JPH0383591A - 抵抗力を増大させるための植物中のリゾチーム遺伝子構造の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、菌・かびおよび動物性有害生物に対する植物
の抵抗力を増大させるための、植物中のリゾチーム遺伝
子構造の使用に関する。

穀物植物の世界の収穫のかなりの部分が、有害生物によ
って常に破壊されている（１９６７年の潜在的生産高の
損失は３５％であった；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆ　Ｐｅ
５ｔｉｃｉｄｅｓ、　Ｋ、　Ｈ，Ｂｕｃｈｅｌ著、Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｓ
　　ｌ　９８３午６頁参照）。従って、穀物植物に有害
生産が繁殖するのを減少または阻止するために適切な、
全ての可能な手段を研究し、利用すべき緊急な要求があ
る。

特許出１ｉｌ　Ｗｏ　　８９１０４３７１には、特定の
バクテリアに対する抵抗力を増大させるための、特定の
リゾチーム遺伝子を有する植物の形質転換が記述されて
いる。

ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チド配列および１個以上（好適には１個）のキメラ遺伝
子融合物のリゾチーム遺伝子から成るか、または、これ
らのキメラ遺伝子融合物を有することを特徴とするリゾ
チームを発現する１個以上（好適には１個）のリゾチー
ム遺伝子構造を、植物のゲノム中に導入することによっ
て、菌・かびおよび動物性有害生物に対して植物の増大
した抵抗力が得られることを見い出した。

従来技術の知識では、本発明に従って用いられる遺伝子
構造の助けで、病原に対する植物の特に際立つｔ；抵抗
力が達成されたことは驚くべきことであり、そして、予
想ができなかった。

リゾチームという言葉は、天然にある酵素ＥＣ３，２，
１，ｌ　７の群を表わす。例として、にわとりのアルブ
ミンリゾチームおよびＴ４−ファージリゾチームが挙げ
られる。

リゾチーム遺伝子は、ＲＮＡ中に転写されそしてたん白
質中に翻訳された後、リゾチームの公知の性質を有する
酵素の生皮を生じる（適切な環境下で）いかなる核酸（
ＤＮＡ）をも意味するとして理解されるものとする。

リゾチーム遺伝子構造もしくはそれらの構成要素は、そ
れらの機能を妨げないか、大きくは妨げない、他のＤＮ
Ａ配列を、例えば、それらの最初の部分および／または
終りの部分に、有することができる。

リゾチーム遺伝子およびリゾチーム遺伝子構造の他の構
成要素は、それらの起源となる有機体のゲノム中（リゾ
チームを暗号化しないおよび／または非調節配列、例え
ばイントロン、を含む“ゲノム的°゛形態）、に含まれ
るのと同様の形で、或いは、逆転写酵素／ポリメラーゼ
の助けでｍＲＮＡを通して得られる（そしてもはやイン
トロンを含まない）ｃＤＮＡ　（″コピー”ＤＮＡ）に
相当する形で、存在することができる。

本発明に従って用いることのできるリゾチーム遺伝子構
造において、ＤＮＡ配列は、本質的に同様に作用する他
のＤＮＡ配列に置き換えることが可能である。

それらはまた、末端に、特別な遺伝子操作に適切なりＮ
Ａ配列（例えば°゛リンカー）を有することができる。

本発明に従って用いることのできる好適なリゾチーム遺
伝子構造は、プラスミドｐＳＲ２−４中に存在するよう
に、リゾチーム遺伝子に加えて、ＴＲプロモーターおよ
び大麦σ−アミラーゼのシグナルペグチト配列を有する
キメラ遺伝子融合物から成るか、或いは、これを有する
。

本発明に従う好適なリゾチーム遺伝子構造は、にわとり
のアルブミンリゾチーム遺伝子および／またはＴ４−フ
ァージリゾチーム遺伝子を有する。

特にＴ４−ファージリゾチーム遺伝子が好ましい。

本発明に従って用いられる特に好適な遺伝子は、プラス
ミドｐＳＲ２−４中に存在するようなＴ４−７アージリ
ゾチーム遺伝子、並びに、本質的に同様に作用するＤＮ
Ａ配列である。

ＴＲプロモーター、大麦σ−アミラーゼのシグナルペブ
チト配列およびプラスミドｐＳＲ２−４に含まれるよう
な、Ｔ４−ファージリゾチーム遺伝子のたん白質を暗号
化する領域のキメラ遺伝子融合物の使用が、特に強調さ
れる。

必要ならば、Ｔ４−ファージリゾチーム遺伝子、ＴＲプ
ロモーターおよび大麦σ−アミラーゼのシグナルペグチ
ト配列から成るか、或いは、この遺伝子融合物を有する
ところの遺伝子融合物を有する配列は、制限酵素の助け
でプラスミドｐＳＲ２−４から通常の方法で得られる。

リゾチーム遺伝子は、遺伝子構造の中に完全に存在する
ことができる、即ち、それらの自然のままの調節部分（
特にプロモーター）を有するか、或いは、たん白リゾチ
ームを暗号化する構造遺伝子の形態でのみ、存在するこ
とができる。

プラスミドｐＳＲ２−４を有する大腸菌株ＴＢＩ　　ｐ
ＳＲ２−４を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖ
ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　［ドイツ国微
生物収集１（Ｄ　Ｓ　Ｍ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　
Ｗｅｇ　ｌ　ｂ　、　Ｄ　−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇｓ　　ドイツ連邦共和国に、特許手続きの目的
のための微生物に関するブダペスト条約（ｔｈｅ　Ｂｕ
ｄａｐｅｓｔ　Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｃｒ
ｏｏｒｇａｎｉｓｍｓｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｐｕｒｐｏｓｅ
　ｏｆ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ）の規
定に従って、寄託し、その受託番号はＤＳＭ５４５５（
寄託日：１９８９年７月２５日）である。

本発明に従えば、有害生物、特に菌・かびおよび動物性
有害生物、特に節足動物、例えば昆虫およびダニおよび
また線虫に対する抵抗性、或いは、増大した抵抗性、を
得ることが可能である。これに関連して特に強調すべき
は、植物病原の菌・かびである。

有害昆虫は、特に次の種類の昆虫である：直翅目（Ｏｒ
ｔｈｏｐｔｅｒａ）　、ハサミム・ン目（Ｄｅｒｍａｐ
ｔｅｒａ）　、’ンロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）　、
アザミウマ目（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）　、半翅目
（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）　、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔ
ｅｒａ）　、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）　、鞘
翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）　、膜翅目（Ｈｙｍｅｎ
ｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）。

有害なダニ類は特に：ホコリダニ（Ｔａｒｓｏｎｅｍｕ
ｓｓｐｐ、）　、ミカンリンゴハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃ
ｈｕｓ　ｓｐｐ、）およびナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙ
ｃｈｕｓ　５ｐｐ）である。

有害な線虫類は特に：ブラチレンカス（Ｐｒａｔｙｌｅ
ｎｃｈｕｓ　５ｐｐ１）　、ヘテドデラ（Ｈｅｔｅｒｏ
ｄｅｒａ　ｓｐｐ、）およびメロイドギネ（ＩＪｅｌｏ
ｉｄｏｇｙｎｅ　ｓｐｐ、）である。

植物病原の菌・かびは特に：プラスモジオ７才ロミセテ
ス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒｏｍｙｃｅｔｅｓ）　
、卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、キトリジオミセテ
ス（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏ−ｍｙｃｅｔｅｓ）　、接合菌
類（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）　、嚢子菌類（Ａｓｃｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）　、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）および不完全菌類（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ）である。

上に示した風呂の範中に含まれる菌・かびによる病気の
原因となるいくつかの病原菌を例示するが、これによっ
て限定されるものではない：ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ
）種、例えば苗立ち枯れ病（Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｕｌｔｉ
ｍｕｍ）　　；フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｌ
ａ）種、例えば疫病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　１ｎ
ｆｅｓｔａｎｓ）　；ブソイドペロノスポラ（Ｐｓｅｏ
ｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばべと病（Ｐｓ
ｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｈｕｍｕｌｉ又はＰ
ｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｃｕｂｅｎｓｅ）
　　：プラスモバラ（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ）種、例え
ばべと病（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ　ｖｉｔｉｃｏｌａ）
　；ツユカビ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ）種、例えばゝ
と病（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｐｉｓｉ又はＰｅｒｏ
ｎｏｓｐｏｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ）；エリシ７工（
Ｅｒｙｓｉｐｈｅ）種、例えばうどんこ病（Ｅｒｙｓｉ
ｐｈｅ　ｇｒａｍｉｎｉｓ）　　；スファエロテ力（５
ｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ）種、例えばうどんこ病（Ｓｐ
ｈａｅｒｏ−ｔｈｅｃａ　ｆｕｌｉｇｉｎｅａ）　　；
ポドス７エラ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ）種、例えばう
どんこ病（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ　１ｅｕｃｏｔｒｉ
ｃｈａ）　；ペンチュリア（Ｖｅｎｔｕｒ　ｉａ）種、
例えば黒星病（Ｖｅｎｔｕｒｉａ　１ｎａｅｑｕａｌｉ
ｓ）　；ピレノホラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）種、例
えば網斑病（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｔｅｒｅｓ又は
Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ　ｇｒａｍｉｎｅａ）（分生胞
子基型：　Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ、同義：　Ｈｅｌｍｉ
ｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）　； コクリオボルス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）種、例え
ば斑点病（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ
）　　（分生胞子基型：Ｄｒｅｃｈｓ　Ｉｅｒａ、同義
：　ＨｅｌｍｉｎＬｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）　　；ウロミ
セス（Ｕｒｏｍｙｃｅｓ）種、例えばさび病（Ｕｒｏｍ
ｙｃｅｓ　ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ）　；プシニ
ア（Ｐｕｃｃｉｎｉａ）種、例えば赤さび病（Ｐｕｃｃ
ｉｎｉａ　ｒｅｃｏｎｄｉｔａ）　；ふすべ菌属（Ｔｉ
ｌｌｅｔｉａ）種、例えば網なまぐさ黒穂病（Ｔｉｌｌ
ｅｔｉａ　ｃａｒｉｅｓ）　　；黒穂病（Ｕｓｔ　ｉ　
ｌａｇｏ）種、例えば裸黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ　ｎ
ｕｄａ又はＵｓｔｉｌｌａｇｏ　ａｖｅｎａｅ）　　；
ペリキュラリア（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ）種、例え
ば紋枯病（Ｐｅｌｌｉｃｕｌａｒｉａ　５ａｓａｋｉｉ
）　　；ピリキュラリア（Ｐｙｒ　ｉｃｕ　ｊａｒ　ｉ
ａ）種、例えばいもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏ
ｒｙｚａｅ）　　；フーザリウム（Ｆｕｓａｒ　ｉｕｍ
）種、例えばフーザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉ
ｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）　　；灰色かび属（Ｂｏｔｒ
ｙｔ　ｉｓ）種、例えば灰色かび病（ＢｏＬｒｙｔｉｓ
　ｃｉｎｅｒｅａ）　　；セプトリア（Ｓｅｐｔｏｒｉ
ａ）種、例えばふ枯病（Ｓｅｐｔｏｒｉａ　ｎｏｄｏｒ
ｕｍ）　；レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒ
　ｉａ）種、例えばレプトスフェリア・ノドルム（Ｌｅ
ｐｔｏｓｐｈａｅｒ　ｉａｎｏｄｏｒｕｍ）　　； セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）種、例えばセル
コスポラ・カネセンス（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｃａｎ
ｅｓｃｅｎｓ）　　；アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａ
ｒｉａ）種、例えば黒斑病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂ
ｒａｓｓｉｃａｅ）及びプソイドセルコスポレラ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌ　ｌａ）種、例えばプ
ソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ　ｈｅｒｐｏＬｒｉｃ
ｈ。

１ｄｅｓ）　　。

更にヘルミンチトスポリウム　力ルポナム（Ｈｅｌｍｉ
ｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｃａｒｂｏｎｕｍ）が挙げら
れる。

本発明に従えば、実質的にすべての植物に上記の有害生
物に対する抵抗力もしくは増大した抵抗力を与えること
が可能である。当然のことながら、穀物植物中、例えば
、もみの木類、えぞ栓類、ドグラジアス（ｄｏｕｇｌａ
ｓｉａｓ）　、栓類、から栓類、ぶな類およびオーク類
のような森林植物、並びに例えば穀物類（特に小麦、ラ
イ麦、大麦、からす麦、きび、米およびとうもろこし）
、じゃがいも類、豆類、大豆類、落花生類、野菜類（特
にキャベツ種およびトマト類）、くだもの（特にりんご
、西洋なし、さくらんぼ、ぶどう、かんきつ類、パイナ
ツプルおよびバナナ）、油やし、紅茶、ココアおよびコ
ーヒー低木、タバコ、サイザル麻および綿のような食料
品および原料を作り出す植物中、そして例えばラウオル
フイア（Ｒａｕｗｏ　ｌ　ｆ　ｉａ）およびジギタリス
のような薬用植物中に、抵抗力を作り出すことへの特別
な要求がある。

既に提案したように、リゾチーム遺伝子構造が本発明に
従って、１個以上のコピーで（ゲノムの同じ座、或いは
、違った座に）、天然植物ゲノム中に導入される。既に
リゾチーム合成可能な植物では、１個以上の追加的、選
択的“異質の″リゾチーム遺伝子を導入することによっ
て、著しく増大した抵抗作用が生じ得る。

既に記述したように、本発明に従って形質転換された植
物細胞および植物の増大した抵抗力は、農業および林業
、観賞用植物および薬用植物の生産、そして植物の品種
改良において、重要である例えば、薬学的に有用な物質
を得る目的で植物細胞を培養する時に、特に菌・かびに
対して増大した抵抗性を有する植物細胞を利用できるの
はまｔ；優位である。

本発明はそれ故また、 （ａ）ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナ
ルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキ
メラ遺伝子融合物から成るか、または、これらのキメラ
遺伝子融合物を有する１個以上のリゾチーム遺伝子構造
が、植物細胞ｃｒｊＫ形質体を含む）のゲノム中に導入
され、そして、適宜、 （ｂ）　　完全に形質転換された植物が、形質転換され
た植物細胞（原形質体を含む）から再生され、そして適
宜、 （ｃ）　　植物、（種子を含む）の所望の部分が、結果
として得られる形質転換された植物もしくはそれらの子
孫から得られる、 ことを特徴とする、菌・かびおよび動物性有害生物に対
して増大された抵抗力を有する形質転換された植物細胞
（［形質体を含む）および植物（種子および植物の部分
を含む）を作り出す方法に関する。

菌・かびおよび動物性有害生物に対する増大した抵抗力
を有し、１個以上のリゾチーム遺伝子構造を有する、形
質転換した植物細胞（原形質体を含む）および植物（種
子および植物の部分を含む）、並びに、上記の方法によ
り得ることができるこれらの形質転換された植物細胞お
よび植物は、また、本発明の主題である。

本発明の部分はまた （ａ）ＴＲプロモーター、大麦σ−アミラーゼのシグナ
ルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキ
メラ遺伝子融合物から成るか、これらのキメラ遺伝子融
合物を有するリゾチーム遺伝子構造の使用、および、菌
・かびおよび動物性有害生物に対して増大した抵抗力を
もたらすところの植物細胞（原形質体を含む）および植
物（種子および植物の部分を含む）を形質転換するため
の、ベクターおよび、リゾチーム遺伝子構造を含む、本
発明に従う形質転換された微生物の使用、並びに、 （ｂ）　　増殖物質を作り出すため、新規な植物および
その増殖物質を作り出すための、本発明による形質転換
された植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（
種子および植物の部分を含む）の使用および、当然のこ
とながら、 （Ｃ）　　特別な抵抗性を増大させることによる、菌・
かびおよび動物性有害生物を駆除し、制御するためのリ
ゾチーム遺伝子構造の使用。

リゾチーム遺伝子構造を植物の遺伝物質、または植物細
胞、の中に導入するために利用でき′る、数多くの種々
の方法がある。遺伝子は、一般的な通常の公知の方法で
移すことが可能で、そして、本技術を収得する人によっ
て、各場合とも難なく、この方法は適切であることがわ
かる。

アクロバクテリウムテユームファシエンス（＾ｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅｓ）のＴ
ｉ−プラスミドは、異質なりＮＡを、双子葉植物および
単子葉植物のゲノム中に移すために、特に好適でそして
広く用いられるベクターとして利用され得る。

リゾチーム遺伝子構造が、適切なＴｉ−グラスミドのＴ
−ＤＮＡ中に導入（例えばＺａｎｂｒｙｓｋ　ｉ他、１
９８３年）され、そして、植物を感染させるか、薬錠を
感染させるか、或いは、アグロバクテリウムトユームフ
ァシエンスとプロトプラストとを共培養することによっ
て、移される。

別法として、リゾチーム遺伝子構造を、多陽イオン、或
いは、カルシウム塩類とポリエチレングリコールの存在
下で、プロトプラスト質体、！：　−ＩＨに培養するこ
とができる（例えばＤａｖｅｙ他、１９８０年；Ｈａｉ
ｎ他、１９８５午；　Ｋｒｅｎｓ他、１９８２年；　Ｐ
ａｓｚｋｏｗｓｋｉ他、１９８４年）。

ＤＮＡ取得は、まｔ；電場（エレクトロポレーション）
によって追加的に促進され得る（例えばＦｒｏｍｍ他、
１９８６年）。

ＤＮＡはまた、物理的に加速したＤＮＡを有する粒子で
、花粉に衝撃を与えることによって、植物の花粉から公
知の方法で導入され得る（ＥＰ−Ａ　　Ｏ，２７０，３
５６参照）。

植物は、適切な培養基の助けで公知の方法によって再生
される（例えばＮａｇｙおよびＭａｌｉｇａ、　　ｌ　
９７６午）。

例えば、通常の方法（例えばＶａｎ　Ｈａｕｔｅ他、１
９８３年）で、プラスミドｐＳＲ２−４は、例えばｐＧ
Ｖ３８５０；もしくはそれらの誘導体（Ｚａｍｂｒｙｓ
ｋ　ｉ他、１９８３午）を有するアグロバクテリウムテ
ユームファシエンスに移さし得ル。

形質転換の成功は、ツバリン（ｎｏｐａｌｉｎ）　モし
くはＮＰＴ　（ＩＩ）を検出することによって調べるこ
とができる。また、リゾチーム遺伝子構造は成体のベク
ター（例えばＫｏｎｃｚおよび５ｃｈｅｌｌ、　　１９
８６午）中で無性生殖させられ、上述のように適切なア
グロバクテリウム種に移される（Ｋｏｎｃｚおよび５ｃ
ｈｅｌｌ、　　ｌ　９８６午）。植物に移すことができ
る形態となったリゾチーム遺伝子構造を有するところの
結果として得られるアグロバクテリウム種は、植物を形
質転換するために更に用いられる。

好適な具体例として、単離されたプラスミドｐＳＲ２−
４が、直接的遺伝子転移による通常の方法で植物原形質
体に転移される（例えばＨａｉｎ他、１９８５午）。こ
の方法では、プラスミドは、環状、しかし好適には直線
状、の形態で存在できる。

プラスミドｐＳＲ２−４が、レポーター遺伝子と共に用
いられる場合、カナマイシン耐性プロトプラストが、リ
ゾチーム表現のために試験される。

形質転換（遺伝子導入）した植物、もしくは植物細胞は
、例えば薬錠形質転換（例えばＨｏｒｓｃｈ他１９８５
年）、再生する植物プロトプラストもしくは細胞培養を
アグロバクテリウムトユームファンエンスと共培養する
こと（例えばＭａｒｔｏｎ他１９７９午、Ｈａｉｎ他１
９８５午）、或いは、直接ＤＮＡ−トランスフェクショ
ンすること、による公知の方法で調製される。結果とし
て得られる形質転換された植物は、例えば、試験管中で
のカナマイシンスルフェートのリン酸化（Ｒｅｉｓ他、
１９８４年；　５ｃｈｒｅｉｅｒ他１９８５午）によっ
て、レポーター遺伝子表現に選択されることによるか、
或いは、ツバリン（ｎｏｐａｌｉｎ）シンターゼの表現
（Ａｅｒｔｓ他、１９８３年に従う）によるか、または
、ノーザンプロット分析とウェスターンプロット分析に
よるリゾチームの表現によって、検出される。形質転換
した植物のリゾチームは、特別な抗体を用いる公知の方
法で検出することも可能である。

形質転換された植物細胞は、特に適切な培養基の助けで
、一般通常の方法を用いて完全な植物に培養され、再生
される。

形質転換されｔ；植物細胞、並びに、リゾチームを有す
る形質転換された植物は、植物病原の菌・かびおよび動
物性有害生物、特に昆虫、だに、および線虫、に対して
相当に改良された抵抗力を示す。

本発明に関して“植物″という言葉は、完全な植物ばか
りでなく植物の部分、例えば葉、種子、塊茎、切り枝な
どを示す。“植物細胞″は、原形質体、細胞系、植物カ
ルスなどを含む。“増殖物質゛′は、形質転換させた植
物および植物細胞を繁殖させるために用いられる植物お
よび植物細胞を示す。

本文中゛本質的に同様に作用するＤＮＡ配列゛′という
言葉は、本発明にはまた、リゾチーム遺伝子もしくはそ
の部分の機能かリゾチームをもはや形成しないか、或い
は、調節遺伝子部分がもはや有効でなくなる程には影響
を受けないような、修正も含まれることを意味している
。適当な修正は、ＤＮＡ配列、個々のコドンおよび／ま
たは個々の核酸を置き換えるか、加えるか、および／ま
たは除くかすることで行なわれ得る。

本発明に従って用いられる微生物における゛″突然変異
体″は、本発明を実行するに必須な特徴をまだ有してい
る修正された微生物、特に特定のプラスミド、を示す。

下記の例示する具体例は、本発明の詳細な説明すること
を意図したものである。

１、用いたプラスミド構造ｐＳＲ２−４に関する記述（
第１図参照） プラスミドｐｓＲ２−４は、ＴＲプロモーター（ＶｅＨ
ｅｎ他、１９８４午）、大麦α−アミラーゼのシグナル
ペプチド配列およびＴ４−ファージリゾチーム遺伝子の
たん白質を暗号化する領域（Ｋ、Ｄｕｒｉｎｇｓ博士論
文、Ｃｏｌｏｇｎｅ大学、１９８８午）からの、表現ベ
クターｐＡＰ２０３４（Ｖｅｌｔｅｎおよび５ｃｈｅｌ
ｌ、　　１９８５手）中に組み込まれたキメラ遺伝子融
合物を有する。プラスミドｐＳＲ２−４の大きさは９．
３Ｋｂである。

第１図 プラスミドｐＳＲ２−４（９，，３Ｋｂ）は下記のよう
に示される： ｐＴＲ＝　Ａ、テユームファシエンスからのデュアル植
物プロモーター ｏｃｓ　　ｐＡ　　＝　　オクトピンシンターゼのポリ
アゾニレ−ジョン配列領域 ＫｍＲ−カナマイシン耐性遺伝子、植物中で活性 ｇ７ｐＡ　　−アグロバクトリウム遺伝子７のポリアゾ
ニレ−ジョン領域 ＣｂＲ−カルブペニシリン耐性遺伝子 Ｓｍ”−ストレプトマイシン耐性遺伝子５ｐＲ＝　　ス
ペクトマイシン耐性遺伝子線形の部分−大麦α−アミラ
ーゼのシグナルペプチド配列 ｌｙｓ　　＝　　Ｔ４−ファージリゾチームのための暗
号化する配列 以下に記述する方法に従って、リゾチーム遺伝子構造を
、例えばタバコおよびじゃがいも中に移植し　ｔこ　。

既に上に説明したように、容易に単離され得る形態で、
プラスミドｐＳＲ２−４を有する大腸菌株ＴＢＩ　　ｐ
ＳＲ２−４がＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ
ｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（ドイツ国微生
物収集）に寄託されている。

２、タバコの形質転換 ａ）タバコ苗条培養およびタバコプロトプラストの単離
： ニコチアナタバキュム（ＮｉｃｏＬｉａｎａ　ｔａｂａ
ｃｕｍ）（Ｐｅｔｉｔ　Ｈａｖａｎｎａ　Ｓ　Ｒｌ　）
は、ホルモンの入っていないＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉ
ｅｒ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ１９６５年）上に苗条無菌培
養として増殖させる。苗条培養は、約６〜８週間の間隔
で新鮮なＬＳ培地に移植する。苗条培養を２４〜２６°
Ｃ，１２時間光（１０００〜３０００ルツクス）で、成
長キャビネット中に保存した。

葉のプロトプラストを単離するために、約２ｇの葉（長
さ約３〜５　ａｍ）を、新しいかみそりの刃を使用して
、小片に切断する。この葉の物質を、Ｋ３培地（Ｎａｇ
ｙ　ａｎｄ　Ｍａｌｉｇａ　ｌ　９７６年）、０．４ｍ
サッカロース、ｐＨ５、６，２％のゼルラーゼ（Ｚｅｌ
ｌｕｌａｓｅ）　Ｒｌ　Ｏ（５ｅｒｖａによる）および
０．５％のマセロチム（Ｍａｃｅｒｏｚｙｍ）　Ｒ１０
（Ｓｅｒｖａによる）を含有する酵素溶液２０ｍＡ中、
室温で１４〜１６時間培養する。この後、原形質体を０
．３０ｍｍと０　、１　ｍｍのスチール製ふるい上で濾
過することによって、細胞の断片から分離する。濾液を
１０分間１１００Ｘで遠心分離する。この遠心分離中、
損傷を受けていないプロトプラストが浮遊し、そして酵
素溶液の上部の端に帯状に集まる。細胞の破片のベレッ
トおよび酵素溶液をガラスキャピラリーで吸引すること
によって除去する。予め洗浄したプロトプラストを、新
鮮なに３培地（浸透性の活性剤として０．４Ｍサッカロ
ース）で１０ｍｎとし、再び浮遊させる。洗浄培地を除
去し、培養または引き続くアゲロバクチリアによる感染
（コカルチャー）のｔ二め１−２Ｘ１０５／ｍｌに希釈
する。原形質体濃度を血球計算盤中で測定する。

ｂ） アグロバクテリウムテユームファシエンスと以下では、
Ｍａｒｔｏｎ他、１９７９年の方法を若干修正した方法
を用いた。プロトプラストを上述したように単離し、Ｋ
３培地（０，４Ｍサッカロース、０．１ｍｇ／ｌ　　Ｎ
ＡＡ、０．２ｍｇのキネチン）中１−２Ｘ１０’／ｍｌ
の密度で、暗所で２日間そして２６°Ｃで弱い光（５０
０ルツクス）の下、１〜２日間培養する。

最初の原形質分裂が生じるとすぐ、最少Ａ（Ａｍ）培地
中のアグロバクテリウム懸濁液（密度、約１０ラアグロ
バクテリア／−）の３０μｌを、３−の再生プロトプラ
ストに加える。コカルチャーの期間は、暗所で２０°Ｃ
１３〜４日である。この後、たばこ細胞を１２ｍ１の遠
心分離管に移し、海水（６００ｍＯｓｍ／　ｋｇ）でｌ
Ｏ−に希釈し、６０×ｇで１０分間ペレット状にした。

この洗浄工程を１〜２回更に繰り返して、はとんどのア
ゲロバクチリアを除去する。細胞懸濁液を５Ｘ１０’／
ｍｊの密度で、１ｍｇ／ｊ２　　ＮＡＡ　（ナフチル−
１−酢酸）　、０．２ｍｇ／ｌケネチン、および５００
ｍｇ／４２のセファロスポリン抗生物質のセフオタキシ
ム（Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ）と共に、Ｋ３培地（０，３
ｍサッカロース）中で培養する。

各週、細胞懸濁液を新鮮なに３培地で希釈し、培地の浸
透価を、コカルチャー後２〜３週間、週当りサッカロー
スを０．０５’ｍ（約６０　ｍｏｓｍ／　ｋｇ）づつ徐
々に減らし、カナマイシンを用いｆ：　希釈（ｌ　ＯＯ
ｍｇ／　ｌカナマイシンサルフェート）　　（Ｓｉｇｍ
ａによる）、６６０ｍｇ／ｇの活性カナマイシン）をア
ゲロース−ビードタイプ培養（Ｓｈｉ１１ｉｔｏ他、１
９８３年）中で開始する。カナマイシン−耐性のコロニ
ーが、背景の遅れたコロニーからの選択が始まった後３
〜４週間で、区別される。

１８０μｌのに３培地中の約１０’ブロトフラストを、
ペトリ皿中でμｌ当り０．５μｇのｐＳＲ２−４を含有
するＯＮＡ水溶液２０μｉと一緒に注意深く混合する。

２００μｌの融合溶液（０，１Ｍの硝酸カルシウム、０
．４５Ｍのマンニトールおよび２５％のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ６０００）、ｐＨ９）を、続いて注意
深く加える。１５分後、５−の洗浄溶液（０，２７５Ｍ
の硝酸カルシウム、ｐＨ６）を加え、そして、更に５分
後、遠心分離管にプロトプラストを移し、６０×ｇでベ
レット状にする。このベレットを少量のに３培地中に摂
取し、炭車に記述するように培養する。二者択一的に、
プロトプラストはＨａｉｎ他、１９８５午の方法で形質
転換され得る。

修正“ビード−タイプ培養″技術（Ｓｈｉｌｉｔ。

他１９８３年）をこの培養に用い、カナマイシン耐性コ
ロニーの選択を下記に示す。ＤＮＡでプロトプラストを
処理した後１週間後（Ｃ参照）、この細胞懸濁液３−を
、５ｃｍのベトリ皿中で、３−のに３培地（０，３Ｍの
サッカロース＋ホルモン類；１４２％の（５ｅａｐｌａ
ｑｕｅ）　Ｌ　Ｍ　Ｔ　Ａｇａｒｏｓｅ　（低融点のア
ガロース、Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓによる）と
−緒に混合する。この目的のため、乾燥アガロースを加
圧滅菌し、Ｋ３培地を加えた後、この混合物を極超短波
中で短時間沸騰させる。アガロースが固化した後、アガ
ロース盤（ビード）を包埋したタバコミクロカルスと一
緒に、次の培養および選択のために１０ｃｍのペトリ皿
に移し、各場合共、ｌＯ−のに３培地（０，３Ｍのサッ
カロース、ｌ　ｍｇ／　ＲのＮＡＡ、０゜２ｍｇ／ｊ！
のキネチンおよび１００ｍｇ／／２のカナマイシンスル
フェート、Ｓｉｇｍａによル）を加える。この液状の培
地を毎週交換する。この処置の間に、培地の浸透価は次
第に降下する。交換培地（Ｋ３＋ｋｍ）を毎週サッカロ
ス０．０５Ｍ（約６０　ｍｏｓｍ）−づつ減らす。

ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン耐性タバココロニーの
選択表： ０．４Ｍ　　Ｏ，３Ｍ　　Ｏ，２５Ｍ　　０．２０Ｍ　
　Ｏ，１５Ｍ　　Ｏ，１０Ｍ液状培地中の サッカロース （Ｋ３培地：１ｍｇのＮＡＡ、０．２ｍｇのキネチン）
Ａ＝ＤＮＡ摂取 Ｅ＝アガロース中に包埋 Ｓ−カナマイシンによる選択（ｌｏｏｍｇ／ｌのカナマ
イシンスルフェート） Ｋ＝カナマイシン耐性のコロニーが背景から明白に区別
できる。

ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーが直径的０．５ｃｍに達する
とすぐ、それらの半分を再生培地（ＬＳ培地、２％のサ
ッカロース、０．５ｍｇ／ｌのベンジルアミノブーリン
ＢＡＰ）に移し、２４°Ｃで１２時光（３０００〜５０
００ルツクス）の成長チャンバ中に保存する。他方の半
分は、ｌ　ｍｇ／　ｊ２のＮ　Ａ　Ａ　、　０　、２　
ｍｇ／ｉのキネチン、Ｏ，１ｍｇ／ＪのＢＡＰおよび１
００ｍｇ／／２のカナマイシンスル７エートヲ有するＬ
Ｓ培地上で、カルス培養として繁殖させる。再生した苗
条が約１ｃｍの大きさになった時、それらを切り取り、
根をはらせるために、成長調整剤を含有しない％ＬＳ培
地（１％のサッカロース、０．８％の寒天）に移ス。１
００ｍｇ／ｌのカナマイシンスルフェートを有する３（
ＭＳ培地上に、この苗条を根づかせた後、土壌に移植す
る。

薬錠の形質転換のため（Ｈｏｒｓｃｈ他１９８５年）、
無菌苗条培養の葉、約２〜３ｃｍの長さのもの、を直径
１ｃｍの盤上に打ち抜き、この盤を、Ａｍ培地中の適切
なアゲロバクチリア（約１０″／ｍＪ２）（ｂ参照）の
懸濁液を用いて、約５分間培養する（以下を参照）。こ
の感染させた葉の断片を、ホルモン類の入っていないＭ
Ｓ培地（以下を参照）上に、約２４°Ｃで３〜４日間保
存する。

この間、アグロバクテリウムは葉の断片上に成育する。

その後、この葉を断片をＭＳ培地（０、５ｍｇ／−のＢ
ＡＰ、０１１ｍｇ／ｍｊのＮＡＡ）中で洗浄し、５００
１１ｇ／ｍ忍のセフオタキシム（Ｃ１ａｆｏｒａｎ）お
よびｌＯＯμｇ／−のカナマイシンスルフェート（Ｓｉ
ｇｍａによる）を含有する同様の培地（０，８％の寒天
）上に置く。この培地は２週間後新しくするものとする
。プロトプラストした苗条は、更に２〜３週間後、見え
るようになる。苗条の再生は選択圧なしでも平行して行
なうものとする。

再生した苗条は、例えばツバリンシンターゼもしくはス
チルベンシンターゼ活性のための、生物学的試験によっ
て、形質転換に関して試験するものとする。この方法に
おいて、１〜ｌＯ％の形質転換した苗条が得られる。

形質転換に関する生化学的検出方法 植物組織中のツバリンの検出ニ ツバリンは下記に示すように、０ｔｔｅｎおよび５ｃｈ
ｉｌｐｅｒｏｏｒｔ　（１９７８年）およびＡｅｒＬｓ
他、（１９７９午）によって示される方法で検出される
。植物物質（カルスもしくは葉の断片）５０ｍｇを０．
１Ｍのアルギニンを有するＬＳ培地中のエラペンドル７
　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管中、室温で一晩培養する。

その後植物物質を吸収性の紙でプロットし、ガラス棒を
用いて新しいエツペンドルフ遠心分離管中でホモジナイ
ズさせ、このホモジナイズした液を、エッペンドルフ遠
心分離中で２分間遠心分離する。

２μｅの上澄み液を電気泳動のための適切な紙（Ｗｈａ
ｔｍａｎ　３　ＭＭ紙）（２０Ｘ４０ｃｍ）上に点とし
て塗布し、乾燥する。この紙を可動相（５％のぎ酸、１
５％の酢酸、８０％の水、ｐＨ１，８）で飽和させ、４
００ＶＣ’４５分間、電気泳動を行なった。ツバリンは
陰極に向がって移動する。その後、この紙を熱風中で乾
燥し、フェナントレンキノン染料を通して、移動する方
向に通過させる（エタノール中の０．０２％の７エナン
トレンキノンと６０％濃度エタノール中の１０％のＮａ
ＯＨを同量）。乾燥した紙を長波長のＵＶ先光下検査し
、写真をとる。この試薬で、アルギニンおよびアルギニ
ンの誘導体は蛍光性の黄色に着色する。

植物組織中のＮＰＴｎ活性は、Ｋｅｉｓｉｓ他（１９８
４年）によって記述される方法、および５ｃｈｒｅｉｅ
ｒ他（１９８５年）によって修正された方法で、カナマ
イシンのイン・サイチュー法リン酸化によって検出され
る。５０ｍｇの植物組織を、ガラス粉末を添加した５０
μｌの抽出緩衝液（１０％のグリセロール、５％の２−
メルカプトエタノール、０．１％のＳＤＳ、０．０２５
％のブロモフェノール・プル６２．５ｍＭトリスｐＨ６
，８）中、氷上でホモジナイズさせ、この混合物を４°
Ｃで１０分間エツベンドル７遠心分離器中で遠心分離す
る。５０μｌの上澄み液を、天然ポリアクリルアミドゲ
ル（１４５Ｘ１１０Ｘｌ。

２ｍｍ　；分離ゲル：１０％アクリルアミド、０゜３３
％のビスアクリルアミド、０．３７５ＭトリスｐＨ８、
８、収集するゲル：５％のアクリルアミド、０．１６５
％のビスアクリルアミド、Ｏ，１２５Ｍ）リス　ｐＨ６
、８）に移し、４°Ｃ６０Ｖで一晩電気泳動を行なった
。ブロモフェノール・ブルー標識がゲルから出て移動し
始めるとすぐ、このゲルを１０分間蒸留水で２回、３０
分間反応緩衝液（６７ｍＭトリスマレイン酸塩、ｐＨ７
，１，４２ｍＭＭｇＣ１２，４００ｍＭ塩化アンモニウ
ム）で１回洗浄する。このゲルを、同じ大きさのガラス
板上に置き、基質のカナマイシンスルフェート（２０ｐ
　ｇ／＋ｎｌ）および２０．−２００　ｕｃｉ　３２ｐ
Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含有する反応緩衝
液中、１％濃度のアガロース４０ｍ２の層でおおった。

このサンドインチ状にしたゲルを室温で３０分間培養し
、そしてホスホセルロース紙Ｐ　８１　　（Ｗｈａｔｍ
ａｎ）のシートを、アガロースの上に置く。この上に、
濾紙３ＭＭ　（Ｗｈａｔｍａｎ）　４層と２〜３枚のベ
ーパータオルを配する。３〜４時間後、イン・サイチュ
ー法でりん酸化した放射性カナマイシンホスフェートの
、Ｐ８１紙への移行が停止する。

このＰ８１紙を、プロテナーゼにと１％ドデシル硫酸ナ
トリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）の溶液中、６０°Ｃで３０分間
培養した後、８０°Ｃで、１０ｍＭりん酸塩緩衝液ｐＨ
７、５の２５０ｍ１２中で３〜４回洗浄し、乾燥し、そ
して−７０°Ｃで１〜１２時間オートラジオグラフをと
る（ＸＡＲ５−フィルム、コダック）。

騰 細胞培養および植物からＲＮＡを単離するために、植物
物質１ｇ当り０．１ｇの無菌石英砂、ｌμｌのβ−メル
カブタエタノールおよびＬｔｎｌのＨＯ緩衝液（０，４
Ｍ　ト！Ｊ　ス／ＨＣ２ｐＨ８，０，１Ｍ　　ＮａＣｊ
！、　０．０４Ｍ　　ＥＤＴＡ、　　５％ＳＤＳ。

６５℃）を加え、そして、この混合物をホモジナイズし
た。ｌｄのフェノール／クロロホルム（１：ｌ）を加え
た後、更に約２分間この混合物をホモジナイズした。こ
のホモジエ不一トを遠心分離管に移し、この管を激しく
振とうした。遠心分離（１０’　　１１００００Ｘ、室
温）後、更に２丁１１１のフェノール／クロロホルムを
加え、この管を激しく振とうした後、遠心分離した。ポ
リサツカロイドを除くため、ｙの容積のエタノールを水
相に加え、この混合物を氷上にｌＯ分間装いた後、１１
００００Ｘ、４°Ｃで１０分間遠心分離した。その後、
核酸を２倍の容積のエタノールを用いて沈殿させ、−７
０’Ｏで保存した。沈殿したＲＮＡをその後、２−づつ
に分けた酢酸ナトリウム（３Ｍ１ｐＨ６）で２〜３回洗
浄した。このＲＮＡを１００μｌの無菌水に溶解した。

ｂ）ＲＮＡの電気泳動 ＲＮＡ変性：　ＲＮＡの電気泳動のため、６．７５μｉ
のＲＮＡ（２０μｇ）に、３μｌの５倍緩清液（０，２
Ｍ　ＭＯＰＳ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　１）Ｈ７）　、５．２５μＮのホルムアルデヒド
（３７％濃度）および１５μｉのホルムアミド（脱イオ
ン化した）を、加えた後、５６°Ｃで１５分間変性を生
じさせた。

アガロースゲルの調製：３．５ｇのアガロースを２００
ｍｇの水中で沸騰させ、この混合物を６０００に冷却し
た後、５倍の緩衝液７０社とホルムアルデヒド６２−を
加えた。この溶液を水で容積３５０−とじ、ゲル装置中
に充填した。この変性ＲＮＡを３μ２の色標識と１μｉ
のエチジュームブロマイド（５ｍｇ／　ｍｌ、　）と混
合した後、ｌＯＯ■で６時間電気泳動を行なった。

Ｃ）　ノーザンブロツテイング法： 引き続いてこのゲルを無菌水中で１０分間３回洗浄した
。このＲＮＡを、標準プロッティング方法（２０ＸＳＳ
Ｃ中３〜４時間）を用いて、ニトロセルロースフィルタ
ー（Ｍａｎｉａｔｉｓ他１９８２年）Ｉこ移した。

ｄ）　ノーサンプロット上の雑種形成：ｐＳＲ２−４か
ら単離したＳａｌ　Ｉ断片１１００ｎを、放射性標識（
比活性＞４Ｘ１０８ｃｐｍ／μｇ）のため、ニック翻訳
を受けさせる。ＴｈｏｍｚｉｋおよヒＨａｉｎ　１９８
８午によって記述される方法により、４２℃で一晩雑種
形戊を行なった。

この方法は、形質転換したタバコ中のＴ４−ファージ−
リゾチームに特異なｍＲＮＡの脅威を検出するために用
いられる。

タバコから全たん白質を単離するために、１００ｍｇの
植物物質を２倍に濃縮したＳＤＳサンプル緩衝液（１５
０ｍＭトリス／ＨＣｊ！ｐＨ６，８，２％ＳＤＳ、２０
％グリセロール、０．００４％ブロモフェノール・ブル
ー　２００ｍＭＤＴＴ。

５ｍＭアスコルビン酸および１０ｍＭ　ＣＨＡＰＳ）中
でホモジナイズした後、この混合物を９５°Ｃで５分間
培養した。遠心分離（１００００Ｘｇ。

５分間）した後、整除できる数に分けた上澄み液（１０
〜１００μｇの全たん白質）を、１５％のＳＤＳポリア
クリルアミドゲルに移し、６０Ｖで１２時間電気泳動を
行なった。分離したたん白質を、その後、移動緩衝液（
２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシンおよび２０％
のメタノール）中、エレクトロブロッティング（２時間
、０．８〜ＬＡ）によって、ＰＶＤＦイモピロン（Ｉｍ
ｍｏｂｉｌｏｎ）膜へ移した。ひき続いてこの膜をＰＢ
Ａ中の５％のウシ科の動物の血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　
Ａ）中で３０分間培養した。ＰＢＡ中の０．１％のＢＳ
Ａを用いて３回洗浄した後、この膜を多クローン性Ｔ４
−リゾチームに特異な抗体と共に２時間培養した。０．
１％のＢＳＡ／ＰＢＡ中で３回洗浄（各々５分間）シｔ
；後、この膜を、金で標識した抗体（Ａｕｒａ　Ｐｒｏ
ｂｅ”　ｋｉｔ、Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅからの
やぎ抗ラビット）を用いて、この業者によって示される
ように２時間培養した。ＰＢＡ中の０．１％のＢＳＡお
よび水で洗浄した後、この膜をエンハンサ−／イニシエ
ーター（１：　ｌ）で着色させた。

３、ソラナムチューベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔａｂ
ｅｒｏｓｕｍ）（じゃがいも）の形質転換 ＥＰ−Ａ、０，２４２，２４６．１４〜Ｉ５頁、プラス
ミドｐＳＲ２−４のリゾチーム遺伝子構造を有するＴｉ
プラスミドを有するアゲロバクチリア、に記載されるの
と全く同様の方法による形質転換で形質転換した。

特に規定されていない限り、上記実施例中の全ての百分
率は重量％である。

上記実施例に従って得られた植物細胞および植物におい
て、リゾチーム遺伝子の存在はサザンプロット分析法に
よって確認された。リゾチーム遺伝子の表現は、特定の
抗体の助けによるノーザンプロット分析法およびリゾチ
ームで検出された。

形質転換したそして形質転換していない植物（比較のた
め）に、ポトリシスシネラ（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃ　１ｎ
ｅｒａ）およびアルテルナリアロンギベス（Ａｌｔｅｒ
ｎａｒｉａ　ｌｏｎｇｉｐｅｓ）の胞子懸濁液を噴霧し
た後、１週間後、菌・かびによる感染を記録した。

形質転換していない比較植物に比べて、形質転換した植
物は、菌・かびによる感染に対して、増大した抵抗力を
示した。

増大した抵抗力の検出の実施例 菌・かびによる植物の病気に対して、植物中で合皮され
たリゾチームによって増大された抵抗力を試験するため
に、植物を病原と一緒に培養し、その感染の度合いをパ
ラメーターとして用いた。

用いた試験病原体はＡｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｌｏｎｇｉ
ｐｅｓ　（Ｅｌｌ＆　Ｅｖｅｒｈ）　）Ｊａｓｏｎおよ
びＢｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ　Ｐｒｅｓである
。

タバコの植物を標準土壌（Ｂａｌｓｔｅｒによる）が入
っているポット（直径１１ｃｍ）中に鉢植えし、実験を
開始するまで、２３℃で相対湿度７０〜８０％の温室中
で成育させる。この植物に必要な水と栄養を与える。接
種のため、５〜８週目の古い植物の葉に病原体の胞子懸
濁液を流れ出すまで噴霧する。引き続いて、この植物を
病原体の好む条件下、初期の相対湿度１００％で２１°
Ｃ１で培養する。４〜８日後、植物の健康状態を、感染
させた葉の部分を基準にして、パーセントで測定する。

表（Ｉおよび■）かられかるように、実施例２に従って
ｐＢＲ２−４で形質転換した植物は、野生種のＳＲ，に
比較して、 ＡＩ　Ｌｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇ　１ｐｅｓ並 びにＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａに対して低い感染を示している。

Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏｎｇ　１ｐｅｓによるタバコ植物の感染に対するリ ゾチーム遺伝子の効果 ＳＲ，野生種 ０ ３ ５ ３ ８ 本 アボッ トの式を用いて計算した減少率 表■ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ Ｃｉｎｅｒｅａによるタバコ植物の感染に対するりゾチ ム遺転子の効果 Ｓ＋？、野生種 ００ ００ ００ ００ ００ 本 アボットの式を用いて計算した減少率 植物もしくは植物細胞の形質転換に用いた培地のいくつ
かを以下に示す。

Ａｍ培地 ３．５ｇ　　Ｋ２ＨＰＯ４ １，５ｇ　　ＫＨ２Ｐ０゜ ０．５ｇ　　クエン酸Ｎａ。

０．１ｇ　　Ｍｇ５Ｏ４Ｘ７Ｈ２０ １ｇ　　（ＮＨ４）２５０４ マクロ要素：ＭＳ塩の濃縮物の％ ミクロ要素：ＭＳ塩の濃縮物のＨ Ｆｅ　ｌ：［）ＴＡ　　ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋ
ｏｏｇ（ＭＳ）ミョ・イノシトール サッカロース 寒天 ビタミン類パントテン酸Ｃａ ビオチン ニコチン酸 ピリドキシン チアミン 加圧滅菌前のＩ）Ｈ５、７ １００ｍｇ／ｅ １０ｍｇ／１ ８　　ｇ　　／（１ １ｍｇ／ｊ １０＋ｎｇ＃２ １ｍｇ／＋２ １ｍｇ／ｇ １　ｍｇ／ｌ に３培地 Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｐｅｔｉｔ　Ｈ
ａｖａｎａ　ＳＲＩ％Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃ
ｕｍ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　　３８およびＮ１ｃｏｔｉ
ａｎａ　Ｐｌｕｍａｇｉｎｉｆｏｌｉａ　ＷＬ形質体培
養用（ＮｏｇｙおよびＭａｌｉｇａ、　　ｌ　９７６午
）マクロ要素　ＮＨ＋　Ｎｏ　３ ＫＮＯ。

ＣａＣ１２Ｘ　２Ｈ２０ ＭｇＳＯ３Ｘ　７）１２Ｏ ＮａＨ，ＰＯ，Ｘ　ｌＨ２Ｏ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ＣａＨＰＯａ　ｘ　ｌＨ２Ｏ ミクロ要素　１１ｓＢＮＯｉ ＭｎＳＯ，Ｘ　ｌＨ２Ｏ Ｚｎ５Ｏ，Ｘ　４Ｈ，Ｏ Ｉ Ｎａ２ＭｏＯａ　Ｘ　２Ｈ２０ ＣｕＳＯ＋　×５８２０ ＣｏＣＩ２Ｘ　（ｉ！（２０ ５０ ５００ ００ ５０ ５０ ３４ ０ ０ ０，７５ ０，２５ ０，０２５ ０、０２５ １７１ｇ／Ｊ２ ｍｇ／ｊ ｍｇ／　ｆ２ ｍｇ／１ ｍｇ／　１２ ｍｇ／Ｒ ｍｇ／Ｑ ｍｇ／ｇ ｍｇ／、ｇ ｍｇ／ε ｍｇ／ｇ ｍｇ／ｇ ｍｇ／ｇ ｍｇ／　Ｉ２ Ｆｅ ＥＤＴＡ イノシトール Ｎａ２ＥＤＴＡ ＦｅＳＯ２Ｘ　７Ｈ２０ ３７，２ｍＦｅ１ ２７．８　　　ｍＦｅ１２ １００　　　　ｍｇ／　１ キシロース　　　　　　　　　　２５０　　　ｍｇ／　
１ビタミン類　ニコチン酸　　　　　ｌ　　　ｍｇ／ｌ
ピリドキシン　　　　１　　　ｒｒＩｇ／ｌチアミン　
　　　　　１０　　　ｍｇ／ｌホルモン　　ＮＡＡ　　
　　　　　　　　１．０　　ｍｇ／ｌキネチン　　　　
　　０．２　　ｍｇ／ｌｐＨ５、６ フィルター無菌 ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ培地（Ｌｉｎｓｍ
ａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ　ｌ　９６５午） 再生プロトプラスト培養用およびタバコ腫瘍およびカル
スの組織培養用。ＬｉｎｓｍａｉｅｒおよびＳｋｏｏｇ
（ｔＳ）培地は下記の修正を行なったＭｕｒａｓｈ　ｉ
ｇｅおよびＳｋｏｏｇ培地（Ｍｕｒａｓｈ　ｉｇｅおよ
びＳｋｏｏｇ、　　１９６２手）であるニ ー０．１ｍｇ／ｊ！の代わ チアミンを計量 一グリシン、ピリ 使用。

マクロ要素 りに０’　、　４　ｍｇ／　ｌの高濃度でミクロ要素 Ｆｅ　　ＥＤＴＡ トキシンおよびニコチン酸を不 Ｎ）Ｉ４Ｎｏ。

Ｎ０３ ＣａＣ１２Ｘ　２Ｈ２０ Ｍｎ５Ｏ４Ｘ　７Ｈ２０ ＫＨ２ＰＯ。

Ｈ，ＢＯ。

Ｍｎ５Ｏ４Ｘ　ＩＨ，０ ＺｎＳＯ４Ｘ　４Ｈ，Ｏ Ｉ Ｎａ２Ｍｏ０４Ｘ　２Ｈ２０ ＣｕＳＯ，Ｘ　５Ｈ２０ ＣｏＣ１＊Ｘ　６Ｈ２Ｏ Ｎａ、ＥＤＴＡ ＦｅＳＯ４ｘ　７Ｈ，。

イノシトール サッカロース 寒天 ビタミン類　チアミン ホルモン　　ＮＡＡ キネチン 加圧滅菌前のｐＨ５−７ ６５０ ９００ ４０ ７０ ７０ ６，２ ２２，３ ８，６ ０，８３ ０，２５ ０，０２５ ０，０２５ ３７，２ ２７，８ ００ ０ ０，４ ０，２ ｍｇ／　Ｉ！。

ｍｇ／Ａ ｍＦｅ１ ｍＦｅ１ ｍｇ／忍 ｍｇ／　１ ｍｇ／　１２ ｍＦｅ１ ｍＦｅ１ ｍｇ／Ｑ ｍＦｅ１ ｍＦｅ１ ｍｇ／Ｊ ｍｇ／Ｎ ｍｇ／Ｑ Ｆｅ１ Ｆｅ１ ｍｇ／　Ｉｔ ｍＦｅ１ ｍｇ／ｌ 下記の参考文献は、植物もしくは植物細胞の形質転換に
関連しており、本発明に従って用いられるリゾチーム遺
伝子に関連している： Ａｅｔｓ　Ｍ、　Ｊａｃｏｂｓ　Ｍ、　）Ｉｅｒｎａｌ
ｓｔｅｅｎｓ　ＪＰ、　ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ　Ｍ、　
５ｃｈｅｌｌ　Ｊ　（１９８３年）　Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓｔｈａｌｉａｎａのクラウンゴール腫瘍の誘導お
よび試験管培養。Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔ、　　
ｌ　７　：　４３　５０Ｄａｖｅｙ　ＭＲ，Ｃｏｃｋｉ
ｎｇ　ＥＣ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｊ、　Ｐｅａｒｃｅ　Ｎ
。

Ｔｕｄｏｒ　Ｉ　（１９８０年）単離したＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍプラスミドによるＰｅｔｕｎｉａプロト
プラストの形質転換、　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ　Ｌｅｔｔ
　ｌ　８　：　３０７−３１３に、　Ｄｌｊｒ！ｎｇｓ
博士論文、Ｃｏｌｏｇｎｅ大学、１９８８午：Ｗｕｎｄ
ｉｎｄｕｚｉｅｒｂａｒｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｕ
ｎｄ　５ｅｋｒｅｔｉｏｎｖｏｎ　Ｔ４　　Ｌｙｓｏｚ
ｙｍ　ｕｎｄ　ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅｎ　Ａｎｔｉｋ
５ｒｐｅｒｎｉｎ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ
ｍ　［創傷誘導の表現およびＴ４−リゾチームの分泌作
用およびＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ中の単クロ
ーン抗体１゜Ｆｒｏｍｍ　ＭＥ、　Ｔａｙｌｏｒ　ＬＰ
、　Ｗａｌｂｏｔ　Ｖ　（１９８６午）エレクトロポレ
ーションによる遺伝子転移後のとうもろこしの安定形質
転換。Ｎａｔｕｒｅ　　３１９　ニア９ｌ−７９３ Ｈａｉｎ、Ｒ，，５ｔａｂｅｌ、Ｐ、、Ｃｚｅｒｎｉｌ
ｏｆｓｋｙ、Ａ、Ｐｐ、。

５ｔｅｉｎ　　ｂｉｓｓ、Ｉｔ、Ｈ，、Ｈｅｒｒｅｒａ
−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、Ｌ、。

５ｃｈｅｌｌ、Ｊ、　（１９８５年）植物プロトプラス
トによる選択可能なキメラ遺伝子の取得、組込み、発現
および遺伝子伝達、Ｍｏ１ｅｃ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　
ｌ　９９　：１６１−１６８ Ｈｏｒｓｃｈ　ＲＢ、　Ｆｒｙ　ＪＥ、　Ｈｏｆｆｍａ
ｎｎ　ＮＬ、　Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ　Ｄ。

Ｒｏｇｅｒｓ　ＳＧ、　Ｆｒａｌｅｙ　ＲＴ　（１’ｌ
　８５午）遺伝子を植物中に移植するための簡単で一般
的な方法。

５ｃｉｅｎｃｅ２７７　：　１２２９−１２３１Ｋｒｅ
ｂｓ　ＦＨ，Ｍｏ１ｅｎｄｉｊｋ　Ｌ、　Ｗｕｌｌｅｍ
ｓ　ＧＪ、　５ｃｈｉｌｐｅｒ。

ｏｒｔ　Ｒ＾（１９８２年）　Ｔｉ−プラスミドＤＮＡ
による植物原形質体の試験管形質転換。Ｎａｔｕｒｅ　
２９６：７２−７４ Ｋｏｎｃｚ　Ｃ，５ｃｈｅ目Ｊ（１９８６年）Ｔ［、−
ＤＮＡ遺伝子５のプロモーターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｌ１ｎａｒｙベクターの新奇な種゛力；有す
る共生体内遺伝子の組織に特異な表現を制御する。Ｍｏ
１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９８６年）２０４　：
　３３８−３９６Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ　ＤＭ、　Ｓｋｏ
ｏｇ　Ｆ　（１９６５年）タバコ組織培養の有機的成長
因子要求。Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ１８　：１００
−１２１ ００−ｌ２７　Ｌ、　Ｗｕｌｌｅｍｓ　ＧＪ、　）Ｊｏ
ｌｅｎｄｉｊｋ　Ｌ、　５ｃｈｉｌｐｅｒ。

ｏｒｔ　ＰＲ（１９７９年）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによるＮ１ｃｏｔｉａｎａ
　ｔａｂａｃｕｍからの培養細胞の試験管形質転換。Ｎ
ａｔｕｒｅ　２７７　：　ｌ　２２９　１３１Ｎａｇｙ
　Ｊｌ、　Ｍａｌｉｇａ　Ｐ　（１９７６年）　Ｎ１ｃ
ｏｔｉａｎａＳｙｌｖｅｓｔｒｉｓの葉肉原形質体から
のカルス誘導および植物再生。Ｚ　Ｐｌｆａｎｚｅｎｐ
ｈｙｓｉｏｌ　７８　：　４５３−５５ ０ｔｔｅｎ　ＬＡＢＭ、　５ｃｈｉｐｅｒｏｏｒｔ　Ｒ
Ａ　（１９７８午）ＬｙｐｏｓｉｎおよびＮｏｐａｌｉ
ｎデヒドロゼナーゼ活性の検出のための迅速マイクロス
ケール方法。Ｂｉｏｃｈｉｍｂｉｏｐｈｙｓ　ａｃｔａ
　５２７　：　４９７−５００Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　
Ｊ、　５ｈｉｌｌｉｔｏ　ＲＤ、　５ａｎｌ　Ｍ、　Ｍ
ａｎｄａｋ　Ｖ。

Ｈｏｈｎ　Ｔ、　Ｈｏｈｎ　Ｂ、　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　
ｌ　（１９８４年）植物への直接遺伝子転移。ＥＭＢＯ
Ｊ　３　：　２７１７−２２２ Ｓｈｉｌｌｉｔｏ　ＲＤ、　Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ　Ｊ
、　ＰｏＬｒｙｋｕｓ　１　（１９８３年）アガロース
平板およびビードタイプ培養技術は、数多い植物種中の
プロトプラスト誘導のコロニーの発展を可能にしそして
刺激する。ＰＩＣｅｌｌ　Ｒｅｐ　２　：　２４４　２
４７Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ＥＦ、
　５ａｎｂｒｏｏｋ　Ｊ　ｅｄｓ、　（１９８２午）分
子クローン化、研究室マニュアル。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋａ　Ｊ、　Ｅ、　Ｔｈｏｍｚｉｋａｎｄ　Ｒ，Ｈ
ａｉｎ　（１９８８年）　、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐ
ｕｓ　Ｌ。

中のトリアジン耐性クロロプラストの伝達および分離Ｔ
ｈｅｏｒ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８８年）７６
：１６５−１７１゜ Ｖａｎ　Ｈａｎｔｅ　Ｅ、　Ｊｏｏｓ　Ｈ，Ｍａｅｓ　
Ｍ、　Ｗｏｒｒｅｎ　Ｇ、　ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ　Ｍ
、　５ｃｈｅｌｌ　Ｊ、　（１９８３年）　ｐＢＲ３２
２中クローン化させた制限フラグメントの民間伝達およ
び交換組換え：　ＡｇｒｏｂａｋＬｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ（７）″Ｔ１−プラスミドの逆遺伝現
象に関する新規な戦略。ＥＭＢＯＪ、　　：　２　４１
１−４１７　　Ｖｅｌｔｅｎ　Ｊ。

Ｖｅｌｔｅｎ　Ｌ、　Ｈａｉｎ　Ｒ，５ｈｅｌｌ　Ｊ　
（１９８４年）　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓのＴ１プラスミドからのデュアル植物
プロモーターフラグメントの単離。

ＥＭＢＯＪ　　ｌ　　２　　：　　２７２３−２７３０
Ｖｅｌｔｅｎ　Ｊ、　５ｃｈｅｌｌ　Ｊ　（１９８５年
）高等植物の遺伝的形質転換に用いるための選択表現プ
ラスミド・ベクター。ＮＡＲ１３：　６９８１−６９９
８Ｚ１−６９９８Ｚａ　Ｐ、Ｊｏｏｓ　Ｈ，Ｇｅｎｅｔ
ｅｌｌｏ　Ｃ，ｖａｎ　ＭｏｎｔａｇｕＭ、　５ｃｈｅ
ｌｌ　Ｊ　（１９８３年）通常の再生能力を変えないで
植物細胞へＤＮＡ導入するためのＴｉプラスミド・ベク
ター、ＥＩＪＢＯＪ　　１２　：　２１４３２１５００ Ｂｅｒｎｄ　Ｒｅ１ｓｓ、　Ｒｏｌｆ　Ｓｐｒｅｎｇｅ
ｌ、　Ｈａｎｓ　ＷｉｌｌおよびＨｅ１ｎｚ　５ｃｈａ
ｌｌｅｒ　（１９８４年）粗細胞束中のネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼの定性的および定量的検定のた
めの新規の鋭敏な方法、ＧＥＮＥ１０’８１：２１１−
２１７ Ｐｅｔｅｒ　Ｈ，５ｃｈｒｅｉｅｒ　　Ｅｌｉｓａｂｅ
ｔｈ　Ａ、　５ｅｆｔｏｒＪｏｚｅｒ　５ｃｈｅｌｌお
よび１（ａｎｓ　Ｊ、　Ｂｏｈｎｅｒｔ　（１９８５午
）光調整の合皮を管理する核をコードする配列の使用、
および、異質ｌ；ん白質の植物クロロプラスト中ヘノ輸
送、ＥＮＢＯＪＶｏｌ、　４、ＮＱ、Ｉ：２５３２゜ 下記の公開された特許出願も示す。

ロツパ特許公開＝Ａ　　１１６，７１８０ツバ特許公開
−Ａ　　１５９．４１８０ツバ特許公開−Ａ　　１２０
，５１５０ツバ特許公開−Ａ　　１２０，５１６−ロツ
パ特許公開＝Ａ　　１７２．１１２０ツバ特許公開−Ａ
　　１４０，５５６０ツバ特許公開−Ａ　　１７４，１
６６０ツバ特許公開−Ａ、　　１２２．７９１−ロツバ
特許公開−Ａ　　１２６．５４６−ロツバ特許公開−Ａ
　　１６４．５９７−ロツバ特許公開−Ａ　　１７５，
９６６ＣＴ特許　８４／　０２９１３ ＣＴ特許　８４／　０２９１９ ＣＴ特許　８４／　０２９２０ ＣＴ特許　８３１０１１７６ ０ツバ特許公開＝Ａ　　０．２７０．３５６

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例におけるプラスミドｐＳＲ２
−４における各遺伝子の配置を示す概略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナル
   ペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメ
   ラ遺伝子融合物から成るかまたは菌・かびおよび動物性
   有害生物に対して植物の抵抗力を増大させるために植物
   中にこれらのキメラ遺伝子融合物を有することを特徴と
   するリゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造の使用
   。 ２、ＴＲプロモーター、大麦ａ−アミラーゼのシグナル
   ペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメ
   ラ遺伝子融合物から成るかまたは菌・かびおよび動物性
   有害生物に対して増大した抵抗力を有する植物を作り出
   すための、これらのキメラ遺伝子融合物を有することを
   特徴とするリゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造
   の使用。 ３、非植物性起源のリゾチーム遺伝子を有するリゾチー
   ム遺伝子構造の特許請求の範囲第１または第２項記載の
   使用。 ４、にわとりのアルブミンリゾチーム遺伝子および／ま
   たはＴ４−ファージリゾチーム遺伝子を有するリゾチー
   ム遺伝子構造の特許請求の範囲第１または第２項記載の
   使用。 ５、プラスミドｐＳＲ２−４上に存在するようなリゾチ
   ーム遺伝子構造、或いは、本質的に同様に作用するその
   ＤＮＡ配列の特許請求の範囲第１〜４項記載の使用。 ６、ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナル
   ペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメ
   ラ遺伝子融合物から成るかまたは菌・かびおよび動物性
   有害生物に対する抵抗力を増大させるために植物細胞（
   プロトプラストを含む）および植物（種子および植物の
   部分を含む）を形質転換するための、これらのキメラ遺
   伝子融合物を有することを特徴とするリゾチームを発現
   するリゾチーム遺伝子構造の使用。 ７、ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナル
   ペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメ
   ラ遺伝子融合物から成るか、これらの遺伝子融合物を有
   することを特徴とする、菌・かびおよび動物性有害生物
   に対する増大した抵抗力を有し、そしてゲノム中に１個
   以上のリゾチーム遺伝子構造を有している、形質転換さ
   れた植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種
   子および植物の部分を含む）。 ８、（ａ）ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシ
   グナルペプチド配列および１個以 上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融 合物から成るか、または、これらのキメ ラ遺伝子融合物を有することを特徴とす る、１個以上のリゾチーム遺伝子構造が 植物細胞（プロトプラストを含む）のゲ ノム中に導入され、そして、適宜、 （ｂ）完全に形質転換された植物が、形質転換された植
   物細胞（プロトプラストを含 む）から再生され、そして適宜、 （ｃ）植物（種子を含む）の所望の部分が、結果として
   得られる形質転換された植物 もしくはそれらの子孫から得られる、 ことを特徴とする、特許請求の範囲第７項記載の、菌・
   かびおよび動物性有害生物に対して増大した抵抗力を有
   する形質転換された植物細胞（プロトプラストを含む）
   および植物（種子および植物の部分を含む）を作り出す
   方法。 ９、各場合に、菌・かびおよび動物性有害生物に対して
   増大した抵抗力を有する増殖物質を作り出すため、およ
   び、新規な植物およびそれらの増殖物質を作り出すため
   の、特許請求の範囲第７項記載の、形質転換した植物細
   胞（プロトプラストを含む）および植物（種子および植
   物の部分を含む）の使用。 １０、特許請求の範囲第７項記載の形質転換した植物細
   胞および植物を繁殖させることによつて得ることのでき
   る、菌・かびおよび動物性有害生物に対して増大した抵
   抗力を有する、植物の増殖物質。