JP2008516627A - 組み換えタンパク質発現系及びその応用 - Google Patents
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Abstract
Description
アグロバクテリウムは、ベクター及び細菌の選択に不可欠な抗生物質の存在下で、28℃で培養される。2日間の培養後、600nmでの細菌の光学濃度は、分光光度計を用いて評価される。細菌は、0.5のDOを得るために、MgCl2溶液中で沈殿し、かつ懸濁状態に置かれる。この溶液は、アグロバクテリウムの毒性を増加させるために、アセトシリンゴンを添加される。溶液は、3〜24時間、外界温度でインキュベートされる。アグロバクテリウムは、針のない注射器によって浸潤される。植物の葉に加えられる1回の圧力によって溶液が葉全体に浸潤することが可能になる。植物は、培養室に戻され、かつ採取は、浸潤後の異なる時間で行われる。
アグロバクテリウムツメファシエンスの液体培養物は、28℃で一晩インキュベートされる。細菌培養物は、固体培地に塗布され、かつ28℃でインキュベートされる。2日後、細菌の床は、液体培地(BY2の細胞懸濁液を培養するための培地、又はOryza sativa var.O2428の同時培養の培地)中で懸濁状態に置かれる。この培地は、アセトシリンゴンを添加される。アグロバクテリウム溶液は、細胞懸濁液によって数時間インキュベートされる。洗浄後、細胞懸濁液は、培養室に戻される。
基質中に、葉の断片又は採取された細胞懸濁液を置く。基質の浸透を容易にするために、10分間の真空の後、テストは、37℃に一晩置かれる。GUS遺伝子が発現される時に、葉又は細胞の青い着色が現れる。図1に、Oryza sativa var.O2428の細胞懸濁液中(図1A)、及びBY2の細胞懸濁液中(図1B)での視覚化を可能にするテストの結果を報告する。
葉又は細胞は、破砕される。次にタンパク質は、タンパク質用抽出緩衝液(Na2EDTA 0.5m pH8、N−ラウリルサルコシン、純トリトン、NaHPO4、50mM、pH7)を用いて抽出され、かつ2回繰り返して遠心分離される。蛍光定量テストは、上清に適用される。タンパク質の量に応じた上清の酵素活性を決定するために、ブラッドフォードテストによってタンパク質の定量化を実施する。このために、クーマシーブルーが、タンパク質に添加される。外界温度で15分間の撹拌及びインキュベーション後、595nmで光学濃度を測定する。595nmでの光学濃度と、タンパク質の量を対応させるために、標準範囲は、様々なBSA(ウシ血清アルブミン)濃度によって確立される。その場合、試料1μl当たりのタンパク質のμgでの濃度が得られる。
タンパク質発現を増加させるために、GUSレポーター遺伝子を含むベクターは、P1、p19又はP1及びp19サイレンシングサプレッサー遺伝子に組み合わされた。
Claims (12)
- ウイルス発現ベクターを含み、該ウイルス発現ベクターは、関心の対象である遺伝子、ベクター発現ウイルスの下流に置かれたレポーター遺伝子、真核細胞遺伝子の発現に適した遺伝子、または、構成的プロモーターの下流に置かれた関心の対象である遺伝子を含む構成物の上流に、構成的かつ普遍的プロモーターを含み、これらの構成物が、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、イネ黄色モットルウイルス(RYMV、Rice Yellow Mottle Virus)のサイレンシングサプレッサーであるP1遺伝子を更に含む構成物によって補完されることを特徴とする植物における組み換えタンパク質の一過性発現系。
- 関心の対象である遺伝子の上流にRYMVの複製部分を更に含むことを特徴とする請求項1に記載の系。
- 前記ベクターが、前記構成的かつ普遍的プロモーターの下流に置かれた、サイレンシングサプレッサー遺伝子を発現する1つまたは幾つかの独立した構成物を追加されることを特徴とする請求項1または2に記載の系。
- 関心の対象である遺伝子が、β−グルクロニダーゼをコードするGUS遺伝子のような、可視又は蛍光定量法によって容易に検出可能な遺伝子から選択されるレポーター遺伝子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の系。
- GUS遺伝子が、CaMVの35Sプロモーターの下流に置かれることを特徴とする請求項4に記載の系。
- 使用されるベクターが、pCambia 1305.1のような、プラスミドであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の系。
- 病原菌を介して植物系中に、請求項1〜6のいずれか1つに定義されたようなベクターを導入することと、一過性ベクター発現を検出することを含むことを特徴とする組み換えタンパク質の生成方法。
- 利用される植物系が、植物全体であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 利用される植物系が、細胞懸濁液であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 植物系中への導入が、アグロバクテリウム浸潤、又は同時培養によって行われることを特徴とする請求項7〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞懸濁液中へのベクター導入が、細胞懸濁液による細菌の同時培養によって行われることを特徴とする請求項7〜9のいずれか1つに記載の方法。
- 工業的、特に医薬上の関心の対象であるタンパク質を生成するための、請求項1〜6のいずれか1つに記載の組み換えタンパク質の一過性発現系又は請求項7〜11のいずれか1つに記載の方法の応用。
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