KR100775037B1 - 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법 - Google Patents

복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)에 복합스트레스 내성 유전자가 결합된 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것에 관한 것으로, 구체적으로는 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터(SWPA2 프로모터)에 복합스트레스 내성 유전자(NDPK2 유전자)가 결합된 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것에 관한 것이다. 본 발명의 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 경우, 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소의 생성 등을 유발하는 다양한 환경 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제조할 수 있으므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량 생산 등에 크게 기여할 수 있다.

Description

복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 복합스트레스 내성 식물체의 제조방법{RECOMBINANT EXPRESSION VECTOR FOR PRODUCTION OF PLANTS HAVING MULTIPLE STRESS TOLERANCES, AND METHOD FOR PREPARING MULTIPLE STRESS-TOLERANT PLANTS USING THE SAME}
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 AtNDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자를 발현시키기 위한 벡터의 제조 과정(도 1a) 및 상기 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터(도 1b)를 나타낸 모식도이고,
도 2a는 본 발명의 발현벡터(pSN-K 벡터)를 이용하여 제조된 카나마이신 내성의 형질전환 감자(품종: 대서(Atlantic))를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 기관의 형태를 나타낸 사진이고, 도 2b는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현벡터(pSN-K 벡터)로 형질전환된 감자 식물체에서 AtNDPK2 유전자의 증폭을 확인한 전기영동 사진이고, 도 2c는 본 발명의 발현벡터(pSN-K 벡터)를 이용하여 제조된 형질전환 감자 식물체의 게놈(genome) 상에 AtNDPK2 유전자가 존재함을 확인한 서던블럿(Southern blot) 사진이고,
도 3a는 본 발명의 발현벡터(pSN-K 벡터)를 이용하여 제조된 카나마이신 내성의 형질전환 고구마(품종: 율미)를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 기관의 형태를 나타낸 사진이고,
도 3b는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현벡터(pSN-K 벡터)로 형질전환된 고구마 식물체에서 AtNDPK2 유전자의 증폭을 확인한 전기영동 사진이고,
도 4a는 본 발명의 발현벡터(pSN-H 벡터)를 이용하여 제조된 하이그로마이신 내성의 형질전환 톨페스큐(tall fescue)를 조직배양함으로써 재분화시킨 식물체의 각 기관의 형태를 나타낸 사진이고,
도 4b는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 PCR을 통해 본 발명의 발현벡터(pSN-H 벡터)로 형질전환된 톨페스큐 식물체에서 AtNDPK2 유전자의 증폭을 확인한 전기영동 사진이고,
도 4c는 본 발명의 발현벡터(pSN-H 벡터)를 이용하여 제조된 형질전환 톨페스큐 식물체의 게놈(genome) 상에 AtNDPK2 유전자가 존재함을 확인한 서던블럿 사진이고,
도 5는 0, 3, 5 및 10μM 농도의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV)에서 48시간 동안 처리한 후의 용액의 이온 전도도를 측정하여 NT 감자식물체 및 SN 감자식물체의 잎 절편체에서의 막 손상율을 조사한 것이고,
도 6은 0, 150, 200 및 250 μM MV 용액을 분사한지 5일 후의 감자 식물체의 MV에 대한 내성 사진을 나타낸 것이고,
도 7은 0, 150, 200 및 250 μM MV 용액을 분사한지 5일 후의 감자 식물체의 가시적인 잎 손상(A), 살아남은 잎의 상대적인 건중량(B), 및 엽록소 함량(C)을 나타낸 것이고,
도 8a 및 도 8b는 감자 식물체 잎 절편체(leaf disc)의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 분석한 것으로, 25℃(A) 및 37℃(B)에서의 용액의 이온 전도도로 나타낸 것이고,
도 9a 및 도 9b는 감자 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 분석한 것으로, 42℃에서 10 시간 동안 처리한 후의 가시적인 식물체 손상(A), 및 42℃에서 10 시간 및 20 시간 동안 처리한 후의 광합성효율(B)을 나타낸 것이다.
본 발명은 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터(oxidative stress inducible promoter)에 복합스트레스 내성유전자가 결합된 발현벡터, 상기 발현벡터를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체 및 상기 식물체의 제조방법에 관한 것에 관한 것이다.
식물을 비롯한 대부분의 생물은 병균, 해충, 바이러스 등의 생물학적 스트레스 뿐만 아니라 지구 환경의 악화에 따라 발생하는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원 균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투성 충격(osmotic shock)과 같은 각종 환경 스트레스를 받게 된다. 특히, 식물은 상기와 같은 각종 환경 스트레스를 받게 되면, 생명 유지에 필요한 필수 원소이지만 반응성이 높은 산소가 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O2 -), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 수산화 라디칼(hydroxyl radical) 등의 활성산소로 변하여 생체내에서 심각한 생리적인 장해 등을 유발하게 된다. 즉, 세포내의 활성산소 양이 미량으로 존재하는 경우에는 이들 활성 산소는 세포내의 신호전달 물질로서 작용하여 식물 생체방어에 필요한 유전자(항산화효소, 열충격 단백질 등)의 발현을 유도하지만, 활성산소 양이 증가된 경우에는 반응성이 높은 활성산소가 농도 의존적인 방식(dose-dependent manner)으로 생리적인 장해를 유발하여 세포를 죽음에 이르게 한다.
최근, 많은 연구자들은 식물에서 이들 활성산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에 대해 많은 관심을 갖고 있다. 이는 이들 경로를 조절할 수 있게 되면 세포내의 항산화효소 및 생체방어 단백질의 발현을 증가시킬 수 있고, 궁극적으로는 각종 환경 스트레스에 내성을 갖는 식물체를 개발할 수 있기 때문이다(Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000). 최근의 보고에 의하면, 식물에서 활성산소에 의해 매개되는 신호전달 경로에는 MAP 카이네즈 케스케이드(MAPK cascade)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kovtun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(6): 2940-2945, 2000).
한편, 1970년 이래로 핵산의 합성 및 대사에 관하여 현재까지 꾸준히 연구되어 왔으며, 1990년대부터는 이러한 핵산 대사에 관여하는 것으로 알려진 효소로서 NDPK(nucleoside diphosphate kinase) 유전자에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. 그러나, 최근에는 NDPK 유전자가 식물의 광 신호전달을 매개하는 신호물질로 알려지면서 NDPK가 식물에서 신호전달에 관여할 가능성이 제시되어 왔다(Kovtun, Nature, 395(6703): 716-720, 1999).
NDPK는 여러 단백질들과 결합하는 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 고온과 같은 환경 스트레스에 대한 식물체 내에서의 조절반응 유용성이 보고되어 있다(Plant Physiol., 126(1): 69-77, 2001 May). 또한, UV에 의해서도 NDPK 유전자가 발현되며, 신호 전달 체계에 있어서도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 다양한 효소를 안정화시키고, 효소간의 연락 및 결합을 조절하는 효소로서의 역할도 수행하는 것으로 보고되어 있다(J. Biol. Chem., 274(24): 17017-17024, 1999). 또한, NDPK는 세포의 분화 및 발육에 관여하는 것으로 보고되어 있으며, 아울러 NDPK는 인산기를 여러 효소로 이동시키는 역할을 수행하는데, 인산화 활성 역할과 탈인산화 역할을 수행하기도 한다는 보고가 있다(Eur. J. Biochem., 234(1): 200-207, 1995 Nov. 15).
그러나, 현재까지 스트레스 내성 식물체 개발에는 특정 조건에 관계없이 항상 발현되는 CaMV 35S 프로모터에 특정 스트레스에 강한 유전자가 결합된 발현벡터 를 사용하는 것이 대부분이어서, 특정한 스트레스에 대해서만 내성을 나타내는 식물체가 제조되었다. 따라서, 다양한 스트레스 조건의 환경에 대해서 발현이 가능한 프로모터와 내성유전자의 발현벡터와 상기 발현벡터로 형질전환된 식물체의 제조에 대한 필요성이 제기되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 환경 재해 내성 형질전환 농작물의 개발을 위하여, 다양한 환경 스트레스에 의해 발현이 유도되는 고구마 유래의 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터인 SWPA2 프로모터에 복합스트레스 내성 유전자인 AtNDPK2 유전자가 결합된 신규한 형질전환용 발현벡터를 제조하고, 상기 발현벡터로 형질전환된 감자, 고구마 및 톨페스큐 식물체를 조직배양에 의해 재분화시킨 결과, 상기 식물체가 복합스트레스에 대한 내성이 크게 향상된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터 및 복합스트레스 내성 유전자를 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 복합스트레스 내성 식물체 및 상기 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 복합스트레스 내성 유전자, 항생제 내성 유전자 및 T-DNA 보더 서열(T-DNA border sequence)을 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 pSN-K(KCTC10538BP) 또는 pSN-H(KCTC10539BP) 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
아울러, 본 발명은
ⅰ) SWPA2 프로모터 및 AtNDPK2 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;
ⅱ) 상기 발현벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터, 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터의 하류에 위치하는 복합스트레스 내성 유전자, 항생제 내성 유전자 및 T-DNA 보더 서열을 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터의 상기 산화스트레스 유도성 퍼옥시다제 프로모터는 서열번호 11로 기재되는 SWPA2(sweetpotato peroxidase anionic 2)의 염기서열인 것이 바람직하고, 상기 복합스트레스 내성 유전자는 서열번호 12로 기재되는 AtNDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2)의 염기서열인 것이 바람직하다.
본 발명자들은 상기의 방법에 의해 제조된 pSN-K 및 pSN-H 발현벡터를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 2003년 11월 7일자로 기탁하였으며, 상기 pSN-K 벡터의 수탁번호는 KCTC10538BP이고, pSN-H 벡터의 수탁번호는 KCTC10539BP이다.
SWPA2 프로모터는 본 발명자들이 고구마(Ipomoea batatas)에서 분리한 산화스트레스 유도성 프로모터(oxidative stress inducible promoter)로서, 재해 내성 식물 및 기타 유용물질을 생산하는 식물 세포주 개발에 이용가능한 유전자이다(대한민국 특허 공개공보 제 2001-51095 호; 국제 공개공보 제 WO 01/31018 호(2000년 10월 28일자 출원); Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003). 구체적으로, SWPA2 프로모터는 배양세포 고발현 퍼옥시다제 프로모터로서 산화스트레스에 의해서 발현이 유도되는 유전자이며, 특히 고구마 현탁 배양세포 및 형질전환 담배 현탁 배양세포에서 대수기 후반에 강하게 발현된다(국제 공개공보 제 WO 01/31018 호). 상기 프로모터는 담배 원형질체를 이용한 GUS 단백질의 일시적 분석(transient assay)에서 CaMV 35S 프로모터보다 약 30배 높은 활성을 나타낸다. 또한, 상기 프로모터는 정상적인 상태의 식물체 잎에서는 전혀 발현되지 않지만, 상처, 저온, 오존 등과 같은 산화스트레스를 받았을 경우에만 발현이 유도되는 특성을 갖는다(Kim, et al., Plant Mol. Biol., 51: 831-838, 2003). 따라서, 본 발명의 SWPA2 프로모터는 환경 스트레스 내성 식물체의 개발, 및 형질전환 식물세포를 이용한 유용물질의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 SWPA2 프로모터는 스트레스에 의해 유전자의 발현을 효과적으로 유도할 수 있다. 본 발명의 SWPA2 프로모터는 아브시스산(abscisic acid, ABA), 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 상처, 저산소증, 활성산소, 열 또는 질소에 의한 외부 환경으로부터의 스트레스를 인식하는 인자들을 포함한다. SWPA2 프로모터는 이러한 특성을 이용하여 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열 및 상기 프로모터 서열과 작동가능하도록 연결된 구조 유전자로 이루어진 융합 유전자 구조물의 제조에 이용될 수 있다. 상기 융합 유전자 구조물은 유용물질의 생산과 관련된 구조 유전자를 SWPA2 프로모터 유전자에 연결하여 다양한 환경 스트레스하에 SWPA2 프로모터의 조절을 받아 유용물질을 발현할 수 있으므로, 유용물질을 생산하기 위한 형질전환체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 융합 유전자 구조물에 다양한 환경 스트레스에 대해 내성을 나타내는 유전자를 구조 유전자로 사용하면 외부적인 스트레스에 대해 내성을 갖는 형질전환체의 제조에도 이용될 수 있 다.
또한, AtNDPK2 유전자가 발현되면 생물체는 다양한 외부 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는 것으로 알려져 있다(대한민국 특허출원 제 2002-15714 호, 2002년 3월 22일 출원; Moon, et al., Procd. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 358-363, 2003). 예를 들어, AtNDPK2 유전자는 항산화효소들의 발현을 유도하여 세포내의 활성산소의 양을 감소시키는 기능을 한다. 즉, AtNDPK2는 다양한 외부 환경 스트레스가 가해지면 식물체 내에서 항산화효소들의 발현을 증가시켜 스트레스를 조절하는 역할을 한다. 식물체에 냉해 처리 및 과산화수소와 같은 산화제에 의한 스트레스를 가하면 AtNDPK2 유전자의 발현이 증가할 뿐만 아니라, KCl 또는 NaCl 등과 같은 염, 또는 열에 의해서도 그의 발현량이 조절되며, 호르몬인 아브시스산(abscisic acid) 및 에틸렌(ethylene) 등에 의해서도 발현량이 증가한다.
AtNDPK2는 농작물에 악조건을 가하는 많은 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는 효과를 나타낼 뿐 아니라, 식물 생체방어 신호전달 대사를 조절하며, 형질전환 기법에 의해 AtNDPK2 유전자를 식물체 내로 도입하면 형질전환 식물체 내에서 항산화 활성을 갖는 단백질인 항산화효소의 발현을 유도하고, 상기 항산화효소에 의해 세포내에서 독성 물질인 활성 산소의 양이 줄어들게 되므로, 궁극적으로는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 제초제, 과다한 UV 노출 및 삼투성 충격과 같은 환경 스트레스에 대한 내성을 갖게 된다.
따라서, AtNDPK2 유전자가 없는 식물체에 AtNDPK2 유전자를 도입하여 제조된 형질전환 식물체의 경우에도 상기와 동일한 환경 스트레스에 대해 내성을 나타낼 수 있으며, AtNDPK2 유전자가 없는 식물체에 순간 도입한 경우에도 동일한 효과를 얻을 수 있다. AtNDPK2 유전자가 대량 발현되는 경우, 생체 내에서 산화/환원 시스템을 조절하는 글루타치온의 양이 조절되는데, 환경 스트레스가 가해지는 경우에 형질전환 식물은 일반적인 식물체와 비교하여 글루타치온이 과량으로 생산되어 수많은 항산화효소 및 합성 효소들이 순차적인 반응에 의해 전체 발현 양상이 증가하게 된다. 결국, AtNDPK2 유전자로 형질전환된 식물체는 일반적인 식물체보다 환경 스트레스에 대해 보다 높은 내성을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 항산화효소의 발현량이 증가하도록 유도하는 식물체의 초기 생체방어 신호전달에 관여하는 AtNDPK2 유전자를 일반적으로 많이 사용되는 식물체에 형질전환시켜, 세포내에서 이를 대량으로 발현시킴으로써 다양한 환경 스트레스에 대한 내성을 갖는 형질전환 식물을 제조할 수 있다.
상기 AtNDPK2 유전자를 적용할 수 있는 식물체는 모든 식물이 될 수 있다. 또한, 상기 AtNDPK2 유전자를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 방법으로는 통상적인 식물 형질전환 방법이 사용될 수 있고, 아그로박테리아를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 방법, 또는 식물체, 포유류, 곰팡이류, 미생물에 가장 보편적으로 사용되는 유전자 도입 방법인 진건(Gene Gun)을 사용하는 입자 충격(particle bombardment) 방법으로 식물체를 형질도입하여 형질전환 식물체를 제조한다(Horsch, et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 50: 433-7, 1985; Rogers, et al., 1986).
바람직한 실시태양에서, 본 발명자들은 서열번호 11로 기재되는 상기 SWPA2 프로모터를 pRW20 벡터에 연결(ligation)하여 pSA 벡터를 제조하고, 제조된 pSA 벡터에 서열번호 12로 기재되는 애기장대(Arabidopsis thaliana) AtNDPK2 유전자를 연결하여 pSN 벡터를 제조하였다(도 1a 참조). 이어, 상기 pSN 벡터에 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자 및 카나마이신 내성 유전자를 각각 도입하여, 최종적으로 식물 형질전환용 벡터인 pSN-K 및 pSN-H 벡터를 제조하였다(도 1b 참조). 상기 pSN-K 및 pSN-H 벡터는 SWPA2 프로모터 및 AtNDPK2 유전자 이외에 TEV(tobacco etch virus) 선도서열(leader sequence), CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator)을 포함하며, 하이그로마이신 및 카나마이신 내성 유전자를 각각 포함하고 있어 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 용이하게 선발할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 pSN-K 또는 pSN-H 발현벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 본 발명의 실시태양에서 형질전환된 식물체로는 모든 식물체를 들 수 있으며, 바람직하게는 콩, 보리, 옥수수, 감자, 고구마 또는 톨페스큐(tall fescue)이고, 감자, 고구마 또는 톨페스큐가 가장 바람직하다.
본 발명은 SWPA2 프로모터 및 AtNDPK2 유전자를 포함하는 복합스트레스 내성 식물체 제조용 재조합 발현벡터에 의해 식물체를 형질전환시켜, 식물체 내에서 AtNDPK2 유전자가 대량으로 발현되는 복합스트레스 내성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 실시태양에서는 상기에서 제조된 pSN-K 또는 pSN-H 발현벡터를 감자, 고구마 또는 톨페스큐에 도입하여 AtNDPK2 유전자를 발현시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명자들은 상기 발현벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105를 이용하거나 입자 충격(particle bombardment) 방법을 사용하여 상기 감자, 고구마 또는 톨페스큐의 어린잎 또는 엽병 절편체에 도입시켜 형질전환체를 제조한 후, 상기 형질전환체를 조직배양에 의해 식물체의 각 기관으로 재분화시켰다(도 2a, 도 3a 및 도 4a 참조). 또한, 상기 재분화된 형질전환 감자, 고구마 및 톨페스큐 식물체로부터 각각 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하고, 이것을 PCR에 의해 증폭시켜 상기 식물체의 게놈 내에 AtNDPK2 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 2b, 도 3b 및 도 4b 참조). 아울러, 상기 PCR에 의해 형질전환되었음이 확인된 각 식물체로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이것을 멤브레인(membrane)에 전달(transfer)한 후, AtNDPK2 유전자를 이용한 서던블럿(Southern blot)의 혼성화 반응에 의해 상기 식물체의 게놈 내에 AtNDPK2 유전자가 도입되었음을 다시 한번 확인하였다(도 2c 및 도 4c 참조).
또한, 본 발명은
ⅰ) SWPA2 프로모터 및 AtNDPK2 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 제조하는 단계;
ⅱ) 상기 발현벡터를 식물체 또는 배양세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계;
iii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
iⅴ) 상기 형질전환체를 조직배양으로 재분화시켜 형질전환된 식물체를 제조하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성의 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 실시태양에서, 상기 발현벡터는 pSN-K 또는 pSN-H 발현벡터인 것이 바람직하고, 상기 식물체 또는 배양세포는 상기 발현벡터로 형질전환될 수 있는 것이면 모두 사용될 수 있으며, 특히 감자, 고구마 또는 톨페스큐가 바람직하다.
또한, 상기 형질전환체의 제조방법으로는 통상적인 식물 형질전환 방법이 사용될 수 있지만(Horsch, et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 50: 433-7, 1985; Rogerset, et. al., 1986), 입자 충격(particle bombardment) 방법으로 제조되거나, 상기 발현벡터를 아그로박테리아(Agrobacteria)에 도입하는 단계; 및 상기 아그로박테리아를 식물체 또는 배양세포 (캘러스, callus 포함)와 공동배양하여 형질전환체를 제조하는 단계로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 식물 배양세포와 아그로박테리아의 공동배양은 ⅰ) 항산화물질인 아스코브산(ascorbic acid) 및 질산은(silver nitrate)을 첨가한 후, 진공처리하여 아그로박테리아를 상기 배양세포에 감염시키는 단계; 및 ⅱ) 상기 아그로박테리아에 감염된 배양세포를 후배양시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것이 보다 바람직하고, 상기 식물 배양세포는 콩, 보리, 옥수수, 고구마, 감자 또는 톨페스큐인 것이 바람직하며, 특히 감자 또는 톨 페스큐가 가장 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 복합스트레스 내성 유전자의 발현벡터인 pSN-K 및 pSN-H의 제조
본 발명자들에 의해 제조된 서열번호 11로 기재되는 산화스트레스 유도성 SWPA2 프로모터(대한민국 특허 공개공보 제 2001-51095 호; 국제 공개공보 제 WO 01/31018 호)에 서열번호 12로 기재되는 애기장대 AtNDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2; GenBank accession number AF017640; Moon, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 358-363, 2003) 유전자를 코딩하는 cDNA가 연결(ligation)된 벡터를 제조하였다.
구체적으로, 먼저 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 51℃에서 1분, 72℃에서 1분 30초의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 SWPA2 프로모터 서열을 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜(protocol)에 따라 증폭된 SWPA2 프로모터 서열을 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다. 염기서열 분석에 의해 상기 목적하는 SWPA2 프로모터 서열이 정확하게 증폭되었음을 확인하였다. 상기 프라이머 염기서열에는 Hind Ⅲ 및 Xho I 절단부위(restriction site)가 존재하므로, Hind Ⅲ 및 Xho I을 처리하여 SWPA2 프로 모터 서열이 클로닝된 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터로부터 SWPA2 프로모터 서열을 분리하였다. 이어, 완두의 APX(ascorbate peroxidase)가 엽록체로 이동되도록 제조된 pRW20 벡터(Allen, et al., Free Rad. Biol. Med., 23: 473-479, 1997)를 동일한 제한효소로 절단하여 증가된 35S 프로모터(enhanced 35S promoter)를 제거한 후, 이전에 분리된 SWPA2 프로모터 서열를 상기 벡터에 연결(ligation)하여 pSA 벡터를 구축하였다(도 1a).
pSA 벡터의 APX 유전자를 NDPK2 유전자로 교체하기 위하여, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1 분, 57℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 AtNDPK2 유전자를 증폭하고, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 AtNDPK2 유전자를 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터(Promega, USA)에 클로닝하였다. 이어, 염기서열 분석에 의해 상기 목적하는 AtNDPK2 서열이 정확하게 증폭되었음을 확인하였다. 상기 프라이머 염기서열에는 Nco I 및 BamH I 절단부위가 존재하므로, Nco I 및 BamH I을 처리하여 AtNDPK2 유전자 서열이 클로닝된 pGEM-T Easy 플라스미드 벡터로부터 AtNDPK2 유전자를 분리하고, 동일한 제한효소에 의해 절단된 상기 pSA 벡터에 AtNDPK2 유전자를 도입하였다. 상기 방법으로 구축된 벡터를 pSN 벡터라 명명하였다(도 1a).
최종적으로, 하이그로마이신(hygromycin) 내성 유전자를 포함하는 pCAMBIA1300 플라스미드(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하는 pCAMBIA2300 플라스미드(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)를 이용하여 식물 형질전환용 벡터인 pSN-K 및 pSN-H 벡터를 제조하였다. 구체적으로, 상기 pSN 벡터를 Hind Ⅲ로 절단하여 얻은 약 2.3kb 크기의 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단된 pCAMBIA1300 플라스미드 및 pCAMBIA2300 플라스미드에 각각 도입하여 pSN-K 벡터(pCAMBIA2300에 도입된 경우) 및 pSN-H 벡터(pCAMBIA1300에 도입된 경우)를 각각 구축하였다(도 1b). 본 발명자들은 상기에서 제조된 pSN-K 및 pSN-H 발현벡터를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(KCTC)에 2003년 11월 7일자로 기탁하였으며, 상기 pSN-K 벡터의 수탁번호는 KCTC10538BP이고, pSN-H 벡터의 수탁번호는 KCTC10539BP이다. 상기 도 1a 및 도 1b에서 SWPA2 pro: 산화스트레스 유도성 프로모터, E35S pro: 증가된(enhanced) CaMV 35S 프로모터, TEV: 담배 식각 바이러스(tobacco etch virus, TEV)의 선도서열(leader sequence), TP: 완두 CuZnSOD(구리ㆍ아연 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, superoxide dismutase)의 신호서열, 35S 3': CaMV 35S 전사 종결서열(transcription terminator), Amp: 항생제(ampicillin) 내성 유전자, H: Hind Ⅲ, P: Pst I, Xh: Xho I, R: EcoR I, N: Nco I, B: BamH I, 및 X: Xba I이다.
안(An)의 방법(An, Meth. Enzymol., 153: 292-305, 1987)을 이용하여 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) EHA105(Hood, et al., Trans. Res., 2: 208-218, 1993)에 상기에서 제조된 식물 형질전환용 발현벡터(pSN-K 또는 pSN-H)를 도입하여 감자 및 톨페스큐의 형질전환체를 제조하였다.
또한, 큐아젠(Qiagen, U.S.A)사의 플라스미드 맥시 키트(Plasmid Maxi kit) 를 이용하여 플라스미드 DNA(pSN-K 벡터)를 대장균으로부터 대량으로 분리한 후, 하기 실시예 4의 방법에 의한 입자 충격(particle bombardment) 방법을 사용하여 고구마를 형질전환시켰다.
<실시예 2> pSN-K 발현벡터를 이용한 형질전환 감자의 제조
<2-1> 형질전환 감자 식물체의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 pSN-K 벡터를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105와 감자 식물체의 절편체를 공동배양하여 감자를 형질전환시켰다.
구체적으로, 형질전환에 사용된 감자(Solanum tuberosum L.) 식물체는 국내의 식용 품종인 수미(Superior) 및 가공용 품종인 대서(Atlantic)를 기내에서 배양하였다. MS(Murashige and Skoog, Physiol. Plant., 15: 473-497, 1962) 배지에 3%의 슈크로스(sucrose)를 첨가하여 16시간 광/8시간 암 주기, 및 40 μ㏖·m-2·sec-1의 냉백(cool-white) 형광의 조건하에 25℃ 배양실에서 상기 감자 식물체를 배양하였으며, 2주 동안 배양한 신초(shoot)의 상부로부터 2 내지 3번째의 어린잎 및 엽병(petiole)을 절취하여 형질전환 재료로 사용하였다.
카나마이신 50 ㎎/ℓ이 첨가된 LB 배지(박토펩톤(bacto peptone) 10 g/ℓ, 효모 추출액(yeast extract) 5 g/ℓ 및 NaCl 10 g/ℓ) 5㎖에 아그로박테리아를 접종하여 28℃ 진탕배양기(shaking incubator)에서 하루 동안 배양한 아그로박테리아 배양액 100 ㎕, 및 감자 식물체의 잎과 엽병 절편체 각각을 MS 기본 액체배지 10 ㎖가 들어있는 페트리 디쉬(petri dish)에 넣어 충분히 혼합한 후 25℃의 암 조건하에서 2일 동안 공동배양하였다. MS 기본 액체배지로 아그로박테리아를 세척한 후, 멸균된 필터 페이퍼로 공동배양한 감자 잎 및 엽병 절편체의 물기를 제거하였다. 이어, 잎과 엽병 절편체를 선발배지(제아틴(zeatin) 2 ㎎/ℓ, NAA(α-naphthaleneacetic acid) 0.01 ㎎/ℓ, GA3(지베렐린, gibberellin) 0.1 ㎎/ℓ, 클라포란(claforan) 300 ㎎/ℓ 및 카나마이신(kanamycin) 100 ㎎/ℓ를 포함하는 MS 배지)에서 배양하였다. 3주 간격으로 신선한 배지로 옮겨 계대배양하였으며, 약 3 내지 약 4주 동안 배양하였을 때 카나마이신 내성을 갖는 신초(shoot)의 발생이 캘러스(callus)와 함께 유도되었다.
잎이 1 내지 2장 정도 나왔을 때, 뿌리 유도 배지(클라포란 300 ㎎/ℓ 및 카나마이신 100 ㎎/ℓ를 포함하는 MS 기본 배지)로 옮겨 뿌리의 발생을 유도하였다. 뿌리는 대부분의 신초로부터 잘 유도되었으며, 뿌리가 발달한 소식물체를 배양 용기에서 꺼내 외기에 4 내지 5일 동안 노출시키고(배양실에서 순화시키고), 원예용 상토 화분으로 옮긴 후 배양기에서 재배하였다(도 2a). 그 결과, 기내에서 증식한 감자 식물체로부터 마이크로튜버(microtuber)가 형성되었다(도 2a). 외부 유전자의 도입에 의해 형성된 형질전환된 감자 식물체는 비-형질전환된 감자 식물체와 외형적인 차이는 발견되지 않았다. 한편, 형질전환 재료로 사용된 엽병 조직은 잎에서보다 많은 수의 신초가 유도되었지만, PCR 결과에 따르면 대부분이 형질전환되지 않은 것으로 판명되었다.
<2-2> PCR 및 서던블럿에 의한 형질전환체의 확인
실시예 <2-1>에서 제조된 형질전환 감자 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 카나마이신 함유 배지에서 일차적으로 선발된 재분화 식물체를 대상으로, AtNDPK2 유전자의 특이 프라이머인 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃ 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 AtNDPK2 유전자를 증폭함으로써 형질전환체를 선발하였다(도 2b). 그 결과, 외래 유전자가 도입된 식물체의 경우에 544bp의 단편이 증폭되어 AtNDPK2 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 상기 도 2b에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 감자 식물체, 1-5: 카나마이신 내성의 감자 식물체, 및 P: 양성 대조군 DNA(positive control DNA)이다.
PCR에 의해 형질전환된 것으로 확인된 감자 식물체를 무작위로 선발하여 서던블럿(Southern blotting) 분석을 실시하였다. 구체적으로, 배양기에서 생육중인 대서 및 수미 식물체 각각의 잎으로부터 디엔이지® 플랜트 맥시 키트(DNeasy® Plant Maxi kit, QIAGEN 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 30 ㎍을 제한효소 EcoR I으로 절단하여 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하였다. 상기 겔 상의 게놈 DNA를 제타프로브 멤브레인(Zeta Probe membrane, Bio-Rad 사)으로 전달(transfer)한 후, 상기 멤브레인에 전달된 DNA와 AtNDPK2 유 전자의 일부분인 약 0.9 kb를 32P로 표지된 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 종료된 후, 멤브레인을 세척하고, X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인한 결과, 형질전환된 대서 및 수미 식물체는 도입된 AtNDPK2 유전자가 2개의 밴드로 존재하고, 대조군 식물체에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않음을 확인하였으며, 이는 AtNDPK2 유전자가 감자 게놈 내에 안정적으로 도입되었음을 보여주는 것이다(도 2c). 상기 도 2c에서, NT: 비-형질전환된 감자 식물체, A1-A3: 형질전환된 대서(Atlantic) 식물체, 및 S1-S3: 형질전환된 수미(Superior) 식물체이다.
<실시예 3> pSN-K 발현벡터를 이용한 형질전환 고구마의 제조
<3-1> 형질전환 고구마 식물체의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 pSN-K 벡터를 이용하여 입자 충격(particle bombardment) 방법으로 고구마의 배발생 캘러스를 형질전환시켰다.
구체적으로, 국내에서 식용으로 재배되는 고구마(Ipomoea batatas Lam.; 품종명: 율미)의 배발생 캘러스를 형질전환 재료로 사용하였다. 고구마의 배발생 캘러스는 본 발명자들이 고구마 식물체 재분화 시스템 확립을 위해 유도한 후 유지되고 있는 것을 사용하였다(Kwon, et al., Korean J. Plant Biotechnol., 29: 189-192, 2002).
상기 배발생 캘러스를 직경 1 내지 2 ㎜의 세포괴로 자르고, 2,4-디클로로페 녹시 아세트산(2,4-dichlorophenoxy acetic acid, 2,4-D) 1 ㎎/ℓ가 첨가된 MS 고체배지 중앙에 약 2 ㎝의 원내에 상기 세포괴를 치상하여 하루 동안 배양한 후, 입자 충격을 수행하였다(도 3a). 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 식물 형질전환용 pSN-K 벡터를 분리한 후, 상기 DNA를 1 ㎛ 직경의 금입자(gold particle)에 코팅하고, 이어 PDS-1000/He 입자 운송 시스템(particle delivery system, BioRad 사)을 이용하여 9 ㎝ 거리 및 1,100 psi 기압에서 입자 충격(particle bombarding)시켰다. 입자 충격을 수행한 후 3일 동안 25℃ 암소(dark site)에서 배양한 후, 2,4-D 1 ㎎/ℓ와 카나마이신 100 ㎎/ℓ가 함유된 MS 선발배지에서 카나마이신 내성 배 발생 캘러스를 선발하였다. 선발은 5 내지 6개월 동안 3주 간격으로 계대배양하면서 진행하였다. 카나마이신 100 ㎎/ℓ가 첨가되고 2,4-D는 첨가되지 않은 MS 기본배지로 상기 카나마이신 내성 배 발생 캘러스를 옮기고, 40 μ㏖·m-2·sec-1의 냉백(cool-white) 형광 및 25℃의 배양실에서 체세포배로 유도시킨 후에 식물체로 재분화시켰다(도 3a).
<3-2> PCR에 의한 형질전환체의 확인
실시예 <3-1>에서 제조된 형질전환 고구마 식물체의 형질전환 여부를 확인하기 위하여, 카나마이신 함유 배지에서 일차적으로 선발된 재분화 소식물체의 잎이 3 내지 4엽이 자랐을 때, 잎으로부터 게놈 DNA를 분리한 후에 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 AtNDPK2 유전자의 특이 프라이머를 이용하여 94℃에서 1분, 65 ℃에서 1분, 72℃에서 1분씩의 1사이클의 PCR을 30회 수행하여 AtNDPK2 유전자를 증폭함으로써 형질전환체를 선발하였다(도 3b). 그 결과, 외래 유전자가 도입된 식물체의 경우에 0.7 kb의 단편이 증폭되어 AtNDPK2 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 상기 도 3b에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 고구마 식물체, 1-5: 카나마이신 내성의 고구마 식물체, 및 P: 양성 대조군 DNA(positive control DNA)이다.
<실시예 4> pSN-H 발현벡터를 이용한 형질전환 톨페스큐의 제조
<4-1> 형질전환 톨페스큐 식물체의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조한 pSN-H 벡터(플라스미드 DNA)를 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105와 톨페스큐(tall fescue) 절편체를 공동배양하여 형질전환시켰다.
구체적으로, 톨페스큐(Festuca arundinacea Schreb.)의 형질전환에는 주로 사료작물로서 많이 재배되는 켄터키-31(Kenturky-31) 품종을 사용하였다. 톨페스큐의 형질전환을 위한 캘러스는 종자를 살균하고 종피를 제거한 후, 캘러스 유도배지(2,4-D 9 ㎎/ℓ, BA(benzyl adenine) 0.1 ㎎/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ, 겔라이트(Gelrite) 5 g/ℓ를 포함하는 MS 배지)에 4주 동안 배양하여 캘러스를 유도하였다. 28℃에서 2일 동안 카나마이신 50 ㎎/ℓ가 첨가된 YEP 액체 배지(박토펩톤 10 g/ℓ, 효모추출액 10 g/ℓ및 NaCl 5 g/ℓ)에서 배양한 아그로박테리움 배양액을 원심분리하여 균체를 수집한 후, 100 μM 아세토시린곤(acetosyringone), 아스코브산 20 ㎎/ℓ, 질산은 5 ㎎/ℓ가 첨가된 액체 캘러스 유도배지에서 흡광도 A600가 1이 되도록 현탁하였다. 캘러스를 아그로박테리움 현탁액에 침지시켜 진공 조건하에 30분 동안 처리하여 감염시킨 후, 여분의 아그로박테리움을 제거하고 캘러스를 공동배양배지(100 μM 아세토시린곤, 아스코빅산 20 ㎎/ℓ및 질산은 5 ㎎/ℓ를 포함하는 캘러스 유도배지)에 옮겨 28℃에서 3일 동안 배양하였다. 감염된 캘러스를 후배양배지(2,4-D 5 ㎎/ℓ, BA 1 ㎎/ℓ, FeNaEDTA 140 ㎎/ℓ, 마이오-이노시톨(myo-inositol) 70 ㎎/ℓ, 25 mM 프롤린, 0.4 mM 티오프롤린(thioproline), 50 mM K2SO4, 효모추출액 2 g/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ 및 겔라이트 5 g/ℓ를 포함하는 MS 배지)에 옮겨 1주일 동안 배양한 후, 1차 선발배지(2,4-D 0.5 ㎎/ℓ, BA 2 ㎎/ℓ, FeNaEDTA 140 ㎎/ℓ, 미오이노시톨 70 ㎎/ℓ, 25 mM 프롤린, 0.4 mM 티오프롤린, 50 mM K2SO4, 효모 추출액 2 g/ℓ, 슈크로스 30 g/ℓ, 겔라이트 5 g/ℓ 및 하이그로마이신(hygromycin) 25 ㎎/ℓ를 포함하는 N6 기본배지)에서 2주 동안 배양하였다. 1차 선발배지에서 살아남은 캘러스와 재분화된 신초를 다시 2차 선발배지(1차 선발배지 + 하이그로마이신 50 ㎎/ℓ)에 옮겨 3주 동안 배양함으로써 형질전환 식물체의 재분화를 유도하였다. 재분화된 식물체는 신초 부분만을 잘라 하이그로마이신 50 ㎎/ℓ와 슈크로스 30 g/ℓ가 첨가된 1/2 MS 고체배지에 치상하여 뿌리의 발생을 유도하였다. 이어, 하이그로마이신에 대해 완전한 내성을 갖는 개체만을 선발하여 순화 과정을 거치고, 이를 화분에 이식하여 재배하였다(도 4a).
<4-2> PCR에 의한 형질전환체의 확인
실시예 <4-1>에서 제조된 형질전환 톨페스큐 식물체의 유전자 도입을 게놈 DNA를 사용한 PCR 분석 및 서던블럿 분석으로 확인하였다. 이때, 하이그로마이신이 첨가된 선발배지에서 강한 내성을 나타내는 톨페스큐 식물체, 및 종자에서 정상적으로 발아되어 생장한 대조군인 야생형 톨페스큐 식물체로부터 각각 분리한 게놈 DNA를 주형(template)으로 이용하고, 발현벡터의 특정 부위 염기서열을 증폭시켜 유전자 도입을 확인하기 위해 AtNDPK2 유전자 일부분의 염기서열을 서열번호 9로 기재되는 정방향 프라이머(P-1), 및 CaMV35S 종결서열(terminator)의 일부 염기서열을 서열번호 10으로 기재되는 역방향 프라이머(P-2)로서 이용하여 94℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1사이클의 PCR을 30회 수행한 결과, 염기서열로부터 0.6 kb의 목적하는 단편이 증폭되어 AtNDPK2 유전자가 도입되었음을 확인하였다(도 4b). 상기 도 4b에서 M: 분자 크기를 나타내는 마커(marker), NT: 비-형질전환(non-transformation)된 톨페스큐 식물체, 1-2: 하이그로마이신 내성의 톨페스큐 식물체, 및 P: 양성 대조군 DNA(positive control DNA)이다.
하이그로마이신에 강한 내성을 나타내는 톨페스큐 식물체, 및 종자에서 정상적으로 발아되어 생장한 야생형 톨페스큐 식물체로부터 각각 게놈 DNA를 분리하여 제한효소 Hind Ⅲ로 절단하고, 아가로즈 겔 전기영동을 수행한 후, 이를 나일론 멤브레인(nylon membrane)에 전달하였다. 이어, SWPA2 프로모터 부위를 프로브(probe)로서 이용하는 서던블럿 분석으로 확인한 결과, 하이그로마이신에 강한 내성을 나타내는 톨페스큐 식물체에서만 1개의 특이적인 밴드가 검출되었으며, 대조군 식물체에서는 어떠한 밴드도 나타나지 않았음을 확인하였다(도 4c). 상기 도 4c에서 NT: 비-형질전환된 톨페스큐 식물체, 및 1 및 2: 형질전환된 톨페스큐 식물체이다.
<실시예 5> SN 형질전환 식물체의 환경 내성 특성
<5-1> 산화스트레스에 대한 내성 특성
<5-1-1> 감자 식물체 잎 절편체(leaf disc)의 산화스트레스에 대한 내성 특성
형질전환 감자(품종: 대서)인 SN 식물체의 산화적 스트레스에 대한 내성을 조사하기 위하여 비-형질전환 식물체(NT 식물체)와 SN 식물체를 온실에서 생육하였다. 생육 7주 된 식물체의 잎(상부로부터 5 내지 7번째의 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 0, 3, 5 및 10 μM의 메틸 비올로겐(methyl viologen, MV)을 각각 포함하는 0.4 M 소비톨(sorbitol) 용액 5 ㎖에 띄우고, 12시간 동안 암 상태에서 배양하여 MV를 흡수하도록 하였다. 암 처리 후에 광 상태에서 48시간 동안 배양한 후에 전기 전도도계(electrical conductivity meter, Orion, Model 162)를 이용하여 용액의 이온 전도도를 측정함으로써 잎의 손상 정도를 조사하였다(도 5). NT 식물체의 잎 절편체는 MV 처리에 의해 모든 농도에서 약 80%의 심각한 손상을 입었지만, SN 식물체는 NT 식물체에 비해 3 μM에서 약 43%의 내성, 및 5와 10 μM 농도에서는 약 24%의 내성이 증가하였다. 이러한 결과로부터 AtNDPK2 유전자가 도입된 SN 감자 식물체는 MV에 의한 산화스트레스에 대해 내성이 증가되었음을 확인할 수 있었다. 상기 도 5에서 NT: 비-형질전환 식물체, 및 SN: pSN-K 벡터 가 도입된 식물체이다.
<5-1-2> 감자 식물체에서의 산화스트레스에 대한 내성 특성
형질전환 감자 식물체(품종: 대서)에서의 산화스트레스에 대한 내성 특성을 분석하였다. 온실에서 4주 동안 생육한 NT 식물체, EV 식물체(pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체) 및 SN 식물체의 잎에 0, 150, 200 및 250 μM의 MV 용액(0.1% 트윈(Tween) 20을 포함함) 70 ㎖를 분무부스(spray booth, Model SB-6, DeVries Manufacturing, Hollandale, MN)를 이용하여 분사하였다. MV 분사 5일 후에 식물체 잎에 나타나는 가시적인 손상(visual damage) 정도를 조사한 결과, 150 μM MV를 분사하는 경우에 NT 식물체, EV 식물체 및 SN 식물체는 거의 비슷한 수준으로 잎에서의 백화 현상이 관찰되었고, 200 내지 250 μM을 처리하는 경우에는 NT 식물체 및 EV 식물체의 잎은 거의 대부분 고사하였으며, 특히 EV 식물체가 심각한 상해를 입었지만, SN 식물체는 동일한 농도의 MV 처리시에 약 25% 정도의 상해를 입은 것으로 나타나, SN 식물체는 NT 식물체에 비해 MV에 대한 내성이 2배 이상 증가하였음을 알 수 있었다(도 6). 상기 도 6에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SN: pSN-K 벡터가 도입된 식물체이다.
또한, 가시적인 손상율, 잎의 건중량 및 엽록소 함량을 측정함으로써 SN 식물체의 MV에 대한 내성 정도를 분석하였다. NT 식물체, EV 식물체 및 SN 식물체의 잎에 150 μM MV를 각각 분사하는 경우에 각각의 식물체의 잎은 20 내지 35% 정도의 비슷한 수준으로 손상을 입었지만, 200 μM 및 250 μM의 농도로 처리하는 경우 에는 NT 식물체 및 EV 식물체의 잎은 60 내지 90% 정도의 손상을 입었고, SN 식물체의 손상은 25% 내지 30% 미만으로 나타났다(도 7의 A). 또한, MV 처리 결과 NT 식물체에서 살아남은 건전한 잎의 건중량은 MV 농도가 증가할수록 감소하여 250 μM MV 처리시 무처리에 비해 50% 감소한 반면, SN 식물체의 경우 MV 처리 후에 살아남은 잎의 건중량은 MV 농도에 관계없이 무처리군의 잎의 건중량과 비슷하였다(도 7의 B). NT 식물체, EV 식물체 및 SN 식물체 세 종류의 엽록소 함량은 MV를 처리하지 않은 경우에 40 ㎎/㎠로 비슷하였지만, MV 농도가 높아질수록 엽록소 함량은 감소하였다. 즉, 200 μM MV 농도에서 NT 식물체 및 EV 식물체의 엽록소 함량은 약 50%로 감소하고 250 μM에서는 60% 정도 감소하였지만, SN 식물체의 엽록소 함량은 약 20% 정도만 감소하였다(도 7의 C). 상기 도 7에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SN: pSN-K 벡터가 도입된 식물체이다.
<5-2> 온도 스트레스에 대한 내성 특성
<5-2-1> 감자 식물체 잎 절편체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성
SN 형질전환 감자(품종: 대서) 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 조사하기 위하여 NT 식물체(비-형질전환 식물체) 및 SN 식물체를 온실에서 생육하였다. 생육 7주 된 식물체의 잎(상부로부터 5 내지 7번째의 잎)에서 지름 8 ㎜인 10개의 잎 절편체를 취하여 0.4 M 소비톨 용액 5 ㎖에 각각 띄우고, 37℃의 연속광하에서 60시간 동안 배양하였으며, 대조군은 배양 온도가 25℃인 것을 제외하고 동일한 조건하에서 배양하였다. 용액의 이온 전도도는 MV 처리시와 동일한 방식으로 12시간 간격으로 측정하여 잎의 손상 정도를 조사하였다. 고온 스트레스를 가하지 않은 경우(25℃ 처리군) NT 식물체 및 SN 식물체의 이온 전도도는 60시간까지 거의 일정하게 유지되었지만(도 8a), 37℃의 스트레스를 가하는 경우에 SN 식물체는 NT 식물체에 비해 뚜렷한 내성을 나타냈다(도 8b). SN 식물체의 이온 전도도는 고온 처리 12시간 이후부터 조금씩 감소하기 시작하여 36시간 이후에 NT에 비해 44% 정도 감소하였고, 48 시간 후에는 50% 정도 감소하여 60시간 이후까지 유지하였다. 즉, SN 식물체는 NT 식물체에 비해 고온 스트레스에 대해 2배 높은 내성을 가짐을 알 수 있었다. 상기 도 8에서는 NT: 비-형질전환 식물체, 및 SN: pSN-K 벡터가 도입된 식물체이다.
<5-2-2> 감자 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성
형질전환 감자(품종: 대서) 식물체의 고온 스트레스에 대한 내성 특성을 확인하기 위하여 온실에서 4주 동안 생육한 감자(품종: 대서)의 NT 식물체, EV 식물체 및 SN 식물체를 42℃에 10시간 동안 노출시킨 결과, NT 식물체 및 EV 식물체는 시들었지만, SN 식물체는 시들지 않고 건강한 상태를 유지하였다(도 9a). 고온 처리 전과 처리 후의 광합성률을 비교한 결과, 고온 처리 20시간 후에 NT 식물체 및 EV 식물체의 광합성율은 각각 0.59 및 0.48로서 약 30 내지 약 40% 정도로 감소하였지만, SN 식물체는 0.71로서 13% 정도 감소하였으며, 이는 NT 식물체 및 EV 식물체에 비해 각각 약 20% 및 약 50% 정도 내성이 증가한 결과이다(도 9b). 또한, 고온 처리 후에 25℃로 3시간 동안 회복시킨 결과, NT 식물체 및 EV 식물체의 광합성 율은 약 78% 정도로 고온 처리 전의 상태로 회복되었지만, SN 식물체는 93% 이상으로 고온 처리 전의 상태로 회복되었음을 나타냈다. 상기 도 9a 및 도 9b에서 NT: 비-형질전환체, EV: pCAMBIA2300 벡터가 도입된 식물체, 및 SN: pSN-K 벡터가 도입된 식물체이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 발현벡터로 형질전환된 식물체는 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소를 유발시키는 다양한 환경오염에 의한 스트레스에 대해 강한 내성을 나타내므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량생산 등에 유용하게 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 도 1b의 개열지도를 갖는 복합 스트레스 내성 식물체 제조용 발현벡터 pSN-K(수탁번호:KCTC10538BP) 또는 pSN-H(수탁번호:KCTC10539BP).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 발현벡터로 형질전환된 식물체.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 식물체는 감자, 고구마 또는 톨페스큐인 것을 특징으로 하는 식물체.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
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