CN103103212B - 一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，包括获得川蔗23号遗传转化所需受体胚性愈伤组织；预培养及预处理胚性愈伤组织；携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备；工程菌液浸染胚性愈伤组织；胚性愈伤组织与农杆菌共培养；抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养；抗性植株PCR检测。在较低浓度的农杆菌液（OD₆₀₀为0.1左右）与较短浸染时间（1.5～2min）并结合各种处理方法成功实现了甘蔗品种川蔗23号的遗传转化。

Description

一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程中对植物进行遗传转化的方法，特别是涉及根癌农杆菌介导植物遗传转化的方法，具体是一种根癌农杆菌介导甘蔗品种川蔗23号遗传转化Bt抗虫基因的方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是重要的糖能经济作物，在世界各地广泛栽植，其产糖量约占世界糖产量的60%～70%，在我国则占到90%以上。甘蔗大田生产的整个生长发育期内均会受到多种虫害威胁，尤以鳞翅目害虫——蔗螟（主要有条螟、二点螟、大螟、白螟、黄螟等）危害最大，以幼虫蛀入甘蔗幼苗和蔗茎，导致甘蔗商品性、糖份等品质下降，并带来每年20%～25%的损失。利用有性杂交技术培育抗虫甘蔗品种是提高甘蔗抗虫能力的重要途径。但是，甘蔗是高度杂合的异源多倍体和多倍的非整倍体植物，遗传背景十分复杂，利用传统育种方法从有性杂交到良种育成要10～13年，周期长成效低。基因工程可以定向改变作物的某些性状，为植物的育种开辟了新途径。

Bt（cry1Ab）基因是从微生物苏云金杆菌分离出的一种杀虫结晶蛋白基因，是一种广谱性的抗虫基因，它指导合成的杀虫结晶蛋白（ICP）。对许多鳞翅目、双翅目及鞘翅目的昆虫均有较强毒性。至1987年首次获得转Bt烟草植株以来，现已在许多植物的遗传转化中得以运用。

甘蔗的遗传转化研究首次报道始于1987年，目前成功培育出转基因甘蔗的转化方法有原生质体电穿孔法、基因枪法和农杆菌介导法等3种。农杆菌介导法简便、易于操作，克服了基因枪法及电击法等直接转化法转化效率低，转化体嵌合体多、转化外植体不易成活及拷贝数多的缺点，因此研究甘蔗农杆菌介导遗传转化对甘蔗遗传工程改良有重要的理论与实践意义。1998年，Arencibia等采用工程菌LBA4404和EHA101成功进行了农杆菌介导的甘蔗遗传转化，平均转化率为0.194%～1.115%，开辟了甘蔗农杆菌介导法转基因研究的先河。同年，Elliott使用工程菌株AGLO进行甘蔗转基因研究，转化效率为5.13%。此后国内外都相继开展了农杆菌介导的甘蔗遗传转化研究。国内有关甘蔗遗传转化的研究较晚，王自章等、罗敬萍等、于兰等、唐建平等先后通过根癌农杆菌介导法成功获得了甘蔗的转基因植株。

出乎预料的是，研究过程中发现按照现有技术中的甘蔗的遗传转化方法对自育甘蔗品种川蔗23号的进行遗传转化，几乎无法实现，而到目前为止还没有见到对特定的川蔗23号进行遗传转化的报道。本领域公知，影响农杆菌遗传转化甘蔗的因素很多，如甘蔗的基因型、受体材料类型、农杆菌株系、菌体浓度、乙酰丁香酮（AS）浓度、浸染时间、共培养时间等。经过长时间的研究发现，对于川蔗23号而言，菌体浓度与浸染时间是影响转化效率的关键因素。在较高菌液浓度与较长浸染时间的条件下可导致受体胚性愈伤组织在筛选培养基上因农杆菌过度增殖而污染死亡，其污染死亡率高达90%以上，从而进一步导致转化无法实现。本发明的方法大大降低了川蔗23号胚性愈伤组织的污染率并成功实现其遗传转化Bt抗虫基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导甘蔗品种川蔗23号遗传转化Bt抗虫基因的方法，可以显著降低川蔗23号胚性愈伤在转基因过程中因农杆菌过度增殖而污染死亡的现象，并成功实现其遗传转化。本发明具体包括如下步骤：

获得川蔗23号遗传转化所需受体胚性愈伤组织；预培养及预处理胚性愈伤组织；携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备；工程菌液浸染胚性愈伤组织；胚性愈伤组织与农杆菌共培养；抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养；抗性植株PCR检测。

所述的胚性愈伤组织是以川蔗23号的幼嫩叶鞘为外植体，经(常规)灭菌后切成幼叶卷(厚度为0.3cm左右)，接种于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养，诱导胚性愈伤组织。胚性愈伤诱导培养基以MS为基本培养基并添加1～2mg·L^-1的2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）与0～50mg·L^-1的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。受体材料以诱导40～50d呈淡黄色、结构疏松、颗粒状、胚性一致的愈伤组织为转化最佳受体。

所述的预培养是将胚性愈伤转入胚性愈伤诱导培养基中，于25℃黑暗培养3～4d。预处理是将胚性愈伤于浸染前在超净工作台风干处理30～45min，至其微微干缩。

所述的工程菌液制备是指挑取携带pCAMBIA1301质粒（以玉米的Ubi-1为启动子）与目的基因Bt（cry1Ab）的农杆菌菌株EHA105（四川省农业科学院生物与核技术研究所提供）单菌落于农杆菌培养基上划线培养，48～72h后刮取长0.5～1.0cm的菌体，悬浮于农杆菌活化培养基内，其OD₆₀₀为0.1左右，再置于28℃，180rpm条件下振荡培养2h，以诱导农杆菌vir基因的活化表达，此菌液即为转化工程菌液。农杆菌培养基以YEP为基本培养基并添加50mg·L^-1的卡那霉素（Kan）、50mg·L^-1的利福平（Rif）和15g·L^-1的琼脂（Agar），农杆菌活化培养基以AAM为基本培养基并添加100～150μm·L^-1的AS（乙酰丁香酮）。

所述的工程菌液浸染是将预处理的胚性愈伤浸没于工程菌液中感染1.5～2min，转到滤纸上吸干多余菌液。

所述的共培养是将浸染的胚性愈伤转入共培养培养基中，于23℃黑暗培养3～4d，待有少量可见农杆菌增殖时为宜。共培养培养基以胚性愈伤诱导培养基并添加100～150μm·L^-1的AS。

所述的筛选培养是指将共培养后的胚性愈伤组织用无菌水清洗至无浑浊后，用含有羧苄青霉素(Car)500mg·L^-1的无菌水浸泡2min，再用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后，接种于抗性胚性愈伤筛选培养基上，25℃黑暗培养15～20d，转入抗性芽筛选培养基上，25℃，2000lx光照强度下培养以诱导芽的形成，当抗性芽长至5cm左右时，转入生根筛选培养基上以筛选抗性完整植株。抗性胚性愈伤筛选培养基为胚性愈伤诱导培养基并添加潮霉素（Hyg）20～30mg·L^-1+Car300～500mg·L^-1，抗性芽筛选培养基以MS为基本培养基并添加6-BA1.0～2.0mg·L^-1+NAA 0.1～0.5mg·L^-1+Hyg 20～30mg·L^-1+Car 300～500mg·L^-1+PVP 0～50mg·L^-1，生根筛选培养基为1/2MS+NAA 1.0～2.0mg·L^-1+Hyg 20～30mg·L^-1+Car 300～500mg·L^-1。

所述的PCR分子检测是根据Bt（Cry1Ab）序列合成反应引物，分别以潮霉素抗性植株的DNA、对照甘蔗植株的DNA及质粒DNA为模板，进行PCR扩增检测。

附图说明

图1为获得的胚性愈伤组织（①为非胚性愈伤；②为致密性白色胚性愈伤；③为淡黄色疏松型胚性愈伤）；

图2为抗性愈伤；

图3为抗性芽；

图4为生根的抗性植株（左为非转化植株，右为转化植株）；

图5为川蔗23号PCR检测结果，其中，M为DNA分子量标准（Maker ⅲ），1为携带有Bt（cry1Ab）基因的pCAMBIA1301质粒PCR扩增结果，2为未转基因的川蔗23号PCR扩增结果，3、5为成功遗传转化的川蔗23号的PCR扩增结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明：

实施例1胚性愈伤的获得

1.选取生长健壮无病虫害的川蔗23号蔗稍，剪去叶片并剥离最外层叶鞘，用洗衣粉搓洗干净，于自来水下冲洗30mi n，擦干于超净工作台上用75%酒精擦洗灭菌，再进行外部叶鞘的剥离，每剥离二层用无水乙醇擦洗，并灼烧其上沾附的酒精，直至茎尖出现，切取距茎尖生长点10cm左右的幼叶组织为外植体，切成厚度为0.3cm左右的幼叶卷，接种于胚性愈伤诱导培养基MS+2,4-D1mg·L^-1，25℃黑暗培养，2周左右继代一次，诱导愈伤组织的发生。诱导的愈伤组织一般有三种形态：①非胚性愈伤，呈黄褐色有黏性；②致密型白色胚性愈伤；③淡黄色结构疏松型胚性愈伤。这诱导初期以前两种愈伤为主，约40d左右即可形成淡黄色分散性较好的愈伤，以此作为受体材料（图1）。

甘蔗外植体极易褐化，在切取外植体的过程中其伤口随即变为褐色，在培养过程中约有15%左右的外植体不能产生愈伤组织，终因褐化而死亡，有些外植体在形成愈伤组织后也极易褐化，研究发现通过添加50mg·L^-1聚乙烯吡咯烷酮（PVP）可有效减轻愈伤组织在培养过程中的褐化。

实施例2抗生素浓度筛选

愈伤组织继代培养阶段：潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10、20、30、40、50mg·L^-1)。选取生长旺盛实施例1制备的淡黄色结构疏松的胚性愈伤组织(直径大小约0.3cm左右)为实验材料，接种在含有潮霉素的胚性愈伤诱导培养基MS+2,4-D1.0mg·L^-1的培养基上，在25℃黑暗条件下培养，每2周转接一次新鲜培养基，每处理10个愈伤，重复3次，30天后统计结果。根据愈伤组织的生长情况确定Hyg的浓度。

不定芽分化培养阶段：潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10、20、30、40、50mg·L^-1)。选取生长旺盛实施例1制备的淡黄色结构疏松的胚性愈伤组织(直径大小约0.3cm左右)为实验材料，接种在含有潮霉素的芽分化培养基MS+6-BA 2.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1培养基上，在28℃，每天14h，2000Lx光照条件下培养，每2周转接一次新鲜培养基，每处理10个愈伤，重复3次，30天后统计结果。根据愈伤组织的分化情况确定Hyg质量浓度。

生根培养阶段：潮霉素(Hyg)设置6个梯度浓度(0、10、20、30、40、50mg·L^-1)。选取生长旺盛、长势一致、株高3cm左右的分化苗，接种在含有潮霉素的生根培养基1/2MS+NAA2.0mg·L^-1上，在28℃，每天14h，2000Lx光照条件下培养，每2周转接一次新鲜培养基，每处理10个愈伤，重复3次，30天后统计结果。根据芽苗发根情况确定生根筛选的Hyg质量浓度。

潮霉素抗性浓度筛选实验表明，随着潮霉素浓度的增加胚性愈伤增殖率、分化率及生根率都逐渐下降。当潮霉素浓达20mg·L^-1时甘蔗胚性愈伤分化率仅为11%，并且分化的不定芽不能伸长，10d后黄化死亡。由于未转化细胞的死亡会影响周围转化细胞的生长，为了保证转化细胞的生长，因此在前期筛选阶段选择较低浓度的潮霉素（20mg·L^-1）。甘蔗小芽对潮霉素的耐受性稍大于胚性愈伤，在10mg·L^-1浓度下其生根率达到100%，只是再生的根与对照相比较少、较纤弱并且颜色为褐色，在20mg·L^-1时其生根率在38.9%，但根较短色泽较深，上部丛芽也会部分黄化，约40d后植株整体死亡。但在30mg·L^-1时，不能生根，并且20d后全部褐化死亡。为了防止假阳性植株的逃逸，因此其生根筛选压以30mg·L^-1为宜。

实施例3工程菌液的制备

挑取携带pCAMBIA1301质粒与目的基因Bt（cry1Ab）的农杆菌菌株EHA105单菌落于农杆菌培养基YEP+Kan50mg·L^-1+Rif 50mg·L^-1+Agar 15g·L^-1上划线培养，48～72h后刮取长0.5～1.0cm的菌体，悬浮于农杆菌活化培养基AAM+AS150μm·L^-1内，其OD600为0.1左右，再置于28℃，180rpm条件下振荡培养2h，以诱导农杆菌vir基因的活化表达，此菌液即为转化工程菌液。

实施例4川蔗23号的遗传转化

将实施例1获得的淡黄色结构疏松的胚性愈伤在新鲜的胚性愈伤诱导培养基MS+2,4-D1mg·L^-1上预培养4d后，置于超净工作台吹风处理45min，至其微微干缩后将其浸没于实施例3所制备的工程菌液中浸染2min，无菌滤纸上吸掉多余水分后于共培养基MS+2,4-D1mg·L^-1+AS150μm·L^-1上，23℃，黑暗培养3d。共培养后将胚性愈伤用无菌水清洗至无浑浊后，用含有羧苄青霉素(Car)500mg·L^-1的无菌水浸泡2min，再用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后，接种于抗性胚性愈伤筛选培养基MS+2,4-D1mg·L^-1+Hyg20mg·L^-1+Car500mg·L^-1上，25℃黑暗培养15～20d，获得抗性愈伤（图2），再将其转入抗性芽筛选培养基MS+6-BA2.0mg·L^-1+NAA0.2mg·L^-1+Hyg20mg·L^-1+Car500mg·L^-1上，25℃，2000lx光照强度下培养以诱导抗性芽（图3），当抗性芽长至5cm左右时，转入生根筛选培养基1/2MS+NAA2.0mg·L^-1Hyg30mg·L^-1+Car300mg·L^-1上，以筛选抗性完整植株（图4）。

在预实验阶段，参照前人的研究方法，设定农杆菌浸染浓度为OD600=0.6，浸染时间为30mi n，但均因在筛选培养阶段农杆菌的过度增殖导致胚性愈伤缺氧而褐化、死亡，未能获得抗性植株。逐渐降低OD600值和浸染时间，因农杆菌而引起的感染有所降低，当OD600=0.1左右浸染时间为2m i n时，在此条件下处理后的甘蔗胚性愈伤在共培养3d后也会有可见的菌体出现，在脱菌中用含有500mg·L^-1Car的无菌水中浸泡2min再转入筛选培养基中即可很好的抑制农杆菌的生长。研究中还发现浸染外植体的大小与胚性愈伤的增殖及分化有很大的影响，外植体过小（直径0.1-0.2cm）极易褐化，外植体过大（直径大于0.5cm）则不利于农杆菌的清洗，直径0.3-0.5cm大小的外植体最适宜。

实施例5转基因植株的PCR检测

根据Bt（Cry1Ab）中间序列合成反应引物5′-TCATCCAGCGAATCTACC-3′和5′-AACAGTGCCCTTACAACC-3′，目的片段大小为823kb（由上海生工合成）。分别以潮霉素抗性植株的DNA、对照甘蔗植株的DNA及质粒DNA为模板，用合成引物，在49℃退火温度下进行PCR扩增检测，对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，获得川蔗23号转基因植株的PCR检测情况如图5所示。结果表明获得了823bp的PCR扩增产物。

1）改良CTAB法提取甘蔗总DNA

①将2×CTAB提取液放入65℃水浴中预热；

②取0.2g材料，加液氮磨成粉，将磨好的材料转入2mL的离心管中，加1mLCTAB提取液，充分混匀，置于65℃水浴45min，期间不断摇动；

③冷至室温，12000rpm，离心5min；

④取上清液，加入500μl饱和酚，以及等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻摇动至溶液成乳化状，12000rpm，离心10mi n；

⑤取上清液，重复步骤（4）两次，不加饱和酚；

⑥取上清液，加入等体积的异丙醇，摇匀，﹣30℃放15mi n；

⑦12000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用70%乙醇500μl洗2～3次，室温干燥沉淀；

⑧用100μl灭菌TE溶解沉淀，加入RNA酶1μl，﹣20℃保存。

⑨取2μl DNA样品在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，与DNA标准比较，估算DNA浓度。

2）PCR反应体系如下：

3）PCR扩增反应程序

94℃预变性5min；94℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸10min。

本发明实施例使用较低浓度的农杆菌液(OD₆₀₀为0.1左右)与较短浸染时间(1.5～2min）并结合各种处理方法成功实现了甘蔗品种“川蔗23号的遗传转化”，本发明浸染后的胚性愈伤不会因农杆菌的过度增殖而污染死亡，共进行了4批次的重复实验，浸染愈伤组织764块，最终获得31个抗性植株（系），经PCR检测后有2株扩增到目的条带，其阳性率为6.45%。

Claims (10)

1.一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）胚性愈伤组织的获取：以川蔗23号的幼嫩叶鞘为外植体，经灭菌后切成幼叶卷，接种于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养，诱导胚性愈伤组织；

（2）胚性愈伤组织的预培养及预处理：将胚性愈伤组织转入胚性愈伤诱导培养基中，于25℃黑暗培养3～4d；然后将胚性愈伤组织于浸染前在超净工作台风干处理30～45min，至其微微干缩；

（3）携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备：挑取携带pCAMBIA1301质粒与目的基因Bt的农杆菌菌株EHA105单菌落于农杆菌培养基上划线培养，48～72h后刮取长0.5～1.0cm的菌体，悬浮于农杆菌活化培养基内，其OD₆₀₀为0.1，再置于28℃，180rpm条件下振荡培养2h，以诱导农杆菌vir基因的活化表达，此菌液即为转化工程菌液；

（4）工程菌液浸染胚性愈伤组织：将预处理的胚性愈伤组织浸没于工程菌液中感染1.5～2min，转到滤纸上吸干多余菌液；

（5）胚性愈伤与农杆菌共培养：将浸染的胚性愈伤组织转入共培养培养基中，于23℃黑暗培养3～4d；

（6）抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养：将共培养后的胚性愈伤组织用无菌水清洗至无浑浊后，用含有羧苄青霉素(Car)500mg·L^-1的无菌水浸泡2min，再用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后，接种于抗性胚性愈伤筛选培养基上，25℃黑暗培养15～20d，转入抗性芽筛选培养基上，25℃，2000lx光照强度下培养以诱导芽的形成，当抗性芽长至5cm左右时，转入生根筛选培养基上以筛选抗性完整植株；

（7）抗性植株PCR检测。

2.如权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述胚性愈伤诱导培养基以MS为基本培养基并添加1～2mg·L^-1的2,4-D与0～50mg·L^-1的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

3.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：步骤（1）诱导培养时间为40～50d，选取淡黄色、结构疏松、颗粒状、胚性一致的愈伤组织进行步骤（2）的操作。

4.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述农杆菌培养基以YEP为基本培养基并添加50mg·L^-1的卡那霉素（Kan）、50mg·L^-1的利福平（Rif）和15g·L^-1的琼脂（Agar），所述农杆菌活化培养基以AAM为基本培养基并添加100～150μm·L^-1的AS。

5.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述共培养培养基以胚性愈伤诱导培养基并添加100～150μm·L^-1的AS。

6.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性胚性愈伤筛选培养基为胚性愈伤诱导培养基并添加潮霉素（Hyg）20～30mg·L^-1+Car300～500mg·L^-1。

7.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性芽筛选培养基以MS为基本培养基并添加6-BA1.0～2.0mg·L^-1+NAA0.1～0.5mg·L^-1+Hyg20～30mg·L^-1+Car300～500mg·L^-1+PVP0～50mg·L^-1。

8.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述生根筛选培养基为1/2MS+NAA1.0～2.0mg·L^-1+Hyg20～30mg·L^-1+Car300～500mg·L^-1。

9.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述的PCR分子检测是根据Bt序列合成反应引物，分别以潮霉素抗性植株的DNA、对照甘蔗植株的DNA及质粒DNA为模板，进行PCR扩增检测。

10.如权利要求9所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述的PCR分子检测是根据Cry1Ab序列合成反应引物，分别以潮霉素抗性植株的DNA、对照甘蔗植株的DNA及质粒DNA为模板，进行PCR扩增检测。