento de 3,0 kb do DNA do tabaco foram removidos com precisão e aquecidos a 65°C para fundir a agarose. 2 ul foram adicionados a 15 μ 1 de água e o DNA foi ligado em agarose como descrito no Exemplo 1. Após incubação duranteaa noite,a agarose contendo o DNA foi então fundida por incubação a 65°C durante 10 minutos e depois usada em transformação essenc i a Inerte como descrito no Exemplo 2. Uma fracção da cultura bacteriana de cada uma das seis construções putativas positivas foi inoculada em 5 ml de meio LB(Mi 1 ler,supra) contendo 100 /ug/ml de ampicilina e esta cultura foi incubada a 37°C durante a noite. As células foram colhidas por centrifugação numa centrífuga clinica na velocidade máxima durante 10 minutos. 0 sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em 100 μΐ de glucose 50 mM, 25 mM Tris, pH 7,5, 10 mM EDTA e a suspensão foi transferida para um tubo de centrífuga Eppendorf de 1,5 ml. Adicionou-se 25 /ul de uma solução de lisozima a 10 mg/ml preparada de fresco e a suspensão foi deixada em gelo durante 10 minutos. Adicionou-se então 200 /j1 de hidróxido de sódio 0,2N, 1% de dodeci1su1fato de sódio e a suspensão foi misturada e deixada em gelo durante dois minutos. Adicionou-se 200 μ 1 de acetato de sódio 2M (pH 4,8) e deixou-se a solução em gelo durante 15 minutos. A solução resultante foi sujeita a centrifugação na velocidade máxima durante 10 minutos numa centrífuga Eppendorf. 0 sobrenadante foi removido, para um novo tubo de centrífuga e extraído com 400 ul de fenol/clorofórmio (1:1). A fase aquosa foi removida para um novo tubo e extraída com 400 μ 1 de clorofórmio. A fase aquosa desta extracção foi removida para outro tubo e o DNA precipitado
pela adição de dois volumes de etanol e guardada a -20°C. durante 30 minutos. 0 DNA precipitado foi colhido por centrifugação numa microcentrífuga Eppendorf durante 15 minutos na velocidade máxima. 0 etanol foi rerovido e os sedimentos lavados com etanol a 80%. 0 etanol foi novamente removido e os sedimentos deixados a secar ao ar. 0 DNA foi ressuspenso em 100 yul de tampão TE. As construções foram verificadas por digestão com PstI. 0 plasmideo parental pBS-PR1013Eco dá uma banda de 6 kb e ^650 pb, a mais pequena faltando nas novas construções. Um destes plasmideos foi seleccionado como sendo o plasmideo pBS-PR 1013EcoZ\Pst. A estrutura deste subclone foi verificada por análise das sequências. Na Figura 5 está apresentada a construção deste p 1 asm i deo.
EXEMPLO 15 Preparação do pBS-PR 101 3Ecoíl\Pst/\Xho
Estabe1eceu-se uma mapa de restrição preliminar do pBS-PR 1013Eco. Um sitio de restrição Xhol está situado ^1200 pb a montante do sitio PstI. 0 plasmideo pBS-PR 1013Eco Pst foi digerido com Xhol e os fragmentos separados num gel de 0,9% de agarose de baixa temperatura de gelificação. Foram observados dois fragmentos com tamanhos de 3,9kb e 1,7 kb. A banda contendo o fragmento de 3,9 kb foi cuidadosamente removida do gel e ligada em agarose essencialmente como descrito atrás. A agarose foi fundida e o DNA usado para transformar células competentes de £. co1i estirpe HB101 conforme descrito atrás. As células foram semeadas em placas LB-amp e incubadas conforme descrito. Uma colónia pos it i va putat i va foi inoculada em meio LB-amp e o DNA isolado essencialmente como descrito. A estrutura deste novo subclone pBS-PR 1013Eco Pst Xho foi verificada por análise de restrição e sequenciação de DNA.A Figura 6 mostra a construção deste plasmideo.
EXEMPLO 16 Preparação de pCIB270 plasmideo pBI101.3 (N9 de Catálogo 6024.1) foi adquirido à Clonetech Labs, Paio Alto, Califórnia. Este plasmideo foi primeiro digerido com BamHI e depois com Sall. 0 plasmideo pBS-PR 1013Ecoò.Pst/\Xho foi digerido com PstI. Um adaptador PstI/BamHI tendo a sequência.
51-GGGATCCCTGCA-31 foi preparado como descrito no Exemplo 4 e ligado a pBS-PR1013EcoLPstAXho digerido com PstI. 0 material resultante foi primeiro digerido com BamHI e depois com Xhol. Isolou-se o fragmento BamHI/Xhol, misturou-se e ligou-se com o pBHOl.3 digerido e usou-se em transformação. Isolou-se um clone positivo putativo do pCIB270 e verificou-se por restrição e análise da sequencia de DNA. A preparação deste plasmideo está apresentada na Figura 7.
EXEMPLO 17 Preparação de M13mpl8- ou mp 19-PR 10 1 3EcoAPstóXho plasmideo pBS-PR1013EcoÁPst^Xho foi digerido com PstI e Asp718. 0 fragmento Asp 718/PstI de 1,1 kb foi isolado após e1ectroforese num gel de 1% de agarose TAE de baixa temperatura de gelificação. A forma replicativa (RF) do fago de £. co1i M13mpl8 ou M13mpl9 foi preparado de acordo com Messing, J. Meth. Enzymol I0I;20 (1983). Como alternativa estes vectores podem ser obtidos da Bethesda Research Labs., Gaithersburg, Maryland.Qualquer um dos vectores foi primeiro digerido com Asp718 e depois
com PstI. Após remoção do pedaço de po1iadaptador por e1ectroforese num gel de 0,7% de agarose TAE de baixa temperatura de gelificação, a RF do vector resultante foi misturada e liagda em agarose com o fragmento de 1,1 kb preparado atrás. 0 DNA foi usado para transformar, e as placas positivas putativas foram isoladas e a sua estrutura verificada por análise do DNA RF. As construções de M13mpl8- e mpl9- PR 1013EcoAPst/\Xho estão apresentadas na Figura 8.
EXEMPLO 18 Preparação de M13mpl8- ou mp19 - PR 1013EcoAPstôXho. Nco e pCIB268.
DNA fágico de cadeia simples do Ml3mp18-PR1013EcoAPstAXho foi isolado de acordo com Mes s i ng , supra. Sintetizou-se um iniciador oligonucleotídico de 18 pb com a sequencia
51AATCCCATGGCTATAGGA-3 como descrito atrás. 0 iniciador foi fosforilado com polinucleotideo-cinase de T4 (Maniatis, T. et a 1.,supra na pág 125) usando ATP não marcado. Após incubação a 37°C durante 60 minutos a reacção foi aquecida a 68°C durante 15 minutos e depois colocada em gelo. Este iniciador e o iniciador de sequenciação M13-40 (New England Biol abs # 1212 ) foram emparelhados com DNA de cadeia simples do Μ1 3mp 18-PR 10 1 3EccZ\ PstAXho após mistura numa proporção molar de 1:1, por arrefecirento lento após aquecimento durante 10 minutos a 68°C.
A mistura emparelhada foi colocada em gelo e adicionou-se 1/10 do volume de tampão de elongação 10 X (tampão 20mM Tris pH 7,5, 6 mM MgCl?, 1 mM DTT,
mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP e 1 mM dTTP). 10 unidades do fragmento grande da DNA-Po 1imerase I (fragmento Klenow, New England Biolabs 210) e 0,1 unidade de DNA-ligase de T4 (NEB#202) foram adicionados e a mistura de reacção deixada decorrer durante 14 horas a 15°C. Naquela altura adicionou-se mais uma pequena quantidade de cada uma das enzimas e a reacção deu-se durante mais 2 horas a 25°C antes da mistura ser usada para transformar células competentes de j[. co 1 i JM1O1. Na Figura 9 está apresentado um fluxograma geral deste processo.
Para identificar o fago mutagenizado, as placas foram transferidas para Gene Screen Plus (DuPont) epprocessadas de acordo com as recomendações do fabricante. Os filtros foram pré-hibridados durante quatro horas e hibridados durante a noite a 42°C, na solução de hibridação do fabricante contendo 0,9 M NaCl. Os filtros foram então sequencialmente lavados numa concentração de NaCl de 0,9M e controlados por autorradiograf1 a aumentando a temperatura de lavagem 5°C em cada passo. Os fagos identificados por hibridação como tendo sido mutagenizados foram sequenciados para confirmar a alteração da base.
A forma replicativa de um destes candidatos(Μ13mp18-PR1013EcoAPstAXho . Nco) foi isolada e digerida com PstI e BstEII para produzir um fragmento de 394 pb que foi usado para substituir o correspondente fragmento de 394 pb não mutagenizado no pBS-PRIOl3EcoAPstAXho conforme ilustrado na Figura 10. Isto resultou na preparação de pCIB268 que tem um sitio Ncol na posição 930 seguido de 217 pb da sequencia codificadora do gene PR-la. A estrutura deste plasmideo foi confirmada por análise de sequências.
EXEMPLO 19 Preparação de genes quiméricos contendo GUS e comprimentos variáveis da sequencia do promotor PR
A. Construção de pCIB269
Um fragmento de 930 pb foi isolado após e1ectroforese de pCIB268 digerido com Xhol e Ncol num gel de 1,0% de agarose TAE de baixa temperatura de gelificação. Este fragmento foi então ligado a pBS-GUS1.2 (ver Exemplo 19B) que tinha sido digerido com Xhol e Ncol. Isolaram-se transformantes que se analisaram por análise de restrição e sequenciação de DNA. Escolheu-se um plasmideo positivo que se designou pCIB269. A construção deste plasmideo está apresentada na Figura 11.
B. Construção de pBS-GUS1.2
Construiu-se pBS-GUS1.2 pela ligação de três partes, um fragmento Sal I/SnabI de 391 pb do pR J265 (Jefferson, R.A. et aj_.,EMB0 J. 6, 309 1 -3907 (1987) e GUS User Manual, Clonetech Labs, Paio Alto, Ca.) com um fragmento Snabl/EcoRI de 1707 do pBI221 (Jefferson, R.A. et a 1., EMBO J. supra) e pBS digerido com Sall e EcoRI, ver Figura 12. Os transfomantes foram isolados e analisados por restrição e sequenciação do DNA.Um clone confirmado foi designado pBS-GUS 1.2.
C. Construção de pCIB200
TJS75Kan foi primeiro criado por digestão de pTJS75 (Schmidhauser e Helinski, J. Bacteriol 164, 446-455 (1985)) com NarI para remover o gene da tetraciclina, seguido da inserção de um fragmento Accl do pUC4K (Messing, J. e Vierra, J., Gene 19, 259-268 ( 1982)) portador de um gene NptI. Construiu-se então pCIB200 por ligação de adaptadores Xhol ao fragmento EcoRV do pCIB7 (contendo os extremos esquerdo e direito do T-DNA, um gene quimérico nos/nptll seleccionãvel e o po1iadaptador pUC, Rothstein, S.J. et a 1.,Gene 53, 1 53- 16 1 ( 1987 ) e clonagem do fragmento digerido com Xhol em TJS75Kam digerido com Sa 11.
D. Construção de pCIB271 plasmideo pCIB269 (Exemplo 19A) foi digerido com Xhol e EcoRI e o fragmento de 3023 pb portador do promotor de PR-la ligado ao gene GUS com um extremo 3' nos foi isolado após e1ectroforese num gel de 1,0% de agarose de baixa temperatura de gelificação. Este fragmento foi então ligado a um vector com uma larga gama de hospedeiros pCIB200 que tinha sido digerido com Sall e EcoRI. Os transformantes foram isolados e analisados por análise de restrição. Um clone confirmado foi designado pCIB271 . A construção deste clone está apresentada na Figura 13.
E. Construção de pCIB272 pCIB268(Exemp1 o 18) foi digerido com Alulrrais Ncol e um fragmento de 833 pb foi isolado após e1ectroforese num gel de 0,7% de agarose TAE 1 X. Este fragmento foi ligado ao gene da β-glucuronidase com o extremo 3' nos em pBS-GUSl.2 (Exemplo 19B). 0 promotor e GUS foram então removidos deste plasmideo designado pCIB282 como um fragmento Asp7181/BamHI e ligado a pCIB200 que tinha sido digerido com Asp718I e BamHI antes da transformação de E. co1i estirpe DH5tC. Os transformantes foram isolados e analisados por restrição. Um clone confirmado foi designado pCIB272.
F. Construção de pCIB273 pCIB268 foi digerido com HaelII mais Ncol e um fragmento de 603 pb isolado após electroforese num gel de 0,7% de agarcse TAE 1 X. Este fragmento foi colocado a seguir ao gene da p-glucuromidase com o extremo 3' nos em pBS-GUS1.2. 0 promotor e GUS foram então rerovidos deste plasmideo designado pCIB283 como um fragmento Asp 7181/BamHI e ligado a pCIB200 que tinha sido digerido com Asp718I e BamHI antes da transformação de E. co1i estirpe DH5ôÇ. Os transformantes foram isolados e analisados por análise de restrição. Um clone confirmado foi designado pC IB273.
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EXEMPLO 20 Preparação de um gene quimérico num vector de higromicina pCIB269 foi digerido com Xhol e EcoRI e o fragmento de 3023 pb portador do promotor de PR-la ligado ao gene GUS com um extremo 3' nos foi isolado após electroforese num gel de 1,0% de agarose de baixa temperatura de gelificação. Este fragmento foi então convertido num fragmento Xhol/SalI por ligação a um adaptador EcoRI/SalI tendo a sequencia
51-AATTCGTCGACG-31.
fragmento Xhol/Sall foi ligado a pCIB712 digerido com Sall (Rothstein, S.J. et a 1. , supra ) , para criar pCIB219, ver Figura 14.
EXEMPLO 21 Preparação de pCIB20 0/PR 1 -BT
A. Ligação com pCIB200 plasmideo pCIB1004 (ver abaixo) foi digerido com Sphl, extraído com fenol, precipitado com etanol e ressuspenso. Sintetitou-se um o 1igonuc1eotideo com a sequencia
51CCGGTACCGGCATG-31
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purificou-se, fosforilou-se e ligou-se ao plasmideo pCIB1004 digerido com Sphl. Após ligação, a ligase foi inactivada e o DNA digerido com Kpnl. Este DNA foi sijeito a electroforese num gel de 0,8%, de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pCIB200 (Exemplo 19C) foi digerido com Kpnl e tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitela e sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda contendo o vector pCIB200 e a banda contendo a fusão sequencia delinitante 5' de PR-l/BT foram misturadas e o DNA ligado para formar o plasmideo pCIB200/PR1 -BT.
B. Preparação de pCIB1004 plasmideo pCIB10/35BT (607) foi digerido com Ncol e BamHI e corrido num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pCIB269 (Exemplo 19A) foi digerido com Ncol e Xhol e sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. Digeriu-se o plasmideo pCIB710 (Rothstein, S.J. et a 1., supra) com Sall e BamHI e submeteu-se a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação). A banda com o vector digerido com Sall e BamHI contendo um extremo 3' do promotor 35S de CaMV clonado em pUC19, a banda contendo o gene BT e a bnada contendo a região delimitante 5' de PR-1 foram removidas, misturadas e o DNA ligado para formar o plasmideo pCIB1004 .
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C Preparação de pCIΒ10/35BT(607) pCIΒ10/35BT(607 ), um gene de protoxina com deleção contendo uma sequencia codificadora de aproximadamente 607 aminoácidos, foi preparado a partir de plasmideo pC IB10/35Sbt, um plasmideo contendo o gene da protodna da endotoxina de Baci 11 us thuringiensis.E. coli MC 1061 contendo pCIB10/35Sbt foi depositada na American Type Culture Collection, ATCC No. 67329, 27 de Fevereiro de 1987. Fez-se um gene de protoxina com deleção através da introdução de um sitio de clivagem BamHI(HHATCC) a seguir ao nucleotido 1976 na sequencia do gene BT. Isto foi feito por clonagem do fragmento BamHI contendo a sequencia da protoxina do pCIB10/35Sbt em mpl8 e usando processos convencionais de mutagénese por oligonucleotidos. Após mutagénese, o DNA forma replicativa de cadeia dupla foi preparado a partir do clone M13, o qual foi então digerido com BamHI. 0 fragmento de aproximadamente 1,9 kb contendo o gene da proteína com delecção foi inserido em pCIB10/710 clivado com BamHI. 0 plasmideo resultante foi seleccionado em canamicina. No Pedido de Patente U.S. No. de Série 122 109, entregue em 18 de Novembro de 1987, aqui incluído como referencia está apresentada uma descrição detalhada da preparação.
EXEMPLO 22 Preparação de pCIΒ1 233(pCIB200/PR 1 - AHAS)
A. Ligação com pCIB200 plasmideo pCIB200 foi digeridD com Kpml e Xbal e sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo
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pCIB1216 foi digerido com Kpml e Xbal e submetido a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda 4,3 kb contendo a sequencia delimitante 5' de PR-1 fundida à sequencia codificadora de AHAS e a banda contendo o vector pCIB200 foram removidas, misturadas e o DNA ligado para formar pCIB1233.
B. Preparação de pCIB1216 plasmideo pCIB269 (Exemplo 19A) foi digerido com Xbal e Ncol e sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pCIB1207 (ver abaixo) foi digerido com Xbal e Ncol e submetido a electroforese num gel de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda contendo o vector Bluescript com a sequencia delimitante 5' de PR-1 e a banda de 3,3 kb contendo a sequencia codificadora de AHAS foram removidas, misturadas e o DNA ligado para formar o plasmideo pCIB1216.
C. Preparação do plasmideo pCIB1207 contendo o gene AHAS de Arabidopsis
DNA total de plantas foi isolado a partir de Arabidops is tha1i ana ecotipo Columbia com 5 semanas. 250 /jg deste DNA foi digerido com 400 unidades da enzima de restrição Xbal durante 4 horas. 0 produto da digestão foi fraccionado por electroforese num gel de 0,8% de agarose. Os fragmentos de DNA entre 6,5 kb e 4,36 kb (com base nos marcadores de tamanho do DNA de lambda digerido com HindIII) foram isolados a partir do gel usando uma membrana NA-45 DEAE
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(Schleicher and Schuell, Keene, NH USA) seguindo os processos recomendados pelo fabricante. A preparação do braço ongC de lambda (long C) digerido com Xbal e tratado com fosfatase foi adquirido à Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, USA). 0,1 tig do DNA da inserção Xbal deArabidopsis. foi ligado a 1,0 pg dos braços long C de acordo com os processos recomendados pela Stratagene. 2,5 μ 1 da reacção de ligação foi encapsidado em cabeças de fago lambda usando o Kit Gigapack Plus (Stratagene Cloning Systems) seguindo os processos recomendados pelo fabricante. A actividade da biblioteca foi titulada em E. co1i UCS257 (Stratagene Cloning Systems ).
pg de DNA do plasmideo pE16/8-c4 (J. Polaina, Carlsberg Res. Comm. 49, 577-584) foram digeridos com EcoRI e os produtos de digestão foram separados num gel de 0,8% de agarose. 0 fragmento EcoRI de 2 kb contendo a sequencia codificadora do gene AHAS de levedura foi isolado a partir de gel usando membrana NA45 DEAE seguindo os processos recomendados pelo fabricante. Sondas marcadas radioactivamente para o fragmento de 2 kb foram sintetizadas no dia da reacção db hibridação com a reacção de iniciação ao acaso usando o Kit Prime Time (International Biotechnologies INc., New Haven, CT, USA), seguindo os processos recomendados pelo fabricanete.
250 000 fagos recombinantes foram semeados em VCS257. Réplicas de membrana em duplicados das placas fágicas foram feitos usando membranas Colony/ /Plaque Screen (New Research Products, DupOnt,Boston,MA,
USA) seguindo os processos recomendados pelo fabri cante.As membranas foram pré-hibridadas em tampão de hibridação LS, depois transferidas para 150 ml de tampão de hibridação LS feito de fresco contendo 0,25 pg da sonda do gene AHAS de levedura marcada com preparada como descrito atrás.
-105As membranas foram incubadas duran te 16 horas a 42°C com agitação suave, lavadas duas vezes à temperatura ambiente com SSC2 X durante 15 mirutos por lavagem, lavadas três vezes a 42°C em tampão de lavagem LS (25% de formamida, SSC5X, 1% SDS) durante 2 horas por lavagem e lavadas duas vezes em tampão de enxaguamento durante 30 minutos por lavagem. As membranas foram montadas e sujeitas a fluorografia com écrans Cronex Lightening Plus (DuPont, Wilmington, DE, USA) e filme XAR-5 (Kodak).As placas das regiões das caixas que deram sinais positivos no filme em ambos os duplicados foram repicadas e semeadas novamente a uma densidade baixa de 300 placas por placa de 150 mm e o processo de despiste foi repetido até serem isoladas placas de hibridação singulares.
Fizeram-se mini-preparações de DNA fá gico a partir do fago purificado por placas seguindo os processos que acompanham o Kit LambdaSorbPhage Adsorbent (Promega, Madison, WI, USA). 0 DNA fágico foi cortado com a enzima de restrição Xbal e o fragmento da inserção de 5,8 kb foi clonado no sitio Xbal do plasmideo pBS(-) (Stratagene Cloning Systems). A identidade do fragmento clonado com o fragmento Xbal contendo o gene AHAS de Arabidopsis foi verificada por comparação do seu mapa de restrição e sequencia de DNA com os publicados para o gene por Haughn et a 1., Mol. Gen. Genet. 21 1, 266 (1988) e Mazur et a 1. , P1 ant Physiol 85, 1 110 (1987). Este plasmideo foi designado pCIB1207.
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EXEMPLO 23 Preparação de pCIB1232 (pC IB200/PR1-AHAS-SuR)
A. Ligação com pCIB200 plasmideo pCIB200 (Exemplo 19C) foi digerido com Kpnl e Xbal e submetido a e1ectroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação.
plasmideo pCIB1230 foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda 4,3 kb contendo a sequencia delimitante 5' do PR-1 fundida à sequencia codificadora AHAS-SuR e a banda contendo o vector pCIB200 foram removidas, misturadas e o DNA ligado para formar pCIB1232.
B. Preparação de pCIB1230 plasmideo pCIB1208 (ver afcaixo) foi digerido com Xbal e Ncol e os fragmentos foram separados por electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pCIB269 (Exemplo 19A) foi digerido com Ncol e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação TAE 1 X . 0 fragmento pCIB269 contendo o vector Bluescript e o promotor de PR-1 e o fragmento de 3,3 kb contendo o gene AHAS mutagenizado (identificado por homologia cruzada e por análise dos fragmentos de restrição com o gene descrito por Mazur et a 1. , Plant Physiol. 85, 1 1 10- 1 1 1 7 (1 987)) foram removidos fundidos e ligados uns aos outros para criar um clone designado pCIB1230.
-10 7C. Preparação de pCIB1208
Construiu-se uma biblioteca de DNA genómico como descrito no Exemplo 22C usando DNA isolado a partir de plantas de Arab idops i s seleccionadas pela resis tência ao herbicida sulfoni1ureia como descrito por Haughn e Somerville, Mol. Gen. Genet. 204, 430-434 (1986).As placas contendo genes codificadores de aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) foram identificadas por hibridação cruzada com uma sonda do gene da aceto-hidroxiácido sintetase de levedura (ver Exemplo 22C). 0 DNA recombinante foi subclonado em Bluescript (Stratagene) criando um clone designa do pCIB1208. Este plasmideo contem um gene codificador de uma aceto-hidroxiácido-sintetase mutagenizada que é resistente à inibição por herbicidas de su 1 foni1ureia.
EXEMPLO 24 Isolamento de um clone genómico codificador da forma básica da β-l,3-Glucanase (Glucan Endo-l,3-p-glucosidase) de N i c o t i a n a Tabacum.
Preparou-se DNA de alto peso molecular a partir de folhas de N i cot i ana tabacum cv.Havana 425 pelo processo CETAB (Murray e Thompson, Nucleic Acid Res. 8, 4321 (1980)). 100 ^g do DNA foi digerido totalmente com Saci. Este DNA foi separado por e1ectroforese num gel de 0,8% de agarose. A região do gel correspondendo a uma gama de peso molecular de 3 a 7 Kb foi cortada em 6 tiras de igual tamanho e o DNA e1ectroe1uido destas tiras e precipitado como fracções separadas. 0 DNA foi ressuspenso e uma amostra de cada uma das fracções foi sujeita a electroforese em gel de agarose e analisada por transferencia Southern. A fracção que contem DNA que híbrida com uma
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sonda de cDNA da β-1,3-g1ucanase (Shinshi, H. et a 1., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 5541-5549 (1988)) foi reunida e usada para construir bibliotecas.
vectcr de clonagem lambda OngC adquirido à Stratagene Corp. foi digerido com Saci. 1 yug deste DNA foi misturado com 0,1 yug de DNA do tabaco digerido com Saci e o DNA ligado com DNA ligase de T4 de acordo com as sugestões do fabricante. 0 DNA ligado foi então encapsidado em partículas fágicas usando um processo de encapsidação i n v i tro de acordo com a Stratagene. Os fagos foram semeados com bactérias confotne sugerido no manual do lambda.
Fez-se o despiste de aproximadamente 75 000 placas usando 3 2 uma sonda de cDNA da β-1,3-g1ucanase marcada com P.Identificaram-se 11 placas positivas. Estas placas foram purificadas por ciclos sucessivos de sementeira e despiste.
Isolou-se DNA a partir dos clones purificados e os clones foram analisados por digestão com enzimas de restrição usando HindIII, EcoRI e Saci. Os clones são de dois tipos, um representado pelo clone 39.1 e o outro representado pelo clone 39.3. As inserções de 4,5 e 4,7 kb no clone 39.1 e 39.3, respectivamente, foram subclonadas no plasmideo Bluescrípt digerido com Saci e os subclones pBSGluc 39.1 (fragmento Saci derivado do clone 39.1 em lamb da) e pBSGluc393 (fragmento Saci derivado do clone 39.3 em lambda) foram isoladas. A sequencia do DNA nos fragmentos Saci contidos nos subclones pBSGluc 39.1 e pBSGluc39=3 foi determinada por sequenciação de DNA e mostrada na Sequencia 5 e Sequencia 6, respectivamente.A sequencia codificadora foi encontrada e uma sequencia interveniente grande está situada perto do extremo 5' da sequencia codificadora.
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EXEMPLO 25 Identificação do sítio de iniciação da transcrição para o gene da β-1,3-g1ucanase
A. Mapeamento por prolongarento de iniciadores
Sintetizou-se im iniciador de DNA sintético que é complementar das bases 2399 a 2416 e usou-se nas experiencias de prolongamento do iniciador como descrito no Exemplo 5. 0 RNA para estas experiencias foi isolado a partir de tabaco infectado com Pfytophthora pa ras i t i ca va r. nicotiana. Os produtos do prolongamento de iniciadores foram sujeitos a electroforese juntamente com um padrão de peso molecular em que o iniciador marcado foi usado nas reacções de sequenciação didesoxi do DNA com o subclone pBSGluc39.1 usado como molde. Os produtos de elongação foram identificados, após e1ectroforese em gel e autorradiografia como descrito no Exemplo 5, que corresponde às posições 1432, 1446 e 1447 da sequencia 39.1 da β-1,3-g1ucanase, Sequências. Uma vez que existe um grande intrão entre as posições 1 554 e 2345 do sequenciado pBSGluc39. 1 , a escada de pesos moleculares pode não repetir o peso molecular correcto dos produtos de elongação. Portanto, realizou-se uma segunda experiência de mapeamento por elongação cfe iniciadores usando um iniciador que é complementar das posições 1530 a 1547.Usando este iniciador, mapearam-se três extremos 5' do mRNA da glucanase em resíduos A nas posições 1434, 1448 e 1449.
B. Mapeamento com nuclease SI
Um oligonucleotido sintético complementar das posições 1415 a 1504 foi sintetizado para usar como sonda em mapeamento com nuclease Sl. 0 oligonucleotí-ι ιο-
ί.-.
2 deo foi fosforilado no extremo 5' usando P-ATP e polinuc1eotido-cina se de T4 de acordo com as recomendações do fornecedor. Após extracção com fenol e precipitação com etanol e o 1igonucleótido marcado foi ressuspenso em tampão de hibridação com formamida (ver Exemplo 6) numa concentração de cerca de 2 nM. 0 RNA usado nestas experiencias foi isolado a partir de tabaco infectado com Phytophthora parasitica como no exemplo anterior.Neste RNA fez-se mapeamentó com SI usando o oligonucleótido marcado como descrito no Exemplo 6. Após electroforese em gel detectaram-se três bandas que correspondem às posições 1434, 1448 e 1449 na sequencia do DNA de pBSGluc39.1.
C. Determinação do sitio de iniciação da transcrição
Os processos de prolongamento de iniciadores e mapeamento com nucleases SI colocam ambos os extremos 5' do mRNA nas posições 1434, 1448 e 1449. Portanto estes sitios que são todos resíduos adenina correspondem ao sitio de iniciação da transcrição do gene da J3-1 ,3-glucanase.
EXEMPLO 26 Preparação de pBSG1uc39.1/GUS
Sintetizaram-se oligonucleotídeos com as sequências
A) 5'-GTTTATGTGAGGTAGCCATGGTGGGAAGACTTGTTGGG-3'
B) 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCTCTAGGGGGCCAAGG-3'
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purificaram-se e usaram-se numa reacção catalisada pela polimerase (PCR) de acordo com as directrizes do fornecedor (Perkin Elmer Cetus,DNA thermal cyeler; e Perkin Elmer Cetus, GeneAmp Reagent Kit) para amplificar um fragmento de DNA de 1 994 pb do pBSGluc39.1. Os o 1igonuc1eotideos destinaram-se a adicionar um sitio Kpnl imediatamente adjacente 5' relativamente ao sitio Saci no par de bases 1 da sequencia 39.1 da glucanase e para gerar um novo sitio Ncol no par de bases 1462. 0 DNA derivado do processo de amplificação PCR foi extraído com feno1/c1oroformio e precipitado com etanol. 0 DNA foi ressuspenso e digerido com Ncol e Kpnl e sujeito a electroforese num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de fusão. A banda de 1462 pb foi removida e usada na ligação seguinte. 0 plasmideo pBS-GUSl .2 (Exemplo 19B) foi digerido com Ncol e Kpnl e migrado num gel de 0,8% de agarose e a banda contendo o vector foi removida. A banda contendo o vector pBS-GUS1.2 e a banda de 1462 pb derivada da reacção PCR foram ligadas e usadas para transformar E_. co 1 i, Repl icaram-se colónias positivas que se testaram relativamente à presença da inserção de 1462 pb. Os plasmídeos contendo inserções são clones putativos do pBSGluc39.1/GUS, no entanto, uma vez que a taxa de mutação neste processo é relativamente alta (-vl/ 1000 bases) vários clones tiveram de ser sequenciados ao longo do fragmento de 1462 pb. Um clone que possuía a sequencia esperada foi escolhido como o clone pBSG 1 uc39 . 1/GUS.
EXEMPLO 27 Preparação de pBSGluc39.3/GUS
Sintetizaram-se o 1 igonuc 1 eotídeos com as sequências
-112Α) 5'-GTTTATCTGAGGTAGCCATGGTGAGAAGACTTGTTGGA-3'
Β) 5'-gatcgcggtaccgagctcccttggggggcaag-3' purificaram-se e usaram-se numa reacção PCR para amplificar um fragmento de 1677 pb do pBSGluc39.3. Os o 1 igonuc1eotídeos destinaram-se a introduzir um novo sitio Kpnl imediatamente adjacente ao sitio Saci na posição 1 da sequencia 39.3 da glucanase e um novo sitio Ncol na posição 1646.0 DNA da amplificação PCR foi extraído com feno1/c1orofórmio , precipitado com etanol, ressuspenso, digerido com Ncol e Kpnl e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda de 1646 pb foi removida e usada na ligação seguinte. pBS-GUSl .2 foi digerido com Ncol e Kpnl e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda contendo o vector foi removida, misturada com a banda de 1646 pb da reacção PCR e ligada para formar o plasmideo pBSG1uc39.3/GUS. Tal como anteriormente isolaram-se vários plasmídeos putativos que se sequenciaram e um com a sequencia esperada foi isolado como o plasmideo pBSGluc39.3/GUS.
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EXEMPLO 28 Preparação de pC I B200/GLUc39.1-GUS e de pC I B200/G1uc39.3-GUS
A. pCIB200 (Exerplo 19C) foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pBSG 1 uc39.1/GUS (Exemplo 26) foi digerido com Kpnl e Xbal e os fragmentos separados num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. As bandas contendo o vector pCIB200 e a banda Kpnl-Xbal contendo a sequencia delimitante 5' do gene 39.1 da glucanase fundido com o gene GUS foram removidos e o DNA ligado para formar o plasmideo pCIB200/G1uc39.1-GUS.
B. De modo semelhante o plasmideo pBSGluc39.3/ /GUS (Exemplo 27) foi digerido e ligado com pCIB200 digerido para formar o plasmideo pCIB200/Gluc39.3-GUS.
EXEMPLO 29 Preparação de pCIB200/G1uc39.1 -BT e pC I B200/G1uc39.3-BT
A. pCIB200/G1uc39 .1-BT plasmideo pBSG1uc39.1/GUS foi digerido com Kpnl e Ncol e migrado num gel de 0,8% agarose de baixa temperatura de gelificação.0 plasmideo pCIB1004 (Exemplo 21B) foi digerido com Kpnl e Ncol e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pC IB200(Exemp1 o 19C) foi digerido com Kpnl, desfosfori1ado usando fosfatase alcalina de intestino de vitela e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de fusão. A banda contendo o vector pCIB200, a ban-114da contendoa região delimitante 5' da glucanase e a banda contendo o gene BT foram removidas, misturadas e ligadas para formar o plasmídeo pCIB200/G1uc39.1-BT.
B. pCIB200/G1uc39.3-BT
De modo semelhante o plasmídeo pBSGluc39.3/GUS foi digerido e ligado com pCIB1004 digerido e pCIB200 digerido para formar o plasmídeo pCIB200/G1uc39.3-BT.
EXEMPLO 30 Preparação de pC IB200/G1uc39.1-AHAS e pC I B200/G1uc39.3-AHAS
A. Ligação com pCIB200 plasmídeo pBSG1uc39.1/AHAS foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmídeo pCIB200 (Exemplo 19C) foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação.
A banda contendo a fusão g1ucanase/AHAS e a banda contendo o vector de expressão pCIB200 foram removidas, misturadas e o DNA ligado para formar o plasmídeo pCIB200/G1u39.3-AHAS.
B. Preparação dos plasmideos pBSGlu 39.1/AHAS e pBSGlu 39.3/ /AHAS plasmídeo pBSG1uc39.1/GUS(Exemp1 o 26) foi digerido com Ncol e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmídeo pCIB1207 (Exemp1 o 22C) foi digerido com Ncol e Xbal e migra-115-
do num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda contendo a sequencia delimitante 5' da glucanase e o vector e a banda contendo a sequencia codificadora de AHAS foram removidas, misturadas e o DNA ligado para produzir o plasmideo, pBSGluc39.1/AHAS.
De modo semelhante, o plasmideo pBSG1uc39.3/GUS (Exemplo 27) foi digerido e ligado com pCIB1207 digerido para formar o plasmideo pBSG1u39.3/AHAS.
EXEMPLO 31 Preparação de pCIB200/G1uc39.1-AHAS-SuR e pCIB200/Gluc39.3-AHAS-SuR
A. Ligação com pCIB200 plasmideo pBSGluc39.1/AHAS-SuR foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. 0 plasmideo pC IB200(Exemp1 o 19C) foi digerido com Kpnl e Xbal e migrado num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação. A banda contendo a fusão g1ucanase/AHAS-SuR e a banda contendo o vector de expressão pCIB200 foram removidas misturadas e o DNA ligado para formar o plasmideo pCIB200/ /G1u c 39.1-AHAS-SuR.
De modo semelhante o plasmideo pBSGluc39.3/AHAS-SuR foi digerido e ligado com pCIB200 digerido para formar o plasmideo pCIB200/G1uc39. 1-AHAS-SuR.
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Β. Preparação dos plasmideos pBSGluc39.1/AHAS-SuR e pBSGluc39.3/AHAS-SuR.
Os plasmideos pBSGluc39.1/GUS(Exemplo 26) e pBSGluc39.3/GUS(Exemp lo 27) foram digeridos com Ncol e Xbal e os fragmentos de restrição foram separados num gel de 0,8% de agarose de baixa temperatura de gelificação 1XTAE.pCI BI 208 (Exemplo 23C) foi digerido com Xbal e Ncol e o fragmento de 3,3kb contendo o gene AHAS mutagenizado (resistente ao herbicida su1foni1ureia , SuR) foi isolado por electroforese em gel de agarose. Os fragmentos contendo o promotor da g1ucoronidase e o vector pBS foram removidos, fundidos e ligados com o fragmento AHAS para criar clones designados pBSG1uc39.1/AHAS-SuR e pBSG1uc39.3/AHS-SuR, respect i vamente.
4.Identificação de novos genes exemplo que se segue divulga o isolamento e caracterização ots restantes novos genes da proteína PR deste invento.
EXEMPLO 32 Isolamento de outros clones genómicos e de cDNA
A. Isolamento de um clone genómico codificador de PR-1 '
Construiu-se uma biblioteca genómica e fez-se o despiste com uma sonda de cDNA de PR-1 conforme descrito no Exemplo 11. Isolou-se um clone que designou 1ambdatobchrPR1019.Estabe1eceu-se um mapa de restrição preliminar. Ao pBS-PR 1019C1 a retirou-se um fragmento grande Xhol resultando no plasmideo pBS-PR 1019C1 a Xho.Este plasmí-117-
deo contem cerca de 2,7 kb de DNA do tabaco contendo o gene PR1019. Fizeram-se delecções neste plasmideo e a série de delecções foram usadas para sequênciação de DNA.
Na sequencia 2 está apresentada a sequencia de DNA com cerca de 2100 pb deste gene. A proteína codificada no PR1019 é cerca de 95% homóloga de PR-la, PR-lb ou PR-1c;portanto este novo gene é designado PR-11.
B. Isolamento de um clone de cDNA codificador da quitinase de pepineiro
Isolou-se uma proteína quitinase in duzível por agentes patogénicos a partir de folhas de pepineiro infectadas conforme descrito (Metraux, J.P. et al. , Physio 1ogica 1 and Molecular Plant Pathology, 33,1 -9 ( 1988 )). Os peptideos foram obtidos a partir desta preparação homogé nea de proteína essencialmente como descrito anteriormente noutros trabalhos e como descrito nos Exemplos 9 e 10. Seleccionaram-se duas regiões da proteína e sintetizaram-se sondas o 1igonuc1eotidicas complementares de todas as combinações possíveis de RNA mensageiro capazes de codificar os peptideos. As sequências das sondas são:
g τ A
1. 5' -CCATTCTGNCCCCAGTA-3'
G G G G C
2· 5'-GGATTATTATAAAATTGNACCCA-3 .
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As folhas de pepineiro foram infectadas com Vírus da Necrose do Tabaco (TNV) e isolado RNA 5 dias após a infecção como descrito no Exemplo 5. Isolou-se RNA poli A+ por técnicas convencionais e construiu-se uma biblioteca de cDNA no vector de clonagem lambda Zap (Stratagene), essencialmente como descrito (Gubler, U. e Hoffman, B.J. Gene 25, 263 ( 1983 ). Semearam-se 300 000 placas e os duplicados foram testados com a mistura 1 de 32 o 1igonuc 1 eotideos marcados com P(sonda l) ou com a mistura 2 (sonda 2).Isolaram-se placas que deram resultados positivos quando testadas com ambas as sondas.0 isolamento do fago e a excisão automática foram efectuadas como descrito no manual do laboratório Stratagene Lambda Zap.
Uma vez isolados os clones de cDNA da quitanase no plasmideo Bluescript eles foram sequenciados por sequenciação didesoxi. A sequencia do gene da quitinase está apresentada na Sequencia 3.
C. Isolamento do clone de cDNA codificador da principal forma de PR-R
Folhas de N i cot i ana tabacum C V . Xanti-nc foram infectadas com vírus do mosaico do tabaco e colhidas cinco dias após a infecção. Preparou-se RNA total como descrito no EXemplo 5 e isolou-se RNA poli A+ usando técnicas convencionais. Construiu-se uma biblioteca de cDNA usando este RNA poli A+ no vector de clonagem Lambda ongC (Stratagene). Foram testados cerca de 300 000 placas com uma sonda o 1 igonuc1eotidica com a sequencia
-GAACTTCCTAAAAGCTTCCCCTTTTATGCC-3'
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Purificaram-se as placas positivas por técnicas convencionais e preparou-se DNA fágico.Um fragmento do fago recombinante que continha o cDNA foi subclonado no plasmideo Bluescript. A sequencia de DNA do cDNA foi determinada por sequenciação de DNA. A sequencia de um clone que codifica a forma principal de PR-R (Pierpoint W.S. et a 1. , Physio1.PLant Pathol. 31, 291 ( 1987) está apresentada na Sequencia 4. Esta proteína codificada tem uma homologia muito forte com um conhecido inibidor da tripsina/alfa-ami1 ase isolado a partir de milho (Richardson,M. et a 1. , Nature, 327:432( 1987)). 0 PR-R clonado pode ser um inibidor de proteases ou alfa-ami lases e como tal conferirá actividade ínsecticida, viricida ou fungicida a plantas quando expresso transgénicamente.
D. Isolamento do cDNA codificador de PR-Q
Folhas de N i cot iana tabacum
Cv. Xanthi-nc foram infectadas com vírus do mosaico do tabaco e colhidas cinco dias apôs a infecção. Preparou-se RNA total como descrito no Exemplo 5 e isolou-se RNA poli A+ usando técnicas convencionais. Construiu-se uma biblioteca de cDNA usando este RNA poli A+ no vector de clonagem Lambda OngC (Stratagene).Foram despistadas cerca de 300 000 placas usando uma sonda marcada de cDNA codificador do gene da quitinase básica do tabaco (Shinshi et ai. , Proc. Natl.Acad. Sei.USA 84, 89-93 ( 1987)) e lavando os filtros a 50°C em 0,125 mM NaCl, 1% SDS, 40 mM fosfato de sódio fpH 7,2), lmM EDTA. Purificaram-se 24 placas positivas e a sequencia de DNA de um clone designado pBSchtl5 foi determinada.Esta sequencia está apresentada na Sequencia 7.
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A proteína PR-Q foi parcialmente purificada a partir de fluido intracelular de folhas do tabaco infectadas com TMV conforme descrito no Exemplo 8.
As fracções da cromatografia em Ultragel ACA54 contendo PR-O, PR-P, PR-Q e PR-R foram reunidas e concentradas por 1 iofi 1 ização. As proteínas foram ainda purificadas por electroforese em gel de po 1 iacri1amida. A banda de proteína contendo PR-Q foi removida e a proteina eluida de acordo com 6 Applied Biosystems User ELilletin No. 36 de 21 de Marco, 1988. A proteina foi tratada pirog1utamato-aminopeptidase e sequenciada pelo método de degradação automática de Edman conforme descrito no Exemplo 9. A sequencia do extremo amino da proteina PR-Q foi determinada como sendo (Xxx=duvidoso) :
GlnGlyIleGlySerIleValThrXxxAspLeuPheAsnGluMetLeu
A proteina codificada no clone representada na sequencia 7 foi determinada como sendo a proteina Q relacionada com patogénese com base em:1)homo1ogia estrutural limitada com a quitinase básica do tabaco e 2) identidade com a sequencia proteica amino-termina 1 da PR-Q determinada por sequenciação de proteínas.
E. Isolamento do cDNA codificador da forma acídica da β- 1 , 3-g lucanase
Cerca de 300 000 placas da biblioteca de cDNA descritas no Exemplo 32D (acima)foram despistadas usando uma sonda marcada de cDNA (Edificador da forma básica da p-1,3-glucanase (Shinshi, H. et a 1.,supra) e lavagem dos filtros a 50°C em 0,125M NaCl, 1% SDS, 40 mM fosfato de sódio (pH 7,2), lmM EDTA. Isolaran-se 15 placas positivas e
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a inserção foi subclonada no plasmideo Bluescrípt Sequenciaçã; parcial de DNA revelou que os clones 5 e 6 codificam cDNA idênticos que têm cerca de 55% de homologia com a sequencia cfe DNA conhecida para a forma básica da β-l ,3-glucanase. A sequência do cDNA no clone 5 e 6 foi determinada e está apresentada na Sequencia 8. Concluiu-se que este cDNA codifica a forma acidica da β-1, 3-g 1 ucanase com base na homologia linu tada da sequencia de aminoácidos e o ponto isoeléctrico mais baixo da proteína codificada.
F. Isolamento de um clone genómico codificador do gene da quitinase do pepineiro.
I sol aram-se núcleos a partir de Cucum i s sat i vus cv. Long Marketer e o DNA foi isolado como descrito no Exemplo 11. 3 ug deste DNA foi digerido com
EcoRI, EcoRI, BamHI ou HindIII e os fragmentos separados num gel de 0,5% de agarose.Uma análise de transferências Southern, usando uma sonda marcada do cDNA da quitinase do pepineiro(Sequencia 3), revela uma única banda no produto da digestão com EcoRI tendo cerca de 12 Kb. Portanto, decidiu-se isolar o gena da quitinase do pepineiro usando o produto da digestão completa com EcoRI e ligação num vector de clonagem tipo substituição de lambda.
ug do DNA isolado atrás foi digerido totalmente usando EcoRI. Este DNA foi então extraído com fenol e precipitado com etanol e ligado ao sitio EcoRI do EMBL4. Cerca de 100 000 placas foram despistadas com a sonda marcada do cDNA da quitinase de pepineiro, Sequencia 3. 10 placas positivas foram repicadas e purifiçadas e a inserção de DNA foi analisada através do mapeamento preliminar com enzimas de restrição. Todos os clones deram o mesmo resultado e um foi escolhido para posterior analise.A inser-122-
ção de 12 Kb neste clone foi então subclonada no plasmideo Bluescript para dar o plasmideo pBScucchi/chitinase. Estabeleceu-se um mapa de restrição para este DNA clonado e os fragmentos foram subclonados e determinada a sequencia do DNA.
G. Isolamento de um clone genómico codificador da β-l ,3-glucanase acidica
Construiu-se uma biblioteca genómica como descrito no Exemplo 11 e fez-se o despiste com um clone de cDNA para a β-1 , 3-g1ucanase acidica, Exemplo 32E. Isolou-se um clone de lambda e um fragmento EcoRI de 1 kb deste clone de lambda foi subclonado em Bluescript como descrito atrás no Exemplo 32A. 0 clone em Bluescript foi designado pBSGL6e.
5. Transformação estável e regeneração de plantas
Transformou-se tecido vegetal com os vectores descritos atrás usando qualquer uma das técnicas convencionais.Tais métodos usados para a transferência de DNA para células vegetais incluem, por exemplo, a infecção directa ou co-cultura de plantas, tecidos vegetais ou células vegetais com A. tumefaciens (Horsch, R.B. et a 1. , Science 225, 1229 ( 1 985 );Marton, L., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Vol. 1, 514-521,1984), tratamento de protoplastos com DNA exógeno por métodos tais como os descritos nas seguintes publicações:Paszkowski, J. et a 1., EMBO J. 3, 2717( 1984) ;EP-A 0 164 575; Shillito, R.D. et a_l_. , Bio/Technology 3, 1099 ( 1985 );Potrykus, I. et a 1., supra; Loerz, H. et a 1.,Mol Gen. Genet. 199, 178( 1985 ) ;Fromm , M. et al., supra; GB 2 140 822; e Negrutiu, I. et al., Plant
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Mol. Biol. 8, 363 ( 1987 );incubação com po 1 ieti 1 enog1ico1 (PEG) (Negrutim, I. et a 1.,supra);microinjecção (Reich,T. J. et a 1., Bio/Techno1ogy 4, 1001 - 1004(1986 ) ;Reich, T.J. et al., Can. J. Bot. 64, 1259-1267(1986)), bombardeamento com microprojecteis (Klein. T. M. et a 1., Nature 327, 70, (1987)).
EXEMPLO 33 Transformação de Agrobacterium
DNA dos plasmideos pCIB270 (Exemplo 16), pCIB271, pCIB272 e pCIB273 (Exemplos 19D, E e F) foi purificado em gradientes de cloreto'de césio e bromet de etídlo e usado para transformar A. tumefaciens estirpe A136 contendo o plasmideo auxiliar pCIB542 através do processo de Holsters, M. et al., Mol. Gen. Genet.163 ,181 - 187 (1978) resultando nas estirpes CIB270, CIB271 , CIB272 e CIB273.
Usando o mesmo processo, os plasmídeos pCIB271, pCIB272 e pCIB273 foram usados para transformar as estirpes virulentas de A. tumefac iens 15955, A208, A281 e A. rhizogenes estirpe A4, criando estirpes designadas como pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, PCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 1 5955, pCIB273 X A208,
PCIB273 X A28, e pCIB273 X A4.
Agrobacterium estirpe CIB542 é a estirpe EHA101 (Hood et al., J. Bacteriol. 168, 129 1 -1301 (1986) em que a marca canamicina do plasmideo foi substituída pela fracção espectinomicina/estreptomicina de Tn7.
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EXEMPLO 34 Transformação de discos de folhas do tabaco
Agrobacterium estirpes C IB 2 7 0 ,
CIB271 , CIB272 e CIB273 foram cultivadas 18-24 horas em meio com sais de glutamato ajustado a pH 5,6 e suplementado com 0,15% manitol, 50 pg/ml de canamicina, 50 pg/ml de espectinomicina e 1 mg/ml de estreptomicina antes de serem diluídas para uma ΟΟθθθ de 0,2 no mesmo maio sem os antibióticos. As bactérias foram então cultivadas durante três a cinco horas antes da diluição para uma ϋΟ^θθ de 0,2-0,4 para inoculação de discos de 5-7 mm retirados das folhas de Nicotiana tabacum cv.Xanthi que foram cultivadas assépticamente em recipientes GA7, seguindo uma modificação do método de Horsch, R. et al., Science 227, 1229-1232 (1985).
Os discos de folhas foram mantidos em 0,7% de agar contendo sais major e minor de Murashige e Skoogs (MS), 1 mg/ml de benzi 1 ademina e 1 mg/ml de ácido <_-nafta lenoacético durante dois dias antes da transferência para o mesmo meio contendo 50 pg/ml de canamicina,
100 /jg/ml de ca rben i c i 1 i na e 100 pg/ml de mefoxina.Os rebentos que se formaram nos discos foram removidos e propagados até se obterem seis plantulas por subcultura dos extremos dos rebentos em meio MS contendo 50 ^ug/ml de canamicina em recipientes GA7.
As plântulas foram enraizadas em meio não contendo hormonas e com 50 pg/ml de canamicina, transferidas para o solo e harchied num fitotrão antes de serem transferidas para estufas para o tratamento de indução com reguladores químicos.Na altura da floração foi induzida a autopolinização.Colheram-se as sementes após maturação.
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As experiências e resultados da indução estão descritos no Exemplo 53, 66 e Tabela II.
EXEMPLO 35 Produção de calos e plantas do tabaco transgénica s
Usou-se Agrobacterium estirpe pCIB270 ou pCIB271 para transformar calus forrados a partir de discos de folhas (Exemplo 34).Os calos formados em meio selectivo MSBN contendo canamicina foram mantidos num para crescimento de calos compreendendo sais major e m i nor MS e Fe-EDTA (Gibco 500-1117; 4,3g/l), vitaminas MS, 100 mg/1 de mio-inosito 1, 20g/l de sucrose, 2 mg/1 de ácido naftalenoacêtico e 0,3 mg/1 de quinetina.
Os calos podem ser usados para regenerar plantas transgénicas através da transferencia de pedaços de calos para meio MSBN e seguindo os métodos descritos no Exemplo 34. Os calos foram também usados para medir a indução de genes após aplicação de químicos indutores e para fazer o despiste de químicos indutores de genes.
EXEMPLO 36 Transformação de cenoura
Agrobacter i um estirpes CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955,
PCIB273 X A208, pCIB273 X A281 e pCIB273 X A4 foram cultivadas como descrito no Exemplo 34. As bactérias diluidas para uma DO^qq de 0,2-0,4 foram então usadas para a inocula-126-
ção de discos cortados da superfície de cenouras esterilizadas.
Para esterilizar a superfície das cenouras elas foram pelas e depois embebidas 20 minutos numa solução a 10% de clorox. As cenouras foram lavadas com água esterilizada, cortadas em fatias de 5 mm e colocadas com o lado basal para cima em agar com água. 20-50 ^il de bactérias foram então aplicadas na superfície superior dos discos.
Após 7 dias os discos foram transferidos para 0,7% de agar contendo sais MS, 3% de sucrose, 0,1 mg/1 de 2,4-D, 50 /ug/ml de canamicina, 100 /jg/ml de carbenici 1 ina e 100 ug/ml de mefoxina. Os calos que se formaram à volta do anel cambial foram removidos e colocados em 0,7% de agar MS suplementado com 3% de sucrose, 0,1 mg/1 de 2,4-D, 50/ug/ml de canamicina, 100 /ug/ml de carben i c i 1 i na e 100 pg/ml de mefoxina. Após os calos terem sido cultivados foram cortados em pequenos pedaços e distribuídos por quatro placas do mesmo meio. Quando estes calos encheram as placas, três destas placas foram vaporizadas com água, sal ici lato de sódio 50 mM pH 5,6 ou 250 yug/1 de benzo-1 , 2,3-1 i ad i azo 1 e-7-ca rbox i 1 a to para induzir a expressão do gene quimérico PR-la/GUS.
As experiências de indução e resultados estão descritos nos Exemplos 63 e 66.
EXEMPLO 37 Transformação do girassol
Agrobacterium estirpes CIB270,
CIB271 , CIB272, CIB273, pCIB27 1 X 15955, pCIB271 X A208, PCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208,
PCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 e pCIB273 X A4 foram cultivadas como descrito
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no Exemplo 34. As bactérias, diluídas para uma DOqqq de 0,2-0,4 foram então usadas para inoculação de caules de plantas de girassol preparados como se segue:
Sementes de girassol foram embebidas 10 min em 10% de captano seguido de 10 min em 10% de clorox e lavadas com água esterilizada. Os revestimentos das sementes foram removidos e as sementes postas a germinar em 0,7% de agar com água no escuro durante três dias, após o que foram colocadas numa incubadora Labline regulada para 23°C com um períodocfe 12 horas diurno e nocturno.As plantulas foram cultivadas durante uma semana antes da decapitação e inoculação das bactérias na superfície dos caules cortados.
Após uma semana os caules inoculados com CIB270, CIB271, CIB272 ou CIB273 foram cortados e colocados em 0,7% de agar contendo sais MS, 3% de sacarose, 2 mg/ml de ácido %-nafta 1enoacético, 1 mg/ml de 6-benzi1 am inopurina , 100 /jg/ml de carben ic i 1 ina , 100 jug/ml de mefoxima e 50 yug/ml de canamicina. Os caules inoculados com PCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281,
PCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281, e pCIB273 X A4 foram cortados e colocados em agar a 0,7% contendo sais MS, 3% de sucrose, 100 /jg/ml de carbenicilina e 100 ^ug/ml de mefoxima.Os calos foram transferidos para meio fresco de duas em duas semanas até se obter quantidade suficiente para 4 placas.Metade dos calos que crescerem com as estirpes virulentas de Agrobacter i um foi transferida para meio sem hormonas contendo 50 pg/ml de canamicina. Após se obterem calos suficientes crescidos na presença ou ausência de canamicina aqueles foram tratados para indução como descrito atrás para calos de cen o ura transformados.
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EXEMPLO 38 Transformação do tomateiro
Agrobacterium estirpes CIB270, CIB271, CIB272, CIB273, pCIB271 X 15955, pCIB271 X A208, PCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955,
PCIB273 X A208, pCIB273 X A201 e pCIB273 X A4 foram cultivadas como descrito no Exemplo 34. As bactérias, diluídas para um ϋΟ^θθ de 0,2-0,4, foram então usadas para inoculação de caules de plantulas de tomateiro preparadas como se segue:
Sementes de tomate foram embebidas 20 min em 10% de clorox e lavadas com água esterilizada.
As sementes foram postas a germinar em 0,7% de agar com água no escuro durante três dias, após o que foram colocadas numa estufa Labline regulada para 23°C com um período de 12 horas diurno e nocturno. As plantulas foram cultivadas durante uma semana antes da decapitação e inoculação das bactérias na superfície de caules cortados.
Após uma semana os caules inoculados com CIB270, CIB271, CIB272 ou CIB273 foram cortados e colocados em 0,7% de agar contendo sais MS, 3% de sacarose, mg/ml de ácido ^-naftalenoacético, 1 mg/ml de 6-benzilaminopurina, 100 ug/ml de carbenici1ina , 100 ug/ml de mefoxima e 50 ug/ml de canamicina. Os caules inoculados com PCIB27 1 X 15955 pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, PCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281, e pCIB273 X A4 foram cortados e colocados em agar a 0,7% contendo sais MS 3% de sacarose, 100 ug/ml de carbenici 1 ina e 100 ug/ml de mefoxima. Os calos foram transferidos para meio fresco de duas em duas semanas até se obter quantidade suficiente para 4 placas. Metade dos calos que crescerem
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com estirpes virulentas de Agrobacter i um foi transferida para meio sem hormonas contendo 50 /jg/ml de canamici na . Após se ter obtido calos suficientes crescidos na presença ou ausência de canamicina estes foram tratados para indução como descrito atrás para os calos de cenoura transformados.
EXEMPLO 39 Transformação do algodoeiro
Agrobacterium estirpes pCIB27I X 1 5955, pCIB271 X A208, pCIB271 X A281, pCIB271 X A4, pCIB272 X 15955, pCIB272 X A208, pCIB272 X A281, pCIB272 X A4, pCIB273 X 15955, pCIB273 X A208, pCIB273 X A281 e pCIB273 X A4 foram cultivadas como descrito no Exemplo 34. As bactérias diluídas para uma ϋΟθθθ de 0,2-0,4, foram então usadas para inoculação de cotilédones de algodoeiro preparados como se segue:
As sementes de algodoeiro foram embebidas 20 min. em 10% clorox e lavadas com água esteri1izada. As sementes foram germinadas em agar a 0,7% com água no escuro. As pl&tulas foram cultivadas durante uma semana antes da inoculação das bactérias na superfície dos cotilédones.
Os cotilédones inoculados formaram calos antes de serem cortados e colocados em agar a 0,7% contendo sais MS, 3% de sacarose, 100 /jg/ml de carbenicilina e 100 ,ug/ml denefoxima. Os calos foram transferidos para meio fresco de três em três semanas até se obter quantidade suficiente para 4 placas. Metade dos calos que cresceram com as estirpes virulentas de Agrobacterium foi transferida para meio sem hormonas contendo 50 pg/ml de canamicina. Após obter-se crescimento suficiente dos calos na
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presença ou ausência de canamicina trataram-se estes para indução como descrito atrás para os calos de ceneoura transformados.
EXEMPLO 40 Preparação de um tipo especial de calos de Zea mays, linha Inbred Elite Funk 2717
Plantas de Zea mays da linha consaguínea Funk 2717 foram cultivadas até à floração numa estufa e auto-pol inlzadas. Espigas contendo embriões imaturos aproximadamente 2-2,5 mm de comprimento foram removidos das plantas e esterilizados em solução de Clorox a 10% durante 20 minutos. Removeram-se os embriões assépticamente dos grãos e semearam-se com o eixo embrionário para baixo em meio OMS contendo 0,1 mg/1 de 2,4-D, 6% (p/v) de
D sacarose e 25 mM L-proiina solidificado com Gelrite a 0,24% (p/v) (meio de iniciação). Após duas semanas de cultura no escuro a 27°C os calos que se desenvolveram a partir do escutelo foram removidos do embrião e semeados em meio B5, (Gamborg, O.L. et a 1., Experimental Cell Research 50, 1 5 1 -158 ( 1968 ), contendo 0,5 mg/1 de 2,4-D e solidificap do com 0 31% (p/v) de Gelrite . Os calos foram subcultivados de duas em duas semanas para meio frseco. Após um total de oito semanas após colocação dos embriões no meio de iniciação, 0 tipo especial de calo foi identificado pela sua morfologia característica. Este calo foi subcultivado ainda no mesmo meio. Após um periodo adicional de dois meses, 0 calo foi transferido e subcultivado seriadamente em melo N6 contendo 2 mg/1 de 2,4-D e solidificado com Ge 1r i teR.
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EXEMPLO 41 Preparação de uma cultura em suspensão de Zea mays , Elite Inbred Funk 2717 calo descrito no Exemplo 40 foi subcultivado durante um total de pelo menos seis meses. 0 tipo de calo escolhido para subcultura era relativamente não muci1aginoso, granular e muito friável, de tal modo que se separou em pequenos agregados individuais de células quando colocado em meio liquido. As culturas contendo agregados com células grandes expandidas não foram mantidas. Amostras de aproximadamente 500 mg do calo especial de Zea mays linha consanguínea funk 2717 foram colocados em 30 ml de meio N6 contendo 2 mg/1 de 2,4-D em frascos Delong de 125 ml. Após uma semana de cultura a 26°C no escuro num agitador giratório (130 rpm, 2,5 cm de curso), o meio foi substituído por meio fresco. As suspensões foram novamente subcultivadas deste modo após mais uma semana. Naquela altura as culturas foram observadas e mantiveram-se as que não apresentavam grande número de células expandidas. Rejeitaram-se as culturas em suspensão contendo agregados com células grandes expandidas. 0 tecido preferido consistiu em agregados de células em divisão com citoplasma denso as quais tinham caracteristicamente uma superfície mais lisa do que o tipo habitual de agregados de células. As culturas mantidas tinham pelo menos 50% das células representadas nestes pequenos agregados. Esta é a morfologia pretendida. Estas suspensões também tinham uma velocidade de crescimento rápida, com um tempo de duplicação de menos de uma semana. As culturas em suspensão foram subcultivadas semanalmente por transferencia de 0,5 ml PCV (volume de células compactadas:vo 1 ume de células sedimentadas numa pipeta)para 25 ml de meio fresco. Após quatro a seis semanas de subcultura deste modo, as culturas aumentaram duas a três vezes por subcultura semanal.
As culturas em que mais do que 75% das células têm a morfo-132-
logia pretendida são mantidas para posterior subcultura.
As linhas são mantidas escolhendo sempre para subcultura o frasco cujo conteúdo apresentava a melhor morfologia. A filtração periódica através de crivos em aço inoxidável com um poro de 630 um de cbas em duas semanas foi usado nalguns casos para aumentar a dispersão das culturas,mas não é necessário.
EXEMPLO 42 Preparação de protoplastos a partir de culturas em suspensão de Zea mays
1-1,5 ml de PCV da suspensão de células em cultura preparada como no Exemplo 41 foi incubado em 10-15 ml de uma mistura esterilizada por filtração consistindo em 4% (p/v) de celulase RS com 1% (p/v) de Rhozyme em solução de sais KMC (8,65 g/1 de KC1, 16,47g/l de MgCl2.6H20 e 12,5g/l de CaCl2.2H20 5g/l MES, pH 5,6).
A digestão foi efectuada a 30°C numa mesa de agitação lenta durante um período de 3-4 horas. A preparação foi controlada relativamente à libertação de protoplastos usando um microscópio invertido. Os protoplastos libertados foram colhidos como se segue: A preparação foi filtrada através de um crivo de 100 um, seguido de um crivo de 50 um. Os protoplastos foram lavados dos filtros com um volume de solução salina KMC igual ap volume original da solução de enzima. 10 ml da preparação de protoplastos foi colocado em cada um de vários tubos de centrífuga em plástico rejeitáveis e 1,5-2 ml de solução de sacarose 0,6M (tamponada para pH 5,6 com 0,1% (p/v) de ácido morfo1inoetanossulfónico (MES e KoH) colocados por baixo. 0 tubo foi centrifugado a 60-100 xg durante 10 minutos e a banda de protoplastos na interface foi colhida usando uma pipeta e colocada num outro tubo. A preparação de protoplastos foi ressuspensa em 10 ml de solução salina KMC
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fresca e centrifugada durante cinco minutos a 60-100 xg.O sobrenadante foi removido e rejeitado e os protoplastos ressuspensos suavemente na gota restante e depois adicionado gradualmente 10 ml de solução KMC com 13/14 da força. Apôs nova centrifugação durante cinco minutos o sobrenadante foi novamente removido e os protoplastos ressuspensos numa solução de KMC com 6/7v da força. Retirou-se uma amos tra para contagem e os protcplastos foram novamente sedimentados por centrifugação. Ressuspenderam-se os protoplastos a 10?(dez milhões) por ml em meio KM-8p (Tabela I) ou em manitol 0,5M contendo MgCl2 6mM ou outro meio adequado para usar em transformação como descrito nos exemplos que se seguem. Esta suspensão de protoplastos foi usada para transformação e subcultivada como descrito nos Exemplos 43 e 44.
EXEMPLO 43 Transformação de protoplastos de Zea mays por e 1 ectroporação
A. Todos os passos com excepção do choque térmico foram efectuados à temperatura ambiente (22-28°C).0s protoplastos foram resuspensos no último passo do Exemplo 42 em manitol 0,5M contendo 0,1% (p/v) de MES em MgCl2 6mM. A resistência desta suspensão foi medida na câmara de um Dialog E1 ectroporator (DIA-LOG G.m.b.H. D-4000 Duesseldorf 13, República Federal Alemã) e ajustada a 1-1,2 KOhm usando uma solução 300 mM MgCl2. Os protoplastos foram sujeitos a choque térmico por imersão do tubo contendo a amostra num banho-maria a 45°C durante cinco minutos,seguido de arref ec imento até à temperatura ambiente em gelo. 4 pg do plasmideo linearizado contendo um gene de resistência à hiçjromicina seleccionável em plantas como seja como descrito por Rothstein, S.J. et a 1.,supra, ou construcções de genes quiméricos como descrito nos Exemplos 19 a 31 e 20 pg
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de DNA veiculo de timo de vitela foram adicionados a amostras de 0,25 ml desta suspensão. Adicionou-se aos protoplastos 0,125 ml de uma solução a 24% (p/v) de po 1 ieti 1 enog 1 icol (PEG) (PM 8000)em manitol 0,5M contendo MgCl^ 30 mM.
A mistura foi bem misturada sta/emente e incubada durante 10 minutos. Transferiu-se a amostra para a câmara do electroporador e as amostras submetidas a três pulsos com intervalos de 10 segundos, com voltagens iniciais de 1500, 1800, 2300 ou 2800 Vcm-1 e um tempo de decaimento exponencial de 10 useg.
Os protoplastos foram cultivados como se segue.As amostras foram semeadas em placas de petri de 6 cm à temperatura ambiente. Após mais 5-15 minutos, adicionou-se 3 ml de meio KM-8p(Tabela I,supra) contendo 1,2% (p/v) de agarose Sea Plaque e 1 mg/1 de 2,4-D.
A agarose e os protoplastos foram bem misturados e o meio deixado gelificar.
B. Repetiu-se o Exemplo 43A com uma ou mais das seguintes modificações:
(1) A resistência da preparação de protoplastos foi ajustada a 0,5-0,7 KOhm (2) 0 PEG usado foi PEG com um peso molecular de 4000.
(3) Não se adicionou PEG ou adicionou-se meio volume de PEG a 12% (p/v).
(4) 0s pulsos foram aplicados com intervalos de três segundos.
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(5) Os protop 1 astos foram semeados após a electroforação em placas colocadas numa placa arrefecida até uma temperatura de 16°C.
(6) Os protoplastos foram colocados em tubos após o passo de e1ectroporação, lavados com 10 ml de solução de KMC com 6/7 da força ou com solução W5 (constituída por 380 mg/1 de KC1, 18,375 g/1 de CaCl2-214^0, 9 g/1 de NaCl; 9 g/1 de glucose, pH 6,0), depois colhidos por centrifugação a 60 g durante 10 minutos, ressuspensos em 0,3 ml de meio KM e semeados como em A.
(7) Não se adicionou DNA veiculo de timo de vitela.
EXEMPLO 44 Transformação de protoplastos de Zea mays por tratamento com po1ieti1enog1ico 1 (PEG)
A. Os protoplastos foram resssuspensos no último passo do Exemplo 42 numa solução de manitol 0,5M contendo 12-30 mM MgCl^. Fez-se um choque térmico de 45° durante cinco minutos como descrito no Exemplo 43. Os protoplastos foram distribuídos em epquenas quantidades para transformação por tubos de centrífuga, 0,3 ml de protoplastos suspensos por tubo. Durante os 10 minutos seguintes adicionou-se o seguinte: DNA (como para o Exemplo 43) e solução de po1ieti 1 enog 1 ico 1 (PEG) (PM 6000, 40% (p/v);contendo CaíNOg^ 0,1M e manitol 0,4M; pH 8-9 com KOH) para dar uma concentração final de 20% de PEG. As amostras foram incubadas durante 30 minutos com agitação suave ocasional e em seguida os protoplastos foram colocados em caixas de petri(0,3 ml da suspensão de protoplastos original por placa de 6 cm de diâmetro)e cultivados como descrito no Exemplo 43.
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B. Repetiu-se ο Exemplo 44Α e os protoplastos foram lavados após 30 minutos de incubação na solução de PEG do Exemplo 44A, pela adição de 0,3 ml da solução W5 cinco vezes com intervalos de dois a três minutos.A suspensão de protoplastos foi centrifugada, o sobrenadante removido e os protoplastos cultivados como no Exemplo 43A.
C. Repetiram-se os Exemplos 44A e B com a modificação de a concentração final de PEG ser entre 13 e 25%(p/v).
EXEMPLO 45 Regeneração de calos a partir de protoplastos
As placas contendo os protoplastos em agarose foram colocadas no escuro a 26°C. Após 14 dias surgiram colónias a partir dos protop1astos.A agarose contendo as colónias foi transferida para a superfície de uma placa de petri de 9 cm de diâmetro contendo 30 ml de meio N6 (Tabela I, supra) contendo 2 mg/1 de 2,4-D, solidiD ficado com 0,24% (p/v) de Gelrite . Este meio foi referido como 2N6. Os calos foram ainda cultivados no escuro a 26°C e os psbços de calos subcu 11ivados de duas em duas semanas em meio sólido e N6 fresco.
EXEMPLO 46 Selecção de calos transformados de Zea mays
Repetiu-se o Exemplo 45 com θ modificação de 100 mg/1 ou 200 mg/1 de higromicina B ser adicionado ao meio 2N6 para seleccionar as células transformadas.
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EXEMPLO 47 Regeneração de plantas do milho
A. 0 calo foi colocado em meio 2N6 para manutenção e em 0N6 (compreendendo N6 sem 2,4-D) e em meio N61 (compreendendo meio N6 contendo 0,25 mg/1 de 2,4-D e 10 mg/1 de quinetina) para iniciar a regeneração. Os calos que cresceram em meios 0N6 e N61 foram cultivados na luz (16 horas) luz do dia de 10-100 p Einsteins/m seg de lampadas fluorescentes brancas).Os calos que cresceram em meio N61/foram transferidos para meio 0N6 após duas serenas uma vez que demasiado tempo em meio N61 é prejudicial. Os calos foram subcu1tivados de duas em duas semanas mesmo quando transferidos novamente na mesma formulação de meio. As plantulas apareceram após entre quatro e oito semanas. Uma vez com mais de 2 cm de altura transferiram-se para meio 0N6 em recipiente GA7. Formaram-se raízes em duas a quatro semanas e quando as raizes pareciam suficientemente bem formadas para suportar o crescimento as plantulas foram transferidas para o solo em vasos de turfa, com uma protecção da luz durante os primeiros quatro a sete dias. E muitas vezes bom inverter uma caneca de plástico transparente sobre as plantas transplantadas durante dois a três dias para induzir o robustecimento. Uma vez estabelecidas as plantas elas são tratadas como plantas de milho normais e cultivadas até à maturidade na estufa.Para se obter progénie, as plantas são autopol inizadas ou cruzadas com o tipo selvagem.
B. Repetiu-se o Exemplo 47A com a modificação de se adicionar 100 mg/1 ou 200 mg/1 de higromicina B ao meio usado para manter os calos.
-138EXEMPLO 48 Preparação de suspensões embriogénicas a partir de tecidos de Dacty 1 i s g 1 omerata j. (erva dos pomares)
A; Iniciaram-se calos embrionários a partir de secções basais das folhas mais novas de plantas de erva dos pomares (DactyIis g 1 omerata LJ cultivadas em estufa como descrito por Hanning, G.E. et a 1., Theor. Appl. Genet.63, 155-159 ( 1982).· A superfície das folhas foi esterilizada por imersão numa diluição de 1:10 de Clorox (5,25%(p/v) de hipoclorito de sódio; The Clorox Company, Oakland, Ca.) durante cerca de 10 minutos e depois cortadas assépticamente em pequenos segmentos de 1 a 5 mm de comprimento ou de diâmetro. Estes segmentos foram semeados em meio SH-30 esterilizado contendo 0,8% (p/v) de agarose como agente de gelificação. Os calos e/ou estruturas embriogénicas apareceram dentro de 2 a 6 semanas após sementeiras quando cultivadas a cerca de 25°C. Os calos embrionários foram mantidos por subcultura em meio SH-30 de duas com intervalos de duas a quatro semanas e cultivadas no escuro a 25°C.
B. Iniciaram-se culturas embrionárias em suspensão colocando aproximadamente 0,5 g de peso fresco de calos embrionários em 50 ml de meio liquido descrito por Gray,
D.J. et a 1. , Plant Cell Tissue Organ Cult., 4, 123-133 (1985) contendo 45 uM dicamba e 4 g/litro de hidrolisado de caseína. As culturas em suspensão foram cultivadas a 27°C sob um período de luz de 16 horas (40 pE/m2seg),8 horas de foto período escuro num agitador giratório a cerca de 130 rpm em frascos Delong de (25 ml fechados com uma tamp pa de metal e parafilm . Após aproximadamente quatro semanas os agregados grandes foram deixados sedimentar durante cerca de 30 segundos e amostras de 10 ml do meio sobrenadante contendo aglomerados pequenos foram removidas e transferidas para 50 ml de meio fresco. Este processo foi repetido
-139com intervalos de 3 a 4 semanas usando as culturas mais promissoras conforme avaliado pelo tamanho pequeno dos agregados e melhor qualidade com base na presença de células pequenas citoplasmãticas. Após 5 a 8 transferências as suspensões estavam práticamente sem células embrionárias e a maioria dos agregados de células embrionárias são muito pequenos (150 a 2000 um).
EXEMPLO 49 Isolamento e purificação de protoplastos de Dactylis 61omerata L.
Prepararam-se protoplastos a partir de culturas embrionárias em suspensão do Exemplo 48 por filtração asséptica das células através de uma unidade p
de filtração Nalgene de 0,2 um seguido da adição de 0,5g de peso fresco de células a cada 12,5 ml de mistura de enzimas para protoplastos uma caixa de petri. A mistura de enzimas consistiu em 2% (p/v) de Cellulase RS, 7 mM CaCl2 X H20, 0,7 mM NaH2P04XH20, 3 mM MES (pH 5,6), glucose (550 mOs/kg de pH 5,6) e foi filtrada para esterilização.
A mistura foi agitada num agitador orbital a cerca de 50 o rpm em luz fusca (4,5 uE/m seg) durante cerca de 4 a 5 horas. 0 produto da digestão foi então passado através de um crivo de aço inoxidável (100 um de malha) e distribuído por tubos de centrífuga de 12 ml que foram centrifugados entre 60 e 100 g durante cerca de 5 minutos. 0 sedimento contendo protoplastos foi então lavado três vezes com meio de cultura para protoplastos KM-8p ajustado a 550 mOs/kg de H20 com glucose. Nesta altura pode.-se incluir um passo de flutuação para purificar mais os protoplastos. Neste caso, os protoplastos lavados foram aplicados no topo de 10 ml de meio de cultura KM-8p ajustado a 700 mOs/kg H20 com sacarose. Após centrifugação a 60-100 xg
-140-durante cerca de 10 minutos, os protoplastos posicionados na interface foram colhidos usando uma pipeta fina. Finalmente os protoplastos foram ressuspensos em 1 a 2 ml de meio de cultura KM-8p e passados através de um crivo de aço inoxidável (20 um de malha). Os protoplastos libertados foram colhidos e lavados e ressuspensos em meio KM-8p para cultura ou em meio ajustado osmóticamente adequado à transformação de acordo com os Exemplos 51 a 53.
EXEMPLO 50 Cultura de protoplastos e crescimento de calos de Dacty1is g 1 omerata
A. Os protoplastos purificados foram semeados a uma densidade de cerca de 5X10 protoplastos por ml em meio de p
cultura KM-8p contendo 1,3% (p/v) de agarose Sea Plaque (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rock 1 and,Maine,USA) e 30 a 40% (p/v) de meio condicionado (obtido a partir de culturas embrionárias em suspensão de Dacty1i s g1omerata de 3 a 4 semanas de idade por filtração do meio através p
de um filtro Nalgene de 0,2 yum, ajustando o meio a 550 mOsm/ /kg H^O através da adição de glucose e nova esterilização por filtração). As placas foram então colocadas no escuro a uma temperatura constante de 28°C. Após 10 a 14 dias a agarose foi cortada em cunhas e colocada em cultura com esferas como descrito por Shillito, R.D. et a 1. , Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983) usando 20 ml de meio para cultura em suspensão SH-45 com 3% (p/v) de sucrose por 3 ml de cultura original embebida em agarose. As placas foram colocadas numa plataforma de agitação e agitadas a cerca de 50 rpm na luz a 8 pE/m seg. A medida que as colónias foram crescendo para fora da agarose e libertadas células para 0 meio liquido novas culturas em suspensão foram formando-se. A suspensão resultante de células em cultura
-141-
foi semeada em meio SH-30 solidificado com agar e colocada no escuro a 25°C até se formarem calos.
B. Cu 11ivaram-se protoplastos como descrito no Exemplo 50 A atrás excepto orneio de cultura não conter meio condicionado.
EXEMPLO 51 Transformação de protoplastos de Dacty 1 i s g 1 omerata L_ por meio de electroporação
A. Imediatamente após purificação dos protoplastos, a e1ectroporação foi efectuada de acordo com Shi11ito ,R.D. et a 1., Bio/Technology 3, 1099- 1 103 (1985) plasmideo linearizado como descrito no Exemplo 20. Os protoplastos foram ressuspensos após a última lavagem a uma densidade de cerca de 7 X 105 protoplastos por ml do tampão de electroporação (manitol 0,4M, MgC^ 6mM). Colocaram-se os protoplastos em quantidades de 0,7 ml chitro-de tubos de centrífuga em plástico de 10 ml. 0 DNA de plasmideo do Exemplo 20 e.
DNA de timo de vitela (Sigma) sonicado para dar concentrações finais de 10 pg/ml e 50 pg/ml respectivamente foi adicionado aos tubos. Em seguida adicionou-se 0,38 ml de solução de polietilenoglicol (PEG) /24% (p/v) PEG 6000 em manitol 0,4M, 30 mM MgC^, 0,1% (p/v) de MES (pH 5,6)/ e a solução foi suavemente misturada. A suspensão de protoplastos foi transferida para a câmara de um electroporap dor Dialog e 10 pulsos de 3250 V/cm de voltagem inicial e constante de decaimento exponencial de 10 useg aplicados com intervalos de 30 seg. Removeu-se a amostra da câmara e colocou-se numa placa de petri de 10 cm. Adicionou-se 10 ml de meio KM-8p contendo 1,2% (p/v) de agarose SeaPLaque^ os protoplastos foram distribuídos pelo meio e deixada gel ificar a agarose.
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B. Repetiu-se ο Exemplo 51 A excepto a voltagem inicial usada ser de 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm ou 2500 V/cm.
C. Repetiram-se os Exemplos 51 A e B exceptuando
ter-se usado PEG de PM 4000 ou PEG de PM 8000.
D. Repetiram-se os Exemplos 51 A a C exceptuando
a concentração final de PEG ser entre 10% e 3 0 % ( p / v)
EXEMPLO 52 Transformação de protoplastos de Dacty1i s glomerata L. por tratamento com polietilenoglicol (PEG).
A. A transferencia directa de genes mediada por PEG foi efectuada segundo Negrutiu, I. et a 1., supra. 0 DNA usado foi o plasmideo linearizado descrito no Exemplo 20.
Após a última lavagem em manitol 0,5M contendo 15 mM MgCl? os protoplastos foram ressuspensos a uma densidade de cerca de 2 X 10a por ml. A suspensão de protoplastos foi distribuída como amostras de 1 ml por tubos de centrífuga de 10 ml em plástico. Adicionou-se DNA como descrito no Exemplo 51 atrás e depois adicionou-se 0,5 ml da solução de PEG (40% (p/v) de PEG 4000 em manitol 0,4M, 0,1M CaíNO^^, pH 7,0). As soluções foram misturadas sia/emente e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 24°C) durante 30 minutos com agitação ocasional. Adicionou-se então 1,4 ml da solução de lavagem e o conteúdo do tubo foi suavemente misturado. A solução de lavagem consiste em manitol 87 mM, 115 mM CaCl^, mM MgC^, 39 mM KC 1, 7 mM Tris-HCl e 1,7 g/1 de mio-ino
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sitol, pH 9,0. Adicionou-se mais quatro quantidades de 1,4 ml de solução de lavagem com intervalos de 4 minutos, com mistura após cada adição. 0 tubo foi então centrífuga do a cerca de 60 X g durante cerca de 10 minutos e o sobrenadante rejeitado. Os protoplastos sedimentados foram ressuspensos em 1 ml de cultura KM-8p e colocados numa placa de petri de 10 cm. Adicionou-se 10 ml de meio
D
KM-8p contendo 1,2% (p/v) de agarose SeaPlaque . Os protoplastos foram distribuídos pelo meio e deixada gelificar a agarose.
B. Repetiu-se o Exemplo 52 com uma ou mais das seguintes modificações:
(1) 0 pH da solução de lavagem foi ajustado a 5,6 ou 7,0.
(2) 0 PEG usado foi PEG de PM 6000, PEG de PM 2000 ou PEG de PM 8000.
(3) 0 meio de lavagem consistiu em 154 mM NaCl,
125 mM CaCl^, 5 mM KC1, 5 mM glucose, pA até 6,0 com KOH, 0,2M CaCl2, 0,1% (p/v) MES, pH 6,0 com KOH ou 0,2M CaCl2> 7 mM Tris/HCl, pH 9,0 com KOH.
-144EXEMPLO 53 Transformação de protoplastos de DactyIi s g 1 omerata J_. por electroporação ou tratamento com PEG
A transformação foi efectuada como descrito nos Exemplos 51 ou 52 exceptuando os protoplastos serem tratados a 45°C durante cerca de 5 minutos antes de distribuição das amostras por tubos para transformação ou após distribuição das amostras e antes da adição do PEG.
EXEMPLO 54 Selecção de colónias transformadas
A. As placas de cultura (placas de Petri) contendo os protoplastos dos Exemplos 51 a 53 foram incubadas durante 10 dias no escuro a cerca de 25°C e depois cortadas em cinco fatias iguais para culturas com esferas (Shillito, R.D. et al., Plant Cell Reports 2, 244-247 (1983)).Quatro das fatias foram colocadas cada uma em 20 ml de meio de cultura SH-45 em 4 g/1 de hidrolisado de caseína e 20 pg/ml de higromicina B. A quinta fatia foi colocada em 20 ml do resmo meio sem higromicina B como controlo não selectivo. Após 4 a 5 semanas as colónias de células putativas derivadas de protoplastos transformados a crescerem em higromicina B foram retiradas da agarose e colocadas numa placa de petri de 19 mm com 2 ml de meio liquido SH-45 contendo 20 jug/ml de higromicina B, que foi agitado a cerca de 50 rpm num agitador orbital. Após mais 4 a 5 semanas todas as colónias que cresceram para fazer novas suspensões foram transferidas para frascos Erlenmeyer de 125 ml e cultivadas de modo semelhante à cultura em suspensão parental, exceptuando ter-se incluído no meio 20 /jg/ml de higromicina B.
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As novas suspensões foram subcultivadas com intervalos de 1 a 3 semanas usando melo SH-45 contendo 4g/l de hidrolisado de caseína e 20 /jg/ml de higromicina B. As células destas suspensões foram também semeadas em meio SH-30 solidificado contendo 20 pg/ml de higromicina B e incubadas a cerca de 25°C no escuro. Os calos que cresceram a partir das células semeadas foram subcultivadas de duas em duas semanas para meio fresco.
As células que cresceram na presença de higromicina B presumiu-se serem transformantes.
B. Fez-se selecção como descrito no Exemplo 54 A exceptuando as colónias de células derivadas de protoplastos a crescer em meio contendo higromicina serem semeadas em placas de meio SH-30 com agar contendo 20 yug/ml de higromi cina B e incubadas a cerca de 25°C no escuro.
EXEMPLO 55 Regeneração de plantas de Dacty1is g1omerata L. transformadas
A. Calos de Dacty 1 i s g I omerata J_.(obtidos como descrito no Exemplo 54; derivados de protoplastos foram cultivados em meio SH-30 solidificado e subcu1tivados de duas em duas semanas. Quaisquer embriões que se formaram foram removidos e semeados em meio de germinação (SH-O) e colocados na luz(45 a 55 /jE/m seg). A germinação destes embriões ocorreu em 1 a 4 semanas e as plantulas resultantes foram colocadas em meio SH-0 na luz para formar sistemas radiculares. Transferiram-se para a estufa na fase de seis a doze folhas e deu-se o robustecimento gradualmente.
-146-
B. Calos (obtidos como descrito no Exemplo 54) derivados de protoplastos foram cultivados en meio SH-0 solidificado com 0,24% (p/v) de GelriteR na luz (45 a 55 /uE/m2seg) e subcultivados de duas em duas semanas. As plantulas resultantes foram colocadas numa mistura a 1:1 de meios SH-0 e OMS solidificados com uma combinação de 0,12% (p/v) de Gelrite e 0,4% (p/v) de agar na luz para formar sistemas radiculares. TRansferiram-se para a estufa na fase de seis a doze folhas e robusteceram gradualmente.
C. Plantulas pequenas foram obtidas como descrito em 44 A e 44 B atrás e foram colocadas em meio OMS solidificado com 0,8% (p/v) de agar na luz para formar sistemas radiculares. Transferiram-se para a estufa na fase de seis a doze folhas e robusteceram gradualmente.
D. Plantulas pequenas foram obtidas como descrito em 44 A atrás e colocadas numa mistura a 1:1 dos meios SH-0 e OMS solidificada com uma combinação de 0,12% (p/v) de
D
Gelrite e 0,4% (p/v) de agar na luz para formar sistemas radiculares. Transferiram-se para a estufa na fase de seis a doze folhas e robusteceram gradualmente.
6. Expressão transitória de genes
Os exemplos que se seguem descrevem como os genes quiméricos podem ser sintetizados e utilizados sem o gene ser necessariamente incorporado de modo estável no genoma da planta.
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EXEMPLO 56 Introdução de DNA em protoplastos de hk tabacum por tratamento com PEG
A. Uma preparação de protoplastos de N. tabacum foi efectuada de acordo com os métodos descritos nas publicações que se seguem: Paszkowski, J. et aI.EMBO J. 3, 2717 (1984); pedido de patente GB 2.159.173, Pedido de Patente Europeia EP 0.129.668; Shillito, R.D. e Potrykus, I.,
Em: Methods in Enzymology, eds. Wu, R. e Grossman, L., Academic Press, Orlando, Florida, Vol. 153, 313-306(1987) ou por outros métodos conhecidos. EStas publicações são aqui incluídas como referência.
B. Introduziu-se DNA em protoplastos por uma modificação do método de Negrutiu, I. et a 1., Plant Mol. Biol. 8, 363 (1987). Os protoplastos preparados como descrito no Exemplo 56 A foram ressuspensos após o último passo de lavagem, numa solução consistindo em manitol 0,4M, 15-30 mM CaC^, 0,1% p/v MES a uma densidade de 1,6-2 X 10θ por ml. A suspensão de protoplastos foi distribuída em quantidades de 0,5 ml por tubos de centrífuga de 10 ml em plástico. 0 DNA dos Exemplos 19 a 31 foi adicionado em 10 μ 1 de água destilada e esterilizada como descrito por Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3, 2717 ( 1984 ) e em seguida adicionou-se 0,5 ml da solução de PEG (40% (p/v) PEG PM 8000 em manitol 0,4M, 0,lM CaíNOg^, pH 7,0). As soluções foram misturadas suavemente e incubadas durante 30 minutos à temperatura ambiente (cerca de 24°C) com agitação ocasional. Adicionou-se então 1 ml da solução de lavagem e os conteúdos dos tubos foram suavemente misturados. A solução de lavagem consiste em 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KC1, 5 mM glucose, pH até 6,0 com KOH. Outras amostras de 2 ml, 3 ml e 4 ml da solução de lavagem foram adicionadas sequencia damente com intervalos de 5 minutos, com mistura após cada
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adição. 0 tubo foi então centrifugado a 10-100 x g durante cerca de 10 minutos e o sobrenadante rejeitado. 0 sedimen to de protoplastos foi ressuspenso em meio de cultura K3 suficiente contendo glucose 0,3M como osmótico e sem sucro se, para se conseguir uma densidade fonal de 100 000 por ml e cultivadas numa placa de petri de 10 cm.
C. Repetiu-se o Exemplo 56 B com uma ou mais das seguintes modificações:
(1) 0 pH da solução de lavagem foi ajustado a 5,6 ou
7,0.
(2) 0 PEG usado foi PEG com um peso .molecular de
4000 .
(3) 0 meio de lavagem consistiu em 0,2M CaCl2> 0,1% p/v MES, pH 6,0 com KOH ou em 0,2 M CaCl2, 7 mM Tris/HCl, pH 9,0 com KOH.
(4) 50 ug de DNA de timo de vitela partido em μ 1 de água esterilizada foi adicionado juntamente com o DNA de plasmideo.
(5) 0 DNA de plasmideo foi linearizado antes de ser usado por tratamento com uma enzima de restrição adequada (e.g. BamHI).
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EXEMPLO 57 Introdução de DNA nos protoplastos de N.tabacum por e 1 ectroporação
A. A introdução de DNA em protoplastos de _N. tabacum foi efectuada por tratamento dos protoplastos com um pulso eléctrico na presença do DNA adequado, numa modificação dos métodos de Fromm, M.E. Methods in Enzymology, eds. Wu, R. e Grossman, L., Academic Press, Orlando, F1 orida , Vo1.153, 307 ( 1987); e Shillito R.D. e Potrykus I., ibid p.283-306 .
Isolaram-se protoplastos como descrito no Exemplo 56 A. Os protoplastos foram ressuspensos, apôs a última lavagem, na seguinte solução;0,2M manitol, 0,1% (p/v) MES/72 mM NaCl, 70 mM CaCl?, 2,5mM KC1, 2,5 mM glucose, pH até 5,8 com KOH a uma densidade de 1,6-2x10 por ml. A suspensão de protoplastos foi distribuída como amostras de 1 ml por cuvetes de plástico rejeitáveis e 10 ug de DNA adicionado como descrito nos Exemplos 56B e
C. A resistência da solução neste ponto que foi medida entre os eléctrodos do sistema de electrodos 471 do aparelho de electroporação descrito abaixo estava na gama de 6 Ohms.
Adicionou-se o DNA dos Exemplos 19 a 31 em água destilada estéril, esterilizada como descrito por Paszkowski, J. et a 1., EMBO J. 2> 27 17 ( 1984 ).
A solução foi suavemente misturada e depois sujeita, à temperatura ambiente (24-28°C) a um pulso de 400 V/cm com uma constante de decaimento exponencial de 10 ms de um aparelho de electroporação BTX-Transfector 300 usando a montagem de eléctrodos 471. Os protoplastos foram deixados em repouso durante 5 minutos e depois colocados numa caixa de petri e adicionou-se meio K3 como descrito no Exemplo 56 para levar a densidade dos protoplastos até 100 000 por m1.
-150-
Β. Repetiu-se ο Exemplo 57 A com uma ou mais das seguintes modificações:
(1) A voltagem usada foi de 200 V/cm ou entre 100 V/cm e 800 V/cm.
(2) A ccnstante de decaimento exponencial foi de 5 ms, 15 ms ou 20 ms.
(3) Adicionou-se 50 ug de DNA de timo de vitela partido em 25 ul de água estéril juntamente com o DNA de plasmideo.
(4) 0 DNA de plasmideo foi linearizado antes de ser usado por tratamento com uma enzima de restrição adequada (e.g. BamHI).
EXEMPLO 58 Introdução de DNA em protoplastos de Zea may s linha 2717
Protoplastos de milho ou inbred line funk 2717 foram preparados como descrito nos Exemplos 40 a 47 atrás e ressuspensos numa das soluções descritas para a ressuspensão de protoplastos de II. tabacum nos Exemplos 56 e 57 atrás numa densidade de 107 por ml. A transformanão foi efectuada essencialmente como descrito nos Exemplos 56 e 57. Os protoplastos foram cultivados após transformação a uma densidade de 2x10 por ml em meio KM-8p sem se adicionar agente so1idificante e contendo 1 mg/1 de 2,4-D.
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EXEMPLO 59 Introdução de DNA em protoplastos de Sorghum bicolor
Protoplastos de suspensão de sorgo FS562 foram preparados essencialmente como descrito para Zea mays no Exemplo 40 acima e ressuspensos numa das soluções descritas para a ressuspensão dos protoplastos de N_. tabacum nos Exemplos 56 e 57 atrás a uma densidade de 107 por ml. A transformação foi efectuada essencialmente como descrito no Exemplo 58. Os protoplastos foram cultivados após transformação a uma densidade de 2xl06 por ml em meio KM-8p, sem se adicionar meio de solidificação.
EXEMPLO 60 Introdução de DNA em protoplastos de N i cot i ana plumbaginif ol ia , Petunia Hybr ida e Lo 1 ium mu 11 i f1orum
Protoplastos de N. pIumbag i n i fo 1i a £. hybrida ou J_. multiflorum foram preparados como descrito em Shillito e Potrykus, supra e tratados como descrito nos Exemplos 56 e 57. Eles foram cultivados no meio descrito por Shillitio e Potrykus, supra sem adição de agarose ou qualquer outro agente sol idificante.
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EXEMPLO 51 Introdução de DNA em protoplastos de G lyc i ne max
Protoplastos de G1yc ine max foram preparados pelos métodos descritos por Tricoli, D.M. et a 1., Plant Cell Reports, 5, 334-337 (1986) ou Chowhury V.K. e Widholm. J.M., Plant Cell Reports 4, 289-292 (1985) ou Klein, A.S. et a 1., Planta 152, 105-1 14 ( 1981).0 DNA foi introduzido nestes protoplastos essencialmente como descrito nos Exemples 56 e 57. Os protoplastos foram cultivados como descrito em Klein, A.S. et a 1., supra, Chowhury V.K. e Wilholm, J.M. supra, ou Tricoli, D.M.et a 1. , supra, sem a adição de alginato para solidificar o meio.
7. Regulação química de tecido de planta transgénica
Os exemplos que se seguem descrevem processos para a regulação química de genes quimicamente reguláveis em tecidos de plantas transgénicas representativos.Se bem que os exemplos que se seguem sejam dirigidos à indução, processos semelhantes serão aplicáveis para sistemas que oferecem por repressão.
Existe uma variedade de técnicas para o tratamento de plantas transgénicas com um regulador qu_i_ mico. Por exemplo, as células podem ser suspensas em meio liquido contendo o regulador.Os calos podem ser cultivados ou transferidos para meio contendo o regulador ou o regulador pode ser aplicado ao calo eom uma trincha estéril ou nebulizador para plantas. De modo semelhante plantas ou partes de plantas são tratadas com uma solução ou uma suspensão do regulador usando uma trincha ou, de preferencia, um nebulizador para plantas.
-153A expressão da caracteristica fenotipica em plantas transgénicas contendo um gene quimérico quimicamente regulável é proporcional à quantidade do regulador aplicado à planta ou tecido vegetal.
EXEMPLO 62 Indução quimica em culturas de calos transgénicos
A. Calos obtidos de acordo com processos préviamente descritos foram testados relativamente a indução quimica pela aplicação, com uma trincha estéril ou um nebulizador para plantas de uma solução esterilizada por filtração de ácido salicilico 0,1 a 50 mM que foi ajustada préviamente a pH entre 6,0 e 8,0 pela adição de NaOH.
Apôs indução os calos são deixados em incubação durante dois dias e depois colhidos, congelados em azoto liquido e guardados a -80°C até serem testados quanto à indução dos genes como descrito no Exemplo 65 e/ou Exemplo 66.
B. Como alternativa usou-se na indução as seguintes soluções:
(1) ácido benzoico 0,1 a 50 mM que foi ajustado a um pH entre 6,0 e 8,0 pela adição de NaOH.
(2) ácido poliacrilico 0,1 a 50 mM que foi ajustado a um pH entre 6,0 e 8,0 pela adição de NaOH.
(3) benzo-1,2,3-tiadiazo 1-7-carboxi1 ato de metilo.A solução ê feita ressuspendendo um pó molhável contendo o quimico em água esterilizada durante vários minutos a uma concentração de 1 mg/ml. 0 sólido insolúvel foi removido da solução por esterilização através de filtros.
(4) ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico
0,1 a 50mM, pH entre 6,0 e 8,0. 0 composto foi dissolvido num mínimo de dimeti16u1fóxido (DMSO), depois diluído com água estéril para a concentração pretendida. A suspensão obtida foi aplicada sem filtração.
(5) benzo-1 , 2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de n-propilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
(6) benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de benzilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
(7) N-sec-buti1-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
(8) ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico 0,1 a 50 mM, pH entre 6,0 e 8,0 preparado como em( 4).
(9) 2,6-dic1 oro 1sonicotinato de metilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
EXEMPLO 63 Indução química de plantas transgénicas
A. A expressão de genes foi induzida em plantas obtidas de acordo com os processos préviamente descritos através da aplicação de um spray fino de uma solução de ácido salicilico 0,1 a 50 mM que tinha sido ajustada a um pH entre 6,0 e 8,0 com NaOH, às folhas usando um nebulizador para plantas.
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crescimento das plantas continuou durante dois dias e foram então colhidas, congeladas em azoto liquido e guardadas a -80°C até serem testadas como descrito no Exemplo 65 e/ou Exemplo 66.
B. Como alternativa usou-se na indução as seguintes soluções:
(1) ácido benzoico 0,1 a 50 mM que foi ajustado a um pH entre 6,0 e 8,0 pela adição de NaOH.
(2) ácido poliacrilico 0,1 a 50 mM que foi préviamente ajustado a um pH entre 6,0 e 8,0 pela adição de NaOH.
(3) benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de metilo. Fez-se a solução ressuspendendo um pó molhável contendo o quimico em água estéril durante vários minutos a uma concentração de 1 mg/ml. 0 sólido insolúvel foi removido da solução por esteri1ização através de filtros.
(4) ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico, pH entre 6,0 e 8,0. 0 composto foi dissolvido num minimo de dimeti1su 1 fóxido (DMSO), depois diluido com água estéril para a concentração pretendida. A suspensão obtida foi aplicada sem fi 1 tração.
(5) benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de n-propilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
(6) benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de benzilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
(7) N-sec-buti 1-hidrazida do ácido benzo-1 ,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico 0,1 a 50 mM preparado como em (4).
-156-
(8) ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico 0,1 a 50 mM, pH entre 6,0 e 8,0 preparado como em (4).
(9) 2,6-dic1 oroisonicotinato de metilo 0,1 a 50 mM, preparado como em (4).
EXEMPLO 64 Indução da expressão de DNA introduzido em protoplastos de N. tabacum, Zea mays, N^. p 1 umbagin ifo 1ia , P. hybrida, L. multiflorum e Sorghum bicolor
Os protoplastos tratados como descrito nos Exemplos 56 a 61 atrás foram cultivados a 26°C no escuro durante 2 dias. Após este tempo adicionou-se ácido salici1ico para uma concentração entre 0,1 e 50 mM como solução neutralizada, pH entre 6,0 e 8,0. Os protoplastos foram cultivados durante mais 2 dias, colhidos por centrifugação, congelados rápidamente e testados como descrito nos Exemplos que se seguem.
B. Como alternativa, as soluções ou suspensões neutralizadas dos compostos que se seguem foram adicionadas aos protoplastos para dar uma concentração final entre 0,1 e 50 mM;
(1) ácido benzoico (2) ácido poliacrílico (3) benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxi1 ato de metilo (4) ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico (5) benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de n-propilo
-157-
(6) benzo-1, 2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de benzilo (7) N-sec-buti 1-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxi1ico (8) ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico (9) 2,6-dic1 oroisonicotinato de metilo
C. Como alternativa, fez-se a indução como descrito no Exemplo 64 A e B excepto os protoplastos serem cultivados durante 1 dia, 3 dias ou 5 dias antes da indução.
D. A indução foi efectuada como descrito nos Exemplos 64 A, B ou C excepto os protoplastos serem cultivados durante 1 dia, 3 dias ou 5 dias após indução e antes de serem colhidos.
EXEMPLO 65 Ensaio para sequências de DNA quimicamente induzivel: produção de mRNA
Os materiais vegetais induzidos e colhidos como nos Exemplos 62 a 64 foram testados quanto à indução de espécies de mRNA através do isolamento de RNA e ensaio de prolongamento de iniciadores como descrito no Exemplo 5.
Calos ou material vegetal regenerado derivados de plantas transgénicas contendo genes quiméricos quimicamente reguláveis codificadores de GUS, AHAS ou BT e induzidos pelo ácido salicilico, benzo-1,2,3-benzotiadiazole-7-carboxilato de metilo, ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxilico, benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de n-propilo, benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de benzilo, N-sec-buti1-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxilico, ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico, 2,6-dic1 oroisonicotinato de metilo ou TMV demonstram os níveis elevados, de mRNA quando do ensaio com o iniciador para GUS, AHAS ou BT, respectivamente, no ensaio de prolongamento de iniciadores. 0 nível de mRNA é proporcional à quantidade de regu_ lador aplicado.
EXEMPLO 66 Ensaio para sequências de DNA quimicamente induzíveis: actividade enzimática de p-g 1 ucuron i dase
A. Ensaio de ELISA
Tecido de folhas congelado foi triturado num almofariz na presença de azoto liquido para produzir um pó fino. Prepararam-se extractos de folhas misturando um determinado peso (g) com um volume igual (ml) de tampão de extracção GUS(tampão fosfato de sódio 5 mM pH 7,0, 0,1% Triton-X-100, 0,1% de sarcosilo, 10 mM B-mercaptoetanol) como descrito por Jefferson, R.A. et a 1.,Proc . Natl. Acad. Sei. USA 83, 8447-8451(1986).
As reacções foram efectuadas nos poços de placas de ELISA misturando 5-25 μ 1 do extracto com 120-100 yul de tampão de ensaio GUS (tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,0, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoetano1) contendo glucuroneto de 4-meti1 -umbe1iferido (MU) numa concentração final de 2 mM num volume total de 125 pl. A placa foi incubada a 37°C durante 1-5 horas e a reacção foi parada pela adição de 150 pl de Na2C03 3M. A concentração do indicador fluorescente libertado foi determinada pela leitura da placa num leitor de placas de ELISA Flow Labs F1 uoroskan 11.
-159Plant a
Η 1
H 3 H 4
H 6 H 9
Alu 1 Alu 2 Alu 3 Alu 4 Alu 5 Alu 6 Alu 7 Alu 6 Alu 9
Resultados
TABELA II
Actividade especifica nKat MU/mg proteina
39 + 1 . 9 13.9 + 1.2 13.5 + 0.8 20.1 + 5.1 33.6 +2
21 + 0.02 6.92 + 0.88 11.95 + 0.85 1.66 + 0.02 6.54 +1
39 + 1.31 27.5 + 0.7 18.52 + 1.07 2.28 + 0.78 25.1 ±0
10 + 0.04 4.08 + 0.58 2.58 + .01 0.09 + 0.06 2.8 + 1
23 10.8 9.1 0.5 7.5
5.6 2.0
0.1+.07 2.1 + 1 0.6+.2 0.8
1.7 0.6 0.9
20.0
6.6
2.8+.9 4 3.0 + 19
4.4 + 2 . 28.8 38.7
0.4
0.6
206.9 83.2
2.0+.9 7.1+2.6 1.2+.6
67.0 29.1
0.4 0.4
20.5 8.9
2.0+.5
6.1+3.2
0.5+.3
3.1
21.7
0.6
0.3
70.5
155.3
5.8 + 3.8 7.5 + 3.5 8.3+3.7
36.4 63.0
0.2 nd
-160-
Alu 10 4 . 0 39.2 52.0 8.1 37.9
Alu 11 1.6+ . 8 1.9+.9 2.8 + 1.3 2.2+2.6 2.8 + 2.9
Alu 12 0.7 +.4 59 . 1 + 22 73.4 2.3+1.2 7 8.0 + 41 . 4
Alu 13 0 . 1 19.1 13.2 1.9 10.6
Hae 1 0.6 1 . 6 2.6 1.7 3.9
Hae 2 2.3 8.8 11.8 0.4 0.8
Hae 3 1 .7 11.1 11.2 3.0 1.6
Hae 4 2.0 8 . 1 10.8 1.7 0.82
Hae 5 18.1 59.4 132.5 36.6 14.0
Hae 8 0.4 30.6 28.9 0.6 29.0
Hae 9 2.6 63.9 129.7 12.5 55.2
Hae 10 1 . 6 70.5 98.2 13.5 94.5
Hae 11 2.6 81.8 58.5 3.9 46.0
Hae 12 0.2 2.5 5.8 0.6 14.5
Hae 13 0.01 0.7 0.1 nd nd
Hae 14 0.1 1 . 8 8.6 0.1 3.3
Hae 15 0 · 1 6.4 7.2 3.4 7.4
Hae 16 0.1 2.3 4.3 0.8 2.7
a Η 1-9 são plantas do tabaco obtidas por transformação de discos de folhas com a estirpe CIB271
Alu 1-13 são plantas do tabaco obtides por transformação de discos de folhas com a estirpe CIB272
Hae 1-16 são plantas do tabaco obtidas por transformação de discos de folhas com a estirpe CIB273 b A água
B ácido salicilico
C benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxilato de metilo D tampão E TMV
-161-
Calos de tabaco transformados (Exemplo 23). As actividades GUS que se seguem foram obtidas a partir de amostras de calos transformados que foram colhidos 21 horas após tratamento transformados com CIB271 :spray H20:l,8 nKat MU/mg proteina; spray salicilato de sódio 50 mM:3,8 nKat MU/mg proteina. Transformados com CIB271 (experiência diferente):spray 1^0 2,8 nKat MU/mg proteina; spray 250 /jg/l de benzo-1 , 2,3-t i ad i azo le-7-carbox i 1 ato de metilo; 13,7 nKat MU/mg proteina. Transformados com CIB273: spray H20:0,46 nKat MU/mg proteina; spray 250 /jg/1 de benzo-1 , 2,3-tiadiazole-7-carboxi1 ato de metilo: 31,2 nKat MU/mg proteina.
Cenoura transformada(Exemp1 o 36): Obtiveram-se as seguintes actividades de GUS a partir de amostras de calos transformados por pCIB271 que foi colhido 21 horas após tratamento. Spray H20: 5,2 pKat MU/mg proteina. Spray salicilato de sódio 50 mM:ll,6 pKat MU/mg proteina. Spray 250 /jg/1 de benzo-1,2,3-tiadiazo1e-7-carboxilato de metilo:22,l pKat MU/mg proteina.
Tomate transformado (Exemplo 38): Obtiveram-se as seguintes actividades GUS a partir de amostras de calos transformados que foram colhidos 21 horas após tratamento. Transformado com CIB271: Spray H20:17,2 pKat MU/mg proteina; spray 250 yug/ml de benzo-1,2,3-1iadiazo1e-7-carboxi1 ato de metilo:56,l pKat MU/mg proteina. Transformado com CIB273XA4:Spray H20:4,6 pKat MU/mg proteina ; Spray 250 yug/1 de benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxilato de metilo:22,l pKat MU/mg proteina.
Expressão transitória em protoplastos de tabaco(Exemplo 56) tratados com pCIB269:H20;30,6+13 pKat MU/mg proteina;benzo-1,2,3-1ia diazo 1e-7-carboxi1 a to de meti 1 o : 66,6 + 20 pKat MU/mg proteina.
-162-
EXEMPLO 67 Ensaio para a indução química do gene endógeno
Como processo de ©ntrolo,materiais de plantas do tabaco induzidas como descrito nos Exemplos 62 a 64 pelo ácido salicilico, benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxilato de metilo e TMV foram testados quanto à transcrição de mRNA a partir do gene endógeno PR-la pelos métodos descritos no Exemplo 5. Detectaram-se níveis elevados de mRNA após indução pelos três indutores.
EXEMPLO 68 Ensaio para sequências de DNA quimicamente induziveis:actividade enzimática de aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS)
A. Preparação da amostra para o ensaio AHAS
Determinou-se o peso do material de tecidos das folhas e/ou raiz a ser testado, o tecido foi colocado em azoto líquido e macerou-se para se obter um pó fino. Adicionou-se um volume(em ml) de tampão de homogenização frio (tampão 50 mM NaH2P0^ pH 7,0, 0,5 mM EDTA pH 7,0, 0,5 mM MgC^, 1 mM piruvato de sódio pH 7,0, di nucléotido de flavina e adenina 10 /uM, fluoreto de fenilmeti1su1foni1 o 1 mM, 10% de g1icero1)igua1 a duas vezes o peso(em g) de tecido e a mistura foi transferida para uma célula de prensa Francesa. Todos os passos subsequentes foram efectuados mantendo o material frio (cerca de 4°C).
As células foram rebentadas a 16 000 psi, colhido o exsudado num recipiente em gelo. Como alternativa o tecido foi triturado com tampão de homogenização num almofariz em lugar do tratamento com a célula de prensa Francesa. 0 exsudado foi centrifugado 5 min a 10 000 rpm para remover os detritos celulares. Mediu-se o volume do sobrenadante e
-163adicionou-se sulfato de amónio para enzimas até 25% de saturação (144 mg(NH^ ) 2S0^/m1 de sobrenadante). A mistura foi agitada em gelo durante 15 min, depois centrifugado durante 5 min a 10 000 rpm. 0 sedimento foi rejeitado e o sobrenadante ajustado a 50% de saturação com sulfato de amónio (158 mg (NH^^SO^/ml de sobrenadante). Após agitação em gelo durante 15 min, o sedimento foi colhido por centrifugação a 10 000 rpm durante 5 min. 0 sedimento obtido foi dissolvido em 1 ml de tampão da coluna para cada 2 g de folhas ou 5 g de material de raízes. Removeu-se o sal ao extracto pela aplicação a uma coluna de Sephadex G50 equilibrada com tampão de coluna (tampão NaH^PO^ 50 mM pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgCl2, dinucleotido de flavina e adenina 10 pM, fluoreto de fenilmeti1su 1 foni1 o 1 mM, 10% glicerol). A amostra foi eluida com tampão de coluna, colheu -se 2 ml de amostra por cada ml de amostra aplicada na coluna.
B. Ensaio em tubos
5-50 pl de um extracto preparado de acordo com o Exemplo 68 A foram dissolvidos num volume total de 0,5 ml de mistura de reacção (tampão NaE^PO^ mM pH 7,0, piruvato de sódio 20 mM pH 7,0, pirofosfato de tiamina 0,5 mM, MgCl2 5 mM, dinucleotido de flavina e adenina 10 pM). A mistura foi incubada durante 30 min. a 37°C. A reacção foi parada pela adição de 50 μ 1 de H2S046N. Incubou-se a mistura durante 15 min a 60°C, depois tratou-se com 625 pl do reagente c<-naftol ( 500 pl deoC-naftol a 5% em NaOH 2,5M e 125 pl de creatina a 25 mg/ml) e incubou-se durante mais 15 min a 60°C. No caso de se formar um precipitado este é removido e a absorvância medida a 520 nm.
As pMoles de acetoina formada foram calculadas a partir de uma curva padrão desenvolvida usando 0,4 ug a 10 ug de acetoina. A actividade especifica foi expressa em pKat/mg prote i na.
-164-
C. Ensaio em placas de ELISA
1-20 μ 1 de uma amostra foi colocado num poço de placa de ELISA com um volume total de 0,15 ml de mistura de reacção. A mistura reagiudurante 30 min a 37°C. A reacção foi parada pela adição de 50 μ 1 de H^SO^ 2,4M contendo 1% de creatlna. Incubou-se a mistura durante 30 minutos a 60°C. Qualquer precipitado presente foi separado por centrifugação. 150 p1 da mistura de ensaio foram transferidos para uma nova placa de ELISA, tratados com 100 μ 1 de c4-naftol a 10% em 5M NaOH e incubado durante mais 20 minutos a 60°C. Mediu-se a absorvância a 520 nm e expressou-se a actividade especifica como no Exemplo 68B.
EXEMPLO 69 Ensaio para sequências de DNA quimicamente induziveis:endotoxina de to i 11 us thur i ng iens i s
A. Processo de extracção de plantas
Cerca de 100 mg de tecido vegetal foi homogenizado em 0,1 ml de tampão de extracção (50 mM Na2C03 pH 9,5, 10 mM EDTA, 0,05% de Triton X-100, 0,05% Tween, 100 mM NaCl, fluoreto de fen1lmeti 1 su 1 foni 1 o 1 mM (adicionado imediatamente antes de usar) e leupeptlna 1 mM (adicionado imediatamente antes de usar).Após extracção adicionou-se 2M Tris pH 7,0 para ajustar o pH a 8,0-8,5. 0 extracto foi então centrifugado 10 minutos numa minicentrifuga Beckman e o sobrenadante usado para aná 1 Ise de ELISA.
-165-
B. ELISA
Pré-tratou-se uma placa de ELISA com etanol.Adicionou-se â placa anti-soro de coelho anti-BT purificado por afinidade (50 μ 1) numa concentração de 3 jug/ml em tampão borato salino (ácido bórico 100 mM, borato de sódio 25 mM, NaCl 75 mM, pH 8,4-8,5) e deixou-se a incubar durante a noite a 4°C. 0 anti-soro foi induzido por imunização de coelhos com cristais de BT (endotoxina de Bacillus thuringiensis) purificados por gradiente /An g, B.J. & Nickerson, K. W., Appl. Environ.Mícrobio 1 .36, 625-626 (1978)7 so1ubi1izados em dodeci1su1fato de sódio. A placa foi lavada com tampão de lavagem (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,05% Tween 20, 0,02% de azida de sódio), depois tratado 1 hora à temperatura ambiente com tampão de bloqueamento (tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4, 140 mM NaCl;l% de albumina do soro bovina, 0,02% de azida de sódio) e novamentelavada. Adicionou-se extracto vegetal numa quantidade para dar 50 |jg de proteína (tipicamente cerca de 5 /jl de extracto;determinou-se a proteína pelo método de Bradford,
Μ. , Anal. Biochem. 72 , 248 ( 1976 ) usando um Kit comercial da Bio-Rad) e incubou-se durante a noite a 4°C. Após lavagem, adicionou-se 50 μΐ de anti-soro de cabra antí-BT purificado por afinidade numa concentração de 3 pg/ml de proteína em diluente de ELISA(tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1% de albumina do soro bovina, 0,02% de azida de sódio) e isto ficou a incubar durante 1 hora a 37°C.Após lavagem,, adicionou-se 50 ul de anticorpo de coelho anti-cabra ligado a fosfatase alcalina (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo., USA) diluído a 1:500 em diluente de ELISA e deixou-se a incubar durante 1 hora a 37°C. Após lavagem, adicionou-se 50 pl de substracto (0,6 mg/ml de fosfato de p-nitrofeni1 o, 0,05 mg/ml MgC1,
10% dietano1amina, pH 9,8 ajustado com HC1) e deixou-se a incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.A reacção
-166-
foi parada pela adição de 50 /j! de NaOH 3M. Leu-se a absorvância a 405 nm num leitorcfe ELISA modificado (Hewlet Packard , Stanford, Ca., USA).

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇOES
    1-. - Processo para a preparação de uma sequencia de DNA não codificadora capaz de regular a transcrição de DNA que lhe esteja associada, cuja regulação está dependente de um regulador químico, a partir de um gene quimicamente regulável num sistema natural contendo aquele gene, caracterizado por compreender os passos de:
    (a) activação da expressão no referido sistema de RNA a partir do gene quimicamente regulável;
    (b) isolamento do referido RNA;
    (c) despiste diferencial de uma biblioteca genómica relativamente a RNA obtido a partir do RNA isolado do referido sistema activado assim como RNA gerado a partir de RNA isolado de um sistema testemunha que não é activado.
    (d) isolamento de um clone genómico;
    (e) subclonagem do gene quimicamente regulável a partir do referido clone genómico;e (f) isolamento da sequencia pretendida de DNA quimicamente regu1á ve 1.
    2?. - Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido sistema é uma planta ou um tecido vegetal, caracterizado por compreender os passos de :
    -168- (a) activação da expressão na referida planta de RNA poliA+ do gene regulável quimicamente;
    (b) isolamento do referido RNA poliA+;
    (c) construção de uma biblioteca de cDNA a partir do referido RNA po1iA+;
    (d) despiste diferencial da referida biblioteca de cDNA com cDNA gerado a partir de RNA numa planta testemunha que não é act i vada;
    (e) isolamento de clones de cDNA que são quimicarente reguláveis;
    (f) isolamento de um clone genómico a partir de uma biblioteca genómica da referida planta usando como sonda o clone de cDNA do passo (e);
    (g) subclonagem do gene quimicamente regulável a partir do referido clone genómico, e (h) isolamento da sequencia pretendida de DNA regulável qu im i camente.
    33. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a sequência de DNA não codificadora ser substancialmente pura.
    43. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a sequência de DNA que lhe está associada ser uma sequência codificadora.
    -169-
    5?. - Processo de acordo com qualquer ura das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a referida regulação estar dependente de um regulador químico indutor.
    63. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequencia de DNA não codificadora ser, ou ter uma homologia de sequências substancial com uma sequencia de DNA não codificadora quimicamente regulável que é parte de um gene natural quimicamente regulável.
    75. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o referido gene quimicamente regulável ser um gene da proteína PR.
    8^. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene PR-la, Pr-lb, Pr-lc, Pr-1 1 , PR-Q ou PR-R do tabaco, um gene da quitinase de pepino ou um gene de B-1,3-g1ucanase básica ou ácida do tabaco.
    95. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene de PR-la, Pr-lb, Pr-lc, Pr-1' ou PR-R do tabaco ou um gene da quitinase de pepino.
    10?. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene PR-la do tabaco.
    11?. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene PR-1' do tabaco.
    -17012?. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene da β-1,3-g1ucanase básica do tabaco.
    13?. - Processo DNA de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida sequencia de DNA quimicamente regulável estar situada na região delimitan te 5' do referido gene da proteína PR.
    14â. _ Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida transcrição ser regulada por um regulador seleccionado do grupo constituído por ácido benzoico, ácido salicil ico, ácido acetilsalicilico, ácido poliacrilico e seus derivados substituídos.
    153. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida transcrição ser regulada por um regulador seleccionado do grupo constituído por ácido benzo-1,2,3,-tiadiazolecarboxi1ico, ácido benzo-1 ,2,3-tiadiazoletiocarboxilico, cianobenzo-1,2,3-tiadiazole, amido do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazolecarboxi1ico e seus der i vados.
    16?. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por a referida transcrição ser regulada por benzo-1 , 2,3-t i ad i azo 1 e-7-carbox i 1 a to de meti 1 o.
    17?. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida transcrição ser regulada pelo ácido dic 1 oroisonicotinico.
    -171183. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida sequencia de DNA compreender uma primeira sequencia de DNA componente que é, ou possui homologia de sequências substancial com, uma sequencia de DNA não codificadora regulável quimicamente de um gene natural regulável quimicamente, sendo esta primeira sequencia componente capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA associada numa planta ou tecido vegetal,em que esta regulação está dependente de um regulador químico e uma segunda sequencia de DNA componente que ê, ou possui substancial homologia de sequências com, parte mas não toda a sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita com a qual o primeiro componente é associado no gene natural quimicamente regu1áve1.
    193. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a sequencia de DNA ser substancialmente pura.
    203. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido gene natural quimicamente regulável ocorrer numa planta e a referida segunda sequencia de DNA componente ser uma sequencia codif| cadora.
    213. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido gene ser um gene da proteína PR.
    22â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a sequencia codificadora codificar um peptideo sinal.
    172 <?G q I o í · < ,7
    23*. - Processo para a preparação de uma sequência de DNA quimérica, quimicamente regulável, compreendendo uma primeira sequência de DNA, componente não codificadora e quimicamente regulável, a qual pode ser obtida por um processo de acordo com a reivindicação 1, que é capaz de regular a transcrição de uma sequência de DNA que lhe esteja associada numa planta ou tecido vegetal, em que esta regulação está dependente de um regulador químico e uma segunda sequência de DNA componente capaz de ser transcrita numa planta ou tecido vegetal, caracterizado por se proceder à ligação, de uma maneira operável, das sequências de DNA componente.
    24®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida segunda sequência de DNA componente ser capaz de regular a expressão de uma característica fenotípica por um mecanismo anti-sentido.
    25®. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida segunda sequência de DNA componente ser uma sequância codificadora que é capaz de ser transcrita e traduzida para produzir um polipeptídeo resultante numa característica fenotípica.
    26®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida segunda sequência de DNA componente ser adjacente à primeira sequência componente.
    27®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida primeira sequência de DNA componente ser regulada por um regulador químico repressor.
    -173-
    28â. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser regulada por um regulador quimico indutor.
    29?. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser, ou possuir substancial homologia de sequencías com uma sequencia de DNA quimicamente regulável num gene natural quimicamente regulável de uma planta.
    303. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser, ou possuir substancial homologia de sequencías com, uma sequencia de DNA quimicamente regulável num gene natural quimicamente regulável de uma planta e a referida segunda sequencia de DNA componente ser uma sequencia codificadora que pode ser transcrita e traduzida para produzir um polipeptideo resultando numa caracteristica fenotipica.
    31k - Prooesso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida segunda sequencia de DNA componente ser adjacente à referida primeira sequencia de DNA codificadora.
    32?. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser regulada por um regulador quimico indutor.
    -174335. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser, ou ter substancial homologia de sequências com a sequencia DNA quimicamente induzível num gene da proteína PR.
    345. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-Q ou PR-R do tabaco, um gene da quitinase de pepino ou um gene da p- 1 ,3-g1ucanase básica ou ácida do tabaco.
    35?. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ ou PR-R do tabaco ou um gene da quitinase de pepino.
    363. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido gene da protej_ na PR ser um gene PR-la ou PR-Γ do tabaco.
    37- . - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o referido gene da proteína PR ser um gene da p-1,3-g1ucanase básica do tabaco.
    38- . - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser a região delimitante 5' do gene PR-la do tabaco e conter cerca de 300 ou mais pares de bases adjacentes ao sitio de iniciação da transcrição.
    39- . - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente conter entre cerca de 600 e 1000 pa
    -175- res de bases adjacentes ao sitio de iniciação da transcrição .
    40?. - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por a segunda sequencia de DNA componente codificar uma caracteristica fenotipica.
    41?. - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por a referida caracteristica fenotipica ser seleccionada do grupo constituído por tolerância ou resistência a um herbicida, fungo, virus,bactéria, insecto, nemãtodo ou aracnidio ;produção de metabolitos secundários;esteri1 idade de macho ou fêmea;e produção de uma enzima ou outro composto marcador.
    423. - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida caracteristica fenotipica ser tolerância ou resistência a herbicidas ou resistência a insectos.
    433. - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por a referida tolerância ou resistência a herbicidas ser provocada por uma sequencia de DNA codificadora de acetato-hidroxiácido sintetase (AHAS) selvagem ou resistente a herbicidas.
    44?. - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por a referida resistência a insectos ser provocada por uma sequencia de DNA codificadora da endotoxina de Bacillus thuringiiensis (BT).
    -176-
    45- . - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida caracteristi ca fenotipica ser um composto marcador seleccionado do grupo constituído por luciferase (LUX), c1oranfenico1-aceti1 transferase (CAT), neomicina-fosfotransferase (NPT), nopa1ina-sintetase (NOS), octopina-sintetase (OCS), beta-1,3-g1ucuronidase (GUS), acetato-hidroxiácido-sintetase (AHAS) e endotoxina de Bacillus thur i ng iens i s (BT).
    46- . - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida caracteristi ca fenotipica ser um composto marcador seleccionado do grupo constituído por beta-1,3-g1ucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido sintetase (AHAS) e endotoxina de Bacillus thuringiensis (BT).
    47- . - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por a referida primeira sequencia de DNA componente ser regulada por um regulador químico indutor de genes da proteína PR em plantas.
    48-. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador químico ser seleccionado do grupo constituído por ácido benzoico, ácido salicilico, ácido aceti1sa1ic 11ico , ácido poliacri1ico e seus derivados substituídos.
    49ê. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador químico ser seleccionado do grupo constituído por ácido benzo-1,2,3 -tiadiazo 1 etiocarboxi1ico, ácido benzo-1 , 2,3-tiadiazo 1 etiocarboxilico. cianobenzo-1,2,3-tiadiazo 1e, amida do ácido benzo-1 ,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico e seus derivados.
    50a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador quimico ser seleccionado do grupo constituído por ácido benzo-1,2, 3-tiadiazole-7-carboxi1ico, ácido benzo-1, 2,3-tiadiazo 1e-7-tiocarboxi1ico, 7-cianobenzo-1,2,3-tiadiazole , amida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1ico , hidrazida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-5-carboxi1ico e seus derivados .
    51a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador quimico ser seleccionado do grupo constituído por ácido benzo-1,2,3 -tiadiazole carboxilico, benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1 ato de alquilo em que o grupo alquilo contem um a seis átomos de carbono e derivados substituídos destes compostos.
    52a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador quimico ser o ácido dic1 oroisonicotinico ou um seu derivado.
    53a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador quimico ser seleccionado do grupo constituído por ácido benzo-1,2,3 -tiadiazole-7-carboxilico, benzo-1,2,3-tiadiazole-7-carboxilato de metilo, benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxi1 ato de n-propilo, benzo-1,2,3-tiadiazo 1e-7-carboxi1 ato de benzilo, sec-buti1-hidrazida do ácido benzo-1,2,3-1iadiazo 1e-7-carboxilico, ácido 2,6-dic1 oroisonicotinico e 2,6-dicloroisonicotinato de meti 1 o.
    54a. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o regulador quimico ser benzo-1 , 2,3-t i ad i azo 1 e-7-ca rbox i 1 ato denetilo.
    -178-
    55?. - Processo de acordo com a reivindicação 23, para a preparação de uma sequencia de DNA quimérica, quimicamente regulável, que compreende uma primeira sequencia de DNA componente que é, ou possui substancial homologia de sequências com, uma sequencia de DNA não codificadora, quimicamente regulável de um gene natural quimicamente regulável, sendo esta primeira sequencia de DNA componente capaz de regular a transcrição de uma sequencia de DNA que lhe esteja associada numa planta ou tecido vegetal, em cpe esta regulação está dependente de um regulador químico, uma segunda sequencia de DNA componente que é, ou possui substancial homologia de sequencia com, parte mas não a totalidade de uma sequencia de DNA susceptivel de ser transcrita com o qual o primeiro componente está associado no gene natural quimicamente regulável e uma terceira sequencia de DNA componente capaz e ser transcrita numa planta ou tecido vegetal, caracterizado por se proceder à ligação, de uma maneira operável, concorrentemente ou consecutivamente, das sequências de DNA componente.
    56-. - Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a primeira sequencia de DNA componente ser, ou possuir substancial homologia de sequencia com, a sequencia de DNA quimicamente induzivel num gene da proteína PR.
    57?. - Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a segunda sequencia de DNA componente codificar um peptideo sinal.
    58-. - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado por uma sequnda sequencia de DNA componente codificar um peptideo que é, ou possui substancial homologia de sequências com, o pqtideo sinal de um gene de proteína PR.
    59â. - Processo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por a segunda sequencia de DNA componente codificar um peptideo tendo a sequencia de aminoácidos :
    Met Gli Fen Vai Leu Fen Ser Gin Leu Pro Ser Fen Leu Leu Vai
    Ser Tre Leu Leu Fen Leu Vai Ile Ser His Ser Cis Arg Ala ou um peptideo tendo substancial homologia de sequências com este peptideo.
    60â.. - Processo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado por o gene da proteína PR ser o gene PR-la.
    615. - Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a terceira sequencia de DNA componente codificar uma caracteristica fenotipica.
    62^. - Vector caracterizado por compreender a sequencia de DNA não codificadora da reivindicação 1.
    63-. - Vector de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por compreender a sequencia de DNA quimérica da reivindicação 23.
    643. - Vector de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por ser funcional em células vegetais ou em Agrobacterium.
    180
    65a. - E. Coll HB101/pTJS75-km, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 67628, depositado em 12 de Fevereiro de 1988.
    66a. - Plasmideo pBS-PR1013Cla, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40426, depositado em 12 de Fevereiro de 1988.
    67a. - Plasmideo pBS-PR1019, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40437, depositado em 12 de Fevereiro de 1988.
    68a. - Plasmideo pBS-Glu39.1, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40526, depositado em 29 de Dezembro de 1988.
    69a. - Plasmideo pBS-Gluc.39.3, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40527, depositado em 29 de Dezembro de 1988.
    70a. - Plasmideo pBScucchi/quitinase, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40528, depositado em 29 de Dezembro de 1988.
    71a. - Plasmideo pBSGLõe, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por apresentar o ATCC número 40535, depositado em 18 de Janeiro de 1989.
    -18172?. - Tecido vegetal ou semente, caracterizado por conter a sequencia de DNA quimérica da reivindicação 23.
    73?. - Processo para a preparação de uma planta caracterizado por se incorporar na referida planta a sequencia de DNA quimérica da reivindicação 23.
    745. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA substancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na Sequencia 1 ou tendo substancial homologia de sequências com a sequencia mostrada na Sequencia 1, a seguir apresentada:
    182
    10 30 50 70 90 110
    CTO&AúGATTTCAAAGTCTAúCrTCACTAAAACTTGACCTTTCTTTTCCACTAATCTC&AAAAAiCGAAATAAACATAAJCCTATTTAGAAAAAATAAAAAAATACTCGATTTCAATCTAAA no i$o no no no no
    CTCAACTCG7'GATT(XGA7AA£AAAATA£AAAT,TTAJT7ATA€TCCA£ATCAACCCGTCATTGâAA71GA£ATAAXJAAAA>^TA?CATAGTA‘CATGA£TAACA?CAA£T’TGGAAATTlUk£
    250 270 290 310 310 350
    CGAACGAJUkTTW^UlAAAQAACTCAJWiAATATCCAAATATTCTrrACCTCCAAATTTCATAÍTrATTrAACCTOkTCCA^TGAClXCCATCTTCAA^TTrrCCACAAATArrCACAAAA
    320 390 410 430 430 470
    CAAACAACAA^ACACAAAL 1Ό11.11 IV^TATTATTATAL· llilltCllll AGAaAATTCA7TCTACATATAA^AAATATAATATAA&A7T7KLAAATAACATTA7TlMGAAAAATCAAACA
    490 310 510 530 570 340
    TCAAAfiTA7TTA7TTTAAA7TCTT7TTCCAATGCACATrCCCATTCT&AAAAAAAAâACATATAAATATCi&AACTAAAAAT7M<TCAAATCC7*7AAA7X7AGAAAA7A7TAATTAACACA <10 <10 <50 <70 <90 710
    TTAACCA7AACCKCTCTACTTrATTTAACAAAAACCACATCT^TAOaOUUUUU^TCTrrAACnCATCaiTTlÍA£AArrTAAAATTArrrrcCAJU>TCO<XrrAJU<ACrATTrTA1CA
    730 750 770 790 <10 <30
    ACAJaTOCTAJU7rCO^TAJATAACTTTAATATCCTAACCTACAAAATAÚCATAAArrATCrATAACAâCATATArTACATTCATATTACCATCTCAJUU<AAr7TACTAACTACATCAATA <50 <70 «0 410 930 950 . ......
    ATOXOCTCAAATCTTCAA1UU irCICCTATAAATACCCTTCCTAgTAAATCTACI 111 KCAJTCAACATACAACA.lTTCTCCTATACTCATCCCAmCnCTCTl'1'1CACAATTCCC ft»tGlyFh»V<lL«uFh»S«cClívLeuFf
    970 990 1010 1030 1030 1070 rrCATTTCrrcTTCTCTCrAakCTTCTCTTATTCCTACTAATATCCCA£TCTTT^OCWCCCAA1AATTCTCAACAACACTATTTGCATCCCakTAACACACCTCCTCOu^TCTAfiCTCT ·4·ΓΡΚ·ϋ·Μ^·Μν·ΐ5·Γ7ΗΠ-·Μυ·υ1-·ΜΡΚ·ΐΑ«ν·1Σ1·ί«ΓΗΐ·<«Γ0γ»ΑΓ4Αΐ·β1ηΑβΛ5·ί01ί»0ΐΛΑΛρΤγϊ LeuA^pAleMl*A*nThcAj*Ar4AlaAapV«lClyV·
    1040 1110 1130 1130 1170 1190
    ACAACCrrrCACCTtXX^CCACCACCTAMCACCCTATíXXCAAAATTATCCrrCeCAATnXCTCCACATTtrrAArCTCTrrA^TTCTCATOCTCAATACCCCUAAAACCrAúCnyuiOC lCluPreLauTTirTrpAapAapClnValAl &Λΐ·7γι AJ«ClrU<anTy rAJ*S«rClnL«uAlaXl «A«pcy·MnUuV» lHiaS«rHl«ClyGlnTy rG ly<luA«nL»uXl«CltfOl mo mo 1230 1370 1290 mo
    AACTXíGOCATTTCATCÀC(^CT&CTAJ*^C7CTTG^ATGTGGCTCCAJ'G>£AAACACTA7TATGACCATCaCTCAAA'TACT'T,CTGCAGAAGCACa£CT'G7CTG«ÍACACTA7ACTCAGCT yS«rC ly Α·ρΡΛ·Λ· t TTi t AJ *Jtl *Ly AJ · V· 1G1 tT rpv· LA*pC l uLy aCinTy rTy r Aa pMl · Aa pi· r A-anTTi r Cy · AJ *C 1 hC 1 y< InV* i Cy »ClyM i «Ty rThrCl nVa mo mo Π70 1390 1410 mo
    IValTrpArgAarLSarVaLArgVaiGlyCyaAlaJsjijValcinCyeAarUkanGlyÇiyTyrValValSarCyeAanTY» AapProProGlyAanTy rAt qClyGlu^ar PreTyr Cnd
    1450 1470 1490 1310 1530 1350
    CAAAC&ACCTAOnrCAT7TCACC7TAATA7CTA7OCA7TVrrCTGC7TGA7AJCAACAACTTAAATAAr7,CCTCTAAAAACCAACT7AAAflTCAAC7ATA7ACTAA7ACTAC7ATA3T7
    207
    1370 1590 K10 1430 1450 1470 |
    CTAATCCrCTCUlACTCCATrrATAJUUL^COUUrnXTCATAArrAXXCCAAAAAXATCACTTOlTCATOrfXTrCATCrKTCATCn^TATTATTATCAAOkCTTTOTACrCAJAC
    313
    1690 1710| 1730 1150 1170 1790
    GAUk7CATCTG7TGAIOCTCTAíXqAÍ?rrG<T^7AyTACGAMCAAAATT,CT7AAC7ACA7,OCCTTAGGAAGAAMC7'7AXACAG7T'CA7AT AAXCTAC7ArflA.3CGCCAAAAA£lATGAAAA37
    1110 11)0 1150 1970 l<90 1910
    ACCAAT77ACATCCTAú(lAGCA7A7TGAAASTGCAôCAâC7ACTTTTAATAAfTCACCC7TACTCTTAAAiATTCAOGCTA7AAAAA7A7TTACATAATCM3>CTCATT7ATAAG>C7AA7TA
    19)0 1950 1970 1990 2010 2030
    TAO9TAAA7A7T7ATCACQAAXTCTCAATAaTAATC7CAJU<AA.AAATTC7AACTAACGrAiTTAfACTAAAACTACTAXAATAâOTTAâATTACAJTAAXGAT?TCATTA£AAGATCTT
    -183
    75^. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA substancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na Sequencia 2 ou tendo substancial homologia de sequências com a sequencia mostrada na Sequencia 2, a seguir apresentada:
    10 30 50 70 90 llú
    TTACTGTTAA/GTATTCGTACTCCTACATATTTCAAAAATTAÍiATtóCCATTTTATCATCTAATCAACTATtóATCTAA^TCCAAAATATACCnOiGTATAGATTTTTA
    130 159 170 190 210
    CTrACCAGCCTTTCATCTTCTTCCAGAAATAAJiACTGGAAATGAACGGTAGCAGATAACGITCACATATGATCTTGTACTAATTGACACCTAACGGCACPCCTrTCCTTT
  2. 2)0 250 270 290 310 230
    AAAATATAí^CCATAATATCACTTATAAC<^TCCTrrCACrrrCTAArrAAACCATATTCT^rrCOCTTTTATA^AATTTCATACAACTrA&ACAOCATCCCrCCAATT
    350 no 390 410 <30
    GAACAOCTTdATTACTCAACTTCCCCTCrACTTAAACAAATTCAACTCTmrCCCCTACTATATTTATCTTAAAATACACTOCTAATAATCTATAAAACTATATCTATG <50 <70 <90 510 510 550
    TATATAATKTAACTTC^TCATTTATCAAACrrCCTCAAArrATCATCATGCCrATAATACTTCTTCATCAATACATACAArri 1 ΓΊAATGGCGCG1 Π M 1'ICI l 1‘AAC
    570 590 610 *10 650
    OAATATGATCTAA(XTTCTITGAATTAACCCAGCrATAATTTTATACTATTCTTrrCAAATATGGCTAAACAiGrrTCCTAACAAGTTGCAAA0TTTCTAACTCAGCTATA
    670 690 710 730 750 770
    TrCTrCCCTATAJUkAATCATCCTTACTATCCTTTCTTTCTCACCAAAACACAAAAATGCCATTCTTAACAACAATACTTCCTTCTTTCATTACCTTTCCAATATTAATTC R«CGlyPh«L*uThrThrIl·ν«1AJ aCy«PhallaThr Ph*Al«XlaLaullaH
    790 610 630 <50 <70
    KnOVTCCAAAGCTCAAAACTCCCCCCAAGATTATCTTAACCCTC>CAATCCtóCrCCTACACAACTTGCTGTTGGCCCCATCACATGfiGACAATACCCTACCACCCrAT ie9«r3«t(.yeAlaGlnlAanSerFroGlftAjpTy<’L«uAaftProWleA«nAl*JUAAr9Ar9GlnVelGlyVAlClyPron«tThraTrpA«pAdrtArgLauAl<Al«TYr <90 910 930 950 970 990
    OCCCAAAATTATQCCAATCAAAâOAATTGGTGACPGCOOCATGATCCACTCTCATOÔCCCTTAC&GCGAAAAGCTACCCGCCOCCTTCCCTCAACTTAACGCTGCTGCTOC AlaOlnAanTyrAlaxanOlnArgl lwdlyAjpCy iQlyHat Il«HlaS«rHlaGly ProTyTGlyGluAanLauAlaAlaxlaPhaPr oGlnLauAanAlaAlaOlyAl
    1010 10)0 1050 1070 1090
    TGTAÂJUU<TGTCGGTCUATGAGAAGCGTTTCrATCA7TACAA3TCAAATTCTrGTGTAGCAGCACTATCTCGACACTATACTCAGCTCGTGTGCCCTAACrCAGTACGTC • ValLyeMatTrpValAipGluLysArgPhaTy rAapTyTAJrkSarA>nSat«^»ValGlyClyV«lCy«GlyHl*TyrThrGlnValValTf pArgAenSarValArgt
    1110 11)0 1150 1170 1190 1210
    TCX^TTCTOCT^^^TTCGA^XlAAOJiXGGTTGGTTTTTCÀTAACTTGCAATTAIGATCCACGAGGTAATTTTATAGGAGAAtXTCCCTTTGCCGATCTTC/JSCACCÀÀ •uGlyCyeAlaArgValÀcgSerAanAanGlyTrpPhePh· t l«ThtCy»Ajr»TyrA*pProProClyAanPhaHaGlyClnArqProPhaGlyA*pLauGiuGluGin
    12)0 1250 1270 1290 1310 (XCTrnykTTCCAAATTGGAACrrCCAACTGATCTCTAATGAGTtXUuXTACATGAACAAArrATCATGAATAAA^iAAAATAAAATGCAGTCCrATGCTATCTGATTTT ProPhaAapSarLyeLauOluLeuProThrAapValtnú
    -184-
    1))0 1350 1370 1390 1410 1430 juxrrrccouirroaKTAATAATCTCATQrrCTtóTAJkCTWiçra^TCTTTetUkCCcrxccrTsCATCTTarrAt^-iccAATCACTTrATATATCACTTTTCTCTTCccr
    1450 1470 1490 1510 15)0
    XKTCTTATmTATTAAAATCTrATTCTACTTTTACACTmTTATTOCCAJCTA.TATCTCTArCOCTCCAAATTI'CArO6ACCAClCACCTATGACGACTACAACAAACGA
    USO 1570 1590 1410 1430 1450
    CCOeCIACtTrTa^TaXCCTCCCAAGtXJUUkCTJlCCCrAÍX^C&AAAÍ^CM^CTSTATCACTCTTCTACTACTCTAACCCCATTAOOGAACATTAACAATATTCCC
    1470 1490 1710 1730 1750 <XCAATACTAATTCTATrr«nTTCTrACAATTTOyuw3<XTTTCTCrCTACTATATAAA<XMGACAAAAAACCrTCTAfc5TCCCCCTCCATACTCrCAlAACCTTACrA
    1710 1790 1410 »30 1150 lno
    ATCTTCGATCAAAAílAAAAACTCTCTTCTCTTTATCrATTATTATTCTA41A0ATTA7TATCTTCACCTACGATTTACCCCTTCATCmGA7TCA7TTCTTCAAAAASGT
    1)90 1910 19)0 1950 1970
    TTTAJWZATCTTTT&ACTCAAACAATTTGGOÍCOOTCTATCKlCCATTTCTATAGCTCiAAATCATACTrCTCATCTAJiATTTCTGAAGTGATAATTACTTTTCTTCAAACCT
    1990 3010 3030 3050 3070 }090
    CKTAAAAATCAAHAATOGCSíJGAAAfiCAACTGAAOCTAAACCOjGTASAGATCCTCTCCAATAACTCCTCAACTCCCTCAACCAACACCíXJbClACAAGACAATCA&AAJA
    76-. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA substancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na 'Sequencia 3 outendo substancial homologia de sequências com a sequen cia mostrada na Sequencia 3, 3 seguir apresentada-
    -185- ίο 30 50 70 90 jj^agaaagctcittaagcaatggctgcccacaaaataactacaaccctttccatcttcttcctcctttcctctattttccgctcttccgacgogcctgga
    HAAHKITTTLSirFLLSSIFRSSDAAG
    110 130 150 170 190
    ATCGCCATCTATTGGGGTCAAAACGGCAACGAGGGCTCTCTTCCATCCACCTGCGCAACTGGAAACTACGAGTTCGTCAACATAGCATTTCTCTCATCCT 1AIYWGQNGNCGSLASTCATGNY C T V N I A Γ L S S T
    210 230 250 270 290 ttggcagcggtcaagctccagttctcaaccttgctggtcactgcaaccctcacaacaacggttgcgcttttitgagcgacciaaataaactcttccaaaag
    CSCQAPVLNLAGHCWPDNMGCAFLSDCINSCKS
    310 330 350 370 390
    TCAAAATCTCAAGCTCCTCCTCTCTATCGGTGCTGGCGCGGGGAGTrArrCACTCTCCTCCGCCGACGATGCGAAACAAGTCGCAAACTTCATrTGGAAC
    QNVKVLLSIGGGACSYSLSSADDAKQVANriWN
    410 430 450 470 490
    JU3CTACCTTGGOGGCCAGTCGGATTCCAGGCCACTTGGCGCTGCGGTTTTGGATGGCGTTGATTTCGATATCGAGTCPGGCTCGGGCCAGTTCTG<ÍGAO3
    SYLGGQSOSRPLGAAVLDGVDrOIESGSGQrWDV
    510 530 550 570 590
    TACTAGCTCAGGAGCTAAAGAATrrrGGACAAGTCATTTTATCTGCCGCCCCGCAGTGTCCAATACCACACGCTCACCTAGACGCCGCGATCAAAACTGG LAQELKNTGQVI LSAAPQCPI PDAH L D A A I KTG
    410 630 650 670 690
    ACTGTrCCATTCCGTTTGGGTTCAATTCTACAACAACCCGCCATGCATCTTPGCAGATAACGCGGACAATCrCCTGAGTTCATGGAATCAGTCGACGGCG
    LFDSVWVQFYNNPPCHFADNADNLLSSWNQWTA
    710 730 750 770 790
    TTTCCGACATQGAAGCTTTACATGGGATTCCCAGOGGClACGGGAGGCAGCGCCGAGCGGGGGATTTATTCCGGCGGATGTCCTTArTTCTCAAGTTCTTC
    F.PTSKLYMCLPAAREAAPSOOFXPADVLISQVLP •10 030 650 670 690 caacgattaaagcttcttccaactatgcaggagtgatgttatogagtaaggcgtttgacaatggctacagogattccattaaaggcagcatccgctcaag
    TIKASSNYGGVMLWSKAFONGYSDSIKGSIG·
    910 930 950 970 990
    GAAGCTCCTAAGTTTAATTTTAATTAAAGCTATGAATAAACTCCAAACTATTATAATAATTAAAAAGTGAGACrTCAÍCTrCTCCATTTAGTCTCATATT
    1010 1030 1050 1070 1090
    AAATTAGTGTGATCCAAXAATTAATATCClTTTTTTCA7TACTATACTACCAATGTTTTAGAA3TGAAAAGTrGATGTCAATAAAAACATTCCAW3TTTA
    TTT *
    -186-
    77-. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA subs tancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na Sequência 4 ou tendo substancial homologia de sequências com a sequencia mostrada na Sequencia 4, a seguir apresentada
    1 AAAAAGAAAA AAAAAATGAA CTTCCTCAAA AGCTTCCCCT TTTTTGCCTT 51 CCTTTATTTT GGCCAATACT TTGTAGCTGT TACTCATGCT GCCACTTTTG 101 ACATTGTCAA CAAATGCACC TACACAGTCT GGGCCGCGGC CTCTCCAGGT 151 GGAGGCAGGC GGCTCGACTC AGGCCAATCT TGGAGCATTA ATGTGAACCC 201 AGGAACAGTC CAGGCTCGCA TTTGGGGTCG AACCAATTGC AACTTCGATG 251 GCAGTGGCCG AGGTAATTGT GAGACTGGAG ACTGTAACGG GATGTTAGAG 301 TGTCAAGGCT ATGGAAAAGC ACCTAACACT TTAGCTGAAT TTGCACTTAA 351 TCAACCCAAT CAGGACTTTG TCGACATCTC TCTTGTTGAT GGATTTAACA 401 TCCCCATGGA ATTCAGCCCG ACCAATGGAG GATGTCGTAA TCTCAGATGC 451 ACAGCACCTA TTAACGAACA ATGCCCAGCA CAGTTGAAAA CACAAGGTGG 501 ATGTAACAAC CCATGTACTG TGATAAAAAC CAATGAATAT TGTTGTACAA 551 ATGGGCCTGG ATCATGTGGG CCTACTGATT TGTCGAGATT TTTTAAGGAA 601 AGATGCCCTG ATGCTTATAG TTATCCACAG GATGATCCAA CCAGTTTGTT 651 TACGTGTCCT TCTGGTACTA ATTACAGGGT TGTCTTCTGC CCTTGAAATT 701 GAAGCCTGCA AAATTATGAC TATGTAATTT GTAGTTTCAA ATATATAAGC 751 TACACAAGTA GTACTAAGCA CTATTAAATA AAAAAGAGAG TGACAAAGAG Θ01 GAGAGGCTGT GGGTCAGATT CTCTTGTTCG CTCTTGTCGT TGTTGTAGCA 851 TTCTGGTTTT AAGAAATAAA GAAGATATAT ATCTGCTAAA TTATTAAATG
    -187-
    78-. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA substancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na Sequencia 5 ou tendo substancial homologia de sequências com a sequencia mostrada na Sequência 5, a seguir apresentada :
    -188-
    1 GAGCTCCTCT AGGGGGCCAA GGCAAACCTT TTTGCTAATG GGAAAAAAAT 51 ATTAGACCAA GAGTTTGTAA TAGCTACTCA ATTTCAATTT ACAAAGGGGA 101 AAATTTAACT GTTTTGCCCT TATATCTTTT GGTCCCGAAA CATAAAATAT 151 CCCATCCGAA ATTCCAAATG GTCCATTATC GGCAAGTAGC TTTCTTTTAT 201 TATAGTTAGT TGACAAAACA CTATCGAGAT ATCATTAGTA TAATAATAAC 251 TTCAAAGTCC ATCTTCTTAG CTGCCTCCTC ATTAGAGCCG CCACTAAAAT 301 AAGACCGATC AAATAAAAGC CGCCATTAAA ATAATGAATT TTAGGACTCT 351 CAATTGTCAC GTAAGTGCCA AAACTCTTCC AATACTTTGC TGCAACTTGG 401 GGCTGCTAGC TTCTGAGCTT CCTGGGATAT TTCTATGTTT ATCTCTTAAT 451 TTACATCTCA ACTAATATCA AGAAATTAAA CAGGTGCAGC AAATCATAAA 501 ATTTTCCTCT AAAGAAGAAA ATGACTCCGG TTACTGATTC ATTGGCCTTT 551 TCAGAGTCTG CGTGCCATAT TCACTAATGG GTCGTTTGGT ACAAGAAATA 601 ATGATAATAA TTTCGAAATA GAATTTGGGA TTTCATTTAT TTCATATTTA 651 ATTATAAATA TTAGCTAATT TCGAAATAAA TTTTACATTA AAATAGTGAA 701 ATCAACTATC TCATATATAA GGTGGAATAG CTAATCTCAT AGCCACCTCA 751 GTTAGAATCC AGTTTCCTCT AATAAATGCA GCGAAATATT AGAAGACTTT 801 CATTAAATCA ATTCATATAA TTTAAAAATA CTAGACATGG AAAAAAAAAA 851 CGATTCGAGA CTGTTATGGA AGGCGTTGCC TTCGATGTAG ATTCTCATCC 901 ATTGCTTTCG TGCAATAGCA ATATGACATC TTATTCTTAG AACTACTTTT 951 AAATGAAAGT CATATAGAAC TTTAAAATCT CTCAACTAGT TTTAAGGGAA 1001 TTCAAAATAC GACCAATATT TATTACTTAC TTATGGATAA ATTTAAATAA 1051 TATGTATTTT ATCTTGAAAT TGAATTGAAA ΑΤΛΤΤΑΛΑΤΤ ACTTGGTTTA 1101 ATATAAACAA TAGATATCGT TAAGTATTTA CCACAAACAT TTTATTAGTT 1151 GTAACGATGA TTAAGCAGGA ATTCCTCTGG TTGTGCAGGA TGAAAGAAAC 1201 TAACTAGCTA TAATTTCTTT TGTAAAGTCA AGATAGTACG GCACCTTATG 1251 GAGAAAATAA ATAACTTTAC ATCATCAAAC TCATCTTCTT TTTTCCACAA 1*3 01 AATGATCAAG TTGACATGTT AATAGCCAGG TCACCGGGGG CGGCTCTTAA 1351 CTTCATTAGC CTACGAATAA CAAATCCAAT ATTATATTTA CACAAGGCTA
    -189-
    1401 TATATATATC TCAATATAAA TAGCTCGTTG TTCATCTTAA TTCTCCCAAC 1451 AAGTCTTCCC _ATCATGTCTA CCTCAÇATAA ACATAATACT CCTCAAATGG 1501 CTGCTATCAC ACTCCTAGGA TTACTACTTG TTGCCAGCAG CATTGACATA 1551 GCAGGTTTCT GGTCAAATAT TTGAACTTCC CAGCCAAAAA TATTGTCTTA 1601 TAATTTTGTG TGCGCAAAAT TTTAATTTAG TTGATAGTTA TTTGCTTATT 1651 TTTCTTTTCA AATTGCTTGT GTTTTTTTCT CAAATTAACT TGCACCGTAT 1701 TCATTTAGCG ATAGTTATTT GCTCTATTTT TGTGTAACAC TCACTCACAA 1751 ACTTTTCAAT TTGAGGGGAG GACAGTGAAT CTAAGATTGA AATTTATGAG 1801 TTTAATTAGA CTAATTCCCA TTTGATTTAT TGGCTAGAAG TCAATTATTT 1851 GCATAGTGAG TCTTTTAACA CACAGATTTG AGTTAAAGCT ACTACGTTCG 1901 TATTAACCCA TAACATATAC ACCTTCTGTT CTAATTTCTT TGACACTTTT 1951 TGTTAGTTTG TTCCAAAAAG GACGGACATA TTTGATATTT GAGAATACTT 2001 TACCTTAACC TTAATAGAAT TTTTTATGAC ATCACATATA ttatggaata 2051 TATACGACCA TAATTTTCAA ATATCTTATA GTCGTACAAA TATTATAGCA 2101 TGTTTAATAC CACAACTTTC AAATTCTTCT TTTCCTTAAA AACAAAATAT 2151 GTCACATAAA TTAAAATAGA GGAAGTATAC TACATCAATC AGCCCCTAGT 2201 GGAGGGGACC CTACTGTAAG TTTTTAAGTT TTCAAGAATT CAGTAATTGA 2251 TTAGGAGCCC GTCTGGACAT AAAAAAAAAT TCCTTTTTTT CCAAAAAATG 2301 CCCACTAAAT TTCTAACACT ATTTTGTAAT TCTTATTGAG CAGGGGGCTC 2351 AATCGATAGG TGTTTGCTAT GGAATGCTAG GCAACAACTT GCCAAATCAT 2401 TGGGAAGTTA TACACjCTCTA CAAGTCAAGA AACATAGGAA GACTGAGGCT 2451 TTATGATCCA AATCATGGAG CTTTACAAGC ATTAAAAGGC TCAAATATTG 2501 AAGTTATGTT AGGACTTCCC AATTCAGATG TGAAGCACAT TGCTTCCGGA 2551 ATGGAACATG CAAGATGGTG GGTACAGAAA AATGTTAAAG ATTTCTGGCC 2601 AGATGTTAAG ATTAAGTATA TTGCTGTTGG GAATGAAATC AGCCCTGTCA 2651 CTGGCACATC TTACCTAACC TCATTTCTTA CTCCTGCTAT GGTAAATATT 2701 TACAAAGCAA TTGGTGAAGC TGGTTTGGGA AACAACATCA AGGTCTCAAC 2751 TTCTGTAGAC ATGACCTTGA TTGGAAAÇTC TTATCCACCA TCACAGGGTT 2Β01 CGTTTAGGAA CGATGCTAGG TGGTTTGTTG ATCCCATTGT TGGCTTCTTA 2851 AGGGACACAC GTGCACCTTT ACTCGTTAAC ATTTACCCCT ATTTCAGTTA
    -190-
    2901 TTCTGGTAAT CCAGGCCAGA TTTCTCTCCC CTATTCTCTT TTTACAGCAC 2951 CAAATGTGGT GGTACAAGAT GGTTCCCGCC AATATAGGAA CTTATTTGAT 3001 GCAATGCTGG ATTCTGTGTA TGCTGCCCTC GAGCGATCAG GAGGGGCATC 3051 TGTAGGGATT GTTGTGTCCG AGAGTGGCTG GCCATCTGCT GGTGCATTTG 3101 GAGCCACATA TGACAATGCA GCAACTTACT TGAGGAACTT AATTCAACAC 3151 GCTAAAGAGG GTAGCCCAAG AAAGCCTGGA CCTATTGAGA CCTATATATT 3201 TGCCATGTTT GATGAGAACA ACAAGAACCC TGAACTGGAG AAACATTTTG 3251 GATTGTTTTC CCCCAACAAG CAGCCCAAAT ATAATATCAA CTTTGGGGTC 3301 TCTGGTGGAG TTTGGGACAG TTCAGTTGAA ACTAATGCTA ctgcttctct 3351 CGTAAGTGAG ATGTGAGCTG ATGAGACACT TGAAATCTCT TTACATACGT 3401 ATTCCTTGGA TGGAAAACCT AGTAAAAACA AGAGAAATTT TTTCTTTATG 3451 CAAGATACTA AATAACATTG CATGTCTCTG TAAGTCCTCA TGGATTGTTA 3501 TCCAGTGACG ATGCAACTCT GAGTGGTTTT aaattccttt TCTTTGTGAT 3551 ATTGGTAATT TGGCAAGAAA CTTTCTGTAA GTTTGTGAAT TTCATGCATC 3601 ATTAATTATA CATCAGTTCC ATGTTTGATC AGATTGGGAT TTGGTAACTT 3651 CAATGTTTAG TTATTTATTA ATTAGTGTCT TTATCATTTG ACTATCAATT 3701 AATCTTTATT TGGCAAGGCT TGATATATTT GAGTTACTCT TAGGTATTTG 3751 CAAGCAACTG ATCTTTCTTT TATCCCGTTT CTCCGTTAAA CCTCATTAGA 3801 AATATATTAT AATGTCACCT ACTCTGTGGT TTAAGACATT CCCTTACATT 3851 ATAAGGTATT TCACGTCGTA TCAGGTCGAA AAAAATAATG GTACGCTCTT 3901 TCTTATCACA AATTTCTCTC AACTTCTAGA CCAATTGAAT CTTGTCTCCA 3951 ATAAGCATTG CTTTTACTGT ATGTTTCTCT CTATCAATTC AAGGCTCAAG 4001 CCATCAAATC GCTTGGTATT TCTCGCTCCC ATTTAACCAA TCGAGCTGTT 4051 AGCTCTGCTA AAGTCTCATT CTTCAGCTTC TCAAACCACT CAGAGCTTCT 4101 CCAACCAAAA ATGTAGAAAA aatctttgat CCACATGTAA AACCCCAGAA 4151 TTGTCATTCG AGTGAAGGAA GGTGCTGGAA ACGCGACATC AAACACGGAT 4201 TTGCCAGCTG ATTGTCATAG GAAAAAGAAA AGTTGATCAG ATAGTTCGTG 4251 CGGGGTATTT CCTACCTCGC CTTTGATCAT AGCTCTAGGC TTGCGAAACT 4301 AAGTTATGCA CGAGGCCCCC TGCGAATCCA TAAATCTAAG AAGCATGCCA 4351 CAACAAACGG GATAACTTCC AGCTAAGAGA TCTATTTTGA TCTTACCCAC 4401 AAACTAGCTC CGTGTGAATT GTCCATTTCA TCAACTCCAA AGGCAGGAAA
    4451 GAAGACTCTA TTCAGAGAGC AGCAAAAGAG CTC
    -19179?. - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a sequencia de DNA subs tancialmente pura ser uma sequencia como se mostra na Sequencia 6 ou tendo substancial homologia de sequências com a sequencia mostrada na Sequencia 6, a seguir apresentada :
    -192-
    1 GAGCTCCCTT GGGGGGCAAG GGCAAAACTT TTTGCTAAAT GGAAAAATAT 51 TATACCAAGT gtttgtaata GTTACTCAAT TTGAATTAAC AAAGGGGCAA 101 ATTTGACTAT TTTGCCCTTA TATCTTTTGG TCACAAAAAC ATAAAATATC 151 CCATCCGAAA TTCCAAATGG TCCATTATCG GCAAGTAGCT TTCTTTAATT 201 ATAGTTAGTT GACAAAACAC TATCAAGATA TCATTATTAT AATAATAACT 251 TCAAAGTCCA TCATCTTAGC TGCCTCCTCA GTAGAGCCGC CAGTAAAATA 301 AGACCGATCA AATAAAAGCC GCCATTAAAA TAATGAATTT TAGGACTCTC 351 GATTGGCACG TAAGTGCCAA AACTCTTCCA ATACTTTGCT GCAACTTGGG 401 GCTGCTAGGT TCTGAGCTTC CAGATATGGG ATATTTCTAA GTTTATCTCC 451 TAATTTACAT CTCAACTAAT ATTAAGAAAT TAAACAGGTA CAGCAAATCA 501 TAAAATTTTC CTCTAAAGAA GACAATGAAT CCGGTTACTG ATTCATTGGC 551 CTTTTCAGAG TCTGCATGCC ATATTCACTA AGGGGTCGTT TGGTACAAGA 601 AATAATAATA ATAATTTCGG GATAGAATTT GAGATTGCAT TTATCTTGTG 651 TTTAATTATA AGTATTAGCT AATTTCAGAA TAAATTTTAC ACTAAAATAG 701 TAAAATCAAC TATCACATGT AGAAGGTGGA ATGGAATAGC TAATCCCATA 751 GCCACTCACA TAGAATATCC TTATTTATCT CACTATTTTA CCAAATGATC 801 GGTTAGTCTT CATGAGAATC CAGTATCCTC AATAAATGCA GTAAGAAGTT 851 AGAAAATTTT CATTAAATCA ATTCATATAA TTTAAAAATA TTAGATATGG 901 AGCACTTAAG ATACAATAAA AGATGTACCG TTAATAATAA AAGATAAGAT 951 AGAGTTTTAA ATAGGAAAAA AAAAACGGTT CGAGACACTC TTATGGAAGG 1001 CGTTGTCTTC AAAGTAGATT CTCATTCATT GCTCTGGTGC AATAGCAAAA 1051 TGACATCTTA CTCTTAAGAT ACAGCGAGCC ACTCTACAAT CTTCTATTGT 1101 ATACTCAAAT GAAAGTTTTA GAGAACTTTC AAATCTCTCA ACTACTTTTA 1151 AGGGAATTCA AAATACGACC aatatttatt ACTTACTTAC TTATAGTTAA 1201 ATGATATGAA TTTTATTTTA AATTTGAATT GAAAATATTA AATTACTTGA 1251 TTTAATATAA ACAATAGATA TCGCTAAGTA TTTACCACAA ACATGGAGAT 1301 ACTACAGAAG ATTTTATTAT TTGTAACGAT GATTAAGCAG CTATTCATCT 1351 GGTTGTGCAG GATGAAAGAA AGTAACTAGC TATAATTTCT TTTGTAAAGT
    -193-
    1401 CAAGATAGTA CGGCACCTTT GGANNAAATA TAAAACTTGT ACATCATCAA 1451 ACTCATTTTC TTTTTTCCAC AAAATGATCA AGTTGACATG TTAATAGCCA 1501 GGTCAGCCGG GGCGGCTCTT AACTTCATTA GCCTACGAAT AACAAATACT 1551 CCAATAATAT TCCACTCGAA TATTTACATT TACACAAGGC TATCTCAATA 1601 TAAATAGCTC ATTGTTCATC TTAATTCTTC CAACAAGTCT TCTCATCATG 1651 TCTACCTCAG ATAAACATAA TACTCCTCAA ATGGCTGCTA TCACACTGCT 1701 AGGATTACTA CTTGTTGCCA GCACCATTGA GATAGCAGGT TTCTGGTCAA 1751 atatttgaac TTCCGAGCCA AAAATATTGT CTTATAATTT TGTTGGTGCA 1801 AAATCTTAAT TTACTTGATA GTTATTTGCT TATTTTTCTT ATCAAATTGC 1851 TTGTGTTTTT TTCTCAAATT TACTTGCACT ATATTCATTT AGCGATAGTT 1901 ATTTGCTCTT TTTTCGGGTA ACACTCACTC ACAAGCTTTT CAAATTTGAG 1951 GGGAGGGCGG TGAATCTAAA ATTTGAAATT TATGAGTTTA GACTAGTGTC 2001 CATTTGATTT ATTGGCTAGA CGTCTATTAG TTGTATACTA AATCTTTTAA 2051 CACATACACC GACCTGAGTC AAAGCTATTA GGTTCGTATT AACACATAAC 2101 ACATATTCCC TCTGTTCTAA TTTATGTGAC ACACTTTCTG TTAGTTTCTT 2151 CCAAAGAGAA TGACATATTT GATATTTAAA AATATTTTAA CTTTAAACTT 2201 TTTATTCTCA ACCTTTTATA ACATCACAAA TATTATGGAA CATATTAGAC 2251 TACAAGTTCC AAATATCTTA TAGTCTCTAC AAATATTATA GCATGTTTAA 2301 TAACACAATT TTCACATTCT TCTTTTTCTT AAACTTTGTG CCCAATTAAA 2351 TTATGTCACA TAAATTAAAA TGGTTACATC ATCCCCTAGT GGAGGGACCT 2401 ACCATGTCTA CTGTAAGTTT TTAACTTTTC AAGAATTACA TAATTGATTT 2451 AGTTTCTAAC ACTAATTCTA attcttattg AGCAGGGGCT CAATCAATAG 2501 GTGTTTGCTA TGGAATGCTA GGCAACAACT TGCCAAATCA TTGGGAAGTT 2551 ATACAGCTCT ACAAGTCAAG AAACATAGGA AGACTGAGGC TTTATGATCC 2601 AAATCATGGA GCTTTACAAG CATTAAAAGG CTCAAACATT GAAGTTATGT 2651 TAGGACTTCC CAATTCAGAT GTCAAGCACA TTGCTTCCGG AATGGAACAT 2701 GCAAGATGGT GGGTACAAAA AAATGTTAAA GATTTCTGGC CAGATGTTAA 2751 GATTAAGTAT ATTGCTGTTG GGAATGAAAT CAGCCCTGTC ACAGGCACAT 2Ϊ01 CTTACCTTAC CTCATTTCTT ACTCCTGCCA TGGTAAATAT TTACAAAGCA 2651 ATTGGTGAAG CTGGTTTAGG AAACAACATC AAGGTCTCAA CTTCTGTAGA
    -194-
    2901
    2951
    3001
    3051
    3101
    3151
    3201
    3251
    3301
    3351
    3401
    3451
    3501
    3551
    3601
    3651
    3701
    3751
    3801
    3851
    3901
    3951
    4001
    4051
    4101
    4151
    4201
    4251
    4501
    CATGACCTTG
    ACGATGCTAG
    CGTGCACCTT
    TCCAGGGCAG
    TAGTACAAGA
    GATTCTGTGT
    TGTTGTGTCC
    ATGACAATGC
    GGTAGCCCAA
    TGATGAGAAC
    CCCCCAACAA
    GTTTGGGACA
    GATGTGAGAT
    GAAAGCTTAG
    TAACATTGCA
    GCAACTCTGA
    GCAAGAAACT
    TGAATTTCAT
    AGGATTTGGT
    ATTTGACTCG
    CGACTCTTAG
    CGTTAACCCT
    TAGAGCTTCA
    GGACATTCTG
    AAATAATGGT
    AATTGAATCT
    ATCAATTCAA
    TTAACCAATC
    AAACCACTCA
    ATTGGAAACT
    GTGGTTTACT
    TACTCGTTAA
    ATTTCTCTCC
    TGGTTCACGC
    ATGCTGCCCT
    GAGAGTGGCT
    AGCAACTTAC
    GAAAGCCTGG
    AACAAGAACC
    GCAGCCCAAA
    GTTCAGTTGA
    GAGACACTTG
    TAAAAACAAG
    CGTCTCTGTA
    GTGGTTTTAA
    TTCTGTAAGT
    GCACCATCAA
    AATTGCAAAG
    ATCAATTAAT
    GTAGTGGCAT
    CATTAGAAAT
    AAATCGATTG
    TTACATTATA
    ACGCTCTTTC
    TGTCTCCAAT
    GGCTCAAGCC
    GAGCTGTTAA
    AAGCTTCTCC
    CTTATCCACC
    GATCCAATTG
    CATTTACCCC
    CCTATTCTCT
    CAATATAGGA
    CGAGCGATCA
    GGCCATCTGC
    TTGAGGAACT
    ACCTATTGAG
    CTGAACTGGA
    TATAATCTCA
    AACTAATGCT
    AAATCTCTTT
    AGAAATTTAT
    AGTCCTCATG
    ATCCCTTTTC
    TTGTGAATTT
    TTATACATCT
    TTTAGTTATT
    CTTTAATTGG
    TCAACTGATC
    ATATTATAAT
    ACAACAGTTT
    AGGTATTTCA
    TTATCACAAA
    AAGTATTGCT
    ATCAAATCGC
    CTCTGCTAAA
    AACAAAAAAA
    ATCACAGGGT
    TTGGGTTCTT
    TATTTCAGCT
    TTTTACAGCA
    ACTTATTTGA
    GGAGGGGCAT
    TGGTGCATTT
    TAATTCAACA
    ACCTATATAT
    GAAACATTTT
    ACTTTGGGGT
    ACTGCTTCTC
    ACATAAGTAT
    TCTTCATGCA
    GATTGTTATC
    TTTGTGATGT
    CATGACTTTC
    TTTCCATGTT
    TATTAATTAG
    TAAGGCTTGA
    TTTCTGTTAT
    GTCACCTAAA
    TGGAGTTACA
    CGTCGTATCA
    TTTCTCTCAA
    TTTACTCTAT
    TTGGTATTTC
    GTCTCATTCT
    GTAGAAAAAA
    TCGTTTAGGA
    AAGGGACACA
    ATTCTGGTAA
    CCAAATGTGG
    TGCAATGCTG
    CTGTAGGGAT
    GGAGCTACAT
    CGCTAAAGAG
    TTGCCATGTT
    GGATTGTTTT
    CTCTGGTGGT
    TCATAAGTGA
    TGCTTAGATG
    AGACACTAAA
    CAGAGACGAT
    TGGTAATTTG
    TGTAAGTTTG
    TGATCACATT
    TGTCTTTATC
    TATATCGGAG
    CCCATGTCTC
    TCAGAGGTTT
    CTGTGGTTTA
    AGGTCGAATA
    CTTCTAGACC
    CTTTCTCTCT
    TCGCTCTCAA
    TCAGCTTCTC
    ACTTTGATCC
    4351 ACATGTAAAA CCCCATAACC ATGTCATTCG AGTGAAGGAA GGTGCTTGAA
    -195-
    4401 ATGCAACGAA CAAACACGGC TTTGCCACTG CTTGTGATAG GTAAAAGAAA 4451 ACTTGATTAG ATAGTTCCTG CGGGGCATTT CCTACCTCGC CTTTGATCTT 4501 AGCTTTAGGC TTGCGAAACT AAGTAGAACC TAAGGCCCCA GCGAATCCGT 4551 AAATCTGAGG AGCATGCCAC AGCAAAAAGG TTAGCTTTCA GATAAGAGAT 4601 CTATTTGATC TTACCCACTA ACTAGCTCTG TGTGAATTGT CCATTTCATC 4651 AACTCCAAAG GCAGGAAAGA AGACTATTGA GAGAGCAGCA AAAGAGCTC
    reivindicação tanc i almente Sequencia 7 com a sequenc sentada :
    803. - Processo de acordo com a 19, caracterizado por a sequencia de DNA subs pura ser uma sequencia como se mostra na ou tendo substancial homologia de sequências ia mostrada na Sequência 7, a seguir apre-196-
    1- 50 ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ AAAAACATAA GAAAGTACAG AGGAAAATGG AGTTTTCTGG 51-100 ATCACCAATG GCATTGTTTT GTTGTGTGTT TTTCCTGTTC TTAACAGGGA 101-150 GCTTGGCACA AGGCATTGGT TCTATTGTAA CGAGTGACTT GTTCAACGAG 151-200 ATGCTGAAGA ATAGGAACGA CGGTAGATGT CCTGCCAATG GCTTCTACAC 201-250 TTATGATGCA TTCATAGCTG CTGCCAATTC CTTTCCTGGT TTTGGAACTA 251-300 CTGCTGATGA TACTGCCCGT AGGAAAGAAA TTGCTGCCTT TTTCGGTCAA 301-350 acttctcacg AAACTACTGG TGGATCCCTG AGTGCAGAAC CATTTACAGG 351-400 AGGGTATTGC TTTGTTAGGC AAAATGACCA GAGTGACAGA TATTATGGTA 401-450 GAGGACCCAT CCAATTGACA AACCGAAATA ACTATGAGAA AGCTGGAACT 451-500 GCAATTGGAC AAGAGCTAGT TAACAACCCT GATTTAGTGG CCACAGATGC 501-550 TACTATATCA TTCAAAACAG CTATATGGTT TTGGATGACA CCACAGGACA 551-600 ACAAGCCATC TTCCCACGAC GTTATCATCG GTCGTTGGAC TCCGTCTGCC 601-650 GCGGATCAGG CGGCGAATCG AGTACCAGGT TACGGTGTAA TTACCAACAT 651-700 CATTAACGGT GGAATTGAAT GTGGCATAGG ACGGAATGAC GCAGTGGAAG 701-750 ATCGAATTGG ATACTACAGG AGGTATTGTG GTATGTTAAA TGTTGCTCCG 751-600 GGGGAAAACT TGGACTGTTA CAACCAAAGG AACTTCGGCC AGGGCTAGGC 801-650 TTCGTTACAT AGAATGCAGA TCATGTTATG TATACAAGTT atatttgtat 851-900 TAATTAATGA ATAAGGGGAT TGTGTATCCA TTAAGAATTA GGTGAAATAT 901-950 TTCTGTTATT TGTCTTCTTG GGAAGAACCA ATAGCTCCTA TATATGAGGC 951- 0 gcttttaagt GATGAGGCTA CTGCATTGAT GAAAACGAAA TTTCTATCCA 1001- 20 GAAATAAAAG TTCCTTGTCT
    -197- rei vindicação 19, caracterí' h Pr°CeSS° de ac°cdo com a tancialmente pura ser uma ° 3 SQqUencia de DNA subsSequencia 8 Ou tendo substanc 1 aTh 'θ com a seouenriA mn + , Ostancial homologia de sequencia mostrada na Sequencia 8 sequências 3 se9uir apresen-
    1- 50 CAGGTGCTCA AGCAGGAGTT TGTTATGGAA GGCAAGGGAA TGGATTACCA 51-100 TCTCCAGCAG ATGTTGTGTC GCTATGCAAC CGAAACAACA TTCGTAGGAT 101-150 GAGAATATAT GATCCTGACC AGCCAACTCT CGAAGCGCTT AGAGGCTCCA 151-200 ACATTGAGCT CAT^CTAGGT GTCCCGAATC CGGACCTTGA GAATGTTGCT 201-250 GCTAGCCAAG CCAATNCAGA TACTTGGGTC CAAAACAATG TTAGGAACTA 251-300 TGGTAATGTC AAGTTCAGGT ATATAGCAGT TGGAAATGAA GTTAGTCCCT 301-350 TAAATGAAAA CTCTAAGTAT GTACCTGTCC TTCTCAACGC CATGCGAAAC 351-400 ATTCAAACTG CCATATCTGG TGCTGGTCTT GGAAACCAGA TCAAAGTCTC 401-450 CACAGCTATT GAAACTGGAC TTACTACAGA CACTTCTCCT CCATCAAATG 451-500 GGAGATTCAA AGATGATGTT CGACAGTTTA TAGAGCCTAT CATCAACTTC 501-550 CTAGTGACCA ATCGCGCCCC TTTGCTTGTC AACCTTTATC CTTACTTTGC 551-600 AATAGCAAAC AATGCAGATA TTAAGCTTGA GTATGCACTT TTTACATCCT 601-650 CTGAAGTTGT TGTAAATGAT AACGGAAGAG GATACCGAAA CCTTTTTGAT 651-700 GCCATCTTAG ATGCCACATA CTCGGCCCTT GAAAAGGCTA GTGGCTCGTC 701-750 TTTGGAGATT GTTGTATCAG AGAGTGGTTG GCCTTCAGCT GGAGCAGGAC 751-800 AATTAACATC CATTGACAAT GCCAGGACTT ATAACAACAA CTTGATTAGT 801-850 CACGTGAAGG GAGGGAGTCC CAAAAGGCTT CCGGTCCAAT AGAGACCTAC 851-900 GTTTTCGCTC TGTTTGATGA AGATCAGAAA GACCCTGAAA TTGAGAAGCA 901-950 TTTTGGACTA TTTTCAGCAA ACATGCAACC AAAGTACCAG ATCAGTTTTA 951- 0 ACTAGTTAAA AGCAAGAGGA GAGCATTAAT AGGAATAAGG ACTTTCCTTT 1001- 50 GTATGAAGAG AAAGTAGTCC ATTGGCACTA TGTACTGAAA CTATATATCA 1051-100 TGCTCATAAA GAAAGCAGTT ATTACAATAA TGAAACACTT ACAAGAAAAG 1101-107 CCATCAA
    -198-
    82?. - Processo para a regulação da transcrição de um gene quimicamente regulável, caracterizado por compreender a aplicação de um regulador químico num tecido vegetal, planta ou semente contendo a sequencia de DNA quimérica da reivindicação 23.
    835. - Processo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado por o referido regulador ser seleccionado do grupo constituido por ácido benzoico, ácido salicilico, ácido aceti1sa1ici1ico, ácido po 1 iacri1ico,ácido benzo-1 , 2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, ácido benzo-1, 2,3-tiadiazo1 etiocarboxi1ico, cianobenzo-1 ,2,3-tiadiazo 1e , amida do ácido benzo-1,2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, hidrazóda do ácido benzo-1 , 2,3-tiadiazo 1ecarboxi1ico, ácido dic1 oroisonicotinico e seus derivados.
    84?. - Processo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado por a primeira sequencia de DNA componente do referido DNA quimérico ser uma sequencia quimicamente induzível que é, ou possui substancial homologia de sequências com, a sequencia quimicamente induzível de um gene PR.
    853. - Processo de acordo com a reivindicação 82, caracterizado por o gene quimicamente regulável codificar uma caracteristica fenotipica seleccionada do grupo constituido por uma fase do desenvolvimento, esterilidade, resistência a doenças, resistência a pragas, tolerância ou resistência a herbicidas, produção de um metabolito secundário e produção de uma marca enzimática susceptivel de ser demonstrada por ensaio.
    86-. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por a referida marca enzimá-199- tica ser luciferase (LUX), c1oranfenico1-aceti1transferase (CAT) neomicina-fosfotransferase (NPT) nopa1ina-sintetase (NOS), octopina-s intetase (OCS), beta-1 ,3-rglucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) ou endotoxina de Bac i 11 us Thurlngiens is (BT).
    87Ê. - Processo de acordo com a reivindicação 86, caracterizado por a referida marca enzimática ser beta-1,3-g1ucuronidase (GUS), aceto-hidroxi-ácido -sintetase (AHAS) ou endotoxina de Bacillus Thur i ng iens i s ( BT).
    883. - Processo para identificação de um regulador quimico caracterizado por compreender a transformação de um hospedeiro com a sequencia de DNA quimérica da reivindicação 30 ou um vector contendo a referida sequencia de DNA quimérica a aplicação de um regulador quimico putativo no hospedeiro transformado e a medição da expressão da caracteristica fenótipica.
    89-. - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por o hospedeiro transformado ser tecido vegetal ou células vegetais.
    90^. - Processo de acordo com a reivindicação 89, caracterizado por a primeira sequencia de DNA componente do referido DNA quimérico ser uma sequencia quimicamente induzivel que é, ou possui substancial homologia de sequencia com, uma sequencia quimicamente induzivel de um gene da proteína PR.
    915. - Processo de acordo com a reivindicação 88, caracterizado por a caracteristica fenotípica codificada pelo DNA quimérico ser uma marca enzimática susceptivel de ser demonstrada através de um ensaio.
    200
    92 a. - Processo de acordo cora a reivindicação 91, caracterizado por a referida marca enzimática ser luciferase (LUX), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), neomicina-fosfotransferase (NPT), nopalina-sintetase (NOS), octopina-sintetase (OCS), beta-1,3-glucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) ou endotoxina de Bacillus thuringiensis (BT).
    93a. - Processo para identificação de uma seguência de DNA quimicamente regulável, que pode ser obtida de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender os passos de:
    (a) transformação de um hospedeiro com uma sequência de DNA quimicamente regulável ou um vector contendo a referida sequência, uma segunda sequência de DNA que é uma marca genética seleccionável do hospedeiro e uma terceira sequência de DNA que codifica uma caracteristica fenotipica;
    (b) aplicação de um regulador químico ao referido hospedeiro transformado; e (c) medição da expressão ou selecção da alteração da expressão da caracteristica fenotipica codificada pela terceira sequência de DNA.
    944. - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por a referida terceira sequência de DNA ser uma marca genética do hospedeiro seleccionável ou susceptível de ser demonstrada por ensaio.
    95a. - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por o hospedeiro transformado ser tecido vegetal ou células vegetais.
    -201-
    96- . - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por a segunda ou terceira sequencia de DNA ser uma marca genética para resistência a herbicidas ou resistência a antibióticos.
    97- . - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por a referida marca genética ser um gene de resistência a antibióticos seleccionado do grupo constituído por çpies de resistência a h i grom i c i na , canamicina, cloranfenicol, bleomicína, puromicina, lincomicina e metotrexato.
    98-. - Processo de acordo com a reividnicação 93, caracterizado por a marca genética ser um gene de resistência à higromicina da am i nog 1 i cosido-f osf otransferase IV.
    99-. - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por a terceira sequencia de DNA codificar uma marca enzimática susceptivel de ser testada, seleccionada do grupo ccrctituido por luciferase (LUX), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), neomicina-fosfotransfera se (NPT), nopa1ina-sinteta se (NOS), octopina-sintetase (OCS), beta-1 , 3-g1ucuronida se (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) e endotoxina do Bacillus thuring iens is (BT).
    1003. - Processo de acordo com a reivindicação 93, caracterizado por a terceira sequencia de DNA codificar uma marca enzimática susceptivel de ser testada, seleccionada do grupo constituído por beta-1,3-glucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sinteta se (AHAS) e endotoxina de Bacillus thuringiensis (BT):
    101a. - Método para selecção de células ou tecidos vegetais transformados que foram tratados com DNA transformante, preparado por um processo de acordo com a reivindicação 23, compreendendo uma primeira sequência de DNA componente que é quimicamente regulável por um regulador químico conhecido e uma segunda sequência de DNA que lhe está associada codificadora de uma marca fenotipica, caracterizado por compreender os passos de:
    (a) tratamento de transformantes putativos com o referido regulador químico conhecido e (b) selecção dos transformantes de acordo com a expressão da caracteristica fenotipica codificada pela segunda sequência de DNA.
    102*. - Método de reivindicação 101, caracterizado por a referida fenotipica ser resistência a antibióticos.
    acordo com a caracteristica acordo com resistência
    103a. - Método de reivindicação 102, caracterizado por a referida antibióticos ser resistência à higromicina, canomicina, cloranfenicol, bleomicina, puromicina, lincomicina, G418 e metotrexato.
    104a. - Método de acordo com a reivindicação 101, caracterizado por a referida caracteristica fenotipica ser uma marca enzimática susceptivel de ser demonstrada por ensaio.
    105a. - Método de acordo com a reivindicação 104, caracterizado por a referida marca enzimática ser seleccionada do grupo constituído por luciferase (LUX), cloranfenicol-acetiltransferase (CAT), neomicina-fosfotransferase (NPT), nopalina-sintetase (NOS), octopina-sintetase (OCS), beta-1,3-glucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) ou endotoxina de Bacillus thuringiensis (BT).
    203
    106a. - Método de acordo com a reivindicação 105, caracterizado por a referida marca enzimática ser seleccionada do grupo constituído por beta-1,3-glucuronidase (GUS), aceto-hidroxiácido-sintetase (AHAS) e endotoxinas de Bacillus thurinqiensis (BT).
    107a. - Ensaio para a actividade de beta-1,3-glucuronidase (GUS), de acordo com a reivindicação 106, caracterizado por compreender a reacção de extractos de tecidos vegetais em amostras inferiores a 0,5 ml contendo 1,5 a 3 mM de 4-metil-umbeliferil-glucuronida a cerca de 37°C durante la 5 horas a determinação da concentração de indicador fluorescente libertado.
    108a. - Método para a determinação da quantidade de um RNA específico numa solução de RNA, num processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 93 e 101, caracterizado por compreender:
    (a) a marcação de um oligonucleotídeo iniciador específico do RNA com um comprimento entre 12 e 18 nucleotídeos com uma radioactividade específica elevada;
    (b) a hibridação do RNA com o oligonucleotídeo marcado numa concentração entre 0,1 e 20 nM durante 2 minutos e 24 horas a uma temperatura à volta de 37“C;
    (c) a extensão do oligonucleotídeo iniciador com transcriptase reversa na presença de trifosfatos de nucleotídeo a uma concentração entre 0,0003 e 1 nM durante entre 1 e 120 minutos, e
    -204- (d) a separação e visualização dos produtos da extensão com autorradiografia.
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