MX2008015742A

MX2008015742A - Metodo de seleccion de celulas transformadas.

Info

Publication number: MX2008015742A
Application number: MX2008015742A
Authority: MX
Inventors: Ronald J Brinker; Paul C C Feng; Yuechun Wan
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2006-06-06
Filing date: 2007-06-05
Publication date: 2008-12-19
Also published as: CA2653742C; WO2007146678A8; USRE44971E1; WO2007146678A1; AU2007257925A1; US7851670B2; AU2007257925B2; CA2653742A1; BRPI0712484B1; ZA200809978B; CN101460626A; EP2024502A1; CN101460626B; BRPI0712484A2; US20080120739A1

Abstract

La invención provee métodos de selección de células transgénicas; la invención se refiere al hallazgo inesperado de que células que expresan un gen que confiere tolerancia a los herbicidas de tipo auxina, tales como dicamba, se pueden seleccionar directamente de las células no transgénicas usando herbicidas de tipo auxina como agente selectivo; de esta manera, se pueden producir directamente plantas que exhiben tolerancia a los herbicidas de tipo auxina sin la necesidad de marcadores seleccionables separados.

Description

METODO DE SELECCION DE CELULAS TRANSFORMADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. 60/811 ,190, presentada el 6 de junio de 2006, cuya descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION En términos generales, la invención se refiere al campo de la biotecnología de plantas. Más específicamente, la invención se refiere a métodos para seleccionar células de planta transformadas usando herbicidas de tipo auxina como un agente selectivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los cultivos transgénicos actualmente se desarrollan en más de 80.0 millones de héctareas en todo el mundo. Los rasgos mejorados provistos por los transgenes han aumentado significativamente la productividad y en muchos casos disminuyen la dependencia en herbicidas e insecticidas que pueden contaminar potencialmente el medio ambiente. Sin embargo, para que los cultivos transgénicos sigan siendo competitivos en el mercado, se requerirán rasgos nuevos de valor agregado. En la producción de plantas transgénicas, un paso particularmente importante es la selección de células transgénicas. Esto es porque típicamente solo un pequeño porcentaje de células son transformadas en cualquier protocolo de transformación dado. El uso de un gen marcador seleccionable permite escoger las células que contienen un gen marcador de entre las que no lo tienen. Al intentar reunir múltiples transgenes en una sola planta, esto se puede hacer particularmente difícil porque se requieren múltiples genes marcadores seleccionabas. Adicionalmente, aunque se han descrito previamente varios marcadores seleccionabas, muchos no confieren un rasgo de un valor agronómico práctico y por lo tanto complican innecesariamente la aprobación regulatoria. Alternativamente, se deben realizar pasos de trabajo intenso para intentar reproducir marcadores seleccionabas de una planta transgénica dada. De esta manera, sería especialmente valioso un gen marcador seleccionable con funciones dobles de un marcador seleccionable y un rasgo. Los genes marcadores seleccionabas usados comúnmente para transformación de planta son los de neomicina fosfotransferasa II, aislada de Tn5 y que confiere resistencia a la kanamicina (Fraley y otros, 1983), e higromicina fosfotransferasa, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Vanden Elzen y otros, 1985). Genes marcadores seleccionabas adicionales de origen bacteriano que confieren resistencia a los antibióticos incluyen los de gentamicina acetiltransferasa, estreptomicina fosfotransferasa, aminoglicósido-3'-adenil-transferasa, y el determinante de resistencia de bleomicina (Hayford y otros, 1988; Jones y otros, 1987; Svab y otros, 1990; Hille y otros, 1986). Están disponibles otros genes marcadores seleccionabas para transformación de planta de origen no bacteriano. Estos genes incluyen, por ejemplo, los de dihidrofolato reductasa de ratón, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa de planta, y acetolactato sintasa de planta (Eichholtz y otros, 1987; Shah y otros, 1986; Charest y otros, 1990). Entre algunos herbicidas a los que los genes marcadores seleccionabas confieren resistencia son glifosato, glufosinato, o bromoxinil (Comai y otros, 1985; Gordon-Kamm y otros, 1990; Stalker y otros, 1988). Los genes que codifican enzimas que desactivan herbicidas y otros compuestos xenofóbicos se han aislado previamente de una variedad de organismos procarióticos y eucarióticos. En algunos casos, estos genes se han construido por ingeniería genética para su expresión exitosa en las plantas. Mediante este enfoque se han desarrollado plantas que son tolerantes a los herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético (Streber y Willmitzer, 1989), bromoxinil (Stalker y otros, 1988), glifosato (Comai y otros, 1985) y fosfinotricina (De Block y otros, 1987). Aunque se ha visto que estas plantas son valiosas en una situación comercial, se requieren plantas tolerantes a otros herbicidas para evitar la dependencia en cualquier herbicida individual y aumentar las opciones para manejar las especies de malezas difíciles de controlar. Además de los herbicidas anteriores, existen los herbicidas de tipo auxina que imitan o actúan de forma similar a los reguladores de crecimiento naturales de las plantas, denominados auxinas. Parece que los herbicidas de tipo auxina afectan la plasticidad de la pared celular y el metabolismo del ácido nucleico, lo que puede descontrolar la división celular y el crecimiento. Los síntomas del daño causado por los herbicidas de tipo auxina incluyen encorvamiento epinástico y retorcimiento de tallos y pecíolos, acopamiento y rizado de hoja, y forma y venación anormales de hoja. El dicamba es un ejemplo de un herbicida de tipo auxina y se usa como un herbicida de preemergencia o postemergencia para el control de malezas perennes de hoja ancha y varias malas hierbas en cultivos de maíz, sorgo, granos pequeños, pastura, heno, terrenos de pastura, caña de azúcar, espárrago, césped y semilla de pasto ("Crop Protection Reference", 1995). Lamentablemente, el dicamba, puede dañar muchos cultivos comerciales, y las plantas dicotiledóneas como soya, algodón, chícharo, papa, girasol y cañóla, son particularmente sensibles al herbicida. A pesar de esto, los herbicidas de tipo auxina son muy efectivos para controlar el crecimiento de la maleza y por lo tanto son una herramienta importante en la agricultura. Esto es remarcado por el desarrollo de malezas tolerantes a otros herbicidas. Recientemente se aisló un gen para dicamba monooxigenasa (DMO) de Pseudomonas maltophilia que confiere tolerancia al dicamba (solicitud de patente de EE. UU. 20030135879). La DMO está implicada en la conversión del herbicida dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico) a un ácido 3,6-diclorosalicílico no tóxico. Este gen provee tolerancia al dicamba en plantas que expresan el gen DMO. Sin embargo, hasta la fecha los transformantes que contienen el gen solo han sido seleccionados usando un gen marcador seleccionable separado y no se han descrito técnicas que permitan el uso de un gen DMO como un marcador seleccionable directo. La necesidad de usar un marcador seleccionable separado complica la producción de plantas tolerantes a herbicidas de tipo auxina, requiriendo un gen adicional en los vectores de transformación usados, que también presenta obstáculos regulatorios. Por lo tanto, existe la necesidad de genes marcadores seleccionabas nuevos y genes de tolerancia a herbicida nuevos. En particular, se requiere un método de selección de células que expresen un gen que confiere tolerancia a dicamba y otros herbicidas de tipo auxina, que puedan ser seleccionadas directamente. Un gen marcador seleccionable con la función doble de marcador y rasgo eliminaría los costos asociados con la preparación y rastreo de dos unidades de expresión durante el desarrollo de un producto, y facilitaría la producción de plantas que tienen rasgos valiosos nuevos.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee un método para seleccionar una célula de planta transformada, que comprende los pasos de: a) poner en contacto una población de células de planta que comprenden una célula de planta transgénica transformada con un polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa, con un medio que comprende herbicidas de tipo auxina en una cantidad que inhibe el crecimiento de las células de la población que carece del polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8, (2) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, (3) una secuencia de ácido nucleico que híbrida con un complemento de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, bajo condiciones de SSC 5X, formamida 50% y 42 °C, (4) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 8; y b) seleccionar la célula de planta transformada de la población de células de planta basándose en la tolerancia exhibida por la célula transformada al herbicida de tipo auxina. La población de células se puede poner en contacto con un medio que comprende un herbicida de tipo auxina, cualquier cantidad de tiempo que permita la selección de la célula transgénica. En algunas modalidades, esto puede comprender por lo menos 1-3 horas, o se puede efectuar indefinidamente, por ejemplo, durante decenas o incluso cientos de días. En una modalidad, el método puede comprender cultivar la población de células de planta en un medio que carece del herbicida de tipo auxina antes del paso a), o entre el paso a) y el paso b). El medio que carece del herbicida de tipo auxina puede contener una citocinina tal como 6- bencilaminopurina (BAP). En modalidades particulares, la 6-bencilaminopurina puede estar a una concentración de aproximadamente 10 mg/l de medio o menos, incluyendo aproximadamente 8, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 1 , y aproximadamente 0.5 mg/l, o menos. En algunas modalidades de la invención, un polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa no está enlazado genéticamente a un gen marcador seleccionable diferente de dicamba monooxigenasa. El polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa se puede enlazar operativamente a un péptido de tránsito de cloroplasto. Un método de la invención también puede comprender el paso de regenerar una planta transgénica de la célula de planta transformada. En algunos aspectos de la invención, la célula de planta transformada es de una planta dicotiledónea o monocotiledónea. Los ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen alfalfa, frijol, brócoli, col, zanahoria, coliflor, algodón, chícharo, colza y soya; y las monocotiledóneas incluyen maíz, cebolla, arroz, sorgo y trigo. En modalidades específicas, la planta es una planta de algodón, soya o cañóla. En algunos aspectos, un herbicida de tipo auxina se selecciona del grupo que consiste en un compuesto de ácido fenoxicarboxílico, un compuesto de ácido benzoico, un compuesto de ácido piridincarboxílico, un compuesto de ácido quinolincarboxílico, y un compuesto de benazolinetilo. En una modalidad, un compuesto de ácido fenoxicarboxílico se selecciona del grupo que consiste en ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 4-(2,4-diclorofenoxi)butírico, y ácido (4-cloro-2-metilfenoxi)acético. En modalidades específicas, un compuesto de ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido 4-(2,4-diclorofenoxi)butírico, o ácido (4-cloro-2-metilfenoxi)acético, está contenido en el medio a una concentración de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, que incluye por ejemplo de aproximadamente 0.01 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 0.01 mg/l a aproximadamente 5 mg/l, de aproximadamente 0.1 mg/l a aproximadamente 5 mg/l, de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 5 mg/l, de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 5 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, y de aproximadamente 0.1 mg/l a aproximadamente 3 mg/l. En otras modalidades, el ácido benzoico es dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico), y está contenido en el medio a una concentración de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, que incluye por ejemplo de aproximadamente 0.01 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 0.01 mg/l a aproximadamente 3 mg/l, de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 0.1 mg/l, de aproximadamente 1 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, de aproximadamente 2 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, y de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 1 mg/l. En modalidades particulares, el medio contiene por lo menos dos herbicidas de tipo auxina, por ejemplo dicamba y ácido 2,4-diclorofenoxiacético. En un método de la invención, la población de células puede comprender un explante de cotiledón y la célula de planta transformada se puede preparar mediante transformación mediada por Agrobacterium. En otro aspecto, la invención provee una célula de planta transgénica que comprende un polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa y es capaz de crecer en un medio que comprende 0.01 mg/l de dicamba, en donde la dicamba monooxigenasa no está enlazada genéticamente a un gen marcador seleccionable, y en donde el polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8, (2) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, (3) una secuencia de ácido nucleico que híbrida con un complemento de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 bajo condiciones de SSC 5X, formamida 50% y 42 °C, (4) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 8. La célula puede ser definida en modalidades particulares como preparada por medio de un método de selección descrito en la presente. La invención también provee un cultivo de tejido que comprende dicha célula. El cultivo de tejido puede comprender la célula en un medio que comprende un herbicida de tipo auxina en una cantidad que inhibe el crecimiento de una célula de planta del mismo genotipo que la célula de planta transgénica, que carece del polinucleótido. Además, la invención provee una planta transgénica regenerada a partir de la célula de planta transgénica.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para mostrar adicionalmente algunos aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas aquí presentadas. Figuras 1A-1C. Respuesta de explantes de soya a dicamba con o sin la adición de BAP. (Figura 1A) En medio sin dicamba (izquierda) o con 0.1 mg/l de dicamba (derecha), 13 DDT. (Figura 1 B) Se inocularon explantes y se cocultivaron con Agrobacterium durante 3 días, y después se cultivaron en medio con 0 mg/l (arriba a la izquierda), 0.1 mg/l (arriba al centro), 0.5 mg/l (arriba a la derecha), 1.0 mg/l (abajo a la izquierda), 5.0 mg/l (abajo al centro) y 10 mg/l (abajo a la derecha) de dicamba, 1 DDT (14 DDI). (Figura 1 C) También se inocularon y se cocultivaron explantes con Agrobacterium durante 3 días, y después se cultivaron en medio con diferentes cantidades de dicamba combinado con BAP; de izquierda a derecha: 0 mg/l, 0.1 mg/l, 1.0 mg/l, y 5.0 mg/l de dicamba; de arriba a abajo: 0 mg/l, 1.0 mg/l, 3.0 mg/l, 5.0 mg/l de BAP. Figura 2. Ejemplos de explantes con botones pequeños (arriba) o sectores (abajo) de GFP+ en el experimento (Exp 508) con selección por dicamba. Las representaciones se tomaron 45 DDI bajo campo brillante regular (izquierda) o luz UV (derecha), para detectar la expresión de GFP.

Figuras 3A-3C. Evento GFP-positivo de la selección por dicamba. (Figura 3A) Vástago pequeño observado 29 DDI bajo microscopio de disección regular. (Figura 3B) El mismo botón mostró la expresión de GFP, observada bajo luz fluorescente para detectar GFP. (Figura 3C) El vástago pequeño de (Figura 3A) y (Figura 3B) se desarrolló formando un vástago alargado resistente (flecha), 48 DDI. Figura 4. Respuesta de explantes cultivados en medio que contenía 0.01 mg/l (izquierda), 0.02 mg/l (centro) y 0.05 mg/l de dicamba 23 DDT (29 DDI). Figuras 5A-5B. Vastagos resistentes separados que se cultivaron en el medio de enraizado liquido con cuentas de vidrio pequeñas (Figura 5A) como material de soporte y casi todos los vastagos pudieron producir raíces. (Figura 5B) También se puede usar medio semisólido para la inducción de raíz. Figuras 6A-6D. (Figura 6A) Flores de soya jóvenes de una planta transgénica con el gen CP4 y GUS (arriba), y una planta transformada con pMON73691 mediante selección por dicamba y que también lleva un gen GFP (abajo). (Figura 6B) Las dos mismas flores observadas bajo un microscopio de disección equipado con luz fluorescente para detectar la expresión de GFP; la expresión de GFP se observó en la flor transformada con pMON73691 , que contiene los genes DMO y GFP. (Figura 6C y Figura 6D) La misma flor transformada con pMON73691 se abrió para mostrar la expresión de GFP en varias estructuras florales.

Figuras 7A-7D. Explantes de soya cultivados en medio de selección que contenia 0.01 mg/l dicamba, después de ser inoculados con Agrobacterium que aloja diferentes construcciones que contienen diferentes versiones del gen DMO, manejado con CTPs diferentes. (Figura 7A) pMON73696, DMO-w, con CTP1. (Figura 7B y Figura 7D) pMON73698, DMO-c, con CTP1. (Figura 7C) pMON73691 , DMO-c, con CTP2. Las imágenes se tomaron 39 DDI (Figura 7A y 7B) y 54 DDI (Figura 7C y 7D), respectivamente. Los vástagos resistentes se muestran con flecha en las figuras 7A y 7C. Figura 8. Muestra la susceptibilidad de Arabidopsis de tipo silvestre a varias concentraciones de dicamba en medio de cultivo. Figura 9. Muestra la recuperación de plantas de Arabidopsis tolerantes a dicamba transformadas con un polinucleótido que codifica DMO.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un aspecto, la invención provee métodos para la selección de células transformadas con herbicidas de tipo auxina tales como dicamba. La invención supera las deficiencias de la técnica anterior, en que se requería previamente el acoplamiento de un gen que confiere tolerancia a herbicidas de tipo auxina con un gen marcador seleccionable separado para recuperar los transformantes. La selección directa elimina la necesidad de genes marcadores seleccionables ajenos, que pueden complicar los procedimientos de transformación y la aprobación regulatoria subsiguiente de las plantas transgénicas. La selección eficiente de células transgénicas es crucial porque normalmente solo un número pequeño de células son transformadas en un protocolo de transformación. Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo se pueden cultivar entonces en un medio que sostiene la regeneración de plantas para producir plantas transgénicas. En particular, usando un ácido nucleico que codifica dicamba monooxigenasa (DMO), la invención permite la selección y creación de plantas transgénicas que exhiben tolerancia a los herbicidas de tipo auxina, que se pueden aplicar a los campos que contienen plantas tolerantes a herbicida para un control de malezas eficaz. La selección de células transformadas de acuerdo con la invención se puede efectuar, por ejemplo, introduciendo primero una molécula de polinucleótido que codifica DMO en un tejido de planta objetivo seleccionado; poner en contacto las células que contienen la célula de planta transformada con un medio que contiene un herbicida de tipo auxina, en una cantidad que inhibe el crecimiento de las células de planta del mismo genotipo que la célula de planta transformada pero que no contienen el polinucleótido que codifica DMO, y seleccionar una célula de planta capaz de crecer en el medio. De esta manera, se puede seleccionar una célula transgénica de una población grande de células no transgénicas. En una modalidad ejemplar, el medio selectivo se puede modificar incluyendo sustancias adicionales tales como reguladores de crecimiento. El tejido se puede mantener en un medio básico con reguladores de crecimiento hasta que esté disponible suficiente tejido para empezar los esfuerzos de regeneración de planta, o después de rondas repetidas de selección manual, hasta que la morfología del tejido sea adecuada para la regeneración, normalmente por lo menos dos semanas; entonces se transfiere a un medio conducente para su maduración en plantas. Los cultivos se pueden transferir cada 2 semanas en este medio. El desarrollo de vástago señalará el momento de transferirlo a un medio que carece de reguladores de crecimiento. Muchos tejidos de planta son susceptibles de transformación. En algunas modalidades la célula de planta se origina de un explante de planta, que se refiere a una parte cortada de una planta que es susceptible de ser transformada y subsiguientemente regenerada a una planta transgénica. Los explantes típicos incluyen suspensiones celulares, meristemas, embriones maduros o inmaduros, embriones secos, embriones húmedos, embriones desecados, semillas, callos, cotiledones, nudos cotiledonarios, hojas, o tallos. Una vez que se ha seleccionado una célula transgénica y se han desarrollado tejidos a partir de la misma, la presencia del ADN exógeno o "transgen" en el tejido o plantas regenerados puede ser confirmada usando una variedad de pruebas. Dichas pruebas incluyen por ejemplo pruebas de "biología molecular", tales como Southern y Northern blotting y PCR™¡ pruebas "bioquímicas", tales como detección de la presencia de un producto de proteína, por ejemplo por medios inmunológicos (ELISAs y Western blots), o mediante función enzimática; pruebas de partes de plantas, tales como las pruebas de hoja o raíz; y también analizando el fenotipo de la planta regenerada completa.

A. Acidos nucleicos y construcciones recombinantes 1. Dicamba monooxiqenasa (DMO) En una modalidad de la presente invención, se usa una construcción de ADN que expresa un polipéptido de dicamba monooxigenasa (DMO) como un gen marcador seleccionable en células de planta. Se proveen aquí polipéptidos DMO ejemplares como las SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 o 12. Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican estas secuencias se proveen como las SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, u 11. De esta manera, en una modalidad de la invención, estas secuencias se usan para la selección de células transformadas. Como es muy conocido, de estas secuencias se pueden preparar y utilizar fácilmente secuencias homologas y derivados. Por ejemplo, se puede usar un ácido nucleico que codifica un polipéptido DMO que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con un polipéptido provisto como SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 o 12, incluyendo por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con dichas secuencias. También se puede usar un ácido nucleico que exhibe por lo menos 70% de identidad de secuencia con una secuencia de ácido nucleico provista como SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9, u 11 , que incluye por lo menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o más de identidad con dichas secuencias. En una modalidad, la identidad se determina usando el paquete de software de Análisis de Secuencia GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, California), MEGAlign (DNAStar, Inc., 1228 S. Park St., Madison, Wisconsin 53715), con los parámetros por omisión. Dicho software iguala secuencias similares asignando grados de similitud o identidad. Una molécula de polinucleótido que expresa un polipéptido DMO se puede obtener mediante técnicas muy conocidas. Las variantes de DMOs que tienen capacidad para degradar herbicidas de tipo auxina se pueden preparar y analizar fácilmente para determinar su actividad de acuerdo con los métodos estándares. También, tales secuencias se pueden identificar mediante las técnicas conocidas, por ejemplo partiendo de organismos adecuados que incluyen bacterias que degradan herbicidas de tipo auxina, tales como dicamba (patente de EE. UU. No. 5,445,962; Krueger y otros, 1989; Cork y Krueger, 1991 ; Cork y Khalil, 1995). Un medio para aislar una secuencia de DMO es mediante la hibridación del ácido nucleico, por ejemplo, con una colección construida de un organismo fuente, o mediante RT-PCR usando ARNm del organismo fuente e iniciadores basados en el DMO descrito. Por lo tanto, la invención abarca el uso de ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones severas con una secuencia que codifica DMO descrita en la presente. El experto en la materia comprende que las condiciones se pueden hacer menos severas aumentando la concentración de sal y disminuyendo la temperatura. De esta manera, las condiciones de hibridación se pueden manipular fácilmente, y por lo tanto serán en general un método elegido dependiendo de los resultados deseados. Un ejemplo de condiciones de alta severidad es SSC 5X, formamida 50% y 42 °C. Efectuando un lavado bajo dichas condiciones, por ejemplo durante 10 minutos, las secuencias que no hibridan con una secuencia objetivo particular bajo estas condiciones, pueden ser removidas. Una modalidad de la invención comprende así el uso de un ácido nucleico que codifica DMO, que es definido porque híbrida bajo condiciones de lavado de SSC 5X, formamida 50% y 42 °C durante 10 minutos, con un ácido nucleico seleccionado de SEQ ID NOs: 1 , 3, 5, 7, 9, u 1 1. La SEQ ID NO: 1 muestra DMO de Pseudomonas maltophilia optimizado para su expresión en dicotiledóneas empleando el uso de codón de Arabidopsis thaliana. El polipéptido, que se predice que tiene Ala, Thr, Cys en las posiciones 2, 3, 1 12, respectivamente, se da en SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 3 muestra otro DMO de Pseudomonas maltophilia optimizado para su expresión en dicotiledóneas y que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 4, que se predice que tiene Leu, Thr, Cys en las posiciones 2, 3, 1 12, respectivamente. La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia codificadora y SEQ ID NO: 6 el polipéptido para DMO optimizado para dicotiledónea, que se predice que tiene Leu, Thr, Trp en las posiciones 2, 3, 112, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 7 y 8 muestran las secuencias codificadoras y de polipéptido para DMO, que se predice que tiene Ala, Thr, Cys en la posición 2, 3, 112, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 9 y 10 muestran la secuencia codificadora optimizada para dicotiledónea y las secuencias de polipéptido para DMO que se predice que tienen Ala, Thr, Trp en las posiciones 2, 3, 112, respectivamente. Las SEQ ID NOs: 11 y 12 muestran la secuencia codificadora y la secuencia de polipéptido para DMO de Pseudomonas maltophilia (solicitud de patente de EE. UU. No: 20030135879). Las variantes también se pueden sintetizar químicamente de acuerdo con las técnicas conocidas usando las secuencias de polinucleótido de DMO conocidas. Por ejemplo, se pueden sintetizar secuencias de ADN mediante química de fosfoamidita en un sintetizador automático de ADN. La síntesis química tiene varias ventajas. En particular, la síntesis química es deseable porque los codones preferidos por el hospedero en el cual se expresará la secuencia de ADN, se pueden usar para optimizar la expresión. No es necesario alterar todos los codones para mejorar la expresión, pero preferiblemente se cambian a codones preferidos por el hospedero por lo menos los codones usados raramente en el hospedero. Se puede obtener un alto grado de expresión cambiando más de cerca de 50%, de preferencia por lo menos aproximadamente 80% de los codones, a codones preferidos por el hospedero. Las preferencias de codón de muchas células hospederas son conocidas (PCT WO 97/311 15; PCT WO 97/1 1086; EP 646643; EP 553494; y patentes de EE. UU. Nos. 5,689,052; 5,567,862; 5,567,600; 5,552,299; y 5,017,692). Las preferencias de codón de otras células hospederas pueden ser deducidas por medio de los métodos conocidos. También se puede cambiar fácilmente la secuencia de la molécula de ADN o su proteína codificada usando síntesis química, por ejemplo para optimizar la expresión (por ejemplo, para eliminar estructuras secundarias de ARNm que afectan la transcripción o traducción), añadir sitios únicos de restricción en puntos convenientes, y suprimir sitios de corte de proteasa. Se pueden hacer modificaciones y cambios a la secuencia de polipéptido de una proteína, tal como las secuencias de DMO aquí provistas, reteniendo aún la actividad enzimática. La siguiente es una discusión basada en el cambio de los aminoácidos de una proteina para crear un polipéptido modificado equivalente, o incluso mejorado, y las secuencias codificadoras correspondientes. En modalidades particulares de la invención, las secuencias de DMO se pueden alterar de esta manera y utilizarse en los métodos de la invención. Los cambios de aminoácidos se pueden hacer cambiando los codones de la secuencia de ADN. Se sabe por ejemplo que algunos aminoácidos pueden sustituir a otros aminoácidos en una estructura de proteína sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como los sitios de unión sobre las moléculas substratos. Puesto que la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína son las que definen la actividad funcional biológica de esa proteína, se pueden hacer algunas sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína, y desde luego en la secuencia codificadora del ADN fundamental, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Así, se contempla que se pueden hacer varios cambios en las secuencias de péptido de DMO aquí descritas y las secuencias codificadoras de ADN correspondientes, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Para hacer dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína es entendida generalmente en la técnica (Kyte y otros, 1982). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, etcétera. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y características de carga (Kyte y otros, 1982); éstos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Se sabe que los aminoácidos pueden ser sustituidos con otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar y resultar todavía en una proteína con actividad biológica similar, es decir, obteniendo todavía una proteína biológica funcionalmente equivalente. Al hacer dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, siendo particularmente preferido que estén dentro de ±1 , y de preferencia dentro de ±0.5. También se entiende que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer eficientemente basándose en la hidrofilicidad. La patente de EE. UU. 4,554,101 , afirma que la hidrofilicidad promedio local más grande de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se detalla en la patente de EE. UU. 4,554,101 , se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1); glutamato (+3.0 ± 1); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0. 5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptófano (-3.4). Se entiende que un aminoácido puede sustituir a otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y obtener aún una proteína biológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, siendo particularmente preferido que estén dentro de ±1 , y de preferencia dentro de ±0.5. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración estas y varias de las características anteriores son muy conocidas para el experto en la materia e incluyen: arginina y glicina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. 2. Construcciones de transformación Un polinucleótido codificador de DMO usado de acuerdo con la invención como un marcador seleccionable, típicamente será introducido en una célula como una construcción que comprende los elementos de control de expresión necesarios para la expresión eficiente de DMO. Los métodos para enlazar operativamente los elementos de control de expresión a las secuencias codificadoras son muy conocidos (Maniatis y otros, 1982; Sambrook y otros, 1989). Las secuencias de control de expresión son secuencias de ADN implicadas de alguna manera en el control de la transcripción. Las secuencias de control de expresión adecuadas y los métodos de uso de las mismas son muy conocidos. Se puede usar un promotor en particular, con o sin elementos incrementadores, región 5' no traducida, péptidos de tránsito o señal para dirigir una proteína o producto de ARN a un organelo de una planta, particularmente a un cloroplasto, y regiones 3' no traducidas, tales como sitios de poliadenilación. El experto en la materia conocerá que varios incrementadores, promotores, intrones, péptidos de tránsito, secuencias de señal de dirección, y regiones 5' y 3' no traducidas (UTRs), son útiles en el diseño de vectores de expresión de planta eficaces, tales como los que se describen por ejemplo en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. 2003/01403641. Los promotores adecuados para los usos actuales y otros usos son muy conocidos. Los ejemplos que describen dichos promotores incluyen la patente de EE. UU. 6,437,217 (promotor de maíz RS81), patente de EE. UU. 5,641 ,876 (promotor de actina de arroz), patente de EE. UU. 6,426,446 (promotor de maíz RS324), patente de EE. UU. 6,429,362 (promotor de maíz PR-1), patente de EE. UU. 6,232,526 (promotor de maíz A3), patente de EE.

UU. 6,177,61 1 (promotores constitutivos de maíz), patentes de EE. UU. 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 y 5,530,196 (promotor 35S), patente de EE. UU. 6,433,252 (promotor de oleosina L3 de maíz), patente de EE. UU. 6,429,357 (promotor de actina de arroz 2, y también un intrón de actina de arroz 2), patente de EE. UU. 5,837,848 (promotor específico de raíz), patente de EE. UU. 6,294,714 (promotores inducibles por luz), patente de EE. UU. No. 6,140,078 (promotores inducibles por sal), patente de EE. UU. No. 6,252,138 (promotores inducibles por patógeno), patente de EE. UU. No. 6,175,060 (promotores inducibles de deficiencia de fósforo), patente de EE. UU. No. 6,635,806 (promotor de gamma-coixin), y solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 09/757,089 (promotor de aldolasa de cloroplasto de maíz). Promotores adicionales que se pueden usar son un promotor de nopalina sintasa (NOS) (Ebert y otros, 1987), el promotor de octopina sintasa (OCS) (que es llevado en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores de caulimovirus tales como el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Lawton y otros, 1987), el promotor 35S de CaMV (Odell y otros, 1985), el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (Walker y otros, 1987), el promotor de sacarosa sintasa (Yang y otros, 1990), el promotor del complejo del gen R (Chandler y otros, 1989), y el promotor del gen de proteína de unión de clorofila a/b, etcétera. Los promotores particularmente benéficos para usarse con la presente invención son los promotores CaMV35S, FMV35S, PCISV, AtAntl y P-AGRtu.nos (véase también el cuadro 1).

Se puede obtener un beneficio para la expresión de genes heterólogos usando una secuencia que codifica un péptido de tránsito. Los péptidos de tránsito se refieren generalmente a moléculas de péptido que cuando están enlazadas a una proteína de interés dirigen la proteína a un tejido, célula, sitio subcelular u organelo celular en particular. Los ejemplos incluyen, sin limitación, péptidos de tránsito de cloroplasto, señales de dirección nuclear y señales vacuolares. Un péptido de tránsito de cloroplasto es de utilidad particular en la presente invención para dirigir la expresión de una enzima DMO a los cloroplastos. Se anticipa que la función de DMO será facilitada por reductasas endógenas y ferredoxinas, encontradas en células de planta para degradar dicamba. Los cloroplastos de planta son particularmente ricos en reductasas y ferredoxinas. Por consiguiente, en una modalidad preferida, para la producción de plantas transgénicas tolerantes a dicamba se puede usar una secuencia que codifica un péptido que dirigirá la oxigenasa de degradación de dicamba a los cloroplastos. Alternativa o adicionalmente, también se puede expresar en una célula una reductasa o ferredoxina heteróloga. El ADN que codifica una secuencia de dirección de cloroplasto se puede colocar preferiblemente en dirección 5' de una secuencia que codifica DMO, pero también se puede colocar en dirección 3' de la secuencia codificadora, o tanto en dirección 5' como 3' de la secuencia codificadora. Un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP), en particular, se puede construir por ingeniería para ser fusionado en el extremo N de las proteínas que se van a dirigir al cloroplasto vegetal. Muchas proteínas localizadas en cloropiastos son expresadas en genes nucleares como precursores y son dirigidas al cloroplasto por un CTP que es removido durante los pasos de importación. Los CTPs útiles pueden ser identificados de la secuencia primaria de aminoácidos de dichos polipéptidos. Los ejemplos de proteínas de cloroplasto incluyen la subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5,-bisfosfato carboxilasa (RbcS2), ferredoxin, ferredoxin oxidorreductasa, el complejo de alojamiento ligero de proteína I y proteína II, y tiorredoxina F. Se ha mostrado in vivo e in vitro que proteínas que no son de cloroplasto pueden ser dirigidas al cloroplasto usando fusiones de proteína con un CTP, y que un CTP es suficiente para dirigir una proteína al cloroplasto. Por ejemplo, se ha mostrado que la incorporación de un péptidb de tránsito de cloroplasto adecuado, tal como el CTP EPSPS de Arabidopsis thaliana (Klee y otros, 1987), y el CTP EPSPS de Petunia hybrida (della-Cioppa y otros, 1986), dirigen secuencias de proteína EPSPS heterólogas a los cloropiastos en plantas transgénicas. Otras secuencias de dirección de cloroplasto ejemplares incluyen la secuencia de señal cab-m7 de maíz (Becker y otros, 1992; PCT WO 97/41228), y la secuencia de señal de glutatión reductasa de chícharo (Creissen y otros, 1991 ; PCT WO 97/41228). En la presente invención, AtRbcS4 (CTP1), AtShkG (CTP2), AtShkGZm (CTP2 sintético), y PsRbcS, y también otros, descritos en la solicitud provisional de EE. UU. No. de serie 60/891 ,675, en particular, pueden ser de beneficio, por ejemplo con respecto a la expresión de un polipéptido DMO (por ejemplo, SEQ ID NOs: 17-28 para las secuencias de péptido de CTPs y secuencias de ácido nucleico que las codifican). Una 5' UTR que funciona como una secuencia guía de traducción es un elemento genético de ADN localizado entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia codificadora. La secuencia guía de traducción está presente en el ARNm completamente procesado en dirección 5' de la secuencia de inicio de traducción. La secuencia guía de traducción puede afectar el procesamiento del transcrito primario a ARNm, la estabilidad del ARNm, o la eficiencia de la traducción. Los ejemplos de secuencias guías de traducción incluyen las guías de proteína de choque de calor de maíz y petunia (patente de EE. UU. No. 5,362,865), guías de proteína de envoltura de virus de planta, guías rubisco de planta, entre otras (Turner y Foster, 1995). En la presente invención, las 5' UTRs que pueden tener beneficio particular son GmHsp, PhDnaK, AtAntl , TEV, y L-Atnos (véase también el cuadro 1). La secuencia 3' no traducida, la región de terminación de transcripción 3', o la región de poliadenilación, significa una molécula de ADN enlazada a, y localizada en dirección 3' de, una molécula de polinucleótido estructural, e incluye polinucleótidos que proveen la señal de poliadenilación y otras señales reguladoras capaces de afectar la transcripción, el procesamiento de ARNm o la expresión del gen. La señal de poliadenilación funciona en las plantas para causar la adición de nucleótidos de poliadenilato al extremo 3' del ARNm precursor. La secuencia de poliadenilación se puede derivar del gen natural, de una variedad de genes de planta, o de genes de ADN-T. Un ejemplo de una región de terminación de transcripción 3' es la región 3' de nopalina sintasa (nos 3'; Fraley y otros, 1983). Se ejemplifica el uso de diferentes regiones 3" no traducidas (Ingelbrecht y otros, 1989). En particular, para usarse con la invención pueden ser de beneficio las moléculas de poliadenilación del gen RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi y otros, 1984) y T-AGRtu.nos (Rojiyaa y otros, 1987, Registro del Genbank E01312). Una unidad de expresión de molécula de polinucleótido que codifica DMO se puede enlazar a una segunda molécula de polinucleótido en una unidad de expresión que contiene elementos genéticos para un marcador seleccionable/calificable, o para un gen que confiere un rasgo deseado. Los genes usados comúnmente para seleccionar las células presuntamente transformadas incluyen ß-glucuronidasa (GUS), ß-galactosidasa, luciferasa y cloranfenicol acetiltransferasa (Jefferson, 1987; Teeri y otros, 1989; Koncz y otros, 1987; De Block y otros, 1984), proteína fluorescente verde (GFP) (Chalfie y otros, 1994; Haseloff y otros, 1995; y solicitud de PCT WO 97/41228). En los ejemplos de trabajo se usó una AvGFP interrumpida por StLS1 para lograr la expresión únicamente en células de planta (véase también el cuadro 1). La segunda molécula de polinucleótido incluye, sin limitación, un gen que provee una característica deseable asociada con la morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo, rendimiento, mejoramiento nutricional, resistencia a enfermedad o plaga, o tolerancia ambiental o química de la planta, y puede incluir elementos genéticos que comprenden resistencia a herbicida (patentes de EE. UU. 6,803,501 ; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 5,463,175), incremento de rendimiento (patentes de EE. UU. RE38.446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441 ,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,21 1 ; 6,235,971 ; 6,222,098; 5,716,837), control de insectos (patentes de EE. UU. 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521 ,442; 6,501 ,009; 6,468,523; 6,326,351 ; 6,313,378; 6,284,949; 6,281 ,016; 6,248,536; 6,242,241 ; 6,221 ,649; 6, 177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6, 1 10,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091 ; 5,942,664; 5,942,658, 5,880,275; 5,763,245; 5,763,241 ), resistencia a enfermedad por hongos (patentes de EE. UU. 6,653,280; 6,573,361 ; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671 ; 5,773,696; 6,121 ,436; 6,316,407; 6,506,962), resistencia a los virus (patentes de EE. UU. 6,617,496; 6,608,241 ; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 5,304,730), resistencia a los nemátodos (patente de EE. UU. 6,228,992), resistencia a las enfermedades bacterianas (patente de EE. UU. 5,516,671), crecimiento y desarrollo de la planta (patentes de EE. UU. 6,723,897; 6,518,488), producción de almidón (patentes de EE. UU. 6,538, 181 ; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), producción de aceites modificados (patentes de EE. UU. 6,444,876; 6,426,447; 6,380,462), producción alta de aceites (patentes de EE. UU. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 6,476,295), contenido de ácido graso modificado (patentes de EE. UU. 6,828,475; 6,822,141 ; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461 ; 6,459,018), alta producción de proteína (patente de EE. UU. 6,380,466), maduración de frutos (patente de EE. UU. 5,512,466), mejoramiento de nutrición animal y humana (patentes de EE. UU. 6,723,837; 6,653,530; 6,541 ,259; 5,985,605; 6,171 ,640), biopolímeros (patentes de EE. UU. RE37.543; 6,228,623; 5,958,745 y publicación de patente de EE. UU. No. US20030028917), resistencia a estrés ambiental (patente de EE. UU. 6,072,103), péptidos farmacéuticos y péptidos secretables (patentes de EE. UU. 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 6,080,560), mejoramiento de rasgos de procesamiento (patente de EE. UU. 6,476,295), mejoramiento de digestibilidad (patente de EE. UU. 6,531 ,648), bajo contenido de rafinosa (patente de EE. UU. 6,166,292), producción de enzima industrial (patente de EE. UU. 5,543,576), mejoramiento de sabor (patente de EE. UU. 6,011 ,199), fijación de nitrógeno (patente de EE. UU. 5,229,114), producción de semilla híbrida (patente de EE. UU. 5,689,041), producción de fibra (patentes de EE. UU. 6,576,818; 6,271 ,443; 5,981 ,834; 5,869,720), y producción de biocombustible (patente de EE. UU. 5,998,700). Cualquiera de estos u otros elementos genéticos, métodos y transgenes, se pueden usar con la invención como será apreciado por el experto en la materia en vista de la presente descripción. Alternativamente, la segunda molécula de polinucleótido puede afectar la característica o fenotipo de la planta mencionado anteriormente, codificando una molécula de ARN que ocasiona la inhibición dirigida de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo mediante mecanismos de antisentido, ARN inhibitorio (ARNi), o mecanismos mediados por cosupresión.

El ARN también puede ser una molécula de ARN catalítica (es decir, un ribozima) construido por ingeniería para cortar un producto deseado de ARNm endógeno. De esta manera, en la práctica de la presente invención puede ser útil cualquier molécula de polinucléotido que codifica una molécula de ARN transcrito que afecta un fenotipo o cambio de morfología de interés. Se pueden proveer unidades de expresión sobre ADN-T's entre regiones del borde derecho (RB) y del borde izquierdo (LB) de un primer plásmido, junto con un segundo plásmido que lleva funciones de transferencia e integración de ADN-T en Agrobacterium. Las construcciones también pueden contener segmentos de ADN de esqueleto de plásmido que proveen una función de duplicación y selección de antibiótico en células bacterianas, por ejemplo un origen de duplicación de Escheríchia coli, tal como ori322, un origen de duplicación de amplia gama de hospederos tal como oriV u oriRi, y una región codificadora para un marcador seleccionable tal como Spec/Strp, que codifica aminoglicósido adeniltransferasa (aadA) Tn7 que confiere resistencia a la espectinomicina o estreptomicina, o un gen marcador seleccionable de gentamicina (Gm, Gent). Para transformación de planta, la cepa bacteriana hospedera es frecuentemente Agrobacterium tumefaciens ABI, C58, o LBA4404. Sin embargo, pueden funcionar en la presente invención otras cepas conocidas para el experto en el campo de la transformación de plantas. 3. Preparación de células transgénicas La transformación de células de planta se puede lograr mediante cualquier técnica conocida para la introducción de transgenes a las células, (véase por ejemplo Miki y otros, 1993). Se considera que los ejemplos de dichos métodos incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual se pueda introducir ADN a una célula. Los métodos que se han descrito incluyen electroporación, como se ilustra en la patente de EE. UU. No. 5,384,253; bombardeo de microproyectil, como se ilustra en las patentes de EE. UU. Nos. 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861 ; y 6,403,865; transformación mediada por Agrobacterium, como se ilustra en las patentes de EE. UU. Nos. 5,635,055; 5,824,877; 5,591 ,616; 5,981 ,840; y 6,384,301 ; y transformación de protoplasto como se ilustra en la patente de EE. UU. No. 5,508,184. Mediante la aplicación de técnicas tales como estas, las células de virtualmente cualquier especie de planta pueden ser transformadas establemente y seleccionadas de acuerdo con la invención, y estas células se desarrollan hasta formar plantas transgénicas. El método utilizado más ampliamente para introducir un vector de expresión en las plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium (por ejemplo, Horsch y otros, 1985). A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias del suelo patógenas para las plantas que transforman genéticamente las células de las plantas. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, llevan genes responsables de la transformación genética de la planta (por ejemplo, Kado, 1991 ). Muchas referencias proveen descripciones de sistemas de vector de Agrobacterium y métodos de transferencia de gen mediada por Agrobacterium, que incluyen Gruber y otros, arriba; Miki y otros, arriba; Moloney y otros, 1989, y patentes de EE. UU. Nos. 4,940,838 y 5,464,763. Otras bacterias tales como Sinorhizobium, Rhizobium, y Mesorhizobium que interaccionan con las plantas de forma natural, pueden ser modificadas para mediar la transferencia de genes a varias plantas. Estas bacterias simbióticas asociadas con plantas se pueden hacer competentes para la transferencia de genes por adquisición de un plásmido Ti desarmado y un vector binario adecuado (por ejemplo, Broothaerts y otros, 2005; solicitud de patente de EE. UU. 1 1/749,583).

B. Cultivos de tejido y medios De acuerdo con la invención, se pueden seleccionar células transgénicas usando medios que contienen una cantidad de un herbicida de tipo auxina que inhibe el crecimiento de una célula que carece de la expresión de un polipéptido DMO. "Medio" se refiere a las muchas mezclas de nutrientes que se usan para desarrollar células in vitro, esto es, fuera del organismo vivo intacto. Usualmente el medio es una suspensión de varias categorías de ingredientes (sales, aminoácidos, reguladores de crecimiento, azúcares, amortiguadores), que se requieren para el crecimiento de la mayoría de los tipos de células. Sin embargo, cada tipo específico de célula requiere una escala específica de proporciones de ingredientes para su crecimiento, y una escala aún más específica de fórmulas para crecimiento óptimo. La velocidad de crecimiento celular también varía entre los cultivos iniciados con el arreglo de medio que permite el crecimiento de este tipo de célula. La regeneración de una célula de planta transformada se puede lograr cultivando primero el explante sobre un medio para fomentar vástagos y subsiguientemente sobre un medio para fomentar raíces. De acuerdo con la invención, generalmente estos medios incluyen un herbicida de tipo auxina, tal como dicamba, como el agente de selección, además de los nutrientes y los reguladores de crecimiento. Se pueden poner en práctica una variedad de medios y requerimientos de transferencia, que se pueden optimizar para cada sistema de planta para la transformación de la planta y la recuperación de las plantas transgénicas. Consecuentemente, dichos medios y condiciones de cultivo descritos en la presente invención se pueden modificar o sustituir con componentes nutricionalmente equivalentes, o procesos similares para selección y recuperación de los eventos transgénicos, y están todavía dentro del alcance de la presente invención. Los medios nutrientes se preparan como un líquido, pero este se puede solidificar agregando al líquido materiales capaces de proveer un soporte sólido. El agar es usado más comúnmente para este propósito. El bactoagar, agar Hazelton, Gelrite y Gelgro, son tipos específicos de soporte sólido que son adecuados para el crecimiento de células de planta en cultivo de tejido. Algunos tipos de células crecerán y se dividirán en suspensión líquida o sobre medio sólido. Las células receptoras objetivo incluyen, sin limitación, células de meristema, callos, embriones inmaduros, gametos tales como microsporas de polen, simiente y células de huevo. En algunas modalidades se puede usar cualquier célula de la cual se pueda regenerar una planta transgénica, incluyendo una planta transgénica fértil. Por ejemplo, se pueden transformar embriones inmaduros, seguido por selección e iniciación de callos y regeneración subsiguiente de plantas transgénicas. La transformación directa de embriones inmaduros elimina la necesidad de desarrollo prolongado de cultivos de células receptoras. Las células meristemáticas (es decir, las células de planta capaces de dividirse continuamente, caracterizadas por una apariencia citológica no diferenciada, encontradas normalmente en los puntos o tejidos de crecimiento de las plantas tales como puntas de raíz, ápices de tallo, botones laterales, etcétera), también se pueden usar como una célula de planta receptora. Debido a su crecimiento no diferenciado y capacidad de diferenciación de órgano y totipotencia, una sola célula meristemática transformada podría ser recuperada como una planta transformada completa. Las células somáticas son de varios tipos. Las células embnogénicas son un ejemplo de células somáticas que pueden ser inducidas para regenerar una planta mediante la formación de embrión. Las células no embnogénicas son aquellas que normalmente no responderán de dicha manera. Se pueden usar algunas técnicas que enriquecen a las células receptoras dentro de una población de células. Por ejemplo, el desarrollo de callo de tipo II, seguido por selección manual y cultivo de tejido embriogénico friable, generalmente resulta en un enriquecimiento de las células receptoras para usarse por ejemplo en transformación por microproyectil. La selección en cultivo se puede efectuar después de la transformación de la célula de planta usando una variedad de métodos de transformación. La transformación por Agrobacterium, seguida por selección, se describe más abajo en los ejemplos de trabajo. Además, se proveen procedimientos ejemplares para la selección de células transformadas preparadas por bombardeo de microproyectil, de la siguiente manera: 1. El tejido (suspensión) se deposita sobre filtros, se bombardea con microproyectil y después los filtros se transfieren a medio de cultivo. Después de 2-7 días, los filtros se transfieren a medio selectivo. Aproximadamente 3 semanas después del bombardeo, el tejido se recoge de los filtros como grumos de callos separados sobre medio selectivo nuevo. 2. Como en el inciso 1 anterior, excepto que después del bombardeo la suspensión se vuelve a poner en líquido, se somete a selección en líquido durante 7-14 días y después se transfiere con pipeta a densidad baja a placas de selección nuevas. 3. El callo se bombardea mientras se asienta directamente sobre el medio o sobre los filtros. Las células se transfieren a medio selectivo 1-14 días después del bombardeo de partícula. El tejido se transfiere a los filtros 1-3 veces a medio selectivo nuevo, a intervalos de dos semanas. Después, el callo se pone brevemente en líquido para dispersar el tejido sobre placas selectivas a densidad baja. 4. El tejido de callo se transfiere a placas selectivas de 1 a 7 días después de la introducción de ADN. El tejido se subcultiva como pequeñas unidades de callo sobre placas selectivas hasta que se identifican los transformantes. En algunas modalidades se seleccionan células receptoras después del crecimiento en cultivo. Las células cultivadas se pueden desarrollar sobre soportes sólidos o en forma de suspensiones líquidas. En cualquier caso se pueden proveer nutrientes en forma de medio a las células, y se controlan las condiciones ambientales. Hay muchos tipos de medios de cultivo de tejido comprendidos de aminoácidos, sales, azúcares, reguladores de crecimiento y vitaminas. La mayor parte de los medios usados en la práctica de la invención tendrá algunos componentes similares, mientras que los medios pueden diferir en composición y proporciones de ingredientes, de acuerdo con las prácticas conocidas de cultivo de tejido. Por ejemplo, varios tipos de células crecen normalmente en más de un tipo de medio pero exhiben diferentes velocidades de crecimiento y diferentes morfologías, dependiendo del medio de crecimiento. En algunos medios, las células sobreviven pero no se dividen. También, frecuentemente la composición de los medios se optimiza basándose en las especies o tipos de células seleccionados. Se han descrito previamente varios tipos de medios adecuados para cultivar células de planta. Los ejemplos de dichos medios se definen más abajo. En algunas modalidades, puede ser preferible usar un medio con una proporción de amoniaco/nitrato un poco más baja, tal como N6, para promover la generación de células receptoras, manteniendo las células en un estado proembriónico capaz de dividirse sostenidamente. En algunas modalidades de la presente invención se usó medio Woody Plant Médium (WPM) (Lloyd y McCown, 1981). El método de mantenimiento de los cultivos de células puede contribuir a su utilidad como fuente de células receptoras para transformación. La selección manual de células para su transferencia a medio de cultivo nuevo, la frecuencia de transferencia a medio de cultivo nuevo, la composición del medio de cultivo y los factores ambientales que incluyen, sin limitación, la calidad y cantidad de luz y la temperatura, todos, son factores para mantener los callos o cultivos en suspensión que son útiles como fuentes de células receptoras. Puede ser benéfico alternar los callos entre diferentes condiciones de cultivo para enriquecer las células receptoras dentro de un cultivo. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en suspensión pero se pueden transferir a medio sólido a intervalos regulares. Después de un periodo de crecimiento en medio sólido, las células se pueden seleccionar manualmente para retornarlas al medio de cultivo líquido. Se puede repetir esta secuencia de transferencias a medio de cultivo nuevo para enriquecer las células receptoras. El paso de los cultivos celulares a través de un tamiz de 1.9 mm también puede ser útil para mantener la friabilidad de un callo o cultivo en suspensión y enriquecer las células transformables cuando se usan dichos tipos de células.

C. Plantas transgénicas Una vez que se ha seleccionado una célula transgénica, la célula se puede regenerar para formar una planta transgénica usando técnicas muy conocidas. Las plantas transformadas se pueden analizar subsiguientemente para determinar la presencia o ausencia de un ácido nucleico particular de interés contenido en una construcción de ADN. Los análisis moleculares pueden incluir, sin limitación, Southern blots (Southern, 1975), análisis de Northern blot, análisis de Western blot, o análisis de PCR, enfoques inmunodiagnósticos, y evaluaciones de campo. Estos y otros métodos muy conocidos se pueden realizar para confirmar la estabilidad de las plantas transformadas producidas mediante los métodos descritos. Estos métodos son muy conocidos (Sambrook y otros, 1989). Se pueden producir plantas transgénicas tolerantes a herbicidas de tipo auxina. En particular, las plantas económicamente importantes que incluyen plantas de cultivo, árboles frutales y plantas de ornato, y árboles que actualmente se sabe son dañados por herbicidas de tipo auxina, pueden ser transformadas con las construcciones de ADN de la presente invención para hacerlas tolerantes al herbicida. Las plantas que actualmente se consideran tolerantes a los herbicidas de tipo auxina se pueden transformar para aumentar su tolerancia al herbicida. En particular, los ejemplos de plantas que pueden ser de utilidad en la presente invención incluyen, sin limitación, alfalfa, frijol, brócoli, col, zanahoria, coliflor, apio, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, chícharo, pimiento, calabaza, rábano, colza, espinaca, soya, tomate, sandía, maíz, cebolla, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, pasto vaina, y césped deportivo. Una vez que se ha preparado una planta transgénica que contiene un transgen, ese transgen puede ser introducido en cualquier planta sexualmente compatible con la primera planta por medio de cruzamiento, sin la necesidad de transformar directamente alguna vez la segunda planta. Por lo tanto, como se usa aquí, el término "progenie" denota la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención, en donde la progenie comprende una construcción de ADN seleccionado, preparada de acuerdo con la invención. Así, una "planta transgénica" puede ser de cualquier generación. El "cruzamiento" de una planta para proveer una línea de planta que tiene uno o más transgenes o alelos añadidos con respecto a una línea de planta inicial, como se describe aquí, se define como las técnicas que resultan en que una secuencia particular se introduzca en una línea de planta cruzando una línea inicial con una línea de planta donadora que comprende un transgen o alelo de la invención. Para lograr esto, se pueden realizar por ejemplo los siguientes pasos: (a) sembrar las semillas de la primera planta progenitora (línea inicial) y la segunda planta progenitora (línea de planta donadora que comprende un transgen o alelo deseado); (b) desarrollar las semillas de la primera y segunda planta progenitora para obtener plantas que llevan flores; (c) polinizar una flor de la primera planta progenitora con polen de la segunda planta progenitora; y (d) cosechar las semillas producidas en la planta progenitora que llevan la flor fertilizada.

D. Definiciones Como se usa aquí, el término "transformado" se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el cual se ha introducido una molécula de polinucleótido ajeno, tal como una construcción. La molécula de polinucleótido introducida se puede integrar en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor, de tal manera que la molécula de polinucleótido introducida es heredada por la progenie subsiguiente. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también incluye la progenie de la célula u organismo y la progenie producida de un programa de reproducción que usa dicha planta transgénica como un progenitor en una cruza, y que exhibe un fenotipo alterado originado de la presencia de una molécula de polinucleótido ajeno. Para "poner en contacto" la célula de planta transformada con un medio de cultivo de tejido que contiene un herbicida de tipo auxina, se puede cultivar la célula de planta en un medio de cultivo de tejido de planta que contiene un herbicida de tipo auxina. El "medio de cultivo de tejido" se refiere a un medio líquido, semisólido o sólido usado para sostener el crecimiento y desarrollo de la planta en un medio ambiente sin tierra. Los medios de cultivo de tejido de planta adecuados son conocidos para los expertos en la materia y pueden incluir medio basado en MS (Murashige y Skoog, 1962) o medio basado en N6 (Chu y otros, 1975), suplementado con reguladores de crecimiento de planta adicionales tales como auxinas, citocininas, cinetina, ABA, y giberelinas. Otros aditivos de medio pueden incluir, sin limitación, aminoácidos, macroelementos, hierro, microelementos, inositol, vitaminas y compuestos orgánicos, carbohidratos, componentes de medio no definidos tales como hidrolizados de caseína, con o sin un agente de gelificación adecuado, por ejemplo para forma agar, tal como una agarosa de bajo punto de fusión o Gelrite®, para preparar un medio semisólido o sólido si se desea. Los expertos en la materia están familiarizados con la variedad de medios de cultivo de tejido, que cuando se suplementan adecuadamente sostienen el crecimiento y desarrollo del tejido vegetal y son adecuados para transformación y regeneración de la planta. Estos medios de cultivo de tejido se pueden comprar como una preparación comercial o se pueden preparar y modificarse según se requiera. Los ejemplos de dichos medios incluirían, sin limitación, medio de Murashige y Skoog (1962), N6 (Chu y otros, 1975), Linsmaier y Skoog (1965), Uchimiya y Murashige (1962), medio de Gamborg (Gamborg y otros, 1968), medio D (Duncan y otros, 1985), medio de planta Woody de McCown (McCown y Lloyd, 1981), Nitsch y Nitsch (1969), y Schenk y Hildebrandt (1972), o derivaciones de estos medios suplementados consecuentemente. Los expertos en la materia saben que los medios y suplementos de medios, tales como nutrientes y reguladores de crecimiento para usarse en la transformación y regeneración, y otras condiciones de cultivo tales como intensidad de luz durante la incubación, pH y temperaturas de incubación, pueden ser optimizados para una planta de interés. Los "herbicidas de tipo auxina" también se denominan herbicidas reguladores de crecimiento o auxínicos, o herbicidas del grupo 4 (según su modo de acción). Estos herbicidas imitan o actúan como los reguladores de crecimiento de planta naturales denominados auxinas. Las auxinas incluyen hormonas naturales tales como ácido indolacético y ácido naftalenacético, que son responsables del alargamiento de la célula en las plantas. Parece que el modo de acción de los herbicidas auxínicos es afectar la plasticidad de la pared celular y el metabolismo del ácido nucleico, que pueden descontrolar la división y el crecimiento celular. El grupo de herbicidas de tipo auxina incluye cuatro familias químicas: ácido fenoxicarboxílico (o piridina), ácido benzoico, y la familia más nueva de ácido quinalincarboxílico. Acidos fenoxicarboxílicos: los herbicidas fenoxi son los más comunes y se han usado como herbicidas desde los años 1940, cuando se descubrió el ácido (2,4-diclorofenoxi)acético (2,4-D). Otros ejemplos incluyen ácido 4-(2,4-diclorofenoxi)butírico (2,4-DB), ácido 2-(2,4-diclorofenoxi)propanoico (2,4-DP), ácido (2,4,5-triclorofenoxi)acético (2,4, 5-T), ácido 2-(2,4,5-thclorofenoxi)propiónico (2,4,5-TP), 2-(2,4-dicloro-3-metilfenoxi)-N-fenilpropanamida (clomeprop), ácido (4-cloro-2-metilfenoxi)acético (MCPA), ácido 4-(4-cloro-o-toliloxi)butírico ( CPB), y ácido 2-(4-cloro-2-metilfenoxi)propanoico (MCPP).

Acidos piridincarboxílicos: la siguiente familia química más grande es la de los herbicidas de ácido carboxílico, también llamados herbicidas de piridina. Los ejemplos incluyen el ácido 3,6-dicloro-2-píridincarboxílico (Clopyralid), ácido 4-amino-3,5,6-tricloro-2-piridincarboxílico (picloram), ácido (2,4,5-triclorofenoxi)acético (triclopir), y ácido 4-amino-3,5-dicloro-6-fluoro-2-piridiloxiacético (fluoroxipir). Acidos benzoicos: los ejemplos incluyen ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba) y ácido 3-amino-2,5-diclorobenzoico (choramben). Acidos quinalincarboxílicos: la cuarta y más nueva familia química de los herbicidas auxínicos es la familia del ácido quinalincarboxílico. Un ejemplo incluye el ácido 3,7-dicloro-8-quinolincarboxílico (quinclorac). Este herbicida es único porque también controla algunas malezas de pasto, a diferencia de otros herbicidas de tipo auxina que esencialmente solo controlan plantas de hoja ancha o dicotiledóneas. El otro herbicida de esta categoría es el ácido 7-cloro-3-metil-8-quinolincarboxílico (quinmerac). "Efecto herbicida de tipo auxina" significa síntomas de daño causado por herbicidas de tipo auxina. Estos incluyen encorvamiento epinástico y retorcimiento de tallos y pecíolos, acopamiento y rizado de hoja, y forma y venación anormales de hoja. Todos estos herbicidas se transponen a otros lugares, algunos más que otros. Algunos de estos herbicidas tienen actividad en la tierra y algunos pueden persistir en la tierra durante periodos bastante largos. Debido a su efecto, se usan ampliamente en muchos cultivos que incluyen cereales de grano pequeño, maíz, arroz, y otros cultivos de pasto, césped, terrenos de pastura, y sitios que no son de cultivo e industriales. La "selección" de la célula de planta transformada que es tolerante a un herbicida de tipo auxina se puede lograr mediante los métodos descritos en la presente invención. Brevemente, por lo menos algunas de las células de planta de una población de células iniciales son transformadas con una construcción de ADN que contiene una molécula de polinucleótido que codifica DMO. La población resultante de células de planta se coloca en un medio de cultivo que contiene un herbicida de tipo auxina a una concentración seleccionada para que crezcan las células de planta transformadas, pero no las células de planta no transformadas. Las concentraciones adecuadas de un herbicida de tipo auxina pueden ser determinadas empíricamente. Antes de la selección los explantes se pueden cultivar en un medio sin herbicida de tipo auxina. Dicho medio se denomina medio de retraso. Los explantes se pueden colocar en un medio de retraso para permitir que crezca un cierto tiempo antes de colocarse en el medio de selección. Los regímenes de selección se podrían optimizar dependiendo del herbicida de tipo auxina particular y el sistema de explante. Frecuentemente se utilizan múltiples pasos de selección y se pueden usar en cada paso cantidades variables de agente de selección. "Tolerante" significa que las células de planta transformadas son capaces de sobrevivir y regenerarse en plantas cuando se colocan en un medio de cultivo que tiene una cantidad de un herbicida de tipo auxina que impide que lo hagan las células no transformadas. "Tolerante" también significa que las plantas transformadas son capaces de crecer después de la aplicación de una cantidad de un herbicida de tipo auxina que inhibe el crecimiento de las plantas no transformadas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar las modalidades de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos siguientes representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la materia, a la luz de la presente invención, apreciarán que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y no obstante obtener los mismos resultados o resultados similares sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que algunos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden sustituir a los agentes aquí descritos, obteniéndose los mismos resultados o resultados similares. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para el experto en la materia se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, definida por las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Preparación de construcciones de polinucleótido que codifican DMO Se prepararon varios vectores binarios para probar la capacidad de las moléculas de polinucleótido que codifica DMO para permitir la selección de células de soya transformadas. Los elementos genéticos usados para preparar los vectores binarios se dan en el cuadro 1 e incluyen un promotor e incrementador CaMV 35S (patentes de EE. UU. Nos. 5,322,938; 5,352,605; 5,359, 142; y 5,530, 196); guía no traducida GmHsp del gen Hsp17.9 de Glycine max (patente de EE. UU. 5,659,122); región codificadora de AvGFPI de los primeros 126.3 aminoácidos de la proteína GFP de Aequorea victoria (patentes de EE. UU. 5,491 ,084; 6,146,826), con un cambio de serina a treonina en el aminoácido 65, y optimizada para su expresión en planta; un segundo intrón StLS1 del gen LS1 de Solanum tuberosum (Eckes y otros, 1986); una región codificadora de AvGFPII para los últimos 1 12.6 aminoácidos de la proteína GFP de Aequorea victoria (patentes de EE. UU. 5,491 ,084; 6, 146,826), optimizada para su expresión en plantas; una región 3' no traducida de T-Atnos del gen de nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens (Rojiyaa y otros, 1987, Registro de GenBank E01312); un promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia FMV (patentes de EE. UU. 6,051 ,753; 5,378,619); una guía no traducida PhDnaK del gen Hsp70 de Petunia hybrida (patente de EE. UU. 5,362,865); y una región codificadora de AtRbcS4 (CTP1 ) para el péptido de tránsito SSU1A de Arabidopsis. Este último elemento incluye el péptido de tránsito, 24 aminoácidos de la proteina madura, y una repetición de los últimos 6 aminoácidos del péptido de tránsito (patente de EE. UU. 5,728,925). También se usó una región codificadora de AtShkG (CTP2) para el péptido de tránsito 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Arabidopsis thaliana. Este elemento varía de la secuencia de tipo silvestre (Klee y otros, 1987) en que el último codón se cambió de GAG (ácido glutámico) a TGC (cisteína). Se usó un elemento AtShkGzmcodon (CTP2syn), que es el mismo que AtShkG (CTP2), pero optimizado para su expresión en planta utilizando codones de Zea mays (véase SEQ ID NO:14 de WO04009761 ). Se usó una región PmDMOCys 12Atcodon para dicamba monooxigenasa de Pseudomonas maltophilia (solicitud de patente de EE. UU. 20030115626), que tiene una cisteína en la posición 1 12, y optimizada para su expresión en dicotiledónea usando los codones de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs: 1 , 3, 7). Para el diseño de la construcción también se usó una región codificadora PmDMOTrpI 12Atcodon para dicamba monooxigenasa de Pseudomonas maltophilia (solicitud de patente de EE. UU. 200301 15626), que tiene un triptófano (Trp) en la posición 112, y optimizada para su expresión en dicotiledónea usando los codones de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NOs: 5, 9); una región de poliadenilación 3' PsRbcS2 del gen RbcS2-E9 de Pisum sativum (Coruzzi y otros, 1984); un promotor/intrón de AtAntl y guía del gen transponedor 1 de nucleótido de adenina de Arabidopsis thaliana; una región codificadora de AtaroA-CP4 para aroA-CPA no natural (patente de EE. UU. 5,633,435), construida por ingeniería para su expresión en plantas; una guía 5' no traducida de TEV del virus de ARN de la mancha anular del tabaco (Carrington y Freed, 1990); un péptido de tránsito de cloroplasto PsRbcS de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bisfosfato carboxilasa de chícharo, y los primeros 24 aminoácidos de la proteína rubisco madura (Coruzzi y otros, 1984); un promotor de P-Atnos para nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens pTiT37 (Registro de GenBank V00087; Depicker y otros, 1982; Bevan y otros, 1983); una región 5' no traducida de L-At.nos del gen de nopalina sintetasa de Agrobacterium tumefaciens pTiT37 (Registro de GenBank V00087; Bevan y otros, 1983), y un promotor PCISV para el transcrito de longitud completa del virus de la raya clorótica del cacahuate. Este último elemento tiene una duplicación de 179 nucleótidos en repeticiones directas con 6 nucleótidos entre la repetición, seguida por la región de 70 p.b. que contiene la caja TATA (patente de EE. UU. 5,850,019). En el cuadro 2 se resumen diferentes CTPs y variantes de molécula de polinucleótido que codifican DMO.

CUADRO 1 Elementos genéticos usados para construir ADN-T's Claves: 5' UTR: región 5' no traducida; RC: región codificadora; Poli-A: región de poliadenilación; y ST: secuencia de tránsito CUADRO 2 Péptidos de tránsito de cloroplasto y polinucleótidos que codifican DMO usados en vectores binarios En el caso de pMON73690, pMON73691 , pMON73696, y pMON73698, la molécula de polinucleótido que codifica DMO se enlazó al marcador seleccionable GFP y se suministró al mismo ADN-T para mostrar que la molécula de polinucleótido que codifica DMO se puede usar con otro gen. En el caso de pMON58498, pMON84254 y pMON73724, la molécula de polinucleótido que codifica DMO se separó del otro transgen (marcador seleccionable o gen de rasgo agronómico) separándolos en dos ADN-T's.

EJEMPLO 2 Desarrollo del método de selección Semillas maduras de soya [Glycine max (L) Merrill] cv. A3525 se embebieron, esterilizaron y germinaron a temperatura ambiente como se indica más abajo. Se pueden usar fácilmente otros ejemplos de genotipos de soya que incluyen, sin limitación, Jack, Williams, Bert, Thorne, Granite, Lambert, Chapman y Kunitz. Brevemente, semillas secas (aproximadamente 770 g) se enjuagaron durante 3 minutos en 2 L de una solución de hipoclorito de sodio a 200 ppm preparada partiendo de Clorox, disponible comercialmente. La solución se drenó y las semillas se apartaron durante 2 horas aproximadamente. Después se añadieron a las semillas aproximadamente 2 L de medio de esterilización/germinación de grano. Después de aproximadamente 9-10 horas, las semillas estaban listas para corte manual de los explantes. El medio de germinación de grano contenía lo siguiente en mg/L: NH4N03: 240, KN03. 505, CaCI2.2H20: 176, MgS0 .7H20: 493, KH2P04: 27, H3B03: 1.86, Na2Mo04.2H2O: 0.216, MnS04.H2O: 5.07, ZnSO4. 7H2O: 2.58, FeS04.7H2O: 2.502, Kl: 0.249, Na2EDTA.2H20: 3.348, CuSO4.5H2O: 0.0008, CoCI2.6H20: 0.0008, B1 : 1.34, B3: 0.5, B6: 0.82, Bravo (75% WP; Diamond Shamrock Company, Cleveland, Ohio): 30, Captan (50% WP; Micro Fio Company, Lakeland, Florida): 30, cefotaxima: 125, y sacarosa: 25000, pH 5.8). Para corte en máquina de los explantes, las semillas se trataron con 2 L de la solución de hipoclorito de sodio a 200 ppm durante 15 minutos. Después de drenar la solución, las semillas se enjuagaron con 2 L de agua destilada estéril durante 1 minuto. La máquina y el método para el corte mecánico se describen en la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. 20050005321. Brevemente, las semillas embebidas se corrieron a través de tres juegos de rodillos en la máquina, con agua destilada estéril corriendo sobre las mismas, y se trituraron. Se recogió una mezcla de cotiledones, cubiertas de semilla y los explantes (eje de embrión), y se tamizaron manualmente o usando un dispositivo de autotamizado para recuperar los explantes. Los explantes se enjuagaron con etanol al 0.05% durante 1 minuto, seguido por dos enjuagues con agua destilada estéril para remover más desechos. Los vectores binarios anteriormente descritos se movilizaron en la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens C58 (ABI). El inoculo de Agrobacterium para la infección se preparó de la siguiente manera: 250 mi de medio LB (Luria-Bertani; Difco, Detroit, Michigan) que contenía 50 mg/l de kanamicina (Sigma, San Luis Misuri) y 75 mg/l de espectinomicina (Sigma, San Luis Misuri), se inoculó con 0.5 mi de solución de reserva de Agrobacterium en glicerol (Acros Organics, Geel, Bélgica) y se agitaron a 200 rpm a 28 °C durante aproximadamente 20-22 h hasta que la DO66o alcanzó de 0.8 a 1.0. Después, el caldo de Agrobacterium se centrifugó durante 25 minutos a 3500 rpm (aproximadamente 3565 g) a 2-4 °C. Después de remover el sobrenadante, la pella de Agrobacterium se resuspendió en medio de inoculación que contenia 2/5x de los macronutrientes, 1/1 Ox de los micronutrientes y vitaminas de medio de Gamborg B5 suplementado con 3.9 g/l de MES (Sigma, San Luis Misuri), y 30 g/l de glucosa (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, Kansas), pH 5.4. Se agregó ácido lipoico (Sigma, San Luis Misuri) a la suspensión de Agrobacterium, a una concentración final de 0.25 mM, después de que la densidad de la suspensión de células de Agrobacterium se ajustó a una DO660 de 0.30 a 0.35. La infección con Agrobacterium y el cocultivo de los explantes se realizaron de la siguiente manera: aproximadamente 100 explantes cortados se dispensaron en la tapa de un recipiente de plástico estéril de cultivo PLANTCON (MP Biomedicals, LLC, Irvine, California). Se agregaron 5 mi del inoculo de Agrobacterium a los explantes en cada tapa de PLANTCON. Después, los explantes se sometieron a sonicación durante 20 segundos en un aparato sonicator (Ultrasonic Multi Cleaner, Modelo W-1 13, Honda, Japón). Una pieza de papel filtro Whatmann #1 (Whatman Inc., Clifton, Nueva Jersey) cortada al tamaño del fondo del PLANTCON, se puso en la parte interior del PLANTCON. Los explantes se transfirieron de la tapa sobre el papel filtro con el inoculo de Agrobacterium. Después, los PLANTCONs se incubaron en una incubadora Percival en un fotoperiodo de 16 horas de luz (a aproximadamente 85-90 µ?) y 8 horas de oscuridad, y a 23 °C, durante 2 a 4 días para cocultivo. Después de un periodo de cocultivo de 2-4 días, primero los explantes se cultivaron en un medio sin dicamba (medio de retraso) durante 3-5 días antes de ser transferidos al medio de selección con dicamba. Hasta la transferencia del medio de retraso al medio de selección, los explantes se mantuvieron en el mismo PLANTCON usado para el cocultivo, pero se agregaron a cada PLANTCON 10 mi o 12 mi del medio de retraso. Alternativamente, los explantes se transfirieron a PLANTCONs nuevos, cada uno conteniendo una pieza de fieltro esterilizado en autoclave (Jo-Ann Fabrics & Crafts, Madison, Wisconsin) y 30 mi del medio de retraso. El medio de retraso contenía medio Woody Plant modificado (Lloyd y McCown, 1981), suplementado con 1 mg/l o 5 mg/l de BAP (6-bencilaminopurina), 200 mg/l carbenicilina (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, Kansas), 200 mg/l de cefotaxima (Hospira, Lake Forest, Illinois) y 100 mg/l de ticarcilina (Duchefa, Países Bajos). El BAP puede ayudar a mantener la proporción de auxina-citocinina ya que el dicamba es un herbicida de auxina, y promueve la producción de múltiples vástagos de meristema apical. Otras citocininas adecuadas que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen: citocininas de adenina (por ejemplo, cinetina, zeatina, benciladenina (es decir, 6-bencilaminopurina), citocininas de adenina y fenilurea (por ejemplo, ?,?'-difenilurea), y tidiazuron (TDZ). La selección se realizó en un medio líquido o semisólido. El medio de selección fue el medio de retraso sin BAP y contenía diferentes concentraciones de dicamba. Para selección en medio líquido, se pusieron en cada Plantcon 50 mi o 60 mi del medio de selección y una pieza de esponja de espuma (Wisconsin Foam Products, Madison, Wisconsin), que tenía 5 rebanadas paralelas en una posición vertical, de modo que el meristema apical quedara boca arriba. Cada dos a tres semanas, el medio viejo se reemplazó con el medio nuevo. Se preparó medio semisólido agregando 4 g/l de AgarGel (Sigma, San Luis Misuri) al medio líquido. Para selección en medio de selección semisólido, los explantes se implantaron individualmente en PLANTCONs en el medio. En la etapa tardía de la selección y desarrollo de vástagos (aproximadamente 4 semanas en el medio de selección), opcionalmente se sobrepusieron 20 mi del medio de selección líquido sobre el medio semisólido. Después de cultivar los explantes en el medio de selección durante aproximadamente 4 a 5 semanas, empezaron a desarrollarse vástagos alargados con hojas de follaje trifoliado expandido. Estos vástagos tolerantes se desprendieron de los explantes originales cuando tenían aproximadamente 2 cm y más de largo y se transfirieron al medio de inducción de raíz semisólido. El medio de inducción de raíz fue el mismo que para el desarrollo de vástago y también se suplemento con dicamba para reducir la frecuencia de escapes. Alternativamente, se usó medio de enraizado de haba (BRM) suplementado con 0.01 mg/l de dicamba para la inducción de raíz. Este medio contenía ½ de la fuerza de sales de MS, vitaminas de MS, 100 mg/l de inositol, 100 mg/l de cisteína, 30 mg/l de sacarosa y 100 mg/l de ticarcilina, y se solidificó con 8 g/l de agar lavado. Para inducción de raíz en el medio líquido, se pusieron en cada PLANTCON suficientes cuentas pequeñas de vidrio (Inotech Biosystems International Inc., Dottikon, Suiza) y 60 mi del medio de enraizado, de tal manera que el medio y las cuentas estuvieran al mismo nivel. Se insertaron hasta 9 vástagos desprendidos en las cuentas para inducción de raíz en líquido o en medio semisólido en cada PLANTCON. Casi todos los vástagos pudieron producir raíces en el medio de enraizado en 1-2 semanas (figuras 5A-5B). Sin embargo, solo aquellos vástagos en los que las hojas existentes y desarrolladas de nuevo permanecieron expandidos y crecieron vigorosamente, se transfirieron a la tierra para su crecimiento hasta la madurez. Todos los cultivos se mantuvieron bajo luz fluorescente con un fotoperiodo de 16 h con intensidad de luz de aproximadamente 20-70 µ? a 27-28 °C, hasta que se transfirieron plantas Ro a la tierra. En un estudio, células de soya transformadas con pMON73691 se seleccionaron sobre 0.01 mg/l a 0.1 mg/l de dicamba en medio de selección (figuras 1A y 1 B¡ figura 4). Los vástagos provenientes de explantes desarrollados en medio de selección con 0.05 mg/l o 0.1 mg/l de dicamba no tuvieron mucho crecimiento y finalmente se decoloraron y no se obtuvieron vástagos tolerantes. Sin embargo, en medio de selección que contenía 0.01 mg/l de dicamba, se cosecharon 30 vástagos tolerantes a dicamba de 800 explantes. Doce de estos formaron raíces en medio de enraizado y se transfirieron a la tierra. Diez de estos se probaron para determinar los polinucleótidos que codifican DMO y se encontraron siete positivos. A una concentración de dicamba de 0.02 mg/l, se cosecharon pocos vástagos tolerantes. Estos resultados sugieren que una concentración de dicamba de 0.01 mg/l o más baja fue más eficaz para seleccionar los vástagos tolerantes a dicamba. Sin embargo, esta concentración puede ser alterada fácilmente por el experto en la materia para estudios particulares, dependiendo de la naturaleza del explante, la construcción y otras variables. Para mostrar la selección de vástagos tolerantes que contienen un gen enlazado, un ácido nucleico que codifica DMO expresable en planta se acopló con un ácido nucleico que codifica GFP expresable en planta, y se introdujo en células después de la selección. Cuarenta y cinco días después de la inoculación (DDI) se examinó la expresión de GFP en los cultivos. Se observaron botones pequeños GFP positivos en varios explantes, sugiriendo que estos botones se originaron de células transformadas con la molécula de polinucleótido enlazada que codifica DMO (figura 2). Vahos de estos botones se desarrollaron a vástagos GFP positivos y fueron positivos para el gen GFP (figuras 3A-3C y figuras 6A-6D). Estos resultados demuestran que se puede usar una molécula de polinucleótido que codifica DMO como un marcador seleccionable, y se puede usar para recuperar los transformantes que contienen y expresan un gen enlazado. El hecho de que el transgen GFP fue heredado en la progenie se confirmó por la autopolinización de plantas R0 transformadas con pMON73691. Se recolectaron semillas Ri inmaduras (de aproximadamente 4 mm de longitud) y se cortaron en dos mitades para exponer el tejido del cotiledón. La expresión de GFP se detectó en el tejido del cotiledón de las semillas bajo un microscopio de disección equipado con luz fluorescente. El enraizado también se efectuó en tapones de medio de crecimiento Oasis (Smithers-Oasis North America, Kent, Ohio, EE. UU.). Un total de 102 vástagos seleccionados por dicamba se insertaron en tapones Oasis para inducir raíces. Los tapones se rodearon con un medio líquido que contenía 0.01 mg/l de dicamba. Los vástagos en los tapones se mantuvieron en un cuarto de cultivo a 28 °C y 16 h de luz. Treinta vástagos desarrollaron raíces y parecieron resistentes a dicamba, mostrando hojas nuevas relativamente expandidas. Las plantas con raíces se probaron por medio de una prueba Invader y se encontró que 19 plantas contenían los genes tanto DMO como GUS. La proporción de escape en el medio líquido fue de aproximadamente 33%, que fue mucho más baja que la proporción de escape de 53% cuando las raíces se indujeron en el medio semisólido. Los fenotipos negativos de los vástagos, es decir, hojas en acopamiento, se podían ver más rápido en el medio de selección líquido que en el medio semisólido. Esto sugiere que el enraizado en el medio de selección líquido podría ser un método más eficiente para eliminar los escapes.

EJEMPLO 3 Análisis molecular de plantas de soya transformadas Para confirmar que las plantas tolerantes a dicamba obtenidas fueron el resultado de la transferencia de polinucleótidos que codifican DMO, se recolectó tejido de hoja de cada planta R0 o Ri, se extrajo el ADN, y la presencia del polinucleótido que codifica DMO se confirmó mediante tecnología Invader (Third Wave Technologies, Madison, Wisconsin) y análisis de Southern blot, usando un equipo de sonda no radiactiva de Roche (Indianapolis, Indiana). Para la prueba Invader, los iniciadores usados fueron: sonda primaria 5'-acggacgcggag ATGCTCAACTTCATCGC-3' (SEQ ID NO: 13) e Invader oligo 5'-TCCGCTGGAACA AGGTGAGCGCGT-3' (SEQ ID NO: 14). La secuencia en letras minúsculas de la sonda primaria es la secuencia 5' FLAP que se separa y no es complementaria a la secuencia objetivo. Para el análisis de Southern blot se usó un fragmento de ADN de 897 p.b. para preparar la sonda. El iniciador delantero 5'-GTCGCTGCCCTGCTTGATATT-3' (SEQ ID NO: 15) y el iniciador inverso 5'-CGCCGCTTCTAGTTGTTC-3' (SEQ ID NO: 16) se usaron para amplificar el fragmento de ADN de 897 p.b. Un total de 12 vástagos enraizados seleccionados sobre vástagos con 0.01 mg/l de dicamba se transfirieron a la tierra. Se probaron diez plantas por medio del Invader y análisis de Southern. Siete de estas mostraron la presencia del ácido nucleico que codifica DMO (cuadro 3). Varias de estas también fueron positivas para polinucleótidos que codifican GFP, confirmando la capacidad de uso del ácido nucleico que codifica DMO como un marcador seleccionable para recuperar los transformantes que contienen un gen enlazado.

CUADRO 3 Pruebas del ácido nucleico que codifica D O en plantas Ro por medio EJEMPLO 4 Selección de plantas tolerantes a dicamba transformadas con variantes de molécula de polinucleótido que codifican DMO Se usaron dos variantes de molécula de polinucleótido que codifican DMO para obtener plantas tolerantes a dicamba. La primera variante tenía cisteína en la posición de aminoácido 112 (DMOCys-112; pMON73698) y la segunda tenía triptófano en la posición de aminoácido 112 (DMOTrp 12; pMON73696). La selección usando ambas variantes resultó en vástagos tolerantes a dicamba (figuras 7A-7D). Después de la selección e inducción de vástago y raíz, las plantas enraizadas se transfirieron a la tierra para que crecieran hasta su madurez y se probó en ellas la presencia de ácido nucleico que codifica DMO por medio del Invader™ y análisis de Southern. Se encontró que varias plantas transformadas con pMON73696 eran positivas para el gen DMO en la generación R0 y Ri, indicando la transformación de línea germinal usando el método de la presente invención.

CUADRO 4 Selección de vástagos tolerantes a dicamba transformados con variantes de ácido nucleico que codifican DMO Medio Construcción # # Vástagos # Vástagos # Plantas Explantes tolerantes enraizados con el gen cosechados transferidos DMO (# de a la tierra plantas probadas) Líquido 73696 (DMOTrp112) 1022 6 1 0 73698 869 0 0 0 (DMOCys112) 1200 25 9 3 73696 (DMOTrp112) 1200 0 0 0 73698 Semisólido (DMOCys112) 1536 94 50 28 (47) 1845 3 0 0 (0) 73696 (DMOTrp112) 450 27 18 10 (16) 73698 475 0 0 0 (0) (DMOCys112) 73696 (DMOTrp112) 73698 (DMOCys112) EJEMPLO 5 Selección de plantas tolerantes a dicamba transformadas con moléculas de polinucleótido que codifican DMO, combinadas con diferentes péptidos de tránsito de cloroplasto Se sabe que diferentes péptidos de tránsito de cloroplasto (CTPs) dirigen un polipéptido ajeno a los cloroplastos, con diferentes eficiencias. Por lo tanto se probó el efecto de diferentes tipos de CTPs transformando explantes de soya con moléculas de polinucleótido que codifican DMO dirigidas por CTP2 (pMON73691) o CTP1 (pMON73698) o no dirigidas a cloroplastos (pMON73690). Como se muestra en el cuadro 5, en general los vástagos se cosecharon con construcciones que contenían CTP2 o CTP1 (véase también las figuras 7A-7D). Las plantas enraizadas se transfirieron a la tierra para que crecieran hasta su madurez y se probó en ellas la presencia de ácido nucleico que codifica DMO por medio del Invader™ y análisis de Southern. Se encontró que varias plantas transformadas con pMON73691 eran positivas para el gen DMO en la generación R0 y Ri, indicando la transformación de línea germinal usando el método de la presente invención. También se encontró que varias plantas transgénicas que llevaban una unidad de expresión PCISV/RbcS/DMO-Wdc/Nos o PCISV/CTP2nat/DMO-Cnative/Nos eran tolerantes a un tratamiento con dicamba en una proporción de 1.12 kg/ha (Clarity, BASF) a V3-4, cuando se analizan 18 DDT en un estudio de invernadero.

CUADRO 5 Selección de plantas tolerantes a dicamba transformadas con ácido nucleico que codifica DMO. combinado con diferentes péptidos de tránsito de cloroplasto EJEMPLO 6 Uso de la molécula de polinucleótido que codifica DMO como marcador seleccionable en combinación con un gen de rasgo agronómico Un uso benéfico de una molécula de polinucleótido que codifica DMO como marcador seleccionable es la recuperación de transformantes que contienen un gen enlazado genéticamente, por ejemplo, que confiere un rasgo agronómico mejorado. Esta capacidad fue demostrada transformando explantes de soya con pMON58498 que tiene 2 ADNs: un primer ADN-T que tiene una molécula de polinucleótido que codifica DMO, y un segundo ADN-T que tiene un gen CP4 para tolerancia a glifosato. Plantas transgénicas seleccionadas en medio semisólido se transfirieron a la tierra y se analizaron por medio del Invader™ y análisis de Southern para mostrar la presencia de ácidos nucleicos de DMO y CP4. Aunque se pueden usar tanto moléculas de polinucleótido que codifican DMO como CP4 como marcadores seleccionables, se mostró que los transformantes que comprenden un transgen CP4 se pueden seleccionar usando la selección de dicamba sola. Como se muestra en el cuadro 6, todas las plantas regeneradas, excepto una, de cada uno de los dos tratamientos, tuvieron genes DMO y CP4. Por lo tanto, este estudio demuestra la capacidad de uso de DMO como un marcador seleccionable para la recuperación de genes agronómicos. Se entiende que cualquier gen que se enlaza genéticamente a un marcador DMO seleccionable introducido en un genoma, por ejemplo presente dentro de 50 cM, se puede seleccionar de esta manera, y que no necesariamente se requiere introducir dichos genes en el mismo vector.

CUADRO 6 Uso de DMO como marcador seleccionable en combinación con un gen de rasgo agronómico Exp-Trt BAP en # # Vástagos # Vástagos # Plantas con # Plantas medio de Explantes tolerantes enraizados el gen DMO con el gen retraso cosechados en la tierra (# de plantas CP4 (# de (mg/l) probadas) plantas probadas) 566-1 y 1 1654 51 37 19 (37) 18 (37) 567-1 35 566-2 y 5 1800 11 3 (11 ) 2 (1 1 ) 567-2 EJEMPLO 7 Tolerancia de las plantas que contienen una molécula de polínucleótido que codifica DMO a otros herbicidas de tipo auxina Se efectuó un análisis para determinar si plantas de soya que tienen un polínucleótido que codifica DMO pueden desactivar otros herbicidas de tipo auxina además del dicamba. Esto se hizo aplicando varias concentraciones de formulaciones disponibles comercialmente de otros herbicidas de tipo auxina, tales como 2,4-D (Helena, Collierville, Tennessee), MCPA (Agriliance, San Pablo, Minnesota), triclopir (GARLON 3A; Dow Elanco, Indianápolis, Indiana), clopiralid (STINGER; Dow Elanco, Indianápolis, Indiana), picloram (TORDON 22K; Dow Elanco, Indianápolis, Indiana), o Banvel o Clarity (BASF, Raleigh, Carolina del Norte), a plantas o tejidos de planta que contienen DMO. Se obtuvieron plantas de soya transgénicas por medio de transformación mediada por Agrobacterium de explantes de soya con un polínucleótido que codifica DMO, como se describe arriba en los eventos designados como eventos 1-4. Se usó una línea no transgéníca como control. Semillas de soya transgénicas y no transgénicas se sembraron en macetas de plástico de 22.58 cm2 que contenían Redi-earth™ (Scotts-Síerra Horticultural Products Co., Marysville, Ohio). Las macetas se pusieron en esterillas capilares en charolas de riego de fibra de vidrio de 88.9 cm x 150 cm para riego aéreo o subirrigación durante el periodo de prueba, a fin de mantener la humedad de tierra óptima para el crecimiento de la planta. Las macetas se fertilizaron con Osmocote (liberación lenta 14-14-14; Scotts-Sierra Horticultural Products Co., Marysville, Ohio), a una dosis de 3.53 kg/m3 para sostener el crecimiento de la planta durante las pruebas de invernadero. Las plantas se desarrollaron en invernaderos a una temperatura de 27 °C / 21 °C de día/noche, con humedad relativa entre 25% y 75%, para simular las condiciones de crecimiento de una estación tibia de finales de la primavera. Se suministró un fotoperiodo mínimo de 14 h, con luz complementaria a aproximadamente 600 µ? según se requirió. Todas las aplicaciones de herbicida se hicieron con el pulverizador de carriles usando una boquilla de ventilador plano Teejet 9501 E (Spraying Systems Co, Wheaton, Illinois) con una presión de aire a un mínimo de 1.68 kg/cm2 (165 kPa). La boquilla de pulverización se mantuvo a una altura de aproximadamente 40.64 cm arriba de la parte superior del material de la planta para la pulverización. El volumen de pulverización fue de 93 litros por hectárea. Las aplicaciones se hicieron cuando las plantas habían alcanzado la etapa V-3. Todas las pruebas se establecieron en un diseño de bloque aleatorizado (aleatorizado por dosis) con 4 a 6 duplicaciones de cada tratamiento, dependiendo de la calidad de la planta, la disponibilidad y para tomar en cuenta cualquier variabilidad ambiental que pudiera ocurrir dentro de cada invernadero. Todas las plantas tratadas en las pruebas de invernadero se evaluaron visualmente aproximadamente 4, 14, 18 y 21 días después del tratamiento (DDT), para calificar el daño en una escala de 0% a 100% con respecto a las plantas de control no tratadas, en donde 0% representa "sin" daño y 100% representa daño "completo" o muerte. Los datos se recolectaron usando una computadora palm top y se analizaron usando métodos estadísticos normales. Los resultados mostrados en el cuadro 9 indican claramente la tolerancia de la soya transgénica a otros herbicidas de tipo auxina, tales como 2,4-D y MCPA, con respecto a la línea no transgénica.

CUADRO 7 Porcentaje de daño con respecto a controles no tratados 25 DDT en aplicaciones post-V3 de diferentes herbicidas de tipo auxina a plantas de soya transgénicas o no transgénicas* * El% de daño se representó como comparaciones de media ANOVA; ** Gramos de ácido equivalente activo /hectárea.

Este ejemplo muestra que las plantas de soya transgénicas exhiben tolerancia a otros herbicidas de tipo auxina, indicando un mecanismo de desactivación probablemente común para dicamba y otros herbicidas de tipo auxina, tales como 2,4-D y MCPA. En el caso de triclopir, clorapid y picloram, la dosis de aplicación de 280 g ae /ha pareció demasiado severa en este estudio, y por lo tanto en la mayoría de las situaciones puede ser conveniente usar concentraciones mas bajas para reducir el daño a la planta. Los resultados indican que los herbicidas de tipo auxina se pueden usar para seleccionar células de planta transformadas con moléculas de polinucleótido que codifican DMO, especialmente en el caso de plantas que son muy sensibles a dicamba, por ejemplo, algodón. La concentración adecuada del herbicida de tipo auxina para selección bajo un grupo de condiciones dadas se puede optimizar usando una cuadrícula de prueba de tratamientos, seguida por la observación de tejidos de planta tratados. Un ejemplo de dicha cuadrícula analiza el efecto de concentraciones de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 10 mg/l, incluyendo 0.01 , 0.1 , 1.0, 2.0, y 5.0 mg/L. También se probó otro herbicida de tipo auxina, Butyrac 200 (2,4-DB; Albaugh), sobre plantas de soya transgénicas que llevan un gen DMO para probar la tolerancia de las plantas al mismo. El herbicida se aplicó como un tratamiento de postemergencia a tres dosis de aplicación sobre dos eventos de soya transgénica, y se comparó con una línea no transgénica para determinar el daño total del cultivo a las tres dosis de aplicación: 280 g/ha, 561 g/ha y 841 g/ha (véase el cuadro 8). Las dos líneas de soya transgénica mostraron poca tolerancia a 2,4-DB. Este ejemplo demuestra que la soya tolerante a dicamba también es tolerante a cantidades bajas de 2,4-DB, y sería de utilidad para manejar el daño de la deriva de vaporización de los mismos campos o de campos vecinos para prevenir la pérdida de cultivo, y exhibiría tolerancia a cantidades residuales de 2,4-DB después de un lavado incompleto del equipo de suministro del herbicida.

CUADRO 8 Porcentaje de daño con respecto al control no tratado 16 DDT mediante la aplicación de 2,4-DB a plantas de soya transgénicas y no transgénicas EJEMPLO 8 Uso del gen DMO como un marcador seleccionable contra otros herbicidas de tipo auxina Explantes de soya recién aislados (ejes embrionarios maduros sin cotiledones) se inocularon con Agrobacterium cepa ABI, que aloja pMON73691 (que contiene los genes DMO y GFP). Después de 3 d de cocultivo con Agrobacterium a 23 °C y un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, los explantes se cultivaron en medio de retraso líquido que contenía medio Woody Plant modificado suplementado con 5 mg/l de BAP, 200 mg/l de carbenicilina, 200 mg/l de cefotaxima y 100 mg/l de ticarcilina. Los explantes estuvieron en el medio de retraso durante 4 días. Después se transfirieron a medio de selección líquido en PLANTCONs. El medio de selección fue el mismo que el medio de retraso, excepto por la adición de varias concentraciones de 2,4-D (0.01 , 0.1 , 1.0 o 2.0 mg/L) o 0.01 mg/L de dicamba como se muestra en el cuadro 9 más abajo. Cada PLANTCON contenía 60 mi del medio de selección y una pieza de esponja de espuma con 5 ranuras. Finalmente se insertaron 25 explantes en las ranuras. Los cultivos se mantuvieron a 28 °C y un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, y se examinaron periódicamente bajo un microscopio estéril equipado para detectar tejidos que expresan GFP. Cuarenta y ocho días después de la inoculación (DDI), se observaron botones o vástagos jóvenes que expresan GFP (GFP+) en varios explantes en los tratamientos con 0.01 mg/L de dicamba, 0.01 , 0.1 o 1.0 mg/L de 2,4-D, pero no en los explantes tratados con 2 mg/L de 2,4-D. Se observó desarrollo extenso de callos en los explantes tratados con 1 o 2 mg/L de 2,4-D. En el tratamiento con 0.01 o 0.1 g/L de 2,4-D, los explantes tuvieron un extenso crecimiento de vástago y algunos tuvieron vástagos alargados GFP+.

CUADRO 9 Resumen de experimentos usando DMO como marcador selecciónatele y 2,4-D como agente de selección EJEMPLO 9 Selección de plantas tolerantes a dicamba transformadas con polinucleótido que codifica DMO sin un paso de retraso En 3 estudios se produjeron plantas transgénicas con un gen DMO sin un paso de retraso para la selección. Como un ejemplo, se infectaron explantes y se cocultivaron con Agrobacterium que aloja pMON73696. Después del periodo de cocultivo, los explantes se cultivaron en medio líquido que contenía 5 mg/l de BAP y 0.01 mg/l de dicamba durante 4 días, y después se transfirieron a un medio de selección líquido o semisólido con 0.1 mg/l de dicamba. Como se muestra en el cuadro 10, se pudieron obtener vástagos tolerantes a dicamba de los tratamientos (717-2 y 757-2) donde se usó selección inmediatamente después del cocultivo con Agrobacterium.

CUADRO 10 Selección de plantas tolerantes a dicamba transformadas con polinucleótido que codifica D O. sin un paso de retraso EJEMPLO 10 Uso de DMO como marcador selecciónatele para Arabidopsis Primero se probó la susceptibilidad de Arabidopsis a diferentes concentraciones de dicamba. Se depositaron semillas de Arabidopsis de tipo silvestre, var. Columbia sobre medio de cultivo de tejido de planta que contenia diversas concentraciones de dicamba. La figura 8 muestra que la Arabidopsis de tipo silvestre fue muy susceptible a 1.0 mg/L en el medio de cultivo. Las plantas de Arabidopsis se transformaron entonces con las construcciones que contenían polinucleótidos DMO usando el método de inmersión floral (Clough y Bent, 1998). Semillas Ri se depositaron sobre medio de cultivo que contenía hasta 4 mg/L de dicamba. La figura 9, por ejemplo, muestra la recuperación de plantas tolerantes a dicamba (mostradas por las flechas) después de la transformación con pMON73696. Se encontró que estas plantas tolerantes a dicamba contienen una o más copias de nucleótido de DMO según se determinó por medio de la prueba Invader™. El ejemplo demuestra la utilidad del gen DMO para producir plantas tolerantes a dicamba de otras especies de planta. Todas las composiciones y métodos descritos y reclamados en la presente se pueden hacer y ejecutar sin mayor experimentación a la luz de la presente descripción. Aunque las composiciones y métodos de esta invención se han descrito en función de las modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la materia que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y métodos, y a los pasos o la secuencia de pasos del método aquí descrito, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que algunos agentes que están relacionados tanto química como fisiológicamente pueden sustituir a los agentes aquí descritos obteniéndose no obstante los mismos resultados o resultados similares. Todos estos sustitutos similares y modificaciones evidentes para los expertos en la materia se consideran dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención, definida por las reivindicaciones anexas.

Referencias Las referencias citadas más abajo se incorporan aquí como referencia pues complementan, explican, proveen una base o enseñan la metodología, técnicas o composiciones usadas en la presente. Patente de EE . UU. No. 4,554,101 ; patente de EE. UU. No. 4,940,838; patente de EE. UU. No. 5,017,692; patente de EE. UU. No. 5,229, 114; patente de EE. UU. No. 5,302,523; patente de EE. UU. No. 5,304,730; patente de EE. UU. No. 5,322,938; patente de EE. UU. No. 5,352,605; patente de EE. UU. No. 5,359,142; patente de EE. UU. No. 5,362,865; patente de EE. UU. No. 5,384,253; patente de EE. UU. No. 5,445,962; patente de EE. UU. No. 5,463, 175; patente de EE. UU. No. 5,464,763; patente de EE. UU. No. 5,464,765; patente de EE. UU. No. 5,491 ,084; patente de EE. UU. No. 5,512,466; patente de EE. UU. No. 5,516,671 ; patente de EE. UU. No. 5,530,196; patente de EE. UU. No. 5,538,877; patente de EE. UU. No. 5,538,880; patente de EE. UU. No. 5,543,576; patente de EE. UU. 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No. 6,639,054; patente de EE. UU. No. 6,642,030; patente de EE. UU. No. 6,645,497; patente de EE. UU. No. 6,653,280; patente de EE. UU. No. 6,653,530; patente de EE. UU. No. 6,657,046; patente de EE. UU. No. 6,660,849; patente de EE. UU. No. 6,663,906; patente de EE. UU. No. 6,686,452; patente de EE. UU. No. 6,706,950; patente de EE. UU. No. 6,713,063; patente de EE. UU. No. 6,716,474; patente de EE. UU. No. 6,723,837; patente de EE. UU. No. 6,723,897; patente de EE. UU. No. 6,770,465; patente de EE. UU. No. 6,774,283; patente de EE. UU. No. 6,803,501 ; patente de EE. UU. No. 6,809,078; patente de EE. UU. No. 6,812,379; patente de EE. UU. No. 6,822, 141 ; patente de EE. UU. No. 6,828,475; Solicitud provisional de EE. UU. No. de serie 60/891 ,675; Publicación de patente de EE. UU. 2005/0005321 ; publicación de patente de EE. UU. 2003/01 5626; publicación de patente de EE. UU. 2003/01403641 ; publicación de patente de EE. UU. 2003/0135879; publicación de patente de EE. UU. 2003/0028917; Solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 09/757,089; solicitud de patente de EE. UU. No. de serie 1 1/749,583; Patente de EE. UU. RE37.543; Patente de EE. UU. RE38.446; Becker y otros, Plant Mol. Biol., 20:49, 1992.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para seleccionar una célula de planta transformada, que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una población de células de planta, que comprenden una célula de planta transgénica transformada con un polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa, con un medio que comprende herbicidas de tipo auxina en una cantidad que inhibe el crecimiento de las células de la población que carece del polinucleótido, en donde el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada de: (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8, (2) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, (3) una secuencia de ácido nucleico que híbrida con un complemento de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, bajo condiciones de SSC 5X, formamida 50% y 42 °C, (4) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 8; y (b) seleccionar la célula de planta transformada de la población de células de planta, basándose en la tolerancia exhibida por la célula transformada al herbicida de tipo auxina.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende cultivar la población de células de planta en un medio que carece del herbicida de tipo auxina antes del paso (a), o entre el paso (a) y el paso (b).

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el medio que carece del herbicida de tipo auxina contiene una citocinina.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el medio que carece del herbicida de tipo auxina contiene 6-bencilaminopurina (BAP).

5. - El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la 6-bencilaminopurina está en una concentración de aproximadamente 10 mg/l de medio o menor.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa no está enlazado genéticamente a un gen marcador seleccionable diferente al de dicamba monooxigenasa.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende el paso de: (d) regenerar una planta transgénica fértil partiendo de la célula de planta transformada.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la célula de planta transformada es de una planta dicotiledónea o monocotiledónea.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en alfalfa, frijol, brócoli, col, zanahoria, coliflor, apio, algodón, pepino, berenjena, lechuga, melón, chícharo, pimiento, calabaza, rábano, colza, espinaca, soya, tomate y sandía.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en maíz, cebolla, arroz, sorgo, trigo, centeno, mijo, caña de azúcar, avena, triticale, pasto varilla y césped deportivo.

11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa está enlazado operativamente a un péptido de tránsito de cloroplasto.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el herbicida de tipo auxina se selecciona del grupo que consiste en un compuesto de ácido fenoxicarboxílico, un compuesto de ácido benzoico, un compuesto de ácido piridincarboxílico, un compuesto de ácido quinolincarboxílico, y un compuesto de benazolinetilo.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto de ácido fenoxicarboxílico se selecciona del grupo que consiste en ácido 2,4-diclorofenoxiacético, ácido (4-cloro-2-metilfenoxi)acético, y ácido 4-(2,4-diclorofenoxi)butírico.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el compuesto de ácido 2,4-diclorofenoxiacético está contenido en el medio a una concentración de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 10 mg/l.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el ácido benzoico es dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico).

16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el dicamba está contenido en el medio a una concentración de aproximadamente 0.001 mg/l a aproximadamente 10.0 mg/l.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el medio contiene por lo menos dos herbicidas de tipo auxina.

18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el medio contiene dicamba y ácido 2,4-diclorofenoxiacético.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la población de células comprende un explante de cotiledón.

20. - El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la célula de planta transformada se prepara mediante transformación mediada por Agrobacterium.

21. - Una célula de planta transgénica que comprende un polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa y es capaz de crecer en un medio que comprende 0.01 mg/l de dicamba, en donde dicamba monooxigenasa no está enlazado genéticamente a un gen marcador seleccionable, y en donde el polinucleótido que codifica dicamba monooxigenasa comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en (1) una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID NO: 8, (2) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, (3) una secuencia de ácido nucleico que híbrida con un complemento de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7 bajo condiciones de SSC 5X, formamida 50% y 42 °C, (4) una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, y (5) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido de SEQ ID NO: 8. 22 - Un cultivo de tejido que comprende la célula que se reclama en la reivindicación 21. 23.- El cultivo de tejido de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque comprende dicha célula en un medio que comprende herbicida de tipo auxina, en una cantidad que inhibe el crecimiento de una célula de planta o promueve el crecimiento anormal del mismo genotipo que la célula de planta transgénica que carece del polinucleótido. 24 - Una planta transgénica regenerada partiendo de la célula de planta transgénica que se reclama en la reivindicación 21.