CN103882023A - 一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2及其应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子。本发明将上述启动子应用在植物转基因工程中。本发明所克隆的水稻启动子PosDro2能够调控基因在干旱胁迫诱导的条件下在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中在干旱胁迫诱导的条件下表达，可以提高和改善水稻的生长特性和抗旱能力，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因耐旱植物品种。

Description

一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种植物干旱胁迫诱导表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中在干旱条件下驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

环境变化对农业生产的影响日益严重，恶劣的环境条件特别是在作物灌浆和结实期出现的恶劣环境几乎可以让农民颗粒无收，造成重大经济损失。而植物生长在固定的环境条件，需要适应环境条件的变化，使自己的生长发育过程与所处的环境条件相适应，适应环境条件变化的能力对植物而言是至关重要的。

干旱等非生物胁迫是自然界常见的不利环境因子，它们严重地制约了植物的生长发育。植物生长在土壤里，自身不能移动，为了抵抗或适应干旱等不利的环境因子，植物自身会诱导表达一批应答基因，产生一些使细胞免受干旱等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子。已有文献报道从植物中分离了一些抗逆相关基因和一些逆境应答的启动子，如Garcia等研究了SalT启动子，Kasuga等研究过RD29A启动子。但在重要农作物水稻中尚未分离到受干旱诱导表达的启动子用于植物抗逆遗传工程。

此外，前人关于利用干旱等逆境诱导基因及其启动子提高植物抗逆性的实验证据基本上是以拟南芥或烟草等模式植物为研究体系而得到的结果，而这些结果能都成功地在禾谷类作物中体现还很少有报道。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，并且水稻抗旱研究日益受到人们的关注，因此，干旱特异诱导性启动子的分离和鉴定对于水稻抗旱遗传改良显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种驱动外源基因在干旱诱导条件下表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2包含序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）的水稻干旱诱导表达启动子，本文中称为PosDro2或启动子PosDro2。

优选地，本发明提供的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列，即PosDro2或启动子PosDro2。

另一方面，本发明提供一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2具有与SEQID No:1所示的DNA序列杂交的产物。并且这些植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同功能，即驱动目标基因在干旱胁迫诱导下植物中表达。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2的表达盒。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，在所述重组表达载体中，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2连接于待表达的基因序列的上游；优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro2，该重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即PosDro2或启动子PosDro2构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体，本文中称为pCAMBIA1391-PosDro2。

在一种优选实现方式中，为了提高植物的耐旱性，待表达基因采用具有耐旱性或能够提高植株耐旱性的基因。

另一方面，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2、上述表达盒、或上述重组表达载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2、上述表达盒、上述重组表达载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。

再一方面，本发明提供上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2连接于载体的待表达的基因序列上游（例如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No：1中相同）：

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“tgaagggtca agttgggaag ga”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“gttcgtcct gctggtggtggtg”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。

综上所述，本发明的发明人从日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare）中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1853bp的DNA序列，并将其命名为PosDro2（序列表中的SEQ ID No:1）。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒（即重组表达载体），利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株在干旱诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平相对较高并显蓝色，从而证明该1853bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻干旱诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接（例如，耐旱基因），构建重组植物表达载体，经转化，干燥诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子PosDro2能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性和抗旱能力，代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的耐旱转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将PosDro2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，图1中A为pCAMBIA1391的示意图，图1中B为pCAMBIA1391-PosDro2示意图，其中示出了利用PosDro2启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；

图2为萌发14天后的PosDro2::GUS转基因植株组织染色图。A为未处理根组织经染色24小时后的结果，仅在中央维管束个别位置出现微弱GUS染色；B为未处理茎组织经染色24小时后的结果，未观察到GUS染色；C为未处理叶片组织经染色24小时后的结果，仅在个别位置出现微弱GUS染色；D为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，根组织特别是侧根中出现强烈GUS染色；E为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，茎组织出现强烈GUS染色；F为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，叶片组织出现明显的GUS染色（标尺=20mm）。

图3为对本发明的启动子进行酶切验证的结果示意图。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的PosDro2启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv.Nipponbare）全基因组序列，依据水稻PosDro2基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391（图1中A部分，该载体来自于CAMBIA为公开使用载体，在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物（SEQ ID No:2）5’端带SalI，酶切位点（GTCGAC），反向引物（SEQID No:3）5’端带EcoRI，酶切位点（GAATTC），引物序列如下：

正向引物：GTCGACTGAAGGGTCAAGTTGGGAAGGA SalI

反向引物：GAATTCCACCACCACCAGCAGGACGAAC EcoRI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子PosDro2的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子PosDro2，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，执行35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1853bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体（购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合）上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和EcoRI进行双酶切验证，如图3所示。将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子PosDro2，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子PosDro2的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和EcoRI双酶切，回收启动子PosDro2片段。同时利用SalI和EcoRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的PosDro2片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶（购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子PosDro2与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-PosDro2（图1中的B），利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用SalI和EcoRI进行酶切验证，验证结果如图3中所示。

利用启动子PosDro2驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

将成熟水稻种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50%次氯酸钠（原液有效氯浓度大于4%）溶液浸泡种子40min（150r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀对种子沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediatedtransformation based on phosphomannose isomerase positive selection inJaponica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.）等提出的方法。

共获得29株pCAMBIA1391-PosDro2植株（PosDro2：：gus转基因水稻植株）。

步骤2、干旱处理和GUS组织化学染色

对于所获得的水稻植株，用300mM甘露醇胁迫处理24小时后，进行GUS染色，其染色方法参照Jefferson(Jefferson RA等人.GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

对萌发14天后的PosDro2::GUS转基因植株组织进行染色后所得结果如图2所示。具体而言，图2的A部分为未处理根组织经染色24小时后的结果，仅在中央维管束个别位置出现微弱GUS染色；B部分为未处理茎组织经染色24小时后的结果，未观察到GUS染色；C部分为未处理叶片组织经染色24小时后的结果，仅在个别位置出现微弱GUS染色；D部分为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，根组织特别是侧根中出现强烈GUS染色；E部分为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，茎组织出现强烈GUS染色；F部分为用300mM甘露醇胁迫处理24小时后的结果，染色仅1小时后，叶片组织出现明显的GUS染色。

因此，从实验结果可以看出，本发明的植物干旱胁迫诱导启动子能够在干旱胁迫（利用甘露醇）下驱动靶标基因集中表达。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2的DNA序列为SEQID No:1所示的序列。

3.根据权利要求1所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，其特征在于，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2的DNA序列与SEQID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；

或者，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；

或者，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2具有与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交的产物。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2，在所述重组表达载体中，所述植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2连接于载体中待表达的基因序列的上游；

优选地，所述待表达的基因为Gus基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1391-PosDro2，其中pCAMBIA1391为植物双元表达载体。

6.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2、权利要求4所述的表达盒、或权利要求5所述的重组表达载体，其中，所述宿主菌为根癌农杆菌。

7.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2、权利要求4所述的表达盒、或根据权利要求5所述的重组表达载体。

8.一种根据权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1-3中任意一项所述的植物干旱胁迫诱导表达启动子PosDro2连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦。

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