KR101300658B1 - 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 국화 식물체 - Google Patents

국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 국화 식물체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유용 유전자가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법, 산화 스트레스 유도성 프로모터와 환경 스트레스 내성 유전자를 포함하는 식물 재조합 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 복합스트레스 내성 형질전환 국화의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 형질전환 국화 식물체에 관한 것이다.

Description

국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 국화 식물체{Method for increasing transformation efficiency of Chrysanthemum and Chrysanthemum plant tolerant against multiple stress produced by the same}
본 발명은 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 국화 식물체에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 산화 스트레스 유도성 프로모터에 환경 스트레스 내성 유전자가 결합된 식물체 제조용 재조합 발현 벡터를 식물체에 도입하여 환경 스트레스 내성 형질전환체의 개발, 및 상기 형질전환체의 환경 스트레스 내성 검정에 관한 것이다.
인류의 건강 복지를 위한 핵심 산업기술로 인식되고 있는 식물생명공학기술은 유용 유전자를 도입하여 새로운 형질을 갖는 형질전환체를 개발하는 것이다. 이러한 기술은 식량 생산량 증산, 내병성, 내충성, 내한성, 고품질 농산물 개발 및 다양한 환경에 적응력이 높은 신품종을 개발하는 분자육종 기술로서 첨단핵심기술이라 할 수 있다. 외국에서는 이러한 분야의 연구결과가 축적되고 있으며 일부 작물에서는 광범위하게 실용화되고 있다. 이 기술은 미래의 차세대 농업 기술로 각광받고 있으며 세계적인 농업회사들이 관련 기술 개발과 유전자 탐색에 참여하는 등 경쟁이 매우 치열하다.
우리나라 농작물 중 화훼작물은 경쟁력 제고 가능성이 매우 높은 작물로 인식되어, 비닐하우스나 유리온실을 이용하는 시설원예가 생산 원가 중 연료비가 높은 비중을 차지하고 있다는 단점에도 불구하고 보급이 증가하고 있다. 그러나 화훼작물의 대부분은 외국에서 개발된 신품종을 재배하고 있는바, 국제 정세의 변화로 종자 및 묘목에 대한 높은 로얄티를 지불하게 되었다. 또한 가뭄, 홍수, 저온, 고온 등 여러 환경 스트레스 등으로 화훼작물 재배 농민들이 어려움을 겪고 있다.
화훼작물 중 국화는 장미 다음으로 가장 높은 비중을 차지하고 있는바 우리나라 실정에 적합한 품종 개량이 시급하다. 상기 문제점을 해결하고자 환경 스트레스에 내성이 있는 국화를 개발하여 농가에 보급하여야 한다.
따라서, 본 발명에서는 화훼재배현장에서 제기되고 있는 문제점들을 극복하기 위한 방법으로서, 환경 스트레스 내성 유전자를 국화에 응용하여 형질전환 국화를 개발하고자 한다.
식물은 그의 생활사(life cycle) 동안 가뭄, 저온 및 고온과 같은 여러 요인으로 환경적 스트레스에 직면한다. 이러한 스트레스는 식물의 생장, 생산성 및 품질에 영향을 미칠 수 있으며, 심한 스트레스는 생존을 위협하기까지 한다. 따라서 비생물적 및 생물적 스트레스 모두에 대하여 동시에 강화된 저항성을 갖는 새로운 작물을 개발하는 것이 경제적 의미에 있어 매우 중요한 일이다.
환경 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 식물 및 농작물 개발에 대한 지속적인 요구에 부응하면, 불리한 환경 조건에서 농작물 수확량이 증가되고, 흉작의 위험이 줄어들게 된다. 예를 들어 극한의 기온 및 고염 조건인 가뭄에 대한 증가된 내성을 갖는 식물은 이미 농작물 생존이 불가능한 반사막기후에서 농업의 가능성을 열 수 있다. 또한, 저온 또는 동결 온도에 대한 개선된 내성을 갖는 새로운 농작물의 개발은 더 추운 기후를 가진 지역에서 식물의 생장기를 현저하게 연장할 수 있다.
환경 스트레스 내성 식물체 재조합 발현 벡터를 이용하여 식물체를 형질전환시키는 경우 활성 산소 생성 등을 유발하는 다양한 환경 스트레스에 대한 강한 내성을 나타내는 형질전환체를 제조할 수 있으므로, 농작물의 생산성 증대 또는 유용성분의 대량 생산 등에 크게 기여할 수 있다. 또한 다른 경제 작물에도 적용이 가능하다.
화훼작물의 형질전환은 전통적 육종의 단점을 보완하고자 내병성, 내충성, 생육연장, 화색변화 등을 목표로 품종개발이 시도되고 있다. 유용 유전자를 이용한 형질전환이 지속적으로 시도되고 있으나, 낮은 효율 및 품종 특이성으로 인한 많은 제약이 있다. 본 발명에서는 장미 다음으로 재배량이 2순위인 국화를 이용하여 형질전환 국화를 개발하고자 한다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 기존에 극히 낮았던 국화의 형질전환 효율을 크게 높인 효율적이면서 안전성 있는 국화의 형질전환 방법을 확립하고, 형질전환체의 환경 스트레스(염)에 대한 내성을 확인하여, 국화 유전자원의 연구를 위한 발판을 마련하고자 한다.
본 발명의 목적은 환경 스트레스 내성 유전자를 효과적으로 국화에 도입시켜 형질전환시키는 방법을 제공하고, 또한 그 방법에 의해 얻어진 환경 스트레스 내성 형질전환체 국화를 제공하고자 하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 유용 유전자가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 산화 스트레스 유도성 프로모터와 환경 스트레스 내성 유전자를 포함하는 식물 재조합 발현 벡터가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 복합스트레스 내성 형질전환 국화의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 형질전환 국화 식물체를 제공한다.
본 발명의 개량된 국화 형질전환 방법은 유용 유전자를 국화에 안정적으로 전이시켜 다수의 형질전환 국화를 얻을 수 있는 방법으로, 기존에 극히 낮았던 국화의 형질전환 효율을 크게 높임으로써, 기존의 기술에 비해 한층 뛰어난 효과가 있다.
본 발명의 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법은 광범위한 비생물학적 및 생물적 스트레스 조건 모두에 대해 증가된 저항성을 갖는 농작물, 육종소재(breeding material)를 제공하는 효과가 있다.
본 발명의 형질전환체는 복합적인 환경 스트레스에 대한 내성을 가지므로 재배비와 노동력이 절감될 수 있으며, 생산성 향상에도 기여한다.
도 1은 형질전환에 사용된 식물 발현 벡터 모식도를 보여준다.
도 2는 아그로박테리움을 이용하여 유용 유전자를 도입하여 형질전환체를 유도하는 과정을 보여준다.
도 3은 NAA 1mg/L와 BA 0.5 mg/L 및 Kanamycin 100 mg/L이 포함된 MS 기본배지에서 형질전환체의 선별과정을 보여준다.
도 4는 형질전환체로의 유전자 도입을 확인하기 위해 형질전환체의 잎으로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하여 도입 유전자 염기서열의 일부분을 이용하여 작성한 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행한 전기영동 사진을 보여준다. N: 비형질전환체, P: Agrobacterium , T: 형질전환체
도 5는 형질전환체의 유전자 발현을 확인하기 위해 PCR 분석으로 선별된 기내 배양중인 형질전환체에 150 μM MV 50 ㎖을 처리하고, 잎으로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR 분석을 수행한 전기영동 사진을 보여준다.
도 6은 시간별 유전자 발현 상태를 확인하기 위해 100 μM MV를 70 ㎖씩 처리하고 24, 36, 48 시간별로 잎으로부터 RNA를 분리하여 RT-PCR 분석을 수행한 전기영동 사진을 보여준다.
도 7은 형질전환체의 염 스트레스에 대한 내성을 조사하기 위해 MS 기본배지에 0, 250, 500, 1000 mM NaCl을 첨가하여 8주간 배양한 후 식물체 변화를 보여준다.
도 8은 화분 순화 후 배양 중인 형질전환체를 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유용 유전자가 도입된 아그로박테리움을 이용하여 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 구체적으로는,
유용 유전자가 도입된 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤이 첨가된 공동배양 배지에서 3~4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
더욱 구체적으로는,
유용 유전자가 도입된 OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 10~20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 3~4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
가장 바람직하게는,
유용 유전자가 도입된 OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 유용 유전자는 CuZnSOD(copper zinc superoxide dismutase) 유전자와 APX(ascorbate peroxidase) 유전자의 조합 또는 NDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 목적 조직에 따라 국화의 형질전환 효율은 영향을 받는데, 국화의 마디절편보다는 엽절편의 형질전환 효율이 더 높았다.
본 발명의 방법에서, 목적 조직 처리 상태에 따라 국화의 형질전환 효율은 영향을 받는데, 무처리보다는 침다발 상처 처리의 형질전환 효율이 더 높았다.
본 발명의 방법에서, 아그로박테리움 접종 농도에 따라 국화의 형질전환 효율은 영향을 받는데, OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움 접종 농도일 때, 국화의 형질전환 효율이 가장 높았다.
본 발명의 방법에서, 아세토시린곤 처리 농도에 따라 국화의 형질전환 효율은 영향을 받는데, 아세토시린곤 처리 농도가 20 mg/L일 때, 국화의 형질전환 효율이 가장 높았다.
본 발명의 방법에서, 국화 엽절편을 아세토시린곤이 첨가된 공동배양 배지에서 배양하는 기간에 따라 국화의 형질전환 효율은 영향을 받는데, 공동배양 기간이 4일 때, 국화의 형질전환 효율이 가장 높았다.
일반적으로 외래 유전자 (exogenous DNA)가 다른 세포에 삽입되어 하나의 독립적인 복제가능단위 (replicon)를 형성하거나 혹은 상동성 재조합 (homologous recombination)에 의해 도입된 세포의 게놈 속으로 통합 (integration)되어 계속적인 복제가 가능하고, 유전자 발현이 됨으로써 새로운 형질을 나타내도록 하는 것을 형질전환이라고 한다. 식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽식물뿐만 아니라 단자엽식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
본 발명에 따른 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 아그로박테리움은 Ti 플라스미드 (tumour inducing plasmid)를 포함하고 있는데, 일단 이 세균이 식물 세포와 접촉하면 약 23kb 크기의 T-DNA라고 불리는 단편이 Ti 플라스미드로부터 식물 세포의 식물의 염색체 중 임의의 위치로 통합되어 들어가게 된다. T-DNA가 식물 세포 게놈으로 통합되는 데에는 상기 T-DNA의 양 쪽 끝에 위치한 약 23 bp 크기의 두 개의 경계부위 (left border, right border)가 중요한 역할을 한다. 이러한 성질을 이용하여 Ti 플라스미드에서 T-DNA의 통합에 필수적인 왼쪽 및 오른쪽 경계부위만을 남겨두고 나머지 T-DNA 대신에 목적하는 외래유전자를 대체시켜 형질전환용 재조합 플라스미드를 제작하고, 이를 아그로박테리움에 도입한 후 숙주식물과 아그로박테리움을 공동배양하는 방법으로 식물의 형질전환에 이용한다. 구체적인 방법으로는 T-DNA를 포함하는 상대적으로 작은 크기의 플라스미드와 이의 통합에 필요한 유전자를 발현하는 플라스미드를 함께 이용하는 이원벡터 시스템 (binary vector system) 또는 코인테그레이션 벡터 (cointegration vector)를 이용할 수 있으며, 이 경우 식물 세포 형질전환용 균주로는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 Ti 플라스미드와 유사한 Ri 플라스미드 (root inducing plasmid)를 포함하는 아그로박테리움 라이조게네스 (Agrobacterium rhyzogenes) 등을 사용할 수 있다. 상기와 같이 아그로박테리움을 사용하는 경우에는 재조합 플라스미드로 형질전환된 아그로박테리움과 식물체 절편을 공동 배양함으로써 상처 부위 등을 통해 재조합 플라스미드가 식물 세포로 전이되게 된다.
또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물이다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 바람직하게는 침다발 상처를 낸 엽절편일 수 있다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명에서 형질전환 식물은 전체 식물체뿐만 아니라 그로부터 수득될 수 있는 조직, 세포 또는 종자를 포함할 수 있다.
상기 재분화 선발 배지는 NAA(naphthalene acetic acid), BA(benzyladenine), 수크로스, 한천, 세포탁심(cefotaxim) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는,
CuZnSOD(copper zinc superoxide dismutase) 유전자와 APX(ascorbate peroxidase) 유전자가 도입된 OD600값 0.7의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 바람직하게는
NDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자가 도입된 OD600값 1.0의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 국화는 품종 산토스, 엔칼리, 백선, 백마, 가을아가씨, 옥피리, 천향압천, 화사, 수정, 상조, 송신, 국화동원, 송심, 주천, 국천, 국화대행진, 국화동춘, 일기, 춘심, 천향고성, 청향화불, 국화대자연, 신사조, 국화광제, 부산설, 애국전, 황천, 국화의송, 국화죽림, 여심, 천향애엽, 백공작, 금풍, 국화모정, 우정, 변주, 이백, 계운, 구주, 은세계, 광주, 국화청탁, 녹립, 자기, 대남인, 국화추장, 천향일기, 황호, 복덕, 일성, 흑진주, 남두, 환희, 국화검무, 안의천수각, 국화명월, 금추, 천향일기, 은하, 봉지백설, 세계평화, 보름달, 대방산취, 대방지추, 홍모란, 귀부인, 길야금, 공작, 소화지광, 홍사자 또는 신마일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 신마일 수 있다.
본 발명은 또한,
산화 스트레스 유도성 프로모터와 환경 스트레스 내성 유전자를 포함하는 식물 재조합 발현 벡터가 도입된 OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 10~20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 3~4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성 형질전환 국화의 제조 방법을 제공하며,
바람직하게는,
산화 스트레스 유도성 프로모터와 환경 스트레스 내성 유전자를 포함하는 식물 재조합 발현 벡터가 도입된 OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움을 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
상기 국화 엽절편을 아세토시린곤 20 mg/L이 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 배양하는 단계; 및
상기 배양한 국화 엽절편을 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 복합스트레스 내성 형질전환 국화의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 산화 스트레스 유도성 프로모터는 SWPA2(sweetpotato peroxidase) 프로모터(한국특허등록 제0704751호 참고)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 상기 환경 스트레스 내성 유전자는 CuZnSOD(copper zinc superoxide dismutase) 유전자와 APX(ascorbate peroxidase) 유전자의 조합(한국특허등록 제0704751호 참고) 또는 NDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자(한국특허등록 제0452130호 참고)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 복합스트레스 내성 형질전환 국화 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 형질전환용 유전자
본 발명에서 사용한 형질전환을 위한 발현 벡터는 한국생명공학연구원 곽상수 박사로부터 무상으로 분양받은 SSA와 SN 2종을 이용하였다. SSA 벡터는 산화 스트레스 유도성 SWPA2 프로모터(promoter)를 이용하여 카사바 CuZnSOD와 완두 APX가 동시에 발현되도록 제작되었고, SN 벡터는 산화 스트레스 유도성 SWPA2 프로모터를 이용하여 애기장대 NDPK2가 발현되도록 제작되었다.
실시예 2: 국화의 형질전환 및 형질전환 식물체 선발
국화 '신마’ 품종의 액아를 70% 에탄올에 2분간, 계면활성제(tween-20)가 포함된 2% NaOCl(sodium hypochlorite) 용액에 10분간 교반하여 표면 살균하였으며, 멸균수를 이용 5회 이상 세척하여 사용하였다. 멸균된 여과지에서 어느 정도 물기를 제거한 액아를 MS 기본배지에 치상하여 24±1℃, 3000 Lux 광도하에서 배양하였으며, 기내에서 6-8주 배양한 국화 엽을 취하여 침다발 상처를 낸 후 5×5mm로 절단하여 사용하였다.
카나마이신(kanamycin) 50 mg/L와 리팜피신(rifampicin) 100 mg/L가 첨가된 YEP 고체배지에서 생육하고 있는 아그로박테리움(Agrobacterium)의 단일 군락을 카나마이신 50 mg/L와 리팜피신 100 mg/L가 첨가된 YEP 액체배지에 접종하여 28℃에서 220rpm으로 진탕배양하면서 O.D600 0.7(SSA)과 1(SN)이 되도록 배양하였다. 배양액을 3000rpm에서 10분 원심분리한 후 상등액을 버리고 아세토시린곤(acetosyringone) 20 mg/L이 첨가된 MS 액체배지에 혼합하였다. 침다발 상처를 낸 엽절편체를 절단하여 준비된 배양액에 40분간 접종한 다음 멸균된 필터 페이퍼에 여분의 아그로박테리움을 제거한 후 MS 기본배지로 이식하였다. MS 기본배지에 치상된 엽 절편체는 20℃에서 4일(SSA, SN)간 암배양한 다음, 멸균수로 세척한 후 세포탁심(cefotaxime) 300 mg/L가 첨가된 재분화 배지에 치상하여 3주간 배양한 후 카나마이신 100 mg/L와 세포탁심 300 mg/L가 첨가된 선발 배지에 치상하였다.
상기 과정에서 고효율 형질전환 조건을 구명하기 위하여, 아그로박테리움의 접종 농도를 O.D600 0.5, 0.7 및 1.0으로 하여 공동배양(Co-culture) 기간을 3, 4 및 5일로 나누어 실험을 수행하였다. 선발 항생제인 카나마이신을 50, 100 및 200 mg/L로 나누어 적정 농도를 구명하였다.
목적 조직에 따른 형질전환 효율
구 분 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율(%)
마디절편 300 6 2
엽절편 300 25 8
목적 조직 처리 상태에 따른 형질전환 효율
구 분 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율(%)
무처리 300 12 4
침다발 상처 처리 300 34 11
SSA 벡터가 포함된 아그로박테리움(Agrobacteruim ) 접종 농도에 따른 형질전환 효율
O.D value 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
0.5 178 15 8.4
0.7 145 15 10.3
1.0 183 17 9.2
SN 벡터가 포함된 아그로박테리움(Agrobacteruim ) 접종 농도에 따른 형질전환 효율
O.D value 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
0.5 150 26 17.3
0.7 145 26 17.9
1 180 36 20
SSA 벡터 공동배양 시 아세토시린곤(acetosyringone)처리에 따른 형질전환 효율
아세토시린곤 농도 (mg/L) 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
0 140 23 16.4
20 132 26 19.6
SN 벡터 공동배양 시 아세토시린곤(acetosyringone)처리에 따른 형질전환 효율
아세토시린곤 (mg/L) 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
0 125 12 9.6
20 144 19 13.1
SSA 벡터 공동배양 처리기간에 따른 형질전환 효율
공동배양 기간 (일) 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
3 110 20 18.1
4 128 28 21.8
5 145 28 19.3
SN 벡터 공동배양 처리기간에 따른 형질전환 효율
공동배양 기간 (일) 접종 절편체 (개) PCR 반응 양성 (개) 형질전환율 (%)
3 110 20 18.1
4 128 28 21.8
5 145 28 19.3
SSA 벡터 도입 시 카나마이신(kanamycin) 농도별 1차 선발 신초 재분화 정도
카나마이신 농도 (mg/L) 접종 절편체 (개) 생존 절편체수 (개) 재분화 신초수/절편체 (개)
50 156 145 3
100 185 120 3
200 133 73 2
SN 벡터 도입시 카나마이신(kanamycin) 농도별 1차 선발 신초 재분화 정도
카나마이신 농도 (mg/L) 접종 절편체(개) 생존 절편체수 (개) 재분화 신초수/절편체 (개)
50 154 120 3
100 138 80 3
200 142 70 3
실시예 3: 형질전환된 국화의 유전자 분석
(1) PCR 분석
형질전환체 게놈 내에 유용 유전자가 삽입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환 식물체로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리한 후, 각각의 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다.
SSA 벡터 라인은 프라이머 APX-F(5'-ATG GGA AAA TCT TAC CCA ACT GTT A-5': 서열번호 1)와 APX-R(5'-TTA GGC TTC AGC AAA TCC AAG CTC-3': 서열번호 2)를 이용하였고, SN 벡터 라인은 프라이머 NDPK2-F(5'-GTT GGC CGC ATT TCG TCC TCA-3': 서열번호 3)와 NDPK2-R(5'-CCA CTT GCA TAG CTC GCC CTC TTT-3': 서열번호 4)을 이용하였다.
PCR은 PCR Premix를 사용했고 각 프라이머에 대한 PCR 조건은 초기 변성 온도는 95℃ 5분, 변성 95℃ 1분, 어닐링(annealing) 58℃ 1분, 연장(extention) 72℃ 1분으로 수행하였다. 이때 NDPK2 프라이머의 경우는 어닐링 온도를 62℃로 수행하였다.
(2) RT-PCT 분석
PCR 분석으로 형질전환이 확인된 식물체의 도입 유전자 발현을 조사하기 위하여 150 μM MV(methyl viologen)를 50 ㎖ 처리하고 1일 후에 잎을 샘플링하여 RNA를 분리 RT-PCR 분석을 수행하였다. 상기 방법과 마찬가지로 시간별 도입 유전자 발현을 확인하기 위하여 100 μM MV를 70 ㎖ 처리하고 24, 36 및 48 시간별로 잎을 샘플링하여 RNA를 분리하여 RT-PCR 분석을 수행하였다.
분리한 RNA를 cDNA로 합성한 후 PCR 분석에서 사용했던 프라이머(APX, NDPK2, SOD)을 사용하여 PCR 분석과 동일 조건으로 RT-PCR 분석을 수행하였다. 이때 내부 대조구(internal control)로 18r-RNA를 사용하였고 사용 프라이머는 18r-RNA-F(5'-TTC TTA GTT GGT GGA GCG ATT TGT-3': 서열번호 5) 및 18r-RNA-R(5'-GAC TG TTA TTG CCT CAA ACT TCC-3': 서열번호 6)이다.
실시예 4: 형질전환된 국화의 염 스트레스 내성 검정
PCR 분석 및 RT-PCR 분석을 통하여 형질전환이 확인된 국화에서 환경 스트레스 내성 유전자가 안정적으로 발현되고 있는지를 확인하기 위하여 NaCl이 첨가된 배양병 내에서 염 스트레스 내성을 검정하였다.
MS 기본배지에 0, 250, 500, 1000 mM NaCl을 첨가하여 형질전환체와 비형질전환체를 약 8주 정도 배양하였다. 8주간 배양하면서 식물체들의 경시적 변화를 조사하였다.
염 스트레스 처리 반복구 수는 3반복으로 진행하였다.
농도별 NaCl을 처리한 배지에서 비형질전환체는 형질전환체에 비해 생장이 억제되었으며 갈변도 심하였다. 형질전환체의 손상 정도는 라인 간 약간의 차이가 나타났다.
형질전환 국화 염 스트레스 내성 검정
라인 250mM 500mM 1000mM
대조구 3 5 7
T1 (SN 48) 1 3 3
T2 (SN 87) 1 3 3
T3 (SSA 51) 1 3 5
* 조사기준 : 1. 생육 정상, 잎 증상 없음; 3. 생육 약간 더딤, 하엽 약간 마름; 5. 생육 느림, 엽 변색; 7. 대부분 잎 변색 및 고사 중; 9. 고사
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 산화 스트레스 유도성 프로모터인 SWPA2 프로모터와 유용 유전자인 CuZnSOD(copper zinc superoxide dismutase) 유전자와 APX(ascorbate peroxidase) 유전자의 조합 또는 NDPK2(nucleoside diphosphate kinase 2) 유전자가 도입된 OD600값 0.7~1.0의 아그로박테리움을 신마 국화의 침다발 상처를 낸 엽절편에 접종하는 단계;
    상기 신마 국화 엽절편을 아세토시린곤 20 mg/L가 첨가된 공동배양 배지에서 4일간 배양하는 단계; 및
    상기 배양한 신마 국화 엽절편을 NAA(naphthalene acetic acid), BA(benzyladenine), 수크로스, 한천, 세포탁심(cefotaxim) 및 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 재분화 선발 배지에서 선발하는 단계를 포함하는 신마 국화의 형질전환 효율을 증가시키는 방법.
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