JP2024516323A - プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用 - Google Patents

プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関する。雑草の防除方法は、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤を、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４は、ＰＰＯ阻害除草剤に対して高い耐性を有する。また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む植物は、ＰＰＯ阻害除草剤に対して強い耐性を有し、圃場濃度４倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルおよびフルミオキサジン、ならびに圃場濃度２倍のスルフェントラゾンの、ほとんど全てに対して高い抵抗性を示す。したがって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼには、植物における広域施用の見込みがある。

Description

本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関し、特に原核生物に由来するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを用いて、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与する方法、およびその使用に関する。
ポルフィリンの生合成経路は、植物代謝で重要な役割を果たすクロロフィルおよびヘムの合成に用いられ、この経路は葉緑体で生じる。この経路では、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（ｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎｏｇｅｎ ｏｘｉｄａｓｅ：ＰＰＯ）が、プロトポルフィリノーゲンＩＸのプロトポルフィリンＩＸへの酸化を触媒する。プロトポルフィリンＩＸが生成された後、マグネシウムケラターゼによってプロトポルフィリンＩＸがマグネシウムと結合してクロロフィルが合成されるか、あるいは、フェロケラターゼによってプロトポルフィリンＩＸが鉄と結合してヘムが合成される。
ＰＰＯを阻害することによって作用する除草剤としては、主にジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類、トリアジノン類などの種類のＰＰＯ阻害除草剤が挙げられる。植物において、ＰＰＯ阻害剤はＰＰＯの酵素活性を阻害し、その結果、クロロフィルとヘムの合成が阻害され、基質であるプロトポルフィリノーゲンＩＸが蓄積する。蓄積したプロトポルフィリノーゲンＩＸは、葉緑体から細胞質へ速やかに輸送され、そこでプロトポルフィリノーゲンＩＸは非酵素的反応でプロトポルフィリンＩＸに変換される。プロトポルフィリンＩＸは、光と酸素分子の存在下で、さらに反応性の高い一重項酸素（１Ｏ２）を形成し、それにより細胞膜に損傷を与え、植物細胞を速やかに死に至らしめる。
ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物を提供する方法としては、主に以下のものが挙げられる。１）除草剤またはその活性代謝物を無毒性産物に変換する酵素で除草剤を無毒化する。２）感受性ＰＰＯを過剰発現させることによって、除草剤に対して十分な量の標的酵素を植物体内で生成し、この酵素の動力学定数を考慮したうえで、阻害剤が存在しても機能的酵素を十分に利用できるようにする。３）除草剤またはその活性代謝物に対する感受性が低く、プロトポルフィリノーゲンＩＸのプロトポルフィリンＩＸへの酸化を触媒する能力を保持している機能性ＰＰＯを提供する。機能性ＰＰＯに関しては、一定の機能性ＰＰＯ酵素が、いくつかのＰＰＯ阻害除草剤に対して有用なレベルの耐性を提供する可能性があるものの、その同じ機能性ＰＰＯは、より望ましい異なるＰＰＯ阻害除草剤に対して、商業レベルの耐性を提供するには全く不十分である可能性がある。例えば、各ＰＰＯ阻害除草剤については、防除する雑草のスペクトル、それぞれの製造コスト、および環境面でのそれぞれの利点が異なる可能性がある。したがって、様々な作物および作物品種群にＰＰＯ阻害除草剤耐性を付与する新規な方法が必要とされている。
本発明の目的は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供することである。当該プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは原核生物に由来し、本発明によるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列で形質転換した植物は、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性が良好である。
上記の目的を達成するために、本発明は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤を施用することを含む雑草の防除方法を提供する。当該方法において、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）、キビ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、ミナトカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、ヒヨコマメ（ｃｉｃｅｒ ａｒｉｅｔｉｎｕｍ）、ピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）であり、さらに好ましくは、遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
（ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
（ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列。
さらに、遺伝子導入植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列とは異なる、第２の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドをさらに含む。
第２のポリヌクレオチドは、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および／または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードする。
特に、第２のポリヌクレオチドは、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および／またはチトクロム様タンパク質をコードする。
あるいは、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤には、さらに、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤および／または出芽後選択的除草剤が含まれてもよい。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、ＰＰＯ阻害除草剤および少なくとも１つの遺伝子導入植物を含む、雑草の成長を抑制するための植栽組合せを提供する。ここで、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用され、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、雑草はグリホサート抵抗性雑草である。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
（ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
（ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列。
さらに、遺伝子導入植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列とは異なる、第２の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドをさらに含む。
第２のポリヌクレオチドは、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および／または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードする。
特に、第２のポリヌクレオチドは、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および／またはチトクロム様タンパク質をコードする。
あるいは、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤には、さらに、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤および／または出芽後選択的除草剤が含まれてもよい。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生方法を提供する。当該方法は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を植物のゲノムに導入することを含み、有効量のＰＰＯ阻害剤を含む除草剤が、少なくとも前記植物が存在する圃場に施用された場合に、前記植物は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。ここで、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、前記導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含む。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物の栽培方法を提供し、その栽培方法は、
植物繁殖体であって、前記植物繁殖体は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する、植物繁殖体を、少なくとも１つ植栽することと、
前記植物繁殖体を植物に成長させることと、
有効量のＰＰＯ阻害剤を含む除草剤を、少なくとも前記植物を含む圃場に施用し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い前記植物を収穫することと
を含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、ＰＰＯ阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、または、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための方法を提供する。当該方法は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含む除草剤を施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
上記の目的を達成するために、本発明はさらに、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供し、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
より好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する。
さらに好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択される。
好ましくは、植物にＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤を施用することを含み、遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。
好ましくは、植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナである。
好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含む。
さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む。
好ましくは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのポリヌクレオチド配列は、以下を含む。
（ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
（ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列。
具体的な実施形態として、ＰＰＯ阻害除草剤（ＰＰＯ阻害剤類の除草剤としても既知である）は、以下に限定されないが、ジフェニルエーテル類（クロルニトロフェン、クロメトキシフェン、ビフェノックス、オキシフルオルフェン、アシフルオルフェン、その塩およびエステル、ホメサフェン、ラクトフェン、フルオログリコフェンエチル、エトキシフェンエチル、アクロニフェン、ビフェノックス、エトキシフェン、クロリントロフェン（ｃｈｌｏｒｉｎｔｒｏｆｅｎ）、およびハロサフェン）、オキサジアゾロン類（オキサジアゾンおよびオキサジアルギル）、Ｎ－フェニルフタルイミド類（フルミオキサジン、フルミクロラックペンチル、およびシニドンエチル）、オキサゾリノン類（ペントキサゾン）、フェニルピラゾール類（フルアゾレートおよびピラフルフェンエチル）、ウラシル類（ベンズフェンジゾン、ブタフェナシル、およびサフルフェナシル）、チアジアゾール類（チジアジミンおよびフルチアセット）、トリアゾリノン類（アザフェニジン、スルフェントラゾン、およびカルフェントラゾン）、トリアジノン類（トリフルジモキサジン）、ならびにその他（フルフェンピルエチルおよびピラクロニル）からなる群から選択される１つまたは複数であってもよい。
本明細書において、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例えば、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つまたは複数の要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（構成要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ））を意味する。さらに、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形語は、記載された要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群を含むことを意味するが、他のいかなる要素、整数もしくは工程、または、要素、整数もしくは工程の群も除外することを意味しないと理解すべきである。
本明細書において、「除草剤非感受性」という用語は、１つまたは複数のＰＰＯ除草剤の存在下でも、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼがその酵素活性の少なくとも一部を維持する能力を意味する。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの酵素活性は、当技術分野で既知の任意の手段によって測定することができ、例えば、１つまたは複数のＰＰＯ除草剤の存在下でのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの産物の生成、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの基質の消費を、蛍光、高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、または質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）により測定するアッセイによって、測定することができる。「除草剤非感受性」とは、特定の除草剤に対する完全または部分的な非感受性であってもよく、特定のＰＰＯ除草剤に対する耐性または非感受性の割合（％）で表されてもよい。
本明細書において、「植物、種子、植物組織もしくは細胞の除草剤耐性」または「除草剤耐性の植物、種子、植物組織もしくは細胞」という用語は、施用された除草剤の効果に抵抗する植物、種子、植物組織または細胞の能力を指す。例えば、除草剤耐性植物は、除草剤の存在下でも生き延び、または成長し続けることができる。植物、種子、植物組織または細胞の除草剤耐性は、植物、種子、植物組織、または細胞を、適切な対照と比較することによって評価することができる。例えば、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む植物（試験植物）と、除草剤耐性を付与することができるタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含まない植物（対照植物）とに除草剤を施用し、次いでそれら２つの植物の損傷を比較することによって、除草剤耐性を評価および判定することができ、試験植物の除草剤耐性は、対照植物と比較した損傷率の低減度によって表される。除草剤耐性の植物、種子、植物組織または細胞は、対照の植物、種子、植物組織または細胞と比較して、除草剤の毒性効果に対する反応が低減する。「除草剤耐性形質」という用語は、野生型植物と比較して改善された除草剤耐性を、植物に付与する遺伝子導入形質である。本発明の除草剤耐性形質を用いて生成し得る植物としては、例えば、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、およびシロイヌナズナなどの作物植物を含む任意の植物を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ分子は、特に、ＤＮＡ操作に有用な配列（制限酵素認識部位、または、組換えに基づいたクローニング部位など）、植物に好ましい配列（植物コドン使用またはコザックコンセンサス配列など）、またはＤＮＡ構築物設計に有用な配列（スペーサー配列またはリンカー配列など）を提供することが望ましい場合、当技術分野で既知の方法によって、完全あるいは部分的に合成および改変されてもよい。本発明には、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、および少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、好ましくはタンパク質が含まれる。「配列同一性割合」または「配列同一性％」という用語は、参照配列もしくはクエリー配列（またはその相補鎖）と、試験配列（またはその相補鎖）とを整列させた場合に、試験配列（またはその相補鎖）と比較した参照配列もしくはクエリー配列（またはその相補鎖）のタンパク質配列における同一アミノ酸の割合を指す。配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知であり、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）によるＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈら（１９８１）によるＡｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカルアラインメントアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）によるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３のグローバルアライメントアルゴリズム、ならびに、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７において修正された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４のアルゴリズムなどの数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装を配列の比較に利用して、配列同一性を決定することができる。このような実装としては、以下に限定されないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）のＡＬＩＧＮプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）ならびにＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。配列同一性割合は、同一性比率に１００を掛けたものとして表される。
本明細書において、オキシフルオルフェンは、無色結晶固体である２－クロロ－１－（３－エトキシ－４－ニトロフェノキシ）－４－トリフルオロメチルベンゼンを指す。オキシフルオルフェンは、ジフェニルエーテル類の超低用量の選択的、出芽前および出芽後の接触性ＰＰＯ阻害除草剤であり、乳化可能な濃縮物として施用することができる。雑草は、主に、子葉鞘および中胚軸を通して除草剤を吸収することにより、枯死する。オキシフルオルフェンは、イネ、ダイズ、トウモロコシ、ワタ、野菜、ブドウ、果樹などの作物の圃場の雑草を、効果的に防除することができる。防除することができる雑草には、以下に限定されないが、単子葉植物および広葉雑草のイヌビエ（Ｂａｒｎｙａｒｄ ｇｒａｓｓ）、キバナツノクサネム（Ｓｅｓｂａｎｉａ ｃａｎｎａｂｉｎａ）、ウマノチャヒキ（Ｂｒｏｍｕｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ）、ヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、シバムギ（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｒｅｐｅｎｓ）、ブタクサ（Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）、アメリカキンゴジカ（Ｓｉｄａ ｓｐｉｎｏｓａ）、イチビ（Ａｂｕｔｉｌｏｎｏｐｈｒａｓｔｉ）およびノハラガラシ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｋａｂｅｒ）が含まれる。
本明細書において、オキシフルオルフェンの有効量とは、１８０から７２０ｇ ａｉ／ｈａまでの範囲の量、例えば、１９０から７００ｇ ａｉ／ｈａまで、２５０から６５０ｇ ａｉ／ｈａまで、３００から６００ｇ ａｉ／ｈａまで、または４００から５００ｇ ａｉ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本明細書において、サフルフェナシルは、淡褐色の押出し粒状固体であるＮ’－［２－クロロ－４－フルオロ－５－（３－メチル－２，６－ジオキソ－４－（トリフルオロメチル）－３，６－ジヒドロ－１（２Ｈ）－ピリミジン）ベンゾイル］－Ｎ－イソプロピル－Ｎ－メチルスルファミドを指す。サフルフェナシルは、ウラシル類の滅菌ＰＰＯ阻害除草剤に属し、７０％水分散性粒剤とすることができる。サフルフェナシルは、グリホサート、アセト乳酸合成酵素（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＡＬＳ）、およびトリアジンに対して抵抗性のあるものなど、様々な広葉雑草に対して有効であり、枯死効果が早く、土壌において残留物の分解が早いという特徴がある。
本明細書において、サフルフェナシルの有効量とは、２５から１００ｇ ａｉ／ｈａまでの範囲の量、例えば、３０から９５ｇ ａｉ／ｈａまで、４０から９０ｇ ａｉ／ｈａまで、５０から８５ｇ ａｉ／ｈａまで、または６０から８０ｇ ａｉ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本明細書において、フルミオキサジンとは、２－［７－フルオロ－３，４－ジヒドロ－３－オキソ－４－（２－プロピニル）－２Ｈ－１，４－ベンゾオキサジン－６－イル］－４，５，６，７－テトラヒドロ－１Ｈ－イソインドール－１，３（２Ｈ）－ジオンを指す。フルミオキサジンは、Ｎ－フェニルフタルイミド類のＰＰＯ阻害除草剤であり、実生や葉によって吸収され、通常、水和剤５０％およびＳＣ剤（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）４８％の剤形で施用される。フルミオキサジンは、一年生広葉雑草、および一部のイネ科雑草を効果的に防除することができる。フルミオキサジンは環境中で分解されやすく、後作物に安全である。
本明細書において、フルミオキサジンの有効量とは、６０から２４０ｇ ａｉ／ｈａまでの範囲の量、例えば、７０から２２０ｇ ａｉ／ｈａまで、８５から２００ｇ ａｉ／ｈａまで、９０から１８５ｇ ａｉ／ｈａまで、または１００から１５０ｇ ａｉ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本明細書において、スルフェントラゾンとは、褐色固体であるＮ－（２，４－ジクロロ－５－（４－ジフルオロメチル－４，５－ジヒドロ－３－メチル－５－オキソ－１Ｈ－１，２，４－トリアゾール－１－イル）フェニル）メタンスルホンアミドを指す。スルフェントラゾンは、通常、３８．９％および４４．５％のＳＣ剤の剤形であるトリアゾリノン類のＰＰＯ阻害除草剤である。スルフェントラゾンは、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、ピーナッツなどの圃場において、とりわけ一年生広葉雑草、イネ科雑草、および、アサガオ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｎｉｌ）、アオゲイトウ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ ｒｅｔｒｏｆｌｅｘｕｓ）、シロザ（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ）、ヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ）、オニメヒシバ（Ｄｉｇｉｔａｒｉａ ｓａｎｇｕｉｎａｌｉｓ）、エノコログサ（Ｓｅｔａｒｉａ ｖｉｒｉｄｉｓ）、オナモミ（Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｔｒｕｍａｒｉｕｍ）、オヒシバ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｉｎｄｉｃａ Ｇａｅｒｔｎ）、ハマスゲ（Ｃｙｐｅｒｕｓ ｒｏｔｕｎｄｕｓ）などのカヤツリグサ科の防除に用いることができる。
本明細書において、スルフェントラゾンの有効量とは、４５０から９００ｇ ａｉ／ｈａまでの範囲の量、例えば、５００から８５０ｇ ａｉ／ｈａまで、５５０から７００ｇ ａｉ／ｈａまで、５００から６８５ｇ ａｉ／ｈａまで、または５００から６５０ｇ ａｉ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本明細書において、「抵抗性」という用語は、遺伝性であり、通常の除草剤での効果的な処理が所与の植物に行われる状況下でも、植物が成長し繁殖することを可能にする。当業者によって認識されるように、除草剤で処理された所与の植物に、ある程度の損傷（小さな壊死、溶解または白化などの損傷）があっても、少なくとも収量が著しく損なわれていなければ、植物は依然として「抵抗性である」とみなすことができる。言い換えれば、所与の植物は、除草剤によって誘発される様々な程度の損傷に抵抗する能力を高めており、一般に、同じ遺伝子型を持つ野生型植物に対しては、同じ用量の除草剤で損傷を生じさせることができる。本発明における「耐性の」または「耐性」という用語は、「抵抗性」という用語よりも広義であり、「抵抗性」を含む。
本明細書において、生物的ストレス抵抗性タンパク質とは、他の生物から強いられるストレスに抵抗するタンパク質、例えば、昆虫抵抗性タンパク質ならびに（ウイルス、細菌、真菌および線虫の）病害抵抗性タンパク質を指す。
本明細書において、非生物的ストレス抵抗性タンパク質とは、外部環境から強いられるストレスに抵抗するタンパク質、例えば、除草剤、乾燥、熱、寒冷、霜、塩ストレス、酸化ストレスなどに対して耐性のあるタンパク質を指す。
本明細書において、植物品質に影響を及ぼすタンパク質とは、例えば、デンプン、油、ビタミンなどの品質および含量を向上させるタンパク質、繊維品質を向上させるタンパク質など、植物産物形質に影響を及ぼすタンパク質を指す。
また、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、植物において除草剤耐性遺伝子をコードする少なくとも１つのタンパク質とともに発現させることもできる。除草剤耐性タンパク質には、以下に限定されないが、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素（５－ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＥＰＳＰＳ）、グリホサート酸化還元酵素（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＧＯＸ）、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＧＡＴ）、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素（ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＰＡＴ）、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ（ａｌｐｈａ－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＡＡＤ）、ジカンバモノオキシゲナーゼ（ｄｉｃａｍｂａ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＤＭＯ）、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（４－ｈｙｄｒｏｘｙ ｐｈｅｎｙｌ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＨＰＰＤ）、アセト乳酸合成酵素（ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＡＬＳ）、および／またはチトクロム様タンパク質（Ｐ４５０）が含まれる。
本明細書において、「グリホサート」とは、Ｎ－ホスホノメチルグリシンおよびその塩を指し、「グリホサート除草剤」での処理とは、グリホサートを含有する任意の除草剤製剤による処理を指す。グリホサートの市販製剤としては、以下に限定されないが、ラウンドアップ（ＲＯＵＮＤＵＰ）（登録商標）（イソプロピルアンモニウム塩であるグリホサート）、ラウンドアップ（登録商標）ウェザーマックス（ＷＥＡＴＨＥＲＭＡＸ）（カリウム塩であるグリホサート）；ラウンドアップ（登録商標）ドライ（ＤＲＹ）およびライバル（ＲＩＶＡＬ）（登録商標）（アンモニウム塩であるグリホサート）；ラウンドアップ（登録商標）ジオフォース（ＧＥＯＦＯＲＣＥ）（ナトリウム塩であるグリホサート）；およびタッチダウン（ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ）（登録商標））（トリメチルスルホニウム塩であるグリホサート）が挙げられる。
本明細書において、グリホサートの有効量とは、２００から１６００ｇ ａｅ／ｈａまでの範囲の量、例えば、２５０から１６００ｇ ａｅ／ｈａまで、３００から１６００ｇ ａｅ／ｈａまで、５００から１６００ｇ ａｅ／ｈａまで、８００から１５００ｇ ａｅ／ｈａまで、１０００から１５００ｇ ａｅ／ｈａまで、８００から１５００ｇ ａｅ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本明細書において、「グルホシネート」はホスフィノトリシンとしても既知であり、２－アミノ－４－［ヒドロキシ（メチル）ホスホリル］ブタン酸アンモニウムを指し、「グルホシネート除草剤」による処理とは、グルホシネートを含有する任意の除草剤製剤による処理を指す。
本明細書において、グルホシネートの有効量とは、２００から８００ｇ ａｅ／ｈａまでの範囲の量、例えば、２００から７５０ｇ ａｅ／ｈａまで、２５０から７００ｇ ａｅ／ｈａまで、３００から７００ｇ ａｅ／ｈａまで、３５０から６５０ｇ ａｅ／ｈａまで、または４００から６００ｇ ａｅ／ｈａまでで用いられることを意味する。
本発明において、オーキシン様除草剤は、オーキシンと呼ばれる天然の植物成長調節因子を模倣するか、そのように作用する。オーキシン様除草剤は、細胞壁の可塑性や核酸代謝に影響を及ぼし、それにより、細胞分裂や成長を抑制不能にすることができる。オーキシン様除草剤によって生じる傷害症状としては、茎および葉柄の上偏生長屈曲およびねじれ、葉の陥凹および湾曲、ならびに、葉形および葉脈の異常が挙げられる。オーキシン様除草剤としては、以下に限定されないが、フェノキシカルボン酸化合物、安息香酸化合物、ピリジンカルボン酸化合物、キノリンカルボン酸化合物、およびベナゾリンエチル化合物が挙げられる。通常、オーキシン様除草剤は、ジカンバ、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：２，４－Ｄ）、（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）酢酸（４－ｃｈｌｏｒｏ－２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＭＣＰＡ）、および／または４－（２，４－ジクロロフェノキシ）酪酸（４－（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：２，４－ＤＢ）である。
本明細書において「ジカンバ」とは、３，６－ジクロロ－ｏ－アニス酸または３，６－ジクロロ－２－メトキシ安息香酸、ならびにその酸および塩を指す。その塩としては、イソプロピルアミン、ジグリコールアミン、ジメチルアミン、カリウムおよびナトリウムの塩が挙げられる。ジカンバの市販製剤としては、以下に限定されないが、Ｂａｎｖｅｌ（登録商標）、（ＤＭＡ塩）、Ｃｌａｒｉｔｙ（登録商標）（ＤＧＡ塩、ＢＡＳＦ）、ＶＥＬ－５８－－ＣＳ－１１（商標）、およびＶａｎｑｕｉｓｈ（登録商標）（ＤＧＡ塩、ＢＡＳＦ）が挙げられる。
本発明における２，４－Ｄは、広域スペクトルの比較的安価で強力な広葉除草剤であり、農業および非作物の条件下で６５年超にわたって、広域スペクトル広葉樹雑草防除に用いられてきた。２，４－Ｄは、植物によって選択性のレベルが異なる（例えば、双子葉植物はイネ科植物よりも感受性が高い）。普通、植物は２，４－Ｄをゆっくりと代謝するので、標的部位の活性の違いによって２，４－Ｄに対する植物の反応の違いが説明できる可能性が高い。２，４－Ｄの植物代謝は、一般に、２段階の代謝、すなわち、普通はヒドロキシル化の後に、アミノ酸またはグルコースに結合するという２段階の代謝によってなされる。
本発明における発芽前の選択的除草剤としては、以下に限定されないが、アセトアニリド、アセトクロル、アセト乳酸合成酵素阻害剤、およびジニトロアニリンが挙げられる。
本発明における発芽後の選択的除草剤としては、以下に限定されないが、ニコスルフロン、リムスルフロン、およびキザロホップ－ｐ－エチルが挙げられる。
本発明における除草剤の施用量は、土壌構造、ｐＨ値、有機物含量、営農体系、および雑草のサイズによって異なり、除草剤のラベルに記載の除草剤の適正施用量を確認して決定する。
本明細書において、「付与する」という用語は、特性または形質、例えば除草剤耐性および／またはその他の望ましい形質を、植物に提供することを指す。
本明細書において、「異種」という用語は、別の供給源からのものを意味する。ＤＮＡの文脈では、「異種」とは、同じ種の別の植物からのものを含め、外来の任意の「非自己」ＤＮＡを指す。例えば、本発明では、遺伝子導入法によりダイズ植物で発現させることができるダイズＨＰＰＤ遺伝子は、やはり「異種」ＤＮＡとみなされる。
本明細書において、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを含み、特に明記しない限り、天然ヌクレオチドの本質的特性を有し、天然起源のヌクレオチドと同様の様式で一本鎖の核酸にハイブリダイズする既知の類似体（例えばペプチド核酸）を包含する。
本明細書において、「コードする」または「コードされた」という用語は、特定の核酸の文脈で用いられる場合、ヌクレオチド配列の特定のタンパク質への翻訳を指示するために、核酸が必要な情報を含むことを意味する。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって特定される。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えばイントロン）を含んでいてもよいし、（例えばｃＤＮＡでのように）そのような介在非翻訳配列がなくてもよい。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列は、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列を含まない同種の植物（対照植物）と比較して、複数のＰＰＯ阻害除草剤に対してより良好な耐性を提示する本発明の植物、植物細胞および種子の提供に用いられる。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生に有用である。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、植物に除草剤耐性を付与するための植物における発現に特に適している。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然起源のアミノ酸ポリマーに適用される。本発明のポリペプチドは、本明細書に開示の核酸から、または標準的な分子生物学的技術によって、生成することができる。例えば、本発明の切断タンパク質は、適切な宿主細胞における本発明の組換え核酸の発現によって、あるいは、プロテアーゼ消化および精製などの、ｅｘ ｖｉｖｏ手順の組合せによって生成することができる。
本発明はまた、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを含む核酸分子を提供する。一般に、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに対して１つまたは複数の保存的アミノ酸置換体を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする任意のポリヌクレオチド配列を含む。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換体は、当技術分野で周知である。次の５つの群はそれぞれ、互いに保存的置換体であるアミノ酸を含んでいる。脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｉ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
したがって、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ阻害除草剤に対する耐性活性を有し、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子と厳密な条件下でハイブリダイズする配列は、本発明に含まれる。例示的な配列は、本発明の配列番号２９～４２および配列番号６２～６４と少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を含む。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、配列番号１５～２８を含まない。
任意の従来の核酸ハイブリダイゼーション法または核酸増幅法を用いて、本発明のＰＰＯ遺伝子の存在を特定することができる。核酸分子またはその断片は、ある状況下で、他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。本発明において、２つの核酸分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することができれば、これら２つの核酸分子は、互いに特異的にハイブリダイズし得るとみなすことができる。２つの核酸分子が完全な相補性を示せば、２つのうち一方の核酸分子は、他方の核酸分子の「相補体」であると言う。本発明では、核酸分子の各ヌクレオチドが別の核酸分子の対応するヌクレオチドと相補的である場合、これら２つの核酸分子は「完全相補性」を示すと言う。２つの核酸分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「最小相補的」であると言う。同様に、２つの核酸分子が、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールし結合するのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができれば、これら２つの核酸分子は「相補的」であると言う。完全相補性からのずれは、このずれによって２分子が二本鎖構造を形成することを完全に妨げられない限り、許容される。核酸分子をプライマーやプローブとして作用可能にするためには、特定の溶媒と塩濃度の条件下で安定した二本鎖構造が形成されるように、分子がその配列において十分な相補性を有することを確保するだけである。
本発明において、実質的に相同な配列とは、高ストリンジェンシー条件下で、適合した核酸分子の相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる核酸分子のことである。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は当業者に周知であり、例えば、適切なストリンジェントな条件は、約４５℃の条件下で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）で処理し、次いで５０℃の条件下、２．０×ＳＳＣで洗浄することによって達成され得る。例えば、洗浄工程における塩濃度は、約２．０×ＳＳＣで５０℃の低ストリンジェンシー条件から、約０．２×ＳＳＣで５０℃の高ストリンジェンシー条件までで選択することができる。また、洗浄工程の温度条件は、室温（約２２℃）の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇させることができる。温度条件と塩濃度のどちらも変えることができ、その２つのうちの一方を変えずに、他方を変えることも可能である。好ましくは、本発明におけるストリンジェントな条件は、６５℃の６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ溶液中で、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズさせ、次いで、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、および１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで１回ずつ、膜を洗浄することによって達成され得る。
本明細書において、「ハイブリダイズする」または「特異的にハイブリダイズする」という用語は、複雑な混合物（例えば全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡの中に特定のポリヌクレオチド配列が存在する場合に、ストリンジェントな条件下で、その配列のみに分子が結合、二本鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。
遺伝コドンの縮重により、様々な異なるＤＮＡ配列が同じアミノ酸配列をコードしてもよい。同じまたは実質的に同じタンパク質をコードするこれらの代替ＤＮＡ配列を生成することは、当業者の技術範囲内である。これらの異なるＤＮＡ配列は、本発明の範囲に含まれる。「実質的に同じ」配列とは、除草剤耐性活性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を有する配列を指し、除草剤耐性活性を保持している断片を含む。
本発明における「機能的活性」または「活性」という用語は、本発明で用いるタンパク質／酵素が（単独で、または他のタンパク質と組み合わさって）除草剤を分解する能力、または除草剤活性を低下させる能力を有することを意味する。本発明のタンパク質を生成する植物は、好ましくは「有効量」の当該タンパク質を生成し、そのため、除草剤で植物を処理する場合、当該タンパク質の発現レベルは、（特に明記しない限り、一般的な量で）除草剤に対する完全または部分的な耐性を前記植物に付与するのに十分である。除草剤は、標的植物を普通は枯死させる量、または通常の圃場の量および濃度で用いることができる。好ましくは、本発明の植物細胞および植物は、除草剤を用いた処理によって生じる成長抑制または損傷から保護される。本発明の形質転換された植物および植物細胞は、好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性があり、すなわち、形質転換された植物および植物細胞は、有効量のＰＰＯ阻害除草剤の存在下で成長することができる。
本発明における遺伝子およびタンパク質は、特定の例示的な配列を含むだけでなく、その特定の例示的なタンパク質に特徴的な活性を保持する部分および／または断片（全長タンパク質と比較した場合の内部欠失および／または末端欠失を含む）、変異体、突然変異体、変異タンパク質、置換体（置換アミノ酸を有するタンパク質）、キメラ、および融合タンパク質を含む。
本発明における「変異体」という用語は、実質的に同様の配列を意味することを意図している。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、参照ポリヌクレオチド内の１つまたは複数の内部部位における１つまたは複数のヌクレオチドの欠失および／または付加、ならびに／または、除草剤耐性遺伝子の１つまたは複数の部位における１つまたは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書において、「参照のポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語はそれぞれ、除草剤耐性のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。本明細書において、「天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチド」という用語はそれぞれ、天然起源のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。核酸分子の場合、保存的変異体には、遺伝コードの縮重により、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの１つをコードする複数のポリヌクレオチド配列が含まれる。上記のような天然起源の対立遺伝子変異体は、周知の分子生物学的技術を用いて、例えば、下記に概説するポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術を用いて特定することができる。変異核酸分子には、合成的に誘導された核酸分子も含まれ、例えば、部位指定突然変異誘発法を用いて産生されてもなお、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのヌクレオチド配列をコードしているものなどがある。一般に、本発明の特定の核酸分子の変異体は、配列アラインメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるその特定の核酸分子と、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することになる。
本発明における「変異タンパク質」とは、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの１つまたは複数の内部部位における１つまたは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加、および／またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの１つまたは複数の部位における１つまたは複数のアミノ酸の置換によって、参照タンパク質から誘導されるタンパク質を意味することを意図している。本発明に包含される変異タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの所望の生物活性、すなわち、本明細書に記載するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性および／または除草剤耐性を引き続き有している。このような変異体は、例えば遺伝子多型または人為的な操作によって生じてもよい。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの生物学的に活性な変異体は、配列アラインメントのプログラムおよびパラメータによって決定されるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼのアミノ酸配列全体と、少なくとも約８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有することになる。本発明のタンパク質の生物学的に活性な変異体は、本発明のタンパク質と、わずか１～１５個のアミノ酸残基、わずか１～１０個のアミノ酸残基、例えば６～１０個、わずか５個、わずか４個、３個、２個、またはただ１個のアミノ酸残基の数だけ異なっていてもよい。
ある実施例では、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異体のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするヌクレオチド配列を、所望の形質を有する植物を作製するために、目的のヌクレオチド配列の任意の組合せとスタッキングすることができる。「形質」という用語は、特定の配列または配列群に由来する表現形質を指す。例えば、当該アミノ酸／本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異体をコードするポリヌクレオチドは、望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする任意の他のヌクレオチドとスタッキングしてもよい。望ましい形質としては、以下に限定されないが、病害、昆虫および除草剤に対する抵抗性、熱および干ばつに対する耐性、作物の成熟までの期間の短縮、例えばデンプンまたはバイオマスを発酵可能な糖に変換するための工業的処理の改善、ならびに、例えば、油分およびタンパク質を高含量にするといった農学的品質の向上が挙げられる。
防除される雑草のスペクトルの向上、および／または、天然でより耐性のある種もしくは抵抗性のある雑草種の防除において、２つ以上の作用機序を組み合わせる利点を、ＰＰＯ耐性作物の他に、人為的方法（遺伝子導入または非遺伝子導入のいずれか）によって作物の除草剤耐性を可能にした化学物質にも拡大適用し得ることは、当業者に周知である。実際、以下の抵抗因子をコードする形質を単独で、または複数の組合せで重ね合わせて、除草剤に対する雑草の変化を効果的に防除または防止する能力を提供することができる。上記の抵抗因子とは、グリホサート抵抗因子（抵抗性植物または細菌からのＥＰＳＰＳ、ＧＯＸ、およびＧＡＴなど）、グルホシネート抵抗因子（ＰＡＴおよびＢａｒなど）、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害剤に対する除草剤抵抗因子（イミダゾリノン、スルホニル尿素、トリアゾールピリミジン、スルホン化アニリン、ピリミジニルチオ安息香酸などの化学物質の抵抗性遺伝子など、例えば、ＡＨＡＳ、Ｃｓｒｌ、およびＳｕｒＡ）、フェノキシオーキシン除草剤抵抗因子（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ－１２（ＡＡＤ－１２）など）、ジカンバ除草剤抵抗因子（ジカンバモノオキシゲナーゼ（ＤＭＯ）など）、ブロモキシニル抵抗因子（Ｂｘｎなど）、フィトエン不飽和化酵素（ｐｈｙｔｏｅｎｅ ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ：ＰＤＳ）阻害剤抵抗因子、光化学系ＩＩ阻害剤に対する除草剤抵抗因子（ｐｓｂＡなど）、光化学系Ｉ阻害剤に対する除草剤抵抗因子、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤に対する除草剤抵抗因子（ＰＰＯ－１など）、フェニル尿素除草剤抵抗因子（ＣＹＰ７６Ｂ１など）、およびジクロロメトキシ安息香酸分解酵素である。
グリホサートは、非常に広域なスペクトルの広葉およびイネ科の雑草種を防除するので、広く用いられている。しかし、グリホサート耐性作物および非作物への施用においてグリホサートを繰り返し用いることにより、雑草が、天然でより耐性のある種やグリホサート抵抗性バイオタイプに変化している（引き続きそうである）。ほとんどの除草剤抵抗性管理プログラムでは、抵抗性雑草の出芽を遅らせる手段として、タンク混合された除草剤類を有効量用いることが提案されており、前記除草剤類とは、同じ種を防除するものの、作用機序が異なるものである。本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子とグリホサート耐性形質（および／または他の除草剤耐性形質）とを重ね合わせることによって、グリホサート耐性作物において、グリホサート除草剤およびＰＰＯ阻害除草剤（オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、およびフルミオキサジンなど）の同作物における選択的使用を可能にすることにより、グリホサート抵抗性雑草種（１つまたは複数のＰＰＯ阻害除草剤によって防除される広葉雑草種）の防除を達成することができる。これらの除草剤は、作用機序の異なる２つ以上の除草剤を含有するタンク混合物で同時に施用することができ、または、単一の除草剤組成物において単独の逐次施用で（例えば、植栽前、または出芽前もしくは出芽後）（２時間から３ヶ月の範囲の施用間隔で）施用することができる。あるいは、これらの除草剤の施用は、施用可能な各化合物カテゴリーを代表する任意の数の除草剤を、任意の時期（作物の植栽後７ヶ月から、作物が収穫される時期（または、単一の除草剤については収穫前の間隔で、最も短い間隔））に組み合わせて用いることにより、施用することができる。
広葉雑草の防除においては、施用時期、単一除草剤の施用量、頑固な雑草または抵抗性雑草を防除する能力の点から、柔軟性が非常に重要である。グリホサート抵抗性遺伝子／本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子を重ねたグリホサートの作物における施用範囲は、２５０から２５００ｇ ａｅ／ｈａまでであり得る。ＰＰＯ阻害除草剤（１つまたは複数）の施用範囲は、１０から１０００ｇ ａｉ／ｈａまでであり得る。これらの施用に最適な時期の組合せは、特定の条件、種および環境に依拠する。
除草剤製剤（例えば、エステル、酸もしくは塩の製剤、または可溶性濃縮物、乳化性濃縮物もしくは可溶性液体）、およびタンク混合添加剤（例えば、アジュバントまたは相溶化剤）が、所与の除草剤の雑草防除、または１つもしくは複数の除草剤を組み合わせた雑草防除に著しく影響を与える可能性がある。前述の除草剤のいずれかの任意の化学的組合せは、本発明の範囲内である。
また、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを、単独で、または除草剤抵抗性作物の他の特性とスタッキングされた状態でコードする遺伝子は、１つまたは複数の他の入力形質（例えば、昆虫抵抗性、真菌抵抗性、もしくはストレス耐性など）、または出力形質（例えば、収量の増加、油量の向上、繊維品質の向上など）とスタッキングされ得る。したがって、本発明を用いると、いかなる数の農業害虫をも柔軟かつ経済的に防除する能力で作物の品質を向上させるために、完全な農業解決策を提供することができる。
上記のスタッキングされた組合せは任意の方法によって作製することができ、その方法としては、以下に限定されないが、従来もしくはＴｏｐＣｒｏｓｓの方法論による交配植物、または遺伝子形質転換が挙げられる。遺伝的に植物を形質転換することによって配列をスタッキングする場合、目的のポリヌクレオチド配列はいつでも、どのような順序でも組み合わせることができる。例えば、１つまたは複数の所望の形質を含む遺伝子導入植物を標的として用い、その後の形質転換によってさらなる形質を導入することができる。その形質は、形質転換カセットの任意の組合せによって提供される目的のポリヌクレオチドと、共形質転換プロトコールで同時に導入することができる。例えば、２つの配列が導入される場合、それら２つの配列は別々の形質転換カセット（ｔｒａｎｓ）に含めることもできるし、または同じ形質転換カセット（ｃｉｓ）に含めることもできる。それらの配列の発現は、同じプロモーターまたは異なるプロモーターによって推進することができる。場合によっては、目的のポリヌクレオチドの発現を抑制する形質転換カセットを導入することが望ましいこともある。これを、他の抑制カセットまたは過剰発現カセットの任意の組合せと組み合わせて、植物において所望の形質の組合せを産生してもよい。さらに、部位特異的組換え系を用いると、所望のゲノム位置にポリヌクレオチド配列をスタッキングし得ることが認識されている。
本発明によるプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子は、ＰＰＯ阻害除草剤に対してより高い耐性を有し、このことは、除草剤耐性作物および選択性マーカー形質の可能性の重要な基礎となる。
本明細書における「発現カセット」という用語は、適切な宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の発現を指示することができる核酸分子を意味し、目的のポリヌクレオチド配列（すなわち、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド）に効果的に連結されるプロモーターを含み、その目的のポリヌクレオチド配列は、終結シグナルに効果的に連結される。コード領域は普通、目的のタンパク質についてコードするが、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡについても、センスまたはアンチセンスの方向でコードしてもよい。目的のポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、このことは、その構成要素の少なくとも１つが、他の構成要素の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然起源のものであってもよいが、異種発現に有用な組換え型で得られたものである。しかし、通常は、発現カセットは宿主に対して異種であり、すなわち、発現カセットの特定のＤＮＡ配列は、宿主細胞で天然に生じるのではなく、形質転換イベントによって新しい宿主細胞に導入されていなければならない。発現カセット中のポリヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、または、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。さらに、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官または発生段階に、特異的であり得る。
本発明は、目的のポリヌクレオチド（すなわち、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードし、またはプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ活性を保持するその変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、単独であるか、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子との組合せであるポリヌクレオチド）を発現することができる発現カセットを用いた植物の形質転換を包含する。発現カセットは、転写の５’－３’方向に、転写および翻訳の開始領域（すなわちプロモーター）ならびにポリヌクレオチド・オープン・リーディング・フレームを含むことになる。発現カセットは、任意選択で、植物において機能的な転写および翻訳の終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、発現カセットは、安定な形質転換体の選択を可能にする選択性マーカー遺伝子を含む。本発明の発現構築物はまた、リーダー配列、および／または目的のポリヌクレオチドの誘導性発現を可能にする配列を含んでもよい。
発現構築物の調節配列は、目的のポリヌクレオチドに効果的に連結される。本発明における調節配列には、以下に限定されないが、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーター、輸送ペプチド、ターミネーター、エンハンサー、リーダー配列、イントロンなどの調節配列が含まれる。
プロモーターは、植物発現性プロモーターである。「植物発現性プロモーター」とは、植物細胞において、そのプロモーターに連結されたコード配列の発現を確実にするプロモーターを指す。植物発現性プロモーターは、構成的プロモーターであり得る。植物において構成的発現を指示するプロモーターの例としては、以下に限定されないが、カリフラワー・モザイク・ウイルスに由来する３５Ｓプロモーター、トウモロコシＵｂｉプロモーター、イネＧＯＳ２遺伝子プロモーターなどが挙げられる。あるいは、植物発現性プロモーターは組織特異的プロモーターであり得、組織特異的プロモーターとは、すなわち、緑色組織などのいくつかの組織において、植物の他の組織よりも高いレベル（従来のＲＮＡ試験によって測定することができる）で、コード配列の発現を指示するプロモーターであり、例えば、ＰＥＰカルボキシラーゼプロモーターがある。あるいは、植物発現性プロモーターは、創傷誘導性プロモーターであり得る。創傷誘導性プロモーター、または創傷誘導性発現パターンを指示するプロモーターとは、力学的要因、または昆虫のかじり取りによって生じる創傷を植物が被った場合に、プロモーターの調節下にあるコード配列の発現が、通常の成長条件と比較して著しく向上することを意味する。創傷誘導性プロモーターの例としては、以下に限定されないが、ジャガイモおよびトマトのプロテアーゼ阻害遺伝子（ｐｉｎ Ｉおよびｐｉｎ ＩＩ）、ならびにトウモロコシのプロテアーゼ阻害遺伝子（ＭＰＩ）のプロモーターが挙げられる。
輸送ペプチド（分泌シグナル配列またはターゲティング配列としても既知である）は、遺伝子導入産物を特定のオルガネラまたは細胞コンパートメントに導く。レセプタータンパク質の場合、輸送ペプチドは異種であってもよく、例えば、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列を用いて葉緑体をターゲティングするもの、または「ＫＤＥＬ」保持配列を用いて小胞体をターゲティングするもの、またはオオムギの植物性凝集素遺伝子のＣＴＰＰを用いて液胞をターゲティングするものがある。
リーダー配列には、以下に限定されないが、ＥＭＣＶリーダー配列（脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）の５’非コード領域）などの小型ＲＮＡウイルスリーダー配列、ＭＤＭＶ（トウモロコシ矮性モザイクウイルス（Ｍａｉｚｅ Ｄｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）リーダー配列などのジャガイモウイルスＹ群リーダー配列、ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、アルファルファ・モザイク・ウイルス（ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）のコートタンパク質ｍＲＮＡの非翻訳リーダー配列（ＡＭＶ ＲＮＡ４）、およびタバコ・モザイク・ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＴＭＶ）リーダー配列が含まれる。
エンハンサーには、以下に限定されないが、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＣａＭＶ）エンハンサー、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルス（ｆｉｇｗｏｒｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＦＭＶ）エンハンサー、カーネーション・エッチドリング・ウイルス（ｃａｒｎａｔｉｏｎ ｅｔｃｈｅｄ ｒｉｎｇ ｖｉｒｕｓ：ＣＥＲＶ）エンハンサー、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ｃａｓｓａｖａ ｖｅｉｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＣｓＶＭＶ）エンハンサー、ミラビリス・モザイク・ウイルス（ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＭＭＶ）エンハンサー、ケストルム黄化葉巻ウイルス（ｃｅｓｔｒｕｍ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌｉｎｇ ｖｉｒｕｓ：ＣｍＹＬＣＶ）エンハンサー、ワタ葉巻Ｍｕｌｔａｎウイルス（ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ ｖｉｒｕｓ：ＣＬＣｕＭＶ）エンハンサー、ツユクサ黄色斑紋ウイルス（ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｙｅｌｌｏｗ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ：ＣｏＹＭＶ）エンハンサー、およびピーナッツクロロティック条斑カリモウイルス（ｐｅａｎｕｔ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｒｅａｋ ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ：ＰＣＬＳＶ）エンハンサーが含まれる。
単子葉植物で用いる場合、イントロンには、以下に限定されないが、トウモロコシｈｓｐ７０イントロン、トウモロコシ・ユビキチン・イントロン、Ａｄｈイントロン１、ショ糖合成酵素イントロン、またはイネＡｃｔ１イントロンが含まれる。双子葉植物で用いる場合、イントロンには、以下に限定されないが、ＣＡＴ－１イントロン、ｐＫＡＮＮＩＢＡＬイントロン、ＰＩＶ２イントロン、および「スーパーユビキチン」イントロンが含まれる。
ターミネーターは、植物において機能する適切なポリアデニル化シグナル配列であり得、適切なポリアデニル化シグナル配列には、以下に限定されないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ノパリン合成酵素（ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ：ＮＯＳ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、プロテアーゼ阻害剤ＩＩ（ｐｉｎＩＩ）遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、エンドウマメｓｓＲＵＢＩＳＣＯ Ｅ９遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列、およびα－チューブリン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列が含まれる。
本発明における「効果的に連結する」とは、核酸配列の一方が、それに連結された配列に必要な機能を提供することを可能にする核酸配列の結合を表す。本発明における「効果的な連結」により、プロモーターが目的の配列に連結することができ、その結果、目的の配列の転写がプロモーターによって制御および調節される。目的の配列がタンパク質をコードしており、そしてそのタンパク質の発現が所望される場合、「効果的に連結する」とは、結果として生じる転写物が効果的に翻訳されるような様式で、プロモーターが前記配列に連結されることを意味する。プロモーターのコード配列への連結が転写物融合であり、そしてコードされたタンパク質が発現される場合、そのような連結は、結果として生じる転写物の最初の翻訳開始コドンがコード配列の開始コドンであるように作製される。あるいは、プロモーターのコード配列への連結が翻訳融合であり、そしてコードされたタンパク質が発現される場合、そのような連結は、５’非翻訳配列に含まれる最初の翻訳開始コドンが、結果として生じる翻訳産物と所望のタンパク質をコードする翻訳オープン・リーディング・フレームとの関係がインフレームであるような様式で、プロモーターに連結されるように作製される。「効果的に連結され」得る核酸配列としては、以下に限定されないが、遺伝子発現機能を提供する配列（すなわち、プロモーター、５’非翻訳領域、イントロン、タンパク質コード領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化部位および／または転写ターミネーターなどの遺伝子発現エレメント）、ＤＮＡ転移および／または組込み機能を提供する配列（すなわち、Ｔ－ＤＮＡ境界配列、部位特異的リコンビナーゼ認識部位、およびインテグラーゼ認識部位）、選択的機能を提供する配列（すなわち、抗生物質抵抗性マーカーおよび生合成遺伝子）、マーカースコアリング機能を提供する配列、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの配列操作を補助する配列（すなわち、ポリリンカー配列および部位特異的組換え配列）、および複製機能を提供する配列（すなわち、細菌性複製起点、自己複製配列、およびセントロメア配列）が挙げられる。
本発明における植物、植物組織または植物細胞のゲノムとは、植物、植物組織または植物細胞の中の任意の遺伝物質を指し、細胞核、色素体およびミトコンドリアのゲノムを含む。
本明細書において、「植物部分」または「植物組織」という用語には、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物凝集塊、および、植物または植物の部分において無傷である植物細胞が含まれ、植物の部分としては、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、コブ、外皮、茎、根、根端、葯などがある。
本発明の突然変異ＰＰＯタンパク質は、様々な種類の植物に適用することができる。双子葉植物には、以下に限定されないが、アルファルファ、マメ、カリフラワー、キャベツ、ニンジン、セロリ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ズッキーニ、ダイコン、アブラナ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ、トマト、シロイヌナズナ、ピーナッツ、またはスイカが含まれる。好ましくは、双子葉植物は、キュウリ、ダイズ、シロイヌナズナ、タバコ、ワタ、アブラナを指す。単子葉植物には、以下に限定されないが、トウモロコシ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、キビ、サトウキビ、カラスムギ、またはシバクサが含まれる。好ましくは、単子葉植物は、トウモロコシ、イネ、モロコシ、コムギ、オオムギ、キビ、サトウキビ、またはカラスムギを指す。
本明細書において、「植物形質転換」という用語は、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする除草剤抵抗性または除草剤耐性の核酸分子を、単独で、または望ましい形質を付与するポリペプチドをコードする１つまたは複数の付加的な核酸分子と組み合わせて、発現系にクローニングした後、植物細胞に形質転換することを意味する。本発明のレセプターおよび標的発現カセットは、当技術分野で認識されている複数の手法で植物細胞に導入することができる。例えば、目的のヌクレオチド構築物であるポリヌクレオチドの文脈における「導入」という用語は、ポリヌクレオチドが植物の細胞内部に到達するような様式での、ポリヌクレオチドの植物への提示を意味することを意図している。２つ以上のポリヌクレオチドが導入される場合、これらのポリヌクレオチドを、単一のヌクレオチド構築物の一部として、または別々のヌクレオチド構築物として組み立てることができ、同じまたは異なる形質転換ベクターに配置することができる。したがって、これらのポリヌクレオチドは、単一の形質転換イベントにおいて、別々の形質転換イベントにおいて、または、例えば植物において育種プロトコールの一部として、目的の宿主細胞に導入することができる。本発明の方法は、１つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する特定の方法に依拠せず、（１つまたは複数の）ポリヌクレオチドが植物の少なくとも１つの細胞の内部に到達することのみに依拠する。１つまたは複数のポリヌクレオチドを植物に導入する方法は当技術分野で既知であり、その方法としては、以下に限定されないが、一過性形質転換法、安定形質転換法、およびウイルス媒介法またはゲノム編集技術が挙げられる。
「安定形質転換」という用語は、外来遺伝子が植物のゲノムに導入されて、その植物またはその植物のどの継代のゲノムにも安定的に組み込まれ、その結果、前記外来遺伝子が安定的に遺伝することを意味する。
「一過性形質転換」という用語は、核酸分子またはタンパク質が植物細胞に導入されて機能が実行されるものの、その植物のゲノムには組み込まれず、その結果、外来遺伝子が安定的に遺伝しないことを意味する。
「ゲノム編集技術」とは、ゲノムを改変するために用いられる技術であって、ゲノム配列を正確に操作して、部位指定遺伝子の突然変異、挿入および欠失などの操作を実現することができる技術を指す。現在のところ、ゲノム編集技術としては主に、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｈｏｍｉｎｇ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ：ＨＥ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＴＡＬＥＮ）、およびクリスパー（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（クラスター化した規則的間隔配置の短回文反復配列）：ＣＲＩＳＰＲ）の技術が挙げられる。
植物の形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターが当業者に既知であり、本発明に関係する遺伝子は、任意のそのようなベクターと組み合わせて用いることができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術、および形質転換のための標的種に依拠する。ある複数の標的種については、異なる抗生物質または除草剤の選択マーカーが好ましい場合がある。形質転換で日常的に用いられる選択マーカーとしては、カナマイシンおよび関連する抗生物質または除草剤に対する抵抗性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｂｅｖａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４－１８７（１９８３）に発表された）；除草剤グルホシネート（ホスフィノトリシンとも呼ばれる）に対する抵抗性を付与するｐａｔ遺伝子およびｂａｒ遺伝子（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：１０６２（１９９０）、Ｓｐｅｎｃｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｏｎ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７９：６２５－６３１（１９９０）、ならびに米国特許第５，５６１，２３６号および５，２７６，２６８号明細書を参照されたい）；抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２９２９－２９３１）；メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）：１０９９－１１０４（１９８３））；グリホサートに対する抵抗性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第４，９４０，９３５号および第５，１８８，６４２号明細書）；同じくグリホサートに対する抵抗性を付与するグリホサートＮ－アセチル基転移酵素（ＧＡＴ）遺伝子（Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０４：１１５１－１１５４；米国特許出願公開第２００７０００４９１２号、第２００５０２４６７９８号および第２００５００６０７６７号明細書）；およびマンノースを代謝する能力を提供するマンノース－６－リン酸イソメラーゼ遺伝子（米国特許第５，７６７，３７８号および第５，９９４，６２９号明細書）が挙げられる。植物の再生方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、Ｔｉプラスミドベクターが外来ＤＮＡの送達に利用されており、ＤＮＡの直接的取込み、リポソーム、電気穿孔、微量注入、および微粒子銃も同様である。
本発明において、雑草とは、農地で栽培される遺伝子導入植物と競合する植物を指す。
本発明における「防除」および／または「予防」という用語は、有効量のＰＰＯ阻害除草剤を農地に少なくとも直接（例えば散布により）施用することによって、雑草の発生を最小限に抑え、かつ／または雑草の成長を停止させることを指す。同時に、栽培される遺伝子導入植物は形態学的に正常であるべきであり、産物の消費および／または産生のために従来の方法で栽培することができる。そして好ましくは、栽培される植物は、非遺伝子導入野生型植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い。植物損傷の低減には、以下に限定されないが、茎の抵抗性の向上および／または穀物重量の増加などが含まれる。プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼには、独立的に、雑草に対する「防除」および／または「予防」の効果があり、その効果は、雑草を「防除」および／または「予防」し得る他の物質の存在によって、減少および／または消失することはない。具体的には、（本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む）遺伝子導入植物のいずれかの組織が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、および／または雑草を防除し得る別の物質を、同時にかつ／または別々に、有しかつ／または生成する場合、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの雑草に対する「防除」および／または「予防」の効果が、その別の物質の存在によって影響を受けることもなく、また、「防除」および／または「予防」の効果が、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼに関係なく、結果的に、その別の物質によって完全および／または部分的に達成されることもない。
本発明における「植物繁殖体」には、以下に限定されないが、植物有性繁殖体および植物栄養繁殖体が含まれる。植物有性繁殖体としては、限定されないが植物の種子が挙げられ、栄養繁殖体とは、ｅｘ ｖｉｖｏ条件下で新しい植物を産生し得る植物の栄養器官または特定の組織を指す。栄養器官または特定の組織としては、以下に限定されないが、根、茎、および葉が挙げられ、例えば、イチゴ、サツマイモなどの根を栄養繁殖体とする植物；サトウキビ、ジャガイモ（塊茎）などの茎を栄養繁殖体とする植物；およびアロエ、ベゴニアなどの葉を栄養繁殖体とする植物が挙げられる。
本発明により、新規な除草剤抵抗性形質が植物に付与され得、（収量などの）表現形質への悪影響は観察されない。本発明における植物は、試験した少なくとも１つの除草剤の一般的な施用レベルの、例えば、２×、３×、４×、または５×に耐性を示し得る。これらの耐性レベルの向上は、本発明の範囲内である。例えば、所与の遺伝子の発現を増大させるために、当技術分野で既知の様々な技術について、予見可能な最適化とさらなる開発を行うことができる。
本発明は、以下の利点を有するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用を提供する。
１．除草剤に対する広範な耐性。本発明はまず、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４が、ＰＰＯ阻害除草剤に対してより高い耐性を示し、そのため、植物における広範な施用の見込みがあることを開示する。
２．除草剤に対する強耐性。本発明が開示するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４は、ＰＰＯ阻害除草剤に対して強い耐性を示し、圃場濃度４倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルおよびフルミオキサジン、ならびに圃場濃度２倍のスルフェントラゾンに対して、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４のほぼ全てが高い抵抗性を示す。
３．ほとんど影響を受けない収量。除草剤に対する植物の耐性には、植物の収量と直接的な相関関係がある。高抵抗性植物は除草剤の影響を受けず、除草剤は植物の収量に影響を及ぼさない。しかし、中抵抗性および低抵抗性の植物の収量は、高抵抗性の植物の収量よりもはるかに低くなる。
本発明の技術的解決策について、下記の図面および実施例により、さらに詳細に説明する。
本発明によるシロイヌナズナ用ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターＤＢＮ１１３７５の概略構造図である。 本発明による対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎの概略構造図である。 本発明によるトウモロコシ用ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターＤＢＮ１１３７５の概略構造図である。 本発明による対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎの概略構造図である。
本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用に関する技術的解決法について、以下の実施例により、さらに説明する。
遺伝子導入シロイヌナズナ植物の取得と検証
１．プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得
微生物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１、ＰＰＯ２、ＰＰＯ３、ＰＰＯ４、ＰＰＯ５、ＰＰＯ６、ＰＰＯ７、ＰＰＯ８、ＰＰＯ９、ＰＰＯ１０、ＰＰＯ１１、ＰＰＯ１２、ＰＰＯ１３およびＰＰＯ１４のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１～１４として記載する。ＰＰＯ１～ＰＰＯ１４のヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４をコードするものであり、配列表の配列番号１５～２８として記載する。ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４をコードし、シロイヌナズナ／ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号２９～４２として記載する。ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂのヌクレオチド配列は、対応するプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１、ＰＰＯ６およびＰＰＯ１２をコードし、トウモロコシ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号６２～６４として記載する。
大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＥＣのアミノ酸配列を、配列表の配列番号４３として記載する。ＰＰＯ－ＥＣヌクレオチド配列は、対応する大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＥＣをコードするものであり、配列表の配列番号４４として記載する。ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列は、対応する大腸菌プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＥＣをコードし、シロイヌナズナ／ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号４５として記載する。
シロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＴのアミノ酸配列を、配列表の配列番号４６として記載する。ＰＰＯ－ＡＴヌクレオチド配列は、対応するシロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＴをコードするものであり、配列表の配列番号４７として記載する。ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列は、対応するシロイヌナズナのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＴをコードし、シロイヌナズナ／ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号４８として記載する。
アルセノフォヌス（Ａｒｓｅｎｏｐｈｏｎｕｓ）のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＰのアミノ酸配列を、配列表の配列番号６５として記載する。ＰＰＯ－ＡＰヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＰをコードするものであり、配列表の配列番号６６として記載する。ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＰをコードし、シロイヌナズナ／ダイズ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号６７として記載する。ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列は、対応するアルセノフォヌスのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ－ＡＰをコードし、トウモロコシ共通コドン使用バイアスに基づいて得たものであり、配列表の配列番号６８として記載する。
２．前述のヌクレオチド配列の合成
ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列およびＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列（配列番号２９～４２、配列番号４５、配列番号４８、および配列番号６７）の５’末端および３’末端をそれぞれ、ユニバーサルアダプタープライマー１に連結した。
５’末端用ユニバーサルアダプタープライマー１：配列表の配列番号４９に記載の５’－ｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｃａｔａｔｇ－３’
３’末端用ユニバーサルアダプタープライマー１：配列表の配列番号５０に記載の５’－ｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇａｇ－３’
３．シロイヌナズナ用のＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列およびＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターの構築
制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＡｓｃ Ｉを用い、植物発現ベクターＤＢＮＢＣ－０１を二重消化して線状化した。消化産物を精製して、線状化ＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーン（ベクターバックボーン：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡから入手可能））を得、次いで、Ｔａｋａｒａ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州、ＣＡＴ：１２１４１６）の説明書の手順に従って、ユニバーサルアダプタープライマー１に連結したＰＰ０１Ａヌクレオチド配列（配列番号２９）と組換え反応を行い、図１に示す概略構造を有する組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７を構築した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）遺伝子、ＲＢ：右境界（ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ）、ｅＦＭＶ：ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ ｏｆ Ｆｉｇｗｏｒｔ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）（配列番号５１）、ｐｒＢｒＣＢＰ：アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター（配列番号５２）、ｓｐＡｔＣＴＰ２：シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド（配列番号５３）、ＥＰＳＰＳ：５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子（配列番号５４）、ｔＰｓＥ９：エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター（配列番号５５）、ｐｒＡｔＵｂｉ１０：シロイヌナズナのユビキチン１０遺伝子のプロモーター（配列番号５６）、ｓｐＡｔＣＬＰ１：シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド（配列番号５７）、ＰＰＯ１Ａ：ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列（配列番号２９）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ａ ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ）（配列番号５８）、ｐｒ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号５９）、ｃＰＡＴ：ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子（配列番号６０）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号６１）、ＬＢ：左境界（ｌｅｆｔ ｂｏｒｄｅｒ））。
大腸菌Ｔ１コンピテント細胞を、以下の熱ショック条件下で熱ショック法を用いることにより、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７で形質転換した。大腸菌Ｔ１コンピテント細胞５０μＬとプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７）１０μＬとを４２℃で３０秒間水浴させ、３７℃で１時間振盪培養し（振盪には振盪機を回転数１００ｒｐｍで使用）、次いで、温度３７℃の条件下で、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体プレート（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよび寒天１５ｍｇ／Ｌ；ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）で１２時間培養した。白色の細菌コロニーを取り出し、ＬＢ液体培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌ；ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整）で、温度３７℃の条件下で一晩培養した。細胞内のプラスミドをアルカリ法で抽出した。菌液を回転速度１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿した菌糸体を、氷で予冷した溶液Ｉ（２５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）および５０ｍＭのグルコース、ｐＨ８．０）１００μＬに懸濁した。新たに調製した溶液ＩＩ（０．２ＭのＮａＯＨ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ：ＳＤＳ）２００μＬを添加し、チューブを４回反転させて混合し、氷上に３～５分間置いた。氷冷した溶液ＩＩＩ（３Ｍの酢酸カリウム、５Ｍの酢酸）１５０μＬを添加し、直ちに均一に混合し、氷上に５～１０分間置いた。温度４℃、回転数１２，０００ｒｐｍの条件下で混合物を５分間遠心分離し、２倍量の無水エタノールを上清に添加し、均一に混合し、室温で５分間置いた。温度４℃、回転数１２，０００ｒｐｍの条件下で混合物を５分間遠心分離し、上清を捨て、濃度７０％（Ｖ／Ｖ）のエタノールで沈殿物を洗浄した後、風乾した。ＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍＬ）を含有するＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３０μＬを添加して、沈殿物を溶解した。得られた産物を温度３７℃で３０分間水浴させてＲＮＡを消化し、使用に備えて温度－２０℃で保存した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７のＳｐｅＩ部位とＡｓｃＩ部位との間のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２９に記載のもの、すなわちＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列であることが示された。
組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７を構築する上記の方法に従い、ユニバーサルアダプタープライマー１に連結したＰＰＯ２Ａ～ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列およびＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化ＤＢＮＢＣ－０１発現ベクターバックボーンと組換え反応を行って、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３８～ＤＢＮ１２３５３を順に構築した。塩基配列決定法により、上述の各ヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３８～ＤＢＮ１２３５３に正しく挿入されたことを確認した。
上記の組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７の構築方法に従い、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎを対照として構築し、その構造を図２に示した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｅＦＭＶ：ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー（配列番号５１）、ｐｒＢｒＣＢＰ：アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター（配列番号５２）、ｓｐＡｔＣＴＰ２：シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド（配列番号５３）、ＥＰＳＰＳ：５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子（配列番号５４）、ｔＰｓＥ９：エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター（配列番号５５）、ｐｒ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号５９）、ｃＰＡＴ：ホスフィノトリシンアセチル基転移酵素遺伝子（配列番号６０）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号６１）、ＬＢ：左境界）。
４．シロイヌナズナ用の組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７～ＤＢＮ１２３５０、ＤＢＮ１２３５２、ＤＢＮ１２３５３、および上述の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下でアグロバクテリウムＧＶ３１０１に形質転換した。１００μＬのアグロバクテリウムＧＶ３１０１と、３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７～ＤＢＮ１２３５０、ＤＢＮ１２３５２、ＤＢＮ１２３５３およびＤＢＮ１２３３７Ｎ）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＧＶ３１０１をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養し、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ固体プレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを取り出して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７～ＤＢＮ１２３５０、ＤＢＮ１２３５２、ＤＢＮ１２３５３およびＤＢＮ１２３３７Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
５．遺伝子導入シロイヌナズナ植物の取得
野生型シロイヌナズナの種子を０．１％（ｗ／ｖ）のアガロース溶液に懸濁した。同調的種子発芽を確実にするために、懸濁した種子を４℃で２日間保存して、休眠要求を満たした。バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して、混合土壌から２４時間かけて水を排出した。上記の前処理した種子をその混合土壌に播種し、７日間保湿カバーで覆った。種子を発芽させ、恒温（２２℃）、恒湿（４０～５０％）、光強度１２０～１５０μｍｏｌ／ｍ２ｓ－１の長日光条件下（１６時間明期／８時間暗期）の温室で栽培した。最初はホーグランド栄養溶液で灌水し、次いで脱イオン水で灌水して、湿っているが水はしみ通らない状態に土壌を保った。
シロイヌナズナは、花浸漬法で形質転換した。スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培養液の１つまたは複数の前培養物１５～３０ｍＬに、採取したアグロバクテリウムのコロニーを接種した。その前培養物を温度２８℃、回転数２２０ｒｐｍで一晩、一定速度で振盪しながらインキュベートした。各前培養物を用いて、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびリファンピシン（１０ｍｇ／Ｌ）を含有するＹＥＰ培養液の培養物５００ｍＬを２つ接種し、その培養物を２８℃で一晩、連続振盪しながらインキュベートした。回転数約４，０００ｒｐｍの遠心分離を２０分間、室温で行って細胞を沈殿させ、生じた上清を捨てた。細胞沈殿物を、１／２×ＭＳ塩／Ｂ５ビタミン、１０％（ｗ／ｖ）ショ糖、０．０４４μＭのベンジルアミノプリン（１０μＬ／Ｌ（１ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ保存溶液））および３００μＬ／ＬのＳｉｌｖｅｔ Ｌ－７７を含有した浸透圧培養液５００ｍＬに穏やかに再懸濁した。月齢約１ヵ月のシロイヌナズナ植物を、再懸濁した細胞を含有する浸透圧培養液に１５秒間漬けて、最新の花序を確実に浸漬した。次いで、シロイヌナズナ植物を横向きに置いて蓋をし、２４時間暗所で湿潤状態を保った。そのシロイヌナズナ植物を、通常、２２℃で１６時間明期／８時間暗期の光周期で栽培した。約４週間後に種子を収穫した。
この新たに収穫した（ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列、および対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎ）のＴ１種子を、室温で７日間乾燥させた。この種子を２６．５ｃｍ×５１ｃｍの発芽ディスクに播種し、ディスク１枚当たり２００ｍｇのＴ１種子（約１０，０００粒）を入れた。ここでの種子は、同調的種子発芽を確実にするために、あらかじめ蒸留水に懸濁し、４℃で２日間保存して休眠要求を満たしたものである。
バーミキュライトを馬糞堆肥土と混合し、その混合物を底部灌水して、重力で水を排出した。ピペットを用いて、前処理した種子を混合土壌に均等に播種し、４～５日間保湿カバーで覆った。初期形質転換体を選択するため、（共形質転換ＰＡＴ遺伝子の選択に用いた）グルホシネートを出芽後散布施用する１日前に、カバーを外した。
リバティ（Ｌｉｂｅｒｔｙ）除草剤（グルホシネート２００ｇ ａｉ／Ｌ）の０．２％溶液を、植栽して７日後（ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｐｌａｎｔｉｎｇ：ＤＡＰ）および１１ＤＡＰ（それぞれ、子葉期、および２～４枚の葉期）に、１０ｍＬ／ディスク（７０３Ｌ／ｈａ）の散布量で、デビルビス圧縮空気ノズルによってＴ１植物に散布し、１回の施用につき、有効量２８０ｇ ａｉ／ｈａのグルホシネートを提供した。最終散布の４～７日後に生存植物（活発に成長している植物）を特定し、馬糞堆肥土およびバーミキュライトで作製した７ｃｍ×７ｃｍの正方形の鉢に移植した（３～５株／ディスク）。移植した植物は、３～４日間保湿カバーで覆い、２２℃の培養庫に置くか、上記の温室に直接移した。次いで、カバーを外し、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性をもたらすＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列および対照ベクターの能力を試験する少なくとも１日前に、植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、１４時間明期：１０時間暗期、最低５００μＥ／ｍ２ｓ－１の自然光＋補助光）で植栽した。
６．遺伝子導入シロイヌナズナ植物の除草剤耐性の検出
形質転換したシロイヌナズナＴ１植物を、最初に、グルホシネート除草剤を用いて選択した。ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１Ａ）、ＰＰＯ２Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ２Ａ）、ＰＰＯ３Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ３Ａ）、ＰＰＯ４Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ４Ａ）、ＰＰＯ５Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ５Ａ）、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ６Ａ）、ＰＰＯ７Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ７Ａ）、ＰＰＯ８Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ８Ａ）、ＰＰＯ９Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ９Ａ）、ＰＰＯ１０Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１０Ａ）、ＰＰＯ１１Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１１Ａ）、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１２Ａ）、ＰＰＯ１３Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１３Ａ）、ＰＰＯ１４Ａヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ１４Ａ）、ＰＰＯ－ＡＴＡヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ－ＡＴＡ）、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたシロイヌナズナＴ１植物（ＰＰＯ－ＡＰＡ）、対照ベクターが導入されたシロイヌナズナＴ１植物（対照ベクター）、および野生型シロイヌナズナ植物（ＣＫ）（各遺伝子型には２４株が含まれる）に、（播種して１８日後に）オキシフルオルフェンを３つの濃度（１８０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度１倍、１×）、７２０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、サフルフェナシルを３つの濃度（２５ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度１倍、１×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、フルミオキサジンを３つの濃度（６０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度１倍、１×）、２４０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにスルフェントラゾンを３つの濃度（４５０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度１倍、１×）、９００ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で散布して、除草剤に対するシロイヌナズナの耐性を判定した。散布の７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均（％）（植物の損傷レベルの平均（％）＝傷害を受けた葉の面積／全体の葉の面積×１００％）に従って評価した。すなわち、農薬損傷の等級：等級０は、植物の成長状態が本質的にブランク溶媒（水）を散布したものと同じであることを意味し、等級１は、植物の損傷レベルの平均が１０％未満であることを意味し、等級２は、植物の損傷レベルの平均が１０％超であることを意味し、等級３は、植物の損傷レベルの平均が１００％であることを意味する。成長状態が等級０および等級１に該当する植物を高抵抗性植物、等級２に該当するものを低抵抗性植物、等級３に該当するものを非抵抗性植物に分類する。実験結果を表１～４に示す。
Figure 2024516323000002
シロイヌナズナでは、オキシフルオルフェン除草剤１８０ｇ ａｉ／ｈａが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表１の結果から、対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａは全て、オキシフルオルフェンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡおよびＰＰＯ－ＡＴＡはいずれも、基本的に耐性を示さなかったことがわかる。
Figure 2024516323000003
シロイヌナズナでは、サフルフェナシル除草剤２５ｇ ａｉ／ｈａが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表２の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびＣＫと比較して、（１）遺伝子型ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａは全て、圃場濃度１倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡおよびＰＰＯ－ＡＴＡはいずれも耐性を示さず、（２）遺伝子型ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ７ＡおよびＰＰＯ９Ａ～ＰＰＯ１４Ａは全て、圃場濃度４倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが（遺伝子型ＰＰＯ８Ａでは２株のみが中程度または低い抵抗耐性を示し、他の２２株は全て、高い抵抗耐性を示した）、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡおよびＰＰＯ－ＡＴＡはいずれも、耐性を示さなかった。
Figure 2024516323000004
シロイヌナズナでは、フルミオキサジン除草剤６０ｇ ａｉ／ｈａが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表３の結果から、対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡおよびＰＰＯ－ＡＴＡはいずれも、基本的に耐性を示さなかったことがわかる。
Figure 2024516323000005
シロイヌナズナでは、スルフェントラゾン除草剤４５０ｇ ａｉ／ｈａが、感受性植物と抵抗性が平均レベルの植物とを識別する有効量である。表４の結果から、対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ～ＰＰＯ１４Ａは全て、スルフェントラゾンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡおよびＰＰＯ－ＡＴＡはいずれも、耐性を示さなかったことがわかる。
遺伝子導入ダイズ植物の取得と検証
１．組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７、ＤＢＮ１２３４２、ＤＢＮ１２３４８、ＤＢＮ１２３５１およびＤＢＮ１２３５３（それぞれ、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、およびＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列を含む）、ならびに実施例１の項目３に記載した対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用い、以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、シカゴ、ＣＡＴ：１８３１３－０１５）に形質転換した。１００μＬのアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養した後、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７、ＤＢＮ１２３４２、ＤＢＮ１２３４８、ＤＢＮ１２３５１、ＤＢＮ１２３５３、および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
２．遺伝子導入ダイズ植物の取得
従来のアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したダイズ変種Ｚｈｏｎｇｈｕａｎｇ１３の子葉節組織を、本実施例の項目１に記載のアグロバクテリウムと共培養して、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７、ＤＢＮ１２３４２、ＤＢＮ１２３４８、ＤＢＮ１２３５１、ＤＢＮ１２３５３、および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３３７ＮのＴ－ＤＮＡを、ダイズ染色体に導入した（Ｔ－ＤＮＡは、ゴマノハグサ・モザイク・ウイルスの３４Ｓエンハンサー配列、アブラナ真核生物伸長因子遺伝子１α（Ｔｓｆ１）のプロモーター配列、シロイヌナズナ葉緑体輸送ペプチド配列、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素遺伝子、エンドウマメＲｂｃＳ遺伝子のターミネーター配列、シロイヌナズナユビキチン１０遺伝子のプロモーター配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２ヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓプロモーター配列、ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチル基転移酵素遺伝子、およびカリフラワー・モザイク・ウイルスの３５Ｓターミネーター配列を含む）。それにより、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎが導入されたダイズ植物をそれぞれ得た。
アグロバクテリウム媒介のダイズ形質転換では、簡単に述べると、ダイズ発芽培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ショ糖２０ｇ／Ｌ、および寒天８ｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）でダイズ成熟種子を発芽させ、次いで、温度２５±１℃、光周期（明期／暗期）１６時間／８時間の条件下で培養した。発芽の４～６日後に、明緑色の子葉節で膨らんだダイズ無菌実生を採取し、子葉節から３～４ミリメータ下の胚軸を切り取り、子葉下軸を縦に切断し、頂芽、側芽、および種子根を除去した。メスの背を用いて子葉節に創傷を作り、創傷子葉節組織にアグロバクテリウム懸濁液を接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、またはＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列をそれぞれ、創傷子葉節組織に転移させることができる（工程１：感染工程）。この工程において、好適に、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．５～０．８、感染培地（ＭＳ塩２．１５ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ショ糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、アセトシリンゴン（ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ：ＡＳ）４０ｍｇ／Ｌ、２－モルホリンエタンスルホン酸（２－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＭＥＳ）４ｇ／Ｌ、およびゼアチン（ｚｅａｔｉｎ：ＺＴ）２ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．３））に子葉節組織を浸漬して、接種を開始した。その子葉組織を、アグロバクテリウムと一定期間（３日間）、共培養した（工程２：共培養工程）。好適に、感染工程の後、固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ショ糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、ＭＥＳ４ｇ／Ｌ、ＺＴ２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ；ｐＨ５．６）で子葉組織を培養した。この共培養段階の後、任意選択で「回収」工程を設けることができ、この工程では、アグロバクテリウムの増殖を阻害するために少なくとも１つの抗生物質（セファロスポリン１５０～２５０ｍｇ／Ｌ）を添加し、植物形質転換体のための選択剤を添加していない回収培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ＺＴ２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、およびアスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ５．６）を用いた（工程３：回収工程）。好適に、子葉節から再生された組織塊を、抗生物質を含むが選択剤を含まない固体培地で培養することによって、アグロバクテリウムを排除し、感染細胞のための回収期間を提供した。その後、子葉節から再生した組織塊を、選択剤（グリホサート）を含有する培地で培養し、増殖途中の形質転換カルスを選択した（工程４：選択工程）。好適に、選択剤を含有するスクリーニング固体培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、ビタミンＢ５、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６－ベンジルアデニン（６－ｂｅｎｚｙｌａｄｅｎｉｎｅ：６－ＢＡＰ）１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸１００ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸１００ｍｇ／Ｌ、およびＮ－（ホスホノメチル）グリシン０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．６）において、子葉節から再生した組織塊を培養することによって、形質転換細胞を選択的に増殖させた。次いで、形質転換細胞から植物を再生させた（工程５：再生工程）。好適に、選択剤を含有する培地で増殖させた子葉節から再生した組織塊を、固体培地（Ｂ５分化培地およびＢ５発根培地）で培養して、植物を再生した。
スクリーニングした抵抗性組織をＢ５分化培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ＺＴ１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、グルタミン酸５０ｍｇ／Ｌ、アスパラギン酸５０ｍｇ／Ｌ、ジベレリン１ｍｇ／Ｌ、オーキシン１ｍｇ／Ｌ、およびＮ－（ホスホノメチル）グリシン０．２５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ５．６）に移し、分化のため２５℃で培養した。分化した実生をＢ５発根培地（Ｂ５塩３．１ｇ／Ｌ、Ｂ５ビタミン、ＭＥＳ１ｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ、セファロスポリン１５０ｍｇ／Ｌ、インドール－３－酪酸（ｉｎｄｏｌｅ－３－ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ：ＩＢＡ）１ｍｇ／Ｌ）に移し、その発根培地において２５℃で培養して高さ約１０ｃｍにした後、ガラス温室に移して結実させた。温室では、２６℃で１６時間、当該植物を培養し、次いで２０℃で１日８時間培養した。
３．ＴａｑＭａｎを用いた遺伝子導入ダイズ植物の検証
ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎが導入されたダイズ植物から葉を約１００ｍｇ、試料として採取した。ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔで上記のダイズ植物のゲノムＤＮＡを抽出し、Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法によりＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数を検出することによって、ＰＰＯ遺伝子のコピー数を決定した。同時に、対照として野生型ダイズ植物を用い、上述の方法に従って検出および解析を行った。実験は３回繰り返し、平均値を算出した。
ＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数を検出する具体的な方法は、以下の通りである。
工程１１：ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎが導入されたダイズ植物、および野生型ダイズ植物の葉を１００ｍｇ採取し、液体窒素を用い、乳鉢で磨砕してホモジネートにし、各試料について３回の繰り返しを行った。
工程１２：ＱｉａｇｅｎのＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用い、製品マニュアルに記載された特定の方法で、上述の試料のゲノムＤＮＡを抽出した。
工程１３：上述の試料のゲノムＤＮＡの濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検出した。
工程１４：上述の各試料のゲノムＤＮＡの濃度を、８０から１００ｎｇ／μＬまでの範囲の同じ値に調整した。
工程１５：Ｔａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法を用いて、試料のコピー数を特定した。ここでは、コピー数が既知で特定されている試料を標準とし、野生型ダイズ植物の試料を対照とし、各試料について３回の繰り返しを行って、平均した。蛍光定量ＰＣＲプライマーおよびプローブの配列は、以下の通りである。
ＥＰＳＰＳ遺伝子配列の検出には、以下のプライマーおよびプローブを用いた。
プライマー１：配列表の配列番号６９に記載のｃｔｇｇａａｇｇｃｇａｇｇａｃｇｔｃａｔｃａａｔａ
プライマー２：配列表の配列番号７０記載のｔｇｇｃｇｇｃａｔｔｇｃｃｇａａａｔｃｇａｇ
プローブ１：配列表の配列番号７１に記載のａｔｇｃａｇｇｃｇａｔｇｇｇｃｇｃｃｃｇｃａｔｃｃｇｔａ
ＰＣＲ反応系：
ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ） １０μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物 １μＬ
ゲノムＤＮＡ ３μＬ
水（ｄｄＨ２Ｏ） ６μＬ
５０×プライマー／プローブ混合物は、濃度１ｍＭの各プライマー４５μＬ、濃度１００μＭのプローブ５０μＬ、１×ＴＥ緩衝液８６０μＬを含み、アンバーチューブに入れて４℃で保存した。
ＰＣＲ反応条件：
工程温度 温度 時間
２１ ９５℃ ５分間
２２ ９５℃ ３０秒間
２３ ６０℃ １分間
２４ 工程２２に戻り、４０回繰り返す
ソフトウェアＳＤＳ２．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータを解析した。
ＥＰＳＰＳ遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列、および対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎが全て、検出されたダイズ植物の染色体に組み込まれていることが実証され、ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３３７Ｎが導入されたダイズ植物の全てが、結果的に、単一コピーの遺伝子導入ダイズ植物となった。
４．遺伝子導入ダイズ植物の除草剤耐性の検出
ＰＰＯ１Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物（ＰＰＯ１Ａ）、ＰＰＯ６Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物（ＰＰＯ６Ａ）、ＰＰＯ１２Ａヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物（ＰＰＯ１２Ａ）、ＰＰＯ－ＥＣＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物（ＰＰＯ－ＥＣＡ）、ＰＰＯ－ＡＰＡヌクレオチド配列が導入されたダイズ植物（ＰＰＯ－ＡＰＡ）、対照ベクターが導入されたダイズ植物（対照ベクター）、および野生型ダイズ植物（ＣＫ）（各遺伝子型には１６株が含まれる）を、（播種して１８日後に）採取し、サフルフェナシルを３つの濃度（５０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、オキシフルオルフェンを３つの濃度（３６０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、７２０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにフルミオキサジンを３つの濃度（１２０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、２４０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で散布して、除草剤に対するダイズ植物の耐性を判定した。実施例１の項目６の上記の方法に従い、散布の７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均（％）に従って評価した。実験結果を表５～７に示す。
Figure 2024516323000006
表５の結果から以下のことがわかる。（１）対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６Ａ、ＰＰＯ１２ＡおよびＰＰＯ－ＥＣＡは、サフルフェナシルに対し、異なる程度で耐性を示すことができたが、ＰＰＯ－ＡＰＡは基本的に耐性を示さなかった。（２）圃場濃度２倍のサフルフェナシルで処理した場合、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６ＡおよびＰＰＯ１２Ａの損傷レベルは等級０と評価されたが、遺伝子型ＰＰＯ－ＥＣＡでは、植物の約４４％が等級１と評価された。（３）遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６ＡおよびＰＰＯ１２Ａは全て、圃場濃度４倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＥＣＡでは、植物の約３１％が中程度または低い抵抗耐性を示した。
Figure 2024516323000007
表６の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびＣＫと比較して、（１）遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６Ａ、ＰＰＯ１２ＡおよびＰＰＯ－ＥＣＡは全て、圃場濃度２倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡでは、植物の５０％が耐性を示さず、（２）遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６Ａ、ＰＰＯ１２ＡおよびＰＰＯ－ＥＣＡは全て、圃場濃度４倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡは耐性を示さなかった。
Figure 2024516323000008
表７の結果から、対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ａ、ＰＰＯ６Ａ、ＰＰＯ１２ＡおよびＰＰＯ－ＥＣＡは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＡはフルミオキサジン耐性を示さなかったことがわかる。
遺伝子導入トウモロコシ植物の取得と検証
１．ＰＰＯ遺伝子を含むトウモロコシの組換え発現ベクターの構築
実施例１の項目１に記載のＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列およびＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列、ならびにＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列の５’末端および３’末端をそれぞれ、以下のユニバーサルアダプタープライマー２に連結した。
５’末端用ユニバーサルアダプタープライマー２：配列表の配列番号７２に記載の５’－ｃｃａａｇｃｇｇｃｃａａｇｃｔｔａ－３’
３’末端用ユニバーサルアダプタープライマー２：配列表の配列番号７３に記載の５’－ｔｇｔｔｔｇａａｃｇａｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃ－３
制限酵素Ｓｐｅ ＩおよびＡｓｃ Ｉを用い、植物発現ベクターＤＢＮＢＣ－０２を二重消化して、植物発現ベクターを線状化した。消化産物を精製して、線状化ＤＢＮＢＣ－０２発現ベクターバックボーン（ベクターバックボーン：ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１（ＣＡＭＢＩＡから入手可能））を得、次いで、Ｔａｋａｒａ Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｓｅａｍｌｅｓｓ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州、ＣＡＴ：１２１４１６）の説明書の手順に従い、ユニバーサルアダプタープライマー２に連結したＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列と組換え反応を行って、図３に示すベクター構造を有する組換え発現ベクターＢＮ１２３５４を構築した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｐｒＯｓＡｃｔ１：イネアクチン１プロモーター（配列番号７４）、ｃＰＡＴ：ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチル基転移酵素遺伝子（配列番号６０）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号６１）、ｐｒ３５Ｓ－０６：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター（配列番号７５）、ｉＺｍＨＳＰ７０：トウモロコシ熱ショック７０ｋＤａタンパク質イントロン（配列番号７６）、ｓｐＡｔＣＬＰ１：シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド（配列番号５７）、ＰＰＯ１Ｂ：ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列（配列番号６２）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター（配列番号５８）、ｐｒＺｍＵｂｉ：トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーター（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（配列番号７７）、ＰＭＩ：ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（ｐｈｏｓｐｈｏｍａｎｎｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ）（配列番号７８）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｏｆ ａ ｎｏｐａｌｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇｅｎｅ）配列番号：５８）、ＬＢ：左境界）。
実施例１の項目３に記載の熱ショック法に従い、大腸菌Ｔ１コンピテント細胞を形質転換し、その細胞内のプラスミドをアルカリ法によって抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４は、配列表の配列番号６２に記載のヌクレオチド配列、すなわちＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列を含むことが示された。
組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４を構築する上記の方法に従い、ユニバーサルアダプタープライマー２に連結したＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列およびＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列をそれぞれ、線状化ＤＢＮＢＣ－０２発現ベクターバックボーンと組換え反応を行って、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５５～ＤＢＮ１２３５７を順に構築した。塩基配列決定法により、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列、およびＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列が、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５５～ＤＢＮ１２３５７に正しく挿入されたことを確認した。
上記の組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４を構築する方法に従い、対照として組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎを構築し、その構造を図４に示した（Ｓｐｅｃ：スペクチノマイシン遺伝子、ＲＢ：右境界、ｐｒＯｓＡｃｔ１：イネアクチン１プロモーター（配列番号７４）、ｃＰＡＴ：ホスフィノトリシン－Ｎ－アセチル基転移酵素遺伝子（配列番号６０）、ｔ３５Ｓ：カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター（配列番号６１）、ｐｒＺｍＵｂｉ：トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーター（配列番号７７）、ＰＭＩ：ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子（配列番号７８）、ｔＮｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（配列番号：５８）、ＬＢ：左境界）。
２．組換え発現ベクターを用いたアグロバクテリウムの形質転換
正しく構築された組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４～ＤＢＮ１２３５７、および上述の対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎをそれぞれ、液体窒素法を用いて以下の形質転換条件下で、アグロバクテリウムＬＢＡ４４０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、シカゴ、ＣＡＴ：１８３１３－０１５）に形質転換した。１００μＬのアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４、および３μＬのプラスミドＤＮＡ（組換え発現ベクター）を液体窒素に１０分間入れ、３７℃の温水に１０分間浸した。形質転換したアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４をＬＢチューブに接種し、温度２８℃、回転数２００ｒｐｍの条件下で２時間培養した後、リファンピシン５０ｍｇ／Ｌおよびスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢプレートに広げて陽性単一クローンを増殖させ、単一クローンを採取して培養し、そのプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを、塩基配列決定法によって同定した。その結果、組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４～ＤＢＮ１２３５７、および対照ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎの構造が、完全に正しいことが示された。
３．遺伝子導入トウモロコシ植物の取得
従来から用いられているアグロバクテリウム感染法に従い、無菌培養したトウモロコシ品種Ｚｏｎｇ３１（Ｚ３１）の幼胚を、本実施例の項目２に記載のアグロバクテリウムと共培養して、本実施例の項目１で構築した組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４～ＤＢＮ１２３５７および対照組換え発現ベクターＤＢＮ１２３５４ＮのＴ－ＤＮＡを、トウモロコシ染色体に導入し（Ｔ－ＤＮＡは、イネアクチン１プロモーター配列、ホスフィノトリシンＮ－アセチル基転移酵素遺伝子、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓターミネーター配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス３５Ｓプロモーター配列、トウモロコシ熱ショック７０ｋＤａタンパク質イントロン配列、シロイヌナズナの白色または薄緑色の葉緑体の輸送ペプチド、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列、ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター配列、トウモロコシユビキチン１遺伝子プロモーター配列、ホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子、およびノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター配列を含む）、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎが導入されたトウモロコシ植物をそれぞれ得た。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用いた。
アグロバクテリウム媒介のトウモロコシ形質転換では、簡単に述べると、未熟な幼胚をトウモロコシから分離し、アグロバクテリウム懸濁液と接触させた。ここで、アグロバクテリウムは、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列、またはＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列を、幼胚の１つの少なくとも１つの細胞に転移させることができる（工程１：感染工程）。この工程では、アグロバクテリウム懸濁液（ＯＤ６６０＝０．４～０．６、感染培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、Ｎ６ビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖６８．５ｇ／Ｌ、グルコース３６ｇ／Ｌ、ＡＳ４０ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ；ｐＨ５．３））に幼胚を浸漬して、接種を開始した。幼胚をアグロバクテリウムと一定期間（３日間）、共培養した（工程２：共培養工程）。好適に、感染工程の後、幼胚を固体培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖２０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、ＡＳ１００ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）で培養した。共培養工程の後、「回収」工程を設けてもよく、この工程では、アグロバクテリウムの増殖を阻害するための少なくとも１つの抗生物質（セファマイシン）を添加し、植物形質転換体のためのいかなる選択剤も添加していない回収培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）を用いた（工程３：回収工程）。好適に、抗生物質を含むが選択剤を含まない固体培地で幼胚を培養することによって、アグロバクテリウムを排除し、感染細胞のための回収期間を提供した。次いで、選択剤（マンノース）を含有する培地で、接種した幼胚を培養し、増殖途中の形質転換カルスを選択した（工程４：選択工程）。好適に、選択剤を含む固体選択培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、マンノース１２．５ｇ／Ｌ、２，４－Ｄ１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）で幼胚を培養することにより、形質転換細胞を選択的に増殖させた。次いで、カルスを植物に再生した（工程５：再生工程）。好適に、選択剤を含有する培地で増殖しているカルスを固体培地（ＭＳ分化培地およびＭＳ発根培地）で培養して、植物を再生させた。
スクリーニングで得られた抵抗性カルスをＭＳ分化培地（ＭＳ塩４．３ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、６－ベンジルアデニン２ｍｇ／Ｌ、マンノース５ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）に移し、２５℃で培養して分化させた。分化した小植物をＭＳ発根培地（ＭＳ塩２．１５ｇ／Ｌ、ＭＳビタミン、カゼイン３００ｍｇ／Ｌ、ショ糖３０ｇ／Ｌ、インドール－３－酢酸１ｍｇ／Ｌ、植物ゲル３ｇ／Ｌ；ｐＨ５．８）に移し、２５℃で培養した。小植物の高さが約１０ｃｍに達したところで温室に移動させ、結実まで培養した。その温室で、２８℃で１６時間、当該植物を培養し、次いで２０℃で１日８時間培養した。
４．ＴａｑＭａｎを用いた遺伝子導入トウモロコシ植物の検証
ＴａｑＭａｎを用いて遺伝子導入ダイズ植物を検証するための実施例２の項目３に記載の方法に従い、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎが導入されたトウモロコシ植物を検出し、解析した。ＰＭＩ遺伝子のコピー数をＴａｑｍａｎプローブ蛍光定量ＰＣＲ法により検出することによって、ＰＰＯ遺伝子のコピー数を決定した。一方、対照として野生型トウモロコシ植物を用い、上述の方法に従って検出、解析した。実験は３回繰り返し、平均値を算出した。
ＰＭＩ遺伝子配列の検出には、以下のプライマーおよびプローブを用いた。
プライマー３：配列表の配列番号７９に記載のｇｃｔｇｔａａｇａｇｃｔｔａｃｔｇａａａａａａｔｔａａｃａ
プライマー４：配列表の配列番号８０に記載のｃｇａｔｃｔｇｃａｇｇｔｃｇａｃｇｇ
プローブ２：配列表の配列番号８１に記載のｔｃｔｃｔｔｇｃｔａａｇｃｔｇｇｇａｇｃｔｃｇａｔｃｃ
ＰＭＩ遺伝子のコピー数に関する実験結果を解析することにより、さらに、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列、および対照ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎが全て、検出されたトウモロコシ植物の染色体に組み込まれていること、ならびに、ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物、および対照ベクターＤＢＮ１２３５４Ｎが導入されたトウモロコシ植物が全て、結果的に、単一コピーの遺伝子導入トウモロコシ植物となったことが確認された。
５．遺伝子導入トウモロコシ植物の除草剤耐性の検出
ＰＰＯ１Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物（ＰＰＯ１Ｂ）、ＰＰＯ６Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物（ＰＰＯ６Ｂ）、ＰＰＯ１２Ｂヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物（ＰＰＯ１２Ｂ）、ＰＰＯ－ＡＰＢヌクレオチド配列が導入されたトウモロコシ植物（ＰＰＯ－ＡＰＢ）、対照ベクターが導入されたトウモロコシ植物（対照ベクター）、および野生型トウモロコシ植物（ＣＫ）（各遺伝子型には１６株が含まれる）を、（播種して１８日後に）採取し、サフルフェナシルを３つの濃度（５０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、１００ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、オキシフルオルフェンを３つの濃度（３６０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、７２０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で、ならびにフルミオキサジンを３つの濃度（１２０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度２倍、２×）、２４０ｇ ａｉ／ｈａ（圃場濃度４倍、４×）、および０ｇ ａｉ／ｈａ（水、０×））で散布して、除草剤に対するトウモロコシ植物の耐性を判定した。実施例１の項目６における上記の方法に従い、散布の７日後（７ＤＡＴ）に、除草剤によって生じた各植物の損傷レベルを、植物の損傷レベルの平均（％）（植物の損傷レベルの平均（％）＝傷害を受けた葉の面積／全体の葉の面積×１００％）で評価した。実験結果を表８～１０に示す。
Figure 2024516323000009
表８の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびＣＫと比較して、（１）遺伝子型ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂは全て、圃場濃度２倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＢでは植物の約５６％が耐性を示さず、（２）遺伝子型ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂは全て、圃場濃度４倍のサフルフェナシルに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＢは基本的に耐性を示さなかった。
Figure 2024516323000010
表９の結果から以下のことがわかる。対照ベクターおよびＣＫと比較して、（１）遺伝子型ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂは全て、圃場濃度２倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＢでは植物の約５０％が耐性を示さず、（２）遺伝子型ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂは全て、圃場濃度４倍のオキシフルオルフェンに対して高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＢは耐性を示さなかった。
Figure 2024516323000011
表１０の結果から、対照ベクターおよびＣＫと比較して、遺伝子型ＰＰＯ１Ｂ、ＰＰＯ６ＢおよびＰＰＯ１２Ｂは全て、フルミオキサジンに対して異なる濃度で高い抵抗耐性を示したが、遺伝子型ＰＰＯ－ＡＰＢは、基本的にフルミオキサジンに対して耐性を示さなかったことがわかる。
まとめると、植物に関して、本発明のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４は、シロイヌナズナ植物にＰＰＯ阻害除草剤に対する良好な耐性を付与することができ、特に、ＰＰＯ１、ＰＰＯ６、およびＰＰＯ１２は、シロイヌナズナ、ダイズ、およびトウモロコシの植物に、ＰＰＯ阻害除草剤に対する良好な耐性を付与することができる。このように、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４は、植物に良好な耐性を付与することができる。除草剤に関して、本発明は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＰＰＯ１～ＰＰＯ１４が、少なくとも圃場濃度４倍のオキシフルオルフェン、サフルフェナシルまたはフルミオキサジン、および圃場濃度２倍のスルフェントラゾンに植物が耐えることができる程度の、ＰＰＯ阻害除草剤に対するより高い耐性を植物に付与することができることを初めて開示する。したがって、本発明には、植物における広域施用の見込みがある。
最後に、上記の全ての実施例は、本発明を限定するためではなく、本発明の実施形態を説明するために用いられているに過ぎないことに留意されたい。好ましい実施例を参照して本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の実施形態は、本発明の技術的解決法の趣旨および範囲から逸脱することなく、等価的に改変または置換され得ることを理解すべきである。

Claims (17)

  1. 雑草の防除方法であって、前記雑草の防除方法は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、前記遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む
    ことを特徴とする、雑草の防除方法。
  2. 前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
    （ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列
    を含むことを特徴とする、請求項１に記載の雑草の防除方法。
  3. 前記遺伝子導入植物が、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列とは異なる、第２の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の雑草の防除方法。
  4. 前記第２のポリヌクレオチドが、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および／または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項３に記載の雑草の防除方法。
  5. 前記第２のポリヌクレオチドが、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および／またはチトクロム様タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項４に記載の雑草の防除方法。
  6. 有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤が、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤、および／または出芽後選択的除草剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の雑草の防除方法。
  7. 雑草の成長を抑制するための植栽組合せであって、前記植栽組合せは、ＰＰＯ阻害除草剤および少なくとも１つの遺伝子導入植物を含み、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤は、前記少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に施用され、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、さらに好ましくは、前記遺伝子導入植物はグリホサート耐性植物であり、前記雑草はグリホサート抵抗性雑草であり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む、
    植栽組合せ。
  8. 請求項７に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せであって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
    （ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列
    を含むことを特徴とする、植栽組合せ。
  9. 前記遺伝子導入植物が、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列とは異なる、第２の除草剤耐性タンパク質をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項７または請求項８に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
  10. 前記第２のポリヌクレオチドが、選択性マーカータンパク質、合成活性を有するタンパク質、分解活性を有するタンパク質、生物的ストレス抵抗性タンパク質、非生物的ストレス抵抗性タンパク質、雄性不稔性タンパク質、植物収量に影響を及ぼすタンパク質、および／または植物品質に影響を及ぼすタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項９に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
  11. 前記第２のポリヌクレオチドが、５－エノールピルビルシキミ酸－３－リン酸合成酵素、グリホサート酸化還元酵素、グリホサート－Ｎ－アセチル基転移酵素、グリホサート脱炭酸酵素、グルホシネートアセチル基転移酵素、アルファ－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ジカンバモノオキシゲナーゼ、４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、アセト乳酸合成酵素、および／またはチトクロム様タンパク質をコードすることを特徴とする、請求項１０に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
  12. 有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤が、グリホサート除草剤、グルホシネート除草剤、オーキシン様除草剤、雑草防除剤、出芽前選択的除草剤、および／または出芽後選択的除草剤をさらに含むことを特徴とする、請求項７乃至請求項１１のいずれか一項に記載の、雑草の成長を抑制するための植栽組合せ。
  13. ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物の産生方法であって、前記方法は、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を前記植物のゲノムに導入することを含み、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤が、少なくとも前記植物が存在する圃場に施用された場合に、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記植物は植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、前記導入の方法は、遺伝子形質転換、ゲノム編集、または遺伝子変異法を含み、
    好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む
    ことを特徴とする、産生方法。
  14. ＰＰＯ阻害除草剤に対して耐性のある植物の栽培方法であって、前記栽培方法は、
    植物繁殖体であって、前記植物繁殖体は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有する、植物繁殖体を、少なくとも１つ植栽することと、
    前記植物繁殖体を植物に成長させることと、
    有効量のＰＰＯ阻害剤を含む前記除草剤を、少なくとも前記植物を含む圃場に施用し、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多い前記植物を収穫することと
    を含み、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類、および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む
    ことを特徴とする、栽培方法。
  15. ＰＰＯ阻害除草剤によって生じる損傷から植物を保護するか、または、前記ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するための方法であって、前記方法は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含む前記除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、前記遺伝子導入植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記遺伝子導入植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む
    ことを特徴とする、方法。
  16. ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用であって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８８％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、
    好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、
    より好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を有し、
    さらに好ましくは、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼは、配列番号１～１４からなる群のアミノ酸配列から選択され、
    好ましくは、植物にＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を付与するための前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記使用は、少なくとも１つの遺伝子導入植物が存在する圃場に、有効量のＰＰＯ阻害剤を含有する前記除草剤を施用することを含み、前記遺伝子導入植物は、そのゲノム中に、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼをコードする前記ポリヌクレオチド配列を持たない他の植物と比較して、前記遺伝子導入植物は、植物損傷が少なく、かつ／または植物収量が多く、
    好ましくは、前記植物は単子葉植物および双子葉植物を含み、より好ましくは、前記植物は、カラスムギ、コムギ、オオムギ、キビ、トウモロコシ、モロコシ、ミナトカモジグサ、イネ、タバコ、ヒマワリ、アルファルファ、ダイズ、ヒヨコマメ、ピーナッツ、テンサイ、キュウリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、トマト、またはシロイヌナズナであり、
    好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、ジフェニルエーテル類、オキサジアゾロン類、Ｎ－フェニルフタルイミド類、オキサゾリノン類、フェニルピラゾール類、ウラシル類、チアジアゾール類、トリアゾリノン類および／またはトリアジノン類の種類のＰＰＯ阻害除草剤を含み、
    さらに好ましくは、前記ＰＰＯ阻害除草剤は、オキシフルオルフェン、サフルフェナシル、スルフェントラゾン、および／またはフルミオキサジンを含む
    プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用。
  17. 請求項１６に記載の、ＰＰＯ阻害除草剤に対する耐性を植物に付与するためのプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用であって、前記プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）配列番号１～１４から選択される配列と少なくとも８８％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし、配列番号１５～２８を含まないポリヌクレオチド配列、または
    （ｂ）配列番号２９～４２または配列番号６２～６４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列
    を含むことを特徴とする、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼの使用。
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