KR100803564B1 - 복합 스트레스 내성 선발 마커-프리 형질전환 감자 - Google Patents

복합 스트레스 내성 선발 마커-프리 형질전환 감자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선발 마커가 도입되지 않은 복합환경 스트레스 내성 형질전환 감자 식물체의 제조에 관한 것으로, 마커-프리 형질전환 벡터에 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter) 및 복합스트레스 내성 유전자가 도입된 복합스트레스 내성 감자 식물체 제조용 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 감자 식물체 및 상기 감자 식물체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 마커-프리 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 경우, 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소의 발생을 유발하는 다양한 환경오염에 의한 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제조할 수 있어 농작물의 생산성을 증대시킬 수 있을 뿐만 아니라 선발 마커로 사용되는 항생제 저항성 유전자가 도입되지 않아 증대되는 형질전환 작물의 일반대중의 염려를 경감할 수 있다.
선발 마커-프리 (selection marker-free) 형질전환 벡터, 복합스트레스 내성 감자

Description

복합 스트레스 내성 선발 마커-프리 형질전환 감자{Multiple stress-resistant selection mark-free transformed potato}
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 CuZnSOD (superoxide dismutase)와 APX (ascorbate peroxidase) 유전자를 동시에 발현시키는 벡터의 제조과정(a) 및 상기 유전자를 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터, pSSA-F (b)를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터(pSSA-F 벡터)를 이용하여 제조된 형질전환 감자(품종: 수미)를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 단계별 형태를 나타낸 사진이다.
도 3은 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현 벡터(pSSA-F 벡터)로 형질전환된 감자 식물체에서 SWPA2 프로모터의 증폭을 확인한 전기영동 사진이다.
도 4은 유전자 도입이 확인된 형질전환 감자식물체에 150 μM 농도의 메틸 비올로겐 (methyl viologen, MV)을 처리하고 96시간 후에 RNA를 추출하여 CuZnSOD 및 APX 유전자의 발현을 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재된 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 확인한 사진이다.
도 5는 3 μM 농도의 메틸 비올로겐 (methyl viologen, MV) 용액에서 형질전 환체의 잎 절편을 60 시간 동안 처리하면서 용액의 이온전도도를 측정하여 NT 식물체 및 형질전환 식물체의 잎 절편체에서의 막 손상율을 조사한 것이다.
본 발명은 선발 마커가 도입되지 않은 복합 환경 스트레스 내성 형질전환 감자 식물체의 제조에 관한 것으로, 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 프로모터 (oxidative stress inducible promoter)에 복합스트레스 내성 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
식물을 비롯한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스뿐만 아니라 지구 환경 악화에 따라 발생하는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투압 충격(osmotic shock)과 같은 다양한 환경 스트레스를 받게 된다. 특히, 식물은 상기와 같은 다양한 환경 스트레스를 받게 되면, 생명 유지에 필요한 필수 원소이지만 반응성이 높은 산소가 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2 -), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 수산화 라디칼(hydroxyl radical) 등의 활성 산소로 변하여 생체 내에서 심각한 생리적인 장해 등을 유발하게 된다. 즉, 세포 내의 활 성 산소의 양이 미량으로 존재하는 경우에는 이들 활성 산소는 세포 내의 신호전달물질로서 작용하여 식물 생체방어에 필요한 유전자(항산화효소, 열충격 단백질 등)의 발현을 유도하지만, 활성 산소의 양이 증가하는 경우에는 반응성이 높은 활성 산소가 농도 의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 생리적인 장해를 유발하여 세포를 죽음에 이르게 한다.
최근, 많은 연구자들은 식물에서 이들 활성 산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에 대해 많은 관심을 갖고 있는데, 이는 이들 경로를 조절하게 되면 세포내의 항산화효소 및 생체방어 단백질의 발현을 증가시킬 수가 있고, 궁극적으로는 각종 환경스트레스에 대한 내성을 갖는 식물체를 개발할 수 있기 때문이다 (Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000). 최근의 보고에 의하면, 식물에서 활성 산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에는 MAP 카이네즈 케스케이드(MAPK cascade)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000).
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase, SOD)는 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 (O2 -)을 과산화수소 (H2O2)로 전환시키는 효소로, 환경스트레스에 의해 최초로 증가되는 생체 내 수퍼옥사이드 음이온 라디칼을 소거하여 환경스트레스 내성의 중요 인자로서 중요성이 증대되고 있다. 이들은 함유하고 있는 금속보족원소에 따라 CuZnSOD, FeSOD 및 MnSOD로 구분되며, 세포내 위치도 다른데 CuZnSOD는 세포질과 엽록체에 존재하고, MnSOD는 미토콘드리아에, FeSOD는 엽록체에서 기능을 수 행하는 것으로 알려져 있다. 이들 SOD 유전자를 도입한 형질전환 식물체는 다양한 환경스트레스, 오존, 저온, 제초제 등의 환경 스트레스에 대한 내성이 강화되었다 (Sen Gupta et al., Plant Physiology, 10: 1049-1054, 1995; 미국특허 제 5,538,878 호).
한편 아스코베이트 퍼옥시다제 (ascobate peroxidase, APX)는 아스코베이트를 전자 공여체로 사용하여 H2O2를 물로 전환시키는 효소로서 식물체와 곤충에서 발견되며, 식물체에서는 세포질, 엽록체의 스트로마 및 틸라코이드 막에 존재하는 것으로 밝혀져 있다(Allen et al., Free Rad. Biol. Med. 23: 473-479, 1997). 식물체의 엽록체에는 비교적 높은 농도의 산소가 상존하고 빛 에너지를 이용하여 물을 분해하는 과정에서 발생되는 전자에너지를 활용하기 때문에 다양한 산화스트레스에 민감하게 반응한다. 따라서 스트레스 조건에 식물체가 노출되었을 때 엽록체에서 발생하는 산화스트레스를 효율적으로 경감시키기 위해 엽록체의 항산화능력을 강화한다면 환경스트레스 조건에서도 식물의 생산성을 유지할 수 있을 것으로 기대된다.
한편, 현재까지 스트레스 내성 식물체 개발에는 특정 조건에 관계없이 항상 발현되는 CaMV 35S 프로모터에 특정 스트레스에 강한 유전자를 결합한 발현 벡터를 사용한 것이 대부분이어서, 특정한 스트레스에 대해서만 내성을 나타내는 식물체가 제조되었다. 따라서 다양한 스트레스 조건에서 발현이 가능한 프로모터 및 내성 유전자를 포함하는 발현 벡터, 및 상기발현 벡터로 형질전환된 식물체의 제조에 대한 필요성이 제기되어 왔다. 또한 형질전환 식물체의 제작에 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자는 형질전환체에 대한 일반 대중의 나쁜 인식에 중요한 요인이었다. 이에, 본 발명자들은 항생제 저항성 유전자를 사용하지 않으며 환경 재해 내성 형질전환 농작물의 개발하기 위하여, 다양한 스트레스에 의해 발현이 유도되는 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터인 SWPA2 프로모터에 복합스트레스 내성유전자인 CuZnSOD (superoxide dismutase) 유전자 및 APX (ascorbate peroxidase) 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 신규한 형질전환용 발현 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터로 형질전환된 감자 식물체를 조직배양함으로써 재분화시킨 결과, 상기 식물체가 복합스트레스에 대한 내성이 크게 향상된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 선발 마커로 사용되는 항생제 저항성 유전자가 사용되지 않으며, 동시에 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 프로모터에 복합스트레스 내성 유전자가 결합되어 상기 유전자를 엽록체에 발현시키는 마커-프리 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 식물체의 제조 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성이 증가된 식물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5'에서 3' 방향으로 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터 및 복합스트레스 내성 유전자가 작동가능하게 연결되어 있으며, 선발 마커가 포함되지 않은 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 박테리아 선발용 항생제 내성 유전자, 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서열 (transcription terminator) 및 T-보더 서열(boarder sequence)을 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 선발 마커로 사용되는 항생제 저항성 유전자가 존재하지 않는 식물 형질전환 벡터 (pNL, 서열번호 8)에 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, 복합스트레스 내성 유전자, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), 및 T-DNA 보더 서열 (T-DNA boarder sequence)을 포함할 수 있다.
본 발명에서, "작동가능하게 연결된"은 이종 단백질을 발현하기 위한 단위로서 기능하는 발현 카세트의 성분을 말한다. 예를 들면, 단백질을 코딩하는 이종 DNA에 작동가능하게 연결된 프로모터는 이종 DNA에 해당하는 기능적 mRNA의 생산을 촉진한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 발현 벡터에서, 고구마 유래의 상기 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터는 서열번호 9의 염기서열로 이루어지는 SWPA2 (sweetpotato peroxidase anionic 2) 프로모터가 바람직하고, 상기 복합스트레스 내성 유전자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어지는 CuZnSOD 유전자 (GenBank Accession 번호 X56435), 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 APX 유전자 (GenBank Accession 번호 X62077)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 프로모터, CuZnSOD 유전자 및 APX 유전자는 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기 서열과 각각 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더 더욱 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명자들은 상기의 방법으로 제조된 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터 pSSA-F를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행 (Korean Collection for Type Cultures)에 2006년 11월 1일자로 기탁하였다. pSSA-F 발현 벡터의 수탁 번호는 KCTC11010BP이다.
SWPA2 프로모터는 본 발명자들이 고구마 (Ipomoea batatas)에서 분리된 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)로서, 재해 내성 식물 및 기타 유용물질 생산 식물 세포주 개발에 활용이 기대되는 유전자이다 (대한민국 특허 등록 제0437266호, 2004년 6월 14일; 미국특허 등록 제095224호, 2004년 6월 23일; Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003). 구체적으로, SWPA2 프로모터는 배양세포 고발현 퍼옥시다제 프로모터로서 산화스트레스에 의해서 발현이 유도되며, 특히 고구마 현탁 배양세포 및 형질전환 담배 현탁 배양세포에서 대수 증식기 후반에 강하게 발현된다. 상기 프로모터는 담배 원형질체를 이용한 GUS 단백질의 일시적 분석(transient assay)에서 CaMV 35S 프로모터보다 약 30배 높은 활성을 나타낸다. 또한, 정상적인 상태의 식물체 잎에서는 전혀 발현되지 않지만 상처, 저온, 오존 등 산화적 스트레스를 받았을 때, 발현이 유도되는 특성, 즉 산화적 스트레스에 의하여 발현이 유도되는 프로모터이다(Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003).
본 발명의 SWPA2 프로모터는 스트레스에 의해 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 SWPA2 프로모터는 ABA, 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 상처, 저산소증, 활성 산소, 열 또는 질소에 의한 외부 환경으로부터의 스트레스를 인식하는 인자들을 포함한다. SWPA2 프로모터는 이러한 특성을 이용하여 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열 및 상기 프로모터 서열과 작동가능하도록 연결된 구조 유전자로 이루어진 융합 유전자 구조물의 제조에 이용될 수 있다. 상 기 융합 유전자 구조물은 유용물질의 생산과 관련된 구조 유전자를 SWPA2 프로모터 유전자에 연결하여 다양한 환경 스트레스하에 SWPA2 프로모터의 조절을 받아 유용물질을 발현할 수 있으므로, 유용물질을 생산하기 위한 형질전환체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 융합 유전자 구조물에 다양한 환경 스트레스에 대해 내성을 나타내는 유전자를 구조 유전자로 사용하면 외부적인 스트레스에 대해 내성을 갖는 형질전환체의 제조에도 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 SOD 유전자는 일반적으로 30종 이상의 다수의 식물로부터 분리되지만, 본 발명에서 사용된 완두의 CuZnSOD 유전자는 다양한 산화적 스트레스에 대한 내성을 부여하는 것 (Sen Gupta et al., Proc Natl Acad Sci 90: 1629-1633, 1993)으로 알려져 있으며, APX 유전자로는 완두에서 분리된 유전자가 사용될 수 있다(Allen et al., Free Rad. Biol. Med. 23: 473-479, 1997). 또한 CuZnSOD 및 APX 유전자가 동시 발현되는 형질전환 담배는 각 유전자를 단독으로 발현하는 담배 식물체보다 높은 산화 스트레스에 대한 내성이 나타난다 (Kwon et al., Plant Cell Environ 25: 873-882, 2002).
본 발명자들은 상기 서열번호 9로 기재되는 SWPA2 프로모터를 pRW20 벡터에 연결하여 pSA 벡터를 제조하였으며, 상기 pSA 벡터에 서열번호 11로 기재되는 CuZnSOD 유전자를 도입하여 pSS-1 벡터를 제조한다 (도 1a 참조). 이어, 상기 pSS-1 벡터에서 SPWA2pro-TEV-TP-CuZnSOD-35S 전사종결서열 구조를 선발 마커가 없는 식물 형질전환용 발현 벡터 (pNL, 서열번호 8)에 도입한 후, pSA 벡터에서 분리된 SWPA2pro-TEV-TP-APX-35S 전사종결서열 구조를 삽입하여 최종적인 복합스트레스 내 성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터 pSSA-F를 제조한다 (도 1b 참조). 상기 pSSA-F 발현 벡터는 SWPA2 프로모터 및 CuZnSOD 및 APX 유전자 이외에 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator)을 포함하고 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 35S 터미네이터, 노팔린 신타아제(NOS) 터미네이터 또는 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체를 제공한다. 이때, 형질전환된 식물체로는 모든 식물체가 이용 가능하지만, 감자가 바람직하다. 바람직하게는, 상기 발현 벡터는 pSSA-F이다.
본 발명은 SWPA2 프로모터, CuZnSOD 유전자 및 APX 유전자가 포함된 복합스트레스내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터를 식물체에 형질전환시켜 식물체 내에서 CuZnSOD 유전자 및 APX 유전자를 대량으로 발현하는 복합스트레스 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 실시예에서는 상기에서 제조된 pSSA-F 발현 벡터를 모든 식물체, 바람직하게는 감자에 도입하여 CuZnSOD 유전자 및 APX 유전자를 발현시킨다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 발현 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) AGL0를 이용하여 상기 감자 어린잎 또는 엽병 절편체에 감염시켜 형질전환체를 제조한 뒤, 상기 형질전환체를 조직배양함으로써 식물체의 각 기관으로 재분화시킨다(도 2a 참조). 또한, 상기 재분화된 형질전환 감자 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 PCR에 의해 상기 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자를 증폭시킴으로써 상기 식물체의 게놈 내에 상기 SWPA2 프로모터 또는 APX 유전자가 도입되었음을 확인한다 (도 2b 참조). 아울러, 상기 PCR에 의해 형질전환되었음이 확인된 각 식물체를 대상으로, RNA를 분리하여 도입유전자의 발현을 RT-PCR로 분석하고 (도 3 참조), 형질전환 식물체의 산화스트레스에 대한 내성을 분석한다 (도 4 참조).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터로 식물체 또는 배양세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환체로부터 형질전환된 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 복합스트레스 내성 형질전환 식물체의 제조 방법의 일 구현예로서,
i) SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현 벡터를 제조하는 단계;
ⅱ) 상기 발현 벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법을 포함한다.
이때, 상기 발현 벡터는 pSSA-F 발현 벡터인 것이 바람직하고, 상기 식물체 또는 배양세포는 모든 식물체, 바람직하게는 감자이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에서의 형질전환은 아그로박테리아(Agrobacteria), 바람직하게는 아그로박테리아 튜머파시엔스(Agrobacteria tumefacies)에 의해 매개될 수있다.
본 발명자들은 바람직한 실시예에서 발현 벡터로 pSSA-F 벡터를 사용하고, 상기 발현 벡터는 SWPA2 프로모터, SOD 유전자 및 APX 유전자 이외에 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV) 선도서열, CaMV 35S 전사 종결서 열(transcription terminator)을 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환 식물체의 제조 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성이 증가된 식물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 복합스트레스 내성 유전자의 발현 벡터인 pSSA-F의 제조
본 발명자들에 의해 제조된 서열번호 9로 기재되는 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터 (대한민국 특허 등록 제0437266호, 2004년 6월 14일; 미국특허 등록 제095224호, 2004년 6월 23일; Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003)에 서열번호 10으로 기재되는 완두의 CuZnSOD (CuZn superoxide dismutase)를 코딩하는 cDNA (GenBank Accession 번호 X56435) 및 서열번호 11로 기재되는 완두의 APX (ascorbate peroxidase; Randy, et al., Free Rad. Biol. Med., 23: 473-479, 1997)를 코딩하는 cDNA (GenBank Accession 번호 X62077)가 연결 (ligation)된 벡터를 제조하였다.
본 발명자들이 앞서 출원한 특허 (대한민국 특허 공개번호 10-2005-0044850)에 기재된 pSA 벡터를 이용하였다. 이는 SWPA2 프로모터에 완두로부터 분리한 APX (ascorbate peroxidase)가 연결되어 있는 구조이며, 도1a에 표시하였다.
pSA 벡터의 APX 유전자를 완두의 CuZnSOD 유전자로 교체하기 위하여, CuZnSOD 발현 벡터 (Texas Tech University로부터 입수, Pro Natl Acad Sci USA 90: 1629-1633, 1993)를 서열번호 3 및 서열번호 5로 기재되는 프라이머를 이용하고, 94℃에서 1분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 이루어지는 1 사이클의 PCR을 30회 수행하여 완두의 CuZnSOD 유전자를 증폭하고, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 완두의 CuZnSOD 유전자를 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다. 이어, 염기서열 분석에 의해 상기 목적하는 완두의 CuZnSOD 유전자가 정확하게 증폭되었음을 확인하였다. 상기 프라이머 염기서열 4번에 존재하는 XbaI 절단부위 및 증폭 DNA 내에 존재하는 SalI 절단 부위가 존재하기 때문에, SalI 및 XbaI을 처리하여 완두의 CuZnSOD 유전자가 클로닝된 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터로부터 완두의 CuZnSOD 유전자를 분리하고, 동일한 제한효소에 의해 절단된 상기 pSA 벡터에 완두의 CuZnSOD 유전자를 도입하였다. 상기 방법으로 구축된 벡터를 pSS-1 벡터라 명명하였다(도 1a).
최종적으로, 선발 마커가 포함되지 않은 벡터인 pNL (서열번호 8)를 이용하여 CuZnSOD 및 APX를 동시에 형질전환하기 위한 식물 형질전환용 벡터인 pSSA-F 벡터를 제조하였다. 구체적으로, 상기 pSS-1 벡터를 Hind Ⅲ로 절단하여 얻은 약 2.0kb 크기의 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단된 pNL 플라스미드에 도입하였다. 여기에 pSA를 PstI으로 절단하여 얻은 2.3kb 크기의 DNA 절편을 도입하여 CuZnSOD 및 APX 유전자가 동시에 도입된 발현 벡터인 pSSA-F를 각각 구축하였다(도 1b). 본 발명자들은 상기 제조된 pSSA-F 발현 벡터를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행 (KCTC)에 2006년 11월 1일자로 기탁하였으며, 상기 pSSA-F 벡터의 수탁번호는 KCTC11010BP이다. 상기 도 1a 및 도 1b에서 SWPA2 pro: 산화스트레스 유도성 프로모터, E35S pro: 증가된 (enhanced) CaMV 35S 프로모터, TEV: 담배 식각 바이러스 (tobacco etch virus, TEV) 선도서열, TP: 완두 CuZnSOD (구리ㆍ아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, superoxide dismutase)의 신호서열, 35S 3': CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), Amp: 항생제 (ampicillin) 내성 유전자, H: Hind Ⅲ, P: PstI, Xh: XhoI, R: EcoR I, N: NcoI, S: SalI, B: BamH I, X: XbaI, 및 Sa: SacI이다. 안(An)의 방법(An, Meth. Enzymol., 153: 292-305, 1987)을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) AGL0 (Lazo et al., Bio/Technol. 9: 963-967, 1991)에 상기에서 제조된 식물 형질전환용 발현 벡터 (pSSA-F)를 도입하여 감자의 형질전환체를 제조하였다.
<실시예 2> pSSA-F 발현 벡터를 이용한 형질전환 감자의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 pSSA-F 벡터를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 AGL0와 감자 식물체의 절편체를 공동배양하여 감자를 형질전환시켰다. 구체적으로, 형질전환에 사용된 감자 (Solanum tuberosum L.) 식물체는 국내의 식용 품종인 수미(Superior)를 배양기 내에서 배양하였다. MS (Murashige and Skoog, Physiol. Plant., 15: 473-497, 1962) 배지에 3%의 수크로스(sucrose)를 첨가하여 16시간 광/8시간 암 주기, 및 40μ㏖·m-2·sec-1의 냉백 (cool-white) 형광의 조건하에 25℃ 배양실에서 상기 감자 식물체를 배양하였으며, 2주 동안 배 양한 신초 (shoot)의 상부로부터 2 내지 3번째의 어린잎 및 엽병 (petiole)을 절취하여 형질전환 재료로 사용하였다. 카나마이신 50 ㎎/ℓ 및 스펙티노마이신 100 ㎎/ℓ이 첨가된 LB 배지 (박토펩톤 (bacto peptone) 10 g/ℓ, 효모 추출액 (yeast extract) 5 g/ℓ 및 NaCl 10 g/ℓ) 5 ㎖에 아그로박테리아를 접종하여 28℃ 진탕배양기 (shaking incubator)에서 하루 동안 배양한 아그로박테리아 배양액 100 ㎕, 및 감자 식물체의 잎 절편체를 MS 기본 액체배지 10 ㎖가 들어있는 페트리 디쉬 (petri dish)에 넣어 충분히 혼합한 후 25℃의 암 조건하에서 2일 동안 공동배양하였다. MS 기본 액체배지로 아그로박테리아를 세척한 후, 멸균된 필터 페이퍼로 공동배양한 감자 잎 및 엽병 절편체의 물기를 제거하였다. 이어, 잎과 엽병 절편체를 신초유기배지 (제아틴(zeatin) 2 ㎎/ℓ, NAA (α-naphthaleneacetic acid) 0.01 ㎎/ℓ, GA3 (지베렐린) 0.1 ㎎/ℓ, 클라포란 (claforan) 300 ㎎/ℓ 를 포함하는 MS 배지)에서 배양하였다. 3주 간격으로 신선한 배지로 옮겨 계대 배양하였으며, 약 3 내지 약 4주 동안 배양하였을 때 신초(shoot)의 발생이 캘러스(callus)와 함께 유도되었다. 잎이 1 내지 2장 정도 나왔을 때, 뿌리 유도 배지 (클라포란 300 ㎎/ℓ 를 포함하는 MS 기본 배지)로 옮겨 뿌리의 발생을 유도하였다. 뿌리는 대부분의 신초로부터 잘 유도되었으며, 뿌리가 발달된 소식물체를 배양 용기에서 꺼내 외기에 4 내지 5일 동안 노출시키고 (배양실에서 순화시키고), 원예용 상토 화분으로 옮긴 후 배양기에서 재배하였다 (도 2). 그 결과, 기내에서 증식한 감자 식물체로부터 마이크로튜버(microtuber)가 형성되었다 (도 2). 외부 유전자의 도입에 의해 형성된 형질전환된 감자 식물체는 비-형질전환된 감자 식물체와 외형적인 차이는 발견 되지 않았다.
<실시예 3> PCR을 사용한 형질전환체의 확인
상기 실시예 2에서 제조된 형질전환 감자 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 완전한 식물체로 분화된 개체를 대상으로 SWPA2 프로모터의 특이 프라이머인 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 이루어지는 1 사이클의 PCR을 30회 수행하여 SWPA2 프로모터를 증폭함으로써 형질전환체를 선발하였다 (도 3). 형질전환 식물체의 제작에 항생제 저항성 유전자 등 선발 마커가 사용되지 않아, 유전자의 도입여부를 PCR로 조사하였다. 구체적으로, 배양기에서 생육중인 수미 식물체 각각의 잎으로부터 디엔이지
Figure 112006089756230-pat00001
플랜트 맥시 키트(DNeasy
Figure 112006089756230-pat00002
Plant Maxi kit, QIAGEN 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 100 ng을 상기의 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수해하였다. 7 차례의 형질전환 시도에서 556개의 신초가 유기할 수 있었으며, 이중 12 개체에서 PCR 분석으로 유전자 도입을 확인할 수 있었다. 그 결과, 아그로박테리움(Agrobacterium)과 공동 배양 후 재분화된 식물체 중 약 2.2%의 식물체에서 유전자의 도입을 확인할 수 있었다 (표 1 참조). 외래 유전자가 도입된 식물체의 경우에 0.5kb의 단편이 증폭되어 SWPA2 프로모터가 도입되었음을 확인하였다. 상기 도 3에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 감자 식물체, 1-12: 유전자 도입 형질전환 감자 식물체, 및 PC: 양성 대조군 DNA (positive control DNA)이다.
표 1. 재분화된 신초 중 유전자도입을 PCR 확인한 결과
실험 차수 재분화된 신초수 PCR 확인된 개체수 형질전환율(%)
1 89 1 1.12
2 130 1 0.7
3 113 1 0.9
4 80 3 3.75
5 32 2 6.25
6 51 2 3.9
7 61 2 3.3
계 556 12 2.2
<실시예 4> 형질전환 식물체에서 도입유전자 발현 분석을 위한 RT-PCR 분석
SWPA2 프로모터는 정상적으로 성장하는 식물체에서는 활성이 없으나 다양한 스트레스 조건에서는 활성이 증가되어 하류의 유전자 발현을 유도하는 특성이 있다 (Plant Mol Biol, 51: 831-838, 2003). 따라서 PCR로 유전자의 도입이 확인된 식물체를 대상으로 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 이를 위해 형질전환 식물체에 150 μM의 메틸 바이올로젠 (methyl viologen, MV)를 살포하고 96시간 경과 후 잎을 채취하여 RNA를 CTAB 완충액 및 LiCl를 사용하는 Kim과 Hamada의 방법 (Kim and Hamada, Biotech Lett 27: 1841-1845)으로 분리하였다. 구체적으로 상기의 처리를 한 1 g의 감자잎을 액체 질소를 이용하여 파쇄하고 65℃로 미리 준비한 10 ml의 CTAB 완충액 (2% (w/v) cetyltrimethylethylamonium bromide, 0.1 M Tris/HCl (pH 9.5), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 1% (w/v) β-mercaptoethanol)에 넣어 잘 섞은 후, 65℃에 수조에서 한 시간 방치한다. 여기에 동일 부피의 클로로포름/이소아밀 알코올 (24:1) 용액을 첨가한 후 잘 섞은 다음 11,000 rpm에서 10분간 원심분리한다. 상징액을 취하고 여기에 1/4 부피의 10 M LiCl를 첨가하고 -20℃ 냉동고에 3 시간 이상 방치한 후 원심분리하여 RNA를 침전시킨다. 최종적으로 분리한 RNA를 이용하여 (주)바이오니아의 AccuPower RT-PCR premix를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 공급자의 방법에 따라 완두의 APX 유전자에 특이적인 프라이머 (서열번호 4) 및 CuZnSOD 유전자 특이 프라이머 (서열번호 5) 및 , 또는 감자 액틴 유전자 특이 프라이머 (서열번호 7)과 1 μg의 RNA를 혼합하여 70℃에서 5분 동안 처리한 후 얼음에 보관하였다. 이 혼합물과 TEV 서열에 특이적인 프라이머 (서열번호 3) 또는 감자의 액틴 유전자 특이 프라이머 (서열번호 6)를 AccuPower RT-PCR premix가 함유된 튜브에 넣고, 42℃에서 60분 처리하고 94℃에서 5분 처리하여 역전사시킨 후, 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 이루어지는 1 사이클의 PCR을 30회 수행하여 유전자의 증폭을 확인하였다. 상기 도 4에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 감자 식물체, 1-9: 유전도입 형질전환 감자 식물체이다.
<실시예 5> 형질전환 감자 식물체 잎 절편체 (leaf disc)의 산화 스트레스에 대한 내성 특성
형질전환 감자(품종: 수미) 식물체의 산화 스트레스에 대한 내성을 조사하기 위하여 비-형질전환 식물체 (NT 식물체) 및 형질전환 식물체를 온실에서 생육하였다. 생육 7주 된 식물체의 잎 (상부로부터 5 내지 7번째 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 3 μM의 메틸 비올로겐 (methyl viologen, MV)을 각각 포함하는 0.4 M 소비톨(sorbitol) 용액 5 ㎖에 띄우고, 12 시간 동안 암 상태에서 배양 하여 MV를 흡수하도록 하였다. 암 처리 후에 광 상태에서 60시간 동안 배양하면서 전기 전도도계 (electrical conductivity meter, Orion, Model 162)를 이용하여 용액의 이온 전도도를 측정함으로써 잎의 손상 정도를 조사하였다 (도 5). MV를 처리 직후 (0 시간) NT 및 형질전환 식물체 잎의 이온 전도도는 20%로 유지하고 있었으나, 12시간 처리 후 NT 식물체의 잎 절편체는 32%의 손상이 관찰되었고, 1-2번 형질전환 식물체 및 7번 식물체의 잎 절편체는 NT 식물체와 비슷한 정도의 손상이 관찰되었다 (각각 32%, 33%, 35% 및 29%). 반면 3-7번 형질전환 식물체는 NT와 비교하여 비교적 낮은 수준의 손상이 관찰되었는데, 각각 20-24%의 손상이 관찰되었다. 이러한 현상은 시간의 경과에 따라서도 비슷한 경향을 나타내었는데, 3번 식물체와 5번 식물체는 60시간 경과 후에도 NT 식물체보다 각각 33% 및 35% 낮은 수준의 손상이 관찰되었다. 이 같은 결과로부터 형질전환 식물체가 NT 식물체에 비해 높은 내성을 나타냄을 알 수 있었으며, 이는 SOD 및 APX가 엽록체에 동시에 발현된 형질전환 감자 식물체는 MV에 의해 유도된 산화스트레스에 대해 내성이 증가되었음을 의미한다. 상기 도 5에서는 NT: 비-형질전환 식물체, SSA-F 형질전환체: pSSA-F 벡터가 도입된 식물체이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 마커-프리 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현 벡터로 형질전환된 식물체는 제초제 등 활성 산소를 유발시키는 다양한 환경오염에 의한 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.
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  8. 다음 단계를 포함하는 선발마커가 포함되지 않은 형질전환 식물체를 제조하는 방법:
    a) 도1의 형태로 제작한 선발마커를 포함하지 않는 형질전환 벡터를 제작하는 단계로서, 상기 벡터는 산화스트레스 유도성 프로모터 (서열번호 9) 및 완두 유래 CuZnSOD (서열번호 10) 및 APX (서열번호 11)를 작동가능하도록 연결하여 제작한 pSSA-F (KCTC11010BP)이며;
    b) 상기벡터를 식물체에 도입하는 단계로서,
    배양기에서 기내 배양한 감자 식물체 (수미 품종)의 잎 절편체 또는 엽병 절편체를 선발마커를 포함하지 않는 형질전환 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens AGL0과 공동배양한 후, 신초유기배지 (제아틴 (zeatin) 2 mg/L, NAA (α-naphthaleneacetic acid) 0.01 mg/L, GA3 (지베렐린) 0.1 mg/L, 클라포란 (claforan) 300 mg/L를 포함하는 MS 배지)에서 배양하여 신초를 유기하고 잎이 1 내지 2장 정도 나왔을 때 뿌리 유기배지 (클라포란 300 mg/L를 포함하는 MS 기본배지)로 옮겨 뿌리를 유도하며;
    c) 형질전환 식물체를 선발하는 단계로서,
    완전한 식물체로 발달한 식물체의 잎으로부터 분리한 DNA를 이용하고 도입한 유전자 특이적인 프라이머 (서열번호 1과 2)로 PCR을 수행하여 형질전환 식물체를 선별하고, 유전자 도입이 확인된 형질전환 식물체로부터 RNA를 추출하여 도입 유전자의 발현을 확인하는 RT-PCR 방법으로 확인하는 단계.
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  11. 제8항의 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성이 증가된 형질전환 감자 식물체.
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