CN104845974A - 能够响应长期冷胁迫的DNA片段POscold5 - Google Patents

Abstract

能够响应长期冷胁迫的DNA片段POscold5，本发明公开一种DNA片段，所述DNA片段包含：1)序列表中SEQ IDNO：1所示的DNA序列；或者2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA片段。该DNA片段可以用作植物冷诱导表达启动子。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体并将其应用于植物基因工程中。该启动子对于水稻耐冷性分子机制的研究，以及水稻耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。

Description

能够响应长期冷胁迫的DNA片段POscold5

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种DNA片段，其能够对长期冷胁迫进行响应，进而在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在植株中表达。

背景技术

很多作物，尤其是水稻是对温度极为敏感的作物，世界水稻主产区普遍存在的问题便是低温冷害的问题。芽期、苗期和孕穗开花期遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少，最终造成水稻产量的大幅度降低。另外，温度也是影响水稻籽粒品质的一个重要的环境因素。因此，迫切需要发掘水稻耐冷种质资源，培育出水稻耐冷品种。

近年来，随着分子生物学的发展，在水稻耐寒性理论的研究方面取得许多进展，包括一些关键的耐冷相关基因或QTL相继被克隆。利用这些关键基因，可以有效提高植物对低温的耐受性。但目前的基因工程操作中，大部分是利用组成型启动子驱动这些关键基因的表达，所获转基因植株虽然能够表现出较强的低温耐性，但组成型启动子往往会带来一些不必要的表达，比如造成植株矮小，发育延滞和物质能量浪费，不利于潜在的实际应用推广。因此，利用冷诱导启动子，特异的激活关键调控基因，将在植物抗冷基因改良中起到重要作用。

我国水稻资源丰富，从水稻中发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子将对水稻耐冷品种的选育具有重要的理论及实际意义，在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。因此，人们迫切希望找到更多的非组成型启动子，用于提高水稻的耐冷性。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种DNA片段，其能够驱动外源基因在冷诱导条件下特异性表达，获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用，进而提高植物的耐寒性。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：

1)序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

2)和3)中的序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基因在植物中表达。

优选地，本发明所述DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。

优选地，序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列可以用作植物冷诱导强表达启动子。

序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列可以提取自日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)，本文中称为POscold5或启动子POscold5。具体而言，本申请的发明人发现日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1259bp的DNA序列，具有驱动目标基因在寒冷条件下特异性表达的功能，并且分离克隆、并鉴定了该DNA序列的功能。但是，需要说明的，后续人们根据本发明公开内容而人工合成的相同序列也包含在本发明的范围内。

另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导强表达启动子的表达盒。

另一方面，本发明还提供一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：AAGCTTGCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC；所述第二引物的DNA序列包含片段：GTCGACCATTGCTGAAGCTGCTGAACTC。

又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导强表达启动子POscold5连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的，所述待表达的基因为任何对作物的耐寒性具有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动该耐寒基因在寒冷条件下表达，从而实现改善作物耐寒性状的功能。

再一方面，本发明提供上述植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本发明提供的上述DNA片段连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。

本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同)：

GAACGAACGGCGCCCGAGCATTTTCGTCGGCGTTTCTGGAACGGCTTCTGTTTCTCTCCACTGTCGCAGCGGTGGAGATCTTTCGTCAACTGAGTTTGGAGCTGTCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCGTTCGCGTGCAGAGCTGGAGATCAAACTCAACTTTTTCTTTCGGTACAGCGACTCTCCAGTCTCCTCGGTCGATCGTTTCTCCTGTTCCCTTCTGATGCGTGTGATCATAAACCTGGTATCATTTGATTGAGATTGATAATAACCTGCTGTAACTTAGCGAATTACCAGAGTTACTCCGTTTTGCTTGTACAGTTTCCGGTTTCTTTGCCATTTCGTTTACAGATAGCACTCATTATTATCTCAACAAAATATACACAATTTCATTTAGTAACTAAGGGCCTGTTGGGCTGCCCAGGCTGCGACTGCCGGCATGAACAGTGCCACATTCACTGTGCACAGCCGCGGCGCTTGCTGAATAGGCCCTAAATTATCGTGGAACTGTACGTCAGTGTAATAATTGTTTAATCACAACCTACAACTAAAGTTGTGTTTAGATCCAAACTTCAATTCTTTTCCATCACATCACATGTCATACACACACAACTTTTCAGTCACATCATCTCCAATTTCAACCAAAATTTAAACTTTGCGCTGAACTAAACACAGCCTAGTACTCCCTCCGTTATATTTCATATTATAAGTTATTTAATTTTTTTCTTAATCAAATACTTACAACAAATTTTACCCTTGTTTTTTTTAAAACGATGCTCGATCGATCGAGAATTTCCATCACCGTTTTCATAATCATCAGTAACCACACCTACAACTGGTACAACACGGTGATATTTTCAACACGAAAAGTAGTTCTGTCAGTACCAGTTCCACGTCAAAGAAACCACGGCGATTTTCTACCGGTCGGAGAATTCCGTCCTTCCGGGACAAAATCCACGCCAACCACAAGCTCACCACAAAGAGAGATCAGAGATGCCATCGGAATATTCTCCGTTTCCATCTCGTTCTGCATTTTCGTGGGCTTTGATTATTATTCGTCGAAACTTCCCAAACTCGCGAATTTACCACGCGTGTCCCGTATGATCCCTCTCCTCTCCATCGTACGTTATCAGCGACTATAAATACGGCCTCGACTCCGGACACCTTCTTCTTCCTGCTGTTCAGAGCAACGGTAGCTGACAGTGACG

需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“GCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“GAGTTCAGCAGCTTCAGCAATG”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也落入本发明的保护范围之内。

综上所述，本发明的发明人发现、提取并鉴定了日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的1259bp的DNA序列，并将其命名为POscold5。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1391上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行Gus表达定量检测发现，转基因植株在低温诱导处理后，整体上的Gus基因表达水平提高，从而证明该1259bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻低温诱导处理后表达。

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因连接，构建重组植物表达载体，经转化后，在低温诱导处理后可驱动靶标基因在植株中特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物中的表达量，增加转基因的效果。

技术效果

本发明所克隆的水稻启动子POscold5能够调控基因在植株中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子驱动耐寒基因在植株中表达，可以提高和改善水稻的生长特性，尤其是耐寒特性，从而培育出理想的生物安全性高的耐冷转基因植物品种。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为将POscold5启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1中A为pCAMBIA1391示意图，图1中B为pCAMBIA1391-POscold5示意图，其中示出了利用POscold5启动子驱动位于其下游的Gus基因表达；

图2为对本发明启动子进行酶切验证的结果示意图；

图3为6周苗龄的POscold5::GUS转基因植株组织染色图。在30℃条件下正常生长的水稻植株，经24小时染色后，根、叶鞘、叶均无Gus活性，而在4℃冷处理24小时后，再经过30min染色后，在根、叶鞘、叶中均有Gus强烈表达。

图4为冷处理0h、12h、24h后POscold5与作为对照的PUBI的相对表达量的变化。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

含有酶切位点的POscold5启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POscold5基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。

本实验例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物(SEQ ID No:2)5’端带HindIII，酶切位点(AAGCTT)，

反向引物(SEQ ID No:3)5’端带SalI，酶切位点(GTCGAC)，引物序列如下：

正向引物：AAGCTTGCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC HindIII

反向引物：GTCGACCATTGCTGAAGCTGCTGAACTC SalI

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子POscold5的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POscold5，按常规PCR体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1259bp，将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照冷激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆菌液提质粒，用HindIII和SalI进行双酶切验证，验证结果如图2所示。将经过鉴定的阳性克隆送并Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POscold5，其核酸序列如SEQ ID No:1所示。

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

从上面“启动子POscold5的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用HindIII和SalI酶切，回收启动子POscold5片段。同时利用HindIII和SalI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收pCAMBIA1391，将上述的POscold5片段和pCAMBIA1391片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POscold5与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-POscold5，利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)。

利用启动子POscold5驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀沿种子的糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤组织与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌的转化。

采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，获得POscold5::gus转基因水稻植株，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照YongboDuan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based onphOsphomannOse isomerase pOsitive selection in Japonica rice(Oryza sativaL.)[J].Plant Cell Report,2012.DOI10.1007/s00299-01201275-3.)等提出的方法。

步骤2、POscold5-pCAMBIA1391植株的冷胁迫处理和POscold5的冷响应活性

从转基因植株POscold5-pCAMBIA1391植株和作为对照的PActin-pCAMBIA1391植株(来自于美国康奈尔大学，由目前基因工程中常用的组成型启动子水稻PActin驱动GUS基因，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)中，挑选4个T2种子用于启动子活性鉴定。将萌发后6周龄苗分别置于4℃下24h进行冷胁迫处理，平行材料则置于30℃正常生长环境下作为对照。

Gus染色：取4℃下24h进行冷胁迫处理的材料，将其根、叶鞘、叶分别染色并拍照。结果显示在4℃的冷诱导24小时的条件下，根、叶鞘和叶均能被染成明显可见的蓝色(图3)，说明该启动子在4℃处理24小时时可驱动GUS基因强烈表达。

Gus定量：取处理0h、12h、24h的全株材料作为样本，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，再使用天根生长科技有限公司的Fastquant RT试剂盒反转录为cDNA，以cDNA为模板，以ACTIN基因为内参，以天根生化科技有限公司的SuperReal PreMix Plus实时荧光定量PCR预混液为反应试剂，在ABI公司的PRISM7500荧光PCR仪上，通过qRT-PCR反应检测POscold5和PActin启动子驱动的Gus表达强度。其中，用于标定ACTIN基因的定量qRT-PCR引物为：

ACTIN上游引物：5’-CCTTCAACACCCCTGCTATG-3’,

ACTIN下游引物：5’-CAATGCCAGGGAACATAGTG-3’

用于检测GUS基因表达的qRT-PCR引物为：

Gus上游引物：5’-TACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCA-3’

Gus下游引物：5’-CAGGTGTTCGGCGTGGTGTAGAG-3’

结果显示，在没有冷诱导时，POscold5-pCAMBIA1391植株中Gus基因的表达量仅为PUBI驱动Gus活性的百分之二，而随着冷处理，POscold5表达活性显著提高，在冷处理24小时后，POscold5的表达活性达到未处理时的近30倍，同时也是PUBI的表达量的一半以上，结果见图4。该结果表达POscold5是一种低本底、冷响应灵敏且诱导强度高的冷诱导启动子。

虽然上面结合本发明的优选实施例对本发明的原理进行了详细的描述，本领域技术人员应该理解，上述实施例仅仅是对本发明的示意性实现方式的解释，并非对本发明包含范围的限定。实施例中的细节并不构成对本发明范围的限制，在不背离本发明的精神和范围的情况下，任何基于本发明技术方案的等效变换、简单替换等显而易见的改变，均落在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包含：

1)序列表中SEQ ID NO：1所示的DNA序列；或者

2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或者

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且具有启动子功能的DNA分子，其中

SEQ ID NO：1中所示序列为

gcagagggcg gaacaagtga acgaacgaac ggcgcccgag cattttcgtc ggcgtttctg 60

gaacggcttc tgtttctctc cactgtcgca gcggtggaga tctttcgtca actgagtttg 120

gagctgtctg ctctctctct ctctctctct ctctcccgtt cgcgtgcaga gctggagatc 180

aaactcaact ttttctttcg gtacagcgac tctccagtct cctcggtcga tcgtttctcc 240

tgttcccttc tgatgcgtgt gatcataaac ctggtatcat ttgattgaga ttgataataa 300

cctgctgtaa cttagcgaat taccagagtt actccgtttt gcttgtacag tttccggttt 360

ctttgccatt tcgtttacag atagcactca ttattatctc aacaaaatat acacaatttc 420

atttagtaac taagggcctg ttgggctgcc caggctgcga ctgccggcat gaacagtgcc 480

acattcactg tgcacagccg cggcgcttgc tgaataggcc ctaaattatc gtggaactgt 540

acgtcagtgt aataattgtt taatcacaac ctacaactaa agttgtgttt agatccaaac 600

ttcaattctt ttccatcaca tcacatgtca tacacacaca acttttcagt cacatcatct 660

ccaatttcaa ccaaaattta aactttgcgc tgaactaaac acagcctagt actccctccg 720

ttatatttca tattataagt tatttaattt ttttcttaat caaatactta caacaaattt 780

tacccttgtt ttttttaaaa cgatgctcga tcgatcgaga atttccatca ccgttttcat 840

aatcatcagt aaccacacct acaactggta caacacggtg atattttcaa cacgaaaagt 900

agttctgtca gtaccagttc cacgtcaaag aaaccacggc gattttctac cggtcggaga 960

attccgtcct tccgggacaa aatccacgcc aaccacaagc tcaccacaaa gagagatcag 1020

agatgccatc ggaatattct ccgtttccat ctcgttctgc attttcgtgg gctttgatta 1080

ttattcgtcg aaacttccca aactcgcgaa tttaccacgc gtgtcccgta tgatccctct 1140

cctctccatc gtacgttatc agcgactata aatacggcct cgactccgga caccttcttc 1200

ttcctgctgt tcagagcaac ggtagctgac agtgacggag ttcagcagct tcagcaatg 1259。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段提取自日本晴水稻。

3.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为水稻冷诱导强表达启动子，并且所述DNA片段为非组成型启动子，优选地，所述水稻冷诱导强表达启动子响应于长期冷胁迫而驱动目标基因表达，所述长期指的是大于12小时或大于24小时。

4.一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的DNA序列包含片段：AAGCTTGCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC；所述第二引物的DNA序列包含片段：GTCGACCATTGCTGAAGCTGCTGAACTC。

5.一种含有权利要求1所述的DNA片段的重组载体，其特征在于，所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1391的多克隆位点插入权利要求1所述的DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中，所述植物冷诱导强表达启动子POscold5连接于载体中待表达的基因序列的上游。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述待表达基因为耐寒基因。

7.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的DNA片段。

8.一种根据权利要求1中任意一项所述的DNA片段在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将根据权利要求1中所述的DNA片段连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物：水稻、玉米、小麦、大麦、高梁或燕麦。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待表达基因为耐寒基因。