JP2002306004A - 植物におけるリゾチーム遺伝子の使用 - Google Patents
植物におけるリゾチーム遺伝子の使用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 植物に有害生物に対する抵抗力を付与するた
めの遺伝子構造物の使用。 【解決手段】 菌・カビおよび動物性有害生物に対して
イネもしくはとうもろこしの抵抗力を増大させるための
リゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造物の使用。
めの遺伝子構造物の使用。 【解決手段】 菌・カビおよび動物性有害生物に対して
イネもしくはとうもろこしの抵抗力を増大させるための
リゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造物の使用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、菌・かびおよび動
物性有害生物に対する植物の抵抗力を増大させるため
の、植物中でのリゾチーム遺伝子構造物の使用に関す
る。
物性有害生物に対する植物の抵抗力を増大させるため
の、植物中でのリゾチーム遺伝子構造物の使用に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】穀物植物の世界の収穫のかなりの部分
が、有害生物によつて常に破壊されている（１９６７年
の潜在的生産高の損失は３５％であつた；Chemistry of
Pesticides，K．H．Buechel 著、John Wiley & Sonc，
New York、１９８３年６頁参照）。従つて、穀物植物に
有害生産が繁殖するのを減少または阻止するために適切
な、全ての可能な手段を研究し、利用すべき緊急な要求
がある。
が、有害生物によつて常に破壊されている（１９６７年
の潜在的生産高の損失は３５％であつた；Chemistry of
Pesticides，K．H．Buechel 著、John Wiley & Sonc，
New York、１９８３年６頁参照）。従つて、穀物植物に
有害生産が繁殖するのを減少または阻止するために適切
な、全ての可能な手段を研究し、利用すべき緊急な要求
がある。
【０００３】国際出願公開 ＷＯ ８９／０４３７１に
は、特定のバクテリアに対する抵抗力を増大させるため
の、特定のリゾチーム遺伝子を有する植物の形質転換が
記述されている。
は、特定のバクテリアに対する抵抗力を増大させるため
の、特定のリゾチーム遺伝子を有する植物の形質転換が
記述されている。
【０００４】
【発明の構成】ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼ
のシグナルペプチド配列および１個以上（好適には１
個）のキメラ遺伝子融合物のリゾチーム遺伝子から成る
か、または、これらのキメラ遺伝子融合物を有すること
を特徴とするリゾチームを発現する１個以上（好適には
１個）のリゾチーム遺伝子構造を、植物のゲノム中に導
入することによつて、菌・かびおよび動物性有害生物に
対して植物の増大した抵抗力が得られることを見い出し
た。
のシグナルペプチド配列および１個以上（好適には１
個）のキメラ遺伝子融合物のリゾチーム遺伝子から成る
か、または、これらのキメラ遺伝子融合物を有すること
を特徴とするリゾチームを発現する１個以上（好適には
１個）のリゾチーム遺伝子構造を、植物のゲノム中に導
入することによつて、菌・かびおよび動物性有害生物に
対して植物の増大した抵抗力が得られることを見い出し
た。
【０００５】従来技術の知識では、本発明に従つて用い
られる遺伝子構造の助けで、病原に対する植物の特に際
立つた抵抗力が達成されたことは驚くべきことであり、
そして、予想ができなかつた。
られる遺伝子構造の助けで、病原に対する植物の特に際
立つた抵抗力が達成されたことは驚くべきことであり、
そして、予想ができなかつた。
【０００６】リゾチームという言葉は、天然にある酵素
ＥＣ３.２.１.１７の群を表わす。例として、にわとり
のアルブミンリゾチームおよびＴ４−フアージリゾチー
ムが挙げられる。
ＥＣ３.２.１.１７の群を表わす。例として、にわとり
のアルブミンリゾチームおよびＴ４−フアージリゾチー
ムが挙げられる。
【０００７】リゾチーム遺伝子は、ＲＮＡに転写されそ
してタンパク質に翻訳された後、リゾチームの公知の性
質を有する酵素の生成を生じる（適切な環境下で）いか
なる核酸（ＤＮＡ）をも意味するとして理解されるもの
とする。
してタンパク質に翻訳された後、リゾチームの公知の性
質を有する酵素の生成を生じる（適切な環境下で）いか
なる核酸（ＤＮＡ）をも意味するとして理解されるもの
とする。
【０００８】リゾチーム遺伝子構造物もしくはそれらの
構成要素は、それらの機能を妨げないか、大きくは妨げ
ない、他のＤＮＡ配列を、例えば、それらの最初の部分
および／または終りの部分に、有することができる。
構成要素は、それらの機能を妨げないか、大きくは妨げ
ない、他のＤＮＡ配列を、例えば、それらの最初の部分
および／または終りの部分に、有することができる。
【０００９】リゾチーム遺伝子およびリゾチーム遺伝子
構造物の他の構成要素は、それらの起源となる有機体の
ゲノム中（リゾチームをコードしないか、そして／また
は非調節配列、例えばイントロン、を含む“ゲノム的”
形態）、に含まれるのと同様の形で、或いは、逆転写酵
素／ポリメラーゼの助けでｍＲＮＡを通して得られる
（そしてもはやイントロンを含まない）ｃＤＮＡ（“コ
ピー”ＤＮＡ）に相当する形で、存在することができ
る。
構造物の他の構成要素は、それらの起源となる有機体の
ゲノム中（リゾチームをコードしないか、そして／また
は非調節配列、例えばイントロン、を含む“ゲノム的”
形態）、に含まれるのと同様の形で、或いは、逆転写酵
素／ポリメラーゼの助けでｍＲＮＡを通して得られる
（そしてもはやイントロンを含まない）ｃＤＮＡ（“コ
ピー”ＤＮＡ）に相当する形で、存在することができ
る。
【００１０】本発明に従つて用いることのできるリゾチ
ーム遺伝子構造物において、ＤＮＡ配列は、本質的に同
様に作用する他のＤＮＡ配列に置き換えることが可能で
ある。
ーム遺伝子構造物において、ＤＮＡ配列は、本質的に同
様に作用する他のＤＮＡ配列に置き換えることが可能で
ある。
【００１１】それらはまた、末端に、特別な遺伝子操作
に適切なＤＮＡ配列（例えば“リンカー”）を有するこ
とができる。
に適切なＤＮＡ配列（例えば“リンカー”）を有するこ
とができる。
【００１２】本発明に従つて用いることのできる好適な
リゾチーム遺伝子構造物は、プラスミドｐＳＲ２−４中
に存在するように、リゾチーム遺伝子に加えて、ＴＲプ
ロモーターおよび大麦α−アミラーゼのシグナルペプチ
ト配列を有するキメラ遺伝子融合物から成るか、或い
は、これらを含んで成る。
リゾチーム遺伝子構造物は、プラスミドｐＳＲ２−４中
に存在するように、リゾチーム遺伝子に加えて、ＴＲプ
ロモーターおよび大麦α−アミラーゼのシグナルペプチ
ト配列を有するキメラ遺伝子融合物から成るか、或い
は、これらを含んで成る。
【００１３】本発明に従う好適なリゾチーム遺伝子構造
物は、にわとりのアルブミンリゾチーム遺伝子および／
またはＴ４−フアージリゾチーム遺伝子を有する。特に
Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子が好ましい。本発明に
従つて用いられる特に好適な遺伝子は、プラスミドｐＳ
Ｒ２−４中に存在するようなＴ４−フアージリゾチーム
遺伝子、並びに、本質的に同様に作用するＤＮＡ配列で
ある。
物は、にわとりのアルブミンリゾチーム遺伝子および／
またはＴ４−フアージリゾチーム遺伝子を有する。特に
Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子が好ましい。本発明に
従つて用いられる特に好適な遺伝子は、プラスミドｐＳ
Ｒ２−４中に存在するようなＴ４−フアージリゾチーム
遺伝子、並びに、本質的に同様に作用するＤＮＡ配列で
ある。
【００１４】ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼの
シグナルペプチト配列およびプラスミドｐＳＲ２−４に
含まれるような、Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子のタ
ンパク質を暗号化する領域のキメラ遺伝子融合物の使用
が、特に強調される。
シグナルペプチト配列およびプラスミドｐＳＲ２−４に
含まれるような、Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子のタ
ンパク質を暗号化する領域のキメラ遺伝子融合物の使用
が、特に強調される。
【００１５】必要ならば、Ｔ４−フアージリゾチーム遺
伝子、ＴＲプロモーターおよび大麦α−アミラーゼのシ
グナルペプチト配列から成るか、或いは、この遺伝子融
合物を有するところの遺伝子融合物を有する配列は、制
限酵素の助けでプラスミドｐＳＲ ２−４から通常の方
法で得られる。
伝子、ＴＲプロモーターおよび大麦α−アミラーゼのシ
グナルペプチト配列から成るか、或いは、この遺伝子融
合物を有するところの遺伝子融合物を有する配列は、制
限酵素の助けでプラスミドｐＳＲ ２−４から通常の方
法で得られる。
【００１６】リゾチーム遺伝子は、遺伝子構造物中に完
全に存在することができる、即ち、それらの自然のまま
の調節部分（特にプロモーター）を有するか、或いは、
タンパク質リゾチームをコードする構造遺伝子の形態で
のみ、存在することができる。
全に存在することができる、即ち、それらの自然のまま
の調節部分（特にプロモーター）を有するか、或いは、
タンパク質リゾチームをコードする構造遺伝子の形態で
のみ、存在することができる。
【００１７】プラスミドｐＳＲ２−４を有する大腸菌株
ＴＢＩ ｐＳＲ２−４を、DeutscheSammlung von Mikroo
rganismen［ドイツ国微生物収集］(ＤＳＭ)、Mascherod
erWeg １ｂ、Ｄ−３３００ Braunschweig、ドイツ連邦
共和国に、特許手続きの目的のための微生物に関するブ
ダペスト条約（the Budapest Convention of Microorga
nisms for the Purpose of Patent Proceedings）の規
定に従つて、寄託し、その受託番号はＤＳＭ５４５５
（寄託日：１９８９年７月２５日）である。
ＴＢＩ ｐＳＲ２−４を、DeutscheSammlung von Mikroo
rganismen［ドイツ国微生物収集］(ＤＳＭ)、Mascherod
erWeg １ｂ、Ｄ−３３００ Braunschweig、ドイツ連邦
共和国に、特許手続きの目的のための微生物に関するブ
ダペスト条約（the Budapest Convention of Microorga
nisms for the Purpose of Patent Proceedings）の規
定に従つて、寄託し、その受託番号はＤＳＭ５４５５
（寄託日：１９８９年７月２５日）である。
【００１８】本発明に従えば、有害生物、特に菌・かび
および動物性有害生物、特に節足動物、例えば昆虫およ
びダニおよびまた線虫に対する抵抗性、或いは、増大し
た抵抗性、を得ることが可能である。これに関連して特
に強調すべきは、植物病原の菌・かびである。
および動物性有害生物、特に節足動物、例えば昆虫およ
びダニおよびまた線虫に対する抵抗性、或いは、増大し
た抵抗性、を得ることが可能である。これに関連して特
に強調すべきは、植物病原の菌・かびである。
【００１９】有害昆虫は、特に次の種類の昆虫である：
直翅目（Orthoptera）、ハサミムシ目（Dermaptera）、
シロアリ目（Isoptera）、アザミウマ目（Thysanopter
a）、半翅目（Heteroptera）、同翅目（Homoptera）、
鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅
目（Hymenoptera）および双翅目（Diptera）。
直翅目（Orthoptera）、ハサミムシ目（Dermaptera）、
シロアリ目（Isoptera）、アザミウマ目（Thysanopter
a）、半翅目（Heteroptera）、同翅目（Homoptera）、
鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅
目（Hymenoptera）および双翅目（Diptera）。
【００２０】有害なダニ類は特に：ホコリダニ（Tarson
emus spp.）、ミカンリンゴハダニ（Panonychus spp.）
およびナミハダニ（Tetranychus spp）である。
emus spp.）、ミカンリンゴハダニ（Panonychus spp.）
およびナミハダニ（Tetranychus spp）である。
【００２１】有害な線虫類は特に：プラチレンカス（Pr
atylenchus spp.,）、ヘテドデラ（Heterodera spp.）
およびメロイドギネ（Meloidogyne spp.）である。
atylenchus spp.,）、ヘテドデラ（Heterodera spp.）
およびメロイドギネ（Meloidogyne spp.）である。
【００２２】植物病原の菌・かびは特に：プラスモジオ
フオロミセテス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（O
omycetes）、キトリジオミセテス（Chytridio‐mycete
s）、接合菌類（Zygomycetes）、嚢子菌類（Ascomycete
s）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全菌類（D
euteromycetes）である。
フオロミセテス（Plasmodiophoromycetes）、卵菌類（O
omycetes）、キトリジオミセテス（Chytridio‐mycete
s）、接合菌類（Zygomycetes）、嚢子菌類（Ascomycete
s）、担子菌類（Basidiomycetes）および不完全菌類（D
euteromycetes）である。
【００２３】上に示した属名の範中に含まれる菌・かび
による病気の原因となるいくつかの病原菌を例示する
が、これによつて限定されるものではない：ピチウム
（Pythium）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythium ultimu
m）；フイトフトラ（Phytophthola）種、例えば疫病（P
hytophthora infestans）；プソイドペロノスポラ（Pse
odoperonospora）種、例えばべと病（Pseudoperonospor
a humuli 又はPseudoperonospora cubense）；プラスモ
パラ（Plasmopara）種、例えばべと病（Plasmopara vit
icola)；ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病(Pe
ronospora pisi又はPeronospora brassicae); エリシ
フエ（Erysiphe）種、例えばうどんこ病（Erysiphe gra
minis）；スフアエロテカ（Sphaerotheca）種、例えば
うどんこ病（Sphaero-theca fuliginea）；ポドスフエ
ラ（Podosphaera）種、例えばうどんこ病（Podosphaera
leucotricha）；ベンチユリア（Venturia）種、例えば
黒星病（Venturia inaequalis）；ピレノホラ（Pyrenop
hora）種、例えば網斑病（Pyrenophora teres又はPyren
ophora graminea)(分生胞子器型：Drechslera、同義：H
elminthosporium）；コクリオボルス（Cochliobolus）
種、例えば斑点病（Cochliobolus sativus） （分生胞子器型：Drechslera、同義：Helminthosporiu
m）；ウロミセス（Uromyces）種、例えばさび病（Uromy
ces appendiculatus）；プシニア（Puccinia）種、例え
ば赤さび病（Puccinia recondita）；ふすべ菌属（Till
etia）種、例えば網なまぐさ黒穂病（Tilletia carie
s）；黒穂病（Ustilago）種、例えば裸黒穂病（Ustilag
o nuda又はUstillago avenae）；ペリキユラリア（Pell
icularia）種、例えば紋枯病（Pellicularia sasaki
i）；ピリキユラリア（Pyricularia）種、例えばいもち
病（Pyricularia oryzae）；フーザリウム（Fusarium）
種、例えばフーザリウム・クルモルム（Fusarium culmo
rum）；灰色かび属（Botrytis）種、例えば灰色かび病
（Botrytis cinerea）；セプトリア（Septoria）種、例
えばふ枯病（Septoria nodorum）；レプトスフエリア
（Leptosphaeria）種、例えばレプトスフエリア・ノド
ルム（Leptosphaeria nodorum）；セルコスポラ（Cerco
spora）種、例えばセルコスポラ・カネセンス（Cercosp
ora canescens）； アルテルナリア（Alternaria）
種、例えば黒斑病（Alternaria brassicae）及びプソイ
ドセルコスポレラ(Pseudocercosporella)種、例えばプ
ソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Pseudoce
rcosporella herpotricho ides）。
による病気の原因となるいくつかの病原菌を例示する
が、これによつて限定されるものではない：ピチウム
（Pythium）種、例えば苗立ち枯れ病（Pythium ultimu
m）；フイトフトラ（Phytophthola）種、例えば疫病（P
hytophthora infestans）；プソイドペロノスポラ（Pse
odoperonospora）種、例えばべと病（Pseudoperonospor
a humuli 又はPseudoperonospora cubense）；プラスモ
パラ（Plasmopara）種、例えばべと病（Plasmopara vit
icola)；ツユカビ（Peronospora）種、例えばべと病(Pe
ronospora pisi又はPeronospora brassicae); エリシ
フエ（Erysiphe）種、例えばうどんこ病（Erysiphe gra
minis）；スフアエロテカ（Sphaerotheca）種、例えば
うどんこ病（Sphaero-theca fuliginea）；ポドスフエ
ラ（Podosphaera）種、例えばうどんこ病（Podosphaera
leucotricha）；ベンチユリア（Venturia）種、例えば
黒星病（Venturia inaequalis）；ピレノホラ（Pyrenop
hora）種、例えば網斑病（Pyrenophora teres又はPyren
ophora graminea)(分生胞子器型：Drechslera、同義：H
elminthosporium）；コクリオボルス（Cochliobolus）
種、例えば斑点病（Cochliobolus sativus） （分生胞子器型：Drechslera、同義：Helminthosporiu
m）；ウロミセス（Uromyces）種、例えばさび病（Uromy
ces appendiculatus）；プシニア（Puccinia）種、例え
ば赤さび病（Puccinia recondita）；ふすべ菌属（Till
etia）種、例えば網なまぐさ黒穂病（Tilletia carie
s）；黒穂病（Ustilago）種、例えば裸黒穂病（Ustilag
o nuda又はUstillago avenae）；ペリキユラリア（Pell
icularia）種、例えば紋枯病（Pellicularia sasaki
i）；ピリキユラリア（Pyricularia）種、例えばいもち
病（Pyricularia oryzae）；フーザリウム（Fusarium）
種、例えばフーザリウム・クルモルム（Fusarium culmo
rum）；灰色かび属（Botrytis）種、例えば灰色かび病
（Botrytis cinerea）；セプトリア（Septoria）種、例
えばふ枯病（Septoria nodorum）；レプトスフエリア
（Leptosphaeria）種、例えばレプトスフエリア・ノド
ルム（Leptosphaeria nodorum）；セルコスポラ（Cerco
spora）種、例えばセルコスポラ・カネセンス（Cercosp
ora canescens）； アルテルナリア（Alternaria）
種、例えば黒斑病（Alternaria brassicae）及びプソイ
ドセルコスポレラ(Pseudocercosporella)種、例えばプ
ソイドセルコスポレラ・ヘルポトリコイデス（Pseudoce
rcosporella herpotricho ides）。
【００２４】更にヘルミンチトスポリウム カルボナム
（Helminthosporium carbonum）が挙げられる。
（Helminthosporium carbonum）が挙げられる。
【００２５】本発明に従えば、実質的にすべての植物に
上記の有害生物に対する抵抗力もしくは増大した抵抗力
を与えることが可能である。当然のことながら、穀物植
物中、例えば、もみの木類、えぞ松類、ドーグラシアス
（douglasias）、松類、から松類、ぶな類およびオーク
類のような森林植物、並びに例えば穀物類（特に小麦、
ライ麦、大麦、からす麦、きび、米およびとうもろこ
し）、じやがいも類、豆類、大豆類、落花生類、野菜類
（特にキヤベツ種およびトマト類）、くだもの（特にり
んご、西洋なし、さくらんぼ、ぶどう、かんきつ類、パ
イナツプルおよびバナナ）、油やし、紅茶、ココアおよ
びコーヒー低木、タバコ、サイザル麻および綿のような
食料品および原料を作り出す植物中、そして例えばラウ
オルフイア（Rauwolfia）およびジギタリスのような薬
用植物中に、抵抗力を作り出すことへの特別な要求があ
る。
上記の有害生物に対する抵抗力もしくは増大した抵抗力
を与えることが可能である。当然のことながら、穀物植
物中、例えば、もみの木類、えぞ松類、ドーグラシアス
（douglasias）、松類、から松類、ぶな類およびオーク
類のような森林植物、並びに例えば穀物類（特に小麦、
ライ麦、大麦、からす麦、きび、米およびとうもろこ
し）、じやがいも類、豆類、大豆類、落花生類、野菜類
（特にキヤベツ種およびトマト類）、くだもの（特にり
んご、西洋なし、さくらんぼ、ぶどう、かんきつ類、パ
イナツプルおよびバナナ）、油やし、紅茶、ココアおよ
びコーヒー低木、タバコ、サイザル麻および綿のような
食料品および原料を作り出す植物中、そして例えばラウ
オルフイア（Rauwolfia）およびジギタリスのような薬
用植物中に、抵抗力を作り出すことへの特別な要求があ
る。
【００２６】既に提案したように、リゾチーム遺伝子構
造物が、本発明に従つて、１個以上のコピーで（ゲノム
の同じ座、或いは、違つた座に）、天然植物ゲノム中に
導入される。既にリゾチーム合成可能な植物では、１個
以上の追加的、選択的“異質の”リゾチーム遺伝子を導
入することによつて、著しく増大した抵抗作用が生じ得
る。
造物が、本発明に従つて、１個以上のコピーで（ゲノム
の同じ座、或いは、違つた座に）、天然植物ゲノム中に
導入される。既にリゾチーム合成可能な植物では、１個
以上の追加的、選択的“異質の”リゾチーム遺伝子を導
入することによつて、著しく増大した抵抗作用が生じ得
る。
【００２７】既に記述したように、本発明に従つて形質
転換された植物細胞および植物の増大した抵抗力は、農
業および林業、観賞用植物および薬用植物の生産、そし
て植物の品種改良において、重要である。例えば、薬学
的に有用な物質を得る目的で植物細胞を培養する時に、
特に菌・かびに対して増大した抵抗性を有する植物細胞
を利用できるのはまた、優位である。
転換された植物細胞および植物の増大した抵抗力は、農
業および林業、観賞用植物および薬用植物の生産、そし
て植物の品種改良において、重要である。例えば、薬学
的に有用な物質を得る目的で植物細胞を培養する時に、
特に菌・かびに対して増大した抵抗性を有する植物細胞
を利用できるのはまた、優位である。
【００２８】本発明はそれ故また、（ａ） ＴＲプロモ
ーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列お
よび１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物
から成るか、または、これらのキメラ遺伝子融合物を含
んでなる１個以上のリゾチーム遺伝子構造物が、植物細
胞（プロトプラストを含む）のゲノム中に導入され、そ
して、適宜、（ｂ） 完全に形質転換された植物が、形
質転換された植物細胞（プロトプラストを含む）から再
生され、そして適宜、（ｃ） 植物（種子を含む）の所
望の部分が、結果として得られる形質転換された植物も
しくはそれらの子孫から得られる、ことを特徴とする、
菌・かびおよび動物性有害生物に対して増大された抵抗
力を有する形質転換された植物細胞（プロトプラストを
含む）および植物体（種子および植物の部分を含む）を
作り出す方法に関する。
ーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列お
よび１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物
から成るか、または、これらのキメラ遺伝子融合物を含
んでなる１個以上のリゾチーム遺伝子構造物が、植物細
胞（プロトプラストを含む）のゲノム中に導入され、そ
して、適宜、（ｂ） 完全に形質転換された植物が、形
質転換された植物細胞（プロトプラストを含む）から再
生され、そして適宜、（ｃ） 植物（種子を含む）の所
望の部分が、結果として得られる形質転換された植物も
しくはそれらの子孫から得られる、ことを特徴とする、
菌・かびおよび動物性有害生物に対して増大された抵抗
力を有する形質転換された植物細胞（プロトプラストを
含む）および植物体（種子および植物の部分を含む）を
作り出す方法に関する。
【００２９】菌・かびおよび動物性有害生物に対する増
大した抵抗力を有し、１個以上のリゾチーム遺伝子構造
物を有する、形質転換した植物細胞（プロトプラストを
含む）および植物（種子および植物の部分を含む）、並
びに、上記の方法により得ることができるこれらの形質
転換された植物細胞および植物は、また、本発明の主題
である。
大した抵抗力を有し、１個以上のリゾチーム遺伝子構造
物を有する、形質転換した植物細胞（プロトプラストを
含む）および植物（種子および植物の部分を含む）、並
びに、上記の方法により得ることができるこれらの形質
転換された植物細胞および植物は、また、本発明の主題
である。
【００３０】本発明の部分はまた（ａ） ＴＲプロモー
ター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列およ
び１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物か
ら成るか、これらのキメラ遺伝子融合物を含んでなるリ
ゾチーム遺伝子構造物の使用、および、菌・かびおよび
動物性有害生物に対して増大した抵抗力をもたらすとこ
ろの植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種
子および植物の部分を含む）を形質転換するための、ベ
クター、および、リゾチーム遺伝子構造物を含む、本発
明に従う形質転換された微生物の使用、並びに、（ｂ）
増殖物質を作り出すため、新規な植物およびその増殖
物質を作り出すための、本発明による形質転換された植
物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種子およ
び植物の部分を含む）の使用および、当然のことなが
ら、（ｃ） 特別な抵抗性を増大させることによる、菌
・かびおよび動物性有害生物を駆除し、制御するための
リゾチーム遺伝子構造物の使用。
ター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列およ
び１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物か
ら成るか、これらのキメラ遺伝子融合物を含んでなるリ
ゾチーム遺伝子構造物の使用、および、菌・かびおよび
動物性有害生物に対して増大した抵抗力をもたらすとこ
ろの植物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種
子および植物の部分を含む）を形質転換するための、ベ
クター、および、リゾチーム遺伝子構造物を含む、本発
明に従う形質転換された微生物の使用、並びに、（ｂ）
増殖物質を作り出すため、新規な植物およびその増殖
物質を作り出すための、本発明による形質転換された植
物細胞（プロトプラストを含む）および植物（種子およ
び植物の部分を含む）の使用および、当然のことなが
ら、（ｃ） 特別な抵抗性を増大させることによる、菌
・かびおよび動物性有害生物を駆除し、制御するための
リゾチーム遺伝子構造物の使用。
【００３１】リゾチーム遺伝子構造物を植物の遺伝物
質、または植物細胞、の中に導入するために利用でき
る、数多くの種々の方法がある。遺伝子は、一般的な通
常の公知の方法で移すことが可能で、そして、当業者に
よつて、各場合とも難なく、この方法は適切であること
がわかる。
質、または植物細胞、の中に導入するために利用でき
る、数多くの種々の方法がある。遺伝子は、一般的な通
常の公知の方法で移すことが可能で、そして、当業者に
よつて、各場合とも難なく、この方法は適切であること
がわかる。
【００３２】アグロバクテリウム・ツメフアシエンス
（Agrobacterium tumefaciences）のＴｉ−プラスミド
は、異質なＤＮＡを、双子葉植物および単子葉植物のゲ
ノム中に移すために、特に好適でそして広く用いられる
ベクターとして利用され得る。リゾチーム遺伝子構造物
が、適切なＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ中に導入（例
えばZanbryski他、１９８３年）され、そして、植物を
感染させるか、葉盤を感染させるか、或いは、アグロバ
クテリウム・ツメフアシエンスとプロトプラストとを共
培養することによつて、移される。
（Agrobacterium tumefaciences）のＴｉ−プラスミド
は、異質なＤＮＡを、双子葉植物および単子葉植物のゲ
ノム中に移すために、特に好適でそして広く用いられる
ベクターとして利用され得る。リゾチーム遺伝子構造物
が、適切なＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ中に導入（例
えばZanbryski他、１９８３年）され、そして、植物を
感染させるか、葉盤を感染させるか、或いは、アグロバ
クテリウム・ツメフアシエンスとプロトプラストとを共
培養することによつて、移される。
【００３３】別法として、リゾチーム遺伝子構造物を、
多陽イオン、或いは、カルシウム塩類とポリエチレング
リコールの存在下で、プロトプラスト質体と一緒に培養
することができる（例えばDavey他、１９８０年；Hain
他、１９８５年；Krens他、１９８２年；Paszkowski
他、１９８４年）。
多陽イオン、或いは、カルシウム塩類とポリエチレング
リコールの存在下で、プロトプラスト質体と一緒に培養
することができる（例えばDavey他、１９８０年；Hain
他、１９８５年；Krens他、１９８２年；Paszkowski
他、１９８４年）。
【００３４】ＤＮＡの取り込みは、また電場（エレクト
ロポレーシヨン）によつて追加的に促進され得る（例え
ばFromm 他、１９８６年）。
ロポレーシヨン）によつて追加的に促進され得る（例え
ばFromm 他、１９８６年）。
【００３５】ＤＮＡはまた、物理的に加速したＤＮＡを
担持する粒子で、花粉に衝撃を与えることによつて、植
物の花粉から公知の方法で導入され得る（ＥＰ−Ａ ０.
２７０,３５６参照）。
担持する粒子で、花粉に衝撃を与えることによつて、植
物の花粉から公知の方法で導入され得る（ＥＰ−Ａ ０.
２７０,３５６参照）。
【００３６】植物は、適切な培養基の助けで公知の方法
によつて再生される（例えばNagyおよびMaliga、１９７
６年）。
によつて再生される（例えばNagyおよびMaliga、１９７
６年）。
【００３７】例えば、通常の方法（例えばVan Haute
他、１９８３年）で、プラスミドｐＳＲ２−４は、例え
ばｐＧＶ３８５０；もしくはそれらの誘導体（Zambrysk
i他、１９８３年）を有するアグロバクテリウム・ツメ
フアシエンスに移され得る。形質転換の成功は、ノパリ
ン（nopalin）もしくはＮＰＴ（II）を検出することに
よつて調べることができる。また、リゾチーム遺伝子構
造物はバイナリーベクター（例えばKonczおよびSchel
l、１９８６年）中で無性生殖させられ、上述のように
適切なアグロバクテリウム種に移される（KonczおよびS
chell、１９８６年）。植物に移すことができる形態と
なつたリゾチーム遺伝子構造物を有する結果として得ら
れるアグロバクテリウム種は、植物を形質転換するため
に更に用いられる。
他、１９８３年）で、プラスミドｐＳＲ２−４は、例え
ばｐＧＶ３８５０；もしくはそれらの誘導体（Zambrysk
i他、１９８３年）を有するアグロバクテリウム・ツメ
フアシエンスに移され得る。形質転換の成功は、ノパリ
ン（nopalin）もしくはＮＰＴ（II）を検出することに
よつて調べることができる。また、リゾチーム遺伝子構
造物はバイナリーベクター（例えばKonczおよびSchel
l、１９８６年）中で無性生殖させられ、上述のように
適切なアグロバクテリウム種に移される（KonczおよびS
chell、１９８６年）。植物に移すことができる形態と
なつたリゾチーム遺伝子構造物を有する結果として得ら
れるアグロバクテリウム種は、植物を形質転換するため
に更に用いられる。
【００３８】好適な具体例として、単離されたプラスミ
ドｐＳＲ２−４が、直接的遺伝子転移による通常の方法
で植物プロトプラストに転移される（例えばHain他、１
９８５年）。この方法では、プラスミドは、環状、しか
し好適には直線状、の形態で存在できる。
ドｐＳＲ２−４が、直接的遺伝子転移による通常の方法
で植物プロトプラストに転移される（例えばHain他、１
９８５年）。この方法では、プラスミドは、環状、しか
し好適には直線状、の形態で存在できる。
【００３９】プラスミドｐＳＲ２−４が、レポーター遺
伝子と共に用いられる場合、カナマイシン耐性プロトプ
ラストが、リゾチームの発現について試験される。
伝子と共に用いられる場合、カナマイシン耐性プロトプ
ラストが、リゾチームの発現について試験される。
【００４０】形質転換（遺伝子導入）した植物、もしく
は植物細胞は、例えばリーフディスク形質転換（例えば
Horsch他１９８５年）、再生する植物プロトプラストも
しくは細胞培養をアグロバクテリウム・ツメフアシエン
スと共培養すること（例えばMarton他１９７９年、Hain
他１９８５年）、或いは、直接ＤＮＡ−トランスフエク
シヨンすること、による公知の方法で調製される。結果
として得られる形質転換された植物は、試験管中でのレ
ポーター遺伝子の発現についての選択、例えばカナマイ
シンスルフエートのリン酸化（Reis他、１９８４年；Sc
hreier他１９８５年）によるか、或いは、ノパリン（no
palin）シンターゼの発現（Aerts他、１９８３年に従
う）によるか、または、ノーザンブロツト分析とウエス
ターンブロツト分析によるリゾチームの発現によつて、
検出される。形質転換した植物のリゾチームは、特別な
抗体を用いる公知の方法で検出することも可能である。
は植物細胞は、例えばリーフディスク形質転換（例えば
Horsch他１９８５年）、再生する植物プロトプラストも
しくは細胞培養をアグロバクテリウム・ツメフアシエン
スと共培養すること（例えばMarton他１９７９年、Hain
他１９８５年）、或いは、直接ＤＮＡ−トランスフエク
シヨンすること、による公知の方法で調製される。結果
として得られる形質転換された植物は、試験管中でのレ
ポーター遺伝子の発現についての選択、例えばカナマイ
シンスルフエートのリン酸化（Reis他、１９８４年；Sc
hreier他１９８５年）によるか、或いは、ノパリン（no
palin）シンターゼの発現（Aerts他、１９８３年に従
う）によるか、または、ノーザンブロツト分析とウエス
ターンブロツト分析によるリゾチームの発現によつて、
検出される。形質転換した植物のリゾチームは、特別な
抗体を用いる公知の方法で検出することも可能である。
【００４１】形質転換された植物細胞は、特に適切な培
養基の助けで、一般的に常用されている方法を用いて培
養され、完全な植物に再生される。
養基の助けで、一般的に常用されている方法を用いて培
養され、完全な植物に再生される。
【００４２】形質転換された植物細胞、並びに、リゾチ
ームを有する形質転換された植物は、植物病原性の菌・
かびおよび動物性有害生物、特に昆虫、だに、および線
虫、に対して相当に改良された抵抗力を示す。
ームを有する形質転換された植物は、植物病原性の菌・
かびおよび動物性有害生物、特に昆虫、だに、および線
虫、に対して相当に改良された抵抗力を示す。
【００４３】本発明に関して“植物”という言葉は、完
全な植物ばかりでなく植物体の部分、例えば葉、種子、
塊茎、切り枝などを示す。“植物細胞”は、プロトプラ
スト、細胞系、植物カルスなどを含む。“増殖物質"は、
形質転換させた植物および植物細胞を繁殖させるために
用いられる植物および植物細胞を示す。
全な植物ばかりでなく植物体の部分、例えば葉、種子、
塊茎、切り枝などを示す。“植物細胞”は、プロトプラ
スト、細胞系、植物カルスなどを含む。“増殖物質"は、
形質転換させた植物および植物細胞を繁殖させるために
用いられる植物および植物細胞を示す。
【００４４】本文中“本質的に同様に作用するＤＮＡ配
列”という言葉は、本発明にはまた、リゾチーム遺伝子
もしくはその部分の機能がリゾチームをもはや形成しな
いか、或いは、調節遺伝子部分がもはや有効でなくなる
程には影響を受けないような、改変も含まれることを意
味している。適当な改変は、ＤＮＡ配列、個々のコドン
および／または個々の核酸を置き換えるか、加えるか、
および／または除くかすることで行なわれ得る。
列”という言葉は、本発明にはまた、リゾチーム遺伝子
もしくはその部分の機能がリゾチームをもはや形成しな
いか、或いは、調節遺伝子部分がもはや有効でなくなる
程には影響を受けないような、改変も含まれることを意
味している。適当な改変は、ＤＮＡ配列、個々のコドン
および／または個々の核酸を置き換えるか、加えるか、
および／または除くかすることで行なわれ得る。
【００４５】本発明に従つて用いられる微生物における
“突然変異体”は、本発明を実施するのに必須な特徴を
いまだ有している改変された微生物、特に特定のプラス
ミド、を示す。
“突然変異体”は、本発明を実施するのに必須な特徴を
いまだ有している改変された微生物、特に特定のプラス
ミド、を示す。
【００４６】下記の例示する具体例は、本発明をより詳
細に具体的に説明することを意図したものである。 １．用いたプラスミド構造ｐＳＲ２−４に関する記述
（第１図参照） プラスミドｐＳＲ２−４は、ＴＲプロモーター（Velten
他、１９８４年）、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チド配列およびＴ４−フアージリゾチーム遺伝子のたん
白質をコードする領域（K.Durring、博士論文、Cologne
大学、１９８８年）からの、表現ベクターｐＡＰ２０３
４（VeltenおよびSchell、１９８５年）中に組み込まれ
たキメラ遺伝子融合物を有するプラスミドｐＳＲ２−４
の大きさは９.３Kbである。第１図プラスミドｐＳＲ２−
４（９.３Kb）は下記のように示される： ｐＴR ＝ Ａ．ツメフアシエンスからのデユアル植物プ
ロモーター ｏｃｓ ｐＡ ＝ オクトピンシンターのポリアデニレー
シヨン配列領域 ＫｍR ＝ カナマイシン耐性遺伝子、植物中で活性 ｇ７ｐＡ ＝ アグロバクテリウム遺伝子７のポリアデニ
レーシヨン領域 ＣｂR ＝ カルブペニシリン耐性遺伝子 ＳｍR ＝ ストレプトマイシン耐性遺伝子 ＳｐR ＝ スペクトマイシン耐性遺伝子 線影の部分 ＝ 大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド
配列 ｌｙｓ ＝ Ｔ４−フアージリゾチームをコードする配列 以下に記述する方法に従つて、リゾチーム遺伝子構造物
を、例えばタバコおよびじやがいも中に移植した。
細に具体的に説明することを意図したものである。 １．用いたプラスミド構造ｐＳＲ２−４に関する記述
（第１図参照） プラスミドｐＳＲ２−４は、ＴＲプロモーター（Velten
他、１９８４年）、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チド配列およびＴ４−フアージリゾチーム遺伝子のたん
白質をコードする領域（K.Durring、博士論文、Cologne
大学、１９８８年）からの、表現ベクターｐＡＰ２０３
４（VeltenおよびSchell、１９８５年）中に組み込まれ
たキメラ遺伝子融合物を有するプラスミドｐＳＲ２−４
の大きさは９.３Kbである。第１図プラスミドｐＳＲ２−
４（９.３Kb）は下記のように示される： ｐＴR ＝ Ａ．ツメフアシエンスからのデユアル植物プ
ロモーター ｏｃｓ ｐＡ ＝ オクトピンシンターのポリアデニレー
シヨン配列領域 ＫｍR ＝ カナマイシン耐性遺伝子、植物中で活性 ｇ７ｐＡ ＝ アグロバクテリウム遺伝子７のポリアデニ
レーシヨン領域 ＣｂR ＝ カルブペニシリン耐性遺伝子 ＳｍR ＝ ストレプトマイシン耐性遺伝子 ＳｐR ＝ スペクトマイシン耐性遺伝子 線影の部分 ＝ 大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド
配列 ｌｙｓ ＝ Ｔ４−フアージリゾチームをコードする配列 以下に記述する方法に従つて、リゾチーム遺伝子構造物
を、例えばタバコおよびじやがいも中に移植した。
【００４７】既に上に説明したように、容易に単離され
得る形態で、プラスミドｐＳＲ２−４を有する大腸菌株
ＴＢＩ ｐＳＲ２−４がDeutsche Sammlung von Mikroor
ganismen（ドイツ国微生物収集）に寄託されている。 ２．タバコの形質転換 ａ）タバコ苗条培養およびタバコプロトプラストの単
離：ニコチアナタバキユム（Nicotiana tabacum）（Pet
it Havanna ＳＲ１）は、ホルモンの入つていないＬＳ
培地（Linsmaier and Skoog １９６５年）上に苗条無菌
培養として増殖させる。苗条培養は、約６〜８週間の間
隔で新鮮なＬＳ培地に移植する。苗条培養を２４〜２６
℃、１２時間光（１０００〜３０００ルツクス）で、成
長キヤビネツト中に保存した。葉のプロトプラストを単
離するために、約２ｇの葉（長さ約３〜５cm）を、新し
いかみそりの刃を使用して、小片に切断する。この葉の
物質を、Ｋ３培地（Nagy and Maliga １９７６年）、
０.４ｍサツカロース、pH５.６、２％のゼルラーゼ（Ze
llulase）Ｒ１０（Servaによる）および０.５％のマセ
ロチム（Macerozym）Ｒ１０（Servaによる）を含有する
酵素溶液２０ml中、室温で１４〜１６時間培養する。こ
の後、プロトプラストを０.３０mmと０.１mmのスチール
製ふるい上で濾過することによつて、細胞の断片から分
離する。濾液を１０分間１００×ｇで遠心分離する。こ
の遠心分離中、損傷を受けていないプロトプラストが浮
遊し、そして酵素溶液の上部の端に帯状に集まる。細胞
の破片のペレツトおよび酵素溶液をガラスキヤピラリー
で吸引することによつて除去する。予め洗浄したプロト
プラストを、新鮮なＫ３培地（浸透性の活性剤として
０.４Ｍサツカロース）で１０mlとし、再び浮遊させ
る。洗浄培地を除去し、培養または引き続くアグロバク
テリアによる感染（コカルチヤーのため１−２×１０5
／mlに希釈する。プロトプラスト濃度を血球計算盤中で
測定する。 ｂ）アグロバクテリウム・ツメフアシエンスとのコカル
チヤーによる再生タバコプロトプラストの形質転換：以
下では、Marton他、１９７９年の方法を若干修正した方
法を用いた。プロトプラストを上述したように単離し、
Ｋ３培地（０.４Ｍサツカロース、０.１mg／１ ＮＡ
Ａ、０.２mgのキネチン）中１−２×１０5／mlの密度
で、暗所で２日間そして２６℃で弱い光（５００ルツク
ス）の下、１〜２日間培養する。最初の原形質分裂が生
じるとすぐ、最少Ａ（Ａｍ）培地中のアグロバクテリウ
ム懸濁液（密度、約１０9アグロバクテリア／ml）の３
０μｌを、３mlの再生プロトプラストに加える。同時培
養期間は、暗所で２０℃、３〜４日である。この後、た
ばこ細胞を１２mlの遠心分離管に移し、海水（６００ m
Osm／kg）で１０mlに希釈し、６０×ｇで１０分間ペレ
ツト状にした。この洗浄工程を１〜２回更に繰り返し
て、ほとんどのアグロバクテリアを除去する。細胞懸濁
液を５×１０4／mlの密度で、１mg／ｌ ＮＡＡ（ナフチ
ル−１−酢酸）、０.２mg／ｌケネチン、および５００m
g／ｌのセフアロスポリン抗生物質のセフオタキシム（C
efotaxime）と共に、Ｋ３培地（０.３ｍサツカロース）
中で培養する。各週、細胞懸濁液を新鮮なＫ３培地で希
釈し、培地の浸透価を、コカルチヤー後２〜３週間、週
当りサツカロースを０.０５ｍ(約６０mOsm／kg）づつ徐
々に減らし、カナマイシンを用いた希釈（１００mg／ｌ
カナマイシンサルフエート）（Sigmaによる）、６６０m
g／ｇの活性カナマイシン）をアグロースービードータ
イプ培養（Shillito他、１９８３年）中で開始する。カ
ナマイシン−耐性のコロニーが、背景の遅れたコロニー
からの選択が始まつた後３〜４週間で、区別される。 ｃ）ＤＮＡを用いたタバコプロトプラストの直接形質転
換、硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質転換 １８０μｌのＫ３培地中の約１０6プロトプラストを、
ペトリ皿中でμｌ当り０.５μｇのｐＳＲ２−４を含有
するＯＮＡ水溶液２０μｌと一緒に注意深く混合する。
２００μの融合溶液（０.１Ｍの硝酸カルシウム、０.４
５Ｍのマンニトールおよび２５％のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ６０００）、pH９）を、続いて注意深く加
える。１５分後、５mlの洗浄溶液（０.２７５Ｍの硝酸
カルシウム、pH６）を加え、そして、更に５分後、遠心
分離管にプロトプラストを移し、６０×ｇでペレツト状
にする。このペレツトを少量のＫ３培地中に摂取し、次
章に記述するように培養する。二者択一的に、プロトプ
ラストはHain他、１９８５年の方法で形質転換され得
る。 ｄ）ＤＮＡで培養したプロトプラストの培養およびカナ
マイシン−耐性のカルスの選択 修正“ビードータイプ培養”技術（Shilito他１９８３
年）をこの培養に用い、カナマイシン耐性コロニーの選
択を下記に示す。ＤＮＡでプロトプラストを処理した後
１週間後（Ｃ参照）、この細胞懸濁液３mlを、５cmのペ
トリ皿中で、３mlのＫ３培地（０.３Ｍのサツカロース
＋ホルモン類；１.２％の（Seaplaque）ＬＭＴ Agarose
（低融点のアガロース、Marine Colloidsによる）と一
緒に混合する。この目的のため、乾燥アガロースを加圧
滅菌し、Ｋ３培地を加えた後、この混合物を極超短波中
で短時間沸騰させる。アガロースが固化した後、アガロ
ース盤（ビード）を包埋したタバコミクロカルスと一緒
に、次の培養および選択のために１０cmのペトリ皿に移
し、各場合共、１０mlのＫ３培地（０.３Ｍのサツカロ
ース、１mg／ｌのＮＡＡ、０.２mg／ｌのキネチンおよ
び１００mg／ｌのカナマイシンスルフエート、Sigmaに
よる）を加える。この液状の培地を毎週交換する。この
処置の間に、培地の浸透価は次第に降下する。交換培地
（Ｋ３＋ｋｍ）を毎週サツカロース０.０５Ｍ（約６０m
Osm）づつ減らす。
得る形態で、プラスミドｐＳＲ２−４を有する大腸菌株
ＴＢＩ ｐＳＲ２−４がDeutsche Sammlung von Mikroor
ganismen（ドイツ国微生物収集）に寄託されている。 ２．タバコの形質転換 ａ）タバコ苗条培養およびタバコプロトプラストの単
離：ニコチアナタバキユム（Nicotiana tabacum）（Pet
it Havanna ＳＲ１）は、ホルモンの入つていないＬＳ
培地（Linsmaier and Skoog １９６５年）上に苗条無菌
培養として増殖させる。苗条培養は、約６〜８週間の間
隔で新鮮なＬＳ培地に移植する。苗条培養を２４〜２６
℃、１２時間光（１０００〜３０００ルツクス）で、成
長キヤビネツト中に保存した。葉のプロトプラストを単
離するために、約２ｇの葉（長さ約３〜５cm）を、新し
いかみそりの刃を使用して、小片に切断する。この葉の
物質を、Ｋ３培地（Nagy and Maliga １９７６年）、
０.４ｍサツカロース、pH５.６、２％のゼルラーゼ（Ze
llulase）Ｒ１０（Servaによる）および０.５％のマセ
ロチム（Macerozym）Ｒ１０（Servaによる）を含有する
酵素溶液２０ml中、室温で１４〜１６時間培養する。こ
の後、プロトプラストを０.３０mmと０.１mmのスチール
製ふるい上で濾過することによつて、細胞の断片から分
離する。濾液を１０分間１００×ｇで遠心分離する。こ
の遠心分離中、損傷を受けていないプロトプラストが浮
遊し、そして酵素溶液の上部の端に帯状に集まる。細胞
の破片のペレツトおよび酵素溶液をガラスキヤピラリー
で吸引することによつて除去する。予め洗浄したプロト
プラストを、新鮮なＫ３培地（浸透性の活性剤として
０.４Ｍサツカロース）で１０mlとし、再び浮遊させ
る。洗浄培地を除去し、培養または引き続くアグロバク
テリアによる感染（コカルチヤーのため１−２×１０5
／mlに希釈する。プロトプラスト濃度を血球計算盤中で
測定する。 ｂ）アグロバクテリウム・ツメフアシエンスとのコカル
チヤーによる再生タバコプロトプラストの形質転換：以
下では、Marton他、１９７９年の方法を若干修正した方
法を用いた。プロトプラストを上述したように単離し、
Ｋ３培地（０.４Ｍサツカロース、０.１mg／１ ＮＡ
Ａ、０.２mgのキネチン）中１−２×１０5／mlの密度
で、暗所で２日間そして２６℃で弱い光（５００ルツク
ス）の下、１〜２日間培養する。最初の原形質分裂が生
じるとすぐ、最少Ａ（Ａｍ）培地中のアグロバクテリウ
ム懸濁液（密度、約１０9アグロバクテリア／ml）の３
０μｌを、３mlの再生プロトプラストに加える。同時培
養期間は、暗所で２０℃、３〜４日である。この後、た
ばこ細胞を１２mlの遠心分離管に移し、海水（６００ m
Osm／kg）で１０mlに希釈し、６０×ｇで１０分間ペレ
ツト状にした。この洗浄工程を１〜２回更に繰り返し
て、ほとんどのアグロバクテリアを除去する。細胞懸濁
液を５×１０4／mlの密度で、１mg／ｌ ＮＡＡ（ナフチ
ル−１−酢酸）、０.２mg／ｌケネチン、および５００m
g／ｌのセフアロスポリン抗生物質のセフオタキシム（C
efotaxime）と共に、Ｋ３培地（０.３ｍサツカロース）
中で培養する。各週、細胞懸濁液を新鮮なＫ３培地で希
釈し、培地の浸透価を、コカルチヤー後２〜３週間、週
当りサツカロースを０.０５ｍ(約６０mOsm／kg）づつ徐
々に減らし、カナマイシンを用いた希釈（１００mg／ｌ
カナマイシンサルフエート）（Sigmaによる）、６６０m
g／ｇの活性カナマイシン）をアグロースービードータ
イプ培養（Shillito他、１９８３年）中で開始する。カ
ナマイシン−耐性のコロニーが、背景の遅れたコロニー
からの選択が始まつた後３〜４週間で、区別される。 ｃ）ＤＮＡを用いたタバコプロトプラストの直接形質転
換、硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質転換 １８０μｌのＫ３培地中の約１０6プロトプラストを、
ペトリ皿中でμｌ当り０.５μｇのｐＳＲ２−４を含有
するＯＮＡ水溶液２０μｌと一緒に注意深く混合する。
２００μの融合溶液（０.１Ｍの硝酸カルシウム、０.４
５Ｍのマンニトールおよび２５％のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ６０００）、pH９）を、続いて注意深く加
える。１５分後、５mlの洗浄溶液（０.２７５Ｍの硝酸
カルシウム、pH６）を加え、そして、更に５分後、遠心
分離管にプロトプラストを移し、６０×ｇでペレツト状
にする。このペレツトを少量のＫ３培地中に摂取し、次
章に記述するように培養する。二者択一的に、プロトプ
ラストはHain他、１９８５年の方法で形質転換され得
る。 ｄ）ＤＮＡで培養したプロトプラストの培養およびカナ
マイシン−耐性のカルスの選択 修正“ビードータイプ培養”技術（Shilito他１９８３
年）をこの培養に用い、カナマイシン耐性コロニーの選
択を下記に示す。ＤＮＡでプロトプラストを処理した後
１週間後（Ｃ参照）、この細胞懸濁液３mlを、５cmのペ
トリ皿中で、３mlのＫ３培地（０.３Ｍのサツカロース
＋ホルモン類；１.２％の（Seaplaque）ＬＭＴ Agarose
（低融点のアガロース、Marine Colloidsによる）と一
緒に混合する。この目的のため、乾燥アガロースを加圧
滅菌し、Ｋ３培地を加えた後、この混合物を極超短波中
で短時間沸騰させる。アガロースが固化した後、アガロ
ース盤（ビード）を包埋したタバコミクロカルスと一緒
に、次の培養および選択のために１０cmのペトリ皿に移
し、各場合共、１０mlのＫ３培地（０.３Ｍのサツカロ
ース、１mg／ｌのＮＡＡ、０.２mg／ｌのキネチンおよ
び１００mg／ｌのカナマイシンスルフエート、Sigmaに
よる）を加える。この液状の培地を毎週交換する。この
処置の間に、培地の浸透価は次第に降下する。交換培地
（Ｋ３＋ｋｍ）を毎週サツカロース０.０５Ｍ（約６０m
Osm）づつ減らす。
【００４８】ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン耐性タバ
ココロニーの選択ダイアグラム：
ココロニーの選択ダイアグラム：
【００４９】
【表１】
【００５０】（Ｋ３培地：１mgのＮＡＡ、０.２mgのキ
ネチン）Ａ＝ＤＮＡ摂取 Ｅ＝アガロース中に包埋 Ｓ＝カナマイシンによる選択（１００mg／ｌのカナマイ
シンスルフエート） Ｋ＝カナマイシン耐性のコロニーが背景から明白に区別
できる。 ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーが直径約０.５cmに達すると
すぐ、それらの半分を再生培地（ＬＳ培地、２％のサツ
カロース、０.５mg／ｌのベンジルアミノプーンＢＡ
Ｐ）に移し、２４℃で１２時光（３０００〜５０００ル
ツクス）の成長チヤンバ中に保存する。他方の半分は、
１mg／ｌのＮＡＡ、０.２mg／ｌのキネチン、０.１mg／
ｌのＢＡＰおよび１００mg／ｌのカナマイシンスルフエ
ートを有するＬＳ培地上で、カルス培養として繁殖させ
る。再生した苗条が約１cmの大きさになつた時、それら
を切り取り、根をはらせるために、成長調整剤を含有し
ない1/2ＬＳ培地（１％のサツカロース、０.８％の寒
天）に移す。１００mg／ｌのカナマイシンスルフエート
を有する1/2ＭＳ培地上に、この苗条を根づかせた後、
土壌に移植する。 ｆ）アグロバクテリウム・ツメフアシエンスによる葉盤
の形質転換 葉盤の形質転換のため(Horsch他１９８５年)、無菌苗条
培養の葉、約２〜３cmの長さのもの、を直径１cmの盤上
に打ち抜き、この盤を、Ａｍ培地中の適切なアグロバク
テリア(約１０9／ml）（ｂ参照）の懸濁液を用いて、約
５分間培養する（以下を参照）。この感染させた葉の断
片を、ホルモン類の入つていないＭＳ培地（以下を参
照）上に、約２４℃で３〜４日間保存する。
ネチン）Ａ＝ＤＮＡ摂取 Ｅ＝アガロース中に包埋 Ｓ＝カナマイシンによる選択（１００mg／ｌのカナマイ
シンスルフエート） Ｋ＝カナマイシン耐性のコロニーが背景から明白に区別
できる。 ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーが直径約０.５cmに達すると
すぐ、それらの半分を再生培地（ＬＳ培地、２％のサツ
カロース、０.５mg／ｌのベンジルアミノプーンＢＡ
Ｐ）に移し、２４℃で１２時光（３０００〜５０００ル
ツクス）の成長チヤンバ中に保存する。他方の半分は、
１mg／ｌのＮＡＡ、０.２mg／ｌのキネチン、０.１mg／
ｌのＢＡＰおよび１００mg／ｌのカナマイシンスルフエ
ートを有するＬＳ培地上で、カルス培養として繁殖させ
る。再生した苗条が約１cmの大きさになつた時、それら
を切り取り、根をはらせるために、成長調整剤を含有し
ない1/2ＬＳ培地（１％のサツカロース、０.８％の寒
天）に移す。１００mg／ｌのカナマイシンスルフエート
を有する1/2ＭＳ培地上に、この苗条を根づかせた後、
土壌に移植する。 ｆ）アグロバクテリウム・ツメフアシエンスによる葉盤
の形質転換 葉盤の形質転換のため(Horsch他１９８５年)、無菌苗条
培養の葉、約２〜３cmの長さのもの、を直径１cmの盤上
に打ち抜き、この盤を、Ａｍ培地中の適切なアグロバク
テリア(約１０9／ml）（ｂ参照）の懸濁液を用いて、約
５分間培養する（以下を参照）。この感染させた葉の断
片を、ホルモン類の入つていないＭＳ培地（以下を参
照）上に、約２４℃で３〜４日間保存する。
【００５１】この間、アグロバクテリウムは葉の断片上
に成育する。その後、この葉を断片をＭＳ培地（０.５m
g／mlのＢＡＰ、０.１mg／mlのＮＡＡ）中で洗浄し、５
００μｇ／mlのセフオタキシム（Claforan）および１０
０μｇ／mlのカナマイシンスルフエート（Sigmaによ
る）を含有する同様の培地（０.８％の寒天）上に置
く。この培地は２週間後新しくするものとする。プロト
プラストした苗条は、更に２〜３週間後、見えるように
なる。苗条の再生は選択圧なしでも平行して行なうもの
とする。再生した苗条は、例えばノパリンシンターゼも
しくはスチルベンシンターゼ活性のための、生物学的試
験によつて、形質転換に関して試験するものとする。こ
の方法において、１〜１０％の形質転換した苗条が得ら
れる。形質転換に関する生化学的検出方法 植物組織中のノパリンの検出：ノパリンは下記に示すよ
うに、OttenおよびSchilperoort（１９７８年）およびA
erts他、（１９７９年）によつて示される方法で検出さ
れる。植物物質（カルスもしくは葉の断片）５０mgを
０.１Ｍのアルギニンを有するＬＳ培地中のエツペンド
ルフ（Eppendorf）管中、室温で一晩培養する。その後
植物物質を吸収性の紙でブロツトし、ガラス棒を用いて
新しいエツペンドルフ遠心分離管中でホモジナイズさ
せ、このホモジナイズした液を、エツペンドルフ遠心分
離中で２分間遠心分離する。２μｌの上澄み液を電気泳
動のための適切な紙（Whatman ３ＭＭ紙）(２０×４０c
m）上に点として塗布し、乾燥する。この紙を可動相
（５％のぎ酸、１５％の酢酸、８０％の水、pH１.８）
で飽和させ、４００Ｖで４５分間、電気泳動を行なつ
た。ノパリンは陰極に向かつて移動する。その後、この
紙を熱風中で乾燥し、フエナントレンキノン染料を通し
て、移動する方向に通過させる（エタノール中の０.０
２％のフエナントレンキノンと６０％濃度エタノール中
の１０％のＮａＯＨを同量）。乾燥した紙を長波長のＵ
Ｖ光下で検査し、写真をとる。この試薬で、アルギニン
およびアルギニンの誘導体は蛍光性の黄色に着色する。ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ（ＮＰＴII）酵
素検定 ：植物組織中のＮＰＴII活性は、Keisis他（１９
８４年）によつて記述される方法、およびSchreier他
（１９８５年）によつて修正された方法で、カナマイシ
ンのイン・サイチユー法リン酸化によつて検出される。
５０mgの植物組織を、ガラス粉末を添加した５０μｌの
抽出緩衝液（１０％のグリセロール、５％の２−メルカ
プトエタノール、０.１％のＳＤＳ、０.０２５％のブロ
モフエノール・ブルー、６２.５ｍＭトリス pH６.８）
中、氷上でホモジナイズさせ、この混合物を４℃で１０
分間エツペンドルフ遠心分離器中で遠心分離する。５０
μｌの上澄み液を、天然ポリアクリルアミドゲル（１４
５×１１０×１.２mm；分離ゲル：１０％アクリルアミ
ド、０.３３％のビスアクリルアミド、０.３７５Ｍトリ
ス pH８.８、収集するゲル：５％のアクリルアミド、
０.１６５％のビスアクリルアミド、０.１２５Ｍトリス
pH６.８）に移し、４℃６０Ｖで一晩電気泳動を行なつ
た。ブロモフエノール・ブルー標識がゲルから出て移動
し始めるとすぐ、このゲルを１０分間蒸留水で２回、３
０分間反応緩衝液（６７ｍＭトリスマレイン酸塩、pH
７.１、４２ｍＭ ＭｇＣｌ2、４００ｍＭ塩化アンモニ
ウム）で１回洗浄する。このゲルを、同じ大きさのガラ
ス板上に置き、基質のカナマイシンスルフエート（２０
μｇ／ml）および２０〜２００uCi 32pＡＴＰ（Amersha
m）を含有する反応緩衝液中、１％濃度のアガロース４
０mlの層でおおつた。このサンドイツチ状にしたゲルを
室温で３０分間培養し、そしてホスホセルロース紙Ｐ８
１（Whatman）のシートを、アガロースの上に置く。こ
の上に、濾紙３ＭＭ（Whatman）４層と２〜３枚のペー
パータオルを配する。３〜４時間後、イン・サイチユー
でりん酸化した放射性カナマイシンホスフエートの、Ｐ
８１紙への移行が停止する。このＰ８１紙を、プロテナ
ーゼＫと１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液
中、６０℃で３０分間培養した後、８０℃で、１０ｍＭ
りん酸塩緩衝液pH７.５の２５０ml中で３〜４回洗浄
し、乾燥し、そして−７０℃で１〜１２時間オートラジ
オグラフをとる（ＸＡＲ５−フイルム、コダツク）。Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子発現の検出 ａ） 細胞培養および植物からのｍ−ＲＮＡの単離 細胞培養および植物からＲＮＡを単離するために、植物
物質１ｇ当り０.１ｇの無菌石英砂、１μｌのβ−メル
カプタエタノールおよび１mlのＨＯ緩衝液（０.４Ｍト
リス／ＨＣｌ pH８、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０４Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、５％ＳＤＳ、６５℃）を加え、そして、この混
合物をホモジナイズした。１mlのフエノール／クロロホ
ルム（１：１）を加えた後、更に約２分間この混合物を
ホモジナイズした。このホモジエネートを遠心分離管に
移し、この管を激しく振とうした。遠心分離（１０′、
１００００×ｇ、室温）後、更に２mlのフエノール／ク
ロロホルムを加え、この管を激しく振とうした後、遠心
分離した。ポリサツカロイドを除くため、1/4の容積の
エタノールを水相に加え、この混合物を氷上に１０分間
置いた後、１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し
た。その後、核酸を２倍の容積のエタノールを用いて沈
殿させ、−７０℃で保存した。沈殿したＲＮＡをその
後、２mlづつに分けた酢酸ナトリウム（３Ｍ、pH６）で
２〜３回洗浄した。このＲＮＡを１００μｌの無菌水に
溶解した。 ｂ） ＲＮＡの電気泳動 ＲＮＡ変性：ＲＮＡの電気泳動のため、６.７５μｌの
ＲＮＡ（２０μｇ）に、３μｌの５倍緩衝液（０.２Ｍ
ＭＯＰＳ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ p
H７）、５.２５μｌのホルムアルデヒド（３７％濃度）
および１５μｌのホルムアミド（脱イオン化した）を、
加えた後、５６℃で１５分間変性を生じさせた。
に成育する。その後、この葉を断片をＭＳ培地（０.５m
g／mlのＢＡＰ、０.１mg／mlのＮＡＡ）中で洗浄し、５
００μｇ／mlのセフオタキシム（Claforan）および１０
０μｇ／mlのカナマイシンスルフエート（Sigmaによ
る）を含有する同様の培地（０.８％の寒天）上に置
く。この培地は２週間後新しくするものとする。プロト
プラストした苗条は、更に２〜３週間後、見えるように
なる。苗条の再生は選択圧なしでも平行して行なうもの
とする。再生した苗条は、例えばノパリンシンターゼも
しくはスチルベンシンターゼ活性のための、生物学的試
験によつて、形質転換に関して試験するものとする。こ
の方法において、１〜１０％の形質転換した苗条が得ら
れる。形質転換に関する生化学的検出方法 植物組織中のノパリンの検出：ノパリンは下記に示すよ
うに、OttenおよびSchilperoort（１９７８年）およびA
erts他、（１９７９年）によつて示される方法で検出さ
れる。植物物質（カルスもしくは葉の断片）５０mgを
０.１Ｍのアルギニンを有するＬＳ培地中のエツペンド
ルフ（Eppendorf）管中、室温で一晩培養する。その後
植物物質を吸収性の紙でブロツトし、ガラス棒を用いて
新しいエツペンドルフ遠心分離管中でホモジナイズさ
せ、このホモジナイズした液を、エツペンドルフ遠心分
離中で２分間遠心分離する。２μｌの上澄み液を電気泳
動のための適切な紙（Whatman ３ＭＭ紙）(２０×４０c
m）上に点として塗布し、乾燥する。この紙を可動相
（５％のぎ酸、１５％の酢酸、８０％の水、pH１.８）
で飽和させ、４００Ｖで４５分間、電気泳動を行なつ
た。ノパリンは陰極に向かつて移動する。その後、この
紙を熱風中で乾燥し、フエナントレンキノン染料を通し
て、移動する方向に通過させる（エタノール中の０.０
２％のフエナントレンキノンと６０％濃度エタノール中
の１０％のＮａＯＨを同量）。乾燥した紙を長波長のＵ
Ｖ光下で検査し、写真をとる。この試薬で、アルギニン
およびアルギニンの誘導体は蛍光性の黄色に着色する。ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ（ＮＰＴII）酵
素検定 ：植物組織中のＮＰＴII活性は、Keisis他（１９
８４年）によつて記述される方法、およびSchreier他
（１９８５年）によつて修正された方法で、カナマイシ
ンのイン・サイチユー法リン酸化によつて検出される。
５０mgの植物組織を、ガラス粉末を添加した５０μｌの
抽出緩衝液（１０％のグリセロール、５％の２−メルカ
プトエタノール、０.１％のＳＤＳ、０.０２５％のブロ
モフエノール・ブルー、６２.５ｍＭトリス pH６.８）
中、氷上でホモジナイズさせ、この混合物を４℃で１０
分間エツペンドルフ遠心分離器中で遠心分離する。５０
μｌの上澄み液を、天然ポリアクリルアミドゲル（１４
５×１１０×１.２mm；分離ゲル：１０％アクリルアミ
ド、０.３３％のビスアクリルアミド、０.３７５Ｍトリ
ス pH８.８、収集するゲル：５％のアクリルアミド、
０.１６５％のビスアクリルアミド、０.１２５Ｍトリス
pH６.８）に移し、４℃６０Ｖで一晩電気泳動を行なつ
た。ブロモフエノール・ブルー標識がゲルから出て移動
し始めるとすぐ、このゲルを１０分間蒸留水で２回、３
０分間反応緩衝液（６７ｍＭトリスマレイン酸塩、pH
７.１、４２ｍＭ ＭｇＣｌ2、４００ｍＭ塩化アンモニ
ウム）で１回洗浄する。このゲルを、同じ大きさのガラ
ス板上に置き、基質のカナマイシンスルフエート（２０
μｇ／ml）および２０〜２００uCi 32pＡＴＰ（Amersha
m）を含有する反応緩衝液中、１％濃度のアガロース４
０mlの層でおおつた。このサンドイツチ状にしたゲルを
室温で３０分間培養し、そしてホスホセルロース紙Ｐ８
１（Whatman）のシートを、アガロースの上に置く。こ
の上に、濾紙３ＭＭ（Whatman）４層と２〜３枚のペー
パータオルを配する。３〜４時間後、イン・サイチユー
でりん酸化した放射性カナマイシンホスフエートの、Ｐ
８１紙への移行が停止する。このＰ８１紙を、プロテナ
ーゼＫと１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の溶液
中、６０℃で３０分間培養した後、８０℃で、１０ｍＭ
りん酸塩緩衝液pH７.５の２５０ml中で３〜４回洗浄
し、乾燥し、そして−７０℃で１〜１２時間オートラジ
オグラフをとる（ＸＡＲ５−フイルム、コダツク）。Ｔ４−フアージリゾチーム遺伝子発現の検出 ａ） 細胞培養および植物からのｍ−ＲＮＡの単離 細胞培養および植物からＲＮＡを単離するために、植物
物質１ｇ当り０.１ｇの無菌石英砂、１μｌのβ−メル
カプタエタノールおよび１mlのＨＯ緩衝液（０.４Ｍト
リス／ＨＣｌ pH８、０.１Ｍ ＮａＣｌ、０.０４Ｍ Ｅ
ＤＴＡ、５％ＳＤＳ、６５℃）を加え、そして、この混
合物をホモジナイズした。１mlのフエノール／クロロホ
ルム（１：１）を加えた後、更に約２分間この混合物を
ホモジナイズした。このホモジエネートを遠心分離管に
移し、この管を激しく振とうした。遠心分離（１０′、
１００００×ｇ、室温）後、更に２mlのフエノール／ク
ロロホルムを加え、この管を激しく振とうした後、遠心
分離した。ポリサツカロイドを除くため、1/4の容積の
エタノールを水相に加え、この混合物を氷上に１０分間
置いた後、１００００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離し
た。その後、核酸を２倍の容積のエタノールを用いて沈
殿させ、−７０℃で保存した。沈殿したＲＮＡをその
後、２mlづつに分けた酢酸ナトリウム（３Ｍ、pH６）で
２〜３回洗浄した。このＲＮＡを１００μｌの無菌水に
溶解した。 ｂ） ＲＮＡの電気泳動 ＲＮＡ変性：ＲＮＡの電気泳動のため、６.７５μｌの
ＲＮＡ（２０μｇ）に、３μｌの５倍緩衝液（０.２Ｍ
ＭＯＰＳ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭＥＤＴＡ p
H７）、５.２５μｌのホルムアルデヒド（３７％濃度）
および１５μｌのホルムアミド（脱イオン化した）を、
加えた後、５６℃で１５分間変性を生じさせた。
【００５２】アガロースゲルの調製：３.５ｇのアガロ
ースを２００mlの水中で沸騰させ、この混合物を６０℃
に冷却した後、５倍の緩衝液７０mlとホルムアルデヒド
６２mlを加えた。この溶液を水で容積３５０mlとし、ゲ
ル装置中に充填した。この変性ＲＮＡを３μｌの色標識
と１μｌのエチジユームブロマイド（５mg／ml）と混合
した後、１００Ｖで６時間電気泳動を行なつた。 ｃ） ノーザンブロツテイング法：引き続いてこのゲル
を無菌水中で１０分間３回洗浄した。このＲＮＡを、標
準ブロツテイング方法（２０×ＳＳＣ中３〜４時間）を
用いて、ニトロセルロースフイルター（Maniatis他１９
８２年）に移した。 ｄ） ノーザンブロツト上の雑種形成：ｐＳＲ２−４か
ら単離したSal I断片１００ngを、放射性標識（比活性
＞４×１０8cpm／μｇ）のため、ニツク翻訳を受けさせ
る。ThomzikおよびHain １９８８年によつて記述される
方法により、４２℃で一晩雑種形成を行なつた。
ースを２００mlの水中で沸騰させ、この混合物を６０℃
に冷却した後、５倍の緩衝液７０mlとホルムアルデヒド
６２mlを加えた。この溶液を水で容積３５０mlとし、ゲ
ル装置中に充填した。この変性ＲＮＡを３μｌの色標識
と１μｌのエチジユームブロマイド（５mg／ml）と混合
した後、１００Ｖで６時間電気泳動を行なつた。 ｃ） ノーザンブロツテイング法：引き続いてこのゲル
を無菌水中で１０分間３回洗浄した。このＲＮＡを、標
準ブロツテイング方法（２０×ＳＳＣ中３〜４時間）を
用いて、ニトロセルロースフイルター（Maniatis他１９
８２年）に移した。 ｄ） ノーザンブロツト上の雑種形成：ｐＳＲ２−４か
ら単離したSal I断片１００ngを、放射性標識（比活性
＞４×１０8cpm／μｇ）のため、ニツク翻訳を受けさせ
る。ThomzikおよびHain １９８８年によつて記述される
方法により、４２℃で一晩雑種形成を行なつた。
【００５３】この方法は、形質転換したタバコ中のＴ４
−フアージーリゾチームに特異なｍＲＮＡの合成を検出
するために用いられる。ウエスタンブロツテイング法によるタバコ中のＴ４−フ
アージリゾチームの検出 タバコから全タンパク質を単離するために、１００mgの
植物物質を２倍に濃縮したＳＤＳサンプル緩衝液（１５
０ｍＭトリス／ＨＣｌ pH６.８、２％ＳＤＳ、２０％グ
リセロール、０.００４％ブロモフエノール・ブルー２
００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭアスコルビン酸および１０ｍ
Ｍ ＣＨＡＰＳ）中でホモジナイズした後、この混合物
を９５℃で５分間培養した。遠心分離（１００００×
ｇ、５分間）した後、整除できる数に分けた上澄み液
（１０〜１００μｇの全タンパク質）を、１５％のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルに移し、６０Ｖで１２時間電
気泳動を行なつた。分離したタンパク質を、その後、移
動緩衝液（２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシンお
よび２０％のメタノール）中、エレクトロブロツテイン
グ(２時間、０.８〜１Ａ）によつて、ＰＶＤＦイモビロ
ン(Immobilon)膜へ移した。ひき続いてこの膜をＰＢＡ
中の５％のウシ科の動物の血清アルブミン（ＢＳＡ）中
で３０分間培養した。ＰＢＡ中の０.１％のＢＳＡを用
いて３回洗浄した後、この膜を多クローン性Ｔ４−リゾ
チームに特異な抗体と共に２時間培養した。０.１％の
ＢＳＡ／ＰＢＡ中で３回洗浄（各々５分間）した後、こ
の膜を、金で標識した抗体（Auro ProbeR kit,Janssen
Chemieからのやぎ抗−ラビツト）を用いて、この業者に
よつて示されるように２時間培養した。ＰＢＡ中の０.
１％のＢＳＡおよび水で洗浄した後、この膜をエンハン
サー／イニシエーター（１：１）で着色させた。 ３．ソラナムチユーベロサム(Solanum taberosum)（じ
やがいも）の形質転換 ＥＰ−Ａ ０,２４２,２４６、１４〜１５頁、プラスミ
ドｐＳＲ２−４のリゾチーム遺伝子構造物を有するＴｉ
プラスミドを有するアグロバクテリア、に記載されるの
と全く同様の方法による形質転換で形質転換した。
−フアージーリゾチームに特異なｍＲＮＡの合成を検出
するために用いられる。ウエスタンブロツテイング法によるタバコ中のＴ４−フ
アージリゾチームの検出 タバコから全タンパク質を単離するために、１００mgの
植物物質を２倍に濃縮したＳＤＳサンプル緩衝液（１５
０ｍＭトリス／ＨＣｌ pH６.８、２％ＳＤＳ、２０％グ
リセロール、０.００４％ブロモフエノール・ブルー２
００ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭアスコルビン酸および１０ｍ
Ｍ ＣＨＡＰＳ）中でホモジナイズした後、この混合物
を９５℃で５分間培養した。遠心分離（１００００×
ｇ、５分間）した後、整除できる数に分けた上澄み液
（１０〜１００μｇの全タンパク質）を、１５％のＳＤ
Ｓポリアクリルアミドゲルに移し、６０Ｖで１２時間電
気泳動を行なつた。分離したタンパク質を、その後、移
動緩衝液（２５ｍＭトリス塩基、１９２ｍＭグリシンお
よび２０％のメタノール）中、エレクトロブロツテイン
グ(２時間、０.８〜１Ａ）によつて、ＰＶＤＦイモビロ
ン(Immobilon)膜へ移した。ひき続いてこの膜をＰＢＡ
中の５％のウシ科の動物の血清アルブミン（ＢＳＡ）中
で３０分間培養した。ＰＢＡ中の０.１％のＢＳＡを用
いて３回洗浄した後、この膜を多クローン性Ｔ４−リゾ
チームに特異な抗体と共に２時間培養した。０.１％の
ＢＳＡ／ＰＢＡ中で３回洗浄（各々５分間）した後、こ
の膜を、金で標識した抗体（Auro ProbeR kit,Janssen
Chemieからのやぎ抗−ラビツト）を用いて、この業者に
よつて示されるように２時間培養した。ＰＢＡ中の０.
１％のＢＳＡおよび水で洗浄した後、この膜をエンハン
サー／イニシエーター（１：１）で着色させた。 ３．ソラナムチユーベロサム(Solanum taberosum)（じ
やがいも）の形質転換 ＥＰ−Ａ ０,２４２,２４６、１４〜１５頁、プラスミ
ドｐＳＲ２−４のリゾチーム遺伝子構造物を有するＴｉ
プラスミドを有するアグロバクテリア、に記載されるの
と全く同様の方法による形質転換で形質転換した。
【００５４】特に規定されていない限り、上記実施例中
の全ての百分率は重量％である。
の全ての百分率は重量％である。
【００５５】上記実施例に従つて得られた植物細胞およ
び植物において、リゾチーム遺伝子の存在はサザンブロ
ツト分析法によつて確認された。リゾチーム遺伝子の発
現は、特定の抗体の助けによるノーンブロツト分析法お
よびリゾチームで検出された。形質転換したそして形質
転換していない植物（比較のため）に、ボトリシスシネ
ラ（Botrytis cinera）およびアルテルナリアロンギペ
ス（Alternaria longipes）の胞子懸濁液を噴霧した
後、１週間後、菌・かびによる感染を記録した。形質転
換していない比較植物に比べて、形質転換した植物は、
菌・かびによる感染に対して、増大した抵抗力を示し
た。増大した抵抗力の検出例 菌・かびによる植物の病気に対して、植物中で合成され
たリゾチームによつて増大された抵抗力を試験するため
に、植物を病原と一緒に培養し、その感染の度合いをパ
ラメーターとして用いた。
び植物において、リゾチーム遺伝子の存在はサザンブロ
ツト分析法によつて確認された。リゾチーム遺伝子の発
現は、特定の抗体の助けによるノーンブロツト分析法お
よびリゾチームで検出された。形質転換したそして形質
転換していない植物（比較のため）に、ボトリシスシネ
ラ（Botrytis cinera）およびアルテルナリアロンギペ
ス（Alternaria longipes）の胞子懸濁液を噴霧した
後、１週間後、菌・かびによる感染を記録した。形質転
換していない比較植物に比べて、形質転換した植物は、
菌・かびによる感染に対して、増大した抵抗力を示し
た。増大した抵抗力の検出例 菌・かびによる植物の病気に対して、植物中で合成され
たリゾチームによつて増大された抵抗力を試験するため
に、植物を病原と一緒に培養し、その感染の度合いをパ
ラメーターとして用いた。
【００５６】用いた試験病原体はAlternaria longipes
（Ell & Everh）MasonおよびBotrytis cinerea Presで
ある。
（Ell & Everh）MasonおよびBotrytis cinerea Presで
ある。
【００５７】タバコの植物を標準土壌（Balsterによ
る）が入つているポツト（直径１１cm）中に鉢植えし、
実験を開始するまで、２３℃で相対湿度７０〜８０％の
温室中で成育させる。この植物に必要な水と栄養を与え
る。接種のため、５〜８週目の古い植物の葉に病原体の
胞子懸濁液を流れ出すまで噴霧する。引き続いて、この
植物を病原体の好む条件下、初期の相対湿度１００％で
２１℃、で培養する。４〜８日後、植物の健康状態を、
感染させた葉の部分を基準にして、パーセントで測定す
る。
る）が入つているポツト（直径１１cm）中に鉢植えし、
実験を開始するまで、２３℃で相対湿度７０〜８０％の
温室中で成育させる。この植物に必要な水と栄養を与え
る。接種のため、５〜８週目の古い植物の葉に病原体の
胞子懸濁液を流れ出すまで噴霧する。引き続いて、この
植物を病原体の好む条件下、初期の相対湿度１００％で
２１℃、で培養する。４〜８日後、植物の健康状態を、
感染させた葉の部分を基準にして、パーセントで測定す
る。
【００５８】表（IおよびII）からわかるように、実施
例２に従つてｐＢＲ２−４で形質転換した植物は、野生
種のＳＲ1に比較して、Alternaria longipes並びにBotr
ytiscinereaに対して低い感染を示している。
例２に従つてｐＢＲ２−４で形質転換した植物は、野生
種のＳＲ1に比較して、Alternaria longipes並びにBotr
ytiscinereaに対して低い感染を示している。
【００５９】
【表２】
【００６０】
【表３】
【００６１】植物もしくは植物細胞の形質転換に用いた
培地のいくつかを以下に示す。
培地のいくつかを以下に示す。
【００６２】Ａｍ培地 3.5g K2HPO4 1.5g KH2PO4 0.5g クエン酸 Na3 0.1g MgSO4×7H2O 1 g (NH4)2SO4 2 g グルコース１リットルに対してタバコの無菌苗条培養用の培地 マクロ要素：ＭＳ塩の濃縮物の1/2 ミクロ要素：ＭＳ塩の濃縮物の1/2 Fe EDTA Murashige および Skoog(MS) ミヨ・イノシトール 100 mg/ｌ サツカロース 10 mg/ｌ 寒天 8 g /ｌ ビタミン類 パントテン酸Ca 1 mg/ｌ ビオチン 10 mg/ｌ ニコチン酸 1 mg/ｌ ピリドキシン 1 mg/ｌ チアミン 1 mg/ｌ 加圧滅菌前のpH5.7Ｋ３培地 Nicotiana tabacum petit Havana SRI、Nicotiana taba
cum Wisconsin ３８およびNicotiana Plumaginifolia
プロトプラスト培養用 （Nogy および Maliga、１９７６年） マクロ要素 NH4NO3 250 mg/ｌ KNO3 2500 mg/ｌ CaCl2×2H2O 900 mg/ｌ MgSO4×7H2O 250 mg/ｌ NaH2PO4×1H2O 150 mg/ｌ (NH4)2SO4 134 mg/ｌ CaHPO4×1H2O 50 mg/ｌ ミクロ要素 H3BNO3 3 mg/ｌ MnSO4×1H2O 10 mg/ｌ ZnSO4×4H2O 2 mg/ｌ KI 0.75 mg/ｌ Na2MoO4×2H2O 0.25 mg/ｌ CuSO4×5H2O 0.025 mg/ｌ CoCl2×6H2O 0.025 mg/ｌ Fe EDTA Na2EDTA 37.2 mg/ｌ FeSO2×7H2O 27.8 mg/ｌ イノシトール 100 mg/ｌ サツカロース 137 g/ｌ (= 0.4M)キシロース 250 mg/ｌ ビタミン類 ニコチン酸 1 mg/ｌ ピリドキシン 1 mg/ｌ チアミン 10 mg/ｌ ホルモン NAA 1.0 mg/ｌ キネチン 0.2 mg/ｌ pH5.6 フイルター無菌Linsmaier および Skoog 培地 （Linsmaierおよび Skoog
１９６５年） 再生プロトプラスト培養用およびタバコ腫瘍およびカル
スの組織培養用。LinsmaierおよびSkoog（LS）培地は下
記の修正を行なつたMurashigeおよびSkoog培地（Murash
igeおよびSkoog、１９６２年）である： −０.１mg／ｌの代わりに０.４mg／ｌの高濃度でチアミ
ンを計量 −グリシン、ピリドキシンおよびニコチン酸を不使用。 下記の参考文献は、植物もしくは植物細胞の形質転換に
関連しており、本発明に従つて用いられるリゾチーム遺
伝子に関連している：Aets M，Jacobs M，Hernalsteens
JP，Van Montagu M，Schell J（１９８３年）Arabidop
sis thalianaのクラウンゴール腫瘍の誘導および試験管
培養。Plant Sci Lett．１７：４３−５０ Davey MR，C
ocking EC，Freeman J，Pearce N，Tudor I（１９８０
年）単離したAgrobacteriumプラスミドによるPetuniaプ
ロトプラストの形質転換。Plant Sci Lett １８：３０
７−３１３ K．Duering、博士論文、Cologne大学、１９
８８年:Wundinduzierbare Expression und Sekretion v
on T４ Lysozym und monoklonalen Antikoerpern in Ni
cotiana tabacum［創傷誘導の表現およびＴ４−リゾチ
ームの分泌作用およびNicotiana tabacum中の単クロー
ン抗体］。Fromm ME，Taylor LP，Walbot V（１９８６
年）エレクトロポレ−シヨンによる遺伝子転移後のとう
もろこしの安定形質転換。Nature ３１９：７９１−７
９３Hain，R.，Stabel，P.，Czernilofsky，A．Pp.，St
ein biss，H．H.，Herrera-Estrella，L.，Schell,J.
（１９８５年）植物プロトプラストによる選択可能なキ
メラ遺伝子の取得、組込み、発現および遺伝子伝達、Mo
lec Gen Genet １９９：１６１−１６８ Horsch RB，Fry JE，Hoffmann NL，Eichholtz D,Rogers
SG，Fraley RT（１９８５年）遺伝子を植物中に移植す
るための簡単で一般的な方法。Science２７７：１２２
９−１２３１ Krebs FH，Molendijk L，Wullems GJ，Schilperoort RA
（１９８２年）Ti-プラスミドＤＮＡによる植物プロト
プラストの試験管形質転換。Nature ２９６：７２−７
４ Koncz C，Schell J（１９８６年）ＴL−ＤＮＡ遺伝子５
のプロモーターは、Agrobacterium linaryベクターの新
奇な種が有する共生体的遺伝子の組織に特異な表現を制
御する。Mol.Gen.Genet.（１９８６年）２０４：３３８
−３９６ Linsmaier DM，Skoog F（１９６５年）タバコ組織培養
の有機的成長因子要求。Physiol Plant １８：１００−
１２７ Marton L，Wullems GJ，Molendijk L，Schilperoort PR
(１９７９年)Agrobacterium tumefaciensによるNicotia
na tabacumからの培養細胞の試験管形質転換。Nature
２７７：１２２９−１３１ Nagy JI，Maliga P（１９７６年）Nicotiana Sylvestri
sの葉肉プロトプラストからのカルス誘導および植物再
生。Z Plfanzenphysiol ７８：４５３−４５５ Otten LABM，Schiperoort RA（１９７８年）Lyposinお
よびNopalinデヒドロゼナーゼ活性の検出のための迅速
マイクロスケール方法。Biochim biophys acta ５２
７：４９７−５００Paszkowski J，Shillito RD，Sanl
M，Mandak V,Hohn T，Hohn B，Potrykus I（１９８４
年）植物への直接遺伝子転移。EMB0 J ３：２７１７−
２７２２ Shillito RD，Paszkowski J．Potrykus I（１９８３
年）アガロース平板およびビードタイプ培養技術は、数
多い植物種中のプロトプラスト誘導のコロニーの発展を
可能にしそして刺激する。Pl Cell Rep ２：２４４−２
４７ Maniatis T，Fritsch EF，Sanbrook J eds.（１９８２
年）分子クローン化、研究室マニユアル。Cold Spring
Harbor，New York。J．E．Thomzik and R．Hain（１９
８８年）、Brassica napus L.中のトリアジン耐性クロ
ロプラストの伝達および分離Theor Appl Genet（１９８
８年）７６：１６５−１７１。 Van Hante E，Joos H，Maes M，Worren G，Van Montagu
M，Schell J.（１９８３年）pBR ３２２中クローン化
させた制限フラグメントの属間伝達および交換組換え：
Agrobakterium tumefaciens のＴｉ−プラスミドの逆遺
伝現象に関する新規な戦略。EMBO J．：２ ４１１−４
１７ Velten J，Velten L，Hain R，ShellJ（１９８４
年）Agrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドから
のデユアル植物プロモーターフラグメントの単離。EMBO
J １２：２７２３−２７３０ Velten J，Schell J（１９８５年）高等植物の遺伝的形
質転換に用いるための選択表現プラスミド・ベクター。
NAR １３：６９８１−６９９８ Zambryski P.Joos H,Genetello C，van Montagu M，Sch
ell J（１９８３年）通常の再生能力を変えないで植物
細胞へＤＮＡ導入するためのＴｉ−プラスミド・ベクタ
ー、EMBO Ｊ １２：２１４３−２１５０。 Bernd Reiss，Rolf Sprengel，Hans WillおよびHeinz S
challer（１９８４年）粗細胞束中のネオマイシンホス
ホトランスフエラーゼの定性的および定量的検定のため
の新規の鋭敏な方法、GENE １０８１：２１１−２１７ Peter H．Schreier，Elisabeth A．Seftor，Jozef Sche
llおよびHans J．Bohnert（１９８５年）光調整の合成
を管理する核をコードする配列の使用、および、異質タ
ンパク質の植物クロロプラスト中への輪送、ENBO J Vo
l．４、Ｎｏ．１：２５−３２。
cum Wisconsin ３８およびNicotiana Plumaginifolia
プロトプラスト培養用 （Nogy および Maliga、１９７６年） マクロ要素 NH4NO3 250 mg/ｌ KNO3 2500 mg/ｌ CaCl2×2H2O 900 mg/ｌ MgSO4×7H2O 250 mg/ｌ NaH2PO4×1H2O 150 mg/ｌ (NH4)2SO4 134 mg/ｌ CaHPO4×1H2O 50 mg/ｌ ミクロ要素 H3BNO3 3 mg/ｌ MnSO4×1H2O 10 mg/ｌ ZnSO4×4H2O 2 mg/ｌ KI 0.75 mg/ｌ Na2MoO4×2H2O 0.25 mg/ｌ CuSO4×5H2O 0.025 mg/ｌ CoCl2×6H2O 0.025 mg/ｌ Fe EDTA Na2EDTA 37.2 mg/ｌ FeSO2×7H2O 27.8 mg/ｌ イノシトール 100 mg/ｌ サツカロース 137 g/ｌ (= 0.4M)キシロース 250 mg/ｌ ビタミン類 ニコチン酸 1 mg/ｌ ピリドキシン 1 mg/ｌ チアミン 10 mg/ｌ ホルモン NAA 1.0 mg/ｌ キネチン 0.2 mg/ｌ pH5.6 フイルター無菌Linsmaier および Skoog 培地 （Linsmaierおよび Skoog
１９６５年） 再生プロトプラスト培養用およびタバコ腫瘍およびカル
スの組織培養用。LinsmaierおよびSkoog（LS）培地は下
記の修正を行なつたMurashigeおよびSkoog培地（Murash
igeおよびSkoog、１９６２年）である： −０.１mg／ｌの代わりに０.４mg／ｌの高濃度でチアミ
ンを計量 −グリシン、ピリドキシンおよびニコチン酸を不使用。 下記の参考文献は、植物もしくは植物細胞の形質転換に
関連しており、本発明に従つて用いられるリゾチーム遺
伝子に関連している：Aets M，Jacobs M，Hernalsteens
JP，Van Montagu M，Schell J（１９８３年）Arabidop
sis thalianaのクラウンゴール腫瘍の誘導および試験管
培養。Plant Sci Lett．１７：４３−５０ Davey MR，C
ocking EC，Freeman J，Pearce N，Tudor I（１９８０
年）単離したAgrobacteriumプラスミドによるPetuniaプ
ロトプラストの形質転換。Plant Sci Lett １８：３０
７−３１３ K．Duering、博士論文、Cologne大学、１９
８８年:Wundinduzierbare Expression und Sekretion v
on T４ Lysozym und monoklonalen Antikoerpern in Ni
cotiana tabacum［創傷誘導の表現およびＴ４−リゾチ
ームの分泌作用およびNicotiana tabacum中の単クロー
ン抗体］。Fromm ME，Taylor LP，Walbot V（１９８６
年）エレクトロポレ−シヨンによる遺伝子転移後のとう
もろこしの安定形質転換。Nature ３１９：７９１−７
９３Hain，R.，Stabel，P.，Czernilofsky，A．Pp.，St
ein biss，H．H.，Herrera-Estrella，L.，Schell,J.
（１９８５年）植物プロトプラストによる選択可能なキ
メラ遺伝子の取得、組込み、発現および遺伝子伝達、Mo
lec Gen Genet １９９：１６１−１６８ Horsch RB，Fry JE，Hoffmann NL，Eichholtz D,Rogers
SG，Fraley RT（１９８５年）遺伝子を植物中に移植す
るための簡単で一般的な方法。Science２７７：１２２
９−１２３１ Krebs FH，Molendijk L，Wullems GJ，Schilperoort RA
（１９８２年）Ti-プラスミドＤＮＡによる植物プロト
プラストの試験管形質転換。Nature ２９６：７２−７
４ Koncz C，Schell J（１９８６年）ＴL−ＤＮＡ遺伝子５
のプロモーターは、Agrobacterium linaryベクターの新
奇な種が有する共生体的遺伝子の組織に特異な表現を制
御する。Mol.Gen.Genet.（１９８６年）２０４：３３８
−３９６ Linsmaier DM，Skoog F（１９６５年）タバコ組織培養
の有機的成長因子要求。Physiol Plant １８：１００−
１２７ Marton L，Wullems GJ，Molendijk L，Schilperoort PR
(１９７９年)Agrobacterium tumefaciensによるNicotia
na tabacumからの培養細胞の試験管形質転換。Nature
２７７：１２２９−１３１ Nagy JI，Maliga P（１９７６年）Nicotiana Sylvestri
sの葉肉プロトプラストからのカルス誘導および植物再
生。Z Plfanzenphysiol ７８：４５３−４５５ Otten LABM，Schiperoort RA（１９７８年）Lyposinお
よびNopalinデヒドロゼナーゼ活性の検出のための迅速
マイクロスケール方法。Biochim biophys acta ５２
７：４９７−５００Paszkowski J，Shillito RD，Sanl
M，Mandak V,Hohn T，Hohn B，Potrykus I（１９８４
年）植物への直接遺伝子転移。EMB0 J ３：２７１７−
２７２２ Shillito RD，Paszkowski J．Potrykus I（１９８３
年）アガロース平板およびビードタイプ培養技術は、数
多い植物種中のプロトプラスト誘導のコロニーの発展を
可能にしそして刺激する。Pl Cell Rep ２：２４４−２
４７ Maniatis T，Fritsch EF，Sanbrook J eds.（１９８２
年）分子クローン化、研究室マニユアル。Cold Spring
Harbor，New York。J．E．Thomzik and R．Hain（１９
８８年）、Brassica napus L.中のトリアジン耐性クロ
ロプラストの伝達および分離Theor Appl Genet（１９８
８年）７６：１６５−１７１。 Van Hante E，Joos H，Maes M，Worren G，Van Montagu
M，Schell J.（１９８３年）pBR ３２２中クローン化
させた制限フラグメントの属間伝達および交換組換え：
Agrobakterium tumefaciens のＴｉ−プラスミドの逆遺
伝現象に関する新規な戦略。EMBO J．：２ ４１１−４
１７ Velten J，Velten L，Hain R，ShellJ（１９８４
年）Agrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドから
のデユアル植物プロモーターフラグメントの単離。EMBO
J １２：２７２３−２７３０ Velten J，Schell J（１９８５年）高等植物の遺伝的形
質転換に用いるための選択表現プラスミド・ベクター。
NAR １３：６９８１−６９９８ Zambryski P.Joos H,Genetello C，van Montagu M，Sch
ell J（１９８３年）通常の再生能力を変えないで植物
細胞へＤＮＡ導入するためのＴｉ−プラスミド・ベクタ
ー、EMBO Ｊ １２：２１４３−２１５０。 Bernd Reiss，Rolf Sprengel，Hans WillおよびHeinz S
challer（１９８４年）粗細胞束中のネオマイシンホス
ホトランスフエラーゼの定性的および定量的検定のため
の新規の鋭敏な方法、GENE １０８１：２１１−２１７ Peter H．Schreier，Elisabeth A．Seftor，Jozef Sche
llおよびHans J．Bohnert（１９８５年）光調整の合成
を管理する核をコードする配列の使用、および、異質タ
ンパク質の植物クロロプラスト中への輪送、ENBO J Vo
l．４、Ｎｏ．１：２５−３２。
【００６３】下記の公開された特許出願も示す。 ヨーロツパ特許公開−Ａ 116,718 ヨーロツパ特許公開−Ａ 159,418 ヨーロツパ特許公開−Ａ 120,515 ヨーロツパ特許公開−Ａ 120,516 ヨーロツパ特許公開−Ａ 172,112 ヨーロツパ特許公開−Ａ 140,556 ヨーロツパ特許公開−Ａ 174,166 ヨーロツパ特許公開−Ａ 122,791 ヨーロツパ特許公開−Ａ 126,546 ヨーロツパ特許公開−Ａ 164,597 ヨーロツパ特許公開−Ａ 175,966 ＰＣＴ特許 84／02913 ＰＣＴ特許 84／02919 ＰＣＴ特許 84／02920 ＰＣＴ特許 83／01176 ヨーロツパ特許公開−Ａ 0,270,356
【図１】本発明の実施例におけるプラスミドｐＳＲ ２
−４における各遺伝子の配置を示す略図である。
−４における各遺伝子の配置を示す略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラウス・シユテンツエル ドイツ連邦共和国デー4000デユツセルドル フ13・ルドルフ−ブライトシヤイト−シユ トラーセ３ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 CD12 CD13 CD17 4B024 AA07 AA08 BA12 CA04 DA01 DA05 EA04 EA05 FA02 FA18 GA14 GA21
Claims (10)
- 【請求項１】 菌・かびおよび動物性有害生物に対して
イネもしくはとうもろこしの抵抗力を増大させるための
リゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造物の使用方
法であって、該遺伝子構造物が、Ｔｉプラスミド由来の
ＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプ
チド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺
伝子融合物から成るかまたは該キメラ遺伝子融合物を含
んで成ることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 菌・かびおよび動物性有害生物に対して
増大した抵抗力を有するイネもしくはとうもろこしを作
出すためのリゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造
物の使用方法であって、該遺伝子構造物が、Ｔｉプラス
ミド由来のＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシ
グナルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子
のキメラ遺伝子融合物から成るか、または該キメラ遺伝
子融合物を含んで成ることを特徴とする方法。 - 【請求項３】 リゾチーム遺伝子構造物が非植物性起源
のリゾチーム遺伝子を有する請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項４】 リゾチーム遺伝子構造物がにわとりのア
ルブミンリゾチーム遺伝子および／またはＴ４−フアー
ジリゾチーム遺伝子を有する請求項１または２記載の方
法。 - 【請求項５】 リゾチーム遺伝子構造物がプラスミドｐ
ＳＲ２−４上に存在するものであるか或いは、本質的に
それと同様に作用するそのＤＮＡ配列を有する請求項１
〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 菌・かびおよび動物性有害生物に対する
抵抗力を増大させるためにプロトプラストを包含するイ
ネもしくはとうもろこしの細胞または種子および該植物
の部分を包含するイネもしくはとうもろこしを形質転換
するためのリゾチームを発現するリゾチーム遺伝子構造
物の使用方法であって、該構造物が、Ｔｉプラスミド由
来のＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナル
ペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキメ
ラ遺伝子融合物から成るかまたは該キメラ遺伝子融合物
を含んで成ることを特徴とする方法。 - 【請求項７】 菌・かびおよび動物性有害生物に対する
増大した抵抗力を有し、そしてゲノム中に１個以上のリ
ゾチーム遺伝子構造物を担持する形質転換されたプロト
プラストを包含するイネもしくはとうもろこしの細胞あ
るいは種子および植物の部分を包含するイネもしくはと
うもろこしであって、該遺伝子構造物がＴｉプラスミド
由来のＴＲプロモーター、大麦α−アミラーゼのシグナ
ルペプチド配列および１個以上のリゾチーム遺伝子のキ
メラ遺伝子融合物から成るか、または該遺伝子融合物を
含んで成ることを特徴とするイネもしくはとうもろこ
し。 - 【請求項８】 （ａ）Ｔｉプラスミド由来のＴＲプロモ
ーター、大麦α−アミラーゼのシグナルペプチド配列お
よび１個以上のリゾチーム遺伝子のキメラ遺伝子融合物
から成るか、または、これらのキメラ遺伝子融合物を含
んで成ることを特徴とする、１個以上のリゾチーム遺伝
子構造物がプロトプラストを包含するイネもしくはとう
もろこしの細胞のゲノム中に導入され、そして、適宜、 （ｂ）完全に形質転換された該植物が、形質転換された
該植物細胞（プロトプラストを含む）から再生され、そ
して適宜、 （ｃ）該植物（種子を含む）の所望の部分が結果として
得られる形質転換された該植物もしくはそれらの子孫か
ら得られる、ことを特徴とする、請求項７記載の、菌・
かびおよび動物性有害生物に対して増大した抵抗力を有
する形質転換されたプロトプラストを包含するイネもし
くはとうもろこしの細胞または種子および植物の部分を
包含するイネもしくはとうもろこしの作出方法。 - 【請求項９】 菌・かびおよび動物性有害生物に対して
増大した抵抗力を有するイネもしくはとうもろこしの種
子、枝条または台芽を作出すため、あるいは、新規な該
植物またはそれらの双子葉植物の種子、枝条または台芽
を作出すための、請求項７記載の、形質転換したプロト
プラストを包含するイネもしくはとうもろこしの細胞ま
たは種子および植物の部分を包含するイネもしくはとう
もろこしの使用方法。 - 【請求項１０】 請求項７記載の形質転換したイネもし
くはとうもろこしの細胞あるいは該植物を繁殖させるこ
とによって得ることのできる、菌・かびおよび動物性有
害生物に対して増大した抵抗力を有する、イネもしくは
とうもろこしの種子、枝条または台芽。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3926390A DE3926390A1 (de) | 1989-08-10 | 1989-08-10 | Verwendung von lysozym genen in pflanzen zur resistenzerhoehung |
| DE3926390.8 | 1989-08-10 |
Related Parent Applications (1)
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