NO310425B1 - Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay - Google Patents

Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay Download PDF

Info

Publication number
NO310425B1
NO310425B1 NO19890972A NO890972A NO310425B1 NO 310425 B1 NO310425 B1 NO 310425B1 NO 19890972 A NO19890972 A NO 19890972A NO 890972 A NO890972 A NO 890972A NO 310425 B1 NO310425 B1 NO 310425B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
gene
dna sequence
dna
sequence
plasmid
Prior art date
Application number
NO19890972A
Other languages
English (en)
Other versions
NO890972L (no
NO890972D0 (no
Inventor
John Ryals
Alice Montoya
Christian Harms
John Duesing
Christoph Sperisen
Fred Meins
George Payne
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of NO890972D0 publication Critical patent/NO890972D0/no
Publication of NO890972L publication Critical patent/NO890972L/no
Publication of NO310425B1 publication Critical patent/NO310425B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D285/00—Heterocyclic compounds containing rings having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D275/00 - C07D283/00
    • C07D285/01—Five-membered rings
    • C07D285/02—Thiadiazoles; Hydrogenated thiadiazoles
    • C07D285/14—Thiadiazoles; Hydrogenated thiadiazoles condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler den kjemiske regulering av genetisk materiale, samt nye materialer som kan reguleres på slik måte. Spesielt omhandler den kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay.
Fremskritt i rekombinant DNA-teknologi koblet med fremskritt i plantetransformasjon og regenereringsteknologi har gjort det mulig å innføre nytt genetisk materiale i planteceller, planter eller plantevev, for således å innføre nye egenskaper, dvs. fenotyper som øker verdien av planten eller plantevevet. Nylige forsøk med genetisk manipulerte planter som er resistente mot patogener (EP-A 240 332 og EP-A 223 452) eller insekter (Vaeck, M. et al., Nature 328, 33 (1987)) og fremstillingen av herbicidtolerante planter (DeBlock, M. et al., EMBO J. 6, 2513 (1987)), uthever potensialet for avlingsutvikling. Målplantene kan strekke seg fra trær og busker til ornamentale blomster og åkerplanter. Faktisk er det klart at "avlingen" kan være en kultur av et plantevev dyrket i en bioreaktor som en kilde for et eller annet naturlig produkt.
I enkelte tilfeller vil det være ønskelig å kontrollere tiden og/eller utstrekningen av ekspresjonen av innført genetisk materiale i planter, planteceller eller plantevev. En ideell situasjon ville være vilkårlig regulering av ekspresjon av en manipulert egenskap via et regulerende intermediat som lett kunne tilføres åkeravlingen, ornamentale busker,
bioreaktorer osv. Denne situasjon kan nå fremskaffes ved foreliggende oppfinnelse som er rettet mot bl.a. et kjemisk regulerbart chimerisk genekspresjonssystem som består av kjemisk regulerbare, ikke-kodende DNA-sekvenser koblet f. eks. med et gen som koder for en fenotypisk egenskap, slik at ekspresjonen av denne egenskap er under kontroll av regulatoren, dvs. slik at ekspresjon fra det regulerte gen er bestemt ved tilstedeværelse eller fravær av en kjemisk regulator. Dette system er den første oppvisning av konseptet med kjemisk regulering av chimerisk genekspresjon i planter eller plantevev. Som sådan muliggjør det produksjonen av transgene planter eller plantevev og kontrollen av egenskaper uttrykt som en funksjon av en kjemisk regulator.
Forskjellige metoder er kjent i faget for å utføre genetisk transformasjon av planter og plantevev (dvs. stabil intro-
duksjon av fremmed DNA i planter). Disse innbefatter trans-
formasjon ved Agrobacteirum-stammer og transformasjon ved direkte genoverføring.
1. Agrobacterium- overførte transformasjoner
A. tumefaciens er den etiologiske enhet for krongalle, en sykdom med et bredt område av dicotyledoner og gymnospermer, som resulterer i dannelsen av tumorer eller galler i plante-vev ved infeksjonsstedet. Agrobacterium. som normalt infi-
serer planter ved sårsted, bærer et stort ekstrakromosomalt element kalt Ti (tumorinduserende)-plasmid.
Ti-plasmidet inneholder to områder som er nødvendig for tumorogenisitet. Ett område er T-DNA ("transferred DNA") som er DNA-sekvensen som til slutt finnes stabilt overført til plantegenom DNA Det andre område som er krevet for tumorogenisitet, er vir (virulens)-området som har vært innbefattet i overføringsmekanismen. Selv om vir-området er absolutt nødvendig for stabil transformasjon, blir vir-DNA ikke faktisk overført til den infiserte plante. Transformasjon av planteceller fremskaffet ved infeksjon med Agrobacterium tumefaciens. og påfølgende overføring av T-DNA alene, er blitt godt dokumentert, se f.eks. Bevan, M.W. og Chilton, M-D., Int. Rev. Genet. 16, 357 (1982).
Etter flere år av intens forskning i mange laboratorier er Agrobacterium-systemet blitt utviklet for å tillate rutinemessig transformasjon av en mengde plantevev. Representative vev transformert på denne måte, innbefatter tobakk, tomater, solsikke, bomull, raps, poteter, soyabønne og poppel. Selv om vertsområdet for Ti-plasmidtransformasjon som bruker A, tumefaciens som infeksjonsenhet er kjent å være meget stort, har tobakk vært en foretrukket vertsorganisme pga. dens manipuleringsletthet.
Agrobacterium rhizogenes er også blitt brukt som en vektor for plantetransformasjon. Denne bakterie som igangsetter håret rotdannelse i mange dicotyledone plantesorter, bærer et stort ekstrakromosomalt element kalt et Ri (rotinduserende)-plasmid, som virker på en analog måte som Ti-plasmidet av A. tumefaciens. Transformasjon som bruker A rhizogenes. har utviklet seg analogt med den til A tumefaciens og er med hell blitt brukt for å transformere f.eks. alfalfa, Solanum nigrum L. og poppel.
2. Direkte genoverføring
Flere fremgangsmåter for såkalt direkte genoverføring er blitt utviklet for å transformere planter og plantevev uten bruk av et Agrobacterium-intermediat. I den direkte transformasjon av protoplaster kan opptaket av eksogent genetisk materiale i en protoplast bli økt ved bruk av et kjemisk stoff eller elektrisk felt. Det eksogene materiale kan så integreres i det nukleære genom. Tidligere arbeid ble foretatt på dicotyledon tobakk, hvor det ble vist at fremmed DNA ble inkorporert og overført til avkomplanter, se f eks. Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3,2717
(1984) ogPotrykus, I. et al., Mol. Gen. Genet. 199, 169 (1985).
Monocott-protoplaster er også blitt transformert ved denne fremgangsmåte i f.eks. Triticum monococcum. Lolium multiflorum (italiensk ruggress), mais og sort meksikansk søtkorn. Alternativt kan eksogent DNA innføres i celler eller proto-
plaster ved mikroinjeksjon. En oppløsning av plasmid-DNA injiseres direkte i cellen med en nøyaktig ført glassnål. På denne måte er alfalfaprotoplaster blitt transformert med et antall plasmider, se f.eks. Reich, T.J. et al., Bio/Technology 4,1001 (1986).
En nyligere utviklet fremgangsmåte for direkte genoverføring innbefatter bombardering av celler med mikroprosjektiler som bærer DNA, se Klein, T.M. et al., Nature 327, 70 (1987). I denne fremgangsmåte blir wolframpartikler belagt med det eksogene DNA akselerert mot målcellene, noe som resulterer i minst transient ekspresjon i det rapporterte eksempel (løk).
På samme måte som det foreligger en mengde metoder for transformasjonen av plantevev, er det en mengde metoder for regenereringen av planter fra plantevev. Den spesielle re-generasjonsmetode vil avhenge av utgangsplantevevet og den spesielle plantesort som skal regenereres. I de senere år er det blitt mulig å regenerere mange plantetyper fra callusvev avledet fra planteeksplanter. Plantene som kan regenereres fra callus, innbefatter monocotter, så som korn, ris, bygg, hvete og rug, og dicotter, så som solsikke, soyabønne, bomull, raps og tobakk.
Regenerasjon av planter fra vev transformert med A. tumefaciens er blitt vist for flere stammer av planter. Disse innbefatter solsikke, tomat, hvitkløver, raps, bomull, tobakk og poppel. Regenerasjonen av alfalfa fra vev transformert med A. rhizogenes er også blitt vist. Planteregenerering fra protoplaster er en spesielt anvendelig teknikk, se Evans, D.A et al., i: Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1, MacMillan Publ. Co., 1983, s. 124. Når en plantetype kan regenereres fra protoplaster, kan direkte genoverføringsprosedyrer bli brukt, og transformasjon er ikke avhengig av bruken av A tumefaciens. Regenerasjon av planter fra protoplaster er blitt vist for ris, tobakk, raps, poteter, eggplante, agurk, poppel og korn.
De teknologiske fremskritt i plantetransformasjon og regene-reringsteknologi uthever potensialet for avlingsforbedring via genetisk manipulering. Det har vært rapporter angående genetisk manipulerte tobakks- og tomatplanter som er motstandsdyktige mot infeksjoner av f.eks. tobakkmosaikkvirus (TMV) og motstandsdyktige mot forskjellige klasser av herbicider. Insektmotstandsdyktighet er blitt innført i tobakks- og tomatplanter.
Potensialet for genetisk manipulering er ikke begrenset til åkeravlinger, men innbefatter forbedringer i ornamentale løvavlinger og trær. Et mindre innlysende mål for plantebio-teknologi som innbefatter både genetisk manipulering og vevskulturanvendelse, er den økte produksjon av et stort antall planteavledede kjemiske forbindelser, innbefattende smaksstoffer, luktstoffer, pigmenter, naturlige søtningsmidler, industrielle matvarer, antimikrobielle midler og farmasøytiske midler. I de fleste tilfeller tilhører disse forbindelser en relativt bred metabolsk gruppe, kollektivt betegnet som sekundære produkter. Planter kan danne slike sekundære produkter for å skremme vekk potensielle rovdyr, tiltrekke pollinatorer eller bekjempe infeksjonssykdommer.
Plantecellekulturer kan etableres fra en imponerende mengde plantetyper og kan fremdyrkes i en bioreaktor. Typiske plantetyper innbefatter de fleste av slike som danner sekundære produkter av kommersiell interesse. Det er blitt klart vist i et antall agrikulturelt viktige avlingsplanter at stabile genetiske varianter som stammer fra vevskulturen av somatiske planteceller (somaklonal variasjon), kan indu-
seres og velges ut. Mange fordeler stammer fra plantevevsdyrking av sekundære forbindelser. Disse innbefatter (1) muligheten for økt renhet av det resulterende produkt, (2) omdannelsen av billige precursorer til dyre sluttprodukter ved biotransformasjon og (3) potensialet for å tilføre substratanaloger til kulturen for å danne nye forbindelser.
Enten målet for genetisk manipulering av planter er en åker-avling, ornamental busk, blomst, tre eller en vevskultur for bruk i en bioreaktor, er en hovedfordel kontrollen av ekspresjon av det chimeriske gen, slik at det uttrykkes kun på det passende tidspunkt og i passende utstrekning, og i enkelte situasjoner i spesielle deler av planten. For eks-
empel for å oppnå en ønsket fenotype, behøver det chimeriske gen å bli uttrykt ved et nivå på 1% av det totale protein eller høyere. Dette kan godt være tilfelle for motstandsdyktighet mot sopp, bundet chimerisk chitinaseekspresjon eller insektmotstandsdyktighet grunnet økt proteinaseinhibitorekspresjon. I disse tilfeller kan den energi som brukes for å fremstille høye nivåer av fremmed protein, resultere i en forverring hos planten, mens dersom genet ble uttrykt kun når det var ønsket, f.eks. når en sopp- eller insektinfeksjon er nær forestående, kunne energiforbruket og følgelig utbyttet bli redusert.
Alternativt kunne fenotypen uttrykt av det chimeriske gen resultere i en uønsket effekt for planten dersom det uttrykkes ved upassende tidspunkter under utviklingen. For eksempel dersom det chimeriske genprodukt var et plantehormon som induserte frøhusavstøtning, kunne tidlig ekspresjon føre til avstøtning av frukten fra planten før fruktfrøet hadde modnet, noe som resulterer i minsket utbytte. I dette tilfelle ville det være meget mer fordelaktig å indusere ekspresjonen av denne gentype ved et tidspunkt når frøhusavstøtning er foretrukket eller minst skadelig for planten.
For vev i kultur eller i en bioreaktor kan upassende frem-
stilling av et sekundært produkt føre til en minsking i vekstgraden av kulturen, noe som resulterer i en minsking i utbyttet av produkt. Følgelig ville det være fordelaktig å tillate kulturen å vokse uten å uttrykke det sekundære produkt, og så indusere det chimeriske gen ved et passende tidspunkt for å tillate en optimalisert ekspresjon av det ønskede produkt.
I betraktning av slike vurderinger, så vel som andre, er det klart at kontroll av tidspunktet, utstrekningen og/eller ekspresjonsstedet av det chimeriske gen i planter eller plantevev ville være svært ønskelig. Kontroll som kunne utføres på lett måte i marken, i veksthus eller i en bio-reaktor, ville være av spesiell kommersiell verdi.
Flere plantegener er kjent for å bli indusert ved forskjellige innvendige og utvendige faktorer, innbefattende plante-hormoner, varmesjokk, kjemikalier, patogener, mangel på oksygen og lys. Selv om få av disse systemer er blitt beskrevet i detalj, fører i de best karakteriserte en økt akkumulering av rnRNA til et økt nivå av spesifikt proteinprodukt.
Som et eksempel på genregulering av et plantehormon er abscisinsyre (ABA) blitt vist å indusere sen embryogenese med rik mengde av mRNA hos bomull, se Galau, G. A. et al., Plant Mol. Biol. 7,155 (1986). I et annet eksempel induserer gibberellinsyre (GA3) malatsyntasetransskripter i lakserbønnefrø og alfa-amylaseisozymer i byggaleuronlag, se Rodrigues, D. et al., Plant Mol. Biol. 9,227 (1987);NolanRC. et al., Plant Mol. Biol. 8,13
(1987).
Reguleringen av varmesjokkproteingener hos soyabønne er blitt studert i detalj. Behandling av planter i flere timer ved 40°C resulterer i de novo-syntese av flere såkalte varmesjokkproteiner (Key, J. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 78,3526 (1981). Flere slike gener er blitt isolert og deres regulering studert i detalj. Ekspresjonen av disse gener er primært kontrollert ved transskripsjonsnivå. Promoteren av hsp70-genet er blitt fusert til neomycinfosfotransferase II (NptU)-genet, og det chimeriske gen er blitt vist å bli indusert ved varmesjokk (Spena, A. et al., EMBO J. 4,2736 (1985)), men ved et lavere nivå enn de endogene varmesjokkgener.
En annen klasse av induserbare gener i planter innbefatter lysregulerte gener og spesielt de cellekodede gener for den lille subenhet av ribulose-l,5-difosfatkarboksylase (RUBISCO).
Morelli, G. et al. (Nature 315, 200 (1985)) og Hererra-Estrella, L. et al. (Nature 310, 115
(1984)) har vist at de 5' flankerende sekvenser av et ert-RUBISCO-gen kan gi
lysinduserbarhet til et rapporteringsgen når det er festet på chimerisk måte. Denne
observasjon er blitt utvidet til andre lysinduserbare gener, så som det klorofyll-a/b-bindende
i protein.
Alkoholdehydrogenase (adh)-genene hos mais er blitt studert i utstrakt grad. adhl-genet hos mais ble isolert og en del av 5' flankerende DNA ble vist å være i stand til å indusere
ekspresjon av et chimerisk rapporteringsgen (dvs. kloramfenikol-acetyltransferase, CAT) når : transient transformert vev ble underkastet anaerobiske betingelser (Howard, E. et al., Planta 170, 535 (1987)).
En gruppe kjemikalier kjent som sikrere ("safeners") er blitt utviklet for å beskytte eller
"sikre" avlinger mot potensielt skadelige tilføringer av herbicider. Selv om en generell
i mekanisme for virkningen av slike forbindelser ikke er blitt fullstendig utviklet, er regulering av naturlig regulerbare gener av slike forbindelser en mulig mekanisme. Det er nylig blitt rapportert at høyere nivåer av glutation-S-transferase (GST) blir indusert i mais behandlet med sikreren 2-Mor-4-(trifluometyl)-5-metyl-tia se Wiegand,
R C. et al., Plant Mol. Biol. 7,235 (1986). Selv om nivået av GST-mRNA økes ved behand-> ling med sikrer, ble mekanismen som fører til økningen ikke angitt.
Mange planter blir når de når hypersensitivitet mot forskjellige patogener, stimulert til å danne en gruppe av syreutskillbare lavmolekylvekt-patogeneserelaterte (PR)-proteiner (Van Loon,
L.C., Plant Mol. Biol. 4,111 (1985)). Av spesiell interesse er imidlertid observasjonen at
) disse samme PR-proteiner akkumulerer til høye nivåer i planter behandlet med kjemikalier, så
som polyakrylsyre og acetylsalisylsyre (Gianinazzi, S. et al., J. Gen. Virol. 23,1 (1974);
White, R.F., Virology 99,410 (1979)). Tilstedeværelsen av PR-proteiner er blitt korrelert med induksjonen av både en lokal og systemisk motstandsdyktighet mot en mengde
patogener. Et interspesifikt tobakkhybrid motstandsdyktig mot tobaklanosaikkvirus (TMV)
5 ble vist å uttrykke PR-proteinene konstitutivt (AM, P. et al., Plant Sei. Lett. 26,173 (1982)). Videre indikerte immunoutfelling av in vitro translasjonsprodukter som bruker mRNA fra enten TMV-infiserte eller kjemisk behandlede tobakksplanter (Cornelissen, B.J.C. et al., EMBO J. 5, 37 (1986); Carr, J.P. et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA 82, 7999 (1985)) at det økte nivå av PR-protein var et resultat av RNA-akkumulering. Følgelig gir induksjon av PR-proteingener av kjemi-
kalier eller patogener en metode for å nærme seg problemet med kjemisk regulering av genekspresjon i planter og plantevev.
Foreliggende oppfinnelse angår ikke-kodende DNA-sekvens fra det 5' ikke-kodende område av et naturlig forekommende gen som koder for et patogenese-relatert protein, som naturlig ligger umiddelbart oppstrøms for det kodende område av nevnte gen, kjennetegnet ved at den ikke-kodende DNA-sekvensen er i stand til å regulere transkripsjonen av en assosiert DNA-sekvens hos en plante eller i et plantevev, hvilken assosierte DNA-sekvens blir transkribert som et RNA som er i stand til å regulere ekspresjonen av en fenotypisk egenskap ved en anti-sense-mekanisme, eller som alternativt koder for et polypeptid som gir den fenotypiske egenskapen, hvor denne reguleringen er avhengig av en forbindelse som innbefatter et benzo-l,2,3-tiadiazol eller en pyridinkarboksylsyrestruktur.
Oppfinnelsen angår videre chimerisk DNA-sekvens kjennetegnet ved at den omfatter en første ikke-kodende DNA-sekvens ifølge kravene 1 til 6 og en andre DNA-sekvens som er i stand til å bli transkribert og translatert for å danne et polypeptid som gir en fenotypisk egenskap.
Oppfinnelsen vedrører i tillegg en vektor, kjennetegnet ved at den omfatter en ikke-kodende DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen.
Oppfinnelsen vedrører videre et plasmid, kjennetegnet ved at det er plasmid pBS-PR1013Cla, ATCC nummer 40426, deponert 11. februar 1988, og som omfatter DNA-sekvensen som inneholder tobakk-PR-la-genet.
Oppfinnelsen vedrører ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av en i hovedsak ren kjemisk regulerbar DNA-sekvens ifølge krav 1, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) å transformere planteceller eller plantevev med første DNA-sekvenser fra det 5' ikke-kodende område av naturlig forekommende kjemisk induserbare gener som naturlig ligger ved siden av det kodende område av slike gener eller vektorer inneholdende slike sekvenser, en andre DNA-sekvens som er en verts-selekterbar gen-markør og en tredje DNA-sekvens som koder for en fenotypisk egenskap; (b) å tilføre en kjemisk regulator til nevnte transformerte vertscelle; (c) å måle ekspresjonen eller selektere for endringen i ekspresjon av den fenotypisk
egenskap som er kodet for av den tredje DNA-sekvens; og
(d) identifisere og isolere 5' ikke-kodende sekvenser som endrer ekspresjonen av den
nevnte fenotypiske egenskap.
Oppfinnelsen angår også en assay for P-l,3-glukoronidase (GUS)-aktivitet i en plante som uttrykker GUS under kontroll av en ikke-kodende DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen, kjennetegnet ved at det omfatter å omsette plantevevekstrakter i prøver på mindre enn 0,5 ml inneholdende 1,5 til 3 mM 4-metyl-umbelliferyl-glukoronid ved omkring 37°C i 1 til 5 timer og derpå bestemme konsentrasjonen av den frigjorte fluorescente indikator. FIGUR 1. Partielt restriksjons-endonukleasekart av lambda tobchrPR1013. Det 49 kb rekombinante faggenom er vist med høyre og venstre armer av lambda angitt. 19 kb tobakkinnskuddet er forstørret under lambdakartet. Beliggenheten av PR-la-genet (utkrysset boks) og transskripsjonsretningen (pil) er angitt. P = Pst, H = HindTTF, C = ClaL R = EcoRI. FIGUR 2. Konstruksjonen av pBS-PR1013Cla fra lambda tobchr-PR1013 er vist. 19 kb DNA-fragmentet mellom de to Clal-seter ble subklonet i kopiplasmidet. C = ClaL LGT-agarose = lavtemperatur-gelformende agarose. FIGUR 3. Dannelsen av pBS-PR1013Eco fra lambda tobchrPR1013 er angitt. 3,6 kb EcoRI-fragmentet inneholdende PR-1 A-genet fra lambda tobchrPR1013, er subklonet i kopi. R = EcoRI, LGT-agarose = lavtemperatur-gelformende agarose. FIGUR 4. Dannelsen av pBS-PR1013Eco fra pBS-PR1013Cla er vist. 3,6 kb EcoRI-fragmentet inneholdende PR-la-genet, er subklonet i EcoRI-setet av kopiplasmidet, C = Clal, R = EcoRI, LGT = gelformende lavtemperaturagarose. FIGUR 5. Dannelsen av pBS-PR1013Eco Pst fra pBS-PR1013Eco er vist. 600 bp Pstl-fragmentet er utspaltet fra pBS-PR1013Eco. P = PstL R = EcoRL X = Xhol, S = SalL LGT-agarose = geldannende lavtemperaturagarose. FIGUR 6. Dannelsen av pBS-PR1013Eco Pst Xho frapBS-PR1013Eco Pst er vist. 2 kb Xhol-fragmentet er utspaltet fra plasmidet pBS-PR1013Eco Pst. R = EcoRL P = Pstl, X = Xhol, S = SalL LGT-agarose = lavtemperatur-geldannende agarose.
FIGUR 7. Dannelsen av pCIB270 fra pBI101.3 og pBS-PR1013-
Eco Pst Xho er vist. Pstl-XhoI-rfagmentet inneholdende deler av PR-la-genet og den 5' flankerende sekvens subklones i Sall-BamHI-fordøyet PbI101.3. Xhol- og Sall-setene er kompatible og når de ligeres, ødelegger de begge restriksjonsseter. Pstl-setet er tilpasset BamFfl-setet ved å bruke en molekylær adapter. X = XhoL P = Pstl, (X/S) = setet for Xhol og Sall-fusjon. Ingen av enzymene vil nå spalte ved dette (X/S)-sete. LB = T-DNA venstre grense, RB = T-DNA høyre grense. Transskripsjonsretning fra den PR-la-induserbare region er vist med pil på pCTB270. Det utkryssede område på pCIB270 representerer det 3'-prosesserende sete av NOS-genet. Det skyggelagte område av pCIB270 representerer 13-glukoronidasegenet. Det stiplede område av pCIB270 representerer neomycinfosfotransferase U-genet. Det stripelagte område av pCIB270 representerer NOS-promoteren. FIGUR 8. Dannelsen av M13mpl8-PR1013Eco Pst Xho ogM13mpl9-PR1013Eco Pst Xho er vist. PstI-Asp718-fragmentet inneholdende deler av den PR-la-kodende sekvens og den 5' flankerende sekvens subklones fra pBS-PR1013Eco Pst Xho til Asp718-PstI-fordøyet M13mpl8 eller 19. R = EcoRL H = HindUL P = PstL K = Kpnl (Asp718 er isoschizomer av Kpnl), LGT-agarose = lavtemperatur-geldannende agarose. FIGUR 9. Strømningsdiagram som viser omdannelsen av ATG-kodonet av PR-1 a til et Ncol-sete. Det enkeltkjedede DNA av M13mpl8-PR1013Eco Pst Xho er vist med en heltrukket linje. Sekvensen TCATGG omdannes til CCATGG ved seterettet mutagenese. K = KpnL X = Xhol, B = BstEIL P = Pstl. FIGUR 10. Dannelsen av pCTB268 er vist. BstEU-Pstl-fragmentet avledet fra den replikative formavM13mpl8-PR1013Eco Pst Xho.Nco subklones i BstEU-Pstl-fordøyet pBS-PR1013Eco Pst Xho for å danne PCIB268. X = Xhol, B = BstEIL N = NcoL P = Pstl. FIGUR 11. Dannelsen av pCTB269 fra pBS-GUS1.2 og pCIB268 er vist. X = XhoL N = Ncol, P = Pstl. Den utkryssede boks av pCIB269 angir GUS-gensekvensene, og den skyggelagte boks viser sekvensene avledet fra PR-la-genet. FIGUR 12. Dannelsen av pBS-GUS1.2 er vist. pBS-GUS1.2 dannes via treveis ligering fra fragmenter avledet fra pRAJ265, pBI221.1 og pBluescript. S = Sali, R = EcoRI, N = Ncol. FIGUR 13. Dannelsen av pCIB271 fra pCIB269 og pCIB200 er vist. X = XhoL N = NcoL R = EcoRI, S = SalL (S/X) = fusjon av Sali- og Xhol-seter, LGT-agarose = lavtemperatur-geldannende agarose. FIGUR 14. Restriksjons-endonukleasekart av pCTB219. Dette plasmid dannes ved å tilsette en EcoRI/XhoI-adapter til pCIB269 XhoIÆcoRI-rfagmentet inneholdende PR-1- og GUS-genet og ligere dette i Sall-spaltet pCTB712. FIGUR 15. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB272. Dette plasmid dannes ved å ligere et Asp718I/BamHI-fragment fra pCIB282 inneholdende et PR-l/GUS-gen (+833 til +1 av PR-la) i Asp718IZBamHI-spaltet pCIB200. FIGUR 16. Restriksjons-endonukleasekart av pCTB273. Dette plasmid dannes ved å ligere et Asp718I/Barnlff-fragment fra pCD3283 inneholdende et PR-l/GUS-gen (-^03 til +1 av PR-la) i Asp718I/BamHI-spaltet pCIB200. FIGUR 17. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1004. Dette plasmid dannes ved å ligere et XhoIZNcoI-fragment fra pCH3269 (inneholdende PR-la-promoteren) med BT-genet utspaltet fra pCIB10/35Bt (607) som et Ncol/BamHI-fragment og Sall/BamHI-fordøyet pCIB710. FIGUR 18. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/PRl-BT. Dette plasmid dannes fra pCIB1004ogpCIB200. FIGUR 19. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1207. Et 5,8 kb Xbal-fragment av den lambdagenomiske klon inneholdende Arabidopsis AHAS-genet klones i Xbal-spaltet Bluescript. FIGUR 20. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1216. Et 3,3 kb NcoI/Xbal-fragment fra pCIB1207 klones i pCIB269 som er blitt spaltet med Ncol og Xbal for å fjerne GUS-genet. FIGUR 21. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1233. Et 4,2 kb Kpnl/Xbal-fragment isoleres fra pCTB1216 og ligeres i pCIB200 som er blitt spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 22. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.1/GUS. Et 1462 bp fragment av pBSGluc39.1 klones i pBS-GUS1.2 som er blitt spaltet med Ncol og Kpnl. FIGUR 23. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.1-GUS. Et Kpnl/Xbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og GUS-genet, isoleres fra pBSGluc39.1/GUS og ligeres i pCIB200 spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 24. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.1-BT. Et Kpnl/Ncol-fragment fra pCIB1004 inneholdende BT-genet, et Kpnl/NcoI-fragment fra pBSGluc39.1/GUS og pCIB200 spaltet med KpnL behandles med kalvethymus alkalisk fosfatase og ligeres. FIGUR 25. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.1/AHAS dannet fra et NcoJVXbal-fragment av pBSGluc39.1/GUS og et 3,3 kb NcoI/Xbal-fragment fra pCIB1207 inneholdende AHAS-genet. FIGUR 26. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.1-AHAS. Et Kpnl/Xbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og AHAS-genet, isoleres fra pBSGluc39.1/AHAS og ligeres i pCIB200 spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 27. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.3/GUS. Et 1677 bp fragment av pBSGrluc39.3 klones i pBS-GUS1.2 som er blitt spaltet med Ncol og Kpnl. FIGUR 28. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.3-GUS. Et Kpnl/Xbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og GUS-genet, isoleres fra pBSGluc39.3/GUS og ligeres i pCTB200 spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 29. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.3-BT. Et Kpnl/Ncol-fragment fra pCIB1004 inneholdende BT-genet, et Kpnl/NcoI-fragment fra pBSGluc39.3/GUS og pCIB200 spaltet med Kpnl og behandlet med kalvethymus alkalisk fosfatase, ligeres. FIGUR 30. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.3/AHAS dannet fra et Ncol/Xbal-fragment av pBSGluc39.3/GUS og et 3,3 kb Ncol</>Xbal-fragment fra pCIB1207 inneholdende AHAS-genet. FIGUR 31. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.3-AHAS. Et KpnlTXbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og AHAS-genet, isoleres fra pBSGluc39.3/AHAS og ligeres i pCIB200 spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 32. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1208. Et 5,8 kb Xbal-fragment av lambdagenomklonet inneholdende et mutert Arabidopsis AHAS-gen, klones i Xbal spaltet med Bluescript. FIGUR 33. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1230. Et 3,3 kb NcoI/Xbal-fragment fra pCIB1208 klones i pCIB269 som er blitt spaltet med Ncol og Xbal for å fjerne GUS-genet. FIGUR 34. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB1232. Et 4,2 kb Kpnl/Xbal-fragment isoleres fra pCffl 1230 og ligeres i pCIB200 som er blitt spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 35. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.1/AHAS-SuR dannet fra et Ncoi<y>Xbal-fragment av pBSGluc39.1/GUS og et 3,3 kb NcoLXbal-fragment fra pCIB1208, inneholdende AHAS-genet. FIGUR 36. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR Et KpruVXbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og AHAS-genet, isoleres fra pBSGluc39.1/AHAS-SuR og ligeres i pCIB200 spaltet med Kpnl og Xbal. FIGUR 37. Restriksjons-endonukleasekart av pBSGluc39.3/AHAS-SuR dannet fra et NcoI/Xbal-fragment av pBSGluc39.3/GUS og et 3,3 kb NcoI/Xbal-fragment fra pCIB1208, inneholdende AHAS-genet. FIGUR 38. Restriksjons-endonukleasekart av pCIB200/Gluc39.3-AHAS-SuR. Et Kpnl/Xbal-fragment inneholdende B-glukanasepromoteren og AHAS-genet, isoleres fra pBSGluc39.3/AHAS-SuR og ligeres i pCIB200 spaltet med Kpnl og Xbal.
Sekvens 1 angir den genomiske DNA-sekvens av 2 kb parfragmentet mellom Xhol- og BgUI-setene av tobakk-PR-la-genet. Pilen ved ca. nukleotid 903 angir det transskirpsjonene startsete, og de vertikale piler merket 207 og 313 identifiserer endene av to uavhengige cDNA-kloner. Polypeptidsekvensen kodet for av den kodende del av genet, er også angitt.
Sekvens 2 angir den genomiske DNA-sekvens av tobakk-PR-l-genet og aminosyresekvensen til polypeptidet som er kodet for av den kodende region av genet.
Sekvens 3 angir cDNA-sekvensen av agurk-PR-chitinase og aminosyresekvensen av polypeptidet som er kodet for av den kodende region av genet.
Sekvens 4 angir cDNA-sekvensen av hovedformen av tobakk-PR-R-genet, og (4a) angir både sekvensen (4) og aminosyresekvensen av polypeptidet som er kodet for av den kodende region av genet.
Sekvens 5 angir den genomiske DNA-sekvens av det grunnleggende tobakk-B-1,3-glukanasegen inneholdt i klonen pBSGHuc39.1.
Sekvens 6 angir den genomiske DNA-sekvens av det grunnleggende tobakk-B-1,3-glukanasegen inneholdt i klonen pBSGluc39.3.
Sekvens 7 angir cDNA-sekvensen av tobakk-PR-Q inneholdt i plasmidet pBSchtl5.
Sekvens 8 angir DNA-sekvensen av et isolert cDNA inneholdt i plasmidet pBSGL6e. cDNA koder for den sure form av B-1,3 - glukanase.
Foreliggende oppfinnelse beskriver isoleringen, kloningen og identifiseringen av DNA-sekvenser som er i stand til å regulere transskripsjonen i plantevev av en assosiert DNA-sekvens hvor reguleringen er avhengig av en kjemisk regulator. Disse DNA-sekvenser kan bli brukt for å danne chimer-iske gener hvor ekspresjonen av genet kan reguleres med slike regulatorer. Muligheten for å regulere ekspresjonen av et chimerisk gen i en transgen plante ved en kjemisk metode, er anvendelig for å erholde passende ekspresjon av den feno-typiske egenskap med minimal uønsket effekt på veksten og utviklingen av planten. Denne regulering er viktig ved dannelsen av sekundære produkter eller andre klonede produkter i plantevev i kultur eller bioreaktorer. Reguleringen av den klonede sekvens er også viktig i reguleringen av andre genprodukter ved en antisensmekanisme.
Ekspresjonen av en gitt kodende sekvens ved enhver gitt tid kan reguleres ved bruk av en kjemisk regulator typisk tilført plantevevet. Gener involvert i kontrollen av spesielle utviklingsmessige overgangstrinn kan også reguleres ved å assosiere en kjemisk regulerbar DNA-sekvens med en passende kodende DNA-sekvens. På denne måte kan utviklingen til en plante stoppes ved et spesielt trinn eller akselereres i en spesiell grad, inntil nivået av en kjemisk regulator økes eller reduseres.
De kjemisk regulerbare DNA-sekvenser kan bli brukt til å drive ekspresjonen av fremmede gener som f.eks. gir herbicidresistens eller toleranse (f.eks. atrazintoleranse i soyabønne), gir insektresistens (f.eks. Bacillus thuringiensis krystallprotein i bomull) eller krever selektiv ekspresjon (så som han- eller hunsterilitet). De kjemisk regulerbare DNA-sekvenser kan også bli brukt til å drive transskripsjonen av en DNA-sekvens som vil kontrollere ekspresjonen av en andre kodende sekvens ved en antisensmekanisme.
Følgelig har foreliggende oppfinnelse et antall mål:
a. I hovedsak rene kjemisk regulerbare DNA-sekvenser som er i stand til å kontrollere genetisk aktivitet i plantevev av andre DNA-sekvenser som svar på en kjemisk regulator.
b. Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser i kombinasjon med deler, men ikke alt, av enhver kodende DNA-sekvens til hvilken de er assosiert, i naturlig forekommende gener.
c. Vektorer inneholdende de chimeriske gener som er hovedmålet for oppfinnelsen.
d. Fremgangsmåter for chimerisk å regulere ekspresjonen av DNA-kodende sekvenser assosiert med de kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, f.eks. for å regulere en fenotypisk egenskap.
e. Fremgangsmåte for å identifisere nye kjemiske regulatorer ved å bruke chimeriske gener ifølge foreliggende oppfinnelse, og plantevev inneholdende disse.
Andre mål kan også finnes fra den følgende beskrivelse av oppfinnelsen.
For å gi en klar og konsistent forståelse av beskrivelsen og kravene, innbefattende bredden som er gitt slike termer, er de følgende definisjoner gitt: Antisensmekanisme: En mekanisme for genregulering basert på kontrollering av translasjonshastigheten av mRNA til protein forårsaket av tilstedeværelsen av et RNA-molekyl i en celle som er komplementært til minst en del av det mRNA som blir translatert. Assosiert DNA- sekvens: En DNA-sekvens hvis cellulare aktivi-tet enten (1) regulerer aktiviteten av en annen DNA-sekvens eller (2) er regulert av en annen DNA-sekvens. Denne defini-sjon omfatter spesielt, men er ikke begrenset til, sekvenser som ligger fysisk ved siden av hverandre i en kontinuerlig DNA-kjede eller som er fysisk atskilt. Fysisk separasjon innbefatter f.eks. separasjon innen samme DNA-kjede, beliggenhet innen forskjellige DNA-kjeder eller diskontinuerlige oppstykkede sekvenser (f.eks. alternerende regulerbare og kodende sekvenser) i én kjede.
Kjemisk regulerbar DNA- sekvens: En DNA-sekvens som er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens hvor reguleringen er avhengig av en kjemisk regulator. Sekvensene kan være av naturlig eller syntetisk opprinnelse.
Kjemisk regulerbart gen: Et gen inneholdende minst én ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens og minst én assosiert kodende DNA-sekvens. Genene kan være av naturlig, syn-
tetisk eller delvis naturlig/delvis syntetisk opprinnelse.
Kjemisk regulator (for en kjemisk regulerbar DNA-sekvens): En elementær eller molekylær enhet som kontrollerer (f.eks. initierer, terminerer, øker eller reduserer), ved direkte eller indirekte virkning, aktiviteten av en kjemisk regulerbar DNA-sekvens i et system hvor den kjemiske regulator ikke normalt er funnet i en aktiv form i en mengde som er til-
strekkelig for å fremskaffe regulering av transskripsjon, i den grad og på det tidspunkt som er ønsket av en transskriberbar DNA-sekvens assosiert med den kjemisk regulerbare DNA-sekvens. Denne terminologi har til hensikt å omfatte situasjoner hvor ingen eller meget lite regulator er til stede når transskripsjon er ønsket, eller når en eller annen regulator er til stede, men økt eller minsket regulering er krevet for å fremskaffe mer eller mindre transskripsjon etter ønske.
Således - dersom systemet inneholdende den kjemisk regulerbare DNA-sekvens er en plante, f.eks. en transgen plante, er en kjemisk regulator en enhet som ikke naturlig finnes i planten i en mengde som er tilstrekkelig for å fremskaffe kjemisk regulering og således transskripsjon av et assosiert gen i den ønskede grad ved den ønskede tid.
Med "direkte virkning" er det ment at den kjemiske regulatorvirkning stammer fra den direkte interaksjon mellom den kjemiske regulator og DNA-sekvensen. Med "indirekte virkning menes at regulatorvirkningen stammer fra den direkte inter-
aksjon mellom den kjemiske regulator og en eller annen endo-gen eller eksogen komponent i systemet, hvor sluttresultatet av denne direkte interaksjon er aktiveringen eller under-trykkingen av aktiviteten av DNA-sekvensen. Med "aktiv form" er det ment at den kjemiske regulator er i en form som er nødvendig for å oppnå kontroll.
Chimerisk sekvens eller gen: En DNA-sekvens som inneholder minst to heterologe deler, f.eks. deler avledet fra naturlig forekommende DNA-sekvenser, som ikke er assosiert i sin naturlig forekommende tilstand eller inneholdende minst en del som er av syntetisk opprinnelse og ikke funnet i naturen.
Kodende DNA- sekvens: En DNA-sekvens som, når den transskriberes eller translateres, resulterer i dannelsen av et cellulart polypeptid.
Gen: En atskilt kromosomal region som er ansvarlig for et spesielt cellulart produkt.
Ikke- kodende DNA- sekvens: En DNA-sekvens som ikke er trans-
skribert og translatert og resulterer i dannelsen av et cellulart polypeptid når det er assosiert med en spesiell kodende DNA-sekvens. Således kan f.eks. en sekvens som er ikke-kodende når den er assosiert med en kodende sekvens, faktisk være kodende når den er assosiert med en annen kodende eller ikke-kodende sekvens.
Fenotypisk egenskap: En observerbar egenskap som stammer fra ekspresjonen av et gen.
Plantevev: Ethvert vev av en plante, i planter eller i kultur. Dette begrep innbefatter, men er ikke begrenset til, hele planter, planteceller, planteorganer, plantefrø, proto-plaster, callus, cellekulturer og enhver gruppe av planteceller som er organisert i strukturelle og/eller funksjonelle enheter. Bruken av dette uttrykk i sammenheng med eller i fravær av enhver spesiell type plantevev, som opp-
summert ovenfor, eller ellers omfattet av denne definisjon er ikke ment å være ekskluderende for enhver annen type plantevev.
PR- eller patogeneserelaterte proteiner: Proteiner uttrykt i planter som reagerer hypersensitivt overfor patogener. Dette uttrykk omfatter, men er ikke begrenset ul de sure og basiske former av tobakk-PR-la-, -PR-lb-, -PR-lc-, -PR-1'-, -PR-2-, -PR-N-, -PR-O-, -PR-P-, -PR-Q-, -PR-S-, -PR-R-proteiner, chitinasen som er en basisk motpart av PR-P eller PR-Q og 6-1,3-glukanasen (glukan-endo-l,3-B-glukosidase, EC3.2.1.39), som er basisk motpart avPR-2, PR-N eller PR-0 og den patogeninduserbare chitinase fra agurk. En hypersensitiv reaksjon er karakterisert ved en lokal nekrose av vevet som ligger umiddelbart rundt infeksjonsstedet for patogenet og den etterfølgende beliggenhet av patogenet som er i motsetning til en sensitiv reaksjon hvor patogenet sprer seg gjennom hele planten. Patogener er f.eks. virus eller viroider, så som tobakk- eller agurkmosaikkvirus, rmgflekkvirus eller nekrosevirus, pelargoniumløvkrøllevirus, rødkløverlfekkvirus, tomatbuskstumpvirus og lignende virus, sopp, f.eks. Phythophthora parasitica eller Peronospora tabacina. bakteirer, f.eks. Pseudomonas syringae eller Pseudomonas tabaci eller insekter, f.eks. Myzus persicae. Denne liste er på ingen måte begrensende.
Regulering: Økningen (induksjonen) eller minskingen (represjonen) av ekspresjonsnivået for et gen eller transskripsjonsnivået for en DNA-sekvens. Denne definisjon er ikke beregnet på å omfatte noen spesiell mekanisme.
I hovedsak ren DNA- sekvens: En DNA-sekvens isolert i hoved-
sak i ren form fra en naturlig eller ikke-naturlig kilde. En slik sekvens kan inntreffe i et naturlig system, f.eks. i bakterier, virus eller i plante- eller animalske celler, eller kan f.eks. bli fremskaffet ved syntetisk metode eller som en cDNA-sekvens. I hovedsak rene DNA-sekvenser blir vanligvis isolert i form av en vektor omfattende det angjel-dende DNA. I hovedsak ren betyr at andre DNA-sekvenser enn den aktuelle er til stede kun i marginale mengder, f.eks. mindre enn 5 %, mindre enn 1 % eller fortrinnsvis mindre enn 0,1 %. I hovedsak rene DNA-sekvenser og vektorer inneholdende disse, kan være og er typisk fremstilt i oppløsning, f.eks. i vandig oppløsning inneholdende buffere, eller i vanlige kulturmedier.
Vesentlig sekvenshomologi: Vesentlig sekvenshomologi betyr nært strukturelt slektskap mellom sekvenser av nukleotider eller aminosyrer. For eksempel kan vesentlig homologe DNA-sekvenser være 80 % homologe, fortrinnsvis 90 % eller 95 % homologe, og vesentlig homologe aminosyresekvenser kan typisk være 50 % homologe eller mer. Homologi innbefatter også et forhold hvor én eller flere sekvenser av nukleotider eller aminosyrer mangler, eller subsekvenser med ytterligere mellomliggende nukleotider eller aminosyrer.
Foreliggende oppfinnelse angår ikke-kodende DNA-sekvenser som er i stand til å regulere, under påvirkning av en kjemisk regulator, transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev. Spesielt omfatter fore-liggende oppfinnelse en ikke-kodende DNA-sekvens som er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator. Fortrinnsvis opptrer DNA-sekvensen i hovedsak i ren form relativt til genet og genomet hvori de inntreffer dersom de stammer fra en natur-
lig kilde, eller relativt til en DNA-blanding dersom de stammer fra en syntetisk blanding.
Foretrukket er ikke-kodende, kjemisk regulerbare DNA-sekven-ser ifølge foreliggende oppfinnelse, slike som når de er assosiert med en kodende DNA-sekvens, regulerer ekspresjonen av den kodende sekvens i plantevev hvor utstrekningen av regulering er avhengig av en kjemisk regulator. Slike sekvenser kan syntetiseres de novo eller er avledet (f.eks. isolert eller klonet) fra et naturlig inntreffende, kjemisk regulerbart gen. Nærværet av kjemisk regulerbare DNA-sekven-ser ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til plantevev, dvs. de kjemisk regulerbare DNA-sekvenser kan være avledet fra et antall naturlige kilder, f.eks. bakterielle, virale eller animalske kilder. Det kan være avledet f.eks. fra den 5' flankerende region eller fra den 3' flankerende region av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen. Alternativt kan den ikke-kodende DNA-sekvens være kjemisk syntetisert eller enzymatisk syntetisert som cDNA, som er identisk med eller som har i hovedsak samme sekvenshomologi som den isolerte sekvens. Ved å klone den kjemisk regulerbare, ikke-kodende DNA-sekvens, kan sekvensen separeres fra andre sekvenser som er hosliggende til denne i det naturlig forekommende gen. På denne måte kan en i hovedsak ren DNA-sekvens erholdes.
I dette aspekt av foreliggende oppfinnelse omfatter regulering kjemiske regulatorer som enten er induserende eller represserende regulatorer. Eksempler på kjemisk represserbare gener, dvs. gener som undertrykkes med et represserende kjemikalie, innbefatter f.eks. gener som TrpR eller AroH, hvor tilsetningen av tryptofanrepressor eller tryptofan i seg selv undertrykker ekspresjonen av disse gener. Mange andre gener eksisterer som er regulert ved denne type slutt-produktrepresjon, og i hvert tilfelle virker sluttproduktet som en kjemisk regulator som kan bli brukt for å undertrykke ekspresjonen av genet. Foreliggende oppfinnelse omfatter de regulerbare deler av slike gener i seg selv eller som deler av chimeriske konstruksjoner som kan reguleres kjemisk for transskripsjon av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev.
Eksempler på kjemisk induserbare gener, dvs. gener som induseres med en induserende kjemisk regulator, er PR-proteingenene, spesielt tobakk-PR-proteingenene, f.eks. PR-la-, PR-lb-, PR-lc-, PR-1-, PR-Q-, PR-R- og PR-S-genene, agurkchitinasegenene og de basiske og sure tobakk-B-l,3-glukanasegener. I et spesielt aspekt omfatter foreliggende oppfinnelse en i hovedsak ren DNA-sekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens som er en del av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen, f.eks. av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen i en plante eller plantevev fra en monocott, dicott eller gymnosperm. Fortrinnsvis er en slik DNA-sekvens i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev hvor den assosierte DNA-sekvens er en kodende sekvens. Transskripsjonen av nevnte DNA-sekvens kan være regulert med en undertrykkende kjemisk regulator eller en induserende kjemisk regulator. DNA-sekvenser som kommer spesielt i betraktning, er de hvor det kjemisk regulerbare gen er et PR-proteingen, f.eks. fra en dicotyledon plante, så som tobakk eller agurk. Mest foretrukket er DNA-sekvenser hvor det kjemisk regulerbare gen er ettobakk-PR-la-, -PR-lb-, -PR-lc-, -PR-1-, -PR-Q- eller -PR-R-gen, et agurkchitinasegen eller et basisk eller surt 13-1,3-glukanasegen, spesielt tobakk-PR-la- og -PR-l'-genet, men også agurkchitinasegenet og de basiske og sure tobakk-13-l,3-glukanasegener. I første rekke kommer DNA-sekvenser i betraktning hvor det kjemisk regulerbare gen er et tobakk-PR-la- eller basisk 13-1,3-glukanasegen.
De kjemisk induserbare DNA-sekvenser av de foretrukne PR- og relaterte gener ifølge oppfinnelsen opptrer tilsynelatende i de ikke-kodende sekvenser av den hosliggende region 5' flankerende til de kodende sekvenser. Som et representativt eksempel er det i en sekvens isolert fra et omtrentlig 6500 baseparfragment av tobakk-PR-la-genet, inneholdende deler av den kodende region, området med ca. 900 til ca. 1200 base-
par, naturlig hosliggende det transskripsjonelle startsete, blitt funnet å være kjemisk induserbart. Induserbarhet opprettholdes i et fragment derav inneholdende ca. 500 til ca. 700 basepar, naturlig hosliggende det transskripsjonelle startsete. Mest foretrukket er følgelig DNA-sekvenser som er beliggende i den 5' flankerende region av nevnte PR- og relaterte gener, f.eks. i de 1200 basepar som ligger ved siden av det transskripsjonelle startsete.
I tillegg til de fullstendig ikke-kodende, kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, beskrevet
ovenfor i del A, omfatter foreliggende oppfinnelse også de ikke-kodende DNA-sekvenser av en naturlig forekommende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens i kombinasjon med en deL men ikke alt, av en kodende sekvens med hvilken den regulerbare sekvens er assosiert i et naturlig forekommende gen. Mer spesielt omfatter foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis i hovedsak i ren form, en DNA-sekvens som omfatter en første DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen, hvor denne første komponentsekvens er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, og en andre DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med deler, men ikke alt, av en transskriberbar DNA-sekvens med hvilken første komponent er assosiert i det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen. Det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen kan være av planteopprinnelse, f.eks. forekommende i en monocotyledon eller dicotyledon plante, og kan være regulert med en undertrykkende eller en induserende kjemisk regulator. Den andre DNA-komponentsekvens vil typisk være en kodende sekvens. En foretrukket andre DNA-sekvens for foreliggende oppfinnelse er en sekvens som koder for
signalpeptidet av ethvert protein uttrykt av det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen.
Spesielt omfatter oppfinnelsen en slik DNA-sekvens som omfatter en første ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens og en andre kodende DNA-sekvens fra et PR-protein-gen, f.eks. et PR-proteingen fra en dicotyledon plante, foretrukket fra tobakk eller agurk, så som et PR-la-,
PR-lb-, PR-lc-, PR-1'-, PR-Q- eller PR-R-gen, et chitinasegen eller et gen for basisk eller sur B-l,3-glukanase. Fore-trukket er en DNA-sekvens fra et PR-proteingen hvor transskripsjonen reguleres med en induserende kjemisk regulator. Spesielt omfatter oppfinnelsen en DNA-sekvens hvor første ikke-kodende DNA-sekvens ligger i den 5' flankerende region av en av nevnte PR-proteingener, f.eks. beliggende ca. 2000 basepar ved siden av det transskripsjonelle startsete av nevnte PR-proteingen. Mest foretrukket er en DNA-sekvens som omfatter en foretrukket første ikke-kodende sekvens, som nevnt ovenfor, og en kodende DNA-sekvens som koder for et signalpeptid, som nevnt ovenfor.
Mest foretrukket er i hovedsak rene DNA-sekvenser, som vist i "sekvens 1, sekvens 2, sekvens 5 og sekvens 6", og i hovedsak rene DNA-sekvenser med vesentlig sekvenshomologi med disse "sekvenser" 1,2, 5 og 6. Disse "sekvenser" er eksempler på kjemisk regulerbare DNA-sekvenser som omfatter en første ikke-kodende og en andre kodende DNA-sekvens og er avledet fra PR-proteingenene tobakk-PR-la, -PR-1' og hhv. fra to former av basisk tobakk-B-l,3-glukanase. "Sekvens 1" viser sekvensen av det representative PR-la-gen fra tobakk. Nukleotid 1 til ca. 1150 er ikke-kodende, 5' flankerende kjemisk induserbar DNA-sekvens og deler av den PR-la-kodende sekvens som er naturlig forekommende i en tobakksplante. I dette tilfelle ligger den kjemisk induserbare komponentsekvens ved siden av den kodende sekvens. De nukleotider som koder for de første 30 aminosyrer, omfatter den kodende sekvens for signalpeptidet av PR-la-proteinet. Den kodende sekvens kan bli fjernet fra den ikke-kodende sekvens for å danne den ikke-kodende, kjemisk induserbare DNA-sekvens fri for enhver kodende sekvens, beskrevet ovenfor i del A. Slik fjerning kan utføres med konvensjonelle teknikker, så som restriksjons-enzymfordøying.
Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for fremstilling av en DNA-sekvens som omfatter en første DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med
en ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen hvor denne første komponentsekvens er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, samt en andre DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig
sekvenshomologi med deler, men ikke alt, av en transskriberbar DNA-sekvens med hvilken første komponent er assosiert i det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen og som er særpreget ved at dette DNA blir isolert fra et naturlig forekommende gen i hovedsak i ren form, eller syntetiseres kjemisk eller enzymatisk. Foretrukket er de spesielle fremgangsmåter som er nevnt i del A ovenfor og de i hovedsak rene DNA-sekvenser som erholdes derved.
Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse er en chimerisk DNA-sekvens (chimerisk gen) inneholdende minst én kjemisk regulerbar DNA-sekvens. To typer av slike chimeriske sekvenser er angitt som eksempler. Den enkleste eller to-
delte type chimerisk DNA-sekvens omfatter en kjemisk regulerbar DNA-sekvens og en transskriberbar DNA-sekvens, slik at det chimeriske gen er i stand til å bli uttrykt i et plantevev under passende betingelser for kjemisk regulering. Mer spesielt omfatter oppfinnelsen en kjemisk regulerbar, chimerisk DNA-sekvens som omfatter en første ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-komponentsekvens som er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, og en andre DNA-komponentsekvens som er i stand til å bli transskribert i en plante eller plante-vev. DNA-komponentsekvensene kan være avledet fra naturlige kilder eller være fremstilt syntetisk.
Den andre DNA-sekvens kan være transskribert som et RNA som er i stand til å regulere ekspresjonen av en fenotypisk egenskap ved en antisensmekanisme. Alternativt kan den andre DNA-sekvens i den chimeriske DNA-sekvens bli transskribert og translatert, dvs. kodet, i plantevevet for å danne et polypeptid som resulterer i en fenotypisk egenskap. Det chimeriske gen er dannet slik at den andre DNA-sekvens på passende måte er assosiert med typisk i en hosliggende orientering til den kjemisk regulerbare DNA-sekvens for å sikre transskripsjon. Assosiering fremskaffes med konvensjonelle teknikker.
Foretrukket er en chimerisk DNA-sekvens som omfatter en første ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-komponent og en andre transskriberbar DNA-komponent, hvor den første ikke-kodende DNA-sekvens er en av de foretrukne DNA-sekvenser som er nevnt ovenfor under del A. Den første DNA-komponentsekvens kan være regulert med en undertrykkende eller med en induserende kjemisk regulator. En spesiell sekvens ifølge oppfinnelsen er en chimerisk DNA-sekvens, hvor den første DNA-komponentsekvens har vesentlig sekvenshomologi med en kjemisk regulerbar DNA-sekvens i et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen fra en plante.
Foretrukket er en chimerisk DNA-sekvens hvor den første DNA-komponentsekvens er eller har vesentlig sekvenshomologi med en kjemisk regulerbar DNA-sekvens i et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen fra en plante, og den andre DNA-komponentsekvens er en kodende sekvens som er i stand til å bli transskribert og translatert for å danne et polypeptid som resulterer i et fenotypisk trekk. Fortrinnsvis ligger denne andre DNA-komponentsekvens ved siden av den første kodende DNA-sekvens. Spesielt foretrukket er en slik chimerisk DNA-sekvens hvor den første DNA-komponentsekvens er eller har vesentlig sekvenshomologi med den kjemisk induserbare DNA-sekvens i et PR-proteingen, f.eks. et PR-protein fra en dicotyledon plante, så som tobakk eller agurk. Eksempler på dette er nevnt ovenfor i del A
En andre eksemplifisert type av chimerisk DNA-sekvens inne-
holder tre DNA-komponentsekvenser som stammer fra to eller flere kilder. I sin enkleste utførelsesform omfatter denne chimeriske DNA-sekvens den todelte DNA-sekvens som beskrevet ovenfor i del B, samt en tredje DNA-sekvens som stammer fra minst én annen kilde. Mer spesielt omfatter denne type chimerisk DNA-sekvens en første DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen, hvor denne første DNA-komponentsekvens er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, samt en andre DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en deL men ikke alt, av en transskriberbar DNA-sekvens med hvilken den første komponent er assosiert i det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen, samt en tredje DNA-komponentsekvens som er i stand til å bli transskribert i en plante eller plantevev. Foretrukket er det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen et plantegen.
Den andre og tredje DNA-komponentsekvens vil typisk være kodende sekvenser. Den tredje DNA-komponentsekvens kan være avledet fra flere enn én strukturell eller syntetisk kilde. De
første to DNA-komponenter vil typisk være naturlige av opprinnelse. Dersom opprinnelsen er en plante, kan den være en monocott, en dicott eller en gymnosperm. I en foretrukket
utførelsesform vil den andre DNA-sekvens innbefatte nukleotidsekvenser som koder for signalpeptidet av det kjemisk regulerbare gen, hvori de første to DNA-sekvenser opptrer. Dersom den kjemisk regulerbare DNA-sekvens er assosiert med deler av den kodende
sekvens av genet, hvorfra den ble avledet, må den tredje DNA-sekvens ikke bare være i riktig i orientering, men må også være i den riktige leseramme i forhold til den andre DNA-sekvens.
Denne orientering kan bli oppnådd ved velkjente teknikker i faget.
Foretrukket er chimeriske DNA-sekvenser hvor første og andre DNA-sekvenskomponenter er slike som nevnt som foretrukne i del B ovenfor. For eksempel er en foretrukket chimerisk DNA-sekvens en hvor første DNA-komponentsekvens er eller har vesentlig sekvenshomologi med den kjemisk induserbare DNA-sekvens i et PR-proteingen fra en dicotyledon plante, f.eks. fra tobakk eller agurk. Eksempler på PR-proteingener er nevnt ovenfor.
De chimeriske gener beskrevet ovenfor omfatter et antall mulige konstruksjoner. En kjemisk regulerbar, ikke-kodende sekvens kan assosieres med et gen som kontrollerer blomstring eller fruktmodning; et gen som påvirker toleranse eller resistens mot herbicider eller overfor mange typer skadedyr, f.eks. sopp, virus, bakterier, insekter, nematoder eller snegler; et gen som kontrollerer produksjon av enzymer eller sekundære metabolitter; hånlig eller hunlig sterilitet; dvergvekst; smak; næringsmessig kvalitet o.l. Ved å bruke foreliggende oppfinnelse, kan slike egenskaper bli økt av bonden eller gartneren, som ikke lenger er avhengig av naturlige faktorer alene. Et fenotypisk trekk av spesiell interesse for kontroll er produksjonen av metabolitter i vevskultur eller i en bioreaktor.
En foretrukket chimerisk DNA-sekvens er en to- eller tre-
komponentsekvens hvor den kodende DNA-komponentsekvens koder for et fenotypisk trekk, f.eks. et trekk valgt fra gruppen omfattende toleranse eller resistens mot et herbicid, sopp, virus, bakterie, insekt, nematode eller snegl; dannelse av sekundære metabolitter; hånlig eller hunlig sterilitet og produksjon av et enzym eller annen signalforbindelse. Spesielt foretrukket er en to- eller trekomponents chimerisk DNA-sekvens hvor den kodende komponentsekvens koder for toleranse eller resistens mot herbicider, f.eks. koder for villtype, eller herbicidresistent acetohydroksysyresyntase (AHAS), eller hvor den kodende komponentsekvens koder for resistens mot insekter, f.eks. koder for Bacillus thuringiensis-endotoksin (BT).
Dersom den chimeriske sekvens skal brukes som et assay for kjemiske regulatorer, er den fenotypiske egenskap fortrinnsvis en påvisbar markør. Egnede markører innbefatter, men er ikke begrenset til, luciferase (LUX), kloramfenikol-acetyltransferase (CAT), neomycinfosfotransferase (NPT), nopalinsyntase (NOS), oktopinsyntase (OCS), B-1,3-glukoronidase (GUS), acetohydroksysyresyntase (AHAS) og Bacillus thuringiensis-endotoksin (BT). Foretrukne markører er B-l,3-glukoronidase (GUS), acetohydroksysyresyntase (AHAS) og Bacillus thuringiensis-endotoksin (BT).
Et representativt eksempel på en slik chimerisk DNA-sekvens, beskrevet i detalj i eksemplene, er en todelt chimerisk DNA-sekvens som inneholder den 5' flankerende, ikke-kodende sekvens av PR-la-genet. Selv om en av de eksemplifiserte markører er den kodende sekvens for GUS-genet, kan enhver av de ovenfor nevnte markører bli brukt. Den analoge tredelte chimeriske sekvens inneholder deler av den kodende sekvens av PR-la-genet. Disse konstruksjoner er spesielt anvendelige fordi effekten av den kjemiske induksjon, dvs. B-glukoronidaseenzymaktiviteten, er lett påviselig i planteceller eller ekstrakter derav. Andre spesielle utførelsesformer, f.eks. de som omfatter den ikke-kodende sekvens av et av tobakk-B-l,3-glukanasegenene, og de som omfatter den kodende sekvens for villtype- eller herbicidresistent acetohydroksysyresyntase eller for Bacillus thuringiensis-endotoksin. er beskrevet i del L i eksemplene.
Foretrukne chimeriske DNA-sekvenser er tokomponents eller trekomponents chimeriske DNA-sekvenser hvor første DNA-komponentsekvens er den 5' flankerende region av tobakk-PR-la-genet og inneholder mer enn ca. 300, f.eks. mellom 300 og 2000, fortrinnsvis mellom 600 og 1000 basepar ved siden av det transskripsjonelle startsete.
Videre foretrukket er en chimerisk DNA-sekvens som omfatter tre komponenter, hvor den andre DNA-komponentsekvens koder for et signalpeptid, f.eks. hvor den andre DNA-komponentsekvens koder for et peptid som er eller har vesentlig sekvenshomologi med signalpeptidet fra et PR-proteingen, fortrinnsvis PR-la-genet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter ytterligere en fremgangsmåte for fremstilling av en kjemisk regulerbar, chimerisk DNA-sekvens omfattende en første ikke-kodende, kjemisk regu-lerbar DNA-komponentsekvens som er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, samt en andre DNA-komponentsekvens som er i stand til å bli transskribert i en plante eller plantevev, og som er særpreget ved at DNA-komponentsekvensen er ligert. Likeledes omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en chimerisk DNA-sekvens som omfatter en første DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en ikke-kodende, kjemisk regulerbar DNA-sekvens av et naturlig forekommende, kjemisk regulerbart gen, hvor den første DNA-komponentsekvens er i stand til å regulere transskripsjonen av en assosiert DNA-sekvens i en plante eller plantevev, hvor denne regulering er avhengig av en kjemisk regulator, samt en andre DNA-komponentsekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med deler av, men ikke alt, av en transskriberbar DNA-sekvens med hvilken første komponent er assosiert i det naturlig forekommende, kjemisk regulerbare gen, og en tredje DNA-komponentsekvens som er i stand til å bli transskribert i en plante eller plantevev, og som er særpreget ved at DNA-komponentsekvensen ligeres samtidig eller påfølgende.
Vektorer dannet med standardteknikker og som omfatter enten den kjemisk regulerbare DNA-sekvens beskrevet i del A eller B, eller den chimeriske DNA-sekvens beskrevet i del C ovenfor, representerer et ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse. Vektorer er rekombinante DNA-sekvenser som kan bli brukt for isolasjons- og mangfoldiggjøringsformål av den nevnte DNA-sekvens og for transformasjonen av egnede verts-
organismer med disse sekvenser. Foretrukne vektorer for isolering og mangfoldiggjøring er plasmider som kan fremmes i en egnet vertsmikroorganisme, f.eks. i E. coli. Foretrukne vektorer for transformasjon er de som er anvendelige for transformasjon av planteceller eller av agrobakterier. Mer spesielt, dersom planteceller andre enn protoplaster trans-
formeres, er den foretrukne vektor en Ti-plasmidavledet vektor. For direkte DNA-overføring i protoplaster kan enhver av de nevnte vektorer bli brukt. Passende vektorer som kan brukes som utgangsmateriale, er kjent i faget. Egnede vektorer for transformering av plantevev og protoplaster er blitt beskrevet av deFramond, A et al., Bio/Technology 1,263 (1983); An, G. et al., EMBO J. 4, 277 (1985); Potrykus, I. et al., supra: Rothstein, S.J. et al., Gene 53,153
(1987). I tillegg til disse er mange andre vektorer blitt beskrevet i faget som er egnet for bruk som utgangsmateriale i foreliggende oppfinnelse.
Vektorene som inneholder kun den kjemisk regulerbare DNA-sekvens, som beskrevet i del A eller B ovenfor, kan bli brukt som intermediater for fremstillingen av en vektor inneholdende den chimeriske DNA-sekvens, som beskrevet i del C ovenfor. Innsettingen av en passende sekvens som er i stand til transskripsjon i en slik intermediatvektor, resul-terer i en vektor omfattende en chimerisk DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen, som så kan bli brukt for å transformere det ønskede plantevev, protoplast eller annen vert. Alternativt kan en chimerisk DNA-sekvens bli fremstilt og satt inn i en egnet vektor, som så blir brukt for å transformere det ønskede plantevev eller annen vertsorganisme.
Konstruksjonen og mangfoldiggjørelsen av vektoren kan bli utført i en passende vertsorganisme, f.eks. i E. coli. Egnede E. coli-stammer innbefatter HB 101, JM83, DH1, DH5a, LE392 o.l. Vektorene ifølge oppfinnelsen kan bli brukt som sådan i en direkte genoverføring eller en mikroinjeksjonsteknikk. I visse tilfeller kan det være foretrukket å linearisere vektoren før bruk. Alternativt kan vektorene bli overført til en Agrobacteirum-vert. Denne overføring utføres med konvensjonelle teknikker innbefattende biparental formering (Simon, R. et al., Bio/Technology 1, 74 (1983)), triparental formering (Ditta, G. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77,7347 (1980) eller transformasjon (Holsters, M. et al., Mol. Gen. Genet. 163,181 (1978). Egnede stammer av Agrobacterium innbefatter, men er ikke begrenset til, A. tumefaciens LBA4404, CIB542 og C58Z707.
Foretrukne vektorer er de som omfatter de foretrukne DNA-sekvenser nevnt i delene A, B og C ovenfor. Videre er en foretrukket vektor en som er funksjonell i en plantecelle eller i A<g>robacterium. Spesielt foretrukket er vektorene som er beskrevet i del L i eksemplene.
Foreliggende oppfinnelse gir et antall fordeler og anvendelsesområder som stammer fra den lett kontrollerte, regulerbare ekspresjon i planter eller plantevev av de chimeriske gener inneholdende kjemisk regulerbare DNA-sekvenser. Regulering av gener som virker ved en antisensmekanisme, eller av gener hvis ekspresjon resulterer i dannelsen av en fenotypisk egenskap, er mulig. Av spesiell viktighet er muligheten for å kontrollere tiden og hastigheten av genekspresjon og lettheten for å utføre denne kontroll, enten uniformt gjennom planten eller i lokaliserte deler av planten.
Å fremskaffe kontrollen kan bli utført enkelt ved å tilføre den kjemiske regulator til plantevevet eller til planten eller deler av planten på en slik måte og i en slik mengde for å regulere de chimeriske gener, hvis ekspresjon i planteceller, plantevev eller planter er ønsket. For eksempel dersom egenskapen som skal uttrykkes fortrinnsvis blir uttrykt kun i bladene, kan så sprøyting eller stryking av bladene ved et tidspunkt som optimaliserer slik ekspresjon i bladene, og før noen migrering til andre deler av planten, fremskaffe dette mål lett og effektivt.
Alternativt kan uniform ekspresjon gjennom den delen av planten som er over bakken, resultere fra påføring til hele planten (dvs. stengel og begge sider av bladene). Dersom ekspresjon i røttene er ønsket, vil tilføring til frøene eller bakken omkring frøene eller røttene være en mulig metode for regulering. Ekspresjon i en bioreaktor utføres meget enkelt, f.eks. ved å tilføre den kjemiske regulator til mediet inneholdende cellene.
Muligheten for å kontrollere tiden, hastigheten og/eller genekspresjonen av nye fenotypiske egenskaper i transgene planter, gir et antall nyttige fordeler. For eksempel dersom toleransen ved en detoksifiseringsmekanisme for et herbicid eller annet pesticid innføres i en plante, kan denne egenskap maksimaliseres ved passende tidspunkt for tilføringen av den kjemiske regulator. Således kan regulatoren tilføres før, sammen med eller etter tilføringen av et herbicid eller annet pesticid, avhengig av hvilken metode som gir den optimale toleranse.
Det er nå også mulig å regulere produksjonen av forbindelser hvis biosyntese er kontrollert av endogene eller fremmede gener. Ved kjemisk induksjon kan produksjonen av slike produkter bli startet ved ønsket tidspunkt. Den induserte prosess kan være en flertrinns biosyntese eller en entrinns omdannelse av en metabolitt.
En annen fordel ved foreliggende oppfinnelse stammer fra egenskapen å regulere utviklingsprosessene i planter ved et ønsket tidspunkt ved tilføringen av et regulerende kjemikalie. For eksempel kan synkroniseringen av planteutvikling (spiring, knoppskyting, vekst, blomsterutvikling, pollendannelse, fruktmodning, nedtørking, løsning osv.) bli utført. I tillegg kan normal planteutvikling bli forhindret. Dette kan bli oppnådd ved å innføre f.eks. et toksingen som vil innvirke på det ønskede utviklingstrinn, en DNA-sekvens som vil blokkere utviklmgstrinnet via en antisensmekanisme, eller et gen hvis ekspresjon blokkerer overgangen til et nytt utviklingstrinn og som kan bli kjemisk undertrykt for å tillate utvikling å fortsette. En egnet utnyttelse er innføringen av hånlig eller hunlig sterilitet for kontrollert hybridisering av avlinger.
Ytterligere fordeler ved foreliggende oppfinnelse er nye assayfremgangsmåter, fortrinnsvis enzymassayfremgangsmåter. For eksempel kan identifisering av nye kjemiske regulatorer nå bli utført meget enkelt. Slike assaymetoder innbefatter bruken av transformerte planter eller planteceller som inne-holder en chimerisk DNA-sekvens ifølge foreliggende oppfinnelse. Et kjemikalie tilføres den transformerte vertsorganisme, og transskripsjonen av den transskriberbare DNA-sekvens måles mot en kontroll, idet transskripsjon vanligvis påvises i form av et translasjonsprodukt eller som en effekt av et slikt produkt. Assayet kan utføres på en mengde måter, men utføres typisk ved å bruke hele, regenererte planter (ved å tilføre kjemikaliet til planten), eller til dyrkede celler eller vev (ved å tilføre kjemikaliet til cellen eller vevet) og derpå tilføre et substrat for enzymaktiviteten. Produktet av enzymaktiviteten påvises derpå ved standardmetoder, f.eks. spektrofotometrisk måling.
Spesielt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere en kjemisk regulator, hvilken består i å trans-formere en vertsorganisme med en chimerisk DNA-sekvens, som beskrevet ovenfor i del C, eller med en vektor inneholdende nevnte chimeriske DNA-sekvens tilføre en antatt kjemisk regulator til den transformerte vertsorganisme og måle ekspresjonen av det fenotypiske trekk. En foretrukket fremgangsmåte er en slik fremgangsmåte hvor den transformerte vertsorganisme er plantevev eller planteceller. Ytterligere foretrukket er en fremgangsmåte hvor den chimeriske DNA-sekvens er en sekvens nevnt ovenfor som foretrukket, f.eks. hvor den første DNA-komponentsekvens av nevnte chimeriske DNA er en kjemisk induserbar sekvens som er eller har vesentlig sekvenshomologi med en kjemisk induserbar sekvens av et PR-proteingen, og hvor det fenotypiske trekk kodet for av det chimeriske DNA er en påviselig enzymmarkør.
Et annet trekk ved oppfinnelsen er utviklingen av nye metoder for å identifisere andre kjemisk regulerbare DNA-sekvenser. En vektor inneholdende en antatt kjemisk regulerbar DNA-sekvens, fremstilles f.eks. fra en vertsutvelgbar markør og en utvelgbar eller påviselig markør. Egnede utvelgbare markører innbefatter antibiotiske resistensgener og herbicide resistensgener. Representative antibiotiske resistensgener innbefatter de for hygromycin, kanamycin, kloramfenikoL bleomycin, puromycin, linkomycin, G418 og metotrexat. Et spesielt egnet gen for resistens mot hygromycin er aminoglukosid-fosfotransferase IV. Egnede vektorer for transformasjonen av planter inneholdende hygromycinresistensgenet er blitt beskrevet avRothstein, S.J. et al., Gene 53,153 (1987). Eksempler på herbicidresistensgener koder for resistens mot f.eks. sulfonylurea, glykofosfat, fosfinotricin og atrazin.
Egnede påviselige markører innbefatter gener for enzymer, antigener, immunoglobuliner o.l. så vel som antibiotiske resistensgener. Egnede enzymmarkører innbefatter LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS og BT. Et spesielt egnet enzym er B-l,3-glukoronidase (GUS) på grunn av lettheten av enzymassayet. DNA-sekvensen som koder for den påviselige markør, kan settes inn i vektoren ved å bruke vanlige teknikker.
Den antatt regulerbare DNA-sekvens er typisk satt inn ved siden av det påviselige markørgen, slik at ekspresjonen av den påviselige markør er under kontroll av den antatte DNA-sekvens. Vektoren blir så brukt for å transformere plantevev eller en annen passende vertsorganisme. Transformert plante-vev eller vertsorganisme velges ut på basis av den planteselekterbare markør, typisk antibiotisk resistens. En kjemisk regulator blir så tilført plantevevet eller den andre vertsorganisme etter seleksjon eller etter regenerasjon av det transformerte vev. Induksjon eller represjon av den påviselige markør etter tilføring av den kjemiske regulator, identifiserer den antatte DNA-sekvens som en som er i stand til å regulere transskripsjonen av en hosliggende DNA-sekvens, hvor reguleringen er avhengig av en kjemisk regulator. Assayet kan utføres på hele, regenererte eller transformerte planter, f.eks. ved å tilføre den kjemiske regulator til bladene eller annet plantevev og måle ekspresjonen av den påviselige markør. Alternativt kan assayet ut-føres på transformert callusvev, eller annen vertsorganisme i cellekultur, ved å tilføre den antatte kjemiske regulator til callus eller annen kultur og måle ekspresjonen av den påviselige markør.
Spesielt omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for å identifisere en kjemisk regulerbar DNA-sekvens, hvilken består av trinnene
a) å transformere en vertsorganisme med en antatt kjemisk regulerbar DNA-sekvens eller en vektor inneholdende nevnte sekvens, og en andre DNA-sekvens som er en vertsutvelgelig
genmarkør, og en tredje DNA-sekvens som koder for et feno-
typisk trekk;
b) å tilføre en kjemisk regulator til nevnte transformerte vertsorganisme og
c) måle ekspresjonen eller velge ut for forandring i ekspresjon av det fenotypiske trekk kodet
for av den tredje DNA-sekvens.
Foretrukket er en slik fremgangsmåte hvor nevnte tredje DNA-sekvens er en vertsutvelgbar eller en påviselig genmarkør, og en fremgangsmåte hvor den andre eller tredje DNA-sekvens er en genmarkør for herbicidresistens eller antibiotikumresistens, f.eks. valgt fra gruppen bestående av hygromycin-, kanamycin-, kloramfenikol-, bleomycin-, puromycin-, linkomycin-og metotrexatresistensgener, f.eks. et arninoglykosid-fosfotransferase IV hygromycinresistensgen.
Også foretrukket er en slik fremgangsmåte hvor den antatt kjemisk regulerbare DNA-sekvens er assosiert med og fortrinnsvis ved siden av den tredje DNA-sekvens. Videre fore-
trukket er en fremgangsmåte hvor den transformerte vertsorganisme er plantevev eller planteceller.
Videre foretrukket er en slik fremgangsmåte hvor den tredje DNA-sekvens koder for en påviselig enzymmarkør valgt fra gruppen bestående av luciferase (LUX), kloramfenikol-acetyl-transferase (CAT), neomycinfosfotransferase (NPT), nopalinsyntase (NOS), oktopinsyntase (OCS), B-l,3-glukoronidase (GUS), acetohydroksysyresyntase (AHAS) og Bacillus thuringiensis-endotoksin (BT).
Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er i hovedsak rene kjemisk regulerbare DNA-sekvenser identifisert ved nevnte fremgangsmåter.
Et signalpeptid eller en signalsekvens er en spesiell N-terminal aminosyresekvens i et protein som stikker inn i det endoplasmatiske reticulum. En slik sekvens inneholder typisk i eukaryote celler ca. 15-40 aminosyreresiduer, hvorav mange er hydrofobe. Sekvensen spaltes til slutt fra det ferdigutviklede protein.
I sammenheng med foreliggende oppfinnelse er signalpeptidet av et kjemisk regulerbart gen anvendelig ved konstruksjonen av tredelte chimeriske konstruksjoner, som beskrevet ovenfor. Slike chimeriske konstruksjoner inneholder en første kjemisk regulerbar sekvens, en andre DNA-sekvens som koder for et signalpeptid i proteiner, og en tredje sekvens som koder for et fenotypisk trekk. Fortrinnsvis er det fenotypiske trekk et som er lett påviselig, f.eks. i en assayfremgangsmåte. Inklusjon i den chimeriske konstruksjon av DNA-sekvensen som koder for et signalpeptid, tillater produktet uttrykt av den tredje DNA-sekvens å bli rettet bort fra det endoplasmatiske reticulum av vertscellen til dets endelige målsete.
Følgelig er et ytterligere trekk ved foreliggende oppfinnelse et signalpeptid fra tobakk-PR-la-proteinet og et protein med en aminosyresekvens som har vesentlig sekvenshomologi med dette peptid. Aminosyresekvensen til dette peptid er som følger:
Foreliggende oppfinnelse omfatter også DNA-sekvensen som koder for dette peptid (se sekvens 1) og DNA-sekvenser med vesentlig sekvenshomologi med denne sekvens. Som bemerket tidligere omfatter oppfinnelsen også (1) DNA-sekvenser som inneholder den kjemisk regulerbare sekvens i kombinasjon med sekvensen som koder for signalpeptidet og (2) tredelte chimeriske DNA-sekvenser inneholdende den kjemisk regulerbare komponent, den kodende del for et signalpeptid samt en DNA-sekvens som transskriberes, fortrinnsvis med translasjon.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også nylig isolerte og identifiserte PR-genomiske DNA-og cDNA-sekvenser fra gener betegnet heri som PR-la, PR-1' og PR-R fra tobakk, den patogeninduserbare chitinase fra agurk, PR-Q fra tobakk, basisk B-l,3-glukanase 39.1 og 39.3 fra tobakk, sur B-l,3-glukanase fra tobakk og DNA-sekvenser med vesentlig sekvenshomologi med disse gener. DNA-sekvensene av disse gener er angitt i sekvensene 1-8. De nye gener av sekvensene 1, 2, 5 og 6 (PR-la, PR-1' og B-l,3-glukanase 39.1 og 39.3 henholdsvis) representerer også spesielle utførelsesformer av ikke-kodende, kjemisk regulerbare DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen, som nevnt ovenfor. De nye sekvenser 3, 4, 7 og 8 koder for PR-proteinene agurkchitinase, tobakk-PR-R, tobakk-PR-Q og den sure form av tobakk-B-l,3-glukanase. Detaljer for isolasjonen og karakteriseringen av genene er gitt i eksemplene.
En kjemisk regulator defineres som en substans som regulerer ekspresjon av et gen via en kjemisk regulerbar DNA-sekvens under visse forhold, som angitt i definisjonen av uttrykket. Substansen, i ionisk eller nøytral form, med eller uten oppløsende eller andre kompleksdannende molekyler eller anioner, vil vanligvis være eksogen relativt til systemet inneholdende det kjemisk regulerbare gen ved den tid regulering er ønsket. Bruken av eksogene kjemiske regulatorer er foretrukket på grunn av lettheten og tilgjengeligheten for å kontrollere mengden av regulator i systemet. Imidlertid inn-befatter oppfinnelsen også bruken av endogene regulatorer, eksempelvis kjemikalier hvis aktivitet eller nivå i systemet kontrolleres kunstig med andre komponenter i, eller som virker på, systemet.
Kjemiske regulatorer innbefatter kjemikalier som er kjent for å være indusere for PR-proteiner i planter, eller nære derivater derav. Disse innbefatter benzosyre, salisylsyre, polyakrylsyre og substituerte derivater derav, hvor egnede substituenter innbefatter lavere alkyl, lavere alkoksy, lavere alkyltio og halogen. Når dette påføres plantevev typisk på bladene av hele planter, utvikler det seg økte nivåer av mRNA og PR-proteiner i plantevevet.
En ytterligere gruppe regulatorer for de kjemisk regulerbare DNA-sekvenser og chimeriske gener ifølge oppfinnelsen er basert på benzo-l,2,3-tiadiazoIstrukturen og innbefatter, men er ikke begrenset til, de følgende typer av forbindelser: benzo-l,2,3-tiadiazolkarboksylsyre, benzo-l,2,3-tia-
diazoltiokarboksylsyre, cyanobenzo-1,2,3 -tiadiazol, benzo-1,2,3 -tiadiazolkarboksylsyreamid, benzo-1,2,3-tiadiazolkarboksylsyrehydrazid og andre derivater derav.
En foretrukket gruppe regulatorer innbefatter, men er ikke begrenset til, benzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, benzo-1,2,3 -tiadiazol-7-tiokarboksylsyre, 7-cyanobenzo-1,2,3 -tiadiazol, benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyreamid, benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyrehydrazid og derivater derav.
Egnede derivater omfatter, men er ikke begrenset til, repre-sentanter for nevnte typer forbindelser, hvor benzo-l,2,3-tiadiazolenheten er usubstituert eller substituert med små substituenter, normalt brukt i aromatiske ringsystemer av agrolqernikalier, så som lavere alkyL lavere alkoksy, lavere haloalkyl, lavere haloalkoksy, lavere alkyltio, cyano, nitro og halogen. Egnede derivater omfatter ytterligere, men er ikke begrenset ul representanter for nevnte benzo-l,2,3-tiadiazolforbindelser, hvor enten karboksylsyren, tiokarboksylsyren, karboksylsyreamidet eller den karboksylsyrehydrazid-funksjonelle gruppe er usubstituert eller substituert med alifatiske, aralifatiske eller aromatiske residuer. Egnede residuer omfatter, men er ikke begrenset ul alkyl (spesielt lavere alkyl), alkoksy (spesielt lavere alkoksy), lavere alkoksyalkyl, alkoksyalkoksyalkyl, cykloalkyl, cyklo-alkylalkyl, fenylalkyl (spesielt benzyl), naftylalkyl, fenoksyalkyL alkenyl og alkynyl, hvor alkyldelen av substi-tuenten er usubstituert eller substituert med hydroksy, halogen, cyano eller nitro, og den aromatiske del av substituenten er usubstituert eller substituert med små substituenter, normalt brukt i aromat-iske ringsystemer i agrokjemikalier, så som lavere alkyl, lavere alkoksy, lavere haloalkyl, lavere haloalkoksy, lavere alkyltio, cyano, nitro og halogen.
Regulatorer basert på benzo-l,2,3-tiadiazolstrukturen omfatter alle molekylære systemer som er i stand til å frigjøre molekylet som faktisk virker som regulator.
En foretrukket gruppe av regulatorer basert på benzo-l,2,3-tiadiazolstrukturen, innbefatter benzo-l,2,3-tiadiazolkarboksylsyre, alkylbenzo-l,2,3-tiadiazolkarboksylat, hvori alkylgruppen inneholder 1-6 karbonatomer, og substituerte derivater av disse forbindelser. Egnede substituenter innbefatter lavere alkyL lavere alkoksy, lavere alkyltio og halogen. Spesielt er benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre og dets alkylestere, f.eks. metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, foretrukne indusere for de chimeriske DNA-sekvenser omfattende kjemisk regulerbare DNA-sekvenser isolert fra PR-proteingener. Syntesene for de nevnte kjemiske regulatorer og deres bruk som biocider kan finnes fra Britisk patentskrift 1.176.799 og Kirby, P. et al., J. Chem. Soc. C 2250 (1970).
Derivater av benzo-1,2,3-tiadiazol, som videre kan bli brukt som regulatorer i henhold til foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i U.S. patentansøkning, serienr. 234.241, innlevert 18. august 1988 og som herved er innbefattet pr. referanse.
Blant de foretrukne forbindelser basert på benzo-l,2,3-tia-
diazolstrukturen, kan det nevnes f.eks. benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, n-propylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, benzylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre-sek.-butylhydrazid o.l.
En ytterligere gruppe regulatorer for de kjemisk regulerbare DNA-sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse er basert på pyridinkarboksylsyrestrukturen, så som isonikotinsyre-strukturen, og fortrinnsvis haloisonikotinsyrestrukturen. Foretrukket er diklorisonikotinsyrer og derivater derav, f.eks. lavere alkylestere. Egnede regulatorer for denne klasse forbindelser er f.eks. 2,6-dikiorisonikotinsyre og de lavere alkylestere derav, spesielt metylesteren.
Et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er følgelig en fremgangsmåte for å regulere transskripsjonen av et kjemisk regulerbart gen, hvilken fremgangsmåte omfatter å tilføre en slik kjemisk regulator til plantevev, plante eller frø inne-holdende en kjemisk regulerbar DNA-sekvens, som beskrevet i del A, B eller C ovenfor. Foretrukket er en slik fremgangsmåte hvor plantevevet, planten eller frøet inneholder en kjemisk regulerbar DNA-sekvens nevnt ovenfor som foretrukket.
De kjemiske regulatorer kan tilføres i ren form, i oppløsning eller suspensjon, som pulvere eller støv eller i andre passende formuleringer som brukes agrikulturelt eller i bioreaktorprosesser. Slike formuleringer kan innbefatte faste eller flytende bærerstoffer, dvs. materialer med hvilke regulatoren kombineres for å lette tilførsel til planten, vevet, cellen eller vevskulturen el, eller for å forbedre lagrings-, behandlings- eller transportegenskaper. Eksempler på passende bæremidler innbefatter silikater, leirer, karbon, svovel, harpiks, alkoholer, ketoner, aromat-iske hydrokarboner o.l. Dersom den dannes som et passende fuktbart pulver eller vandig emulsjon, kan regulatorformuleringen innbefatte én eller flere passende surfaktanter, enten ioniske eller ikke-ioniske, så som fuktende, emulgerende eller dispergerende midler.
Regulatoren kan også bli tilført plantene i kombinasjon med andre midler som er ønsket for å gi en eller annen fordel til planten, en fordel som kan være relatert eller urelatert til egenskapen som er kontrollert av ethvert chimerisk gen som reguleres av regulatoren. For eksempel kan en regulator iblandes et gjødningsmiddel og tilføres like før ekspresjonen av en transgen egenskap som er urelatert til gjødningen er ønsket. Den kan også kombineres med et herbicid og tilføres for å mette effekten av herbicidet på den tid når en slik effekt ellers ville være ved et maksimum.
Som en flytende formulering kan regulatoren tilføres som en spray til plantebladene, stenglene eller grenene, til frøet før planting eller til marken eller et annet vekstmedium som støtter planten. Regulatorer kan også bli brukt i bioreaktorsystemer hvor regulering blir oppnådd ved en enkelt tilførsel av regulatorformulering til reaksjonsmediet, eller ved gradvis tilførsel over en på forhånd bestemt tidsperiode.
Regulatoren tilføres i en mengde og over en tidsperiode som er tilstrekkelig for å fremskaffe den ønskede regulering. En foretrukket regulator er en som viser ingen eller kun mini-
male fytotoksiske eller andre uønskede effekter på planten, plantevevet eller plantecellene, til hvilke den tilføres i den tilførte mengde.
Foretrukne DNA-sekvenser blant de som er beskrevet ovenfor i del A eller B, og foretrukne chimeriske DNA-sekvenser blant de som er beskrevet ovenfor i del C, er spesielt de hvor transskripsjonen reguleres av en kjemisk regulator nevnt ovenfor, f.eks. valgt fra gruppen bestående av benzosyre, salisylsyre, acetylsalisylsyre, polyakrylsyre og substituerte derivater derav, eller valgt fra gruppen bestående av benzo-l,2,3-tiadiazolkarboksylsyre, benzo-1,2,3-tiadiazoltiokarboksylsyre, cyanobenzo-l,2,3-tiadiazol, benzo-1,2,3-tiadiazolkarboksylsyreamid, benzo-1,2,3 -tiadiazolkarboksylsyrehydrazid og derivater derav, eller ditøorisoriikotinsyre eller et derivat derav. Mest foretrukket er de DNA-sekvenser hvor transskripsjonen er regulert av nevnte foretrukne kjemiske regulatorer, f.eks. av benzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, metylbenzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, n-propylbenzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, benzylbenzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, benzo-1,2,3 -tiadiazol-7-karboksylsyre-sek-butylhydrazid, 2,6-dMorisonikotinsyreeller metyl-2,6-diklorisonikotinat, spesielt metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat.
De følgende bakterier, plasmider og suspensjonskulturer er blitt deponert hos the American Type Culture Collection: F^cojiHB101/PtJS75-Km, ATCC-nummer 67628, deponert 12. februar 1988;
plasmid pBS-PR1013Cla, ATCC-nummer 40426, deponert 12. februar 1988;
plasmid pBS-PR1019, ATCC-nummer 40427, deponert 12. februar 1988;
Zea mays suspensjonskultur 6-2717-GC, ATCC-nummer 40326, deponert 20. mai 1987;
plasmid pBS-Gluc39.1, ATCC-nummer 40526, deponert 29. desember 1988;
plasmid pBS-Gluc39.3, ATCC-nummer 40527, deponert 29. desember 1988;
plasmid pBScucchi/chitinase, ATCC-nummer 40528, deponert 29. desember 1988;
plasmid pBSG16e, ATCC-nummer 40535, deponert 18. januar 1989.
De chimeriske gener ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder kjemisk regulerbare DNA-sekvenser fra en hvilken som helst kilde som er naturlig eller syntetisk, i kombinasjon med én eller flere transskriberbare DNA-sekvenser; vanligvis vil minst en del av den transskriberbare sekvens bli translatert til et fenotypisk trekk selv om oppfinnelsen også omfatter chimeriske gener som virker via en antisensmekanisme. Selv om den følgende beskrivelse og mange av eksemplene er rettet mot kjemisk regulerbare DNA-sekvenser som finnes naturlig i et plantegenom, angår denne oppfinnelse likeledes slike sekvenser som opptrer i andre naturlige systemer, f.eks. bakterielle, virale og animalske systemer, siden teknikker er velkjent for å isolere slike sekvenser fra deres naturlige systemer. Videre omfattes likeledes sekvenser avledet fra syntetiske eller andre ikke-naturlige systemer.
En kjemisk regulerbar DNA-sekvens isoleres fra kilden hvori den eksisterer naturlig eller syntetisk og karakteriseres om nødvendig ved konvensjonelle metoder. Dersom DNA-sekvensen er isolert fra et naturlig forekommende gen, aktiveres dette gen med en passende regulator, enten ved en kjemisk eller annen kjent regulator for dette gen. RNA som stammer fra denne aktivering, isoleres og blir brukt for å konstruere et cDNA-bibliotek. Dette bibliotek blir brukt for differensiell skjerming ved å bruke radiomerket cDNA dannet både fra (1) RNA isolert fra det aktiverte system og (2) RNA isolert fra et annet system som ikke er aktivert av regulatoren. Denne differensielle skjerming er et spesielt aspekt ved foreliggende oppfinnelse, som nevnt ovenfor. Klonene inneholdende det kjemisk regulerte cDNA, blir så isolert og blir fortrinnsvis sekvensert ved dette punkt. cDNA-klonene blir så brukt for å identifisere og isolere en genomisk klon fra et genomisk bibliotek, hvilken genomiske klon omfatter den kjemisk regulerbare DNA-sekvens. Dette gen blir fortrinnsvis sekvensert, og den kjemisk regulerbare DNA-sekvens blir funksjonelt kartlagt ved å subklone fragmenter av dette gen, ligere dem til et rapporteringsgen og beregne deres aktivitet i transgent plantemateriale eller i transiente planteekspresjonssystemer.
For PR-proteingenene av tobakk blir et lambdagenomisk bibliotek konstruert ved å bruke standardteknikker, og kloner bestående av kjemisk regulerbare DNA-sekvenser blir identifisert og renset. En av disse kloner karakteriseres. Restriksjonsfragmenter som bærer den kjemisk regulerbare DNA-sekvens identifiseres; for PR-la-genet innbefatter disse genfragmenter et Clal-fragment på ca. 20.000 basepar, et 6500 basepar Hindin-fragment og et 3600 basepar EcoRI-fragment. HmdrJJ-rfagmentet inneholder ca. 500 kodende basepar og ca. 6000 ikke-kodende baser i den 5' flankerende region som ligger ved siden av det transskripsjonelle start-sete. Enkelte av disse fragmenter subklones i plasmider for bruk som kilder for DNA for ytterligere subkloning og full karakterisering, dvs. restriksjonskartlegging, DNA-sekvensering og identifisering av det transskripsjonelle startsete av genet. For PR-la-genet blir det 3600 basepars EcoRI-fragment direkte subklonet fra en lambdagenomisk klon og derpå subklonet til en endelig klon på ca. 1200 basepar flankert av Xhol- og Pstl-seter. Denne klon inneholder en kjemisk induserbar DNA-sekvens fra PR-la-genet og en del av den hosliggende kodende region for dette gen, idet denne del innbefatter den kodende sekvens for signalpeptidet av PR-la-proteingenet.
Likeledes blir genomiske kloner isolert som koder for den basiske form av B-l,3-glukanase. To kloner betegnet 39.1 og 39.3 karakteriseres, og restriksjonsfragmenter omfattende kjemisk regulerbare DNA-sekvenser identifiseres.
Ved å bruke vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse, kan disse kloner derpå bli brukt for fremstillingen av chimeriske gener inneholdende tre deler, som diskutert ovenfor. Disse chimeriske DNA-sekvenser inneholder den kjemisk regulerbare sekvens, deler av det transskriberbare DNA og en tredje DNA-sekvens fra en fremmed kilde. Alternativt kan klonene ytterligere manipuleres, f.eks. ved seterettet mutagenese, for å fjerne alt eller mesteparten av ethvert kodende fragment fra modergenet før tilkobling til den kodende sekvens fra en fremmed kilde for å fremstille et todelt chimerisk gen, som beskrevet ovenfor. I en foretrukket utførelsesform består denne del av det chimeriske gen, som ikke er den kjemisk regulerbare sekvens, av et rapporteringsgen for et lett observerbart eller påviselig fenotypisk trekk. De følgende eksempler illustrerer genene for 13-1,3-glukoronidase, villtype og herbicidresistent acetohydroksysyresyntase og Bacillus thuringiensis-endotoksin. men en mengde andre rapporteringsgener kan tenkes, som beskrevet ovenfor. I en ytterligere foretrukket utførelsesform koder den kodende komponent-DNA-sekvens av det chimeriske gen for toleranse eller resistens mot herbicider eller for resistens mot insekter. Denne utførelsesform er eksemplifisert ved de nevnte gener for acetohydroksysyresyntase og for Bacillus thuringiensis-endotoksin.
De chimeriske gener og vektorer inneholdende disse gener, kan innføres i planteceller ved hjelp av en mengde teknikker som gir opphav til transformerte celler, vev og planter eller til cellekulturer som er anvendelige i bioreaktorer. Flere teknikker er beskrevet i detalj i eksemplene som følger og er rettet mot både monocotyledoner og dicotyledoner. Enkelte av disse metoder, innbefattet her for utførelsesformål, er gjenstand for andre patentsøknader, spesielt U.S. patentansøkning, serienr. 056.506, innlevert 29. mai 1987 og U.S. patentansøkning, serienr. 165.665, innlevert 8. mars 1988.
Det transformerte plantemateriale kan så bli behandlet med en kjemisk regulator, og ekspresjonen av det fenotypiske rapporteringsgen observeres og/eller måles. Denne type system gir en lett skjermingsanordning for å identifisere den regulatoriske aktivitet av spesielle kjemikalier. Oppfinnelsen angår også et forbedret assay for B-l,3-glukoronidase (GUS)-enzymatisk aktivitet som tillater skjermingen av et stort antall prøver med høy presisjon, og over en kort tidsperiode. Spesielt omfatter dette assay reaksjonen av plantevevsekstrakter i prøver på mindre enn 0,5 ml inneholdende 1,5-3 mM 4-metylumbelliferyl-glukoronid ved ca. 37°C i 1-5 timer, og å bestemme konsentrasjonen av den frigjorte fluorescente indikator.
Mengdebestemmelsen av "steady-state"-nivået av RNA er et essensielt trinn i analysen for genekspresjon. For dette formål er et primerutvidelsesassay blitt utviklet. Denne metode ifølge oppfinnelsen innbefatter å merke et gen som er spesifikt for oligonukleotid til høy spesifikk radioaktivitet, å hybridisere oligonukleotidet til en RNA-prøve og utvide hybriden med revers-transskriptase. Utvidelsesproduktene atskilles på denaturerende akrylamidgeler og gjøres synlig ved autoradiografi. Fordelene ved denne metode i forhold til tidligere assay innbefatter letthet ved prøvefremstilling, enkelhet ved assayfremgangsmåten og tiden som kreves for å utføre assayet. Primerutvidelsesassayet er like følsomt og mengdespesifikt som Sl-kartlegging.
Primerutvidelsesassayet, slik det utføres under spesielle reaksjonsbetingelser beskrevet nedenfor i eksemplene, optimaliseres for bestemmelsen av PR-l-mRNA-nivå i totalt RNA ekstrahert fra TMV-infiserte tobakksblader. PR-1-mRNA uttrykkes som 1 % av mRNA i disse blader, basert på kvantitativ analyse av primerutvidelsesdata og frekvensen av cDNA-kloner i et cDNA-bibliotek avledet fra dette RNA. Forbedringene ved metoden ifølge oppfinnelsen i forhold til de som tidligere er beskrevet, består av merkingen av oligonukleotidet til en høy spesifikk aktivitet, den mindre molare mengde av prøve som brukes i assayet (typisk ca. 0,01-0,05 pmol), optimalisert hybridisering og forlengelsestid og optimaliserte nuUeotidtrifosfatkonsentrasjoner.
Oppfinnelsen omfatter følgelig en fremgangsmåte for bestemmelse av mengden av et spesielt RNA i en oppløsning av RNA omfattende
(a) å merke et RNA-spesifikt primeroligonukleotid av en lengde på mellom 12 og 18 nukleotider til høy spesifikk radioaktivitet, (b) å hybridisere RNA med det merkede oligonukleotid ved en konsentrasjon på mellom 0,1 og 20 nM i mellom 2 min. og 24 timer ved en temperatur omkring 37°C, (c) å forlenge primeroligonukleotidet med revers-transskriptase i nærvær av nukleotidtrifosfater ved en konsentrasjon på mellom 0,003 og 1 mM i mellom 1 og 120 min. og
(d) atskille og synliggjøre forlengelsesproduktene med autoradiografi.
De følgende eksempler illustrerer ytterligere foreliggende oppfinnelse. De skal på ingen måte betraktes som en begrensning i omfang og betydning av kravene.
Enzymreaksjoner utføres i samsvar med forhandlers anbefalte fremgangsmåter, med mindre annet er angitt. De chimeriske gener og vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse konstrueres ved å bruke teknikker som er velkjente i faget. Egnede teknikker er blitt beskrevet i Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982); Methods in Enzymology, volum 68, 100, 101 og 118 (1979, 1983, 1983 og 1986) og DNA Cloning, Glover D.M., utg. IRL Press, Oxford (1985). Mediumsammensetninger er blitt beskrevet i Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1972), så vel som referansene tidligere angitt.
FORKORTELSER
ATP adenosintrifosfat
bp basepar
CETAB heksadecyltrimetylammoniumbromid
2,4-D 2,4-diklorfenoksyeddiksyre
DDT ditiotreitol
dicamba 3,6-diklor-2-metoksybenzosyre
EDTA etylendiamin-N,N,N,N-tetraeddiksyre
kb kilo basepar
MES 2-(N-morfolino)etansulfonsyre
MU 4-metylumbelliferyl-glukuronid
PEG polyetylenglykol
picloram 4-animo-3,5,6-triklorpikolinsyre
SDS natriumdodecylsulfat
TFA trifluoreddiksyre
TMV tobakkmosaikkvirus
Tris-HCl tris(hydrolcsymetyl)metylaniin-hydroklorid.
MEDIER
SH- O- medium: medium ifølge Schenk, RU. et al., Can. J. Bot. 50 (1972), 199-204, uten hormoner. SH-medium kan være flytende eller fast med 0,8 % agar eller med 0,5 % "GelRite". Mediet er vanligvis varmesterilisert i en autoklav ved 110-121°C i 15-20 min.
SH- 30- medium: SH-0-medium inneholdende 30 um dicamba.
SH- 45- medium: SH-0-medium inneholdende 45 um dicamba.
RY- 2- medium: Medium ifølge Yamada, Y. et al., Plant Cell Reports 5, 85-88 (1986).
OMS- medium: Medium ifølge Murashige, T. og Skoog, F., Physiologia Plantarum 9,473
(1968). Mediet kan være fast med 0,8 % agar eller agarose eller med 0,5 % "GelRite".
MATERIALER
Agarose: Fremstilling og opprensing av agarose er beskrevet av Guiseley og Renn, "The Agarose Monograph", Marine Collo-
ids Division FMC Corp., 1975. Agarose er en av bestanddelene av agar. Kommersielt tilgjengelig agar består vanligvis av en blanding av nøytral agarose og ionisk agaropektin med et stort antall sidegrupper. Vanligvis forblir et visst antall av sidekjedene intakte og bestemmer de fysiokjemiske egen-
skaper av agarosen, så som geldannelse og smeltetemperatur. Agarose med lav smeltetemperatur, spesielt "SeaPlaque" agarose, er et foretrukket herdingsmiddel.
Kaseinhydrolysat: Kaseinhydrolysat - enzymatisk hydrolysat fra bovin melk, type 1, Sigma Co., PO. Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA
CellulaseRS: Cellulase RS, Yakult Honsha Co. Ltd., 1.1.19 Ffigashi-Shinbashi, Minato-ku, Tokyo, 105 Japan.
" GelRite": "GelRite" Gellan Gum, Scott Laboratories Inc., Fiskerville, RI. 02823, USA.
" GeneScreenPlus": Kat.nr. NEF 976, NEN Research Products, 549 Albany St., Boston, MA 02118, USA.
IBI Random primersett: "Prime Time" random primersett, International Biotechnologies Inc., PO. Box 1565, New Haven, CT 07606, USA
" Nalgene" filter: Nalge Co., Division of Sybron Corp. Rochester, N.Y. 14602, USA.
" Pectolyase Y- 23": Seishin Pharmaceutical Co. Ltd., 4-13 Koami-cho, Nihonbashi, Tokyo, Japan.
" Parafilm": "Parafilm" laboratoriefilm, American Can Co. Greenwich, CT 06830, USA.
SSC: 1,54 mMNaCl, 0,154 natriumcitrat.
Gelfiltreringskolonne (spin-kolonne): "Sephadex" G25 forpakket kolonne, kat.nr. 100402, Boehringer Mannheim Biochemicals, Piscataway, NJ, USA
TÆ- buffer og TBE- buffer: Tris-acetatbufFer hhv. tris-boratbuffer, vanlige buffere for elektroforese, se Maniatis et al., supra.
1. GENERELLE TEKNIKKER
Denne gruppen eksempler beskriver generelle manipuleringer som brukes for å utføre de følgende detaljerte eksempler.
EKSEMPEL 1. Ligering i agarose
Etter restriksjonsfordøying av plasmid-DNA og elektroforetisk atskillelse av fragmentene på en lavtsmeltende TAE-geL blir båndene som inneholder passende fragmenter nøyaktig skåret ut og varmet til 65°C for å smelte agarosen. 2-5 ul tilsettes til 15 ul vann, og oppløsningen holdes ved 65°C i 10 min. Denne oppløsning avkjøles til 37°C og oppbevares i 5 min. for å utligne temperaturen. 2 ul av 10 x ligasebuffer (200 mM tris, pH 8,0, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP) tilsettes sammen med 1 (il T4 DNA-ligase (New England BioLabs), og denne oppløsning tillates å bli hard og inkuberes ved 15°C over natten.
EKSEMPEL 2. Transformering fra agarose
Agarosen som inneholder det passende DNA smeltes ved å inkubere ved 65°C i 10 min. 10 ul av denne oppløsning til-
settes 30 ul TE-buffer (10 mM tris, pH 7,5, 1 mM EDTA), blandes og tillates å stå ved romtemperatur. Frosne kompetente celler ( E. coli-stamme DH5a) plasseres på våt is for å tine. Den fortynnede DNA-løsning tilsettes 200 ul celler og tillates å stå på is i 20 min. Cellene inneholdende DNA blir så varmesjokket i 90 sek. ved 41°C. Cellene blir så etterlatt ved romtemperatur i 10 min. 0,8 ml SOC-medium (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557-580
(1983)) tilsettes, og kulturen inkuberes ved 37°C i 1 time. 100 uJ av kulturen settes på LB-plater (Miller, supra) inneholdende 100 (ig/ml ampicillin (L-amp), og platene inkuberes over natten ved 37°C. Positive kolonier plukkes ut og gjenstripes på en andre L-amp-plate, og platene inkuberes over natten ved 37°C.
EKSEMPEL 3. Southern Blotting
3 ug av tobakk-DNA fordøyes med forskjellige restriksjonsenzymer under betingelser antydet av forhandler. DNA ekstra-heres med fenol, utfelles med etanol og resuspenderes derpå i gelpåsettingsbuffer (15 % ficolL 0,025 % bromfenolblått, 10 mM EDTA, pH 8). Prøver settes på og underkastes elektroforese på en 0,5 % agarosegel ved 5 V/cm inntil bromfenolblått— fargen når enden av gelen. DNA overføres til Gene-Screen Plus (DuPont) ved å bruke den alkaliske overføringsfremgangsmåte som beskrevet av forhandler. Prehybridisering, hybridisering og vask foretas i henhold til forhandlers anbefaling. Hybridisering påvises ved autoradiografi.
EKSEMPEL 4. Molekylære adaptere
En typisk molekylær adapter er sekvensen
for omdannelsen av et Pstl-sete til et BamHI-sete. Dette molekyl syntetiseres på en Applied Biosystems syntetisator ved å bruke B-cyanoetylfosforamidittkjemi og renses ved revers-fase-HPLC. Cirka 2 ug av dette oligonukleotid kinaseres i henhold til Maniatis et al., supra. s. 125. Oligonukleotidoppløsningen varmes til 65°C i et vannbad og tillates å avkjøle seg til romtemperatur over en tidsperiode på ca. 30 min. Et omtrentlig 10-gangers molart overskudd av denne tilkoblede adapter tilsettes det fordøyede DNA sammen med 10 x ligasebuffer, T4 DNA-ligase og en passende mengde vann. En typisk reaksjon er:
Denne oppløsning inkuberes ved 12-15°C i 30 min. og varmes til 65°C i 30 min. for å inaktivere ligasen. Saltkonsentrasjonen og volumet justeres for den passende restriksjonsford-øying, og det justerte DNA fordøyes for å eksponere de tilpassede "klebrige ender". Adaptere som ikke er inkorporert, fjernes enten ved elektroforese på en agarosegel eller ved sekvensielle isopropanolutfellinger.
EKSEMPEL 5. Primemtvidelseskartlegging
A. Syntese og 5' endemerking av primere for pirmerutvidelse
De følgende primeroligomerer syntetiseres ved å bruke en Applied Biosystems syntetisator og J3-cyanoetylfosforamiditt-kjemi:
Oligonukleotidene renses ved revers-fasehøytrykksvæskekromatografi (FJPLC). 5 pmol av
hvert oligonukleotid kinaseres (Maniatis et al., supra. s. 125) ved å bruke 200 uC av <32>P-ATP (6000 Ci/mmol, 10 uCi/|il). Etter inkubering ved 37°C i 30 min. fortynnes reaksjonen til 100 ul ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles derpå tre ganger med 50 ug bærer-RNA Den endelige utfelling resuspenderes i 1 x revers-transskriptasebuffer (50 mM tris-HCl, pH 7,5,40 mM KC1,3 mM MgCfe) ved en konsentrasjon på 2 nM. Den spesifikke aktivitet av det merkede oligonukleotid bestemmes til å være ca. 3 x IO<6> Cvcpm/pmol.
B. Total RNA- frernstilling
Totalt RNA fremstilles i hovedsak som beskrevet av Lagrirnini, L.M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 7542 (1987). Vev males under flytende nitrogen i en morter og støter. Det malte vev tilsettes oppmalingsbuffer (Lagrirnini et al., supra) ved å bruke 2,5 ml/g vev. Et likt volum fenol tilsettes derpå, og emulsjonen homogeniseres i en Brinkman polytron. En halv volumdel kloroform tilsettes, og emulsjonen blandes forsiktig i 15 min. Fasene atskilles ved sentrifugering, og den vandige fase fjernes. RNA felles ut ved tilsetning av natriumacetat til 0,3 M og 2,5 volumdeler etanol. Precipitatet samles opp ved sentrifugering og resus-penderes i 2 ml sterilt vann. Litiumklorid tilsettes til en endelig konsentrasjon på 3 M og oppbevares ved 4°C over natten. Precipitatet samles opp ved sentrifugering, og pelleten vaskes med iskald 80 % etanol. Pelleten tørkes og resuspenderes i 500 ul sterilt vann. Konsentrasjonen av dette totale RNA-preparat bestemmes spektrofotometrisk. Alternativt ekstraheres RNA fra callus, som beskrevet ovenfor, bortsett fra at callusvevet skjæres i terninger ca. 3 mm i størrelse og tilsettes de på forhånd avkjølte mortere og støtere for maling i flytende nitrogen før polytrontrinnet.
C. Primerforlengelse
50 ug av det totale RNA frysetørkes i et 500 ul Eppendorf-rør. RNA resuspenderes i 30 ul radiomerket prøveoppløsning og varmes til 70°C i 10 min. Røret avkjøles langsomt til 37°C og inkuberes over natten. Uten å fjerne røret fra det 37°C vannbad, tilsettes 2 ul av 10 x revers-transskriptasebufFer (500 mM tris-HCL pH 7,5,400 mM KC1, 30 mM MgCl2), 1 ul 5 mg/ml bovint serumalbumin, 5 ul 100 mM ditiotreitol, 50 ul 10 x dNTP (10 mM av hver dNTP i H20), 3 ul H20, 2 ul RNasin (80 enheter) og 2 ul revers-transskriptase (400 enheter), og reaksjonen inkuberes ved 37°C i 30 min. For å stoppe reaksjonen blir 5 ul av 3 M natriumacetat, pH 5, og 150 ul absolutt etanol tilsatt. Røret oppbevares ved +20°C i 30 min., precipitatet samles opp ved sentrifugering, vaskes med 80 % etanol og lufttørkes. Precipitatet resuspenderes i 10-20 ul påsettingsfarge (90 % formamid, 0,05 % bromfenolblått, 0,05 % xylencyanol, 1 mM EDTA), og forlengelsesproduktene atskilles på en 6 % sekvenseringsgel (Maniatis, T. et al., supra). Forlengelsesprodukter gjøres synlig ved autoradiografi.
EKSEMPEL 6. S 1- nukleasekartlegging
Plasmidet pBS-PR1013Cla fordøyes med SfaNL defosforyleres med lcalvetarrnfosfatase og kinaseres med <32>P-ATP. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling fordøyes DNA med BstEII, og 300 bp fragmentet fra 750 til 1035 i figur 1 isoleres etter elektroforese på en lavtemperatur-geldannende agarosegel. Prøven resuspenderes i formamid-hybridiseringsbuffer (Berk, AJ. et al., Cell 12, 721 (1977)) ved en konsentrasjon på ca. 2 nM. Den spesifikke aktivitet av prøven er ca. 5 x 10 Cvcpm/pmol.
Frysetørket totalt RNA (50 ug) oppløses i 30 ul av prøveoppløsningen, og rørene varmes til 65°C i 10 min. og blir derpå tillatt å hybridisere over natten ved 48°C. Sl-nukleasebehandling og gelelektroforese er i hovedsak som beskrevet ved å bruke en Sl-konsentrasjon på 400 enheter/ml og en inkuberingstemperatur på 30°C. Den passende Sl-nukleasekonsentrasjon bestemmes i piloteksperimenter.
EKSEMPEL 7. Kartlegging av transskirpsjonelt startsete
Det transskripsjonelle startsete for PR-la-genet bestemmes ved en kombinasjon av Sl-nukleasekartlegging og primerforlengelsesanalyse. Et autoradiogram for et primerforlengel-seseksperiment, som bruker enten RNA isolert fra TMV-infiserte blader eller en mp 19 subklon av XhoI-Pstl-rfagmentet som et templat, og et 17-basers oligonukleotid, som er komplementært til posisjoner 1025 til 1042 av PR-la-sekvensen som en spesifikk primer, undersøkes. Primeren i seg selv er merket ved 5' fosfatet, og følgelig vil størrelsen av forlengelsesproduktet være identisk med størrelsen av det tilsvarende bånd i sekvenseringsbrønnene. Eksistensen av to sterke bånd som tilsvarer posisjonene 902 og 903 og et svakt bånd ved posisjon 901 av den genomiske klon, antyder at transskripsjon begynner ved hver av disse posisjoner. Imidlertid kan ikke primerforlengelsesanalyse alene bli brukt for å identifisere den 5' ende av et mRNA. For eksempel kan mRNA inneholde en 5' ende som er blitt spleiset fra en oppstrøms beliggenhet.
For endelig å bestemme den 5' ende, blir høyoppløsning Sl-nukleasekartlegging brukt sammen med primerforlengelse. Et SfaNI-fragment merkes ved den 5' ende og fordøyes med BstEn for å gi en kjedespesifikk prøve som strekker seg fra posisjon 759 til 1040. Denne prøve brukes for å kartlegge den 5<*> ende av PR-la-transskripter i RNA isolert fra TMV-infiserte tobakksblader. Et hovedbånd på 137 ± 2 baser blir funnet, og som tilsvarer posisjonene 901 til 905 av den genomiske klon. I høyoppløsning Sl-eksperimenter, hvor fordøyingsproduktene underkastes elektroforese sammen med en størrelsestandard av sekvenserende reaksjoner utført på prøven, gjøres tre bånd synlig som tilsvarer posisjonene 901, 902 og 903. Disse resultater bekrefter primerforlengelsesanalysen og plasserer den 5<* >ende av PR-l-mRNA ved enten posisjon 901, 902 eller 903. Med hensyn til transskripsjons-start er en mulig tolkning av disse resultater at RNA-polymerase begynner transskripsjon ved enten base 901, 902 eller 903 med mer eller mindre lik sannsynlighet. Imidlertid, siden eukaryotisk transskripsjon begunstiger initiering ved en A, er en mer sannsynlig forklaring for de tilsynelatende multiple 5' ender at PR-la-mRNA begynner ved posisjon 903 (en A), og PR-lb- og -lc-mRNA begynner hver ved en av de andre posisjoner på deres tilsvarende gener.
2. PROTE1NIDENTMSERING OG KARAKTERISERING
PR-proteinene som er relevante til disse eksempler, isoleres, renses og sekvenseres, i enkelte tilfeller for første gang og i andre i samsvar med litteraturprosedyrer, for det endelige formål å bekrefte identiteten av deres kjemisk induserbare gener.
EKSEMPEL 8. Rensing av PR- la- og PR- lb- protein
Planter av Nicotiana tabaccum cv. Xanthi dyrkes i et glass-
hus og infiseres når de er 8 uker gamle ved forsiktig å gni bladene med en suspensjon av en vanlig stamme (Ul) av TMV (0,5 ug/ml). Blader innhøstes 7 dager etter infisering, og intracellularvæsken (ICF) vaskes ut av bladene og samles opp i henhold til Parent, J.G. et al.,
Can. J. Bot. 62, 564 (1984). 250 ml av ICF konsentreres til 50 ml ved frysetørking og settes på en ultragel ACA54-kolonne ekvilibrert med tris-HCl, pH 8,0, og 1 mM EDTA. Eluater analyseres ved elektroforese på 10 % polyakrylamidgeler. Fraksjoner inne-
holdende PR-1-proteiner slås sammen, frysetørkes, resuspenderes i 3 ml vann og dialyseres derpå over natten mot vann. Dette preparat renses ytterligere ved HPLC anionebytter-kromatografi på en TSK-DEAE 5 PN-kolonne. Kolonnen elueres med en 0-0,6 MNaCl-gradient i 50 mM tris-HCl, pH 8,0,1 mM EDTA. Fraksjoner analyseres ved polyakryl-amidgel-elektroforese (PAGE). PR-lb elueres først fra kolonnen ved 0,18 MNaCl, og PR-la elueres ved 0,28 MNaCl. Fraksjoner inneholdende hvert protein slås sammen, dialyseres mot vann og frysetørkes. Renheten av PR-la- og PR-lb-proteinpreparatet bekreftes ved revers-fase-HPLC ved å bruke en Aquapore fenylkolonne (2,1 x 100 mm, Brownlee) og ved eluering med en lineær acetomtril/isopropanol (1: l)-gradient (5-80 %) i 0,1 % TF A.
EKSEMPEL 9. Proteinsekvensbestemmelse
Renset, frysetørket PR-la-protein oppløses i 6 M guanidin-HCl inneholdende 1 M tris-HCl, pH 8,6,10 mM EDTA. Ditiotreitol tilsettes til 20 mM, og 4-vinylpyridin tilsettes til en endelig konsentrasjon på 50 mM. Prøven inkuberes derpå i 1,5 time under nitrogen. Det pyridyletylerte materiale avsaltes på HPLC ved å bruke en Aquapore fenylkolonne (2,1 x 10 cm, Brownlee). Kolonnen elueres med en lineær 5-80 % gradient av acetonitrMsopropanol (1:1) i 0,1 % trifluoreddiksyre (TF A).
Automatisk Edman-degradering utføres med en Applied Biosystems 470A gassfasesekvensator. Fenyltiohydantoin (PTH) aminosyrer identifiseres med en Applied Biosystems 120APTH-analysator.
Cyanogenbromidspaltning utføres in situ i henhold til Simpson, RJ. et al., Biochem. Intl. 8, 787 (1984). Fordøying av PR-1 med pyroglutamat-aminopeptidase (Boehringer Mannheim) utføres i henhold til Allen, G., Plant Sei. Lett. 26,173 (1982).
PR-la fordøyes med endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) i 0,1M tris-HCl, pH 8,5, i 24 timer ved romtemperatur ved å bruke et enzym- til substratforhold på 1:10. Peptider isoleres med HPLC ved å bruke en Aquapore C-8-kolonne (1 x 22 cm, Brownlee) ved en lineær acetomtril/isopropanol (l:l-forhold) gradient (0-60 %) i 0,1 % TF A
Fordøying av det N-terrninale Lys-C-peptid med trypsin (Cooper) utføres i 0,1M ammoniumbikarbonat, pH 8,2, inne-holdende 0,1 M kalsiumklorid i 5 timer ved 37°C ved å bruke et enzym- til substratforhold på 1:100. De to dannede peptider atskilles på HPLC ved å bruke de samme betingelser som med Lys-C-peptidene.
EKSEMPEL 10. Proteinsekvens av PR- la- peptider
En sammenligning mellom DNA-sekvensen av tre cDNA-kloner og PR-la-, -lb-, og -lc-proteiner er tidligere foretatt av Cornelissen, BJ.C. et al., supra. basert på en sammenligning av de publiserte proteinsekvensdata av tre peptider avledet fra PR-la (Lucas, J. et al., EMBO J. 4,2745 (1985)) og primærstrukturen av proteinet avledet fra cDNA-klonene. Imidlertid er cDNA-klonen betegnet som PR-la, spaltet ved den 5' ende og kan kun sammenlignes med to av de tre peptider med en ulikhet på ett residuum. Den kodede aminosyresekvens avledet fra cDNA, som fremstilt og analysert ovenfor, og PR-la-cDNA-sekvensen fra Pfitzner, U M. et al. supra. er ikke bare ulik den publiserte proteinsekvens ved tryptofanresiduet som rapportert, men er også ulik de tre andre posisjoner av den ammoterrninale proteinsekvens. Denne ulikhet stiller spørsmålstegn ved identifiseringen av denne klon som PR-la. Følgelig bekreftes identiteten av tobchrPR1013-klonen som PR-la-genet ved å bestemme en stor del av primærstrukturen av det rensede PR-la-protein ved aminosyresekvensering.
Dataene for aminosyresekvensen av PR-la-proteinet sammenlignes med aminosyresekvensene avledet fra cDNA-kloner for PR-la, -lb og -lc. cDNA-sekvensdataene brukt i analysene, er fra cDNA-kloner isolert ovenfor og sekvenser fra Pfitzner, U.M. et al., supra, som er like ved hver posisjon. Over 80 % av de ferdigutviklede PR-la-proteinsekvenser bestemmes, og denne sekvens er lik den avledede proteinsekvens for tobchr-PR1013. Sammenlignet med den avledede aminosyresekvens fra de antatte PR-lb- og PR-lc-cDNA-kloner (Cornelissen, BJ.C. et al., supra) er det hhv. sju og seks ulikheter. Således vises det klart at tobchrPR1013 faktisk er en klon av PR-la-genet.
3. FREMSTILLING AV KLONER
Denne gruppe eksempler beskriver kloner fremstilt som et resultat av genisolering og identifisering av de kjemisk regulerbare gener og chimeriske gener inneholdende disse sekvenser.
EKSEMPEL 11. Fremstilling av tobchrPR1013
Kjerner isoleres fra blader av Nicotiana tabaccum ved først å fryse 35 g av vevet i flytende nitrogen og male dette til et fint pulver med en morter og støter. Pulveret tilsettes 250 ml malebuffer (0,3 M sukrose, 50 mM tris, pH 8, 5 mM magnesiumklorid, 5 mM natriumbisulfitt, 0,5 % NP40) og omrøres på is i 10 min. Denne blanding filtreres gjennom seks lag osteklede, og væsken overføres til sentrifugerar og underkastes sentrifugering ved 700 x g i 10 min. Pelletene resuspenderes i malebuffer og resentrifugeres. Pelletene resuspenderes igjen i malebuffer og resentrifugeres. Pelletene resuspenderes igjen i malebuffer, og denne suspensjon blir lagt over med et 20 ml kaldt sukroselag inneholdende 10 mM tris, pH 8,1,5 mM magnesiumklorid, 140 mM natriumklorid, 24 % sukrose, 1 % NP40. Disse rør sentrifugeres ved 17.000 x g i 10 min. Pelletene inneholder ved dette trinn for det meste kjerner og stivelsesgranuler. Høymolekylvekt-DNA isoleres fra kjernene i hovedsak i henhold til Maniatis, T. et al., supra. DNA fordøyes delvis med Mbol og ligeres inn i BamHI-setet av EMBL3-kloningsvektoren. Cirka 300.000 plakker undersøkes med en merket PR-lb-cDNA-prøve. Femti positive kloner isoleres og karakteriseres. Positive plakker renses og karakteriseres ved restriksjonsanalyse. Disse kloner klassifiseres i åtte distinkte grupper ved restriksjonskartlegging. En av klonene identifiseres som tobchrPR1013. Et partielt restriksjonskart av tobchrPR1013 er vist i figur 1. Isolering av DNA og DNA-manipuleringer er vesentlig som beskrevet av Maniatis, T. et al., supra.
EKSEMPEL 12. Fremstilling av pBS- PR1013Cla
Et Clal-fragment fra klonen tobchrPR1013 subklones i Blue-
script-plasmidet (Stratagene Cloning Systems) og resulterer i pBS-PR1013Cla (se figur 2). Det 2 kb XhoI-BgUI-rfagmentet fra pBS-PR1013Cla sekvenseres, og posisjonene 913 til 1711 (sekvens 1) finnes å tilsvare perfekt sekvensen av en cDNA-klon for PR-la isolert av Pfitzner, U.M. et al., supra. Mulige omstokkinger av tobakk-DNA under kloningsprosedyren utelukkes ved å analysere forutsagte restriksjonsfragmenter fra genomisk DNA Basert på sekvensinformasjon og et restriksjonskart av pBS-PR1013Cla, ville fordøying av genomisk tobakk-DNA med enten EcoRI, Ffindm, Xhol+Bgin eller HindUI+Pstl hhv. danne fragmenter på 3,2 kb, 6,7 kb, 2,0 kb eller 6,4 kb som inneholder PR-la-genet. For å undersøke denne forutsigelse, ble 3 ug kromosomalt tobakk-DNA fordøyet med passende enzymer og underkastet elektroforese på en 0,7 % agarosegel. DNA overføres til en nylonmembran og undersøkes med et merket XhoI-BstEn-restriksjonsfragment fra PR-la-genet. Som en kontroll fordøyes pBS-PR1013Cla-DNA og underkastes elektroforese på samme gel. Som forutsagt danner EcoRI-, HindlH-, XhoI+BgUJ- og FfindHI+Pstl-for-
døyingene bånd med ventet molekylvekt som beveger seg sammen med kontrollbåndene. Følgelig representerer DNA inneholdt i tobchrPR1013-klonen en sammenhengende del av DNA i tobakkgenomet.
EKSEMPEL 13. Fremstillin<g> av pBS- PR1013Eco
A Plasmidet pBS-PR1013Eco dannes ved subkloning på 3,6 kb EcoRI-fragmentet inneholdende PR-la-genet fra tobchrPR1013 (eksempel 9) inn i det eneste EcoRI-setet av Bluescript-plasmidet. Bluescript-plasmid (katalognr. 21203) erholdes fra Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California. Strukturen av pBS-PR1013Eco bekreftes både ved restriksjonskartlegging og DNA-sekvensering. Denne konstruksjon av plasmidet er vist i figur 3.
B. Alternativt fordøyes plasmidet pBS-PR1013Cla med EcoPJ, og 3,6 kb fragmentet inneholdende PR-la-genet isoleres. pBluescript fordøyes med EcoRL blandes med og ligeres til det på forhånd isolerte 3,6 kb EcoRI-fragmentet. Denne konstruksjon av plasmidet er vist i figur 4.
EKSEMPEL 14. Fremstillin<g> av pBS- PR1013Eco A Pst
Plasmidet pBS-PR1013Eco fordøyes med Pstl, og DNA-fragmentene atskilles på en 2,5 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Det store fragment inneholdende Bluescript-vektoren og et 3,0 kb fragment av tobakk-DNA, skjæres nøye ut og varmes til 65°C for å smelte agarosen. 2 ul tilsettes 15 (il vann, og DNA ligeres i agarose, som beskrevet i eksempel 1. Etter inkubering over natten blir agarosen inneholdende DNA derpå smeltet ved inkubering ved 65°C i 10 min. og derpå transformert fra agarosen, i hovedsak som beskrevet i eksempel 2. En del av den bakterielle kultur fra hver av seks antatt positive konstruksjoner inokuleres i
5 ml LB-medium (Miller, supra) inneholdende 100 ug/ml ampicillin, og denne kultur inkuberes ved 37°C over natten. Celler høstes ved sentrifugering i en klinisk sentrifuge ved full hastighet i 10 min. Supernatanten fjernes, og cellene resuspenderes i 100 ul 50 mM glukose, 25 mM tris, pH 7,5,10 mM EDTA, og suspensjonen overføres til et 1,5 ml Eppendorf-sentrifugerør. 25 ul av en ferskt fremstilt 10 mg/ml lysozymoppløsning tilsettes, og suspensjonen holdes på is i 10 min. 200 ul av 0,2 N natriumhydroksyd, 1 % natriumdodecylsulfat blir så tilsatt, og suspensjonen blandes og tillates å stå på is i 2 min. 200 ul av 2 M natriumacetat (pH 4,8) tilsettes, og oppløsningen tillates oppbevart på is i 15 min. Den resulterende oppløsning underkastes sentrifugering ved full hastighet i 10 min. i en Eppendorf-sentrifuge. Supernatanten fjernes til et nytt sentrifugerar og ekstraheres med 400 ul fenol/kloroform (1:1). Den vandige fase fjernes til et nytt rør og ekstraheres med 400 ul kloroform. Den vandige fase fra denne ekstraksjon fjernes til et nytt rør, og DNA utfelles ved tilsetning av 2 volumdeler etanol og lagring ved +20°C i 30 min. Det utfelte DNA samles opp ved sentrifugering i en Eppendorf-mikrofuge i 15 min. ved full hastig-het. Etanolen fjernes, og pelletene vaskes med 80 % etanol. Etanolen fjernes igjen, og pelletene tillates å lufttørke. DNA resuspenderes i 100 ul TE-buffer. Konstruksjoner bekreftes ved fordøying med Pstl. Det parentale plasmid pBS-PR1013Eco gir et 6 kb og ca. 650 bp bånd, hvorav det minste mangler i de nye konstruksjoner. Et av disse plasmider velges ut som plasmidet pBS-PR1013Eco A Pst. Strukturen av denne subklon bekreftes ved sekvensanalyse. Konstruksjonen av dette plasmid er vist i figur 5.
EKSEMPEL 15. Fremstilling av pBS- PR1013Eco A Pst A Xho
Et foreløpig restriksjonskart av pBS-PR1013Eco etableres. Et Xhol-restriksjonssete ligger ca. 1200 bp oppstrøms for Pstl-setet. Plasmidet pBS-PR1013Eco Pst fordøyes med Xhol, og fragmentene separeres på 0,9 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. To fragmenter gjøres synlig med 3,9 kb og 1,7 kb. Båndet som inneholder 3,9 kb fragmentet, fjernes forsiktig fra gelen og ligeres i agarose, i hovedsak som beskrevet ovenfor. Agarosen smeltes, og DNA overføres til kompetent E. coli-stamme HB 101, som beskrevet ovenfor. Celler plasseres på LB-amp-plater og inkuberes som beskrevet. En antatt positiv koloni inokuleres i LB-amp-medium, og DNA isoleres i hovedsak som beskrevet. Strukturen av denne nye subklon pBS-PRl 013Eco Pst Xho bekreftes ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering.
Figur 6 viser konstruksjonen av dette plasmid.
EKSEMPEL 16. Fremstillin<g> av pCJJ3270
Plasmid pBI101.3 (katalognr. 6024.1) erholdes fra Clonetech Labs, Palo Alto, California. Dette plasmid fordøyes først med BamHI og derpå med Sali. Plasmidet pBS-PR1013Eco pst
-Xho fordøyes med Pstl. En PstlZBamHI-adapter med sekvensen
fremstilles som beskrevet i eksempel 4 og ligeres til Pstl-fordøyet pBS-PR1013Eco Pst Xho. Det resulterende materiale fordøyes først med BamHI og derpå med Xhol. BamFfl/XhoI-fragmentet isoleres, blandes og ligeres til det fordøyede pBI101.3 og transformeres. En antatt positiv klon av pCIB270 isoleres og bekreftes ved restriksjons- og DNA-sekvensanalyse. Fremstillingen av dette plasmid er vist i figur 7.
EKSEMPEL 17. Fremstilling av M13mpl8- eller mpl9- PR1013Eco- A Pst A Xho
Plasmidet pBS-PR1013Eco A Pst A Xho fordøyes med Pstl og Asp-
718. 1,1 kb Asp718/PstI-fragmentet isoleres etter elektroforese på en 1 % TAE lavgeldannende agarosegel. Den replikative form (RF) av coli-fagen M13mpl8 eller M13mpl9 fremstilles i henhold til Messing, 1, Meth. Enzymol. 101, 20 (1983). Alternativt kan disse vektorer erholdes fra Bethesda Research Labs., Gaithersburg, Maryland. Hver vektor fordøyes først med Asp718 og derpå med Pstl. Etter fjerning av poly-
linkerdelen ved elektroforese på 0,7 % TAE lavgeldannende agarose blandes den resulterende vektor RF og ligeres i agarose med 1,1 kb fragmentet fremstilt ovenfor. DNA transformeres, antatt positive plakker isoleres, og deres struktur bekreftes ved analyse av RF-DNA Konstruksjonene av M13mpl8- og mpl9-PR1013Eco A Pst A Xho er vist i figur 8.
EKSEMPEL 18. Fremstilling av M13mpl8- eller mpl9- PR1013Eco- A Pst A Xho. Nco og
pCD3268
Enkeltkjedet M13mpl8-PR1013Eco A Pst A Xho-fag-DNA isoleres i henhold til Messing, supra. En 18 bp oligonukleotidprimer med sekvens
syntetiseres som beskrevet ovenfor. Primeren fosforyleres med T4-polynukleotidkinase (Maniatis, T. et al., supra ved s. 125) ved å bruke umerket ATP. Etter inkubering ved 37°C i 60 min. oppvarmes reaksjonen til 68°C i 15 min. og plasseres derpå på is. Primeren og M13-40 fremadsekvenserende primer (New England BioLabs nr. 1212) tilknyttes enkeltkjedet
M13-mpl8-PR1013Eco APst AXho-DNA etter blandingiet 1:1:1 molart forhold ved sakte avkjøling etter oppvarming i 10 min. ved 68°C. Den sammenkoblede blanding plasseres på is, og 1/10 volumdel av 10 x forlengelsesbuffer (20 mM tris-buffer, pH 7,5, 6 mMMgCk, 1 mM DTT, ImM dATP, 1 mM dCTP, ImM dGTP og 1 mM dTTP) tilsettes. 10 enheter DNA-polymerase I stort fragment (Klenow-rfagment, New England BioLabs nr. 210) og 0,1 enhet T4-DNA-ligase (NEB nr. 202) tilsettes, og reaksjonen tillates å fortsette i 14 timer ved 15°C. Ved denne tid tilsettes en ytterligere del av hvert enzym, og reaksjonen utføres i ytterligere 2 timer ved 25°C før blandingen brukes for å transformere kompetent JM101 E. coli. Et generelt flytdiagram av denne fremgangsmåte er gitt i figur 9.
For å identifisere den muterte fag, løftes plakkene på Gene Screne Plus (DuPont) og behandles i henhold til forhandlers anbefalinger. Filtrene prehybridiseres i 4 timer og hybridi-seres over natten ved 42°C i forhandlers hybridiseringsoppløsning inneholdende 0,9 MNaCl. Filtrene blir derpå sekvensielt vasket med en NaCl-konsentrasjon på 0,9 M og overvåket ved autoradiografi ved å øke vasketemperaturen med 5°C ved hvert trinn. Fager identifisert ved hybridisering til å ha blitt mutert, sekvenseres for å bekrefte baseforandringen.
Den replikative form av en slik kandidat (M13mpl8-PR1013Eco- A Pst A Xho.Nco) isoleres og fordøyes med Pstl og BstEII for å danne et 394 bp fragment som blir brukt for å erstatte det tilsvarende ikke-muterte 394 bp fragment i pBS-PR1013Eco A - Pst A Xho, som vist i figur 10. Dette resulterer i fremstillingen av pCIB268 som har et Ncol-sete ved posisjon 930, fulgt av 217 bp av den kodende sekvens for PR-la-genet. Strukturen av dette plasmid er bekreftet ved sekvensanalyse.
EKSEMPEL 19. Fremstilling av chimeriske gener inneholdende GUS og variable lengder
av PR- promotersekvensen
A. Konstruksjon av pCIB269
Et fragment på 930 bp isoleres etter elektroforese av Xhol- og Ncol-fordøyet pCJJB268 på en 1,0 % lavtemperatur-geldannende agarose-TAE-gel. Dette fragment ligeres derpå inn i pBS-GUS1.2 (se eksempel 19 B) som er blitt fordøyet med Xhol og Ncol. Transformanter isoleres og analyseres ved restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering. Et positivt plasmid velges og betegnes pCJJ3269. Konstruksjonen av dette plasmid er vist i figur 11.
B. Konstruksjon av pBS- GUS1. 2
pBS-GUS 1.2 dannes ved tredelt ligering av et 391 bp Sall/Snabl-fragment fra pRAJ265 (Jefferson, RA. et al., EMBO J. 6,3091-3907 (1987)) og GUS-brukerveiledning, Clonetech Labs, Palo Alto, Ca.) med et 1707 bp Snabl/EcoRI-fragment fra pBI221 (Jefferson, RA. et al., EMBO J. supra) og pBS fordøyet med Sali og EcoRI, se figur 12. Transformanter isoleres og analyseres ved restriksjonsfordøying og DNA-sekvensering. En bekreftet klon betegnes pBS-GUS. 1.2.
C. Konstruksjon av pCIB200
TJS75Kan fremstilles først ved fordøying av pTJS75 (Schmidhauser og Helinski, J. Bacteriol. 164,446-455 (1985)) med Narl for å skille ut tetracyklingenet, fulgt av innsetting av et Accl-fragment fra pUC4K (Messing, J. og Vierra, 1, Gene 19,259-268 (1982)) som bærer et Nptl-gen. pCTB200 fremstilles derpå ved å ligere Xhol-linkere til EcoRV-fragmentet av pCIB7 (inneholdende venstre og høyre T-DNA-grenser, et planteutvelgelig nos/nptU chimerisk gen og pUC-polylinkeren (Rothstein, S.J. et al., Gene 53,153-161 (1987)), og å klone Xhol-fordøyet fragment i Sall-fordøyet TJS75Kan.
D. Konstruksjon av pCJJ3271
Plasmidet pCJJ3269 (eksempel 19 A) fordøyes med Xhol og Eco-
RI, og 3023 bp fragmentet som bærer PR-la-promoteren koblet til GUS-genet med en nos 3' ende, isoleres etter elektroforese på en 1,0 % lavgeldannende agarose-TAE-gel. Dette fragment ligeres derpå i bred vertsområdevektor pCD3200 som er blitt fordøyet med Sali og EcoRI. Transformanter isoleres og analyseres ved restriksjonsanalyse. En bekreftet klon kalles pCTB271. Konstruksjonen av denne klon er vist i figur 13.
E. Konstruksjon av pCTB272
pCJJ3268 (eksempel 18) fordøyes med Alul pluss Ncol, og et 833 bp fragment isoleres etter elektroforese på en 1 x TAE 0,7 % agarosegel. Dette fragment ligeres til 6-glukoronidasegenet med nos 3' enden i pBS-GUS1.2 (eksempel 19 B). Promoteren og GUS skilles derpå ut fra dette plasmid, betegnet pCTB282, som et Asp718I/BamHI-fragment og ligeres i pCTB200 som er blitt fordøyet med Asp718I og BamHI før transformasjon i E. coli-stamme DH5cc. Transformanter isoleres og analyseres ved restriksjonsanalyse. En bekreftet klon betegnes pCTB272.
F. Konstruksjon av pCTB273
pCTB268 fordøyes med HaeHI pluss Ncol, og et 603 bp fragment isoleres etter elektroforese på en 1 x TAE 0,7 % agarosegel. Dette fragment plasseres foran B-glukoronidasegenet med nos 3' enden i pBS-GUS1.2. Promoteren og GUS skilles derpå ut fra dette plasmid, betegnet pCTB283, som et Asp718I/BamHI-fragment og ligeres i pCIB200 som er blitt fordøyet med Asp718I og BamHI før transformasjon i E. coli-stamme DH5a. Transformanter isoleres og analyseres ved restriksjonsanalyse. En bekreftet klon betegnes pCIB273.
EKSEMPEL 20. Fremstilling av et chimerisk gen i en hygromycinvektor
pCIB269 fordøyes med Xhol og EcoRL og 3023 bp fragmentet som bærer PR-la-promoteren knyttet til GUS-genet med en nos 3' ende, isoleres etter elektroforese på en 1,0 %
lavgeldannende agarose-TAE-gel. Dette fragment omdannes derpå til et XhoI/SaU-fragment ved ligering med en EcoRI/Sall-adapter med sekvensen
XhoI/Sall-rfagmentet ligeres i Sall-fordøyet pCIB712 (Rothstein, S.J. et al., supra) for å danne pCJJ3219, se figur 14.
EKSEMPEL 21. Fremstilling av pCIB200/ PRl- BT
A. Ligerin<g> med pCJJ3200
Plasmidet pCIB1004 (se nedenfor) fordøyes med SphI, fenolekstraheres, etanolutfelles og resuspenderes. Et oligonukleotid med sekvensen
syntetiseres, renses, behandles med kinase og ligeres til Sphl-fordøyet plasmid pCTB1004. Etter ligering inaktiveres ligasen, og DNA fordøyes med Kpnl. Dette DNA behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCTB-
200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl og behandles med kalvetarm-alkalisk fosfatase og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet som inneholder pCTB200-vektoren og båndet som inneholder PR-1 5* flankerende sekvens/BT-fusjon blandes, og DNA ligeres for å danne plasmid pCJJB200/PRl-BT.
B. Fremstilling av pCIB1004
Plasmidet pCIB10/35Bt(607) fordøyes med Ncol og BamHI og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCJJ3269 (eksempel 19 A) fordøyes med Ncol og Xhol og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCTB710 (Rothstein, S.J. et al., supra) fordøyes med Sali og BamHI og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet med Sali- og BamHI-fordøyet vektor inneholdende en CaMV 35S-promoter 3'ende klonet i pUC19, båndet inneholdende BT-genet og båndet inneholdende den PR-1 5' flankerende region skylles ut, blandes, og DNA ligeres for å danne plasmidet pCTB1004.
C. Fremstilling av pCTB10/ 35Bt( 6( m
pCIB10/35Bt(607), et utskilt protoksingen inneholdende en sekvens som koder for ca. 607 aminosyrer, fremstilles fra plasmid pCTB10/35Sbt, et plasmid inneholdende protoksingenet fra Bacillus thuringiensis-endotoksin. E. coli MC 1061 inneholdende pCIB10/35Sbt ble deponert ved the American Type Culture Collection, ATCC-nummer 67329, 27. februar 1987. Et utskilt protoksingen dannes ved å sette inn et BamHI-spaltningssete (GGATCC) etter nukleotid 1976 i BT-gensekvensen. Dette blir gjort ved å klone BamHI-fragmentet inneholdende protoksinsekvensen fra pCJJ310/35Sbt i mp 18, og ved å bruke standard oligonukleotid-mutageneseprosedyrer. Etter mutagenese fremstilles dobbeltkjedet replikativ form DNA fra M13-klonen som derpå fordøyes med BamHI. Cirka 1,9 kb fragmentet inneholdende det utskilte protoksingen, settes inn i BamHI-spaltet pCIBlO/710. Det resulterende plasmid blir utvalgt på kanamycin. En detaljert beskrivelse av denne fremstilling er gitt i U.S. patentsøknad, serienr. 122.109, innlevert 18. november 1987, som er innbefattet heri pr. referanse.
EKSEMPEL 22. Fremstilling av pCIB1233 ( pCIB200/ PRl- AHAS1
A Ligering med pCIB200
Plasmidet pCIB200 fordøyes med Kpnl og Xbal og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB1216 fordøyes med Kpnl og Xbal og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Cirka 4,3 kb båndet inneholdende den PR-1 5' flankerende sekvens fusert til den AHAS-kodende sekvens, og båndet inneholdende pCIB200-vektoren skilles ut, blandes, og DNA ligeres for å danne pCIB1233.
B. Fremstilling av pCIB1216
Plasmidet pCIB269 (eksempel 19 A) fordøyes med Xbal og Ncol og behandles på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB1207 (se nedenfor) fordøyes med Xbal og Ncol og behandles på en lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende Bluescript-vektoren med den PR-1 5' flankerende sekvens, og 3,3 kb båndet inneholdende den AHAS-kodende sekvens skilles ut, blandes, og DNA ligeres for å danne plasmid pCIB 1216.
C. Fremstillin<g> av plasmid pCTB1207 inneholdende Arabidopsis- AHAS- genet
Totalt plante-DNA isoleres fra 5 uker gammel Arabidopsis thaliana. ecotype Columbia. 250 ug av dette DNA fordøyes med 4000 enheter av restriksjonsenzymet Xbal i 4 timer. For-døyingen fraksjoneres ved elektroforese på en 0,8 % agarosegel. DNA-fragmentene mellom 6,5 kb og 4,36 kb (basert på Hmdffl-fordøyet lambda-DNA størrelsesmarkører) isoleres fra gelen ved å bruke NA-45 DEAE-membran (Schleicher og Schuell, Keene, NH, USA) ifølge forhandlers anbefalte fremgangsmåter. Xbal-fordøyet og fosfatasebehandlet lambdaOngC (longC) arm-preparat erholdes fra Stratagene Cloning Systems (La Jolla, CA, USA). 0,1 ug av Arabidopsis Xbal-innskutt DNA ligeres til 1,0 ug av longC-armene i henhold til fremgangsmåtene anbefalt av Stratagene. 2,5 ul av ligeringsreaksjonen pakkes i lambda faghoder ved å bruke Gigapack Plus-sett (Stratagene Cloning Systems) ifølge fremgangsmåtene anbefalt av forhandler. Aktiviteten av biblioteket titeres på E. coli VCS257 (Stratagene Cloning Systems). 50 ug av pE16/8-c4-plasmid-DNA (J. Polaina, Carlsberg Res. Comm. 49, 577-584) fordøyes med EcoRL, og fordøyelsesproduktene atskilles på en 0,8 % agarosegel. 2 kb EcoRI-fragmentet inneholdende den kodende sekvens for gjær-AHAS-genet, isoleres fra gelen ved å bruke NA45 DEAE-membran ifølge fremgangsmåtene anbefalt av forhandler. Radiomerkede prøver til 2 kb fragmentet syntetiseres på dagen av hybridiseringsreaksjonen med tilfeldig prirningreaksjon ved å bruke Prime Time-sett (International Biotechnologies Inc., New Haven, CT, USA) ved å følge fremgangsmåtene anbefalt av forhandler.
250.000 rekombinante fager plasseres på plater på VCS257. Duplikate membranavheisinger av fagplakkene foretas ved å bruke Colony/Plaque Screen-membraner (NEN Research Products, DuPont, Boston, MA, USA) ifølge fremgangsmåtene anbefalt av forhandler. Membranene prehybridiseres i LS-hybridiseringsbuffer, overføres derpå til 150 ml fersk LS-hybridiseringsbuffer inneholdende 0,25 ug av <32>P-merket gjær-AHAS-genprøve fremstilt som beskrevet ovenfor. Membranene inkuberes i 16 timer ved 42°C under forsiktig risting, vaskes to ganger ved romtemperatur med 2 x SSC i 15 min. pr. vask, vaskes tre ganger ved 42°C i LS-vaskebuffer (25 % formamid, 5 x SCC, 1 % SDS) i 2 timer pr. vask og vaskes to ganger i rensebuffer (0,1 x SSC, 0,1 % SDS) i 30 min. pr. vask. Membranene monteres og underkastes fluorografi med Cronex Lightening Plus Sceens (DuPont, Wilmington, DE, USA) og XAR-5-film (Kodak). Plakkene fra områdene av platene som gir positive filmsignaler på begge membransjikt, plukkes ut og omplates ved en lav tetthet på 300 plakker pr. 150 mm plate, og avskjerrningsprosessen gjentas inntil enkle hybridiseringsplakker isoleres.
Miniprep av fag-DNA fra den plakkrensede fag utføres ifølge fremgangsmåten som følger med lambdaSorb-fag adsorbentsettet (Promega, Madison, WI, USA). Fag-DNA spaltes med restriksjonsenzymet Xbal, og 5,8 kb innskuddsrfagmentet klones i Xbal-setet av pBS(-)-plasmid (Stratagene Cloning Systems). Identiteten av det klonede fragment med Xbal-fragmentet inneholdende Arabidopsis-AHAS-<g>enet verifiseres ved å sammenligne dets restriksjonskart og DNA-sekvens med de som er publisert for genet av Haughn et al., Mol. Gen. Genet. 211, 266 (1988) og Mazur et al., Plant Physiol. 85, 1110 (1987). Dette plasmid betegnes pCIB 1207.
EKSEMPEL 23. Fremstilling av pCIB1232 fpCIB200/ PRl- AHAS- SuR)
A. Ligerin<g> med pCIB200
Plasmidet pCIB200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl og Xbal og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB1230 fordøyes med Kpnl og Xbal og føres på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet ved ca. 4,3 kb inneholdende den PR-1 5' flankerende sekvens fusert til den AHAS-SuR-kodende sekvens, og båndet inne-holdende pCIB200-vektoren skjæres ut, blandes, og DNA ligeres for å danne pCIB1232.
B. Fremstilling av pCD31230
Plasmid pCIB1208 (se nedenfor) fordøyes med Xbal og Ncol, og fragmentene separeres ved elektroforese på en 1 x TAE 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB269 (eksempel 19 A) fordøyes med Ncol og Xbal og føres gjennom en 1 x TAE 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. pCIB-269-rfagmentet inneholdende Bluescript-vektoren og PR-l-pro-moteren, og 3,3 kb fragmentet inneholdende det muterte AHAS-gen (identifisert ved krysshomologi og ved restriksjonsrfagmentanalyse med genet beskrevet av Mazur et al., Plant Physiol. 85,1110-1117 (1987)), skjæres ut, smeltes og ligeres sammen for å danne en klon betegnet som pCIB1230.
C. Fremstillin<g> av pCIB1208
Et genomisk DNA-bibliotek konstrueres som beskrevet i eksempel 22 C ved å bruke DNA isolert fra Arabidopsis-planter utvalgt for resistens mot sulfonylurea-herbicid, som beskrevet av Haughn og Sommerville, Mol. Gen. Genet. 204,430-434 (1986). Plakker inneholdende gener som koder for acetohydroksysyresyntase (AHAS), identifiseres ved krysshybridisering med en gjær-acetohydroksysyresyntase-gensonde (se eksempel 22 C). Det rekombinante DNA subklones i Blue-
script (Stratagene) for å danne en klon betegnet som pCTB-
1208. Dette plasmid inneholder et gen som koder for en mutert acetohydroksysyresyntase som er motstandsdyktig mot inhibering av sulfonylurea-herbicider.
EKSEMPEL 24. Isolering av en genomisk klon som koder for den basiske form av B- 1. 3-glukanase ( glukan- endo- 1. 3- B- glukosidase) fra Nicotiana tabaccum
Høymolekylvekt-DNA fremstilles fra blader av Nicotiana tabaccum cv. Havana 425 ved CETAB-fremgangsmåten (Murray og Thompson, Nucleic Arid Res. 8,4321 (1980)). 100 ug av DNA fordøyes fullstendig med Sacl. Dette DNA separeres ved elektroforese på en 0,8 % agarosegel. Området av gelen som tilsvarer et molekylvektområde på 3-7 kb, skjæres i seks like store strimler, og DNA elektroelueres fra disse strimler og utfelles som separate fraksjoner. DNA resuspenderes, og en porsjon fra hver fraksjon føres på en agarosegel og analyseres ved Southern blotting. Fraksjonen som inneholder DNA som hybridiserer til B-1,3-glukanase-cDNA-prøven (Shinshi, H. et al., Proe. Nati. Acad. Sri. USA 85, 5541-5545
(1988)), slås sammen og brukes for å danne bibliotek.
Kloningsvektoren lambdaOngC kjøpt fra Stratagene Corp. fordøyes med Sacl. 1 ug av dette DNA blandes med 0,1 ug av det Sacl-fordøyede tobakk-DNA, og DNA ligeres med T4 DNA-ligase i henhold til forhandlers beskrivelse. Det ligerte DNA pakkes derpå inn i fagpartikler ved å bruke en invitro pakkefremgangsmåte i henhold til Stratagene. Fagene settes på plater med bakterier som antydet i lambda-veiledningen. Cirka 75.000 plakker avskjermes ved å bruke en 32-P-merket B-l,3-glukanase-cDNA-prøve. 11 positive plakker identifiseres. Disse plakker renses med påfølgende runder av utsåing på plater og avskjerming.
DNA isoleres fra de rensede kloner, og klonene analyseres ved restriksjonsfordøying ved å bruke HindTII, EcoRI og Sacl. Klonene er av to typer, én representert ved klonen 39.1 og den andre representert ved klonen 39.3.4,5 og 4,7 kb innskuddene i klon 39.1 og 39.3 subklones hver i Bluescript-plasmid fordøyet med Sacl, og subklonene pBSGluc39.1 (Sacl-fragment avledet fra lambdaklonen 39.1) og pBSGluc39.3 (Sacl-fragment avledet fra lambdaklonen 39.3) isoleres. Sekvensen av DNA i Sacl-fragmentene inneholdt i subklonene pBSGluc.39.1 og pBSGluc.39.3, bestemmes ved DNA-sekvensering og er vist hhv. i sekvens 5 og sekvens 6. Den kodende sekvens blir funnet, og en stor mellomliggende sekvens er lokalisert nær den 5' ende av den kodende sekvens.
EKSEMPEL 25. Identifikasjon av det transskripsjonelle startsete for fi- 1. 3-glukanasegenet
A. Primerforlengelseskartlegging
En syntetisk DNA-primer syntetiseres som er komplementær til basene 2399 til 2416 og brukes i primerforlengelseseksperimenter, som beskrevet i eksempel 5. RNA for disse eksperimenter isoleres fra Phytophthora parasitica. variant nicotiana infisert tobakk. Primerforlengelsesproduktene sammenlignes med en molekylvektstandard hvor den merkede primer brukes i dideoksy-DNA-sekvenseringsreaksjoner med subklonen pBSGluc.39.1 brukt som et templat. Forlengelsesprodukter identifiseres etter gelelektroforese og autoradiografi, som beskrevet i eksempel 5, og tilsvarer posisjonene 1432,1446 og 1447 av 6-1,3-glukanase 39.1-sekvensen, sekvens 5. Siden et stort intron eksisterer mellom posisjonene 1554 og 2345 av pBSGluc.39.1-sekvensen, behøver ikke molekylvektstigen angi den korrekte molekylvekt av forlengelsesproduktene. Følgelig utføres et andre primerforlengelses-kartleggings-eksperiment ved å bruke en primer som er komplementær til posisjon 1530 til 1547. Ved å bruke denne primer, kartlegges tre 5<*> ender av glukanase-mRNA til A-residuer ved posisjonene 1434, 1448 og 1449.
B. S1 - nukleasekartlegging
Et syntetisk oligonukleotid komplementært til posisjonene 1415 til 1504 syntetiseres for bruk som en prøve i Sl-nukleasekartlegging. Oligonukleotidet kinaseres ved 5' enden ved å bruke 32P-ATP og T4-polynukleotidkinase i henhold til forhandlers anbefalinger. Etter fenolekstraksjon og etanolutfelling resuspenderes det merkede oligonukleotid i form-amidhybridiseringsbuffer (se eksempel 6) ved en konsentrasjon på ca. 2 nM. RNA som blir brukt i disse eksperimenter, er isolert fra Phytophthora parasitica infisert tobakk som i foregående eksempel. S 1-kartlegging utføres på dette RNA ved å bruke det merkede oligonukleotid som beskrevet i eksempel 6. Etter gelelektroforese finnes tre bånd som tilsvarer posisjonene 1434, 1448 og 1449 påpBSGluc.39.1-DNA-sekvensen.
C. Bestemmelse av det transskripsjonelle startsete
Primerforlengelse og Sl-nukleasekartleggings-fremgangsmåter plasserer begge de 5' ender av mRNA ved posisjonene 1434,1448 og 1449. Følgelig tilsvarer disse seter, som alle er adeninresiduer, det transskripsjonelle startsete av B-l,3-glukanasegenet.
EKSEMPEL 26. Fremstilling av pBSGluc. 39. 1/ GUS
Oligonukleotider med sekvensene
syntetiseres, renses og brukes i en polymerasekatalysert reaksjon (PCR) i henhold til forhandlers retningslinjer (Perkin Eimer Cetus, DNA thermal cycler og Perkin Eimer Cetus, GeneAmp Reagent Kit) for å forsterke et 1494 bp frag-ment av DNA fra pBSGluc.39.1. Oligonukleotidene er utformet for å legge til et Kpnl-sete umiddelbart 5' for Sacl-setet ved basepar 1 av 39.1-glukanasesekvensen og å danne et nytt Ncol-sete ved basepar 1462. DNA avledet fra PCR-amplifiseringsprosedyren blir fenoWkloroformekstrahert og etanolutfelt. DNA resuspenderes og fordøyes med både Ncol og Kpnl og føres på en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. 1462 bp båndet skjæres ut og brukes i den følgende ligering. Plasmidet pBS-GUS1.2 (eksempel 19 B) fordøyes med Ncol og Kpnl og føres gjennom en 0,8 % agarosegel, og båndet inneholdende vektoren skjæres ut. Båndet inne-holdende pBS-GUS1.2-vektoren og 1462 bp båndet fra PCR-reaksjonen, ligeres og brukes for å transformere E. coli. Positive kolonier plukkes ut og avskjermes for slike som inneholder 1462 bp innskuddet. Plasmidene inneholdende innskudd er antatte kloner av pBSGluc.39.1/GUS, men siden mutasjonshastigheten i denne prosedyre er relativt høy (ca. 1/1000 baser), må flere kloner sekvenseres gjennom 1462 bp fragmentet. En klon som har den ventede sekvens blir valgt som klonen pBSGluc.39.1/GUS.
EKSEMPEL 27. Fremstilling av pBSGluc. 39. 3/ GUS
Oligonukleotider med sekvensene
syntetiseres, renses og brukes i en PCR-reaksjon for å forsterke et 1677 bp fragment fra pBSGluc39.3. Oligonukleotidene utformes for å innføre et nytt Kpnl-sete umiddelbart ved siden av Sacl-setet ved posisjon 1 av glukanase 39.3-sekvensen og et nytt Ncol-sete ved posisjon 1646. DNA fra PCR-forsterkningen fenol-/kloroformekstraheres, etanolutfelles, resuspenderes, fordøyes med både Ncol og Kpnl og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet ved 1646 bp skjæres ut og brukes i den følgende ligering. pBS-GUS1.2 fordøyes med Ncol og Kpnl og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende vektoren skjæres ut, blandes med 1646 bp båndet fra PCR-reaksjonen og ligeres for å danne plasmidet pBSGluc39.3/GUS. Som tidligere isoleres flere antatte plasmider, og et med den ventede sekvens velges ut som plasmid pBSGluc39.3/GUS.
EKSEMPEL 28. Fremstilling av pCIB200/ Gluc39. 1- GUS og pCIB200/ Gluc39. 3- GUS
A pCJJ3200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl og Xbal og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pBSGluc39.1/GUS (eksempel 26) fordøyes med Kpnl og Xbal, og fragmentet separeres på en 0,8 % lavtemperatur-gel-dannende agarosegel. Båndene inneholdende pCJJB200-vektoren, og Kpnl-Xbal-båndet inneholdende den 5' flankerende sekvens av glukanase 39.1-genet fusert til GUS-genet, skjæres ut, og DNA ligeres for å danne plasmidet pCIB200/Gluc39.1-GUS.
B. På lignende måte fordøyes plasmid pBSGluc39.3/GUS (eksempel 27) og ligeres med fordøyet pCffi200 for å danne plasmidet pCJJ3200/Gluc39.3-GUS.
EKSEMPEL 29. Fremstilling av pCTJB200/ Gluc39. 1- BT og pCIB200/ Gluc39. 3- BT
A. pCIB200/ Gluc39. 1- BT
Plasmidet pBSGluc39.1/GUS fordøyes med Kpnl og Ncol og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCTB1004 (eksempel 21B) fordøyes med Kpnl og Ncol og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl, defosforyleres ved å bruke kalvetarm-alkalisk fosfatase og føres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende pCTB200-vektoren, båndet inneholdende den glukanase 5' flankerende region og båndet inneholdende BT-genet skjæres ut, blandes og ligeres for å danne plasmidet pCIB200/Gluc39.1-BT.
B. pCIB200/ Gluc39. 3- BT
På lignende måte fordøyes plasmid pBSGluc39.3/GUS og ligeres med fordøyet pCJJ31004 og fordøyet pCJJ3200 for å danne plasmidet pCIB200/Gluc39.3-BT.
EKSEMPEL 30. Fremstilling av pCJB200/ Gluc39. 1- AHAS og pCIB200/ Gluc39. 3- AHAS
A. Li<g>erin<g> med pCIB200
Plasmidet pBSGluc39.1/AHAS fordøyes med Kpnl og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCTB200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende glukanase/AHAS-fusjonen, og båndet inneholdende pCTB200 ekspresjonsvektoren skjæres ut, blandes, og DNA ligeres for å danne plasmid pCTB200/Gluc-39.1-AHAS.
Likeledes fordøyes plasmid pBSGrluc39.3/AHAS og ligeres med fordøyet pCTB200 for å danne plasmidet pCJJ3200/pBSGluc39.3-AHAS.
B. Fremstilling av plasmidene pBSGluc39. 1/ AHAS og pBSGluc39. 3/ AHAS
Plasmidet pBSGluc39.1/GUS (eksempel 26) fordøyes med Ncol og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCJJ31207 (eksempel 22 C) fordøyes med Ncol og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende den glukanase-51 flankerende sekvens og vektoren, og båndet inneholdende den AHAS-kodende sekvens skjæres ut, blandes, og DNA ligeres for å danne plasmidet pBSGluc39.1/AHAS.
Likeledes fordøyes plasmid pBSGluc39.3/GUS (eksempel 27) og ligeres med fordøyet pCIB1207 for å danne plasmidet pBSGluc39.3/AHAS.
EKSEMPEL 31. Fremstilling av pCIB200/ Gluc39. 1- AHAS- SuR og pCTB200/ Gluc39. 1-AHAS- SuR
A. Ligering med pCTB200
Plasmidet pBSGluc39.1/AHAS-SuR fordøyes med Kpnl og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Plasmidet pCIB200 (eksempel 19 C) fordøyes med Kpnl og Xbal og passeres gjennom en 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. Båndet inneholdende glukanase/AFIAS-SuR-fusjonen, og båndet inneholdende pCTB200 ekspresjonsvektoren skjæres ut, blandes, og DNA ligeres for å danne plasmid pCTB200/- Gluc39.1-AHAS-SuR.
Likeledes fordøyes plasmid pBSG4uc39.3/AHAS-SuR og ligeres med fordøyet pCJJ3200 for å danne plasmidet pCJJB200/Gluc39.1-AHAS-SuR.
B. Fremstillin<g> av plasmidene pBSGluc39. 1/ AHAS- SuR oe pBSGluc39. 3/ AHAS- SuR
Plasmidene pBSGluc39.1/GUS (eksempel 26) og pBSGluc39.3/GUS (eksempel 27) fordøyes med Ncol og XbaL og restriksjonsfragmentene atskilles på en 1 x TAE 0,8 % lavtemperatur-geldannende agarosegel. pCJB1208 (eksempel 23 C) fordøyes med Xbal og NcoL og 3,3 kb fragmentet inneholdende det muterte AHAS-gen (sulfonylurea-herbicidresistent, SuR), isoleres ved agarosegelelektroforese. Fragmentene inneholdende glukoronidasepromoteren og pBS-vektoren skjæres ut, smeltes og ligeres med AHAS-fragmentet for å danne kloner betegnet hhv. pBSGluc39.1/AHAS-SuR og pBSGluc39.3/AHAS-SuR
4. IDENTIFISERING AV NYE GENER
Det følgende eksempel beskriver isoleringen og karakteirseringen av de gjenværende nye PR-proteingener ifølge foreliggende oppfinnelse.
EKSEMPEL 32. Isolering av andre genome og cDNA- kloner
A. Isolering av en genomisk klon som koder for PR- 1'
Et genomisk bibliotek dannes og avskjermes med en PR-l-cDNA-prøve, som beskrevet i eksempel 11. En klon isoleres og betegnes lambdatobchrPR1019. Et foreløpig restriksjonskart etableres. Et Clal-fragment subklones i Bluescript, og derpå etableres et restriksjonskart av plasmid pBS-PR1019Cla. Et stort Xhol-fragment spaltes ut fra pBS-PR1019Cla som resulterer i plasmidet pBS-PR1019ClaXho. Dette plasmid inneholder ca. 2,7 kb av tobakk-DNA inneholdende PR1019-genet. Delesjoner blir foretatt i dette plasmid, og settet av delesjoner blir brukt for DNA-sekvensering.
DNA-sekvensen for ca. 2100 bp av dette gen er vist i sekvens 2. Proteinet kodet for i PR1019 finnes å være ca. 65 % homologt med PR-la, PR-lb eller PR-lc, og følgelig betegnes dette nye gen PR-1<1>.
B. Isolering av en cDNA- klon som koder for agurkchitinase
Et patogeninduserbart chitinaseprotein isoleres fra infiserte agurkblader som beskrevet (Metraux, J.P. et al., Physiological and Molecular Plant Pathology, 33,1-9 (1988)). Peptider dannes fra dette homologe proteinpreparat i hovedsak som beskrevet i faget, og som beskrevet i eksemplene 9 og 10. To områder av dette protein velges ut, og oligo-nukleotidsonder syntetiseres som er komplementære til alle mulige kombinasjoner av messenger-RNA, som er i stand til å kode for peptidene. Sekvensen av sondene er:
Agurkblader infiseres med tobakknekrosevirus (TNV), og RNA isoleres 5 dager etter infeksjon, som beskrevet i eksempel 5. Poly A+-RNA isoleres ifølge standardteknikker, og et cDNA-bibliotek dannes i lambda Zap-kloningsvektoren (Stratagene) i hovedsak som beskrevet (Gubler, TJ. og Hoffman, B J. Gene 25, 263 (1983)). 300.000 plakker sås ut på plater, og duplikate plakkavløftninger undersøkes enten med <32>P-merket oligonukleotidblanding 1 (sonde 1) eller blanding 2 (sonde 2). Plakker isoleres som viser positive resultater når de avskjermes med hver sonde. Isolering av fag og automatisk utskillelse utføres som beskrevet i Stratagene lambda Zap-laboratorieveiledningen.
Når chitinase-cDNA-klonene er isolert i Bluescript-plasmidet, sekvenseres de ved dideoksysekvensering. Sekvensen av chitinasegenet er gitt i sekvens 3.
C. Isolering av cDNA- klonen som koder for hovedformen av PR- R
Nicotiana tabaccum cv. Xanthi-nc-blad infiseres med tobaklanosaikkvirus og høstes inn 5 dager etter infeksjon. Totalt RNA fremstilles som beskrevet i eksempel 5, og poly A+-RNA isoleres ved å bruke standardteknikker. Et cDNA-bibliotek konstrueres ved å bruke dette poly A+-RNA i lamdbaOngC-kloningsvektoren (Stratagene). Cirka 300.000 plakker avskjermes med en oligonukleotidsonde med sekvens
Positive plakker renses ved standardteknikker, og DNA frem-
stilles fra fagen. Et fragment av den rekombinante fag som inneholder cDNA subklones i Bluescript-plasmidet. DNA-sekvensen av dette cDNA bestemmes ved DNA-sekvensering. Sekvensen av en klon som koder for hovedformen av PR-R (Pierpoint, W.S. et al., Physiol. Plant Pathol. 31,291 (1987)), er vist i sekvens 4. Dette kodede protein har en meget sterk homologi til en kjent trypsin-/alfa-amylaseinhibitor isolert fra mais (Richardson, M. et al., Nature 327,432 (1987)). Den klonede PR-R kan være en inhibitor av enten proteaser eller alfa-amylaser og vil som sådan tilføre insekticid, viricid eller fungicid aktivitet til planter når den uttrykkes transgent.
D. Isolering av cDNA som koder for PR- 0
Nicotiana tabaccum cv. Xanthi-nc-blader ble infisert med tobakkmosaikkvirus og innhøstet 5 dager etter infeksjon. Totalt RNA fremstilles som beskrevet i eksempel 5, og polyA+-RNA isoleres ved å bruke standardteknikker. Et cDNA-bibliotek konstrueres ved å bruke dette polyA+-RNAi lambda-OngC-kloningsvektoren (Stratagene). Cirka 300.000 plakker avskjermes ved å bruke en merket cDNA-prøve som koder for tobakk-basisk-chitinasegenet (Shinshi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84, 89-93 (1987)) og vaskefiltre ved 50°C i 0,125 mMNaCl, 1 % SDS, 40 mM natriumfosfat (pH 7,2), 1 mMEDTA 24 positive plakker renses, og DNA-sekvensen av én klon betegnet pBSchtl5 bestemmes. Denne sekvens er vist i sekvens 7.
PR-Q-proteinet renses delvis fra intracellularvæsken av TMV-infiserte tobakksblader, som beskrevet i eksempel 8. Fraksjoner fra ultragel ACA54-kromatograferingen inneholdende PR-O, PR-P, PR-Q og PR-R, slås sammen og konsentreres ved frysetørking. Proteinene renses ytterligere med polyakrylamidgelelektroforese. Proteinbåndet som inneholder PR-Q skjæres ut og proteinelueres i henhold til the Applied Biosystems User Bulletin nr. 36, 21. mars 1988. Proteinet behandles med pyroglutamat-aminopeptidase og sekvenseres med automatisk Edman-degradering, som beskrevet i eksempel 9. Sekvensen av ammoterminalen av PR-Q-proteinet bestemmes til å være (Xxx = uklar):
Proteinet kodet for i klonen i sekvens 7 bestemmes til å være det patogeneserelaterte protein Q basert på: 1) begren-set strukturell homologi med den basiske tobakkchitinase og 2) identitet med den ammoterminale proteinsekvens av PR-Q bestemt ved proteinsekvensering.
E. Isolering av cDNA som koder for den sure form av 13- 1. 3 - glukanase
Cirka 300.000 plakker av cDNA-biblioteket beskrevet i eksempel 32 D (ovenfor), skjermes ved å bruke en merket cDNA-prøve som koder for den basiske form av 13-1,3-glukanase (Shinshi, H. et al., supra) og vaskefiltre ved 50°C i 0,125 MNaCl, 1 % SDS, 40 mM natriumfosfat (pH 7,2), 1 mMEDTA 15 positive plakker isoleres, og innskuddet subklones i Bluescript-plasmidet. Partiell DNA-sekvensering viser at klon 5 og 6 koder for identiske cDNA som har ca. 55 % homologi med den kjente DNA-sekvens av den basiske form av 13-1,3-glukanase. Sekvensen av cDNA i klon 5 og 6 er bestemt og vist i sekvens 8. Det konkluderes med at dette cDNA koder for den sure form av 13-1,3-glukanase basert på den begrensede aminosyresekvenshomologi og det mer sure isoelektriske punkt av det kodede protein.
F. Isolering av en genomisk klon som koder for agurkchitinasegenet
Kjerner isoleres fra Cucumis sativus cv. Long Marketer, og DNA isoleres som beskrevet i eksempel 11. 3 u,g av dette DNA fordøyes med enten EcoRV, EcoRI, BamHI eller Hindlll, og fragmentene atskilles på en 0,5 % agarosegel. En Southern blot-analyse som bruker en merket prøve av agurkchitinase-cDNA (sekvens 3), viser et enkelt bånd i det EcoRI-fordøyede materiale ved ca. 12 kb. Følgelig blir det bestemt å isolere agurkchitinasegenet ved å bruke en total EcoRI-fordøying og ligering i en lambda erstatningstype-klonvektor.
10 ug av DNA isolert ovenfor, fordøyes fullstendig ved å bruke EcoRI. Dette DNA blir så ekstrahert med fenol og utfelt med etanol og ligert i EcoRI-setet av EMBL 4. Cirka 100.000 plakker skjermes med den merkede cDNA-prøve av agurkchitinase, sekvens 3. 10 positive plakker plukkes ut og renses, og DNA-innskuddet analyseres ved preliminær restrik-sjonsfordøyelses-kartlegging. Alle klonene gir det samme resultat, og én plukkes derfor ut for videre analyse. 12 kb innskuddet i denne klon blir så subklonet i Bluescript-plasmidet for å gi plasmid pBScucchi/chitinase. Et restriksjonskart etableres for dette klonede DNA, fragmenter subklones, og DNA-sekvensen bestemmes.
G. Isolering av en genomisk klon som koder for sur 13- 1. 3- glukanase
Et genomisk bibliotek dannes som beskrevet i eksempel 11 og skjermes med en cDNA-klon for den sure 13-1,3-glukanase, eksempel 32 E. En lambda-klon isoleres, og et 1 kb EcoRI-fragment av denne lambda-klon subklones i Bluescript, som beskrevet ovenfor i eksempel 32 A Bluescript-klonen betegnes pBSGL6e.
5. STABIL TRANSFORMASJON OG REGENERERING AV PLANTER
Plantevev transformeres med vektorene beskrevet ovenfor ved enhver teknikk kjent i faget. Slike metoder brukt for overføring av DNA i planteceller, innbefatter f.eks. direkte infeksjon av eller kokultivering av planter, plantevev eller celler med A. tumefaciens (Horsch, RB. et al., Science 225,1229 (1985); Marton, L., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, volum 1, 514-521, 1984), behandling av protoplaster med eksogent DNA ved metoder så som den beskrevet i de følgende publikasjoner: Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3,2717
(1984); EP-A 0 164 575; Shillito, RD. et al., Bio/Technology 3, 1099 (1985); Potrykus, I. et al., supra: Loerz, H. et al., Mol. Gen. Genet. 199,178 (1985); Fromm, M. et al., supra: GB 2.140.822 ogNegrutiu, I. et al., Plant Mol. Biol. 8, 363 (1987); inkubering med polyetylenglykol (PEG) (Negrutiu, I. et al., supra): mikroinjeksjon (Reich, T.J. et al., Bio/Technology 4,1001-1004 (1986); Reich, T.J. et al., Can. J. Bot. 64, 1259-1267 (1986)), mikroprosjektilbombardering (Klein, T.M. et al., Nature 327, 70 (1987)).
EKSEMPEL 33. Transformasjon av Agrobacterium
pCIB270- (eksempel 16), pCJJ3271-, pCIB272- og pCIB273- (eksempler 19 D, E og F) plasmid-DNA renses på cesiumkloridetidiumbromidgradienter og blir brukt for å transformere A. tumefaciens-stamme A136 inneholdende hjelpeplasmidet pCIB542 ved fremgangsmåten til Holsters, M. et al., Mol. Gen. Genet. 163,181-187 (1978), som resulterer i stammene CIB270, CJJ3271, CIB272 og CIB273.
Ved å bruke samme fremgangsmåte, transformeres plasmidene pCJJ3271, pCIB272 og pCIB273 i de virulente A. tumefaciens-stammer 15955, A208, A281, og A. rhizogenes-stamme A4 for å danne stammene betegnet som pCJJ3271 x 15955, pCTB271 x A208, pCIB271 x A281, pCIB271 x A4, pCTB272 x 15955, pCJJ3272 x A208, pCIB272 x A281, pCIB272 x A4, pCJJ3273 x 15955, pCIB273 x A208, pCJJ3273 x A281 og pCIB273 x A4.
Agrobacteirum-stamme CIJ3542 er stamme EHA101 (Hood et al., J. Bacteriol. 168, 1291-1301 (1986), hvori kanamycinmarkøren av plasmidet er blitt erstattet med spectinomycin/streptomycindelen av Tn7.
EKSEMPEL 34. Bladskivetransformasjon av tobakk
A<g>robacteirum-stamme CIB270, CIB271, CIB272 og CIB273 dyrkes i 18-24 timer i glutamatsaltmedium justert til pH 5,6 og supplert med 0,15 % mannitol, 50 ug/ml kanamycin, 50 |j<g>/ml spectinomycin og 1 mg/ml streptomycin før de fortynnes til en OD»» på 0,2 i samme medium uten antibiotikum. Bakteriene blir så dyrket i 3-5 timer før fortynning til en OD600 på 0,2-0,4 for inokulering av skivene på 5-7 mm stanset ut fra blader av Nicotiana tabaccum cv. Xanthi, som er blitt dyrket aseptisk i GA7-beholdere ifølge en modifisering av metoden til Horsch, R. et al., Science 227, 1229-1232 (1985).
Bladskivene holdes på 0,7 % agar inneholdende Murashige og Skoogs hoved- og bisaker (MS), 1 mg/l benzyladenin og 1 mg/ml a-naftaleneddiksyre i 2 dager før overføring til samme medium inneholdende 50 u,g/ml kanamycin, 100 ug/ml carbenicillin og 100 ug/ml mefoxin. Skudd som dannes på skivene, skjæres fra og utvikles inntil seks planteemner erholdes ved å subdyrke skuddtuppene på MS-medium inneholdende 50 ug/ml kanamycin i GA7-beholdere.
Planteemnene slår rot på medium uten hormoner, og 50 u,g/ml kanamycin blir overført til jord og herdes i en fytotron før overføring til veksthus for induksjonsbehandling med kjemiske regulatorer. Ved blomstringstid induseres blomstene til selvpollinering. Frø høstes etter maturering.
Induksjonseksperimenter og resultater er beskrevet i eksemp-lene 63, 66 og tabell II.
EKSEMPEL 35. Dannelse av transgene tobakkcallus og planter
Agrobacteirum-stamme pCIB270 eller pCIB271 blir brukt for å transformere callus som
danner seg fra bladskivene (eksempel 34). Callus som danner seg på kanamycin-inneholdende MSBN- utvelgelsesmedium, opprettholdes på et callusvekstmedium bestående av MS hoved-og bisalter og Fe-EDTA (Gibco nr. 500-1117; 4,3 g/l), MS-vitaminer, 100 mg/l myo-inositol, 20 g/l sukrose, 2 mg/l naftaleneddiksyre og 0,3 mg/l kinetin.
Callusen kan bli brukt for å regenerere transgene planter ved å overføre callusdeler til MSBN-medium og følge metodene beskrevet i eksempel 34. Callusen blir også brukt til å måle geninduksjon etter tilføring av induserende kjemikalier og å avskjerme for geninduserende kjemikalier.
EKSEMPEL 36. Transformasjon av gulrot
A<g>robacteirum-stammer CIB270, CJJ3271, CJJ3272, CJJ3273, pCIB-
271 x 15955, pCIB271 x A208, pCB271 x A281, pCffi271 x A4, pCJJ3272 x 15955, pCTJ3272 x A208, pCIB272 x A281, pCIB272 x A4, pCIB273 x 15955, pCffi273 x A208, pCJJ3273 x A281 og pCIB-273 x A4 dyrkes som beskrevet i eksempel 34. Bakteriene, fortynnet til en OD6oo på 0,2-0,4, blir derpå brukt for inokulering av skiver skåret fra overflatesteriliserte gulrøtter.
For å overflatesterilisere gulrøttene, skrelles de og bløtes derpå i 20 min. i en 10 % oppløsning av klorox. Gulrøttene blir renset med sterilt vann, skåret opp i 5 mm deler og plassert med basalsiden opp på vannagar. 20-50 ul bakterier blir så tilført den øvre overflate av skivene. Etter 7 dager overføres skivene til 0,7 % agar inneholdende MS-salter, 3 % sukrose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 ug/ml kanamycin, 100 ug/ml carbenicillin og 100 ug/ml mefoxin. Callus som danner seg rundt kambialringen, skjæres ut og plasseres på 0,7 % MS-agar supplert med 3 % sukrose, 0,1 mg/l 2,4-D, 50 ug/ml kanamycin, 100 ug/ml carbenicillin og 100 ug/ml mefoxin. Etter at callusen er blitt dyrket, skjæres den i små deler og plasseres tilfeldig på fire plater av samme medium. Når denne callus har fylt platen, sprøytes tre av platene med vann, 50 mM natriumsalysilat, pH 5,6, eller 250 ug/l metyl-benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat for å indusere ekspresjonen av det chimeriske PR-la/GUS-gen.
Induksjonseksperimenter og resultater er beskrevet i eksempel 63 og 66.
EKSEMPEL 37. Transformasjon av solsikke
A<g>robacteirum-stammer CJJ3270, CIB271, CJJ3272, CJJ3273, pCB-
271 x 15955, pCJJ3271 x A208, pCIB271 x A281, pCJJ3271 x A4, pCJJ3272 x 15955, pCIB272 x A208, pCJJ3272 x A281, pCIB272 x A4, pCJJ3273 x 15955, pCIB273 x A208, pCJJ3273 x A281 og pCIB-273 x A4 dyrkes som beskrevet i eksempel 34. Bakteriene, fortynnet til en OD600 på 0,2-0,4, blir så brukt for inoku-
lering av stammer av solsikkeplanter fremstilt som følger:
Solsikkefrø bløtes 10 min. i 10 % captan, følgt av 10 min. i 10 % klorox og rensing med sterilt vann. Frøkapslene fjernes og frøene svelles på 0,7 % vannagar i mørke i 3 dager, hvorpå de plasseres i et labline inkubatorsett ved 23 °C med en 12 timers dag og natt. Spirene dyrkes i 1 uke før nedkutting og inokulering av bakteriene i snittet av stengeloverflaten.
Etter 1 uke blir stenglene inokulert med CJJ3270, CJJ3271, CJJ3272 eller CJJ3273, skåret ned og plassert på 0,7 % agar inneholdende MS-salter, 3 % sukrose, 2 mg/ml a-naftaleneddiksyre, 1 mg/ml 6-benzylaminopurin, 100 ug/ml carbenicillin, 100 ug/ml mefoxin og 50 ug/ml kanamycin. Stengler inokulert med pCIB271 x 15955, pCD3271 x A208, pCJB271 x A281, pCIB271 x A4, pCB272 x 15955, pCIB272 x A208, pCIB272 x A281, pCIB272 x A4, pCJJ3273 x 15955, pCJJ3273 x A208, pCIB-273 x A281 og pCIB273 x A4 kappes og plasseres på 0,7 % agar inneholdende MS-salter, 3 % sukrose, 100 ug/ml carbenicillin og 100 Hg/ml mefoxin. Callusen overføres til ferskt medium hver annen uke inntil en passende mengde erholdes for fire plater. Halvdelen av callusen som vokser fra de virulente Agrobacterium-stammer. overføres til medier uten hormoner inneholdende 50 ug/ml kanamycin. Etter at tilstrekkelig callus dyrket i nærvær eller fravær av kanamycin erholdes, blir den behandlet for induksjon, som beskrevet ovenfor for transformert gulrotcallus.
EKSEMPEL 38. Transformasjon av tomat
A<g>robacteirum-stammer CJJ3270, CJJ3271, C1B272, CIB273, pCIB-
271 x 15955, pCJJ3271 x A208, pCJJ3271 x A281, pCIB271 x A4, pCIB272 x 15955, pCJJ3272 x A208, pCB272 x A281, pCB272 x A4, pCJJ3273 x 15955, pCIB273 x A208, pCIB273 x A281 og pCIB-273 x A4 dyrkes som beskrevet i eksempel 34. Bakteriene, fortynnet til en OD600 på 0,2-0,4, blir så brukt for inokulering av stammer av tomatspirer fremstilt som følger: Tomatfrø bløtes i 20 min. i 10 % klorox og renses med sterilt vann. Frøene svelles på 0,7 % vannagar i mørke i 3 dager, hvorpå de plasseres i et labline inkubatorsett ved 23 °C med en 12 timers dag og natt. Spirene dyrkes i 1 uke før nedskjæring og inokulering av bakteriene i den skårede stengeloverflaten.
Etter 1 uke blir stenglene inokulert med CJJ3270, CIB271, CIB272 eller CJJ3273, skåret og plassert på 0,7 % agar inne-
holdende MS-salter, 3 % sukrose, 2 mg/ml a-naftaleneddiksyre, 1 mg/ml 6-benzylaminopurin, 100 ug/ml carbenicillin, 100 ug/ml mefoxin og 50 u,<g>/ml kanamycin. Stengler inokulert med pCJJ3271 x 15955, pCIB271 x A208, pCJJ3271 x A281, pCJJ3271 x A4, pCIB272 x 15955, pCJJ3272 x A208, pCJJ3272 x A281, pCIB-272 x A4, pCB273 x 15955, pCJJ3273 x A208, pCIB273 x A281 og pCJJ3273 x A4 skjæres opp og plasseres på 0,7 % agar inneholdende MS-salter, 3 % sukrose, 100 jig/ml carbenicillin og 100 ug/ml mefoxin. Callusen blir overført til ferskt medium hver annen uke inntil en tilstrekkelig mengde erholdes for fire plater. Halvdelen av callusen som vokser fra de virulente Agrobacterium-stammer, overføres til medier uten hormoner inneholdende 50 ug/ml kanamycin. Etter at tilstrekkelig callus dyrket i nærvær eller fravær av kanamycin erholdes, blir den behandlet for induksjon som beskrevet ovenfor for transformert gulrotcallus.
EKSEMPEL 39. Transformasjon av bomull
Agrobacterium-stammer pCIB271 x 15955, pCJJ3271 x A208, pCIB-271 x A281, pCJJ3271 x A4, pCJJ3272 x 15955, pCJJ3272 x A208, pCJJ3272 x A281, pCJJ3272 x A4, pCJJ3273 x 15955, pCJJ3273 x A208, pCIB273 x A281 og pCIB273 x A4 dyrkes som beskrevet i eksempel 34. Bakteriene, fortynnet til en OD6oo på 0,2-0,4, blir så brukt for inokulering av bomullscotyledoner fremstilt som følger: Bomullsfrøene bløtes i 20 min. i 10 % klorox og renses med sterilt vann. Frøene svelles på 0,7 % vannagar i mørke. Spirene dyrkes i 1 uke før inokulering av bakteriene på cotyledonoverflaten.
De inokulerte cotyledoner blir tillatt å danne callus før de skjæres ned og plasseres på 0,7 % agar inneholdende MS-salter, 3 % sukrose, 100 ug/ml carbenicillin og 100 ug/ml mefoxin. Callusen blir overført til ferskt medium hver tredje uke inntil en tilstrekkelig mengde er erholdt for fire plater. Halvdelen av callusen som vokser fra de virulente A<g>robacterium-stammer. blir overført til medier uten hormoner inneholdende 50 ug/ml kanamycin. Etter at tilstrekkelig callusvekst i nærvær eller fravær av kanamycin blir erholdt, blir den behandlet for induksjon, som beskrevet ovenfor for transformert gulrotcallus.
EKSEMPEL 40. Fremstilling av en spesiell type callus av Zea Mays, elite innavlet linje
Funk 2717
Zea Mays-planter av den innavlede linje Funk 2717 dyrkes til blomstring i veksthus og selvpollineres. Umodne ører inneholdende embryoer, ca. 2-2,5 mm i lengde, fjernes fra plantene og steriliseres i 10 % kloroxoppløsning i 20 min. Embryoer fjernes aseptisk fra kjernene og plasseres på plater med embryoaksen nedad på OMS-medium inneholdende 0,1 mg/l 2,4-D, 6 % (w/v) sukrose og 25 mM L-prolin gjort fast med 0,24 % (w/v) "GelRite"
(initieringsmedium). Etter 2 ukers dyrking i mørke ved 27°C fjernes callusen som utvikler seg på scutellum fra embryoet og plasseres på plater på B5-medium (Gamborg, OL. et al., Experimental Cell Research 50, 151-158 (1968)), inneholdende 0,5 mg/l 2,4-D og gjøres fast med 0,24 % (w/v) "GelRite". Callusen subdyrkes hver annen uke til ferskt medium. Etter totalt 8 uker etter plassering av embryoene på initieringsmediet blir den spesielle type callus identifisert ved sin karakteristiske morfologi. Denne callus subdyrkes videre på samme medium. Etter en ytterligere periode på 2 måneder overføres callusen til og subdyrkes serielt på N6-medium inneholdende 2 mg/l 2,4-D og gjort fast med "GelRite".
EKSEMPEL 41. Fremstilling av en suspensjonskultur av Zea Mays elite innavlet Funk
2717
Callusen beskrevet i eksempel 40 subdyrkes i totalt minst 6 måneder. Den type callus som velges for subdyrking er relativt ikke-mycilaginøs, granulær og meget sprø, slik at den separeres i små individuelle celleaggregater ved plassering i flytende medium. Kulturer inneholdende aggregater med store ekspanderte celler blir ikke beholdt. Cirka 500 mg porsjoner av den spesielle callus av Zea Mays elite innavlet Funk 2717 plasseres i 30 ml N6-medium inneholdende 2 mg/I 2,4-D i 125 ml Delong-flasker. Etter 1 ukes dyrking ved 26°C i mørke på en gyratorisk rister (130 rpm, 2,5 cm utslag) erstattes mediet med ferskt medium. Suspensjonene subdyrkes igjen på denne måte etter ytterligere 1 uke. Ved denne tid inspiseres kulturene, og de som ikke viste store antall ekspanderte celler beholdes. Suspensjonskulturer inneholdende aggregater med store ekspanderte celler kastes. Det foretrukne vev besto av tette cytoplasmiske, delende celleaggregater som hadde en karakteristisk glattere over-
flate enn den vanlige type celleaggregater. Kulturene beholdt hadde minst 50 % av cellene representert i disse små aggregater. Dette er den ønskede morfologi. Disse suspensjoner
hadde også en rask veksthastighet med en fordoblingstid på mindre enn 1 uke. Suspensjonskulturene subklones ukentlig ved å overføre 0,5 ml PCV (pakket cellevolum: nedfelt cellevolum i en pipette) i 25 ml ferskt medium. Etter 4-6 ukers subdyrking på denne måte formerte kulturene seg to til tre ganger pr. ukentlig subdyrking. Kulturene hvori mer enn 75 % av cellene har den ønskede morfologi, beholdes for ytterligere subdyrking. Linjene blir opprettholdt ved alltid å velge ut for subdyrking den flaske hvis innhold oppviste den beste morfologi. Periodisk filtrering gjennom rustfri stålsikter med 630 um porestørrelse hver annen uke blir i enkelte tilfeller brukt for å øke dispersjonen av kulturene, men er ikke nødvendig.
EKSEMPEL 42. Fremstilling av protoplaster fra suspensjonskulturer av Zea Mays
1-1,5 ml PCV av suspensjonskulturcellene fremstilt som i eksempel 41, inkuberes i 10-15 ml av en filtersterilisert blanding bestående av 4 % (w/v) cellulase-RS med 1 % (w/v) Rhozyme i KMC (8,65 g/l KC1,16,47 g/l MgCl2-6 H20 og 12,5 g/l CaCl2-2 H20, 5 g/l MES, pH 5,6) saltoppløsning. Fordøying utføres ved 30°C på et sakte vibrerende bord i en periode på 3-4 timer. Preparatet overvåkes under et invertmikroskop for protoplastrfigivelse. Protoplastene som frigjøres blir samlet opp som følger: Preparatet filtreres gjennom en 100 um maskesikt, fulgt av en 50 um maskesikt. Protoplastene vaskes gjennom sikten med et volum av KMC-saltoppløsning lik det opprinnelige volum av enzymoppløsningen. 10 ml av protoplastpreparatet plasseres i hver av flere engangs plastsentrifugerør og 1,5-2 ml av 0,6 M sukroseoppløsning (bufret til pH 5,6 med 0,1 % (w/v) morfolinoetansulfonsyre (MES og KOH) lagt under. Røret sentrifugeres ved 60-100 x g i 10 min., og protoplastene som danner et bånd ved overgangen, blir samlet opp ved å bruke en pipette og plassert i et ferskt rør. Protoplastpreparatet resuspenderes i 10 ml fersk KMC-saltoppløsning og sentrifugeres i 5 min. ved 60-100 x g. Supernatanten fjernes og kastes, og protoplastene resuspenderes forsiktig i den gjenværende dråpe, og derpå tilsettes gradvis 10 ml av en 13/14-styrke KMC-oppløsning. Etter ny sentrifugering i 5 min. fjernes igjen supernatanten, og protoplastene resuspenderes i en 6/7-styrke KMC-oppløsning. En porsjon fjernes for telling, og protoplastene sedimenteres igjen ved sentri-fugering. Protoplastene resuspenderes ved IO<7 >(10 mill.) pr. ml i KM-8p-medium (tabell I) eller i 0,5 M mannitol inneholdende 6 mM MgCl2 eller et annet egnet medium for bruk i transformasjon, som beskrevet i de følgende eksempler. Denne protoplastsuspensjon blir brukt for transformasjon og dyrkes som beskrevet i eksemplene 43 og 44.
EKSEMPEL 43. Transformasjon av Zea Mays- protoplaster ved elektroporering
A. Alle trinn bortsett fra varmesjokket utføres ved romtemperatur (22-28°C). Protoplastene resuspenderes i siste trinn fra eksempel 42 i 0,5 M mannitol inneholdende 0,1 % (w/v) MES og 6 mM MgCl2. Resistensen av denne suspensjon måles i kammeret av en Dialog elektroporator (DIA-LOG G.m.b.H, D-4000 Dusseldorf 13, Vest-Tyskland) og justeres til 1-1,2 kOhm ved å bruke en 300 mM MgCl2-oppløsning. Protoplastene gis et varmesjokk ved nedsenkning av røret inneholdende prøven i et vannbad ved 45°C i 5 min., fulgt av avkjøling til romtemperatur på is. 4 ug av linearisert plasmid inneholdende et planteselekterbart hygromycinresistensgen, så som beskrevet av Rothstein, S.J. et al., supra. eller chimeriske genkonstrukter, som beskrevet i eksemplene 19-31, og 20 ug av kalvethymus-bærer-DNA tilsettes porsjonene på 0,25 ml av denne suspensjon. 0,125 ml av en 24 % (w/v) polyetylenglykol (PEG)-oppløsning (MW 8000) i 0,5 M mannitol, inneholdende 30 mM MgCl2, tilsettes proto-plastene. Blandingen blandes godt, men forsiktig, og inku-
beres i 10 min. Prøven overføres til kammeret av elektroporatoren, og prøvene pulseres tre ganger ved 3 sekunders intervaller ved opprinnelige spenninger på 1500, 1800, 2300 eller 2800 Vcm-1 og en eksponentiell nedbrytningstid på 10 usek.
Protoplastene dyrkes som følger. Prøvene plasseres på plater i 6 cm petriskåler ved romtemperatur. Etter ytterligere 5-15 min. tilsettes 3 ml av KM-8p-medium (tabell L, supra) inneholdende 1,2 % (w/v) "SeaPlaque" agarose og 1 mg/ml 2,4-D. Agarosen og protoplastene blandes godt, og mediet tillates å stivne.
B. Eksempel 43 A gjentas med én eller flere av de følgende modifikasjoner.
(1) Motstanden av protoplastpreparatet justeres til 0,5-0,7 kOhm.
(2) Det PEG som blir brukt er PEG med en molekylvekt på 4000.
(3) Intet PEG tilsettes, eller en halvdel av volumet av 12 % (w/v) PEG tilsettes.
(4) Pulsene tilføres ved intervaller på 3 sek.
(5) Protoplastene plasseres på plater etter elektroporeringen i skåler plassert på en plate, avkjølt til en temperatur på 16°C. (6) Protoplastene plasseres i rør etter elektroporermgstrinnet, vaskes med 10 ml 6/7-styrke KMC-oppløsning eller med W5-oppløsning (bestående av 380 mg/l KC1, 18,375 g/l CaCl2.2H20, 9 g/l NaCl; 9 g/l glukose, pH 6,0), samles derpå opp ved sentrifugering ved 60 g i 10 min., resuspenderes i 0,3 ml KM-medium og plasseres på plater som i A
(7) Kalvethymus-bærer-DNA tilsettes ikke.
EKSEMPEL 44. Transformasjon av Zea Mays- protoplaster ved behandling med
polyetylenglykol ( PEG )
A. Protoplastene resuspenderes ved siste trinn i eksempel 42 i en 0,5 M mannitoloppløsning inneholdende 12-30 mM MgCk. Et varmesjokk på 45°C i 5 min. tilføres som beskrevet i eksempel 43. Protoplastene fordeles i porsjoner for trans-formasjon i sentrifugerar, 0,3 ml protoplaster suspendert pr. rør. I løpet av de neste 10 min. tilsettes det følgende: DNA (som for eksempel 43) og polyetylenglykol (PEG)-oppløsning (MW 6000,40 % (w/v), inneholdende 0,1M Ca(N03)2 og 0,4 M mannitol, pH 8-9 med KOH) for å gi en endelig konsentrasjon på 20 % PEG. Porsjonene inkuberes i 30 min. med tidvis forsiktig risting, og derpå plasseres protoplastene i petriskåler (0,3 ml protoplastsuspensjon pr. 6 cm skål-diameter) og dyrkes som beskrevet i eksempel 43.
B. Eksempel 44 A gjentas, og protoplastene vaskes etter 30 minutters inkubering i PEG-oppløsningen fra eksempel 44 A ved å tilsette 0,3 ml W5-oppløsning fem ganger ved 2-3 min. intervaller. Protoplastsuspensjonen sentrifugeres, supernatanten fjernes, og protoplastene dyrkes som i eksempel 43 A. C. Eksemplene 44 A og 44 B gjentas med den modifikasjon at den endelige konsentrasjon av PEG er mellom 13 og 25 % (w/v).
EKSEMPEL 45. Regenerering av callus fra protoplaster
Platene inneholdende protoplastene i agarose plasseres i mørke ved 26°C. Etter 14 dager oppstår kolonier fra protoplastene. Agarosen inneholdende koloniene overføres til overflaten av en 9 cm i diameter petriskål, inneholdende 30 ml N6-medium (tabell I, supra). inneholdende 2 mg/l 2,4-D, gjort fast med 0,24 % w/v "Geinte". Dette medium refereres til som 2N6, Callusen dyrkes videre i mørke ved 26°C, og callusdeler subdyrkes hver annen uke i ferskt, fast 2N6-medium.
EKSEMPEL 46. Utvelgelse av transformert callus fra Zea Mays
Eksempel 45 blir gjentatt med den modifikasjon at 100 mg/l eller 200 mg/l hygromycin B tilsettes 2N6-mediet for å velge ut for transformerte celler.
EKSEMPEL 47. Regenerering av kornplanter
A. Callus plasseres på 2N6-medium for opprettholdelse og på ON6- (bestående av N6-medium uten 2,4-D) og N61-medium (bestående av N6-medium inneholdende 0,25 mg/l 2,4-D og 10 mg/l kinetin) for å begynne regenerering. Callus som vokser på ON6- og N61-medium, dyrkes i lys (16 timer/dag lys på 10-100 uEinstein/m<2>sek. fra hvite fluorescente lamper). Callus som vokser på N61 -medium, overføres til ON6-medium etter 2 uker, idet lengre tid på N61 -medium er skadelig. Callusen subdyrkes hver andre uke, selv om callusen igjen skal overføres til samme mediumsammensetning. Småplanter opptrer etter ca. 4-8 uker. Når småplantene er minst 2 cm høye, overføres de til ON6-medium i GA7-beholdere. Røtter danner seg etter 2-4 uker, og når røttene synes veldannede nok til å understøtte vekst, blir småplantene overført til jord i torvpotter under en lysavskygning for de første 4-7 dager. Det kan ofte hjelpe å snu en klar plastkopp over transplantene i 2-3 dager for å medhjelpe avherding. Når plantene er etablert, blir de behandlet som normale kornplanter og dyrket til voksne planter i veksthus. For å erholde avkom, blir plantene selvpollinert eller krysset med villtype.
B. Eksempel 47 A gjentas med den modifikasjon at 100 mg/l eller 200 mg/l hygromycin B tilsettes mediet brukt for å opprettholde callusen.
EKSEMPEL 48. Fremstilling av embryogene suspensjoner fra vev av Dactylis glomerata L.
( hagegress)
A. Embryogene callus oppstartes fra basaldeler av de yngste blader fra veksthusdyrkede hagegressplanter ( Dactylis glomerata L.). som beskrevet av Flanning, G.E. et al., Theor. Appl. Genet., 63, 155-159 (1982). Bladene overflatesteriliseres ved neddykking i en 1:10-fortynning av kloroxoppløsning (5,25 % (w/v) natriumhypokloritt, The Chlorox Company, Oakland, Ca.) i ca. 10 min. og skjæres derpå aseptisk i små segmenter på 1-5 mm i lengde eller i diameter. Disse segmenter plantes på sterilt SH-30-medium inneholdende 0,8 % (w/v) agarose som geldannende middel. Callus og/eller embryogene strukturer opptrer innen 2-6 uker etter plating ved dyrking ved ca. 25°C. Embryogene callus opprettholdes ved subdyrking på ferskt SH-30-medium hver 2.-4. uke og dyrking i mørke ved 25°C.
B. Embryogene suspensjonskulturer oppstartes ved å plassere ca. 0,5 g ferskvekt av embryogen callus i 50 ml flytende medium, som beskrevet av Gray, D.J. et al., Plant Cell Tissue Organ Cult., 4, 123-133 (1985), inneholdende 45 uM dicamba og 4 g/l kaseinhydrolysat. Suspensjonskulturene dyrkes ved 27°C under 16 timers lys (40 uE/m<2>sek.) og 8 timers mørkefotoperiode på en gyratorisk rister ved ca. 130 rpm i 125 ml Delong-flasker, forseglet med en metallkapsel og "Parafilm". Etter ca. 4 uker tillates de store klumpene å nedfelles i ca. 30 sek., og 10 ml porsjoner av supematantmediet inneholdende små celleaggregater, fjernes og overføres til 50 ml ferskt medium. Denne prosessen gjentas hver 3.-4. uke ved å bruke de mest fremgangsrike kulturer slik de er vurdert ved mindre aggregatstørrelse og bedre kvalitet, basert på tilstedeværelsen av små cytoplasmiske celler. Etter 5-8 overføringer er suspensjonene i hovedsak fri for ikke-embryogene celler, og hoveddelen av de embryogene celleaggregater er ganske små (150-2000 um).
EKSEMPEL 49. Isolering og opprensing av Dactylis glomerata L.- protoplaster
Protoplaster fremstilles fra embryogene suspensjonskulturer fra eksempel 48 ved aseptisk filtrering av cellene på en "Nalgene" 0,2 um filterenhet og derpå tilsette 0,5 g fersk-vektceller til hver 12,5 ml av protoplastenzymblanding i en petriskål. Enzymblandingen består av 2 % (w/v) Cellulase RS, 7 mM CaCl2 x H20, 0,7 mM NaH2P04 x H20, 3 mM MES (pH 5,6), glukose (550 mOs/kg H20 av pH 5,6) og filtersteriliseres. Blandingen omristes på en orbitalrister ved ca. 50 rpm i svakt (< 5uE/m<2>sek.) lys i ca. 4-5 timer. Fordøyingen blir derpå siktet gjennom en sikt av rustfritt stål (100 um åpningsstørrelse) og fordeles i 12 ml sentrifugerør som blir sentrifugert ved ca. 60-100 g i ca. 5 min. Det protoplastinneholdende sediment blir så vasket tre ganger med protoplastkulturmedium KM-8p justert til 550 mOs/kg H20 med glukose. Ved dette punkt kan et flotasjonstrinn innføres for ytterligere rensing av protoplastene. I dette tilfelle blir de vaskede protoplaster lagt i et lag på toppen av 10 ml KM-8p-kulturmedium justert til 700 mOs/kg H20 med sukrose. Etter sentrifugering ved 60-100 x g i ca. 10 min. blir protoplastene, som samler seg i et bånd ved skillet, samlet opp ved å bruke en fin pipette. Endelig resuspenderes proto-plastene i 1-2 ml KM-8p-kulturmedium og siktes gjennom en rustfri stålskjerm (20 um åpningsstørrelse). De frigjorte protoplaster samles opp og vaskes og resuspenderes i KM-8p-kulturmedium for dyrking eller i osmotisk justert medium som er egnet for transformasjon i henhold til eksemplene 51-53.
EKSEMPEL 50. Dactylis <g>lomerata L.- protoplastlcultur og vekst av callus
A. De rensede protoplaster blir plassert på plater ved en tetthet på ca. 5 x 10<5> protoplaster pr. ml i KM-8p-kulturmedium inneholdende 1,3 % (w/v) "Seaplaque" agarose (FMC Corp., Marine Colloids Division, Rockland, Maine, USA) og 30-40 % (w/v) av kondisjonert medium (erholdt fra 3-4 uker gammel Dactylis glomerata L. embryogen suspensjonskultur ved å filtrere mediet gjennom et sterilt "Nalgene" 0,2 um filter og gjøre mediet 550 mOsm/kg H20 ved tilsetning av glukose og ny filtersterilisering). Platene blir så plassert i mørke ved en konstant temperatur på 28°C. Etter 10-14 dager skjæres agarosen i kiler og plasseres i
"kulekultur", som beskrevet av Shillito, R.D. et al., Plant Cell Reports, 2,244-247 (1983) ved å bruke 20 ml SH-45-suspensjonskulturmedium med 3 % (w/v) sukrose pr. 3 ml opprinnelig agaroseinneholdende kultur. Platene plasseres på en plattformrister og ristes ved ca. 50 rpm i lys ved 8 uE/m<2>sek. Nye suspensjonskulturer dannes idet kulturene vokser ut av agarosen og frigjør celler i det flytende medium. De resulterende suspensjonsdyrkede celler plasseres på plater på agarstivnet SH-30-medium og plasseres i mørke ved 25°C inntil callus blir dannet.
B. protoplaster blir dyrket som beskrevet i eksempel 50 A ovenfor, bortsett fra at kulturmediet ikke inneholder kondisjonert medium.
EKSEMPEL 51. Transformasjon av Dactylis glomerata L.- protoplaster ved hjelp av
elektroporasjon
A Umiddelbart etter opprensing av protoplastene utføres elektroporasjon i henhold til Shillito, R.D. et al., Bio/Technology 3,1099-1103 (1985) ved å bruke linearisert plasmid som beskrevet i eksempel 20. Protoplastene resuspenderes etter siste vask ved en tetthet på ca. 7 x IO<6> proto-
plaster pr. ml i elektroporasjonsbufleren (0,4 M mannitol, 6 mMMgCl2). Protoplastene plasseres i 0,7 ml porsjoner i 10 ml plastsentrifugerør. Plasmid-DNA fra eksempel 20 og lydbehandlet kalvethymus-DNA (Sigma) tilsettes for å gi en endelig konsentrasjon på hhv. 10 Hg/ml og 50 ug/ml i rørene. Derpå blir 0,38 ml polyetylenglykol (PEG)-oppløsning [24 %
(w/v) PEG 6000 i 0,4 M mannitol, 30 mM MgCl2, 0,1 % (w/v) MES (pH 5,6)] tilsatt, og oppløsningen blir forsiktig blandet. Protoplastsuspensjonen overføres til kammeret av en "Dialog" elektroporator og 10 pulser på 3250 V/cm opprinnelig spenning og eksponentiell nedbrytningskonstant på 10 usek., tilført ved 30 sekunders intervaller. Prøven fjernes fra kammeret og plasseres i en petriskål med 10 cm i diameter. 10 ml KM-8p-medium inne-holdende 1,2 % (w/v) "SeaPlaque" agarose tilsettes, protoplastene fordeles jevnt gjennom mediet, og agarosen tillates å stivne.
B. Eksempel 51 A gjentas, bortsett fra at den opprinnelige spenning som er brukt er 3500 V/cm, 4000 V/cm, 5000 V/cm, 3000 V/cm eller 2500 V/cm. C. Eksempel 51 A og B blir gjentatt, bortsett fra at det blir brukt PEG med MW 4000 eller PEG med MW 8000. D. Eksempel 51 A-C blir gjentatt, bortsett fra at den endelige PEG-konsentrasjon er mellom 10 % og 30 % (w/v).
EKSEMPEL 52. Transformasjon av Dactylis glomerata L.- proto- plaster ved behandling
med polyetylenglykol ( PEG)
A PEG-mediert direkte genoverføring utføres i henhold til Negrutiu, I. et al., supra. Det anvendte DNA er linearisert plasmid beskrevet i eksempel 20.
Protoplastene suspenderes etter siste vask i 0,5 M mannitol inneholdende 15 mM MgCl2 ved en tetthet på ca. 2 x IO<6> pr. ml. Protoplastsuspensjonen fordeles som 1 ml porsjoner i 10 ml plastsentrifugerør. DNA blir tilsatt som beskrevet i eksempel 51 ovenfor, og derpå tilsettes 0,5 ml av PEG-oppløsningen (40 % (w/v) PEG 4000 i 0,4 M mannitol, 0,1 M Ca(N03)2, pH 7,0). Oppløsningene blir blandet forsiktig og inkubert i 30 min. ved romtemperatur (ca. 24°C) i 30 min. med tidvis risting. 1,4 ml av vaskeoppløsningen blir derpå tilsatt og innholdet av røret forsiktig blandet. Vaskeoppløsningen består av 87 mM mannitol, 115 mM CaCl2, 27 mM MgCl2, 39 mM KC1, 7 mM tris-HCl og 1,7 g/l myo-inositol, pH 9,0. Fire ytterligere 1,4 ml porsjoner av vaskeoppløsning tilsettes ved 4 minutters intervaller under blanding etter hver tilsetning. Røret blir derpå sentrifugert ved 60 x g i omkring 10 min. og supernatanten kastet. De sedimenterte protoplaster blir tatt opp i 1 ml KM-8p-kulturmedium og plassert i en 10 cm petriskål. 10 ml av KM-8p-mediet inneholdende 1,2 % (w/v) "SeaPlaque" agarose tilsettes. Protoplastene blir jevnt fordelt gjennom mediet, og agarosen tillates å stivne.
B. Eksempel 52 A ble gjentatt med én eller flere av de følgende modifikasjoner:
(1) pH av vaskeoppløsningen justeres til 5,6 eller 7,0.
(2) Det anvendte PEG er PEG av MW 6000, PEG av MW 2000 eller PEG av MW 8000. (3) Vaskemediet består av 154 mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KC1, 5 mM glukose, pH til 6,0 med KOH, av 0,2 M CaCl2,0,1 % (w/v) MES, pH 6,0 med KOH, eller av 0,2 M CaCl2,
7 mM tris/HCl, pH 9,0 med KOH.
EKSEMPEL 53. Transformasjon av Dactylis glomerata L.- proto- plaster ved
elektroporering eller PEG- behandling
Transformasjon utføres som beskrevet i eksempel 51 eller 52, bortsett fra at protoplastene behandles ved 45°C i ca. 5 min. før fordeling av porsjonene i rør for transformasjon, eller etter fordeling av porsjonene og før tilsetning av PEG.
EKSEMPEL 54. Utvelgelse av transformerte kolonier
A. Dyrkingsplatene (petriskålene) inneholdende protoplastene fra eksemplene 51-53, inkuberes i 10 dager i mørke ved ca. 25°C og skjæres derpå i fem like store skiver for "kulekulturer" (Shillito, R.D. et al., Plant Cell Reports, 2, 244-247 (1983)). Fire av skivene plasseres hver i 20 ml SH-45-kulturmedium med 4 g/l kaseinhydrolysat og 20 ug/ml hygromycin B. Den femte skiven plasseres i 20 ml av samme medium, men uten hygromycin B som en ikke-selektert kontroll. Etter 4-5 uker blir de antatt transformerte proto-plasta-vledede cellekolonier som vokser i hygromycin B, skåret ut av agarosen og plassert i en 19 mm petriskål med 2 ml flytende SH-45-medium inneholdende 20 ug/ml hygromycin B, som ristes ved ca. 50 rpm på orbitalrister. Etter ytterligere 4-5 uker blir alle kolonier som vokser for å danne nye suspensjoner, overført i 125 ml Erlenmeyer-flasker og dyrkes på lignende måte som den opprinnelige suspensjonskultur, bortsett fra at 20 ug/ml hygromycin B er innbefattet i mediet.
De nye suspensjoner subdyrkes hver 1.-3. uke ved å bruke SH-45-medium inneholdende 4 g/l kaseinhydrolysat og 20 ug/ml hygromycin B. Celler fra disse suspensjoner blir også plassert på plater på stivnet SH-30-medium inneholdende 20 ug/ml hygromycin B og inkubert ved ca. 25°C i mørke. Calli dyrket fra de plateutlagte celler subdyrkes hver annen uke på ferskt medium. Cellene som vokser i nærvær av hygromycin B, er antatt å være transformanter.
B. Utvelgelse utføres som beskrevet i eksempel 54 A, bortsett fra at de protoplastavledede cellekolonier som vokser i hygromycin B-inneholdende medium, plasseres på agarplater av SH-30-medium, inneholdende 20 ug/ml hygromycin B, og inkuberes ved ca. 25 °C i mørke.
EKSEMPEL 5 5. Regenerering av transformerte Dactylis glomerata L.- planter
A. Dactylis glomerata L.-callus (erholdt som beskrevet i eksempel 54) avledet fra protoplaster, blir dyrket på fast SH-30-medium og subdyrket hver annen uke. Ethvert embryo som danner seg, blir fjernet og sådd ut på plater på frødannelsesmedium (SH-0) og plassert i lys (45-55 uE/m<2>sek.). Frø-
dannelse av disse embryoer inntreffer etter 1-4 uker, og de resulterende småplanter blir plassert på SH-O-medium i lys for å danne rotsystemer. De blir flyttet til veksthus ved 6.-12. løvstadium og herdes av gradvis.
B. Callus (erholdt som beskrevet i eksempel 54) avledet fra protoplaster, dyrkes på SH-O-medium stivnet med 0,24 % (w/v) "Gelrite" i lys (45-55 uE/m2sek.) og subdyrkes hver annen uke. De resulterende småplanter plasseres på en 1:1-blanding av SH-0- og OMS-medium stivnet med en kombinasjon av 0,12 % (w/v) "Gelrite" og 0,4 % (w/v) agar i lys for å danne rotsystemer. De blir flyttet til veksthus ved 6.-12. løvstadium og herdes av gradvis. C. Små planter erholdes som beskrevet i 44 A og 44 B ovenfor og plasseres på OMS-medium stivnet med 0,8 % (w/v) agar i lys for å danne rotsystemer. De blir flyttet til veksthus ved 6.-12. løvstadium og herdes av gradvis. D. Små planter erholdes som beskrevet i 44 A ovenfor og plasseres på en 1:1-blanding av SH-0- og OMS-medium stivnet med en kombinasjon av 0,12 % (w/v) "Gelrite" og 0,4 %
(w/v) agar i lys for å danne rotsystemer. De blir flyttet til veksthus ved 6.-12. løvstadium og herdes av gradvis.
6. TRANSIENT GENEKSPRESJON
De følgende eksempler beskriver hvorledes de chimeriske gener kan innføres og anvendes uten at genet nødvendigvis er stabilt inkorporert i genomet av planten.
EKSEMPEL 56. Innføring av DNA i protoplaster av N. tabaccum ved behandling med PEG
A. Fremstilling av protoplaster av N. tabaccum kan utføres i henhold til metodene beskrevet i følgende publikasjoner: Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3, 2717 (1984); GB patentansøkning 2.159.173, Europeisk patentansøkning EP 0.129.668; Shillito, RD. ogPotrykus, I, i: Methods in Enzymology, red. Wu, R og Grossman, L., Academic Press, Orlando, Florida, vol. 153, 313-306 (1987), eller ved andre metoder kjent i faget. Disse publikasjoner er innbefattet pr. referanse.
B. DNA innføres i protoplaster med en modifikasjon av metoden til Negrutiu, I. et al., Plant Mol. Biol. 8,363 (1987). Protoplastene fremstilt som beskrevet i eksempel 56 A, resuspenderes etter siste vasketrinn i en oppløsning bestående av 0,4 M mannitol, 15-30 mM CaCl2,0,1 % w/v MES ved en tetthet på 1,6-2 x IO<6> pr. ml. Protoplastsuspensjonen fordeles som 0,5 ml porsjoner i 10 ml plastsentrifugerør. DNA fra eksemplene 19-31 tilsettes i 10 ul sterilt, destillert vann, sterilisert som beskrevet av Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3, 2717
(1984), og derpå blir 0,5 ml av PEG-oppløsningen (40 % (w/v) PEG MW 8000 i 0,4 M mannitol, 0,1 M Ca(N03)2, pH 7,0) tilsatt. Oppløsningene blir blandet forsiktig og inkubert i 30 min. ved romtemperatur (ca. 24°C) under tidvis risting. 1 ml av vaskeoppløsningen blir så tilsatt og innholdet av røret forsiktig blandet. Vaskeoppløsningen består av 154 mM NaCl,
125 mM CaCl2, 5 mM KC1, 5 mM glukose, pH 6,0 med KOH. Ytterligere porsjoner på 2 ml, 3 ml og 4 ml av vaskeoppløsning blir tilsatt trinnvis ved 5 minutters intervaller med blanding etter hver tilsetning. Røret blir så sentrifugert ved ca. 10-100 x g i ca. 10 min., og supernatanten blir kastet. De pelleterte protoplaster blir tatt opp i tilstrekkelig K3-dyrkingsmedium, med 0,3 M glukose som osmotikum og uten sukrose, til å oppnå en endelig tetthet på 100.000 pr. ml og dyrket i en 10 cm petriskål.
C. Eksempel 56 B blir gjentatt med én eller flere av de følgende modifikasjoner:
(1) pH av vaskeoppløsningen justeres til 5,6 eller 7,0.
(2) Det anvendte PEG er PEG med en molekylvekt på 4000.
(3) Vaskemediet består av 0,2 M CaCl2, 0,1 % w/v MES, pH 6,0 med KOH, eller av 0,2 M CaCl2, 7 mM tris/HCl, pH 9,0 med KOH. (4) 50 ug av oppkuttet kalvethymus-DNA i 25 ul sterilt vann tilsettes sammen med plasmid-DNA (5) Plasmid-DNA lineariseres før bruk ved behandling med et passende restriksjonsenzym (f.eks. BamHI).
EKSEMPEL 57. Innføring av DNA i protoplaster av N. tabaccum ved elektroporering
A. Innføring av DNA i protoplaster av N. tabaccum utføres ved å behandle protoplastene med en elektrisk puls i nærvær av det passende DNA i en modifikasjon av metodene til Fromm, M.E., i: Methods in Enzymology, red. Wu, R. og Grossman, L., Academic Press, Orlando, Florida, vol. 153, 307 (1987) og Shillito, R.D. og Potrykus, I, ibid., s. 283-306.
Protoplaster isoleres som beskrevet i eksempel 56 A. Protoplastene resuspenderes etter siste vask i følgende oppløsning: 0,2 M mannitol, 0,1 % w/v MES/72 mM NaCl, 70 mM CaCl2, 2,5 mM KC1, 2,5 mM glukose, pH til 5,8 med KOH, ved en tett-het på 1,6-2 x 10<6> pr. ml. Protoplastsuspensjonen fordeles som 1 ml porsjoner i engangs plastkyvetter, og 10 u,g DNA tilsettes som beskrevet i eksempel 56 B og C. Mot-standen til oppløsningen ved dette punkt, når den måles mellom elektrodene av 471-elektrodesettet av elektroporeringsapparaturen beskrevet nedenfor, er i området 6 ohm.
DNA fra eksemplene 19-31 tilsettes i 10 ul sterilt, destillert vann, sterilisert som beskrevet av Paszkowski, J. et al., EMBO J. 3, 2717 (1984). Oppløsningen blandes forsiktig og
underkastes derpå ved romtemperatur (24-28°C) en puls på 400 V/cm med en eksponentiell nedbrytningskonstant på 10 ms fra en BTX-transfektor 300 elektroporeringsapparatur ved å bruke 471-elektrodesammensetningen. Protoplastene holdes uforstyrret i 5 min. og plasseres derpå i en petriskål, og K3-medium, som beskrevet i eksempel 56 A, tilsettes for å bringe tettheten av protoplastene til 100.000 pr. ml.
B. Eksempel 57 A gjentas med én eller flere av de følgende modifikasjoner:
(1) Den anvendte spenning er 200 V/cm eller mellom 100 V/cm og 800 V/cm.
(2) Den eksponentielle nedbrytningskonstant er 5 ms, 15 ms eller 20 ms.
(3) 50 |ig av oppkuttet kalvethymus-DNA i 25 ul sterilt vann tilsettes sammen med plasmid-DNA. (4) Plasmid-DNA lineariseres før bruk ved behandling med et passende restriksjonsenzym (f.eks. BamHI).
EKSEMPEL 58. Innføring av DNA i protoplaster av Zea Mavs linje 2717
Protoplaster av mais, innavlet linje Funk 2717, fremstilles som beskrevet i eksemplene 40-47 ovenfor og resuspenderes i hver av de beskrevne oppløsninger for resuspensjon av N. tabaccum-protoplastene i eksemplene 56 og 57 ovenfor, ved en tetthet på IO<7> pr. ml. Transformasjon utføres i hovedsak som beskrevet i eksemplene 56 og 57. Protoplastene dyrkes etter transformasjon ved en tetthet på 2 x IO<6> pr. ml i KM-8p-medium uten stivningsmiddel tilsatt og inneholdende 1 mg/ml 2,4-D.
EKSEMPEL 59. Innføring av DNA i protoplaster av Sorghum bicolor
Protoplaster av sorghumsuspensjon FS 562 fremstilles i hovedsak som beskrevet for Zea Mays i eksempel 40 ovenfor og resuspenderes i hver av de beskrevne oppløsninger for resuspensjon av N. tabaccum-protoplaster i eksemplene 56 og 57 ovenfor, ved en tetthet på IO<7 >pr. ml. Transformasjon utføres i hovedsak som beskrevet i eksempel 58. Protoplastene dyrkes etter transformasjon ved en tetthet på 2 x IO<6> pr. ml i KM-8p-medium uten tilsatt stivningsmiddel.
EKSEMPEL 60. Innføring av DNA i protoplaster av Nicotiana plumbaginifolia. Petunia
hvbrida og Lolium multiflorum
Protoplaster av N. plumbaginifolia. P. hvbrida eller L. multiflorum fremstilles som beskrevet i Shillito og Potrykus, supra. og behandles som beskrevet i eksemplene 56 og 57. De dyrkes i mediet beskrevet av Shillito og Potrykus, supra. uten tilsetning av agarose eller noe annet gel-dannende middel.
EKSEMPEL 61. Innføring av DNA i protoplaster av Glycine max
Protoplaster av Glycine max fremstilles ved metodene som beskrevet av Tricoli, D.M. et al., Plant Cell Reports 5,334-337 (1986), eller Chowhury, V.K. og Widholm, LM., Plant Cell Reports 4, 289-292 (1985), eller Klein, AS. et al., Planta 152,105-114 (1981). DNA innføres i disse tre proto-
plaster i hovedsak som beskrevet i eksemplene 56 og 57. Protoplastene dyrkes som beskrevet i Klein, AS. et al., supra. Chowhury, V.K. og Widholm, J.M., supra. eller Tricoli, D.M. et al., supra. uten tilsetning av alginat for å stivne mediet.
7. KJEMISK REGULERING AV TRANSGENT PLANTEVEV
De følgende eksempler beskriver fremgangsmåter for kjemisk regulering av kjemisk regulerbare gener i representative transgene plantevev. Selv om de følgende eksempler er rettet mot induksjon, ville en lignende fremgangsmåte være anvendelig for systemer som virker ved represjon.
En mengde teknikker er tilgjengelige for behandling av transgene celler med en kjemisk regulator. For eksempel kan celler bli suspendert i flytende medium inneholdende regulatoren. Callus kan bli dyrket på eller overført til medium inneholdende regulatoren, eller regulatoren kan tilføres callus med en steril malingbørste eller plantespray. Like-
ledes blir planter eller deler av planter behandlet med en oppløsning eller en suspensjon av regulatoren med malerkost eller fortrinnsvis en plantesprøyte.
Ekspresjon av det fenotypiske trekk i transgene planter inneholdende et kjemisk regulerbart, chimerisk gen, er proporsjonal med mengden av regulatoren som tilføres planten eller plantevevet.
EKSEMPEL 62. Kjemisk induksjon i transgene calluskulturer
A. Callus erholdt i henhold til tidligere beskrevne frem-
gangsmåter, undersøkes for kjemisk induksjon ved å tilføre med en steril malerkost eller plantesprøyte en filtersterilisert oppløsning av 0,1-50 mM salisylsyre, som er blitt justert til en pH mellom 6,0 og 8,0 ved tilsetning av NaOH.
Etter induksjon tillates callusen å inkubere i 2 døgn og blir derpå innhøstet, frosset i flytende nitrogen og lagret ved -^80°C inntil den skal undersøkes for geninduksjon, som beskrevet i eksempel 65 og/eller eksempel 66.
B. Alternativt blir de følgende oppløsninger brukt for induksjon:
(1) 0,1-50 mM benzosyre som er blit tjustert til en pH mellom 6,0 og 8,0 ved tilsetning av NaOH. (2) 0,1-50 mM polyakrylsyre som er blitt justert til en pH mellom 6,0 og 8,0 ved tilsetning av NaOH. (3) Metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat. Oppløsningen fremstilles ved å resuspendere et fuktbart pulver inneholdende kjemikaliet i sterilt vann i flere minutter ved en konsentrasjon på 1 mg/ml. Uløselig faststoff fjernes fra oppløsningen ved filtersterilisering. (4) 0,1-50 mM benzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, pH mellom 6,0 og 8,0. Forbindelsen oppløses i et minimum av dimetylsulfoksyd (DMSO) og fortynnes derpå med sterilt vann til den ønskede konsentrasjon. Den erholdte suspensjon tilføres uten filtrering.
(5) 0,1-50 mM n-propylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, fremstilt som i (4).
(6) 0,1-50 mM benzylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, fremstilt som i (4).
(7) 0,1-50 mM benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre-N-sek-butylhydrazid, fremstilt som i (4).
(8) 0,1-50 mM 2,6-diklorisonikotinsyre, pH mellom 6,0 og 8,0, fremstilt som i (4).
(9) 0,1-50 mM metyl-2,6-diklorisonikotinat, fremstilt som i (4).
EKSEMPEL 63. Kjemisk induksjon i transgene planter
A. Genekspresjon induseres i planter erholdt i henhold til ovenfor beskrevne fremgangsmåter ved å tilføre en fin dusj av en oppløsning av 0,1-50 mM salisylsyre, som er blitt justert til en pH mellom 6,0 og 8,0 med NaOH, til bladene ved å bruke en plantesprøyte.
Plantene tillates å fortsette å vokse i 2 dager og innhøstes derpå, blir frosset i flytende nitrogen og lagret ved +80°C inntil de undersøkes som beskrevet i eksempel 65 og/eller eksempel 66.
B. Alternativt blir de følgende oppløsninger brukt for induksjon:
(1) 0,1-50 mM benzosyre som er blitt justert til en pH mellom 6,0 og 8,0 ved tilsetning av NaOH. (2) 0,1 -50 mM polyakrylsyre som er blitt justert til en pH mellom 6,0 og 8,0 ved tilsetning av NaOH. (3) Metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat. Oppløsningen fremstilles ved å resuspendere et fuktbart pulver inneholdende forbindelsen i sterilt vann i flere minutter ved en konsentrasjon på 1 mg/ml. Uløselig faststoff fjernes fra oppløsningen ved filtersterilisering. (4) 0,1-50 mM benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, pH mellom 6,0 og 8,0. Forbindelsen oppløses i et minimum av dimetylsulfoksyd (DMSO) og fortynnes med sterilt vann til den ønskede konsentrasjon. Den erholdte suspensjon tilføres uten filtrering.
(5) 0,1-50 mM n-propylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, fremstilt som i (4).
(6) 0,1-50 mM benzylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, fremstilt som i (4).
(7) 0,1-50 mM benzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre-N-sek-butylhydrazid, fremstilt som i (4).
(8) 0,1-50 mM 2,6-diklorisonikotinsyre, pH mellom 6,0 og 8,0, fremstilt som i (4).
(9) 0,1-50 mM metyl-2,6-diklorisonikotinat, fremstilt som i (4).
EKSEMPEL 64. Induksjon av ekspresjon av det innførte DNA i protoplaster av N.
tabaccum. Zea Mays. N plumbaginifolia. P. hvbrida. L. multiflorum og Sorghum bicolor
Protoplastene behandlet som beskrevet i eksemplene 56-61 ovenfor, dyrkes ved 26°C i mørke i 2 dager. Etter denne tid tilsettes salisylsyre til en konsentrasjon på mellom 0,1 og 50 mM som en nøytralisert oppløsning, pH mellom 6,0 og 8,0. Protoplastene dyrkes i ytterligere 2 dager, innhøstes ved sentrifugering, blir hurtig nedfrosset og undersøkt som beskrevet i de følgende eksempler.
B. Alternativt blir nøytraliserte oppløsninger eller sus-
pensjoner av de følgende forbindelser tilsatt protoplastene for å gi en endelig konsentrasjon på mellom 0,1 og 50 mM:
(1) benzosyre
(2) polyakrylsyre
(3) metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat
(4) benzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre
(5) n-propylbenzo-1,2,3-tiadiazol-7-karboksylat
(6) benzylbenzo-1,2,3 -tiadiazol-7-karboksylat
(7) benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre-N-sek-butyl-hydrazid
(8) 2,6-diklorisonikotinsyre
(9) metyl-2,6-diklorisonikotinat.
C. Alternativt utføres induksjon som beskrevet i eksempel 64 A og B, bortsett fra at protoplastene dyrkes i 1 dag, 3 dager eller 5 dager før induksjon. D. Induksjon utføres som beskrevet i eksempel 64 A, B eller C, bortsett fra at protoplastene dyrkes i 1 dag, 3 dager eller 5 dager etter induksjon og før innhøsting.
EKSEMPEL 65. Undersøkelse for kjemisk induserbar DNA- sekvens: mRNA-dannelse
Plantemateriale indusert og høstet som i eksemplene 62-64, undersøkes for induksjonen av mRNA-typer ved isolasjon av RNA og primer-forlengelsesassay, som beskrevet i eksempel 5.
Callus eller regenerert plantemateriale avledet fra transgene planter inneholdende kjemisk regulerbare, chimeriske gener som koder for GUS, AHAS eller BT, og indusert av salisylsyre, metylbenzo-l,2,3-benzotiadiazol-7-karboksylat, benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre, n-propylbenzo-1,2,3 -tiadiazol-7-karboksylat, benzylbenzo-1,2,3 -tiadiazol-7-karboksylat, benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylsyre-N-sek-butylhydrazid, 2,6-diWorisoriikotinsyre, metyl-2,6-diklorisonikotinat eller TMV, viser økte nivåer av mRNA ved assay med hhv. GUS-, AHAS-eller BT-primer i primer-forlengelsesassayet. Nivået av mRNA er proporsjonalt med mengden av tilført regulator.
EKSEMPEL 66. Assay for kjemisk induserbare DNA- sekvenser: 13-glukoronidaseenzymatisk aktivitet
A. ELISA- assay
Frossent bladvev males i en morter med en støter i nærvær av flytende nitrogen for å danne et fint pulver. Bladekstrakter prepareres ved å blande en gitt vekt (g) med et gitt volum (ml) av GUS-ekstraksjonsbuffer (50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, 0,1 % Triton-X 100, 0,1 % sarkosyl, 10 mM 13-merkaptoetanol), som beskrevet av Jefferson, KA. et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 83, 8447-8451 (1986).
Ekstraksjonene utføres i brønnene av ELISA-plater ved å blande 5-25 ul ekstrakt med 120-100 ul GUS-assaybuffer (50 mM natriumfosfatbufFer, pH 7,0,0,1 % Triton X-100, 10 mM 13-merkaptoetanol), inneholdende 4-metylumbelliferylglukoronid (MU), ved en endelig konsentrasjon på 2 mM i et totalvolum på 125 ul. Platen inkuberes ved 37°C i 1-5 timer, og reaksjonen stoppes ved tilsetning av 150 ul 3 M Na2C03. Konsentrasjonen av fluorescent indikator som er frigjort, bestemmes ved å avlese platen på en Flow Labs Fluoroskan II ELISA-plateleser.
B. Resultater
Transformerte tobakkscallus (eksempel 23): De følgende GUS-aktiviteter erholdes fra prøver av transformerte callus som er blitt høstet 21 timer etter behandling. Transformert med CIB271: H20-spray: 1,8 nKat MU/mg protein; 50 mM natriumsalisylatspray: 3,8 nKat MU/mg protein. Transformert med CTJ3271 (forskjellig eksperiment): H20-spray: 2,8 nKat MU/mg protein; 250 ug/l metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat-spray: 13,7 nKat MU/mg protein. Transformert med CJJ3273: H20-spray: 0,46 nKat MU/mg protein; 250 ug/1 metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylatspray: 31,2 nKat MU/mg protein.
Transformert gulrot (eksempel 36): De følgende GUS-aktiviteter erholdes fra prøver av callus transformert med pCTB271 som er blitt høstet 21 timer etter behandling. H20-spray: 5,2 pKat MU/mg protein; 50 mM natriumsalisylatspray: 11,6 pKat MU/mg protein; 250 ug/1 metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylatspray: 22,1 pKat MU/mg protein.
Transformert tomat (eksempel 38): De følgende GUS-aktiviteter er erholdt fra prøver av transformert callus som er blitt høstet 21 timer etter behandling. Transformert med CTB271: H20-spray: 17,2 pKat MU/mg protein; 250 ug/l metyl-benzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylatspray: 56,1 pKat MU/mg protein. Transformert med CTB273 x A4: H20-spray: 4,6 pKat MU/mg protein; 250 ug/l metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylatspray: 22,1 pKat MU/mg protein.
Transient ekspresjon i tobakksprotoplaster (eksempel 56) behandlet med pCJJ3269: H20: 30,6 ± pKat MU/mg protein; metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat: 66,6 ± 20 pKat MU/mg protein.
EKSEMPEL 67. Assay for kjemisk induksjon av det endogene gen
Som en kontrollprosedyre induseres tobakksplantemateriale som beskrevet i eksemplene 62-64 med salisylsyre, metylbenzo-l,2,3-tiadiazol-7-karboksylat, og TMV undersøkes for transskripsjon av mRNA fra det endogene PR-la-gen ved metodene beskrevet i eksempel 5. Økte nivåer av mRNA blir påvist etter induksjon med alle tre indusere.
EKSEMPEL 68. Assay for kjemisk induserbare DNA- sekvenser:
acetohydroksysyresyntase ( AHASVenzymatisk aktivitet
A Prøvepreparering for AHAS- assay
Vekten av blad og/eller rotvevsmateriale som skal undersøkes blir bestemt, og vevet plasseres i flytende nitrogen og males til et fint pulver. En volumdel (i ml) av kald homogeniseringsbuffer (50 mMNaH2P04-buffer, pH 7,0, 0,5 mM EDTA, pH 7,0, 0,5 mMMgCl2, 1 mM natriumpyruvat, pH 7,0,10 um flavinadenindinukleotid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 % glyserol) lik to ganger vekten (i gram) av vevet tilsettes, og blandingen overføres til en fransk trykkpresse. Alle etterfølgende trinn utføres ved å holde materialet kaldt (ca. 4°C). Cellene ødelegges ved 16.000 psi under oppsamling av celleeksudatet i en beholder på is. Alternativt blir vevet malt med homogeniseringsbuffer i en morter og støter i stedet for behandlingen i den franske trykkcelle. Eksudatet sentrifugeres i 5 min. ved 10.000 rpm for å fjerne overflødig cellemateriale. Volumet av supernatanten måles, og enzymgradert ammoniumsulfat blir tilsatt til 25 % metning (144 mg (NH^SCVml supernatant). Blandingen omrøres på is i 15 min. og sentrifugeres derpå i 5 min. ved 10.000 rpm. Pelleten kastes og supernatanten justeres til 50 % metning med ammoniumsulfat (158 mg (NH^-SOVml supernatant). Etter omrøring på is i 15 min. samles pelleten opp ved sentrifugering ved 10.000 rpm i 5 min. Den erholdte pellet oppløses i 1 ml kolonnebuffer for hvert 2. gram av blad eller 5. gram av rotmateriale. Ekstraktet avsaltes ved tilsetning på en "Sephadex" G50-kolonne ekvili-brert med kolonnebuffer (50 mMNaH2P04-buffer, pH 7,0, 0,1 mMEDTA, 0,5 mM MgCl2, 10 uM flavinadenindinukleotid, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 % glyserol). Prøven elueres med kolonnebuffer ved å samle opp 2 ml prøve for hver ml prøve som er tilsatt kolonnen.
B. Rørassay
5-50 ul av et ekstrakt fremstilt i henhold til eksempel 68 A oppløses i et totalt volum på 0,5 ml av reaksjonsblanding (20 mMNaH2P04-buffer, pH 7,0, 20 mM natriumpyruvat, pH 7,0, 0,5 mM tiaminpyrofosfat, 5 mMMgCl2,10 uM flavinadenindinukleotid). Blandingen inkuberes i 30 min. ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 50 ul 6 N H2OS04. Blandingen inkuberes i 15 min. ved 60°C, behandles derpå med 625 ul a-naftolreagens (500 ul 5 % a-naftol i 2,5 MNaOH og 125 ul 25 mg/ml kreatin) og inkuberes i ytterligere 15 min. ved 60°C. Dersom en utfelling er blitt dannet, blir denne sentrifugert fra, og absorbansen blir målt ved 520 mu,. Piko-molmengden av acetoin som er dannet, regnes ut fra en standardkurve fremskaffet ved å bruke 0,4 ug til 10 ug acetoin. En spesifikk aktivitet blir uttrykt som pKat/mg protein.
C. ELISA- plateassay
1-20 ul av en prøve plasseres i en ELISA-platebrønn med et totalt volum på 0,15 ml av reaksjonsblandingen. Blandingen reageres i 30 min. ved 37°C. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 50 ul 2,4 M H2OS04 inneholdende 1 % kreatin. Blandingen inkuberes i 30 min. ved 60°C. Enhver utfelling som er til stede, skilles fra ved sentrifugering. 150 ul av assayblandingen overføres til en ny ELISA-plate, behandles med 100 ul 10 % a-naftol i 5 M NaOH og inkuberes i ytterligere 20 min. ved 60°C. Absorbansen måles ved 520 mu, og den spesifikke aktivitet blir uttrykt som under eksempel 68 B.
EKSEMPEL 69. Assay for kjemisk induserbare DNA- sekvenser: Bacillus thuringiensis-endotoksin
A. Planteekstraksjonsprosedyre
Cirka 100 mg plantevev homogeniseres i 0,1 ml ekstraksjonsbuffer (50 mMNa2C03, pH 9,5, 10 mM EDTA, 0,05 % Triton X-100, 0,05 % Tween, 100 mMNaCl, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (tilsatt like før bruk) og 1 mM leupeptin (tilsatt like før bruk). Etter ekstraksjon tilsettes 2 M tris, pH 7,0, for å justere pH til 8,0-8,5. Ekstraktet sentrifugeres derpå i 10 min. i en Beckman mikrofuge, og supernatanten blir brukt for ELISA-analyse.
B. ELISA
En ELISA-plate forbehandles med etanol. AfEnitetsrenset kanin-anti-Bt-antiserum (50 (il) ved en konsentrasjon på 3 ug/ml i boratbufret saltvann (100 mM borsyre, 25 mM natrium-borat, 75 mMNaCl, pH 8,4-8,5) tilsettes platen, og dette blir tillatt å inkubere over natten ved 4°C. Antiserum blir dannet ved å immunisere kaniner med gradientbufret Bt ( Bacillus thuringiensis-endotoksin)-krystaller [Ang, B.J. ogNickerson, K.W., Appl. Environ. Microbiol. 36, 625-626 (1978)], gjort oppløselig med natriumdodecylsulfat. Platen blir vasket med vaskebuffer (10 mM tris-HCl, pH 8,0, 0,05 % Tween 20, 0,02 % natriumazid) og blir behandlet i 1 time ved romtemperatur med blokkeringsbuffer (10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4,140 mM NaCl, 1 % bovint serumalbumin, 0,02 % natriumazid) og blir igjen vasket. Planteekstraktet tilsettes i en mengde for å gi 50 ug protein (typisk ca. 5 ul av ekstraktet; proteinet blir bestemt ved metoden til Bradford, M., Anal. Biochem. 72,248 (1976) ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett fra Bio-Rad) og inkuberes over natten ved 4°C. Etter vask blir 50 ul affinitetsrenset geit-anti-Bt-antiserum tilsatt ved en konsentrasjon på 3 ug/ml protein i ELISA-fortynningsmiddel (10 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,4,140 mM NaCl, 0,05 % Tween 20,1 % bovint serumalbumin, 0,02 % natriumazid), og dette blir tillatt å inkubere i 1 time ved 37°C. Etter vask blir 50 ul kanin-anti-geit-antistoff bundet til alkalisk fosfatase (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo., USA), fortynnet 1:500 i ELISA-fortynningsmiddel, tilsatt og tillatt å inkubere i 1 time ved 37°C. Etter vask blir 50 ul substrat (0,6 mg/ml p-nitro-fenylfosfat, 0,05 mg/ml MgCl2, 10 % dietanolamin, pH 9,8 justert med HC1) tilsatt og tillatt å inkubere i 30 min. ved romtemperatur. Reaksjonen avsluttes ved å tilsette 50 ul 3 MNaOH. Absorbansen avleses ved 405 nm i en modifisert ELIS A-leser (Hewlett Packard, Stanford, Ca., USA).

Claims (20)

1. Ikke-kodende DNA-sekvens fra det 5' ikke-kodende område av et naturlig forekommende gen som koder for et patogenese-relatert protein, som naturlig ligger umiddelbart oppstrøms for det kodende område av nevnte gen, karakterisert ved at den ikke-kodende DNA-sekvensen er i stand til å regulere transkripsjonen av en assosiert DNA-sekvens hos en plante eller i et plantevev, hvilken assosierte DNA-sekvens blir transkribert som et RNA som er i stand til å regulere ekspresjonen av en fenotypisk egenskap ved en anti-sense-mekanisme, eller som alternativt koder for et polypeptid som gir den fenotypiske egenskapen, hvor denne reguleringen er avhengig av en forbindelse som innbefatter et benzo-l,2,3-tiadiazol eller en pyridinkarboksylsyrestruktur.
2. DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske reguleringen er avhengig av benzosyre, salisylsyre, polyakrylsyre eller substituerte derivater derav.
3. Ikke-kodende DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert v e d at nevnte naturlig forekommende gen som koder for et PR-protein er fra tobakk.
4. DNA-sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at PR-proteingenet er et tobakk PR-la-, PR-lb-, PR-lc-, PR-1'-, PR-Q- eller PR-R-gen, et agurk-chitinase-gen eller et basisk eller surt 3-1,3-glukanase-gen.
5. DNA-sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at PR-proteingenet er et tobakk PR-la-, PR-lb-, PR-lc-, PR-1'-, PR-Q- eller PR-R-gen, et agurk-chitinase-gen.
6. DNA-sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved atPR-protein-genet er et basisk tobakk P-l,3-glukanase-gen.
7. DNA-sekvens ifølge krav 3, karakterisert ved at det ytterligere koder for et signal-peptid.
8. Chimerisk DNA-sekvens, karakterisert ved at den omfatter en første ikke-kodende DNA-sekvens ifølge kravene 1 til 6 og en andre DNA-sekvens som er i stand til å bli transkribert og translatert for å danne et polypeptid som gir en fenotypisk egenskap.
9. Chimerisk DNA-sekvens ifølge krav 8, karakterisert ved at den første DNA-komponent-sekvens er det 5'flankerende område hos tobakk-PR-la-genet og inneholder omkring 300 eller fler basepar oppstrøms for transkripsjons-startsettet.
10. Chimerisk DNA-sekvens ifølge krav 8, karakterisert v e d at den fenotypiske egenskap er valgt fra gruppen omfattende toleranse eller resistens overfor et herbicid, sopp, virus, bakterier, insekter, nematoder eller arachnider, dannelse av sekundære metabolitter, hannlig eller hunnlig sterilitet samt dannelse av et enzym eller en annen signal-forbindelse.
11. Chimerisk DNA-sekvens ifølge krav 8, karakterisert v e d at signal-peptidet som er kodet for har aminosyresekvensen Met-Gly-Phe-Val-Leu-Phe-Ser-Gln-Leu-Pro-Ser-Phe-Leu-Leu-Val-Ser-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Val-Ile-Ser-His-Ser-Cys-Arg-Ala eller en i hovedsak homolog sekvens til dette.
12. Vektor, karakterisert ved at den omfatter en ikke-kodende DNA-sekvens ifølge ethvert av kravene 1 til 10.
13. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBS-PR1013Cla, ATCC nummer 40426, deponert 11. februar 1988, og som omfatter DNA-sekvensen som inneholder tobakk-PR-la-genet.
14. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBS-PR1019, ATCC nummer 40427, deponert 11. februar 1988, og som omfatter en DNA-sekvens som inneholder tobakk PR-l'-genet.
15. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBS-Gluc39.1, ATCC nummer 40526, deponert 29. desember 1988, og som omfatter en DNA-sekvens som inneholder en genomisk DNA-sekvens av det basiske B-1,3-glukanase-gen.
16. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBS-Gluc39.3, ATCC nummer 40527, deponert 29. desember 1988, og som omfatter en DNA-sekvens av det basiske P-l,3-glukanase-gen.
17. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBScucchi/chitinase, ATCC nummer 40528, deponert 29. desember 1988, og som omfatter DNA-sekvensen som koder for agurk chitinase.
18. Plasmid, karakterisert ved at det er plasmid pBSGL6e, ATCC nummer 40535, deponert 18. januar 1989, og som omfatter DNA-sekvensen av et cDNA som koder for den sure form av B-1,3 -glukanase.
19. Fremgangsmåte for fremstilling av en i hovedsak ren kjemisk regulerbar DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter: (e) å transformere planteceller eller plantevev med første DNA-sekvenser fra det 5' ikke-kodende område av naturlig forekommende kjemisk induserbare gener som naturlig ligger ved siden av det kodende område av slike gener eller vektorer inneholdende slike sekvenser, en andre DNA-sekvens som er en verts-selekterbar gen-markør og en tredje DNA-sekvens som koder for en fenotypisk egenskap; (f) å tilføre en kjemisk regulator til nevnte transformerte vertscelle; (g) å måle ekspresjonen eller selektere for endringen i ekspresjon av den fenotypisk egenskap som er kodet for av den tredje DNA-sekvens; og (h) identifisere og isolere 5' ikke-kodende sekvenser som endrer ekspresjonen av den nevnte fenotypiske egenskap.
20. Assay for P-l,3-glukoronidase (GUS)-aktivitet i en plante som uttrykker GUS under kontroll av en ikke-kodende DNA-sekvens ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter å omsette plantevevekstrakter i prøver på mindre enn 0,5 ml inneholdende 1,5 til 3 mM 4-metyl-umbelliferyl-glukoronid ved omkring 37°C i 1 til 5 timer og derpå bestemme konsentrasjonen av den frigjorte fluorescente indikator.
NO19890972A 1988-03-08 1989-03-07 Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay NO310425B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16566788A 1988-03-08 1988-03-08
US30556689A 1989-02-06 1989-02-06

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO890972D0 NO890972D0 (no) 1989-03-07
NO890972L NO890972L (no) 1989-09-11
NO310425B1 true NO310425B1 (no) 2001-07-02

Family

ID=26861592

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19890972A NO310425B1 (no) 1988-03-08 1989-03-07 Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0332104A3 (no)
JP (1) JPH029377A (no)
KR (2) KR100225352B1 (no)
AR (1) AR242987A1 (no)
AU (1) AU617433B2 (no)
CZ (1) CZ143589A3 (no)
DK (1) DK109889A (no)
FI (1) FI891054A (no)
HU (1) HUT54417A (no)
IL (1) IL89495A (no)
NO (1) NO310425B1 (no)
NZ (1) NZ228234A (no)
PT (1) PT89915B (no)
RU (1) RU2130491C1 (no)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8901677D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
US5741684A (en) * 1988-02-03 1998-04-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US6198026B1 (en) 1988-02-03 2001-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
US5789214A (en) * 1988-03-08 1998-08-04 Novartis Finance Corporation Method of inducing gene transcription in a plant
GB8901675D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Inhibitor of gene expression
DE69034190T2 (de) * 1989-02-02 2006-02-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molekulare verfahren zur vermehrung von hybriden saaten
JP3364616B2 (ja) 1989-02-24 2003-01-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 合成植物遺伝子と調製方法
KR920701453A (ko) * 1989-03-17 1992-08-11 미리엄 디. 멕코나헤이 유전자발현의 외부조절
ATE241699T1 (de) * 1989-03-24 2003-06-15 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene pflanze
US5665543A (en) * 1989-07-18 1997-09-09 Oncogene Science, Inc. Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators
US5580722A (en) * 1989-07-18 1996-12-03 Oncogene Science, Inc. Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease
ATE238431T1 (de) * 1989-07-18 2003-05-15 Osi Pharm Inc Methode der veränderung der expression von genen bei der transkription und zum nachweis von chemischen substanzen, die wie modulatoren der genexpression wirken
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5776502A (en) 1989-07-18 1998-07-07 Oncogene Science, Inc. Methods of transcriptionally modulating gene expression
NL8901932A (nl) * 1989-07-26 1991-02-18 Mogen Int Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen.
DE59004884D1 (de) * 1989-09-26 1994-04-14 Ciba Geigy Benzo-1,2,3-thiadiazol-Derivate und ihre Verwendung zum Schutz von Pflanzen gegen Krankheiten.
IL97020A (en) * 1990-01-30 2000-12-06 Mogen Int Recombinant polynucleotides comprising a chitinase gene and a glucanase gene
US6066491A (en) * 1990-01-30 2000-05-23 Zeneca Mogen B.V. Process for obtaining fungal resistant plants with recombinant polynucleotides encoding β-1,3-glucanase modified for apoplast targeting
DK0532650T3 (da) * 1990-05-25 1996-10-07 Univ Washington Fremgangsmåde til udløsning af plantebeskyttende mekanismer
US5935809A (en) * 1990-05-25 1999-08-10 Washington State University Research Foundation Method of inducing plant defense mechanisms
WO1991018984A2 (en) * 1990-06-07 1991-12-12 Mogen International N.V. New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
US6087560A (en) * 1991-01-29 2000-07-11 Rijksuniversiteit Te Leiden Transgenic fungal resistant plants expressing chitinase and glucanase, process for obtaining, and recombinant polynucleotides for uses therein
IL100908A0 (en) * 1991-02-22 1992-11-15 Salk Inst Biotech Ind Invertase genes and their use
US5907086A (en) * 1991-05-01 1999-05-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant promoter sequences
GB9200710D0 (en) * 1992-01-14 1992-03-11 Unilever Plc Novel plant gene regulatory element
GB9216151D0 (en) * 1992-07-29 1992-09-09 Ici Plc Containment of plant germplasm
GB9223332D0 (en) * 1992-11-06 1992-12-23 Ici Plc Production of polyhydroxyalkanoate in plants
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US6013859A (en) * 1994-07-14 2000-01-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
US5981843A (en) * 1995-05-18 1999-11-09 Board Of Trustee Of The University Of Kentucky Elicitin-mediated plant resistance
US6100451A (en) * 1995-05-18 2000-08-08 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Pathogen-inducible regulatory element
EP0871707A4 (en) * 1995-05-19 2000-10-25 Phytera Inc MANIPULATION OF VEGETABLE CELL AND TISSUE CULTURES
US5851766A (en) * 1995-05-31 1998-12-22 Novartis Finance Corporation Process for isolating chemically regulatable DNA sequences
US6084155A (en) 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
DE19525034A1 (de) * 1995-07-10 1997-01-16 Bayer Ag DNA-Sequenzen und ihre Verwendung
US5773696A (en) * 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
GB9613753D0 (en) * 1996-07-01 1996-09-04 Broekaert Willem F Plant protection method
WO1998011235A2 (en) 1996-09-12 1998-03-19 Novartis Ag Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
CA2285676C (en) 1997-04-04 2011-03-08 Donald P. Weeks Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
FR2775001B1 (fr) * 1998-02-13 2000-05-12 Lvmh Rech Acide nucleique comprenant la sequence d'un promoteur inductible par un stress et une sequence d'un gene codant pour une stilbene synthase, cellule et plante transformees par cet acide nucleique
FR2775000B1 (fr) * 1998-02-13 2002-02-08 Lvmh Rech Promoteur inductible dans les plantes, sequence incorporant ce promoteur et produit obtenu
ATE507299T1 (de) 1998-04-08 2011-05-15 Commw Scient Ind Res Org Verfahren und mittel zum erhalt von veränderten phänotypen
AR020078A1 (es) 1998-05-26 2002-04-10 Syngenta Participations Ag Metodo para alterar la expresion de un gen objetivo en una celula de planta
GB9813345D0 (en) 1998-06-19 1998-08-19 Nickerson Biocem Ltd Promoters
US7439018B2 (en) 1999-01-29 2008-10-21 Evolutionary Genomics, Inc. EG1117 Polynucleotides and uses thereof
US7252966B2 (en) 1999-01-29 2007-08-07 Evolutionary Genomics Llc EG307 polynucleotides and uses thereof
US6890726B1 (en) 1999-04-06 2005-05-10 Oklahoma Medical Research Foundation Method for selecting recombinase variants with altered specificity
US6677503B1 (en) 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
US6667427B1 (en) * 1999-10-14 2003-12-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sclerotinia-inducible promoters and their uses
EP1238090B1 (en) 1999-12-16 2007-05-09 CropDesign N.V. Optimized t-dna transfer and vectors therefor
CA2331674A1 (en) 2000-01-28 2001-07-28 Southern Illinois University Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same
US20030126644A1 (en) * 2000-08-28 2003-07-03 Soo-Hwan Kim Protocols for the generation of high yield, super productive transgenic plants disturbed in ran/ran-binding protein mediated cellular process
WO2002061102A2 (en) 2000-10-24 2002-08-08 Syngenta Participations Ag Control of gene expression in plants
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
US7456335B2 (en) 2001-09-03 2008-11-25 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences and their use in methods for achieving pathogen resistance in plants
ATE539083T1 (de) 2001-11-07 2012-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
EP1947201A3 (en) 2002-01-16 2009-05-06 Evolutionary Genomics, LLC Methods to identify evolutionarily significant changes in polynucleotide and polypeptide sequences in domesticated plants and animals
DE60230071D1 (de) 2002-06-14 2009-01-08 Monier Tadros Methode für die herstellung von protamin
WO2004061122A2 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Syngenta Participations Ag Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
CA2558621C (en) 2004-03-08 2013-04-30 Syngenta Participations Ag Promoter from maize prolamin seed storage protein and uses thereof
EP1948806A2 (de) 2005-11-08 2008-07-30 BASF Plant Science GmbH Verwendung von armadillo-repeat (arm1)-polynukleotiden zum erreichen einer pathogenresistenz in pflanzen
CA2632872A1 (en) 2006-01-12 2007-07-19 Basf Plant Science Gmbh Use of stomatin (stm1) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
WO2007103768A2 (en) 2006-03-02 2007-09-13 Athenix Corporation Methods and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant
WO2008043826A1 (de) 2006-10-12 2008-04-17 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur erhöhung der pathogenresistenz in transgenen pflanzen
JP4745944B2 (ja) * 2006-12-04 2011-08-10 株式会社荒井製作所 シール部材
WO2008087141A2 (en) 2007-01-15 2008-07-24 Basf Plant Science Gmbh Use of subtilisin (rnr9) polynucleotides for achieving a pathogen resistance in plants
CA2584934A1 (en) 2007-04-17 2008-10-17 University Of Guelph Nitrogen-regulated sugar sensing gene and protein and modulation thereof
JP5822466B2 (ja) 2008-03-04 2015-11-24 ワシントン ステイト ユニバーシティー 種子油および膜脂質における脂肪酸不飽和化の示差的調節のための組成物および方法
WO2010007628A1 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 Ashwani Pareek Method for enhancing regeneration frequency of brassica species
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
CN105753950B (zh) 2009-10-02 2020-06-16 先正达参股股份有限公司 杀虫蛋白
US20130055471A1 (en) 2009-12-15 2013-02-28 Edwin Henricus Antonius HOLMAN Transgenic Ozone-Resistant Plants
MX2012007681A (es) 2009-12-31 2013-01-29 Pioneer Hi Bred Int Ingenieria de resistencia de plantas a enfermedades causadas por patogenos.
WO2012159891A1 (en) 2011-05-20 2012-11-29 Syngenta Participations Ag Endosperm-specific plant promoters and uses therefor
EA031448B1 (ru) 2012-02-16 2019-01-31 Зингента Партисипейшнс Аг Сконструированные пестицидные белки
CA2870428A1 (en) * 2012-04-16 2013-10-24 Suntory Holdings Limited Novel campanula flavonoid 3',5'-hydroxylase gene and its use
RU2015101749A (ru) 2012-06-22 2016-08-10 Зингента Партисипейшнс Аг Биологический контроль жесткокрылых вредителей
WO2014043435A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
EP3117003B1 (en) 2014-03-11 2019-10-30 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
WO2015193653A1 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas Oxidative resistance chimeric genes and proteins, and transgenic plants including the same
MX2017007619A (es) 2014-12-12 2017-09-18 Syngenta Participations Ag Composiciones y metodos para controlar plagas en plantas.
WO2016100333A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
MX2017007904A (es) 2014-12-23 2017-09-05 Syngenta Participations Ag Control biologico de plagas de coleopteros.
EP3280271A4 (en) 2015-04-10 2019-04-10 Syngenta Participations AG ANIMAL FEED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
PL232272B1 (pl) 2015-07-28 2019-05-31 Fundacja Univ Im Adama Mickiewicza W Poznaniu Zastosowanie amidów 7-karboksybenzo[1,2,3]tiadiazolu jako regulatora wzrostu roślin
WO2017184727A1 (en) 2016-04-21 2017-10-26 Bayer Cropscience Lp Tal-effector mediated herbicide tolerance
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
US11091772B2 (en) 2016-11-23 2021-08-17 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC AXMI669 and AXMI991 toxin genes and methods for their use
KR20190095411A (ko) 2016-12-22 2019-08-14 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 선충 해충의 방제를 위한 ｃｒｙ１４의 용도
UY37571A (es) 2017-01-18 2018-08-31 Bayer Cropscience Lp Gen de toxina bp005 y procedimientos para su uso
US11286498B2 (en) 2017-01-18 2022-03-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of BP005 for the control of plant pathogens
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
BR112019018175A2 (pt) 2017-03-07 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula, célula, planta, sementes, polipeptídeos recombinantes, método para produzir um polipeptídeo, planta, método para controlar ervas, uso do ácido nucleico e produto de utilidade
WO2019083810A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE FOR 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE DIOXYGENASE (HPPD) INHIBITORS BY NEGATIVE REGULATION OF HPPD EXPRESSION IN SOYBEANS
WO2019083808A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ209338A (en) * 1983-09-14 1988-02-12 Lubrizol Genetics Inc Plasmid for the transformation of a plant cell
EP0222493A1 (en) * 1985-10-04 1987-05-20 Lubrizol Genetics Inc. TR-based sub-TI plasmids
ZA885916B (en) * 1987-09-15 1989-04-26 Gen Hospital Corp Pathogenesis-related proteins in plants
ATE105585T1 (de) * 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
CA1340685C (en) * 1988-07-29 1999-07-27 Frederick Meins Dna sequences encoding polypeptides having beta-1,3-glucanase activity
EP0360750A3 (en) * 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Novel herbicide tolerant plants

Also Published As

Publication number Publication date
CZ143589A3 (cs) 1999-12-15
IL89495A (en) 1995-08-31
KR890014737A (ko) 1989-10-25
KR19990000606A (ko) 1999-01-15
EP0332104A2 (en) 1989-09-13
KR100247622B1 (ko) 2000-03-15
HUT54417A (en) 1991-02-28
EP0332104A3 (en) 1991-03-20
AU3108089A (en) 1989-09-14
NO890972L (no) 1989-09-11
AU617433B2 (en) 1991-11-28
PT89915A (pt) 1989-11-10
DK109889D0 (da) 1989-03-07
FI891054A0 (fi) 1989-03-06
KR100225352B1 (ko) 1999-10-15
JPH029377A (ja) 1990-01-12
PT89915B (pt) 1994-10-31
NZ228234A (en) 1992-09-25
RU2130491C1 (ru) 1999-05-20
FI891054A (fi) 1989-09-09
DK109889A (da) 1989-09-09
AR242987A1 (es) 1993-06-30
NO890972D0 (no) 1989-03-07
IL89495A0 (en) 1989-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO310425B1 (no) Kjemisk regulerbare DNA-sekvenser, fremgangsmåte for deres fremstilling og vektor inneholdende disse, samt plasmider og assay
US5847258A (en) DNA encoding β-1,3-glucanases
US5789214A (en) Method of inducing gene transcription in a plant
CA2012778C (en) Disease-resistant transgenic plants
DE69434312T2 (de) Regulierung von pflanzenwachstum
EP0257993B1 (en) Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
WO1990011361A1 (en) External regulation of gene expression
WO1990007001A1 (en) Overexpression of chitinase in transgenic plants
US6054637A (en) Signal sequences for vacuolar sorting
JPH0383591A (ja) 抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用
NZ235265A (en) Regulatory gene from 5&#39; untranslated region of a plant chitinase gene, recombinant dna, vectors, hosts, transgenic plants (including some expressing chitinase), and method of repelling chitin-containing pathogens
CA2184741A1 (en) Processes for inhibiting and for inducing flower formation in plants
CA2335651A1 (en) Gene switch
AU707563B2 (en) Nematode-inducible plant gene promoter
US5851766A (en) Process for isolating chemically regulatable DNA sequences
US20060288438A1 (en) Novel miniature inverted-repeat transposable elements (MITEs)-like element and transcriptional activation element
US7094952B1 (en) Method for obtaining transgenic plants expressing a protein with activity producing hydrogen peroxide by transformation by agrobacterium rhizogenes
DD283647A5 (de) Verfahren zur regulierung der transkiption eines chemisch regulierbaren gens in pflanzlichem material

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees

Free format text: LAPSED IN SEPTEMBER 2003