KR20030076058A - ａＮＤＰＫ2 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스저항성을 갖게 하는 방법 및 상기 유전자가 도입된형질전환 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 aNDPK2(Arabidopsis nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법 및 aNDPK2 유전자가 도입되어 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다. aNDPK2 유전자를 식물체에 형질전환시키면 항산화 효소들의 생성을 유도하여 세포내의 활성산소 양을 줄이게 되고, 그 결과 제초제, 냉해, 염해 또는 활성 산소종을 유발하는 환경 스트레스에 대해서 내성을 가지게 되므로, 본 발명의 NDPK2 유전자를 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법은 복합 환경 스트레스에 대해 내성을 가지는 식물체를 만드는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ａＮＤＰＫ2 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법 및 상기 유전자가 도입된 형질전환 식물체{Method for enhancing stress tolerance of plants by transformation of aNDPK2 gene and transgenic plants transformed by aNDPK2 gene}

본 발명은 aNDPK2(Arabidopsis nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법 및 aNDPK2 유전자가 도입되어 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체에 관한 것이다.

식물은 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 과다한 UV 노출 및 삼투압 충격(osmotic shock)과 같은 각종 환경 스트레스를 받게 되면 반응성이 높은 산소인 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical), 과산화 수소 및 수산화 라디칼 등의 활성산소를 축적하게 되며, 이들의 축적은 세포내의 다양한 생리학적 변화를 야기한다. 상기에서 증가된 활성산소에 대한 세포의 반응은 증가된 활성산소의 양에 의존(dose dependent)한다. 즉, 세포 내에 증가된 활성산소 양이 미량일 때는 이들 활성산소는 세포내의 신호전달 물질로서 작용하여 식물생체 방어에 필요한 유전들(항산화효소, 열충격 단백질 등)의 발현을 유도하게 되지만, 증가된 활성산소 양이 높을 때에는 반응성이 높은 활성산소가 생리적인 장해를 유발하여 세포를 죽음에 이르게 한다.

최근 많은 연구자들에 의해 식물에서 이들 활성산소에 의하여 매개되어지는 신호전달 경로에 대한 관심이 증가하고 있다. 왜냐하면 이들 경로를 조절하게 되면 세포내의 항산화 효소 및 생체방어 단백질의 발현을 증가시킬 수가 있고 궁극적으로는 각종 환경 스트레스에 저항성을 가진 식물체를 개발할 수가 있기 때문이다(Kovtun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97(6):2940-45). 최근의 보고에 의하면 식물에서 활성산소에 의하여 매개되어지는 신호전달 경로에는 MAP 카이네즈 케스케이드(MAPK cascade)가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Kovtun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97(6):2405-7).

1970년 이래로 핵산의 합성과 대사에 관한 연구는 현재까지 꾸준히 보고가 있는데, 1990년대부터 이러한 핵산 대사에 관여하는 효소로서 NDPK 유전자에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. 그러나 최근에 NDPK 유전자가 식물의 광 신호전달을 매개하는 신호물질로 알려지면서 NDPK가 식물에서 신호전달에 관여할 가능성이 제시되었다(Kovtun, Nature, 1999, 395(6703):716-20).

NDPK는 여러 단백질들과 결합하는 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 고온에 대한 식물체 내에 조절반응 유용성이 보고되었다(Plant Physiol 2001 May;126(1):69-77). UV에 의해서도 NDPK 유전자가 발현되며, 신호 전달 체계에 있어서도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 여러 가지 효소를 안정화시키고, 또한 효소간의 연락과 결합을 조절해 주는 효소로서의 역할도 수행하는 것으로 보고되었다(J Biol Chem 1999, 274(24):17017-24). 또한, NDPK는 세포의 분화와 발육에 대해서도 관여하는 것으로 보고되고 있으며, 아울러 NDPK는 인산기를 여러 효소로 이동시키는 역할을 수행하는데, 인산화 활성역할과 탈인산화 역할을 수행하기도 한다는 보고가 있다(Eur J Biochem 1995 Nov 15;234(1):200-7). 그러나, 현재까지 NDPK 유전자를 이용하여 식물체의 항산화 스트레스를 감소시키는 것에 관한 연구는 보고된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 aNDPK2 유전자가 MAP 카이네이즈인 ATMPK3와 결합하여 세포내의 산화환원 상태를 조절하며, aNDPK2 유전자를 식물체에 도입했을 경우 항산화 효소들의 생성을 유도하게 됨으로서 세포내의 활성산소 양을 줄이게 되고, 그 결과 냉해나 염해 또는 활성 산소종을 유발하는 환경스트레스에 대해서 식물체가 내성을 가지게 됨을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 aNDPK2 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법 및 aNDPK2 유전자가 도입되어 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다

도 1은 야생형 애기장대 식물에 4 mM의 H₂O₂(A) 또는 4℃의 냉해 처리(B)를 한 후 NDPK2 유전자의 발현 양상을 노던 블럿으로 분석한 사진이고,

도 2의A는 CaMV 35S 프로모터를 갖는 재조합 DNA 벡터인 PBI121에 aNDPK2 유전자를 클로닝하여 제조한 식물 발현벡터를 나타낸 모식도이고,

BamHI, HindIII, SacI: 벡터내에 존재하는 제한효소 자리,

35S : CaMV 35S 프로모터,

도 2의B는 본 발명의 형질전환체군과 대조군 식물체로부터 단백질을 추출한 후, 카이네이즈 활성을 분석한 사진이고,

도 2의C는 본 발명의 형질전환체군과 대조군 식물체로부터 단백질을 추출한 후, 자가인산화(Autophosphorylation) 활성을 분석한 사진이고,

도 3의A는 본 발명의 형질전환체군과 대조군 식물체의 활성 산소종(ROS) 양을 유도 세포 분석기로 분석한 그래프이고,

도 3의B는 본 발명의 형질전환체군, 대조군 및 NDPK2 파괴군의 원형질체를 DCF로 염색하여 활성 산소종의 양을 형광 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 3의C는 본 발명의 형질전환체군, 대조군 및 aNDPK2 파괴군 내의 글루타치온 양을 측정하여 비교한 그래프이고,

도 4는 본 발명의 형질전환체군, 대조군 및 NDPK2 파괴군으로부터 GST6 유전자의 발현정도를 노던블럿으로 분석한 것이고,

1-8, 21-8 : 각각 다른 aNDPK2 형질전환체,

도 5는 본 발명의 형질전환체군와 대조군 식물로부터 각각 RNA를 뽑은 뒤 각각의 RNA를 형광 물질인 사이아닌(Cyanine) 5와 사이아닌 3으로 표지하고 애기장대 유전자가 집적되어 있는 DNA칩과 혼성화 반응하여 스캐닝한 것이고,

Cya 5 : 대조군, Cya 3 : 형질전환체,

Rate : 형광정도를 비율로 나타낸 수치,

도 6은 aNDPK2와 결합하는 단백질을 분석하기 위하여 효모 이중 하이브리드(yeast two hybrid) 분석을 수행한 사진이고,

T-L- : Trp, Leu 아미노산이 결핍된 배지,

T-L-A- : Trp, Leu, Ade 아미노산이 결핍된 배지,

선택 배지 : 선택 배지 위에서 효모가 자라는지 확인,

LacZ : 파괴된 세포의 복사본을(replica)에 X-갈락토시다제를 처리,

도 7의A는 파종 후 20일 지난 본 발명의 형질전환체군, 대조군 및 NDPK2 파괴군에 각각 50 uM의 메틸바이올로젠(Methylviologen)을 처리한 후, 1주일 경과한 후의 사진이고,

도 7의B는 도 7의 A의 각각의 식물로부터 엽록소를 70% 아세톤으로 추출해 낸 다음 클로로필 a와 b의 흡광값인 645 nm, 663 nm에서 얻은 값으로 엽록소의 양을 산출한 그래프이고,

도 8의A는 왼쪽 그림은 소금이 들어있지 않은 배지에서 소금이 들어 있는 배지의 식물체와 비슷한 크기가 될 때의 6일 경과 후 사진을 찍은 것이고, 오른쪽은 100 mM의 소금이 들어 있는 MS 배지에 파종을 한 후 10일 후에 사진을 찍은 것이고,

도 8의B는 도 8의 A의 각각의 식물들의 발아된 숫자를 5일부터 10일까지 경과되는 동안 나타낸 그래프이고,

도 9의A는 애기장대 형질전환 식물체를 1℃에 16시간을 둔 후, 0℃부터 1℃씩 내려주어 -7℃까지 1시간 간격으로 내려주어 식물체 전체가 얼어버린 상태로 만들고, 이후 4℃에 12시간을 두고 다시 23℃에서 2일 둔 후의 사진이고,

도 9의B는 도 9의 A의 각각의 식물체가 냉해에 의해서 사멸된 것과 산 것의 숫자를 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 aNDPK2(Arabidopsis nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 aNDPK2 유전자가 도입되어 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 aNDPK2 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법을 제공한다.

상기에서 NDPK2 유전자는 모든 식물체의 NDPK2 유전자가 될 수 있으며,서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 aNDPK2(Genebank accession number AF17640)가 바람직하다.

aNDPK2는 여러 환경 스트레스에 의해 식물체 내에서 발현이 증가하여 스트레스를 조절하는 역할을 한다. 식물체를 냉해 처리하거나 과산화 수소에 의한 스트레스를 주면 aNDPK2 유전자의 발현이 증가한다(도 1참조). aNDPK2 유전자는 산화제와 냉해뿐만 아니라 KCl 또는 NaCl 등과 같은 염이나 열에 의해서도 그 양이 조절 받으며, 호르몬인 아브시스산(Abscisic acid) 및 에틸렌(ethylene) 등에 의해서도 발현이 증가된다.

상기 NDPK2는 인산화기를 다른 효소에 옮겨주는 역할을 수행하는 에너지 대사에 있어 필수 효소일 뿐만 아니라(도 2참조), 그 염기 서열을 분석해 볼 때 신호전달 조절에 관여하는 효소로서, 3부분 이상의 인산화 모티프의 가능성을 보이는 잔기를 가지며, 166에서부터 173 잔기 까지의서열번호 2로 기재되는 부분은 ATP_GTP_AATP/GTP-결합 부위 모티프 A(P-loop)로 알려져 있다. 또한, 194번부터 202번까지의서열번호 3으로 기재되는 부위에서 히스티딘 잔기는 카이네이즈의 인산화 기능을 가지는 도메인으로 잘 알려져 있다.

aNDPK2는 농작물에 악조건을 가지는 많은 스트레스에 대해서 저항성을 가지는 효과를 줄 뿐 아니라 식물 생체방어 신호전달 대사를 조절하며, aNDPK2 유전자를 형질전환 기법을 이용하여 식물체내로 도입하게 되면 형질전환 식물체 내에서 황산화 활성을 갖는 단백질의 발현을 유도하고, 상기 항산화 효소에 의해 세포내에서 독성인 활성산소 양을 줄이게 되어 궁극적으로는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 제초제, 과다한 UV 노출 및 삼투압 충격(osmotic shock)과 같은 환경 스트레스에 저항성을 갖게 된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, aNDPK2를 애기장대 원형질체에 도입할 경우에 생체내의 독성인 활성 산소종을 줄여 주기 때문에 항산화의 역할을 유도하여 내성을 나타내었다(도 3의A참조). aNDPK2 유전자가 없는 식물체에 aNDPK2를 다시 도입하여 형질전환 식물을 만든 경우도 상기와 동일한 결과를 얻을 수 있었으며, NDPK2 유전자가 없는 식물체에 순간 도입한 경우도 같은 효과를 얻을 수 있다. 상기 식물체의 원형질체를 형광 현미경 상으로 살펴보면, 활성 산화종, 특히 미토콘드리아에 존재하는 산화물들과 특이적으로 결합하여 발광을 내게 염색한 후 관찰해 한 경우도 동일하게 aNDPK2를 도입한 식물이 더욱 적은 양의 형광을 띄는 것을 볼 수 있다(도 3의B참조). 이렇게 활성 산화종을 조절하는 근본적인 원인을 살펴볼 때, 생체내에 산화환원 시스템을 조절하는 글루타치온의 양이 식물체 내에서 조절되어, 형질전환 식물이 일반 식물체와 비교하여 글루타치온의 양이 많은 것을 볼 수 있고(도 3의C참조), 이로 인해서 많은 항산화 효소와 합성 효소들이 aNDPK2 유전자의 대량 발현에 대해서 순차적인 반응으로 발현양상이 높아진다(도 5참조). 마이크로어래이 분석에 의하면, 2 시스테인 퍼옥시데이스(2c Prx),싸이오레독신(trx), 퍼옥시데이스(Peroxidase), 클루타 레독신 트렌스퍼레이스(GST) 등의 유전자 발현 정도가 2배 이상 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, aNDPK2로 형질전환된 식물체는 일반 식물보다 환경 스트레스에 대하여 내성을 가지는 것을 알 수 있다(도 7,도 8,도 9참조).

결과적으로, 항산화 효소의 발현이 증가되게 유도하는 식물 초기생체방어 신호전달에 관여하는 유전자인 aNDPK2를 일반적으로 많이 활용되어지는 식물체에 대량으로 발현시킴으로서 여러 가지 환경 스트레스에 저항성을 가진 형질전환 식물을 제조할 수 있다.

상기에서 aNDPK2 유전자를 적용할 수 있는 식물체는 모든 식물이 될 수 있다. 또한, 상기에서 aNDPK2 유전자를 식물체에 형질전환시키는 방법은 일반적인 식물 형질전환 방법이 사용될 수 있고, 아그로박테리아를 이용하여 식물체에 형질전환시키는 방법 또는 식물체, 포유류, 곰팡이류, 미생물에 걸쳐 가장 보편적으로 사용되는 유전자 도입 방법인 진건(Gene Gun)을 사용하는 입자 충격(Particle bombardment) 방법으로 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조한다(Horsch et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1985, 50:433-7 ; Rogers et al., 1986).

또한, 본 발명은 NDPK2 유전자를 포함하며, 식물에서 발현할 수 있는 식물 형질전환용 발현벡터를 제공한다.

상기에서 식물 형질전환용 발현벡터로는 콜리 플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터를 갖는 식물 형질전환용 발현벡터이고, pCambia 1300 또는 pBI121등의 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.

상기에서 NDPK2 유전자는 모든 식물체의 NDPK2 유전자가 될 수 있고,서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 aNDPK2가 바람직하다.

본 발명에서는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 aNDPK2 유전자 및 콜리 플라워 모자이크 바이러스의 35S(CaMV35S) 프로모터(promoter)를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터 pCambia 1300::NDPK2을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 발현벡터 pCambia 1300::NDPK2를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전환시키고, 이를 'GV3101/pCambia 1300::NDPK2'라 명명하고, 2002년 2월 20일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10184BP).

또한, 본 발명은 aNDPK2가 도입되어 스트레스 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 aNDPK2 유전자가 포함된 식물 형질전환용 발현벡터를 식물체에 형질전환시켜 식물체 내에서 aNDPK2가 대량 발현되고 스트레스 저항성을 나타내는 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은서열번호 1로 기재되는 aNDPK2 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터를 애기장대에 형질전환시킨 형질전환 식물체를 제공한다.

상기에서 식물체에 형질전환시키는 방법은 일반적인 식물 형질전환 방법이 사용될 수 있고(Horsch et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1985, 50:433-7; Rogerset al., 1986), 식물 형질전환용 발현벡터를 아그로박테리아를 이용하거나 입자 충격 방법으로 식물체에 도입하여 형질전환 식물체를 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 aNDPK2를 형질전환시킨 형질전환 애기장대가 스트레스에 대한 저항성을 갖는지 알아보면, aNDPK2 형질전환체는 파라쿼트(paraquet) 또는 메틸바이올로젠과 같은 제조체의 처리에도 외관상 거의 손상되지 않았으나, aNDPK2 유전자가 없는 aNDPK2 파괴군은 치명적인 손상을 입었다(도 7의A참조). 또한, 엽록소의 양을 측정하여 보면, aNDPK2 형질전환체에서 가장 많았고, 상대적으로 aNDPK2 파괴군이 엽록소 양이 가장 적은 것으로 나타나(도 7의B참조), aNDPK2 형질전환체는 제초제에 대해 내성을 갖는 것을 알 수 있다. 또한, aNDPK2 형질전환체가 염성에 대한 저항성을 나타내는지 알아보면, 소금이 있는 배지에서 aNDPK2 형질전환 식물체는 색깔이 약간 갈변하였지만 잘 자라는 반면, 대조군은 거의 발아를 하지 못하거나 성장이 느리게 자란다(도 8참고). 또한, 본 발명의 aNDPK2 형질전환체는 냉해에 대해서도 대조군에 비해 강한 내성을 나타낸다(도 9참조).

본 발명의 aNDPK2 유전자를 도입한 식물은 유용 유전자원의 확보, 고부가가치 형질전환 식물의 개발과 산업화에 대한 종합적인 연구일 뿐만이 아니라 학문적으로도 항산화 기작에 대한 흐름을 더욱 밝히는데 있어서 매우 중요하다. 식물 세포는 끊임없이 스트레스 상태에 놓여있으며 이로 인한 배양세포의 산화와 세포 사멸의 문제점을 해결하는 방안으로 이 형질전환 식물은 안정적 농작물의 생산을 위하여 필수적이라고 할 수가 있다. 환경 스트레스에 저항성을 가지는 식물에 관한 연구는 농업생산성과 직결되는 문제이기 때문에 전 세계적으로 식물의 연구분야 중 가장 관심이 집중되고 있다. 이러한 항산화성을 유도하는 유전자 확보 및 그 기능 해석은 산업적으로 유용하게 이용할 수 있을 뿐만이 아니라, 식물의 생존 메카니즘을 이해하는 데도 크게 기여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 스트레스에 의한 aNDPK2 유전자의 발현 분석

본 발명자들은 활성산소 및 저온과 같은 환경스트레스에 의해 aNDPK2 유전자가 발현되는지 확인하기 위하여, 애기장대에 환경 스트레스를 주고 난 후 이를 노던 블럿으로 분석하여 aNDPK2 유전자의 발현을 측정하였다. 구체적으로, 파종 후 20일이 지난 애기장대에 4 mM H₂O₂를 시간별로 3시간, 6시간 또는 9시간 처리하거나, 4℃에서 상기와 동일한 시간으로 애기장대에 저온 처리한 후, 상기 애기장대에서 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는³²P[dATP]로 표지된 aNDPK2 유전자를 탐침으로 이용하여 혼성화한 노던블럿 분석을 수행하였다. 노던블럿의 대조구로는라이보조말(ribosomal) RNA를 사용하였다. 노던 블랏 분석 방법은 스트레스를 처리한 각각의 RNA 20 ㎍을 1.5% 포름알데하이드-아가로스 겔(formaldehyde-agarose gel)에서 분리한 후, 나이론 멤브레인(nylon membrane)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 자외선(UV)를 쬐인 후, 0.5M NaHPO₄(pH 7.2, 1 mM EDTA, 1% BSA) 및 7% SDS의 용액에서 65℃의 조건하에서 방사선 동위원소로 표지된 aNDPK2 cDNA 프로브(probe)를 넣고 하루 동안 방응시켰다. 이 멤브레인을 2×SSC(0.3 M NaCl, 0.03 M 소듐싸트레이트)로 37℃에서 15분 동안 2번 세척한 후, 다시 0.1%의 SDS를 포함하는 0.2×SSC 용액으로 60℃에서 15분 동안 2번 세척합니다. 상기 멤브레인을 말려서 -70℃에서 X-ray 필름에 노출시켰다.

그 결과, aNDPK2 유전자는 4℃에서 3시간 정도 두었을 때 그 발현 정도가 3배 정도 증가되었고, 과산화 수소의 양 또한 4 mM 정도의 스트레스 상태로 처리하게 되면 3시간 때 2배 이상 발현이 증가되었다(도 1). 상기 결과로부터, aNDPK2 유전자는 스트레스를 받았을 때 식물체 내에서 많이 발현되는 것을 알 수 있다.

<실시예 2> 형질전환 애기장대의 제조

<2-1> 식물 형질전환용 발현벡터의 제조

본 발명자들은 aNDPK2 유전자가 형질전환된 애기장대를 제조하기 위하여, 우선 aNDPK2를 발현벡터에 클로닝하였다. 구체적으로, CaMV 35S 프로모터를 가지고있으며 카나마이신(kanamycin)저항성과 하이그로마이신(hygromycin)저항성을 가지는 발현벡터 pCambia 1300(Cambia 사)에서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 aNDPK2 유전자를 클로닝시켜 식물 형질전환용 발현벡터 pCambia 1300-aNDPK2를 제조하였다(도 2의A).

본 발명자들은 상기 발현벡터 pCambia 1300::NDPK2를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전환시키고, 이를 'GV3101/pCambia 1300::NDPK2'라 명명하고, 2002년 2월 20일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10184BP).

<2-2> 형질전환 애기장대의 제조

본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 제조한 GV3101/pCambia 1300::NDPK2를 이용하여 애기장대에 형질전환시켰다. 구체적으로, 형질전환 식물체를 제조하기 위해 애기장대 식물을 MS배지에 키워서 흙으로 옮겨 키우고, 꽃대가 올라오면 2번 잘라서 상태가 좋을 때 형질전환을 시키기 위한 야생형의 식물체를 준비하였다. GV3101이라는 아그로박테리아(agrobacterium)에 pCambia 1300::NDPK2를 전기적인 충격에 의해서 형질전환시켰다. 상기 박테리아를 OD=0.8이 될 때까지 YEP(1% peptone, 1% yeast extract, 0.5% NaCl) 배지에서 키운 후, 식물체를 거꾸로 해서, 아그로박테리아를 희석한 동일 배지에 담가 약 10초씩 5회에서 10회를 반복하여 박테리아에 의해서 aNDPK2가 도입된 형질전환 애기장대를 제조하였다(Horsch et al., 1985 ; Rogers et al., 1986)

aNDPK2가 도입된 형질전환 식물은 대조군 식물에 비해서 발아율이 월등히 높을 뿐만 아니라, 꽃대도 빨리 올라온 것을 알 수 있었다. 또한, aNDPK2 유전자가 없는 aNDPK2 파괴 식물(Krysan et al., PNAS, 1996, 93:8145)은 발아율이 대조군에 비해서 늦었고, 잎의 사이즈만 커다래지고 식물의 키가 커지지 않는 것을 알 수 있었다. 노지가 아니라 고형 배지에서 키울 경우 aNDPK2 유전자가 없는 식물은 발아율이 보통 식물에 비해서 늦거나 발아가 되지 않는 경우가 많고, 자라는 성장 속도 또한 느린 것을 볼 수 있었다.

<실시예 3> 형질전환 애기장대의 카이네이즈 활성 및 자기인산화 활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조한 형질전환 애기장대에서 형질전환된 aNDPK2 유전자가 식물체 내에서 발현되어 카이네이즈(kinase) 활성과 자체인산화(autophosphorylation) 기능을 나타내는지 알아보았다.

구체적으로, 각각의 식물체로부터 식물 단백질 추출버퍼(250 mM Sucrose, 25 mM HEPES(pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl₂, 1 μM 단백질 분해효소 저해제(Proteinase inhibitors))를 사용하여 애기장대로부터 단백질을 추출한 후, 이 단백질에³²P[dATP]의 γ사이트 인산화기의 방사성동위원소를 섞어준 후, 0.1 M HEPES, GDP, 20 mM MgCl₂등을 넣고 섞어, 30분 후 TLC(thin layer chromatography) 플레이트를 사용하여 7.5 M KH₂PO₄의 기질 용액에 넣었다. 플레이트에 혼합 용액의스팟을 떨어뜨린 후, TLC 크로마토그래피에 의해서 라벨링된 인산화기의 움직임을 분석하였다.

그 결과, 대조군에 비해서 형질전환체의 활성정도가 월등히 뛰어나서, ATP의 γ 사이트의³²P의 인산화기를 GDP로부터 GTP로 모두 옮길 수 있는 능력이 증가된 것을 볼 수 있다(도 2의B).

또한, 본 발명자들은 형질전환체군 식물의 자가인산화(Autophosphorylation) 활성을 대조군과 비교 분석하였다. 구체적으로, 형질전환체와 대조군의 식물로부터 단백질을 추출하고,³²P[dATP]의 γ사이트 인산화기의 방사성동위원소를 섞어 준 후, 0.1 M HEPES, 20 mM MgCl₂를 넣어주고 반응시킨 후 단백질 SDS-PAGE를 수행하여 필름을 현상시켰다.

그 결과, 형질전환체 식물의 활성이 대조군과 비교해 볼 때 고유의 활성이 적어도 2배 이상 증가된 것을 알 수 있었다(도 2의C).

<실시예 4> 원형질체를 이용한 aNDPK 2의 환원 조절 반응 조사

<4-1> 활성 산소종의 측정

본 발명자들은 aNDPK2로 형질전환시켰을 때 aNDPK2에 의해서 활성 산소종에대한 내성을 나타내는지 알아보기 위하여, 생체내 독성인 활성 산소종의 양을 측정하였다. 구체적으로, 대조군과 형질전환체 식물체로부터 효소 용액인(1% Cellulase R-10, 0.3% Macerozyme R-10, 500 mM Mannitol, 1∼8 mM CaCl₂, 5 mM MES-KOH)에 12시간 식물체를 담가두어 세포벽을 제거한 후 원형질체를 분리하였다. 상기 분리한 원형질체에 aNDPK2 유전자를 트렌짓(transient) 방법(Kovtun et al. 2000)으로 도입시킨 후, 활성 산소종과 특이적으로 결합하는 디클로로플루오르세인-디아세테이트(dichlorofluorescein-diacetate; DCFH-DA)를 사용하여 염색을 시키고, 이를 유도세포 분석기를 이용하여 형질전환체 식물체와 대조군의 활성 산소종의 양을 측정하였다.

그 결과, 형질전환체 식물은 대조군 보다 훨씬 적은 양의 활성 산소종을 발생시키는 것을 알 수 있었다(도 3의A). 또한, aNDPK2 유전자가 없는 식물체(Krysan et al., Plant Cell, 1999, 12:2283-90)에 aNDPK2를 다시 도입하여 형질전환 식물을 만든 경우 동일한 결과를 얻을 수 있었으며, 이 유전자가 없는 식물체에 순간 도입한 경우도 같은 효과를 얻을 수 있었다.

상기 결과로부터, 형질전환 식물은 대조군에 비해서 생체내의 독성인 활성 산소종의 양을 줄여 주기 때문에 항산화의 역할을 유도하였고, 여러 가지 스트레스에 대한 저항을 더 많이 가질 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<4-2> 형광 현미경 관찰

본 발명자들은 상기 실시예 <4-1>에서 DCF로 염색한 원형질체를 형광 현미경 상에서 관찰하여 보면, 형질전환체의 활성 산소종 양이 대조군보다 적은 것을 알 수 있었다(도 3의B). 활성 산화종, 특히 미토콘드리아에 존재하는 산화물들과 특이적으로 결합하여 발광을 낼 수 있는 10 ㎍/㎖의 DCF를 염색액을 사용하여 염색한 후 관찰한 경우도 동일하게 aNDPK2를 도입한 식물이 더욱 적은 양의 형광을 띄는 것을 볼 수 있었다.

<4-3> 글루타치온(GSH)의 측정

세포내 치올(thiol) 중 가장 많은 트리펩티드(tripeptide)인 글루타치온(L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH)은 포유동물의 세포에서는 주된 비단백질 설프하이드릴(nonprotein sulfhydryl) 화합물으로서 세포가 증식되는 동안 아미노산의 수송, 단백질의 합성과 DNA의 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide) 전구물질 합성, 효소활성, 대사작용, 디설파이드(disulfide)의 환원, 시스테인(cysteine)의 저장과 운반 및 자유 라디칼(free radical)과 활성 산소 화합물(reactive oxygen compounds)에 대한 세포의 보호작용 등 많은 생물학적인 기작에 있어 중요한 역할의 수행하는 아미노산 유도체로 알려져 있다(Koswer et al., Int Rev Cytol. 1978, 54:109-60 ; Lafleur et al., Free Radic Res, 1994, 21(1):9-17 ; Meister and Anderson, 1983; Koswer et al., Eur. J. Biochem.,77(3):529-34, Koswer et al., Biochem Biophys Res Commun, 1975,65(3)901-6). 글루타치온은 외부화합물과의 결합, 에스트로젠, 프로스타글랜딘스(prostaglandins)와 류코트리엔스(leukotrienes) 등의 대사작용에서 형성된 화합물과의 결합을 통한 조효소로도 많은 역할을 수행하는 것으로도 알려져 있다(Valerie와 Barbara, 1987). 글루타치온 함량은 세포가 성숙되고 발육되는 동안 증가하며, 발육되는 동안 난포란에서 글루타치온의 축척은 세포내의 주요한 역할을 하는 산화 환원 조절을 조절하여, 축척되어진 글루타치온의 함량은 세포내 발란스를 유지해서, 안정화에 주요한 역할을 한다. 포유동물의 세포에서 글루타치온의 농도는 0.5∼10mM으로서 매우 폭넓은 범위를 가지는 것으로 알려져 있는데, 과산화수소와 같은 활성산소종의 높은 농도는 단백질, 핵산, 지방 등과 같은 세포구성물에게 유해한 효과가 있는데 배양액에 글루타치온의 첨가는 산화적 스트레스에 의해 일어나는 이러한 유독성을 완화시켜 줄 수 있는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 생체내에서 환원 조절에 중요한 역할을 하는 글루타치온을 형질전환체가 대조군보다 세포내에 더 많이 가지고 있는지 알아보기 위해서, 글루타치온의 양을 측정하였다. 글루타치온은 과산화지질과 활성산소를 이용하여 몸의 기능을 정상적으로 유지하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 이때 기질로 사용되어 지는 중간 매체가 5,5-디티오비스-2- 니트로벤젠산인 것으로 알려져 있다. 구체적으로, 식물로부터 추출한 단백질을 초음파로 분쇄시킨 후 그 상등액을 사용하는데, 125 mM 소듐 포스페이트, 6.3 mM EDTA, 0.21 mM NADPH, 0.1 M 5,5-디티오비스-2-니트로벤조산(5,5-dithiobis-2- nitrobenzoic acid)과 단백질을섞은 최종 용액을 30℃에서 5분 동안 둔 후, 200 ㎕씩 나눈 후 상기 샘플에 0.5 유니트의 글루타치온 환원제(glutathione reductase)를 넣어준 후, 412 nm에서 모니터링하였다. 글루타치온 농도는 글루타치온 표준곡선과 비교 계산하여 산출하였다.

그 결과, aNDPK2 형질전환 식물체는 대조군에 비하여 많은 양의 글루타치온이 발현되었고, aNDPK2 파괴군에서는 대조군에 비하여 글루타치온의 양이 적었다(도 3의C).

<실시예 5> 형질전환 배양 세포의 제조와 항산화 효소의 발현 비교

<5-1> GST6(Glutathione-S-Transferase 6)의 발현 분석

본 발명자들은 대조군, 형질전환 식물체와 NDPK2가 파괴된 식물체로부터 NDPK2에 의해서 최종적으로 조절 받을 것이라고 생각되어지는 목적 조절 유전자이고 항산화 효소인 GST6(Kovtun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2000, 97(6):2940-5) 유전자의 발현정도를 비교 분석하였다. 구체적으로, 형질전환 배양 세포를 제조하기 위하여, 유전자 도입이 확인된 형질전환 식물체의 잎을 MS 기본배지(murashige and skoog medium(MS) salts include Vitamin4.4g/ℓ, sucrose 3%, pH5.7; DUCHEFA 사)에 20 g/ℓ수크로스, 0.5 ㎎ 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid; DUCHEFA)과 0.05 ㎎/ℓ 키네틴(kinetin)과 0.5 g/ℓ 2-N-모포리오 에탄메설폰산(2-N-Morpholio ethanmesulfonic acid, MES; Sigma)를포함하는 배양세포 유도배지에서 배양하여 이로부터 유도된 형질전환 세포주로부터 현탁 배양을 확립하였고, 이로부터 RNA를 분리하여 GST6의 유전자의 발현 증가량을³²P[dATP]로 표지된 GST6 항산화 유전자를 탐침으로 노던 블럿을 수행하였다. 대조구로는 라이보조말 RNA를 사용하였다.

그 결과, 대량 발현시킨 형질전환체에서 3배 이상의 높은 GST6의 발현율을 나타내었고, NDPK2 파괴군 식물체에서는 그 발현 정도가 줄어드는 것을 볼 수 있었다(도 4).

<5-2> 마이크로어레이를 이용한 항산화 효소의 발현 분석

본 발명자들은 NDPK2 유전자가 형질전환된 식물체가 어떠한 유전자의 발현에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 많은 수의 유전자가 집적되어 있는 마이크로어레이를 이용하였다. 구체적으로 대조군에 비하여 NDPK2 형질전환체에서 특이적으로 많이 발현되는 유전자를 찾아내기 위하여, 대조군과 NDPK2 형질전환체 식물로부터 각각 RNA를 뽑은 뒤 각각의 RNA를 형광 물질인 사이아닌(Cyanine) 5와 사이아닌 3으로 표지하고, 이를 2,304개의 애기장대 유전자가 집적되어 있는 DNA 칩(Takara Shuzo Co., Ltd.)과 혼성 반응하였다. 상기 혼성 반응한 것을 아주 미세한 차이의 형광수준까지 읽어낼 수 있는 스캐너를 이용하여 데이터를 수집하였다(Girke et al., Plant Physiology, 2000, 124:1570-81; Hegde et al., Biotechniques, 2000,29(3):548-562).

그 결과, 대조군에 비하여 NDPK2 형질전환 식물체에서 2-시스테인 퍼옥시데이스(2c Prx), 싸이오레독신(trx), 퍼옥시데이스(Peroxidase), 글루타 레독신 트렌스퍼레이스(GST)등(Das et al 2000., Cheong et al., Plant Mol Biol, 1999, 40(5)825-34; Kampranis, J. Biol. Chem. 2000, 275(38):29207-16; Ruzsa and Mylona, Redox Rep, 1999, 4(3):95-103; Mitohashi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 2001, 98(20)11224-9; Laloi et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 98(24)14144-9; Goyer et al, Eur. J. Biochem., 2002, 269(1):272-282; Goyer et al., Plant J., 1999, 3:285-92; Richardset al., Plant Physiol, 1998, 116(1):409-18; Sagara et al 1998.,Radyuk et al 2001., Takeuchi et al 2000., Vontas et al 2001.)의 유전자 발현이 2배 이상 증가하는 것을 알 수 있었다(도 5).

상기 결과로부터, NDPK2 유전자의 발현에 의해 항산화 효소의 발현이 많이 유도되고, 상기 항산화 효소들에 의해 스트레스 저항성을 갖게되는 것을 알 수 있다.

<실시예 6> NDPK2와 특이적으로 결합하는 단백질의 분석

본 발명자들은 NDPK2가 식물에서 잘 알려져 있는 산화 스트레스에 관련된 것으로 알려진 MAPK 신호 전달 경로를 경유하는지 알아보기 위하여, 효모 이중 하이브리드(yeast two hybrid) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 활성 도메인(activatedomain, AD)을 가진 pGAD(Clontech) 벡터에 ATMPK3(arabidopsis mitogen-activated protein kinase 3)를 클로닝하고, 결합 도메인(binding domain, BD)을 가진 pAS2-1(Clontech) 벡터에 NDPK2를 클로닝하여 pJG694a 균주(Stratagene)에 동시 형질전환하면 숙주내의 Ade와 Lac Z의 전사를 돕는다. 결국 Ade-Sc 배지에서도 자라며 질소로 효모의 세포벽을 파괴한 후 도출되는 단백질에 X-갈락토시다제를 처리하여 단백질간의 결합을 규명하였다.

그 결과, aNDPK2는 ATMPK3와 특이적으로 결합한다는 것을 밝혀내었다. ATMPK3에 대한 항산화 기능에 대해서는 잘 밝혀져 있고(Kovtun et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(6)2940-5; Kovtun et al., Nature, 1998, 395(6703):716-20; Yuasa et al., Plant Cell Physiol, 2001, 42(9):1012-6; Clarke et al., Plant J. 2000, 5:667-77), 따라서 ATMPK3가 aNDPK2와 결합하는 것은 스트레스 저항성에 대한 메카니즘을 조절할 수 있는 단백질이라는 것을 알 수 있다.

<실험예 1> 제초제에 대한 내성 실험

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조한 aNDPK2 형질전환체가 제초제에 대해 내성을 갖는지 알아보기 위하여, 제초제의 일종인 메틸바이올로젠(Methylviologen)을 사용하여 제초제에 대한 내성을 알아보았다. 구체적으로, aNDPK2가 도입된 식물의 씨를 소독한 후 파종하여 4℃에 이틀 정도 두어 춘화 처리한 후, 배양 조건에서(25℃) 10일간 키웠다. 메틸바이올로젠을 처리한 경우 대조군 식물보다 더욱 저항성을 보이는지 조사해 보기 위해서, 10 μM의 메틸바이올로젠을 식물과 같이 액체배지인 MS 배지에 두고, 7일 이후에 탈색되어지는 것을 관찰하였다.

또한, 상기에서 에반스 블루라는 사멸 세포를 검색할 수 있는 화학 물질을 사용하여 염색한 후 현미경 상에서 분석하였고, 남아 있는 엽록소를 70%의 아세톤에 녹여낸 후 그 엽록소의 양을 스펙트로 포토메타를 이용하여 클로로필 a와 b의 흡광값인 645 nm 및 663 nm에서 여러 가지 파장에서 분석하여 엽록소의 양을 산출하였다.

그 결과, aNDPK2 형질전환체는 외관상 거의 손상되지 않은 모양이지만, NDPK2 파괴군은 치명적인 손상을 입었다(도 7의A). 또한, 엽록소의 양을 측정한 결과 aNDPK2 형질전환체에서 가장 많았고, 상대적으로 aNDPK2 파괴군이 엽록소 양이 가장 적은 것으로 나타났다(도 7의B). 상기 결과로부터, aNDPK2 형질전환체에서 세포 사멸정도가 확연히 지연되었고, 이는 aNDPK2 형질전환체가 제초제에 대하여 내성을 갖는 것을 알 수 있었다.

<실험예 2> 염성에 대한 내성 실험

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조한 aNDPK2 형질전환체가 염성에 대한 저항성을 나타내는지 알아보기 위하여, aNDPK 2를 도입한 형질전환 식물체를 소금이 들어 있지 않은 배지 또는 100 mM 농도의 소금(NaCl)을 포함한 고형 MS 배지에 심은 후 각각 6일 또는 10일 후에 발아율을 조사하였다.

그 결과, 소금이 있는 배지에서 aNDPK2 형질전환 식물체는 색깔이 약간 갈변하였지만 잘 자라는 반면, 대조군은 거의 발아를 하지 못하거나 성장이 느리게 자라는 것을 볼 수 있었다(도 8). 따라서, 본 발명의 aNDPK2 형질전환 식물체는 염성에 대한 내성을 갖는 것을 알 수 있었다.

<실험예 3> 냉해에 대한 내성 실험

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제조한 aNDPK2 형질전환 식물체가 냉해에 대한 내성을 갖는지 알아보았다. 애기장대가 냉해에 강한 식물인 점을 가만할 때, 4℃의 온도에서는 대조군도 잘 자라기 때문에 비교 차이를 분석할 수 없었다. 따라서, -7℃까지 얼려주는 실험을 수행하였는데 식물체가 들어갈 수 있는 챔버안을 50% 알콜로 채우고, 식물이 자라고 있는 페트리 디쉬안에 아이스 크리스탈을 만들어 방수 테잎으로 싸서 암상태로 -1℃에서 16시간 동안 챔버안에 두었다. -1℃에서 한시간에 1℃ 내리면서 -7℃까지 내려주게 되는데, 플레이트의 가운데 둔 얼음이 크리스탈을 만들게 됨으로 플레이트 전체에 얼음 크리스탈층이 생기게 되었다. 따라서 식물체 전체가 얼어버린 상태로 만들어지게 되고, 이후 4℃에 12시간 암상태로 둔 후 배양실(25℃)로 옮겨서 이틀 후에 형질전환체와 대조군 식물을 비교하였다.

그 결과, 대조군은 사멸 상태로 진행이 계속 되지만 aNDPK2 형질전환체는 회복되어져 엽록체가 그대로 남아져 있는 것을 볼 수 있었고, 대조군은 결국 하얀 색의 죽은 식물체가 되었다(도 9). 상기 결과로부터 aNDPK2 형질전환체는 냉해에 내성을 갖는 것을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 aNDPK2 유전자를 도입한 식물체는 다양한 환경 스트레스에 대해서 생성되어지는 생체 내에서 독성을 보이는 활성 산소종을 줄여주는 역할을 하고, 가뭄, 염성 또는 냉해와 환경스트레스 뿐만 아니라, 제초제 등의 화학 약품에 대해서도 내성을 가지므로, 상기 유전자는 여러 가지 환경 스트레스에 내성을 갖는 형질전환 생물체의 제조에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, aNDPK2 유전자가 도입된 형질전환 식물체는 유용 유전자원의 확보, 고부가가치 형질전환 식물의 개발과 산업화에 대한 종합적인 연구일 뿐만이 아니라 학문적으로도 항산화 기작에 대한 흐름을 밝히는 데도 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. aNDPK2(Arabidopsis nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자를 식물체에 형질전환시켜 스트레스 저항성을 갖게 하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 aNDPK2 유전자는서열번호 1로 기재되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 스트레스는 고온, 염해, 건조, 공해, 병원균, 상처, 냉해, 과다한 광조건, 오존, 제초제, 과다한 UV 노출 및 삼투압 충격(osmotic shock)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 aNDPK2 유전자 및 콜리 플라워 모자이크 바이러스의 35S(CaMV35S) 프로모터를 포함하는 식물형질전환용 발현벡터(pCambia 1300::NDPK2).
5. 제 4항의 발현벡터가 도입된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101/pCambia 1300::NDPK2(수탁번호 :KCTC 10184BP).
6. aNDPK2 유전자가 도입되어 냉해, 가뭄, 건조 및 활성산소 관련 환경 스트레스에 저항성을 갖는 형질전환 식물체.
7. 제 6항에 있어서, 제 5항의 아그로박테리움 투메파시엔스 GV3101/pCambia 1300::NDPK2를 애기장대에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.