CN108220296B - 合成启动子ANDp及其在植物抗干旱中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物转基因工程领域，具体涉及一种合成启动子ANDp及其在植物抗干旱中的应用。针对如何提高植物对干旱耐受能力的问题，本发明提供了一种合成启动子ANDp，核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示，它能在干旱胁迫时诱导表达耐旱基因CARK1。本发明合成启动子与CARK1基因(ANDp：CARK1)的最优组合，大大提高了植物对干旱的耐受力，对于转基因工程具有很好的应用前景。

Description

合成启动子ANDp及其在植物抗干旱中的应用

技术领域

本发明属于植物转基因工程领域，具体涉及一种合成启动子ANDp及其在植物抗干旱中的应用。

背景技术

农作物的生长和发育往往受到干旱、高温、低温以及高盐等一些非生物胁迫，从而导致其产量降低。随着人类的经济发展和人口膨胀，水资源短缺现象日趋严重，这也直接导致了干旱地区的扩大与干旱化程度的加重，干旱化趋势已成为全球关注的问题。干旱是导致农作物产量降低的最大因素，因此，各国科学界都在努力寻找提高植物干旱耐受性的相关基因。迄今为止，虽然发现很多能够提高植物干旱的相关基因，但是却没有见到利用合成启动子来提高相关基因的表达以提高植物对干旱的耐受力的报道。本领域目前急需将已经获得基础研究知识利用相应手段转化为应用研究，以能够提高农作物的干旱耐受力及产量。

转基因工程是将外源基因通过载体转移到受体植株上，用于改善植物性状，培育高产作物，增强植物对各种逆境的耐受能力。而对于转基因工程来说，一般是利用35S启动子来过量表达目的基因，虽然目的基因确实能够提高植株对某些逆境的抵抗力，然而这些基因的过表达在正常生长下往往会导致植株矮小或者提前开花。于是，对诱导型启动子的研究变得尤为重要，只有在一定条件下，它才能诱导目的基因的表达。然而，天然启动子含有多种的响应元件，它能够在不同条件下响应，同时启动子活性也很低。于是，提供一个诱导型启动子模型及设计出合理的合成诱导型启动子就成为了本研究的目的。

合成诱导型启动子，即通过化学方法合成所设计的含有某一响应元件的组合启动子。它具有在正常生长条件下无活性或者低活性，在某种逆境下较高活性的特点。它相对于35S启动子，既解决了在正常生长条件下对植物的不利影响，又保证了在逆境条件下植物对逆境的耐受力的提高。相对于天然启动子，既增强了对某一逆境的响应专一性，又提高了对逆境的高效响应性。

现有技术还没有以合成启动子与耐旱基因的组合来提高植物的抗旱性的研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是通过合成启动子在干旱胁迫时表达抗旱基因，提高植物对干旱的耐受能力。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种合成启动子ANDp，在干旱胁迫时表达耐旱基因CARK1。

其中，上述合成启动子ANDp的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种含有上述启动子ANDp的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因细胞系或转基因植物。

其中，上述的重组载体为表达载体。所述的表达载体为真核表达载体。

进一步的，本发明还提供了一种上述合成启动子ANDp在植物抗干旱中的用途。

本发明还提供了一种上述合成启动子ANDp在干旱胁迫时表达耐旱基因CARK1的用途。

本发明还提供了一种提高植物耐旱能力的方法，包括以下步骤：

a、将上述合成启动子ANDp连接CARK1基因，形成可被诱导表达该基因的重组载体；

b、将a步骤构建的重组载体转入到农杆菌中，通过花絮浸染，获得后代，筛选后培育成稳定型转基因植株。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种化学合成诱导型启动子ANDp，具有基础启动活性低，诱导活性高的优点。本发明的启动子只能在干旱和ABA胁迫下响应，在干旱和ABA处理下才具有启动活性，其与表达基因CARK1协同，在干旱时表达抗旱基因CARK1，能够有效提高植物对干旱的耐受力，具有重要的经济意义和应用前景。本发明为提高植物的耐旱能力提供了一种新的方法，通过合成诱导型启动子ANDp与CARK1基因组合构建重组载体转入植株，培育新的转基因植株，能够有效提高植株的耐干旱能力。

附图说明

图1合成启动子的组成；

图2合成启动子FLUC/RLUC的表达量比值；

A为Ap：FLUC，Dp：FLUC，ANDp：FLUC三种质粒分别与质粒35S:DREB2A混合(NA不添加35S:DREB2A,作为对照组)后转染到原生质体中，在黑暗中孵育14小时。

B为Ap：FLUC，Dp：FLUC，ANDp：FLUC三种质粒转染到原生质体后加入10μM ABA(NA不添加ABA,作为对照组)，在黑暗中温育14小时。

使用Dual-Luciferase Assay Kit试剂盒，通过LMax II384光度计测量萤光素酶活性，结果显示是FLUC/RLUC的比值(萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的比值)。

图3转基因Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系在ABA或者甘露醇处理下相关基因的表达量比值变化；

A在50uM ABA处理三小时前后相比较,COL-0(野生型)(作为对照组)Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系CARK1,RD29A,RD29B基因的变化比值。(以野生型处理前后的变化比值为1)；

B在200mM甘露醇处理两小时前后相比较，COL-0(野生型)(作为对照组)Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系CARK1,RD29A,RD29B基因的变化比值。(以野生型处理前后的变化比值为1)；

图4转基因Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系在ABA处理下的子叶变绿率和根长；

A COL-0(野生型)、过表达株系35S:CARK1(作为正对照)、转基因Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系的种子在0.1μM ABA处理下，在第五天的子叶变绿率；

B三日龄的COL-0(野生型)、过表达株系35S:CARK1(作为正对照)、转基因Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系，在对照组(不加ABA)以及10μM、20μM ABA处理下生长七日后的根长；

图5转基因Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1各株系在甘露醇渗透胁迫下的根长。

具体实施方式

使用基因工程技术对植物进行改良是近年来的热点。使用基因工程技术以期提高植物的抗逆性，培育出耐逆性系也是一个可行之道。但是，目前还鲜见有能利用合成启动子的研究来提高植物抗逆性的报道。申请人从拟南芥中克隆到的一个可提高植物干旱胁迫抗性(耐旱性)的基因CARK1。CARK1基因能够参与ABA代谢途径，并能提高植物对干旱的耐受力。

申请人以拟南芥中RD29A和RD29B的启动子为基础，设计并合成了三条合成诱导性启动子(Ap、Dp和ANDp)。

研究发现，ANDp是最好的一条合成启动子，具有基础启动活性低，诱导活性高，且只能干旱和ABA胁迫下响应。实验发现，ANDp:CARK1能够有效的提高植物对干旱的耐受力，具有重要的经济意义和应用前景。

本发明提供了一种合成启动子，在干旱胁迫时表达耐旱基因CARK1。

进一步的，本发明的合成启动子为ANDp，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明的合成启动子ANDp由拟南芥Rd29A启动子、拟南芥Rd29B启动子和花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子合成。

进一步的，所述拟南芥Rd29A启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1拟南芥Rd29A启动子的核苷酸序列

cgactcaaaacaaacttacgaaatttaggtagaacttatatacattatatgtgtaattttttgtaacaaaatgtttttattattattatagaattttactggttaaattaaaaatgaatagaaaaggtgaattaagaggagagaggaggtaaacattttcttctattttttcatattttcaggataaattattgtagaagtttaaaagatttccatttgactagtgtaaatgaggaatattctctagtaagatcattatttcatctacttcttttatcttctaccagtagaggaataaacaatatttagctcctttgtaaatacaaattaattttcgttcttgacatcattcaattttaattttacgtataaaataaaagatcatacctattagaacgattaaggagaaatacaattcgaatgagaaggatgtgccgtttgttataataaacagccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcatacgtgtccctttatctctctcagtctctctataaacttagtgagaccctcctctgttttactcacaaatatgcaaactagaaaacaatcatcaggaataaagggtttgatt。

进一步的，所述拟南芥Rd29B启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2拟南芥Rd29B启动子的核苷酸序列

cgtaattttctagatccgtcttgggagctcagactgtatcagtgatgatgatgatgatgaagaagagaacgaattttgaaattggcggttttgaatttttaagaaattaaaaaatatcccccgtcgatttcaagagggagatggagataccaaagcaactctcgccacttgtcgtcttttaattttaattgagtacgttatgccgttttaaatgttcaaaacagcacacagttgatagctgaattgattttttcttttgccgttttgttatatttaaacaacacacagtgcatttgccaaataactacatgatgggccaataaacgtggaccgactaaaactaaataatagaagatacatcgataggcttctctaaagatcggataaaagataatgtcgcatagccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtcagaatcctacagaagtaaagagacagaagccagagagaggtggttcggccatatgtcatcgttctctctataaactttatggaactttgttctgattttctcagagacacgaaaagaaagaaaacaacactagaacaaagagggtttgattgattcacttgaaaaagagaaaacacagctttggaaa。

进一步的，所述花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子的核苷酸序列

tgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaaca。

其中，上述合成启动子ANDp中的-262～-521碱基取自拟南芥Rd29A启动子的-371～-113碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示。上述序列中含有两个DRE(TACCGACAT)顺式作用元件,能够参与干旱代谢途径，不参与ABA代谢途径。

SEQ ID NO：26启动子ANDp中的-262～-521碱基序列

gccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttca。

其中，上述合成启动子ANDp中的-103～-73碱基取自拟南芥Rd29A启动子的-112～-82碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。

SEQ ID NO：27合成启动子ANDp中的-103～-73碱基序列

tccctttatctctctcagtctctcgacgcac。

其中，上述合成启动子ANDp中的-261～-184碱基取自拟南芥Rd29B启动子的-247～-170碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示。

SEQ ID NO：28合成启动子ANDp中的-261～-184碱基序列

gccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtcagaatcctacagaagta。

其中，上述合成启动子ANDp中的-183～-104碱基取自拟南芥Rd29B启动子的-269～-190碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。

SEQ ID NO：29合成启动子ANDp中的-183～-104碱基序列

aggataaaagataatgtcgcatagccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgaacgtg。

特别的，SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29中含有两个ABRE(ACGTGGC)顺式作用元件,能够参与脱落酸(ABA)途径。

其中，上述合成启动子ANDp中的-72～+1碱基取自花椰菜花叶病毒CaMV的35S启动子的-72～+1碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。

SEQ ID NO：30合成启动子ANDp中的-72～+1碱基序列

aatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggac。

特别的，序列SEQ ID NO：30中含有CAAT盒和TATA盒，是合成启动子ANDp的核心元件。

在本发明中，“+”表示基因从起始密码子中ATG的下游，ATG向上是“-”表示启动子在ATG上游，ATG中的A即为+1。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，载体pGreenII 0800-LUC购自于优宝生物公司，载体pUC57购自于华大基因公司；

所用菌株：农杆菌GV3101、大肠杆菌DH5α为来自普通市售产品；

载体pBI121-35S:CARK1和载体pBI221-35S:DREB2A由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室构建，构建方法如下：

载体pBI121-35S:CARK1：利用Xba1与Sma1两个限制性内切酶将pBI121-GUS载体中GUS基因序列切除后，将CARK1基因插入到其中；

载体pBI221-35S:DREB2A：利用XbaⅠ和SacⅠ两个限制性内切酶将pBI221-eGFP载体中eGFP基因序列切除后，将DREB2A基因插入到其中。

实施例1合成启动子Ap、Dp和ANDp的设计

以拟南芥Rd29A启动子和拟南芥Rd29B启动子为基础，利用NCBI在线网站查找到Rd29A启动子和Rd29B启动子的序列，然后通过plant CARE在线网站分析其启动子区域的顺式作用元件，最后根据CARK1基因的能够参与ABA信号通路以及提高植物的耐旱的功能，设计启动子并通过化学方法合成。

共合成三条启动子，分别命名为Ap,Dp和ANDp。启动子合成由华大基因公司完成。

其中，Ap,Dp和ANDp三个合成启动子的组成如图1所示。A：Rd29A(-371～-113)，其中包含两个标准的DRE元件；B：由Rd29B(-247～-170)和(-269～-190)两部分串联构成，其中包含四个标准的ABRE元件；C：Rd29A(-112～-82)，没有DRE和ABRE元件，主要是为了使顺式作用元件与核心元件有一个相对的距离，也为了保证所设计的启动子源于自身；D：核心35S启动子序列(-72～+1)，含有CAAT框和TATA框，这是启动子必需的。Ap,Dp和ANDp三个合成启动子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

实施例2合成启动子Ap、Dp和ANDp的相关重组载体的构建

1、合成启动子(Ap、Dp和ANDp)由华大基因公司化学合成，并构建在pUC57载体上。根据Ap(SEQ ID NO：4)所示核苷酸序列设计引物，

SEQ ID NO：4 Ap的核苷酸序列

gccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtcagaatcctacagaagtaaggataaaagataatgtcgcatagccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtccctttatctctctcagtctctcgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggac。

上游引物(SEQ ID NO：10)：5’—gtcgacggtatcgataagcttgccacgtagagagca-3’，

下游引物(SEQ ID NO：11)：5’-cgctctagaactagtggatccgtcccccgtgttctc-3’。

根据Dp(SEQ ID NO：5)所示核苷酸序列设计引物，

SEQ ID NO：5 Dp的核苷酸序列

gccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcagacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggac。

上游引物(SEQ ID NO：12)：5’-gtcgacggtatcgataagcttgccacacgacgtaaa-3’，

下游引物(SEQ ID NO：11)：5’-cgctctagaactagtggatccgtcccccgtgttctc-3’。

根据ANDp(SEQ ID NO：6)所示核苷酸序列设计引物，

SEQ ID NO：6 ANDp的核苷酸序列

gccacacgacgtaaacgtaaaatgaccacatgatgggccaatagacatggaccgactactaataatagtaagttacattttaggatggaataaatatcataccgacatcagtttgaaagaaaagggaaaaaaagaaaaaataaataaaagatatactaccgacatgagttccaaaaagcaaaaaaaaagatcaagccgacacagacacgcgtagagagcaaaatgactttgacgtcacaccacgaaaacagacgcttcagccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtcagaatcctacagaagtaaggataaaagataatgtcgcatagccacgtagagagcaactggctgagacgtggcaggacgaaacggacgcatcgtacgtgtccctttatctctctcagtctctcgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggac。

上游引物(SEQ ID NO：12)：5’-gtcgacggtatcgataagcttgccacacgacgtaaa-3’，

下游引物(SEQ ID NO：11)：5’-cgctctagaactagtggatccgtcccccgtgttctc-3’。

经PCR，将从pUC57载体中扩增完整的SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列扩增出酶切位点。对PCR产物纯化(见天根公司所公开的资料)，然后用HindIII与BamH1酶切，胶回收，与载体pGreenII 0800-LUC连接(连接位点：HindIII与BamH1)，经测序验证，分别获得含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6的瞬时表达重组质粒。

2、对载体pBI121-35S:CARK1进行验证，CARK1基因序列如SEQ ID NO：7显示，根据SEQ ID NO：7所示核苷酸序列设计引物：

SEQ ID NO：7 CARK1基因的核苷酸序列

atgggctgctttggttgttgtggtggtggtgaggatttccgtagagtttctgaaactggaccaaagccagtgcataacactggaggttacaatggaggtcaccatcaaagggcagatccacccaaaaaccttccagtcattcagatgcagcctatctctgttgcggccattccagctgatgaattgagggatataacggataactatggttcaaagtccttgattggtgagggttcatatggaagagtcttttatggtattcttaaaagtggtaaagcagctgccattaagaaactggattctagtaagcaaccagatcaagaatttctcgcccaggtatcaatggtttcgagattgcgacaagaaaatgttgttgcgcttctgggctattgtgttgatggcccactccgtgttcttgcttatgaatatgctcctaatggatctcttcatgatattcttcatggtcgaaaaggtgttaaaggggcacagccaggtcctgttctgtcgtggcaccagagagtcaaaattgctgttggtgcggctagaggactcgagtacttgcatgagaaggcaaaccctcatgttatccacagagacatcaaatccagcaatgtacttctgttcgatgatgatgttgccaagattgctgattttgatttgtccaaccaagcccctgacatggctgctcgccttcactcaacccgtgtgctcggaacctttggctatcacgctccagagtatgcaatgacggggacgttgagcacaaagagtgatgtctatagttttggcgttgttctgctggagctcctcacaggtcgtaaaccagttgatcataccttaccacgtggacagcagagtgtcgtgacatgggcaacccctaaattgagtgaagacaaggtgaagcagtgtgttgacgcaagactaaacggagaatatcctcccaaagctgttgctaagctggctgcggtagctgcactgtgtgtgcaatatgaggcagacttcaggcctaacatgagcatagtggtgaaggctcttcagccgttgctcaatcctcctcgttctgctccccagactccacacaggaacccgtattga。

上游引物(SEQ ID NO：8)：5’-ATGGGCTGCTTTGGTTGTTGTGGTG-3’，

下游引物(SEQ ID NO：9)：5’-TCAATACGGGTTCCTGTGTGGAGTC-3’。

3、直接对pUC57载体用HindIII和XbaI双酶切，胶回收，与载体pBI121-35S:CARK1连接(连接位点：HindIII与XbaI)，经测序验证，获含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6的表达重组质粒，并转入大肠杆菌DH5α进行克隆。

实施例3合成启动子Ap、Dp和ANDp启动活性测定实验

原生质体瞬时表达系统缓冲液如下：

酶解液(现配现用)(100mL)组成为：15％纤维素酶1.5g；0.4％离析酶0.4g，Mannitol0.4M，MES(pH＝5.7)20mM，KCl 20mM。

55℃温育10min，使蛋白酶失活，增加酶的溶解性，冷却至25℃后加入10mM CaCl₂和0.1g BSA，定容至100mL，推滤保存于-20℃。

PEG溶液的组成为：PEG4000 40％，Mannitol 0.2M，CaCl₂ 100mM。

WI溶液的组成为：Mannitol 0.5M，KCl 20mM，MES(pH＝5.7)4mM。

W5溶液的组成为：NaCl 154mM，CaCl₂ 125mM，KCl 5mM，MES(pH＝5.7)2mM。

MMG溶液的组成为：Mannitol 0.4M，MgCl₂ 15mM，MES(pH＝5.7)4mM。

一、原生质体细胞的制备

1)选取生长3-4周的未开花植株，取生长状况良好的第五到第七片莲座叶。通过特殊胶带去掉叶片下表皮，放于10mL酶解液中，在黑暗条件下静置酶解2h。

2)酶解完成后在显微镜下检测溶液中释放的完整的原生质体，拟南芥的叶肉细胞的原生质体的大小直径为30-50μm。

3)加入酶解液等体积预冷的W5溶液，用一层纱布将稀释后的酶解液过滤到新的大EP管中，100g离心2min，小心吸除上清。

4)经过上次操作步骤处理后，继续向其中注入10mL提前预冷处理的W5溶液，置于碎冰上30min，100g离心2min，小心吸除上清，加入1mL MMG溶液，在室温下静置。

二、转化原生质体

1)将10μL DNA(10-20μg质粒DNA)(图2中A，等量添加35S:DREB2A载体)，100μL的原生质体，110μL的PEG4000溶液加入2mL圆底离心管中，轻轻混匀，置于室温静置转化15-20min。

2)加入440μL的W5溶液稀释转化的PEG溶液，轻轻混匀后100g离心2min，弃上清。再加入1mL的W5溶液，100g离心2min，去除上清。

3)加入1.5mL WI溶液重悬原生质体，轻轻混匀。

三、原生质体培养与检测

1)将EP管平躺置于22℃的培养箱中，避光培养14-16h(图2中B，需加入10μM ABA)。

2)100g室温离心2min，小心吸除离心后的尽量弃掉上清溶液。利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(见威格拉斯生物技术公司所公开的资料)，通过化学荧光检测器检测,结果见表1。

表1合成启动子的启动活性

FLUC/RLUC	NA	35S:DREB2A	NA	10μM ABA
					Ap	0.2634	0.2930	0.0942	1.5387
Dp	0.9162	3.6243	1.0254	1.6934
					ANDp	0.3513	0.9580	0.2227	5.0183

说明：FLUC/RLUC,萤火虫荧光素酶/海肾荧光素酶的比值。(其中，FLUC的表达是由我们自己合成的启动子启动；RLUC则是由35S启动子启动，它作为内参)；NA，作为对照组。因为ANDp启动子中含有DRE和ABRE顺势作用元件，其中DREB2A能与DRE相互作用，而驱动下FLUC表达。外源ABA，能够调节ABA信号通路，产生一些能够与ABRE相互作用的转录因子，从而驱动FLUC表达。

结果发现：Ap:FLUC在没有任何处理下，FLUC/RLUC的比值是非常低的；但是在10μMABA处理下FLUC/RLU的比值增高了17倍左右；另外在同时转入载体35S:DREB2A，共同孵育后，FLUC/RLUC的比值基本没有变化。Dp:FLUC在没有任何处理下FLUC/RLUC的比值相对于Ap:FLUC要高一些；但是在10μM ABA处理下FLUC/RLUC的比值只是微微的增加了1.5倍；另外在同时转入载体35S:DREB2A，共同孵育后，FLUC/RLUC的比值3倍左右。而ANDp:FLUC在没有任何处理下FLUC/RLUC的比值相对于Ap:FLUC也要高一些；在10μM ABA处理下FLUC/RLUC的比值也增高了22倍左右；另外在同时转入载体35S:DREB2A，共同孵育后，FLUC/RLUC的比值4倍左右。

以上结果说明Dp只响应35S：DREB2A(只含有DRE元件)，Ap只响应ABA(只含有ABRE元件),且Ap(因为Dp在没有任何处理条件下，FLUC/RLUC的比值接近1，说明基础启动活性高)的基础启动活性是非常低的。与Dp和Ap比较，ANDp能够响应35S：DREB2A和ABA，同时它的基础启动活性非常低，且应答能力非常强。

实施例4 Ap:CARK1、Dp:CARK1和ANDp:CARK1转基因株系鉴定及相关基因定量分析实验

一、转基因植物的获得

1)转化农杆菌(GV3101)

首先取出农杆菌感受态于冰上融化，加入2μL重组质粒，液氮冻2min，然后37℃水浴5min。加入1mlLB培养基，28℃振荡培养2-3h，离心收集菌体，将其涂在LB+Rif(25μg/ml)+Kan(50μg/ml)平板上，28℃继续培养2～3d。

2)阳性农杆菌转化子的鉴定

随机挑取重组平板上的农杆菌单菌落接种于LB+Rif+Kan液体培养基中进行振荡培养，培养一定时间后，用菌液作模板进行PCR扩增。

根据CARK1(SEQ ID NO：7)，Ap(SEQ ID NO：4)，Dp(SEQ ID NO：5)，ANDp(SEQ IDNO：6)的核苷酸序列设计鉴定引物：

Ap：CARK1鉴定引物：

上游引物(SEQ ID NO：23)：5’-GCCACGTAGAGAGCAACTGGCTGAG-3’；

下游引物(SEQ ID NO：24)：5’-TCAATACGGGTTCCTGTGTGGAGT-3’；

Dp：CARK1鉴定引物：

上游引物(SEQ ID NO：25)：5’-GCCACACGACGTAAACGTAAAATGA-3’；

下游引物(SEQ ID NO：24)：5’-TCAATACGGGTTCCTGTGTGGAGT-3’；

ANDp：CARK1鉴定引物：

上游引物(SEQ ID NO：25)：5’-GCCACACGACGTAAACGTAAAATGA-3’；

下游引物(SEQ ID NO：24)：5’-TCAATACGGGTTCCTGTGTGGAGT-3’；

然后琼脂糖电泳检测是否有目标条带出现(条带大小约为1500bp)，若有则代表目的基因已转入。

3)花絮浸染法介导的拟南芥稳定遗传转化

将带有目标质粒的农杆菌按1:1000体积比加入到200mL LB+Kan+Rif的培养基中，220rpm震荡培养18-20h。6000g，室温离心10min，弃上清收集菌体。

将菌体溶于MS+3％蔗糖溶液中，调整OD至0.6-0.8。加入0.02％的表面活性剂Silwet L-77，混匀。选取生长状况良好、花瓣完全开放、没有角果(约5周生长时间)的拟南芥幼苗，将花絮浸入溶解有菌体的MS溶液中约1min，取出花絮。套袋在幼苗上，黑暗处理24h后揭开袋子。5天后重复前面步骤。

4)转基因T1代阳性苗的筛选

收取花絮浸染后的T0代种子10000-20000颗，将其播于MS+Kan固体培养基中，pBI121载体中带有NPTⅡ基因，具有抗卡那霉素的抗性，因此阳性苗能够在卡纳抗性的培养基中正常生长。选取长出绿色真叶，根较长的幼苗移栽入泥炭土中，温室培养。待幼苗长到六片子叶后，粗提DNA，通过PCR鉴定，去除假阳性植株。

5)转基因T1代阳性苗的鉴定及获得稳定转基因株系

收取T1代种子，取50-100颗种子播于1/2MS+Kan平板中，观察卡纳抗性分离比，符合3：1的株系为单拷贝，移栽绿色幼苗入土中温室培养。T2代再发1/2MS+Kan平板，全为绿色则为纯合子。获得稳定转基因植株T3代。

二、拟南芥转基因植物总RNA的提取

1)选取在MS培养基上生长良好12d左右的拟南芥幼苗，放入研钵中用液氮将其完全磨碎，称取0.08-0.1g放入EP管中。

2)EP管中加入1mL ambion TRIzol提取液，涡旋振荡1min后室温静置5min。

3)加入0.2mL氯仿，涡旋振荡15s，室温静置2-3min。

4)4℃，12000g离心10min，吸取水相至干净的EP管中。

5)加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，-20℃，静置10min。

6)4℃，12000g离心10min，弃上清。

7)将沉淀用1mL 75％乙醇轻轻洗涤，4℃，12000g离心30s，弃上清。

8)室温干燥沉淀5min，加入30μL RNase free ddH2O溶解沉淀。

三、单链cDNA的合成

a.基因组DNA的除去反应

10μL反应体系中加入：

5×gDNA Eraser Buffer 2μL

gDNA Eraser 1μL

Total RNA 1μg

RNase free ddH2O至10μL

室温静置5分钟。

b.反转录反应

RNase free ddH2O至20μL

37℃15min，85℃5s。

-20℃保存。

四、qRT PCR

根据CARK1,RD29A,RD29B,Actin基因核苷酸序列设计定量引物：

CARK1基因(SEQ ID NO：7)：

上游引物(SEQ ID NO：15)：5’-ACCTTCCAGTCATTCAGA-3’；

下游引物(SEQ ID NO：16)：5’-ACCATAGTTATCCGTTATATCC-3’；

RD29A基因(SEQ ID NO：13)：

SEQ ID NO：13RD29A基因的核苷酸序列

ATGGATCAAACAGAGGAACCACCACTCAACACACACCAGCAGCACCCAGAAGAAGTTGAACATCATGAGAATGGTGCGACTAAGATGTTTAGGAAAGTAAAGGCTAGAGCTAAGAAGTTCAAGAACAGTCTCACTAAACATGGACAAAGCAATGAGCATGAGCAAGATCATGATTTGGTTGAAGAAGATGATGATGATGACGAGCTAGAACCTGAAGTGATCGATGCACCAGGCGTAACAGGTAAACCTAGAGAAACTAATGTTCCAGCATCGGAGGAAATTATTCCACCAGGGACAAAGGTGTTTCCTGTCGTGTCTTCCGATTACACCAAACCCACTGAATCTGTACCAGTACAAGAGGCCTCTTACGGACACGATGCACCGGCTCATTCTGTAAGGACGACGTTTACATCGGACAAGGAAGAGAAAAGAGATGTACCGATTCATCATCCTCTGTCCGAATTGTCAGACAGAGAAGAGAGTAGAGAGACTCATCATGAGTCATTGAACACTCCGGTCTCTCTGCTTTCTGGAACAGAGGATGTAACGAGTACGTTTGCTCCAAGTGGTGATGATGAATATCTTGATGGTCAACGGAAGGTCAACGTCGAGACCCCGATAACGTTGGAGGAAGAGTCGGCTGTTTCAGACTATCTTAGTGGTGTATCTAATTATCAGTCCAAAGTTACTGATCCCACCAAAGAAGAAACTGGAGGAGTACCGGAGATTGCTGAGTCTTTTGGTAATATGGAAGTGACTGATGAGTCTCCTGATCAGAAGCCAGGACAATTTGAAAGAGACTTGTCGACGAGAAGCAAAGAATTCAAAGAGTTTGATCAGGACTTTGACTCTGTTCTCGGTAAGGATTCGCCGGCGAAATTTCCAGGTGAATCAGGAGTTGTTTTCCCGGTGGGCTTTGGTGACGAGTCAGGAGCTGAGCTGGAAAAAGATTTTCCGACGAGAAGTCATGATTTTGATATGAAGACTGAAACTGGAATGGACACGAATTCTCCATCAAGAAGCCATGAATTTGATCTGAAGACTGAATCTGGAAACGACAAGAATTCTCCGATGGGCTTTGGTAGTGAATCAGGAGCTGAGCTGGAAAAAGAATTTGATCAGAAGAACGATTCTGGAAGAAACGAGTATTCGCCGGAATCTGACGGCGGTTTAGGAGCTCCGTTGGGAGGAAATTTTCCGGTGAGAAGTCATGAGTTGGATCTGAAGAACGAATCTGATATCGACAAGGATGTGCCGACGGGATTTGACGGAGAACCAGATTTTCTGGCGAAGGGAAGACCTGGATACGGTGAGGCATCAGAAGAGGATAAATTTCCGGCGAGAAGTGATGATGTGGAAGTAGAGACTGAGCTGGGAAGAGACCCAAAGACGGAGACTCTTGATCAATTCTCACCGGAACTTTCTCATCCTAAAGAAAGAGATGAGTTTAAGGAGTCCAGAGATGATTTTGAGGAGACGAGAGATGAGAAAACAGAGGAGCCAAAACAGAGCACTTACACAGAGAAGTTTGCTTCAATGCTAGGTTACTCCGGAGAAATTCCGGTGGGAGATCAAACTCAAGTGGCGGGAACTGTTGATGAGAAGTTGACTCCGGTCAATGAGAAGGATCAAGAAACAGAGTCTGCCGTGACGACGAAGTTACCTATCTCCGGAGGTGGAAGTGGAGTAGAGGAGCAACGAGGGGAAGATAAAAGTGTGTCGGGTAGAGATTATGTGGCGGAGAAACTGACAACTGAAGAAGAAGACAAAGCCTTTTCTGATATGGTTGCCGAGAAACTTCAGATTGGAGGAGAAGAAGAGAAGAAGGAAACGACGACAAAGGAAGTGGAGAAGATCTCTACCGAGAAGGCAGCATCGGAGGAGGGTGAGGCGGTGGAAGAGGAAGTGAAAGGAGGAGGAGGAATGGTTGGGAGGATTAAAGGATGGTTCGGTGGTGGTGCGACTGATGAGGTGAAGCCAGAATCGCACATTCTGTTGAAGAGGCTCCAAAATCATCTGGCTGGTTTGGTGGTGGTCGACGGAGGAGGTGAAGCCAAAATCGCCTCATTCCGTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTGGCTCCACTGTTGTTCCGGTGCAGAAGGAGCTTTAA。

上游引物(SEQ ID NO：17)：5’-TCAACACACACCAGCAGCAC-3’；

下游引物(SEQ ID NO：18)：5’-ATCGGAAGACACGACAGGAA-3’；

RD29B基因(SEQ ID NO：14)：

SEQ ID NO：14 RD29B基因的核苷酸序列

ATGGAGTCACAGTTGACACGTCCTTATGGTCATGAGCAAGCAGAAGAACCAATCAGAATTCACCATCCAGAAGAAGAAGAGCATCATGAGAAGGGAGCATCCAAAGTGTTGAAGAAAGTAAAAGAAAAGGCTAAGAAAATCAAGAACAGTCTCACTAAACATGGAAATGGTCATGATCACGATGTGGAAGATGATGATGATGAGTATGACGAGCAAGACCCAGAAGTTCACGGCGCACCAGTGTATGAATCCTCTGCCGTGAGAGGTGGTGTAACGGGTAAACCTAAGTCTCTTAGTCATGCCGGAGAAACTAATGTTCCGGCATCGGAGGAGATTGTTCCTCCAGGGACAAAAGTTTTTCCTGTCGTGTCTTCTGACCACACCAAACCCATTGAGCCTGTATCATTACAAGATACCTCTTACGGACATGAGGCACTGGCTGATCCTGTAAGAACGACGGAAACATCGGACTGGGAAGCGAAAAGAGAGGCACCGACTCATTATCCTCTCGGAGTGTCAGAATTTTCAGACAGAGGAGAGAGCAGAGAGGCTCATCAAGAGCCATTGAACACTCCTGTGTCTCTGCTTTCAGCAACAGAGGACGTGACTAGGACGTTTGCTCCTGGTGGTGAAGATGACTATCTCGGTGGTCAACGGAAAGTCAACGTCGAGACGCCAAAACGTTTGGAGGAAGATCCGGCTGCTCCAGGAGGAGGATCGGATTATCTCAGTGGTGTATCTAATTATCAGTCCAAAGTTACTGATCCCACGCATAAAGGTGGAGAAGCTGGAGTACCAGAGATTGCTGAGTCTCTTGGTAGAATGAAAGTGACTGATGAGTCTCCTGATCAGAAATCAAGACAAGGACGCGAAGAAGACTTTCCGACGAGAAGCCATGAGTTTGATCTGAAGAAGGAATCTGATATCAACAAGAATTCTCCGGCAAGATTTGGAGGGGAATCAAAAGCTGGGATGGAGGAAGATTTTCCGACAAGAGGTGATGTGAAAGTAGAGAGTGGATTGGGAAGAGACTTACCGACGGGAACTCATGATCAGTTCTCACCAGAACTATCTCGTCCCAAAGAGAGAGATGATTCTGAGGAAACCAAAGATGAGTCGACACATGAGACAAAACCAAGCACCTACACAGAGCAGTTAGCTTCAGCTACATCAGCCATAACTAACAAAGCTATAGCCGCAAAGAACGTCGTTGCCTCAAAGCTAGGTTACACCGGAGAGAATGGCGGCGGGCAAAGCGAGAGCCCTGTAAAAGATGAAACTCCGAGATCTGTTACTGCTTACGGGCAGAAAGTGGCGGGAACTGTTGCTGAGAAGTTGACTCCGGTTTACGAAAAAGTCAAAGAAACAGGATCAACGGTGATGACAAAGCTACCTCTCTCCGGAGGTGGAAGTGGAGTGAAGGAGACGCAACAAGGGGAAGAGAAAGGTGTGACGGCTAAAAATTATATATCAGAGAAGCTGAAACCTGGAGAAGAGGACAAAGCTTTATCGGAAATGATAGCTGAGAAACTTCATTTTGGAGGAGGAGGAGAGAAGAAGACAACGGCTACAAAGGAGGTGGAAGTGACGGTTGAGAAGATACCTTCCGACCAGATAGCGGAGGGGAAAGGACATGGTGAGGCGGTTGCAGAGGAAGGAAAAGGTGGAGAAGGAATGGTGGGGAAAGTTAAAGGAGCGGTCACTTCTTGGCTCGGTGGTAAACCGAAGTCGCCACGGTCCGTTGAAGAGTCTCCACAATCACTTGGCACCACCGTTGGGACTATGGGGTTTTCGGATTCCGGTGGAAGTGAGTTGGGAGGCAGTGGCGGAGGTAAGGGAGTTCAAGATTCTGGGAACTGA。

上游引物(SEQ ID NO：19)：5’-ATCGGAAGACACGACAGGAA-3’；

下游引物(SEQ ID NO：20)：5’-TCTCTTTTCGCTTCCCAGT-3’；

Actin基因：

上游引物(SEQ ID NO：21)：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；

下游引物(SEQ ID NO：22)：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’；

反应体系：

程序：

Melt Curve 65℃to 95℃,increment 0.5C，

for 5s+Plate Read。

结果(图3)发现：在50uM ABA处理三小时前后相比较(图3中A)，ANDp:CARK1株系和Ap：CARK1株系的CARK1,RD29A,RD29B基因的表达量的变化值都是比COL-0(对照组)高很多的，且ANDp:CARK1株系中CARK1(4-9倍)和RD29A(4-5倍)基因的表达量的变化值远远高于Ap：CARK1株系的CARK1(2倍)和RD29A(2倍)。对于RD29B基因的表达量的变化值来说，ANDp:CARK1株系比Ap：CARK1株系更加稳定在3倍左右。与野生型来说，RD29A,RD29B基因变化比值更大。

在200mM甘露醇处理两小时前后相比较(图3中B)，ANDp:CARK1株系和Dp：CARK1株系的CARK1,RD29A,RD29B基因的表达量的变化值也都是比COL-0高很多的；ANDp:CARK1株系与Dp：CARK1株系相比较，虽然ANDp:CARK1株系中CARK1和RD29A基因的表达量的变化值比Dp：CARK1株系的低，但是RD29B基因的表达量的变化值是要高于Dp：CARK1株系的。与野生型来说，RD29A,RD29B基因变化比值更大。

以上结果说明，各转基因株系在不同条件诱导下CARK1表达明显升高，同时也影响相关的重要基因的表达。

实施例5转基因株系对ABA的响应实验

1)子叶变绿实验：不同转基因株系各100颗左右种子置于4℃春化3d，均匀播于0.1μM ABA的MS培养基上，五天后记录子叶变绿情况，结果见图4中A。

结果表明：在0.1uM ABA处理下，35S:CARK1作为正对照,除了Dp:CARK1，其他转基因株系的子叶变绿率都要比COL-0都低。有趣的是，Ap:CARK1，ANDp:CARK1以及Dp:RCAR11-Ap:CARK1的子叶变绿率比35S:CARK1低。说明含有ABRE元件的启动子对ABA比35S启动子更加敏感。

2)根长实验：各转基因株系中约100颗种子，分层点在MS培养基上并垂直放置培养。三天后，各株系移5颗生长相似的苗转移到1/2MS培养基中(0,10,20μM ABA)，并垂直放置培养。7天后测定根长，结果见图4中B。

结果表明：在10、20uM ABA处理下，Dp:CARK1、Ap：CARK1和ANDp:CARK1与35S:CARK1表型相似且都比COL-0的根短。Dp:CARK1根长比COL-0的短，因为ABA与干旱途径能够互相影响，所以在ABA处理下，也会引起相关基因的表达从而DRE结合，过表达CARK1。

以上结果可以发现Dp:CARK1在子叶变绿过程中是不受到ABA影响的。Ap：CARK1和ANDp:CARK1则在子叶变绿和发育过程中都能受到影响。

实施例6转基因株系根对甘露醇的渗透胁迫实验

每层五个株系，每个株系6颗种子在含有不同甘露醇(0,200,250mM)1/2MS培养基中垂直培养，根长约14天后测定，结果如图5所示。

结果表明：在250、300mM甘露醇处理下，35S:CARK1、Ap：CARK1与COL-0根长是没有差异的。而Dp:CARK1和ANDp:CARK1的根长比35S:CARK1和COL-0都要短。

实验说明：Ap：CARK1没有DRE元件，所以没有影响；35S:CARK1与Dp:CARK1和ANDp:CARK1的不同结果，35S:CARK1在甘露醇条件下是不受影响的，而其他是因为含有DRE元件，从而引起了不同的实验结果。

实验例7转基因株系干旱胁迫实验

各转基因株系中约100颗种子，分层点在MS培养基上并垂直放置培养。三天后，移到花盆中，在相同的生长条件下2周后的幼苗，进行干旱胁迫处理14天。再复水4天后，记录植物的存活情况，如表2所示。

表2干旱胁迫存活率

结果说明：以三个合成动子及35S启动子相比较，ANDp:CARK1转基因株系的存活率是最强的，且比35S:CARK1株系还要高。

于是，认为基因对植物的影响不需要高量表达，适当的提高就能达到对干旱的抵抗。

由上述结果可知：

1、Dp和Ap合成启动子特异性非常强,且Ap和ANDp的基础启动活性是非常低的，且应答能力非常强。

2、Dp:CARK1、Ap：CARK1、ANDp:CARK1相比，ANDp：CARK1转基因株系具有最强的耐旱能力。

3、转基因的构建需要根据目的基因来设计合成启动子，同时基因对植物的影响并不是使其大量表达，而是适当的提高就能达到最好的效果。

总之，合成启动子与CARK1基因(ANDp：CARK1)的最优组合，大大提高了植物对干旱的耐受力。对于转基因工程具有很好的应用前景。

序列表

<110> 四川大学

<120> 合成启动子ANDp及其在植物抗干旱中的应用

<130> A180153K（序）

<141> 2018-03-09

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgactcaaaa caaacttacg aaatttaggt agaacttata tacattatat gtgtaatttt 60

ttgtaacaaa atgtttttat tattattata gaattttact ggttaaatta aaaatgaata 120

gaaaaggtga attaagagga gagaggaggt aaacattttc ttctattttt tcatattttc 180

aggataaatt attgtagaag tttaaaagat ttccatttga ctagtgtaaa tgaggaatat 240

tctctagtaa gatcattatt tcatctactt cttttatctt ctaccagtag aggaataaac 300

aatatttagc tcctttgtaa atacaaatta attttcgttc ttgacatcat tcaattttaa 360

ttttacgtat aaaataaaag atcataccta ttagaacgat taaggagaaa tacaattcga 420

atgagaagga tgtgccgttt gttataataa acagccacac gacgtaaacg taaaatgacc 480

acatgatggg ccaatagaca tggaccgact actaataata gtaagttaca ttttaggatg 540

gaataaatat cataccgaca tcagtttgaa agaaaaggga aaaaaagaaa aaataaataa 600

aagatatact accgacatga gttccaaaaa gcaaaaaaaa agatcaagcc gacacagaca 660

cgcgtagaga gcaaaatgac tttgacgtca caccacgaaa acagacgctt catacgtgtc 720

cctttatctc tctcagtctc tctataaact tagtgagacc ctcctctgtt ttactcacaa 780

atatgcaaac tagaaaacaa tcatcaggaa taaagggttt gatt 824

<210> 2

<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtaattttc tagatccgtc ttgggagctc agactgtatc agtgatgatg atgatgatga 60

agaagagaac gaattttgaa attggcggtt ttgaattttt aagaaattaa aaaatatccc 120

ccgtcgattt caagagggag atggagatac caaagcaact ctcgccactt gtcgtctttt 180

aattttaatt gagtacgtta tgccgtttta aatgttcaaa acagcacaca gttgatagct 240

gaattgattt tttcttttgc cgttttgtta tatttaaaca acacacagtg catttgccaa 300

ataactacat gatgggccaa taaacgtgga ccgactaaaa ctaaataata gaagatacat 360

cgataggctt ctctaaagat cggataaaag ataatgtcgc atagccacgt agagagcaac 420

tggctgagac gtggcaggac gaaacggacg catcgtacgt gtcagaatcc tacagaagta 480

aagagacaga agccagagag aggtggttcg gccatatgtc atcgttctct ctataaactt 540

tatggaactt tgttctgatt ttctcagaga cacgaaaaga aagaaaacaa cactagaaca 600

aagagggttt gattgattca cttgaaaaag agaaaacaca gctttggaaa 650

<210> 3

<211> 346

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaaca 346

<210> 4

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccacgtaga gagcaactgg ctgagacgtg gcaggacgaa acggacgcat cgtacgtgtc 60

agaatcctac agaagtaagg ataaaagata atgtcgcata gccacgtaga gagcaactgg 120

ctgagacgtg gcaggacgaa acggacgcat cgtacgtgtc cctttatctc tctcagtctc 180

tcgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 240

atttggagag aacacggggg ac 262

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccacacgac gtaaacgtaa aatgaccaca tgatgggcca atagacatgg accgactact 60

aataatagta agttacattt taggatggaa taaatatcat accgacatca gtttgaaaga 120

aaagggaaaa aaagaaaaaa taaataaaag atatactacc gacatgagtt ccaaaaagca 180

aaaaaaaaga tcaagccgac acagacacgc gtagagagca aaatgacttt gacgtcacac 240

cacgaaaaca gacgcttcag acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat 300

ataaggaagt tcatttcatt tggagagaac acgggggac 339

<210> 6

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gccacacgac gtaaacgtaa aatgaccaca tgatgggcca atagacatgg accgactact 60

aataatagta agttacattt taggatggaa taaatatcat accgacatca gtttgaaaga 120

aaagggaaaa aaagaaaaaa taaataaaag atatactacc gacatgagtt ccaaaaagca 180

aaaaaaaaga tcaagccgac acagacacgc gtagagagca aaatgacttt gacgtcacac 240

cacgaaaaca gacgcttcag ccacgtagag agcaactggc tgagacgtgg caggacgaaa 300

cggacgcatc gtacgtgtca gaatcctaca gaagtaagga taaaagataa tgtcgcatag 360

ccacgtagag agcaactggc tgagacgtgg caggacgaaa cggacgcatc gtacgtgtcc 420

ctttatctct ctcagtctct cgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct 480

atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga c 521

<210> 7

<211> 1095

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggctgct ttggttgttg tggtggtggt gaggatttcc gtagagtttc tgaaactgga 60

ccaaagccag tgcataacac tggaggttac aatggaggtc accatcaaag ggcagatcca 120

cccaaaaacc ttccagtcat tcagatgcag cctatctctg ttgcggccat tccagctgat 180

gaattgaggg atataacgga taactatggt tcaaagtcct tgattggtga gggttcatat 240

ggaagagtct tttatggtat tcttaaaagt ggtaaagcag ctgccattaa gaaactggat 300

tctagtaagc aaccagatca agaatttctc gcccaggtat caatggtttc gagattgcga 360

caagaaaatg ttgttgcgct tctgggctat tgtgttgatg gcccactccg tgttcttgct 420

tatgaatatg ctcctaatgg atctcttcat gatattcttc atggtcgaaa aggtgttaaa 480

ggggcacagc caggtcctgt tctgtcgtgg caccagagag tcaaaattgc tgttggtgcg 540

gctagaggac tcgagtactt gcatgagaag gcaaaccctc atgttatcca cagagacatc 600

aaatccagca atgtacttct gttcgatgat gatgttgcca agattgctga ttttgatttg 660

tccaaccaag cccctgacat ggctgctcgc cttcactcaa cccgtgtgct cggaaccttt 720

ggctatcacg ctccagagta tgcaatgacg gggacgttga gcacaaagag tgatgtctat 780

agttttggcg ttgttctgct ggagctcctc acaggtcgta aaccagttga tcatacctta 840

ccacgtggac agcagagtgt cgtgacatgg gcaaccccta aattgagtga agacaaggtg 900

aagcagtgtg ttgacgcaag actaaacgga gaatatcctc ccaaagctgt tgctaagctg 960

gctgcggtag ctgcactgtg tgtgcaatat gaggcagact tcaggcctaa catgagcata 1020

gtggtgaagg ctcttcagcc gttgctcaat cctcctcgtt ctgctcccca gactccacac 1080

aggaacccgt attga 1095

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggctgct ttggttgttg tggtg 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaatacggg ttcctgtgtg gagtc 25

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtcgacggta tcgataagct tgccacgtag agagca 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgctctagaa ctagtggatc cgtcccccgt gttctc 36

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtcgacggta tcgataagct tgccacacga cgtaaa 36

<210> 13

<211> 2131

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggatcaaa cagaggaacc accactcaac acacaccagc agcacccaga agaagttgaa 60

catcatgaga atggtgcgac taagatgttt aggaaagtaa aggctagagc taagaagttc 120

aagaacagtc tcactaaaca tggacaaagc aatgagcatg agcaagatca tgatttggtt 180

gaagaagatg atgatgatga cgagctagaa cctgaagtga tcgatgcacc aggcgtaaca 240

ggtaaaccta gagaaactaa tgttccagca tcggaggaaa ttattccacc agggacaaag 300

gtgtttcctg tcgtgtcttc cgattacacc aaacccactg aatctgtacc agtacaagag 360

gcctcttacg gacacgatgc accggctcat tctgtaagga cgacgtttac atcggacaag 420

gaagagaaaa gagatgtacc gattcatcat cctctgtccg aattgtcaga cagagaagag 480

agtagagaga ctcatcatga gtcattgaac actccggtct ctctgctttc tggaacagag 540

gatgtaacga gtacgtttgc tccaagtggt gatgatgaat atcttgatgg tcaacggaag 600

gtcaacgtcg agaccccgat aacgttggag gaagagtcgg ctgtttcaga ctatcttagt 660

ggtgtatcta attatcagtc caaagttact gatcccacca aagaagaaac tggaggagta 720

ccggagattg ctgagtcttt tggtaatatg gaagtgactg atgagtctcc tgatcagaag 780

ccaggacaat ttgaaagaga cttgtcgacg agaagcaaag aattcaaaga gtttgatcag 840

gactttgact ctgttctcgg taaggattcg ccggcgaaat ttccaggtga atcaggagtt 900

gttttcccgg tgggctttgg tgacgagtca ggagctgagc tggaaaaaga ttttccgacg 960

agaagtcatg attttgatat gaagactgaa actggaatgg acacgaattc tccatcaaga 1020

agccatgaat ttgatctgaa gactgaatct ggaaacgaca agaattctcc gatgggcttt 1080

ggtagtgaat caggagctga gctggaaaaa gaatttgatc agaagaacga ttctggaaga 1140

aacgagtatt cgccggaatc tgacggcggt ttaggagctc cgttgggagg aaattttccg 1200

gtgagaagtc atgagttgga tctgaagaac gaatctgata tcgacaagga tgtgccgacg 1260

ggatttgacg gagaaccaga ttttctggcg aagggaagac ctggatacgg tgaggcatca 1320

gaagaggata aatttccggc gagaagtgat gatgtggaag tagagactga gctgggaaga 1380

gacccaaaga cggagactct tgatcaattc tcaccggaac tttctcatcc taaagaaaga 1440

gatgagttta aggagtccag agatgatttt gaggagacga gagatgagaa aacagaggag 1500

ccaaaacaga gcacttacac agagaagttt gcttcaatgc taggttactc cggagaaatt 1560

ccggtgggag atcaaactca agtggcggga actgttgatg agaagttgac tccggtcaat 1620

gagaaggatc aagaaacaga gtctgccgtg acgacgaagt tacctatctc cggaggtgga 1680

agtggagtag aggagcaacg aggggaagat aaaagtgtgt cgggtagaga ttatgtggcg 1740

gagaaactga caactgaaga agaagacaaa gccttttctg atatggttgc cgagaaactt 1800

cagattggag gagaagaaga gaagaaggaa acgacgacaa aggaagtgga gaagatctct 1860

accgagaagg cagcatcgga ggagggtgag gcggtggaag aggaagtgaa aggaggagga 1920

ggaatggttg ggaggattaa aggatggttc ggtggtggtg cgactgatga ggtgaagcca 1980

gaatcgcaca ttctgttgaa gaggctccaa aatcatctgg ctggtttggt ggtggtcgac 2040

ggaggaggtg aagccaaaat cgcctcattc cgttgaagag tctccacaat cacttggctc 2100

cactgttgtt ccggtgcaga aggagcttta a 2131

<210> 14

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggagtcac agttgacacg tccttatggt catgagcaag cagaagaacc aatcagaatt 60

caccatccag aagaagaaga gcatcatgag aagggagcat ccaaagtgtt gaagaaagta 120

aaagaaaagg ctaagaaaat caagaacagt ctcactaaac atggaaatgg tcatgatcac 180

gatgtggaag atgatgatga tgagtatgac gagcaagacc cagaagttca cggcgcacca 240

gtgtatgaat cctctgccgt gagaggtggt gtaacgggta aacctaagtc tcttagtcat 300

gccggagaaa ctaatgttcc ggcatcggag gagattgttc ctccagggac aaaagttttt 360

cctgtcgtgt cttctgacca caccaaaccc attgagcctg tatcattaca agatacctct 420

tacggacatg aggcactggc tgatcctgta agaacgacgg aaacatcgga ctgggaagcg 480

aaaagagagg caccgactca ttatcctctc ggagtgtcag aattttcaga cagaggagag 540

agcagagagg ctcatcaaga gccattgaac actcctgtgt ctctgctttc agcaacagag 600

gacgtgacta ggacgtttgc tcctggtggt gaagatgact atctcggtgg tcaacggaaa 660

gtcaacgtcg agacgccaaa acgtttggag gaagatccgg ctgctccagg aggaggatcg 720

gattatctca gtggtgtatc taattatcag tccaaagtta ctgatcccac gcataaaggt 780

ggagaagctg gagtaccaga gattgctgag tctcttggta gaatgaaagt gactgatgag 840

tctcctgatc agaaatcaag acaaggacgc gaagaagact ttccgacgag aagccatgag 900

tttgatctga agaaggaatc tgatatcaac aagaattctc cggcaagatt tggaggggaa 960

tcaaaagctg ggatggagga agattttccg acaagaggtg atgtgaaagt agagagtgga 1020

ttgggaagag acttaccgac gggaactcat gatcagttct caccagaact atctcgtccc 1080

aaagagagag atgattctga ggaaaccaaa gatgagtcga cacatgagac aaaaccaagc 1140

acctacacag agcagttagc ttcagctaca tcagccataa ctaacaaagc tatagccgca 1200

aagaacgtcg ttgcctcaaa gctaggttac accggagaga atggcggcgg gcaaagcgag 1260

agccctgtaa aagatgaaac tccgagatct gttactgctt acgggcagaa agtggcggga 1320

actgttgctg agaagttgac tccggtttac gaaaaagtca aagaaacagg atcaacggtg 1380

atgacaaagc tacctctctc cggaggtgga agtggagtga aggagacgca acaaggggaa 1440

gagaaaggtg tgacggctaa aaattatata tcagagaagc tgaaacctgg agaagaggac 1500

aaagctttat cggaaatgat agctgagaaa cttcattttg gaggaggagg agagaagaag 1560

acaacggcta caaaggaggt ggaagtgacg gttgagaaga taccttccga ccagatagcg 1620

gaggggaaag gacatggtga ggcggttgca gaggaaggaa aaggtggaga aggaatggtg 1680

gggaaagtta aaggagcggt cacttcttgg ctcggtggta aaccgaagtc gccacggtcc 1740

gttgaagagt ctccacaatc acttggcacc accgttggga ctatggggtt ttcggattcc 1800

ggtggaagtg agttgggagg cagtggcgga ggtaagggag ttcaagattc tgggaactga 1860

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

accttccagt cattcaga 18

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accatagtta tccgttatat cc 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcaacacaca ccagcagcac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atcggaagac acgacaggaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atcggaagac acgacaggaa 20

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctcttttcg cttcccagt 19

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggtaacattg tgctcagtgg tgg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aacgacctta atcttcatgc tgc 23

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gccacgtaga gagcaactgg ctgag 25

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcaatacggg ttcctgtgtg gagt 24

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gccacacgac gtaaacgtaa aatga 25

<210> 26

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gccacacgac gtaaacgtaa aatgaccaca tgatgggcca atagacatgg accgactact 60

aataatagta agttacattt taggatggaa taaatatcat accgacatca gtttgaaaga 120

aaagggaaaa aaagaaaaaa taaataaaag atatactacc gacatgagtt ccaaaaagca 180

aaaaaaaaga tcaagccgac acagacacgc gtagagagca aaatgacttt gacgtcacac 240

cacgaaaaca gacgcttca 259

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tccctttatc tctctcagtc tctcgacgca c 31

<210> 28

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gccacgtaga gagcaactgg ctgagacgtg gcaggacgaa acggacgcat cgtacgtgtc 60

agaatcctac agaagta 77

<210> 29

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

aggataaaag ataatgtcgc atagccacgt agagagcaac tggctgagac gtggcaggac 60

gaaacggacg catcgaacgt g 81

<210> 30

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga 60

gaacacgggg gac 73

Claims (8)

1.合成启动子ANDp，其特征在于：在干旱胁迫时表达耐旱基因CARK1；所述合成启动子ANDp的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.含有权利要求1所述的合成启动子ANDp的表达盒。

3.含有权利要求1所述的合成启动子ANDp或权利要求2所述表达盒的重组载体或重组微生物。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述载体为表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的表达载体为真核表达载体。

6.权利要求1所述的合成启动子ANDp、权利要求2所述的表达盒、权利要求3所述的重组载体或重组微生物、权利要求4或5所述的重组载体在植物抗干旱中的用途。

7.权利要求1所述的合成启动子ANDp在干旱胁迫时表达耐旱基因CARK1的用途。

8.提高拟南芥耐旱能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将权利要求1所述的合成启动子ANDp连接CARK1基因，形成可被诱导表达该基因的重组载体；

b、将a步骤构建的重组载体转入到农杆菌中，通过花絮浸染，获得后代，筛选后培育成稳定型转基因植株。

Images