KR19990000606A - 화학적 조절제의 확인방법 및 화학적 조절제를 확인하기 위한 분석법 - Google Patents

화학적 조절제의 확인방법 및 화학적 조절제를 확인하기 위한 분석법 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

화학적 조절제의 확인방법 및 화학적 조절제를 확인하기 위한 분석법
제 1도는 λtobcbrPR1013의 부분적인 제한 효소 지도이고,
제 2도는 λtobcbrPR1013으로부터 pBS-PR1013Cla의 작성을 도시하며,
제 3도는 λtobcbrPR1013으로부터 pBS-PR1013Eco의 작성을 도시하고,
제 4도는 pBS-PR1013Cla으로부터 pBS-PR1013Eco의 작성을 도시하며,
제 5도는 pBS-PR1013Eco로부터 pBS-PR1013Eco △Pst의 작성을 도시하고,
제 6도는 pBS-PR1013Eco △Pst로부터 pBS-PR1013Eco △Pst △Xbo의 작성을 도시하며,
제 7도는 pBI101.3 및 pBS-PR1013Eco △Pst △Xbo로부터 pCIB270의 작성을 도시하고,
제 8도는 M13mp18-PR1013Eco △Pst △Xbo 및 M13mp19-PR1013Eco △Pst △Xbo의 작성을 도시하며,
제 9도는 PR-la의 ATG 코돈의 NcoI 부위로의 전환을 도시하는 흐름설명도이고,
제 10도는 pCIb268의 작성도이며,
제 11도는 pBS-GUS 1.2 및 pCIB268로부터 pCIB269의 작성을 도시하고,
제 12도는 pBS-GUS 1.2의 작성도이며,
제 13도는 pCIB260 및 pCIB200의 작성도이고,
제 14도는 pCIB219의 제한효소 지도이며,
제 15도는 pCIB272의 제한효소 지도이고,
제 16도는 pCIB273의 제한효소 지도이며,
제 17도는 pCIB1004의 제한효소 지도이고,
제 18도는 pCIB200/PR1-BT의 제한효소 지도이며,
제 19도는 pCIB1207의 제한효소 지도이고,
제 20도는 pCIB1216의 제한효소 지도이며,
제 21도는 pCIB1233의 제한효소 지도이고,
제 22도는 pSBGluc39.1/GUS의 제한효소 지도이며,
제 23도는 pCIB200/Gluc39.1-GUS의 제한효소 지도이고,
제 24도는 pCIB200/Gluc39.1-BT의 제한효소 지도이며,
제 25도는 pBSGluc39.1/AHAS의 제한효소 지도이고,
제 26도는 pCIB200/Gluc39.1-AHAS의 제한효소 지도이며,
제 27도는 pBSGluc39.3/GUS의 제한효소 지도이고,
제 28도는 pCIB200/Gluc39.3-GUS의 제한효소 지도이며,
제 29도는 pCIB200/Gluc39.3-BT의 제한효소 지도이고,
제 30도는 pBSGluc39.3/AHAS의 제한효소 지도이며,
제 31도는 pCIB200/Gluc39.3-AHAS의 제한효소 지도이고,
제 32도는 pCIB1208의 제한효소 지도이며,
제 33도는 pCIB1230의 제한효소 지도이고,
제 34도는 pCIB1232의 제한효소 지도이며,
제 35도는 pBSGluc39.1/AHAS-SuR의 제한효소 지도이고,
제 36도는 pCIB/Gluc39.1-AHAS-SuR의 제한효소 지도이며,
제 37도는 pBSGluc39.3/AHAS-SuR의 제한효소 지도이고,
제 38도는 pCIB200/Gluc39.3-AHAS-SuR의 제한효소 지도임.
본 발명은 유전 물질의 화학적 조절 및 그렇게 조절될 수 있는 신규 물질에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 00화학적 조절제 존재하에서, 식물에서 기타 DNA 서열의 전사를 조절하는 비코딩 DNA 서열에 관한 것이다.
식물의 형질전환 및 재분화 기술에서의 발달과 결부된 재조합 DNA 기술에서의 발달은 새로운 유전 물질을 식물 세포, 식물 또는 식물조직으로 도입함으로써 식물 또는 식물 조직의 가치를 향상시키는 표현형과 같은 새로운 특징을 도입하는 것이 가능하게 되었다.
최근, 병원균에 대하여 내성(EP-A 240 332호 및 EP-A 223 452호)이거나 또는 곤충에 대하여 내성(베크, 엠, 일행, nature 328, 33 (1987))인 유전자 조작된 식물의 등장 및 제초제 내성식물(디블록, 엠. 일행, EMBO J. 6. 2513 (1987))의 제조는 작물의 개선 가능성을 밝혀준다. 표적 작물은 나무 및 관목 내지 관상용 꽃과 농작물일 수 있다. 작물은 몇가지 천연산물을 영양원으로 한 바이오리엑터(bioreactor)에서 성장한 식물 조직의 배양물일 수 있다.
어떤 경우에는 도입된 유전 물질의 식물, 식물 세포 또는 식물 조직에서의 발현 시기 및/또는 발현정도를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 이상적인 것은 조작된 특징의 발현을 농작물, 관상용관목, 바이오리엑터 등에 용이하게 적용될 수 있는 조절 매개체를 통하여 원하는대로 조절하는 것이다. 이것은 예를 들어 조절된 유전자의 발현이 화학적 조절제의 존재 여부로 결정되는 것과 같이 표현형 특징의 발현이 화학적 조절제의 존재 여부로 결정되는 것과 같이 표현형 특징의 발현이 조절제의 조절을 받게 되도록 표현형 특징을 코딩하는 유전자와 결합된 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열을 포함하는 화학적으로 조절가능한 키메라 유전자 발현 계에 관한 본 발명에 의하여 실현될 수 있다. 이 계는 식물 또는 식물 조직에서 키메라 유전자의 발현을 화학적으로 조절하는 첫 예이다. 이와 같이 이 계는 트랜스제닉 식물 또는 식물 조직의 제조 및 화학적 조절제의 작용에 의해 발현되는 특징의 조절을 가능하게 한다.
A. 식물 형질전환 기술의 일반적 개간
식물 및 식물 조직의 유전자 형질전환(즉, 외래 DNA의 식물로의 안정한 도입)을 행하는 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 이들은 아그로박테륨(Agrobacterium) 종에 의한 형질전환 및 직접적인 유전자 전달에 의한 형질전환을 포함한다.
1. 아크로박테륨 매개 형질전환
에이. 튜메파시엔스(A. tumefaciens)는 쌍자업식물 및 나자식물에서 흔한 질병인 크라운 갈(crown gall)의 병인체로서, 감염부위의 식물조직에서 종양 형성을 초래한다. 부상 부위에서 식물을 감염하는 아그로박테륨은 Ti(종양 유도) 플라스미드라 불리는 대형 염색체의 원소를 갖고 있다.
Ti 플라스미드는 종양 형성에 필요한 2개 영역을 함유한다. 한 영역은 궁극적으로 안정하게 식물 게놈 DNA에 전달되는 DNA 서열인 T-DNA(전달 DNA)이다. 종양 형성에 필요한 다른 영역은 전달 메카니즘에 관련된 vir(독성) 영역이다. 이 vir 영역은 안정한 형질전환에 절대적으로 필요하지만 이 vir DNA는 감염된 식물에 실제로 전달되지 않는다. 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 의한 감염으로 매개된 식물 세포의 형질전환과 뒤이은 T-DNA의 전달은 잘 보고되어 있다. 예를 들어 배반, 엠. 더블유, 및 칠튼, 엠. 디이, Int. Rev. Genet. 16, 357 (1982) 참조.
수년동안 많은 실험실에서 예의 연구한 결과, 아그로박테륨계는 각종 식물 조직의 통상적인 형질전환을 허용할 수 있게 개발되었다. 이렇게 형질전환된 조직의 대표적인 것으로 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 평지씨, 감자, 콩 및 포플라 등이 포함된다. 감염원으로 에이. 튜메파시엔스를 사용하는 Ti 플라스미드 형질전환에 대한 숙주 범위는 매우 넓으나, 조작의 용이함 때문에 담배가 최상의 숙주이다.
아그로박테륨 리조게네스(Agrobacterium rhizogenes)가 또한 식물 형질전환용 벡터로 사용되고 있다. 많은 쌍자엽 식물종에서 모상근 형성을 자극하는 이 세균은 에이. 튜메파시엔스의 Ti-플라스미드와 유사한 방법으로 작용하는 Ri(뿌리 유도) 플라스미드라 불리는 대형 염색체외 원소를 갖고 있다. 에이. 리조게네스를 이용한 형질전환은 에이. 튜메파시엔스의 형질전환과 유사하게 개발되었고 또 예를 들어 자주게자리, 감자(Solanum rigrum L.), 및 포플라를 형질전환시키는데 성공적으로 이용되고 있다.
2. 직접적인 유전자 전달
소위 직접적인 유전자 전달법은 아그로박테륨 매개체를 사용하지 않고 식물과 식물 조직을 형질전환시키기 위해 개발되었다. 직접적인 프로토플라스트의 형질전환에서 외인성 유전 물질을 프로토플라스트로 취입하는 것은 화학물질 또는 전기장을 사용하여 향상될 수 있다. 이 외인성 물질은 핵의 게놈으로 통합될 수 있다. 초기 연구는 쌍자엽 담배에서 행해졌는데 여기서 외래 DNA는 통합되어 후대 식물로 전달되는 것이 밝혀졌다. 파츠코우스키, 제이. 일행, EMBO J. 3, 2717 (1984) ; 및 포트리쿠스, 아이. 일행, Mol. Gen. Genet. 199, 169 (1985) 참조.
단자엽 프로토플라스트도 또한 이 방법에 의하여 형질전환될 수 있고, 그 예로는 트리트쿰 모노코쿰(Triticum monococcum), 롤륨 멀티플로룸(Lolium multiflorum : 이태리 호밀), 옥수수, 및 블랙 멕시칸 사탕옥수수가 있다.
이와 달리 외인성 DNA는 미량주사법(microinjection)에 의하여 세포 또는 프로토플라스트 도입될 수 있다. 플라스미드 DNA 용액은 가득찬 미세 유리 바늘을 이용하여 세포에 직접 주사된다. 이런 방식으로 각종 플라스미드를 이용하여 자주게자리 프로토플라스트를 형질전환시켰다. 예를 들어 리이히, 디. 제이. 일행, Bio/Technology 4, 1001 (1986) 참조.
보다 최근에 개발된 직접적인 유전자 전달 방법은 DNA를 갖는 미세발사체(microprojectiles)를 폭파시키는 방법을 포함한다. 클라인, 티. 엠. 일행, Nature 327, 70 (1987) 참조. 이 방법에서 외인성 DNA로 피복된 텅스텐 입자는 표적 세포로 들어가 보고된 식물(양파)에서 적어도 순간적인 발현을 일으킨다.
B. 형질전환된 식물조직의 재분화
식물조직을 형질전환 하기 위해 많은 방법이 있듯이 식물 조직으로부터 식물을 재분화시키는 방법도 다양하다. 특정 재분화 방법은 출발 식물조직 및 재분화될 특정 식물종에 따라 다르다. 최근 식물 외식편으로부터 유도된 캘러스 조직으로부터 많은 식물종을 재분화할 수 있게 되엇다. 캘러스로부터 재분화될 수 있는 식물은 옥수수, 벼, 보리, 밀 및 호밀과 같은 단자엽식물과 해바라기, 콩, 목화, 평지씨 및 담배와 같은 쌍자엽 식물을 포함한다.
에이. 튜메파시엔스로 형질전환된 조직으로부터 식물의 재분화는 여러 식물종에 대하여 알려져 있다. 이들은 해바라기, 토마토, 화이트 클로버, 평지씨, 목화, 담배 및 포플라를 포함한다. 에이. 리조게네스로 형질전환된 조직으로부터 자주게자리를 재분화하는 것도 알려졌다. 프로토플라스트로부터 식물을 재분화하는 것이 특히 유용한 수법이다. 에반스, 디이. 에이 일행, Handbook of Plant Cell Culture, Vol. 1, MacMillan Publ. Co., 1983, 124 페이지 참조. 어떤 식물종이 프로토플라스트로부터 재분화될 수 있으면, 직접적인 유전자전달방법이 사용될 수 있기 때문에 형질전환은 에이. 튜메파시엔스의 사용에 의존하지 않는다. 프로토플라스트로부터 식물을 재분화하는 것은 벼, 담배, 평지씨, 토마토, 가지, 오이, 포플라 및 옥수수에 대하여 증거되어 있다.
식물 형질전환 및 재분화 기술에서 기술적 진보는 유전공학을 통한 작물 개량의 가능성을 밝혀준다. 예를 들어 담배 모자이크 비루스(TMV)의 감염에 내성이며 또 상이한 종류의 제초제에 내성인 유전자 조작된 담배 및 토마토 식물이 보고 되어 있다. 곤충 내성도 담배 및 토마토 식물에서 처리되었다.
C. 세포 배양
유전공학의 가능성은 농작물에만 한정되는 것이 아니라 관상용 식물, 마초 및 수목에서의 개량도 포함한다. 유전공학 및 조직배양 적용을 포함하는 식물 생물공학의 분명한 목적은 향미, 향료, 안료, 천연 감미제, 공업적 사료, 항미생물제 및 약제를 포함한 식물 유도 화합물의 방대한 생산을 촉진하는 것이다. 대부분의 경우 이들 화합물은 광범위한 대사물질군으로서, 전체적으로 2차 산물로 나타낸다. 식물은 포식동물을 피하고, 수분을 촉진하거나 또는 전염병을 박멸하기 위해 이러한 2차 산물을 생산할 수 있다.
식물 세포 배양은 특정 식물종으로부터 이루어져 바이오리엑터에서 증식될 수 있다. 전형적인 식물종은 상업적 가치가 있는 2차 산물을 생산하는 식물종의 대부분을 포함한다. 많은 농업적으로 중요한 작물에서 식물 체세포의 조직 배양에 의하여 안정한 변이 식물체(체세포 변이)가 유도 및 선별될 수 있음이 분명하게 알려져 있다. 다양한 이점은 2차 산물을 생산하는 식물 조직 배양으로부터 유래한다. 이들 이점은 (1) 생성한 산물의 순도 향상 가능성, (2) 효소법에 의하여 값싼 전구체를 고가의 최종 산물로 전환하는 것, 및 (3) 배지와 유사한 피딩(feeding) 기질이 신규한 화합물을 제조할 가능성 등을 포함한다.
D. 조절되는 유전자 발현의 이점
바이오리엑터에 사용할 식물 유전 공학의 표적이 농작물, 관상용 관목, 꽃, 수목 또는 조직배양물의 어떤 것이어도 실현되어야 할 주 이점은 키메라 유전자의 발현이 적당한 시기에 적당한 정도로 어떤 경우는 식물의 특정 부위에서 발현되도록 조절하는 것이다. 예를 들어 원하는 표현형을 얻기 위하여 키메라 유전자는 전체 단백질의 1% 이상의 수준으로 발현되어야 한다. 이것은 키메라 키니나제 발현에 의한 진균내성 또는 프로테이나제(proteinase) 억제제 발현 증가에 의한 곤충 내성의 경우이다. 이들 경우에서 예를 들면 진균 감염 또는 곤충 감염이 급박한 경우에서와 같이 필요한 경우에만 유전자가 발현되면 에너지 소모 및 수율이 감소될 수 있는 까닭에 외래 단백질을 에너지 소모 및 수율이 감소될 수 있는 까닭에 외래 단백질을 고수준으로 생산하기 위해 소모되는 에너지는 식물에 손상을 초래할 수 있다.
이와 달리 키메라 유전자에 의하여 발현될 표현형은 발달되는 동안 부적합한 시기에 발현되면 식물에 악영향을 초래할 수 있다. 예를 들면 키메라 유전자 산물이 꼬투리 절단을 유도하는 식물 호르몬이면, 초기발현은 종자가 성숙되기 전에 열매를 절단할 수 있어 수율을 감소시킨다. 이 경우에서는 꼬투리 절단이 바람직하거나, 또는 식물에 해롭지 않을 시기에 이 유전자형의 발현을 유도하는 것이 보다 더 유리할 것이다.
배양 조직 또는 바이오리엑터내의 조직에게서 부적합한 시기에 2차 산물을 제조하면 산물의 수율 감소에 따른 배양물 성장율의 감소를 초래할 수 있다. 그러므로 2차 산물을 발현하지 않으면서 배양물을 성장시킨 다음 적합한 시기에 키메라 유전자가 원하는 산물을 적당하게 발현하도록 유도하는 것이 유리하다.
이들과 다른 것을 고려해볼 때 식물 또는 식물 조직에서 키메라 유전자 발현의 시기, 정도 및/또는 부위를 조절하는 것은 매우 바람직하다. 야외, 온실 또는 바이오리엑터에서 용이하게 실시될 수 있는 조절이 특히 상업적 가치가 있다.
E. 식물에서 공지된 조절 가능한 유전자 발현 계
몇가지 식물 유전자는 식물 호르몬, 열충격, 화학약품, 병원체, 산소 및 광 부족을 포함한 내부 및 외부적 요인에 의하여 유도된다고 공지되어 있다. 이들 계의 소수가 자세하게 기술되어 있으나, 가장 잘 알려진 것은 mRNA 축적이 증가하면 특이 단백질 산물의 수준이 증가된다는 것이다.
식물 호르몬에 대한 유전자 조절의 예로서, 아브시식산(ABA)은 목화의 풍부한 후기 배형성 mRNA를 유도한다고 알려져 있다. 갈라우, 지. 에이. 일행, Plant Mol. Bio. 7, 155 (1986) 참조. 다른 예로 지베렐린산(GA 3)은 아주까리 열매 종자에서 말레이트 신타제 전사물을 유도하고 또 보리 호분층에서 알파 아밀라제 아이소자임을 유도한다. 로드리케, 디. 일행, Plant Mol. Bio. 9, 227 (1987) ; 놀란, 알. 씨이. 일행, Plant Mol. Biol. 8, 13 (1987) 참조.
콩의 열충격 단백질 유전자의 조절은 자세하게 연구되어 있다. 40℃에서 몇시간 동안 식물을 처리하면 소위 열 충격 단백질이 새로이 합성된다(케이, 제이. 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 3526 (1981)). 이러한 몇가지 유전자들은 분리되고 또 그의 조절이 자세하게 연구되어 있다. 이들 유전자의 발현은 전사 수준에서 주로 조절된다. bsp 70 유전자의 프로모터는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(Npt II) 유전자에 융합되었고 또 키메라 유전자는 내인성 열충격 유전자 보다 낮은 수준으로 열 충격(스페나, 에이. 일행, EMBO J. 4, 2736 (1985))에 의하여 유도되는 것으로 밝혀졌다.
식물에서 유도될 수 있는 다른 유전자류로는 리불로스 1,5-이인산 카르복시라제(RUBISCO)의 작은 서브 유닛에 대한 핵코드화 유전자인 광조절된 유전자를 포함한다. 모렐리, 지이 일행(Nature 315, 200 (1985)) 및 헤레라-에스트렐라, 엘, 일행(Nature 310, 115 (1984))은 완두콩의 RUBISCO 유전자의 5' 측 서열이 키메라 모양으로 부착될 때 리포터 유전자에게 광 유도성능을 부여할 수 있음을 밝혔다. 이 관찰은 클로로필 a/b 결합 단백질과 같은 기타 광 유도성 유전자에 확장되었다.
옥수수의 알코올 디히드로게나제(adb) 유전자가 광범위하게 연구되어 있다. 옥수수로부터 adb1-s 유전자가 분리되었고 또 그의 5' 측 DNA 부분은 순간적으로 형질전환된 조직을 혐기 조건 처리시킬 때 키메라 리포터 유전자 (예 : 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, CAT)의 발현을 유도할 수 있음이 밝혀졌다(호워드, 이. 일행, Planta 170, 535 (1987)).
완화제(safener)로 공지된 화학약품류는 유해한 제체조 투여에 대하여 작물을 보호하거나 또는 완화시키기 위해 개발되었다. 이러한 화합물의 작용에 대한 기본적인 메카니즘은 충분히 밝혀지지 않았으나, 이러한 화합물에 의한 천연적으로 조절 가능한 유전자의 조절이 가능한 1개 메카니즘이다. 최근 2-클로로-4-(트리플루오로메틸)-5-메틸-티아졸카르복시산 벤질 에스테르로 처리된 옥수수에서 높은 수준의 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)가 유도된다고 보고되었다. 위간드, 알. 씨이. 일행, Plant Mol. Biol. 7, 235 (1986) 참조. GST mRNA의 수준은 완화제 처리시 증가되지만 증가시키는 메카니즘은 보고되지 않았다.
식물이 각종 병원체와 과민하게 반응되면 많은 식물은 산 추출성, 저분자량 병인관련(PR) 단백질을 생산하도록 자극된다(바룬, 엘. 씨이., Plant Mol. Biol. 4, 111 (1985)). 그러나 특히 흥미있는 것은 이들 동일한 PR 단백질이 폴리아크릴산 및 아세틸살리실산과 같은 화학약품으로 처리된 식물에서 높은 수준으로 축적된다는 사실이다(지안이나지, 에스, 일행, J. Gen. Virol. 23, 1 (1974) ; 화이트, 알. 에프, Virology 99, 410 (1979)). 이 PR 단백질의 존재는 광범위한 병원체에 대하여 국부적 및 전체적 내성을 유도하는 것과 관련되어 있다. 담배 모자이크 비루스(TMV)에 내성인 중간 담배 잡종은 구성적으로 PR-단백질을 발현하는 것으로 알려져 있다(Abl, P. 일행, Plant Sci. Lett. 26, 173 (1982)). 또한, TMV 감염된 또는 화학적으로 처리된 담배의 mRNA를 사용하여 시험관에서 번역 산물을 면역침강(코르넬리신, 비, 제이. 씨이. 일행, EMBO J. 5, 37 (1986) ; Carr, J. P. 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7999 (1985)) 시키면 PR-단백질의 증가된 수준은 RNA의 축적에 의한 것이라는 것을 알 수 있다. 그러므로 화학약품 또는 병원체에 의한 PR 단백질 유전자의 유도는 식물체 및 식물 조직에서 화학적으로 조절되는 유전자 발현의 문제를 해결할 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 특히 실질적으로 순수한 형태인 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 ; (b) 조절 가능한 서열이 천연적으로 존재하는 유전자에서 코딩 DNA 서열과 연결되어 있고, 이 코딩 DNA 서열의 전체가 아닌 1개 이상의 부위와 결합된 1개 이상의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 ; (c) 1개 이상의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 키메라 유전자 ; (d) (a), (b) 및/또는 (c)의 유전자 또는 서열을 함유하는 벡터 ; (e) 화학적으로 조절가능한 키메라 유전자를 함유하는 식물체, 종자 및 식물조직 ; 및 (f) 화학적으로 조절가능한 키메라 유전자의 식물조직에서의 화학적 조절을 포함한다. 본 발명은 시그널 펩티드, 이 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 서열 및 천연적으로 존재하는 화학적으로 유도가능한 유전자의 실질적으로 순수한 형태를 포함한다.
본 발명은 또한 화학적으로 조절가능한 DNA 서열의 하기 용도를 포함한다 : (a) 바이오리엑터에서 증식되는 세포에서 키메라 유전자의 조절, (b) 화학적 조절제의 분석, (c) 식물의 성장조절, (d) 식물불임의 조절 및 (e) 형질 전환된 식물에서 키메라 및/또는 비상동 유전자 발현의 조절.
제 1도는 λtobcbrPR1013의 부분적인 제한 효소지도이다. 49kb의 재조합 파아지 게놈은 도시된 λ의 왼쪽 및 오른쪽 아암으로 묘사되어 있다. 19kb의 담배 삽입물은 λ 지도 아래에 확대되어 있다. PR-Ta 유전자(그물친 부분)의 위치 및 전사방향(화살표)이 표시되었다. P=Pst, H=Hind III, C=ClaI, R=EcoRI.
제 2도는 λtobcbrPR1013으로부터 pBS-PR1013Cla의 작성을 나타낸다. 2개 ClaI 부위 사이의 19kb의 DNA 단편을 블루스크립트 플라스미드로 서브클로닝한다. C=ClaI, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 3도는 λtobcbrPR1013으로부터 pBS-PR1014Eco의 작성을 도시한다. λtobcbrPR1013의 PR-la 유전자를 함유하는 3.6kb Ecori 단편을 블루스크립트로 서브클로닝한다. R=Eco RI, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 4도는 pBS-PR1013Cla로부터 pBS-PR1013Eco의 작성을 나타낸다. PR-la 유전자를 함유하는 3.6kb의 EcoRI 단편을 블루스크립트 플라스미드의 EcoRI 부위로 서브클로닝한다. C=ClaI, R=EcoRI, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 5도는 pBS-PR1013Eco로부터 pBS-PR1013 Eco △Pst의 작성을 나타낸다. pBS-PR1013Eco로부터 600bp PstI 단편을 결실시킨다. P=PstI, R=EcoRI, S-SalI, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 6도는 pBS-PR1013Eco △Pst로부터 pBS-PR1013Eco △Pst △Xbo의 작성을 나타낸다. 플라스미드 pBS-PR1013Eco △Pst로부터 2kb의 XboI 단편을 결실시킨다. R=EcoRI, P=PstI, X=XboI, S=SalI, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 7도는 pBI101.3 및 pBS-PR1013 Eco △Pst △Xbo로부터 pCIB270의 작성을 나타내다. PR-la 유전자의 일부 및 5' 측 서열을 함유하는 PStI-XboI 단편을 SalI-BamHI로 분해된 pBI101.3에 서브클로닝한다. XboI 및 SalI 부위는 양립하며 결찰되면 양쪽 제한 부위를 파괴한다. PstI 부위는 어댑터 분자를 이용하여 BamHI 부위에 적응된다. X=XboI, P=PstI, (X/S)=XboI 및 SalI 융합부위, 어떠한 효소도 (X/S) 부위를 절단할 수 없다. LB=T-DNA 왼쪽경계, RB=T-DNA, 오른쪽 경계, PR-la 유도성 영역의 전사 방향은 pCIB270에서 화살표로 나타내어져 있다. pCIB 270 상의 그물친 영역은 NOS 유전자의 3' -수식 영역을 의미한다. pCIB270의 어두운 영역은 베타-글루쿠로니다제 유전자를 나타낸다. pCIB270의 전체 영역은 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II 유전자를 나타낸다. pCIB270의 줄무늬 영역은 NOS 프로모터를 나타낸다.
제 8도는 M13mp18-PR1013 Eco △Pst △Xbo 및 M13mp19-PR1013 Eco △Pst △Xbo의 작성을 나타낸다. PR-la 코딩서열 및 5' 측 서열을 함유하는 PSTI-Asp718 단편을 pBS-PR1013Eco △Pst △Xbo로부터 Asp718-PstI으로 분해된 M13mp18 또는 19로 서브클로닝한다. R=EcoRI, H-Hind III, P-PstI, K=KpnI (Asp718은 Kpn I의 이소시조머임), LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 9도는 PR-la의 ATG 코돈의 NcoI 부위로의 전환을 도시하는 흐름설명도이다. M13mp18-PR1013Eco △Pst △Xbo의 1가닥 DNA를 굵은 선으로 나타낸다. TCATGG 서열은 부위 특이적 돌연변이에 의하여 CCATGG로 전환된다. K=KpnI, X=XboI, B=BstEII, P=PstI.
제 10도는 pCIB268의 작성을 나타낸다. M13mp18-PR1013Eco△Pst △Xbo, Nco의 복제형으로부터 유도된 BstEII-PstI 단편을 BstE II-PstI로 분해된 pBS-PR1013Eco △Pst △Xbo에 서브클론(subclone)시켜 pCIB268을 형성한다. X=XboI, B=BstEII, N=NcoI, P=PstI.
제 11도는 pBS-GUS 1.2 및 pCIB 268으로부터 pCIB269의 작성을 나타낸다. X=XboI, N=NcoI, P=PstI, pCIB 269의 그물친 부분은 GUS 유전자 서열을 나타내고 어두운 부분은 PR-la 유전자로부터 유도된 서열을 나타낸다.
제 12도는 pBS-GUS1.2의 작성을 나타낸다. pBS-GUS1.2는 pRAJ 265, pBI221.1 및 pBluescript로부터 유도된 단편으로 3가지 결찰을 통하여 제조된다. S=SalI, R=EcoRI, N=NcoI.
제 13도는 pCIB 269 및 pCIB 200으로부터 pCIB271의 작성을 나타낸다. X=XboI, N=NcoI, R=EcoRI, S=SalI, (S/X)=SalI 및 XboI 부위의 융합, LGT 아가로스=겔화온도가 낮은 아가로스.
제 14도는 pCIB219의 제한 효소 지도이다. 이 플라스미드는 PR-1 및 GUS 유전자를 함유하는 pCIB269 XboI/EcoRI 단편에 EcoRI/XboI 어댑터를 부가하고 그것을 SalI으로 제한 분해된 pCIB 712에 결찰시켜 작성한다.
제 15도는 pCIB272의 제한 효소지도이다. 이 플라스미드는 PR-1/GUS 유전자 (PR-la의 -833 내지 +1)를 함유하는 pCIB 282로부터 유도한 Asp718I/BamHI 단편을 Asp718I/BamHI으로 분해된 pCIB 200에 결찰시켜 작성한다.
제 16도는 pCIB 273의 제한 효소지도이다. 이 플라스미드는 PR-1/GUS 유전자(PR-la의 -603 내지 +1)를 함유하는 pCIB 283으로부터 유래하는 Asp718I/BamHI 단편을 Asp718I/BamHI으로 분해된 pCIB 200에 결찰시켜 작성한다.
제 17도는 pCIB1004의 제한 효소지도이다. 이 플라스미드는 NcoI/BamHI 단편인 pCIB10/35Bt (607)으로부터 절단된 BT 유전자를 갖는 pCIB269(PR-la 프로모터 함유)으로부터의 XboI/NcoI 단편 및 SalI/BamHI으로 절단된 pCIB 710을 결찰시켜 제조한다.
제 18도는 pCIB200/PR1-BT의 제한 효소지도이다. 이 플라스미드는 pCIB1004 및 pCIB200으로부터 작성된다.
제 19도는 pCIB1207의 제한 효소지도이다. 아라비돕시스(Arabidopsis) AHAS 유전자를 함유하는 λ 게놈 클론의 5.8kb XbaI 단편을 XbaI으로 분해된 블루스크립트에 클론한다.
제 20도는 pCIB1216의 제한효소지도이다. pCIB 1207으로부터의 3.3kb NcoI/XbaI 단편을, GUS 유전자를 제거하기 위해 NcoI 및 XbaI으로 분해시킨 pCIB269에 클론한다.
제 21도는 pCIB1233의 제한효소 지도이다. 4.2kb의 KpnI/XbaI 단편을 pCIB1216으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB200으로 결찰시킨다.
제 22도는 pBSGluc39.1/GUS의 제한효소 지도이다. pBSGluc39.1의 1462bp 단편을 NcoI 및 KpnI으로 분해된 pBS-GUS1.2에 클론한다.
제 23도는 pCIB200/Gluc39.1-GUS의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 GUS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.1/GUS으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB 200에 결찰시킨다.
제 24도는 pCIB200/Gluc39.1-BT의 제한효소 지도이다. BT 유전자를 함유하는 pCIB1004으로부터의 KpnI/NcoI 단편, pBSGluc39.1/GUS으로부터의 KpnI/NcoI 단편 및 KpnI으로 분해되고 송아지 흉선의 알칼리성 포스파타제로 처리된 pCIB200을 결찰시킨다.
제 25도는 pBSGluc 39.1/GUS의 NcoI/XbaI 단편 및 AHAS 유전자를 함유하는 pCIB1207으로부터의 3.3kb의 NcoI/XbaI 단편으로부터 작성된 pBSGluc39.1/AHAS의 제한효소 지도이다.
제 26도는 pCIB200/Gluc39.1/AHAS의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 AHAS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.1/AHAS으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB200에 결찰시킨다.
제 27도는 pBSGluc39.1/GUS의 제한효소 지도이다. pBSGluc393.3의 1677bp 단편을 NcoI 및 KpnI으로 분해된 pBS-GUS1.2에 클론한다.
제 28도는 pCIB200/Gluc39.3-GUS의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 GUS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.3/GUS으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI 으로 분해된 pCIB 200에 결찰시킨다.
제 29도는 pCIB200/Gluc39.3-BT의 제한효소 지도이다. BT 유전자를 함유하는 pCIB1004으로부터의 KpnI/NcoI 단편, pBSGluc39.3/GUS으로부터의 KpnI/NcoI 단편, 및 KpnI으로 분해되고, 송아지 흉선의 알칼리성 포스파타제로 처리된 pCIB 200을 결찰시킨다.
제 30도는 pBSGluc39.3/GUS의 NcoI/XbaI 단편 및 AHAS 유전자를 함유하는 pCIB1207으로부터의 3.3kb NcoI/XbaI 단편으로 작성된 pBSGluc39.3/AHAS의 제한효소 지도이다.
제 31도는 pCIB200/Gluc39.3/AHAS의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 AHAS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.3/AHAS으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB 200에 결찰시킨다.
제 32도는 pCIB1208의 제한효소 지도이다. 돌연변이 처리된 아라비돕시스 AHAS 유전자를 함유하는 람다 게놈 클론의 5.8kb XbaI 단편을 XbaI으로 분해된 블루스크립트에 클론한다.
제 33도는 pCIB1230의 제한효소 지도이다. pCIB1208으로부터의 3.3kb NcoI/XbaI 단편을, GUS 유전자를 제거하기 위하여 NcoI 및 XbaI으로 분해된 pCIB269에 클론한다.
제 34도는 pCIB1232의 제한효소 지도이다. 4.2kb의 KpnI/XbaI 단편을 pCIB1230으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 제한된 pCIB 200에 결찰시킨다.
제 35도는 pBSGluc39.1/GUS의 NcoI/XbaI 단편 및 AHAS 유전자를 함유하는 pCIB1208으로부터의 3.3kb NcoI/XbaI 단편으로 작성된 pBSGluc39.1/AHAS-SuR의 제한효소 지도이다.
제 36도는 pCIB/Gluc39.1-AHAS-SuR의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 AHAS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.1/AHAS-SuR으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB200에 결찰시킨다.
제 37도는 pBSGluc39.3/GUS의 NcoI/XbaI 단편 및 AHAS 유전자를 함유하는 pCIB1208으로부터의 3.3kb의 NcoI/XbaI 단편으로 작성된 pBSGluc39.3/AHAS-SuR의 제한효소 지도이다.
제 38도는 pCIB 200/Gluc 39.3-AHAS-SuR의 제한효소 지도이다. β-글루카나제 프로모터 및 AHAS 유전자를 함유하는 KpnI/XbaI 단편을 pBSGluc39.3/AHAS-SuR으로부터 분리하고 또 KpnI 및 XbaI으로 분해된 pCIB 200에 결찰시킨다.
신규 유전자의 DNA 서열
서열 1은 담배 PR-la 유전자의 XboI 및 BglII 부위 사이의 2kb 단편의 게놈 DNA 서열을 나타낸다. 약 뉴클레오티드 903에 있는 화살표는 전사개시 부위를 나타내고 207 및 313에 직각의 화살표는 독립적인 2개의 cDNA 클론의 말단을 의미한다. 이 유전자의 코딩 영역이 코드하는 폴리펩티드 서열도 또한 나타낸다.
서열 2는 담배 PR-1' 유전자의 게놈 DNA 서열 및 이 유전자의 코딩 영역이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 3은 오이의 PR 키티나제의 cDNA 서열 및 이 유전자의 코딩 영역이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 4은 담배 PR-R 유전자의 주 형태의 cDNA 서열을 나타내고 또 (4a)는 서열 4 및 이 유전자의 코딩 영역이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
서열 5는 클론 pBSGluc39.1에 함유된 담배의 염기성 β-1,3-글루카나제 유전자의 게놈 DNA 서열을 나타낸다.
서열 6은 클론 pBSGluc39.3에 함유된 담배의 염기성 β-1,3-글루카나제 유전자의 게놈 DNA 서열을 나타낸다.
서열 7은 플라스미드 pBSht15에 함유된 담배의 PR-Q의 cDNA 서열을 나타낸다.
서열 8은 플라스미드 pBSGLGe에 함유된 단리 cDNA 서열을 나타낸다. 이 cDNA는 산성 형태의 β-1,3-글루카나제를 코딩한다.
서열 1
서열 2(1)
서열 2(2)
서열 3
서열 4
서열4(a) : 서열 4 및 이 유전자의 코딩영역이 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 서열
서열 5(1)
서열 5(2)
서열 5(3)
서열 6(1)
서열 6(2)
서열 6(3)
서열 6(4)
서열 7
서열 8
본 발명은 연합 DNA 서열의 식물 조직에서의 전사를 화학적 조절제의 조절을 받아 조절할 수 있는 DNA 서열의 분리, 클로닝 및 확인을 기재하고 있다. 이들 DNA 서열은 유전자의 발현이 화학적 조절제에 의해 조절될 수 있는 키메라 유전자를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 화학적 방법에 의하여 트랜스제닉 식물에서 키메라 유전자의 발현을 조절할 수 있는 것은 식물의 생장 및 발생에 대하여 악영향을 최소화하면서 표현형 특징을 적당하게 발현시키는데 유용하다. 이러한 조절은 배양기 또는 바이오리엑터(bioreactor) 내의 식물 조직에서 2차 산물 또는 기타 클론 산물을 제조하는데 중요하다. 클론된 서열의 조절은 안티센스메카니즘(anti-sense mechanism)에 의하여 다른 유전자 산물을 조절하는데 중요하다.
특정 시기에 주어진 코딩 서열의 발현은 식물 조직에 전형적으로 가해지는 화학적 조절제를 사용함으로써 조절될 수 있다. 분명한 발생전이 단계의 조절에 관여하는 유전자는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 적합한 코딩 DNA 서열과 연합시키는 것에 의하여 조절될 수 있다. 이렇게 하여 화학적 조절제의 수준이 향상되거나 또는 감소될 때 식물의 발생이 특정단계에서 정지되거나 또는 특정 비율로 촉진될 수 있다.
화학적으로 조절가능한 DNA 서열은 예를 들어 제초제 내성 또는 내약력(예 : 콩에서의 아트라진 내약력)을 부여하는 유전자, 곤충내성(예 : 목화에서 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 결정 단백질)을 부여하는 유전자 또는 선별적 발현(웅성 또는 자성 불임)을 필요로 하는 유전자같은 외래 유전자의 발현을 추진하기 위해 사용될 수 있다. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열은 또한 안티센스 메카니즘에 의하여 2차 코딩 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열의 전사를 추진하기 위해 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 하기를 목적으로 한다 ;
a. 주목적으로 식물 세포에서의 발현이 화학적 조절제에 의하여 조절되는 키메라 유전자.
b. 식물조직에서 화학적 조절제에 반응하여 다른 DNA 서열의 유전적 활성을 조절할 수 있는 실질적으로 순수한 화학적으로 조절가능한 DNA 서열.
c. 천연적으로 존재하는 유전자와 연합된 어떤 코딩 DNA 서열 모두가 아니라 일부가 결합된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열.
d. 천연적으로 존재하는 유전자의 다른 부위를 갖거나 또는 갖지 않으면서 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 벡터.
e. 본 발명의 주 목적인 키메라 유전자를 함유하는 벡터.
f. 이들 벡터에 의하여 형질 전환된 세포로부터 유도된 식물조직, 식물 및 종자.
g. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열과 연합된 DNA 코딩 서열의 발현을 화학적으로 조절하는 방법, 예를 들어 표현형 특징을 조절하는 방법.
h. 본 발명의 키메라 유전자 및 이들을 함유하는 식물 조직을 사용하여 새로운 화학적 조절제를 확인하는 방법.
i. 화학적으로 조절된 유전자에 의하여 코딩된 단백질에서 시그널 펩티드 서열.
j. 실질적으로 순수한 병인관련 단백질 유전자.
하기의 본 발명의 기술로부터 다른 목적도 인식된다.
정의
용어에 주어진 의미를 포함하여 명세서 및 특허청구 범위의 명확하고 일치하는 이해를 위하여 하기 정의를 나타낸다.
안티센스메카니즘 : 세포에서 번역될 mRNA의 적어도 일부에 상보적인 RNA 분자가 존재하는 것에 의한 mRNA를 단백질로 번역하는 비율을 조절하는 것을 기본한 유전자 조절의 메카니즘.
연합 DNA 서열 : 자신의 세포성 활성이 (1) 다른 DNA 서열의 활성을 조절하거나 또는 (2) 다른 DNA 서열에 의하여 조절되는 DNA 서열. 이 정의는 특히 연속적인 DNA 가닥에서 물리적으로 근접하거나 또는 물리적으로 분리된 서열을 포함하지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 물리적 분리는 예를 들어 동일한 DNA 가닥에서의 분리, 상이한 DNA 가닥에서의 위치, 또는 1개 가닥에서 비연속적으로 산재하는 서열(예 : 변화조절가능한 코딩 서열)을 포함한다.
화학적으로 조절가능한 DNA 서열 : 조절이 화학적 조절제에 따라 다른 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있는 DNA 서열. 이 서열은 천연 또는 합성유래일 수 있다.
화학적으로 조절가능한 유전자 : 적어도 1개의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열 및 적어도 1개의 연합 코딩 DNA 서열을 함유하는 유전자. 이 유전자는 천연, 합성 또는 부분적으로 천연/부분적으로 합성 유래일 수 있다.
화학적 조절제(화학적으로 조절가능한 DNA 서열에 대한) :
화학적 조절제가 화학적으로 조절가능한 DNA 서열과 연합된 전사가능한 DNA 서열의 전사 조절을 원하는 정도 및 원하는 시기에 실행할 수 있을 만큼 충분한 양으로 활성형태로 존재하지 않는 계에서 화학적으로 조절가능한 DNA 서열의 활성을 직접적 또는 간접적 작용에 의하여 조절(예 : 개시, 종결, 증가 또는 감소시킴) 하는 원소 또는 분자종. 이 용어는 전사가 필요한 시기에 조절제가 존재하지 않거나 또는 거의 존재하지 않고 또는 약간의 조절제가 존재하지만 보다 더 많은 또는 적은 전사가 필요함에 따라 증가되거나 감소되는 조절이 요구되는 상황을 포괄하며 의미한다.
그러므로 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 계가 식물, 예를 들어 트랜스제닉 식물체이면, 화학적 조절제는 식물체에서 화학적 조절을 행하여 연합 유전자의 전사가 원하는 정도로 원하는 시기에 실행될 만큼 충분한 양으로 천연적으로 존재하지 않는 종이다.
직접적 작용이라는 것은 화학적 조절제 작용이 화학적 조절제 및 DNA 서열 사이의 직접적인 상호작용에 의한 것을 의미한다. 간접적 작용이라는 것을 조절제 작용이 화학적 조절제 및 계내의 다른 내인성 또는 외인성 성분사이의 직접적 상호작용에 의한 것을 의미하며, 이 직접적 상호작용의 궁극적인 결과는 DNA 서열 활성의 활성화 또는 억제이다. 활성형태란 화학적 조절제가 조절을 실행하는데 필요한 형태를 의미한다.
키메라 서열 또는 유전자 : 예를 들어 천연적으로 존재하는 상태에서는 연합되지 않는 천연적으로 존재하는 DNA 서열로부터 유도된 부분인 적어도 2개의 비상동 부분을 함유하는 DNA 서열을 함유하거나, 또는 합성적으로 유래하며 천연적으로 존재하지 않는 적어도 1개의 부분을 함유하는 DNA 서열.
코딩 DNA 서열 : 전사 및 번역될 때 세포성 폴리펩티드를 형성하는 DNA 서열.
유전자 : 불연속적인 세포 산물에 책임있는 불연속적 염색체 영역.
비코딩 DNA 서열 : 특정 코딩 DNA와 연합될 때 세포성 폴리펩티드를 형성하는 전사 및 번역되지 않는 DNA 서열. 따라서 1개 코딩 서열과 연합될 때 코딩되지 않는 서열은 다른 코딩 또는 비코딩 서열과 연합되면 코딩될 수 있다.
표현형 특징 : 유전자 발현에 의하여 생성된 관찰가능한 특성.
식물조직 : 식물계 또는 배양물에서 식물의 조직. 이 용어는 전체식물, 식물세포, 식물기관, 식물종자, 프로토플라스트, 캘러스, 세포배양물 및 구조적 및/또는 기능적 단위로 조직된 식물 세포의 그룹을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 상기 열거한 식물조직의 특정형 및 이 정의에 포함되는 다른 것과 연합하거나 또는 그의 부재하에서 이 용어의 사용은 다른 식물조직형을 배제하려는 것이 아니다.
PR, 또는 병인관련 단백질 : 병원체에 대하여 민감하게 반응하는 식물에서 발현된 단백질. 이 용어는 담배 PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1', PR-2, PR-N, PR-O, PR-P, PR-Q, PR-S, PR-R 단백질의 산성 및 염기성형, PR-P 또는 PR-Q의 염기성 부분인 키티나제, 및 PR-2, PR-N 또는 PR-O의 염기성 부분인 베타-1,3-글루카나제(글루칸 엔도-1,3-β-글루코시다제, EC 3.2. 1.39) 및 오이의 병원체 유도성 키티나제를 포함하지만 여기서 한정되지 않는다. 과민 반응은 병원체가 식물 전체로 퍼지는 감수성 반응과 대조적으로 병원체 감염 부위 주위의 조직의 즉각적인 국부 회저 및 이어 병원체가 착상되는 것을 특징으로 한다. 병원체로는 예를 들어 담배 또는 오이 모자이크 비루스, 고리점(ringspot) 비루스 또는 회저 비루스, 양아육속 식물 잎 위축병 비루스, 적 클로버 반점 비루스, 토마토 관목 위축 비루스 및 그와 사한 비루스와 같은 비루스 또는 비로이드, 예를 들어 피토프토라 파라지티카(Phythophthora parasitica) 또는 페로노스포라 타바시나(Peronospora tabacina)와 같은 진균류, 슈도모나스 시린가애(Pseudomonas syrngae)와 같은 세균, 또는 미주스 페르시캐(Myzus persicae) 같은 진디를 포함한다. 상기 열거한 것은 어떠한 제한을 의미하지 않는다.
조절 : 유전자의 발현수준 또는 DNA 서열의 발현수준을 증가(유도)하거나 또는 감소(억제)시킴. 이 정의는 특정 메카니즘을 의미하는 것은 아니다.
실질적으로 순수한 DNA 서열 : 천연적 또는 비천연적 공급원으로부터 실질적으로 순수한 형태로 분리된 DNA 서열. 이러한 서열은 천연적인 계, 예를 들어 세균, 비루스 또는 식물 또는 동물 세포에 존재하거나 또는 예를 들어 합성적인 방법에 의하여 cDNA 서열로 제공될 수 있다. 실질적으로 순수한 DNA 서열은 목적하는 DNA를 포함하는 벡터 형태로 분리된다. 실질적으로 순수하다는 것은 목적하는 DNA 서열과 다른 DNA 서열이 예를 들어 5% 미만, 1% 미만 또는 바람직하게는 0.1% 미만의 한계량으로만 존재한다는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 DNA 서열 및 이를 함유하는 벡터는 전형적으로 용액 형태, 예를 들어 완충액을 함유하는 수용액 또는 통상적인 배지 내의 용액으로 제공된다.
실질적인 서열상동 : 실질적 서열상동이라 함은 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열 사이의 구조적 관계가 유사함을 의미한다. 예를 들어 실질적으로 상동인 DNA 서열은 80% 상동, 바람직하게는 90% 또는 95% 상동이고 또 실질적으로 상동인 아미노산 서열은 전형적으로 50% 상동 이상이다. 상동은 뒤이은 1개 또는 몇개의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 빠지거나 또는 뉴클레오티드 또는 아미노산 사이에 추가로 더해질 때의 관계도 포함한다.
A. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열
본 발명은 화학적 조절제 영향하에서 식물 또는 식물조직에서 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있는 비코딩 DNA 서열에 관한 것이다. 특히 본 발명은 식물 또는 식물 조직에서 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있고 이 조절이 화학적 조절제에 따라 다른 비코딩 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는 이 DNA 서열은 천연공급원으로부터 제공될 때 자신이 존재하는 유전자 또는 게놈에 비하여 순수한 형태이고, 또는 합성 혼합물 내에 존재하면 DNA 혼합물에 비하여 순수하다.
본 발명의 화학적으로 조절 가능한 비코딩 DNA 서열은 코딩 DNA 서열과 연합되면 식물 조직에서 코딩 서열의 발현을 조절하고, 조절 정도는 화학적 조절제에 따라 다르다. 이러한 서열은 새로이 합성되거나 또는 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자로부터 유도(예를 들어 분리되거나 클론됨) 될 수 있다. 본 발명의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열의 산출은 식물조직에만 한정되지 않는다 ; 즉 화학적으로 조절가능한 DNA 서열은 각종 천연공급원, 예를 들어 세균, 비루스 또는 동물로부터 유도될 수 있다. 예를 들어 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 5' 측 영역 또는 3' 측 영역으로부터 분리될 수 있다. 이와 달리 비코딩 DNA 서열은 화학적으로 합성되거나 또는 분리된 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 상동인 서열을 갖는 cDNA로서 효소적으로 합성될 수 있다. 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열을 클로닝함으로써 이 서열을 천연적으로 존재하는 유전자 옆에 존재하는 다른 서열로부터 분리할 수 있다. 이렇게 하여 실질적으로 순수한 DNA 서열을 수득할 수 있다.
본 발명과 관련하여 조절은 조절제를 유도하거나 또는 억제하는 화학적 조절제를 포함한다. 화학적으로 억제할 수 있는 유전자, 즉 억제 화학물질에 의하여 억제되는 유전자의 예로는 TrpR 또는 AroH 같은 유전자를 포함하는 데 여기서 트립토판 억제제 또는 트립토판 그 자체를 부가하면 이들 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 이러한 최종 산물 억제형에 의하여 조절되는 많은 유전자가 존재하며, 이 경우 최종 산물은 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있는 화학적 조절제로서 작용한다. 본 발명은 이러한 유전자의 그 자체에 의하여 조절가능한 영역 또는 식물 또는 식물조직에서 연합 DNA 서열의 전사를 위해 화학적으로 조절될 수 있는 키메라 구조의 부위를 포함한다.
화학적으로 유도가능한 유전자, 즉 유도성 화학 조절제에 의하여 유도될 수 있는 유전자의 예로는 PR 단백질 유전자, 특히 담배 PR 단백질 유전자, 예를 들어 PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1', PR-Q, PR-R 및 PR-S 유전자, 오이 키티나제 유전자, 및 염기성 및 산성 담배 β-1,3-글루카나제 유전자를 들 수 있다. 특히 본 발명은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자, 예를 들어 단자엽, 쌍자엽 또는 나자식물 또는 식물조직에서 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 부분인 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열이거나, 또는 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열과 실질적으로 상동인 영역을 갖는 실질적으로 순수한 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는 이러한 DNA 서열은 식물 또는 식물조직에서 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있는데 이 연합 DNA 서열은 코딩서열이다. 이 DNA 서열의 전사는 화학적 조절제를 억제하거나 또는 화학적 조절제를 유도함으로써 조절될 수 있다. 특히 생각할 수 있는 DNA 서열은 화학적을 조절가능한 유전자가 담배 또는 오이와 같은 쌍자엽 식물로부터의 PR 단백질 유전자인 서열이다. 가장 바람직한 것은 화학적으로 조절가능한 유전자가 담배 PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1', PR-Q, 또는 PR-R 유전자, 오이 키티나제 유전자 또는 염기성 또는 산성 β-1, 3-글루카나제 유전자, 특히 담배 PR-1a 및 PR-1' 유전자이지만, 또한 오이 키티나제 유전자 및 염기성 및 산성 담배 β-1, 3-글루카나제 유전자이다. 화학적으로 조절가능한 유전자가 담배 PR-1a 또는 염기성 β-1, 3-글루카나제 유전자인 DNA 서열이 가장 중요하다.
본 발명의 바람직한 PR 및 관련 유전자의 화학적으로 유도가능한 DNA 서열은 코딩 서열 5'측 영역 옆의 비코딩 DNA 서열에서 발견된다. 대표적인 예로서 전사 개시부위 옆에 천연적으로 존재하는 약 900 내지 약 1200 염기쌍을 갖는 영역인 코딩 영역 부위를 함유하는 담배 PR-1a 유전자의 약 6500 염기쌍 단편으로부터 분리된 서열에서 화학적으로 유도될 수 있는 것으로 밝혀져진 것이 있다. 유도성은 천연적으로 전사개시부위 옆의 약 500 내지 약 700 염기쌍을 함유하는 단편에 함유된다. 그러므로 상기 PR 및 관련 유전자의 5'측 영역, 예를들어 전사개시 부위 옆의 1200 염기쌍에 존재하는 DNA 서열이 가장 바람직하다.
본 발명은 또한 연합 DNA 서열의 식물 또는 식물 조직에서의 전사를 화학적 조절제에 따라서 조절할 수 있는 비코딩 DNA 서열의 제조방법 및 DNA가 실질적으로 순수한 형태로 천연적으로 존재하는 유전자로부터 분리되거나 또는 화학적으로 또는 효소적으로 합성되는 것을 특징으로 하는 상기 비 코딩 서열과 실질적으로 상동인 DNA 서열의 제조방법도 포함된다.
특히 본 발명은 화학적으로 조절가능한 유전자를 함유하는 천연적으로 존재하는 제 내의 화학적으로 조절가능한 유전자로부터 실질적으로 순수한 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 제조하는 방법을 포함하며, 이 방법은 하기 단계로 구성된다.
(a) 상기 제에서, 화학적으로 조절가능한 유전자로부터 RNA의 발현을 활성화시키고;
(b) RNA를 분리하며;
(c) 활성화되지 않은 대조용 제로부터 분리된 RNA로부터 발생된 RNA뿐 아니라 활성화된 제로부터 분리된 RNA로부터 발생된 RNA에 대한 게놈 라이브러리를 특이적으로 스크리닝하고;
(d) 게놈클론을 분리하며;
(e) 상기 게놈클론의 화학적으로 조절가능한 유전자를 서브클로닝하고; 또
(f) 소망하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 분리함.
또한 본 발명은 상기개가 식물인 방법도 포함하는데, 이 방법은 하기 단계로 구성된다;
(a) 상기 식물에서, 화학적으로 조절가능한 유전자로부터 폴리 A+RNA의 발현을 활성화하고;
(b) 폴리 A+RNA를 분리하며;
(c) 이 폴리 A+RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고;
(d) 활성화되지 않은 대조용 식물에서 RNA로부터 발생된 cDNA로 상기 cDNA 라이브러리를 특이적으로 스크리닝하며;
(e) 화학적으로 조절가능한 cDNA 클론을 분리하고;
(f) 상기 단계(e)의 cDNA 클론을 프로브(probe)로 사용하여 상기 식물의 게놈 라이브러리로부터 게놈 클론을 분리하며;
(g) 상기 게놈 클론의 화학적으로 조절가능한 유전자를 서브클로닝하고; 또
(h) 소망하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 분리한다.
상기 화학적으로 조절가능한 유전자가 예를 들어 담배 PR-1a, PR-1b, PR-1c, PR-1', PR-Q 또는 PR-R 유전자와 같은 PR 단백질 유전자, 오이 키티나제 유전자 또는 담배의 염기성 또는 산성 β-1, 3-글루카나제 유전자와 같이 화학적으로 유도가능한 유전자인 방법이 바람직하다. 또한 상기 PR 단백질 유전자가 화학적 유발물질 또는 병원체에 의하여 단계(a)에서 활성화되는 방법이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의하여 제조된 실질적으로 순수한 DNA를 포함한다.
B. 천연적으로 존재하는 코딩서열 부위를 갖는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열
상기 A에서 기재된 전체적으로 화학적으로 조절가능한 DNA 서열이외에, 본 발명은 조절가능한 서열이 천연적으로 존재하는 유전자에서 연합된 코딩 서열 전체가 아니라 일부와 결합된 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열의 비코딩 DNA 서열을 제공한다. 보다 상세하게는 본 발명은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열을 제공한다. 보다 상세하게는 본 발명은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 가지며, 연합 DNA 서열의 식물 또는 식물 조직에서의 전사를 조절할 수 있고, 그 조절이 화학적 조절제에 따라서 다른 제 1 DNA 성분 서열; 및 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자에서 제 1 성분이 결합된 전사가능 DNA 서열의 전체아닌 일부이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 제 2 DNA 성분 서열을 포함하는 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태인 DNA서열도 포함한다. 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자는 예를들어 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물 같은 식물에서 유래할 수 있고, 또 화학적 조절제를 억제하거나 유도함으로써 조절될 수 있다. 제 2 DNA 성분 서열은 전형적으로 코딩 서열일 수 있다. 본 발명에서 제 2 DNA 서열로 바람직한 것은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자에 의하여 발현된 단밸질의 시그널 펩티드를 코드하는 서열이다.
특히 본 발명은 화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 서열 및 PR-1a, PR-1b, PR-c, PR-1', PR-Q, 또는 PR-R 유전자, 키티나제 유전자 또는 염기성 또는 산성 β-1, 3-글루키나제 유전자등의 쌍자엽식물의, 바람직하게는 담배 또는 오이의 PR 단백질 유전자와 같은 PR 단백질유전자로부터의 제 2 코딩 DNA서열을 포함하는 DNA 서열을 포함한다. 화학적 조절제를 유도함으로써 전사가 조절되는 PR 단백질 유전자로부터의 DNA 서열이 바람직하다. 특히 본 발명은 예를 들어 상기 PR 단백질 유전자의 전사개시 부위 옆의 약 2000 염기쌍에 존재하는 것과 같이 상술한 PR 단백질 유전자 중의 어느 하나의 5' 측 영역에 제 1 비코딩 DNA 서열이 존재하는 DNA 서열도 포함한다. 상술한 제 1 비코딩 서열 및 상술한 시그널 펩티드를 코드하는 제 2 코딩 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열이 가장 바람직하다.
서열 1, 서열 2, 서열 5 및 서열 6에 나타낸 바와같은;
본 발명은 또한 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 가지며, 연합 DNA 서열의 식물 또는 식물 조직에서의 전사를 조절할 수 있고 그 조절이 화학적 조절제에 따라서 다른 제 1 DNA 성분 서열; 및 천연적으로 존재하는 유전자로부터 실질적으로 순수한 형태로 분리되거나 또는 화학적 또는 효소적으로 합성되는 것을 특징으로 하는, 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자에서 제 1 성분이 결합된 전사가능 DNA 서열의 전체 아닌 일부이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 제 2 DNA 성분 서열을 포함하는 DNA 서열의 제조방법도 포함한다. 상술한 A에서 언급한 방법 및 이것에 의하여 수득된 실질적으로 순수한 DNA 서열이 바람직하다.
C. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 키메라 유전자
본 발명의 다른 대상은 적어도 1개의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 키메라 DNA 서열 (키메라 유전자)이다. 이러한 키메라 서열의 2가지 형태를 예로 들 수 있다. 보다 단순한 또는 2부분형 키메라 DNA 서열은 키메라 유전자가 화학적 조절제의 적합한 조건하에서 식물조직에서 발현될 수 있도록 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 및 전사가능한 DNA 서열을 포함한다. 보다 상세하게는 본 발명은 식물 또는 식물조직에서의 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있고 또 그 조절이 화학적 조절제에 따라 다른 화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 성분 서열, 및 식물 또는 식물 조직에서 전사될 수 있는 제 2 DNA 성분 서열을 포함하는 화학적으로 조절가능한 키메라 DNA 서열을 포함한다. 이 DNA 성분 서열들은 천연적 공급원으로부터 유도되거나 또는 합성적으로 제조될 수 있다.
제 2 DNA 서열은 안티센스 메카니즘에 의하여 표현형 특징의 발현을 조절할 수 있는 RNA로 전사될 수 있다. 이와달리 키메라 DNA 서열내의 제 2 DNA 서열은 식물 조직에서 전사 및 번역되어, 즉 폴리펩티드를 코딩하여 표현형 특징을 초래한다. 키메라 유전자는 전사를 확실히 하기 위하여 제 2 DNA 서열이 전형적으로 그 옆에 실질적으로 순수한 DNA 서열 및 이들 서열 1, 2, 5 및 6과 실질적으로 상동인 서열을 갖는 실질적으로 순수한 DNA 서열이 가장 바람직하다. 이들 서열은 제 1 비코딩 DNA 서열 및 제 2 코딩 DNA 서열을 포함하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열의 예이며 또 PR 단백질 유전자 담배 PR-1a, PR-1'로부터 또 염기성의 담배 β-1, 3-글루카나제 2 형태로부터 유도된다. 서열 1은 담배로부터 얻은 대표적인 PR-1a 유전자의 서열을 나타낸다. 뉴클레오티드 1 내지 약 1150은 화학적으로 유도가능한 5'측 비코딩 DNA 서열 및 담배 식물에 천연적으로 존재하는 PR-1a 코딩 서열의 일부이다. 이 경우 화학적으로 유도가능한 성분서열은 코딩 서열 옆에 존재한다. 처음의 30개 아미노산을 코드하는 뉴클레오티드가 PR-1a 단백질의 시그널 펩티드의 코딩 서열을 구성한다. 이 코딩 서열은 비코딩 서열로부터 제거되어 상기 A에서 기재한 어떠한 코딩 서열도 갖지 않는 화학적으로 유도가능한 비코딩 DNA 서열을 발생시킨다. 이러한 제거는 제한 효소 분해와 같은 통상적인 수법에 의하여 실행될 수 있다. 존재하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열에 적합하게 연합되게 구성되어 있다. 연합은 통상적인 수법으로 실행한다.
화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 성분 및 전사가능한 제 2 DNA 성분을 포함하는 키메라 DNA 서열이 바람직하며, 이때 제 1 비코딩 DNA 서열은 상기 A에서 언급한 바람직한 DNA 서열중의 하나이다. 제 1 DNA 성분 서열은 화학적 조절제를 억제하거나 또는 유도함으로써 조절될 수 있다. 본 발명의 특정 서열은 제 1 DNA 성분 서열이 식물으로부터 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자내의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열과 실질적으로 상동인 서열을 갖는 키메라 DNA 서열이다.
제 1 DNA 성분 서열은 식물로부터의 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자내의 화학적으로 조절 가능한 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖고 또 제 2 DNA 성분 서열은 전사 및 번역되어 표현형 특징을 초래하는 폴리 펩티드를 생산할 수 있는 코딩 서열인 키메라 DNA 서열이 바람직하다. 이 제 2 DNA 성분 서열은 제 1 DNA 코딩 서열과 접하는 것이 바람직하다. 제 1 DNA 성분 서열은 예를 들어 담배 또는 오이와 같은 쌍자엽 식물로부터 유래하는 PR 단백질과 같은 PR단백질 유전자내의 화학적으로 유도가능한 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동성을 갖는 서열인 것이 특히 바람직하다. 이들의 예로는 상기 A에서 언급되어 있다.
키메라 DNA 서열의 둘째 형은 2 이상의 공급원으로부터 유래하는 3개의 DNA 성분 서열을 함유한다. 이 키메라 DNA 서열의 가장 간단한 태양은 B에서 기재된 바와같은 2 부분 DNA 서열 및 1 이상의 상이한 공급원으로부터 유래하는 제 3 DNA 서열을 포함한다. 보다 상세하게는 이형의 키메라 DNA 서열은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 가지며, 연합 DNA 서열의 식물 또는 식물 조직에서의 전사를 조절할 수 있고 그 조절이 화학적 조절제에 따라서 다른 제 1 DNA 성분 서열; 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자에서 제 1 성분이 결합된 전사가능 DNA 서열의 전체가 아닌 일부이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 제 2 DNA 성분서열; 및 식물 및 식물 조직에서 전사될 수 있는 제 3 DNA 성분 서열을 포함한다. 바람직하게는 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유잔자는 식물 유전자이다.
제 2 및 제 3 DNA 성분 서열은 전형적으로 코딩 서열이다. 제 3 DNA 성분은 1개 이상의 천연 또는 합성공급원으로 부터 유도될 수 있다. 2개의 제 1 DNA 성분은 전형적인 천연적으로 유래하는 것이다. 식물에서 유래하면, 식물은 단자엽, 쌍자엽 또는 나자식물일 수 있다. 바람직한 태양에서 제 2 DNA 서열은 2개의 제 1 DNA 서열이 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 시그널 펩티드를 코드하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 시그널 펩티드를 코드하는 뉴클래오티드 서열을 포함한다. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열이 자신이 유도된 유전자의 코딩 서열의 일부와 결합되면, 제 3 DNA 서열은 적합한 방향으로 존재해야할 뿐 아니라 제 2 DNA 서열과 적합한 판독구조에 있어야 한다. 이 방향성은 당해 분야에 공지된 수법에 의하여 달성될 수 있다.
제 1 및 제 2 DNA 서열 성분이 B에서 바람직한 것으로 언급된 것과 같은 것인 키메라 DNA 서열이 바람직하다. 예를들어 바람직한 키메라 DNA 서열은 제 1 DNA 서열이 담배 또는 오이와 같은 쌍자엽 식물로부터 유래하는 PR단백질 유전자에 있는 화학적으로 유도가능한 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 것이다. PR단백질 유전자의 예로는 상술한 바와 같다.
상술한 키메라 유전자는 가능한 각종 구조를 포함한다. 화학적으로 조절가능한 비코딩 서열은 개화 또는 열매 숙성을 조절하는 유전자; 제초제 또는 진균, 비루스, 세균, 곤충류, 선충류 또는 절지동물류 등 각종 해충에 대한 내약력 또는 내성을 부여하는 유전자; 효소 또는 2차 대사산물의 생산을 조절하는 유전자; 응성 또는 자성 불임; 외소발육; 향미; 영양의 질 등에 관여하는 유전자와 연합될 수 있다. 본 발명을 이용하여 이러한 특징은 농부 및 정원사에 의하여 향상될 수 있고, 또 이것은 더 이상 천연적인 인자에만 의존하는 것이 아니다. 특히 조절하기 위해 중요한 표현형 특징은 조직배양물 및 바이오리엑터에서 대사산물의 생산이다.
바람직한 키메라 DNA 서열은 코딩 DNA 성분 서열이 제초제, 진균, 비루스, 세균, 곤충류, 선충류 또는 절지동물류에 대한 내약력 또는 내성; 2차 대사산물의 생산; 응성 또는 자성 불임; 및 효소 또는 기타 리포터 화합물의 제조와 같은 것으로 구성된 군으로부터 선정된 특징과 같은 표현형 특징을 코딩하는 2 또는 3개 성분 서열이다. 코딩 성분 서열이 예를 들어 야생형 쏘는 제초제 내성 아새토히드록시산 신타제(AHAS)를 코딩하는 것과 같이 제초제에 대하여 내약력 또는 내성을 코딩하거나, 또는 코딩 성분 서열이 예를들어 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내부독소(BT)를 코딩하는 것과 같은 곤충에 대하여 내성을 코딩하는 2 또는 3개 성분 키메라 DNA 서열이 특히 바람직하다.
키메라 서열이 화학적 조절제를 분석하기 위해 사용되면 표현형 특징은 분석될 수 있는 마커로 바람직하다. 적당한 마커로 루시페라제(LUX), 클로람페니클 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 내오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타재(OCS), 배타-1, 3-글루쿠로니다제(GUS), 아세톤 히드록시산 신다제(AHAS), 및 바실러스 루린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내부독소(BT)를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 베타-1, 3-글루쿠로니다제(GUS), 아세토히드록시산 신타제(AHAS) 및 바실루스 투린지엔시스 내부독소(BT)가 바람직한 마커이다.
실시예에서 자세하게 기재된 키메라 DNA 서열의 대표에는 PR-1a 유전자의 5'측 비코딩 서열을 함유하는 2 부분 키메라 DNA 서열이다. 예로든 마커중의 하나가 GUS 유전자의 코딩 서열이면, 상술한 마커중의 어느 마커라도 사용될 수 있다. 이와 유사한 3부분 키메라 서열은 PR-1a 유전자의 코딩 서열의 일부를 함유한다. 이들 구조는 예를들어 베타-글루쿠로니다제 효소 활성과 같은 화학적 유도의 영향이 식물 세포 또는 그의 추출물에서 쉽게 검출되기 때문에 특히 유용하다. 기타 태양에서 예를들어 담배의 β-1, 3-글루카나제 유전자중 어느 하나의 비코딩 서열을 포함하는 구조 및 야생형 또는 제초제 내성 아세토히드록시산 신타제 또는 바실러스 투린지엔시스 내부독소의 코딩서열을 포함하는 구조는 하기 L에 기재되어 있다.
바람직한 키메라 DNA 서열은 제 1 DNA 성분 서열이 담배 PR-1a 유전자의 5'측 영역이고 또 전사개시부위 옆의 300 이상, 예를들어 300 및 200 사이, 바람직하게는 600 및 1000 사이의 염기쌍을 함유하는 2 성분 또는 3성분 키메라 DNA 서열이다.
또한 바람직한 것을 예를들어 제 2 DNA 성분 서열이 PR 단백질 유전자, 바람직하게는 PR-1a 유전자로부터 유래하는 시그널 펩티드이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 펩티드를 코드하는 것처럼 제 2 DNA 성분 서열이 시그널 펩티드를 코드하는 3성분을 포함하는 키메라 DNA 서열이다.
본 발명은 또한 식물 또는 식물조직에서 연합 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있고 그 조절이 화학적 조절제에 따라 다른 화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 성분 서열, 및 식물 또는 식물조직에서 전사될 수 있는 제 2 DNA 성분 서열을 포함하며, 이들 DNA 성분 서열이 결찰되는 것을 특징으로 하는 화학적으로 조절가능한 키메라 DNA 서열의 제조방법도 포함한다. 이와 유사하게 본 발명은 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 가지며 또 연합 DNA 서열의 식물 또는 식물 조직에서의 전사를 조절할 수 있으며 그 조절이 화학적 조절제에 따라 다른 제 1 DNA 성분 서열, 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 유전자에서 제 1 성분이 연합된 전사가능한 DNA 서열 전부가 아닌 일부이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 제 2 DNA 성분 서열, 및 식물 또는 식물 조직에서 전사될 수 있는 제 3 DNA 성분 서열을 포함하며, 이들 DNA 성분 서열이 동시에 또는 연속적으로 결찰된 것을 특징으로 하는 키메라 DNA 서열의 제조방법도 포함한다.
D. 벡터
표준 수법에 의하여 제조되며 또 A 또는 B에 기재된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 또는 상기 C에 기재된 키메라 DNA 서열중 어느 하나를 포함하는 벡터는 본 발명의 다른 요지를 나타낸다. 벡터는 상술한 DNA 서열을 분리하고 증식시키기 위해 또 적합한 숙주를 이들 서열로써 형질전환시키기 위해 사용될 수 있는 제조합 DNA 서열이다. 분리 및 증식에 적합한 벡터는 예를들어 대장균과 같은 적합한 숙주 미생물에서 증식될 수 있는 플라스미드이다. 형질전환에 적합한 벡터는 식물 세포 또는 아그로박테리아(Agrobacteria)를 형질전환시키는데 유용한 벡터이다. 보다 상세하게는, 프로토플라스트 이외의 식물세포가 형질전환되면, Ti-플라스미드 유래 벡터가 바람직한 벡터이다. DNA를 프로토플라스트에 직접전달하기 위해, 상술한 벡터중 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 출발물질로 사용될 수 있는 적합한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 식물 조직 및 프로토플라스트를 형질전환하기 위해 적합한 벡터는 디프라몬드, 에이. 일행, Bio/Technology 1, 263(1983); An, G. 일행, EMBO J. 4, 277 (1985); 포트리쿠스, 아이. 일행, 상기 동일; 로드스타인, 에스. 제이. 일행, Gene 53, 153 (1987)에 기재되어 있다. 이들 이외에 본 발명에서 출발물질로 사용되기 적합한 많은 벡터가 당해 분야에 기재되어 있다.
상기 A 또는 B에 기재된 것과 같은 화학적으로 조절가능한 DNA 서열만을 함유하는 벡터는 상기 C에 기재된 바와 같은 키메라 DNA 서열을 함유하는 벡터를 제조하기 위한 중간체로 사용될 수 있다. 전사가능한 적합한 서열을 이러한 중간체 벡터로 삽입하면 원하는 식물 조직, 프로토플라스트 또는 기타 숙주를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 본 발명의 키메라 DNA 서열을 함유하는 벡터를 생성한다. 이와달리 키메라 DNA 서열을 제조하고 또 원하는 식물 조직 또는 숙주를 형질전환시키기 위해 사용되는 적합한 벡터로 삽입할 수 있다.
벡터의 작성 및 증식은 예를들어 대장균과 같은 적합한 숙주내에서 실행될 수 있다. 적합한 대장균 균주로 HB 101, JM 83, DH1, DH5α, LE392 등을 포함한다. 본 발명의 벡터는 직접적 유전자 전달 또는 미량주사법에 사용될 수 있다. 어떤 경우에는 벡터를 사용하기 전에 선상으로 만드는 것이 바람직할 수 있다. 또한 벡터는 아그로박테륨 숙주에 전달될 수 있다. 이 전달은 양친교배(시몬, 알. 일행 Bio/Technology 1, 74(1983)), 3친교배(디타, 지. 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347(1980)) 또는 형질전환법(홀스터스, 엠. 일행, Mol. Gen. Genet. 163, 181(1978))을 포함한 통상적인 수법에 의하여 달성된다. 적합한 아그로박테륨(Agrobacterium)주는 에이. 튜메파시엔스(A. tumefaciens) LBA4404, CIB542 및 C58Z707을 포함하며, 여기에 한정되지 않는다.
상기 A, B 및 C에서 언급된 바람직한 DNA 서열을 포함하는 벡터가 바람직하다. 또한 식물세포 또는 아그로박테륨에서 작용하는 벡터가 바람직하다. 하기 L 실시예에서 기술된 벡터가 특히 바람직하다.
E. 식물조직, 식물 및 종자
본 발명의 다른 요지는 상기 기술된 키메라 DNA 서열을 함유하는 식물조직, 식물 또는 종자이다. 상기에서 바람직한 것으로 언급된 키메라 DNA 서열을 함유하는 식물조직, 식물 또는 종자가 바람직하다.
식물조직의 세포는 상기 기재된 벡터로써 상기의 참고 문헌에 기재된 방법을 포함한 당해 분야에 공지된 수법 및 하기 실시예에서 자세하게 기술된 수법에 의하여 형질전환된다. 이들 수법은 식물 또는 식물조직을 아그로박태륨과 직접 감염 또는 공동 배양하는 것을 포함한다. 호슈, 알. 비이. 일행에 의하여 Science 225, 1229(1985))에 기재된 잎 화반 형질전환법이 매우 적합한 수법이다. 이와달리, 벡터는 예를들어 상기에서 충분히 기재된 바와 같이 엘렉트로포래이손법, 미량주사법 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 염화칼슘 존재하 또는 전장속에서 프로토플라스트를 형질전환시키는 것에 의하여 직접적으로 전달될 수 있다.
형질전환된 세포는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물로부터 유래하며 또 본 발명의 화학적으로 조절가능한 키메라 유전자 1개 이상을 함유할 수 있다. 따라서 예를들어 제초제 및 곤충, 비루스, 세균, 진균 및 기타 해충에 대한 내성 또는 내약력, 불임, 크기, 개화 및 열매 숙성을 코드하는 유전자를 식물조직에 도입하고, 이들 세포 또는 프로토플라스트는 궁극적으로 화학적 조절제의 조작에 의하여 특징이 조정될 수 있는 식물로 재분화된다. 이와달리 세포는 조직배양 또는 바이오리엑터에서 중식되어 효소 또는 2차 대사산물을 생산할 수 있다. 효소 분석법이 필요하면 키메라 유전자의 코딩 부분은 앞서 학인된 바와 같이 예를들어 LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS 또는 BT유전자를 포함한다. PR 유전자로부터 유래하는 화학적으로 유도가능한 서열을 함유하는 이러한 키메라 유전자는 조절제의 사용이 용이하고 또 효소산물의 검출이 용이하기 때문에 본 발명의 바람직한 태양이다.
형질전환에 이어 형질전환된 세포 또는 식물 조직은 통상적인 수법에 의하여 선별되거나 또는 탐색된다. 형질전환된 세포 또는 식물조직은 상기 기술된 키메라 DNA 서열을 함유하며 또 필요에 따라서 상기 참고문헌에 기재된 방법 및 단자엽 및 쌍자엽 식물에 대한 실시예에서 기술된 방법을 포함한 공지 방법에 의하여 재분화될 수 있다. 이들 수법에 의하여 재분화될 수 있는 종은 옥수수, 해바라기, 평지씨, 클로버, 담배, 당근, 목화, 자주개자리, 벼, 토마토, 가지나무 및 오이를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 재분화된 식물체는 표준 방법에 의하여 형질전환에 대하여 탐색된다. 재분화된 식물체의 후대는 개량된 식물 또는 종자개통(seed line)을 발생시키기 위해 삽입된 DNA 서열이 계속적으로 존재하는지에 대해 연속적으로 탐색 및 선별된다. 이 DNA 서열은 고전적인 육종, 프로토플라스트 융합, 핵이식 및 염색체 이식을 포함한 수법에 의하여 다른 유전자계로 이동될 수 있다.
F. 이점 및 용도
본 발명은 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 키메라 유전자의 식물 또는 식물조직에서의 발현을 용이하게 조절할 수 있는 것으로부터 유래하는 많은 이점과 용도를 제공한다. 안티센스 메카니즘에 의하여 작용하는 유전자의 조절 또는 발현이 표현형 특징의 생산을 유도하는 유전자의 조질이 가능하다. 특히 중요한 것은 유전자 발현의 시기와 비율을 조절할 수 있다는 것과 식물 전체를 통하여 또는 식물의 특징 부위에서 균일하게 이 조절을 용이하게 실행할 수 있다는 것이다.
식물세포, 식물조직 또는 식물에서 키메라 유전자의 발현이 요구되는 경우 키메라 유전자(들)를 조절할 수 있는 방법 및 양으로 화학적 조절재를 식물조직, 또는 식물 또는 식물부위에 적용함으로써 간단하게 조절을 실행할 수 있다. 예를들어 발현될 특징이 바람직하게는 앞에서만 발현되면, 식물의 다른 부위로의 어떠한 이동이 있기전에 잎에서만 발현이 가능한 시기에 잎을 분무 또는 살포 처리하면 상기 목적을 용이하고 효과적으로 완성할 수 있다.
이와달리 상기 식물의 부위 도처에서 균일한 발현은 전체식물(즉, 줄기 및 잎의 양면)에 적용하는 것에 의하여 유발된다. 뿌리에서의 발현이 요구되면, 종자 또는 종자 주위의 토양에 적용하는 것이 가능한 조절 방법이다. 바이오리엑터에서의 발현은 화학적 조절제를 세포와 접촉하는 배지에 부가하는 것에 의하여 용이하게 완수된다.
트랜스재닉 식물에서 신규 표현형 특징의 발현 시기, 비율 및/또는 유전자를 조절할 수 있는 능력은 많은 유용한 이점을 제공한다. 예를들어 해독매카니즘에 의하여 제초제 또는 기타 살충제에 대한 내약력이 식물에 도입된 경우, 이 특징은 화학적 조절제를 적당한 시기에 투여함으로써 최대화될 수 있다. 따라서 이 조절제는 적절한 내약력을 주는 방법에 따라서 제초제 또는 기타 살충제 투여전, 투여와 함께 또는 투여후에 적용될 수 있다.
또한 생합성이 외인성 또는 외래 유전자에 의하여 조절되는 화합물의 생산을 조절할 수 있다. 화학물질 유도시 이러한 산물의 생산은 필요한 시기에 개시될 수 있다. 유도된 방법은 다단계 생합성 또는 대사산물의 1단계 전환일 수 있다.
본 발명의 다른 이점은 화학적 조절제를 투여함으로써 식물에서 발생 과정을 원하는 시기에 조절할 수 있는 능력에 기인한다. 예를들어 식물 발생(발아, 싹이남, 싹틈, 꽃 형성, 화분형성, 열매숙성, 건조탈락, 절단 등)을 동시에 행할 수 있다. 또한, 정상적인 식물성장이 방해될 수 있다. 이것은 예를들어 소망하는 성장 단계를 억제하는 독소 유전자, 안티샌스 메카니즘을 통하여 성장 단계를 차단할 수 있는 DNA 서열, 또는 그의 발현이 새로운 성장 단계로의 전이를 차단하고 또 성장이 진행되는 것을 화학적으로 억제할 수 있는 유전자를 도입하는 것에 의하여 달성될 수 있다. 1가지 적합한 유용성은 작물의 잡종 형성 조정에 대한 응성 또는 자성 불임의 유도이다.
본 발명의 추가적인 이점은 신규 분석방법, 바람직하게는 효소분석 방법이다. 예를들어 신규화학적 조절제의 확인을 아주 쉽게 달성할 수 있다. 이러한 분석 방법은 봉 발명이 키메라 DNA 서열을 함유하는 형질전환된 식물 또는 식물세포의 사용을 포함한다. 화학물질을 형질전환된 숙주에 투여하고 또 전사 가능한 DNA 서열의 전사를 대조용에 대하여 측정하며; 전사는 통상 번역산물 형태로 또는 이러한 산물의 영향으로 확인된다. 이 분석법은 다양한 방식으로 실행될 수 있지만, 전형적으로 전체적으로 재분화된 식물(화학물질을 식물에 투여하는 것에 의하여) 또는 배양세포 또는 조직(화학물질을 세포 또는 조직에 투여하는 것에 의하여)을 사용하고 이어 효소활성용 기질을 투여하는 것에 의하여 실행된다. 효소활성 산물은 예를들어 분광광도 측정법과 같은 표준방법으로 검출된다.
특히, 본 발명은 상기 C에서 기술한 키메라 DNA 서열을 갖거나 또는 상기 키메라 DNA 서열을 함유하는 벡터를 갖는 숙주를 형질전환시키고, 이 형질전환된 숙주에 임의의 화학적 조절제를 투여하며, 또 표현형 특징의 발현을 측정하는 것을 포함하는 화학적 조절제를 확인하는 방법을 포함한다. 형질전환된 숙주가 식물조직 또는 식물 세포인 방법이 특히 바람직하다. 키메라 DNA 서열이 상기에서 바람직한 것으로 정의된 서열, 예를들어 키메라 DNA의 제 1 DNA 성분 서열이 PR 단백질 유전자의 화학적으로 유도가능한 서열이거나 또는 그와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 화학적으로 유도가능한 서열이고, 또 이 키메라 DNA가 코드하는 표현형 특징이 분석가능한 효소 마커인 방법이 또한 바람직하다.
본 발명의 다른 요지는 기타 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 확인하는 신규 방법을 개발하는 것이다. 임의의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 벡터를 예를 들어 숙주 선별성 마커 및 선별 가능한 또는 분석가능한 마커로부터 제조된다. 적합한 선별성 마커는 항생물질 내성 유전자 및 제초제 내성 유전자를 포함한다. 항생물질 내성 유전자의 대표로 히그로마이신, 카나마이신, 클로람페니콜, 블래오마이신, 퓨로마이신, 린코마이신, G 418 및 메토트랙세이트에 대한 유전자를 포함한다. 히그로마이신에 대하여 내성인 특히 적합한 유전자는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 IV이다. 히그로마이신 내성 유전자를 함유하는 식물의 형질전환에 적합한 벡타는 로드슈타인, 에스. 제이. 일행에 의하여 Gene 53, 153(1987)에 기재되어 있다. 제초제 내성 유전자의 예는 예를 들어 술포닐우레아, 글리포세이트, 포스피노트리신 및 아트라진에 대한 내성을 코드한다.
적합한 분석가능한 마커는 항생물질 내성 유전자 뿐 아니라 효소, 항원, 면역 글로불린 등 대한 유전자도 포함한다. 적합한 효소 마커는 LUX, CAT, NPT, NOS, OCS, GUS, AHAS 및 BT를 포함한다. 베타-1, 3- 글루쿠로니다제 (GUS)는 효소분석의 용이함 때문에 특히 적합한 효소이다. 분석가능한 마커를 코딩하는 DNA 서열은 통상적인 수법을 이용하여 벡터에 삽입될 수 있다.
임의의 조절가능한 DNA 서열은 분석가능한 마커 유전자 옆에 전형적으로 삽입되어 이 분석 가능한 마커의 발현이 임의의 DNA 서열의 조절을 받게된다. 벡터는 식물 조직 또는 기타 적합한 숙주를 형질전환시키기 위해 사용된다. 형질전환된 식물조직 또는 숙주는 식물선별성 마커, 전형적으로 항생물질 내성을 기본하여 선별된다. 화학적 조절재는 선별후 또는 형질전환된 조직의 재분화 이후에 식물조직 또는 기타 숙주에 투여된다. 화학적 조절제의 투여에 뒤따른 분석가능한 마커의 유도 또는 억제는 임의의 DNA 서열이 옆에 있는 DNA 서열의 전사를 조절할 수 있는 서열이고 또 그 조절이 화학적 조절제에 따른 것이라는 것을 확인한다. 이 분석은 전체적으로 재분화된 또는 형질 전환된 식물상에서, 예를들어 화학적 조절제를 잎 또는 기타 식물 조직에 투여하고 또 분석가능한 마커의 발현을 측정하는 것에 의하여 실행될 수 있다. 이와달리 임의의 화학적 조절제를 캘러스 또는 기타 배양물에 투여하고 또 분석가능한 마커의 발현을 측정하는 것에 의하여 형질전환된 캘러스 배양물 또는 세포 배양물 내의 기타 숙주에서 분석을 행할 수 있다.
특히 본 발명은 하기 단계를 포함하는 화학적으로 조절가능한 DNA서열을 확인하는 방법을 포함한다.
(a) 임의의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 또는 상기 서열, 숙주 선별 가능 유전자 마키인 제 2 DNA 서열 및 효현형 특징을 코드하는 제 3 DNA 서열을 함유하는 벡터로 숙주를 형질전환시키고;
(b) 이 형질 전환된 숙주에 화학적 조절제를 투여하며; 또
(c) 발현을 측정하거나 또는 제 3 DNA 서열이 코드하는 표현형 특징의 발현상의 변화를 선별함.
제 3 DNA 서열이 숙주 선별가능 또는 분석가능한 유전자 마커인 방법, 및 제 2 또는 제 3 DNA 서열이 히그로마이신, 카나마이신, 클로람페니클, 블레오마이신, 푸로마이신, 린코마이신 및 매토트랙세이트 내성 유전자(예 : 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 IV 히그로마이신 내성 유전자)로 구성된 군에서 선별된 제초제 내성 또는 항생물질 내성에 대한 유전자 마커인 방법이 바람직하다.
또한 임의의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열이 제 3 DNA 서열과 연합되는, 바람직하게는 그 옆에 위치하는 방법이 바람직하다. 또한 형질전환된 숙주가 식물 조직 또는 식물 세포인 방법이 바람직하다.
또한 제 3 DNA 서열이 루시페라제(LUX), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 내오마이신 포스포트랜스피라제(NPT), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS), 베타-1, 3-글루쿠로니다제(GUS), 아세토히드록시산 신타제(AHAS), 및 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내부독소(BT)로 구성된 군에서 선정된 분석가능한 효소마커를 코드하는 방법이 바람직하다.
본 발명의 다른 요지는 상술한 방법에 의하여 확인되는 실질적으로 순수한 화학적으로 조절가능한 DNA 서열이다.
본 발명은 또한 형질전환된 식물 물질을 선별하는 방법을 제공한다. 화학적 조절제가 공지된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 및 표현형 특징을 코드하는 제 2 DNA 서열을 함유하는 외인성 DNA 서열에 노출된 식물물질을 조절제로 처리하고 또 표현형 특징의 발현을 조사한다. 이 특징의 관찰은 임의의 형질전환체의 형질전환이 실제로 일어났었다는 것을 증명한다.
이 방법의 목적을 위해 전형적인 표현형 특징은 상술한 숙주 선별성 마커 및 분석가능한 마커를 포함한다.
특히 본 발명은 공지된 화학적 조절제에 의하여 화학적으로 조절가능한 제 1 DNA 성분서열 및 표현형 특징을 코딩하는 연합된 제 2 DNA 서열을 포함하는 형질전환성 DNA로 처리되어진 형질전환된 식물세포 또는 조직을 선별하는 방법을 포함하며, 이 방법은 (a) 임의의 형질전환체를 공지된 화학적 조절재로 처리하고 또 (b) 제 2 DNA 서열이 코드하는 표현형 특징의 발현에 따라 형질전환체를 선별하는 단계를 포함한다. 상기 표현형 특징이 예를들어 히그로마이신 카나마이신, 클로람페니클, 블래오마이신, 푸로마이신, 린코마이신, G418 및 메토트렉새이트와 같은 항생물질 내성, 또는 루시페라제(LUX), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 내오마이신 포스포트랜스 피라제(NPT), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS), 베타-1, 3-글루쿠로니다재(GUS), 아세토히드록시산 신타제(AHAS), 및 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내부독소(BT)로 구성된 군에서 선정된 분석가능한 효소마커인 방법이 바람직하다.
G. 시그널 펩티드
시그널 펩티드 또는 시그널 서열은 소포체로 들어가는 단백질내의 특수한 N-말단 아미노산 서열이다. 진핵 세포에서의 이러한 서열은 약 15 내지 40 아미노산 잔기를 함유하며, 그이 대부분이 소수성이다. 이 서열은 성숙 단백질로부터 분해된다.
본 발명의 관계에서 볼 때 화학적으로 조절가능한 유전자의 시그널 펩티드는 상술한 3부분 키메라 구조의 작성에 유용하다. 이러한 키메라 구조는 화학적으로 조절가능한 제 1 서열, 단밸질에서 시그널 펩티드를 코딩하는 제 2 DNA 서열, 및 표현형 특징을 코드하는 제 3 서열을 함유한다. 바람직하게는 표현형 특징을 예를들어 분석과정에서 용이하게 검출될 수 있는 특징이다. 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 키메라 구조에 포함시키면 숙주 세포의 소포체로부터 떨어져야 하는 제 3 DNA 서열에 의하여 발현된 산물이 궁극적인 표적 부위로 향하도록 한다.
그러므로 본 발명의 추가적인 요지는 담배 PR-1a 단백질로부터 생성된 시그널 펩티드, 및 이 펩티드와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 아미노산으로된 단백질이다. 이 펩티드와 아미노산 서열은 다음과 같다.
; MetGlyPheValLeuPheSerGlnLeuProSerPheLeuLeuVal-
, SerThrLeuLeuLeuPheLeuValIleSerHisSerCysArgAla.
본 발명은 이 펩티드를 코드하는 DNA 서열(서열 1 참고) 및 이 서열과 실질적으로 상동인 서열을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 앞서 이미 말한 바와 같이 본 발명은 또한 (1) 시그널 펩티드를 코딩하는 서열과 결합된 화학적으로 조절가능한 서열을 함유하는 DNA 서열 및 (2) 화학적으로 조절가능한 성분, 시그널 펩티드의 코딩하는 부분 및 전사되고, 바람직하게는 번역되는 DNA 서열을 함유하는 3부분 키메라 DNA 서열을 포함한다.
H. 신규 PR 유전자
본 발명은 또한 담배의 PR-1a, PR-1' 및 PR-R, 오이의 병인성 키티나제, 담배의 PR-Q, 담배의 염기성 β-1, 3-글루카나제 39.1 및 39.3, 담배의 산성 β-1, 3-글루카나제로 표시된 유전자로부터 새로 분리되어 확인된 PR 개놈 DNA 및 cDNA 서열 및 이들 유전자와 실질적으로 상동인 서열을 갖는 DNA 서열을 포함한다. 이들 유전자의 DNA 서열은 서열 1에서 서열 8에 나타낸다. 서열 1, 2, 5 및 6(각각 PR-1a, PR-1', 및 β-1, 3-글루카나제 39.1 및 39.3)의 신규 유전자는 또한 상술한 본 발명의 화학적으로 조절가능한 비코딩 DNA 서열의 특징 구체예를 나타낸다. 신규 서열 3, 4, 7 및 8은 PR 단백질 오이 키티나제, 담배 PR-R, 담배 PR-Q 및 산성 형태의 담배 β-1, 3-글루카나제를 코드한다. 이 유전자의 분리 및 특징의 자세한 것은 실시예에 나타낸다.
I. 화학적 조절재
화학적 조절재는 이 용어의 정의에 지시된 바와 같이 특정환경하에서 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 통하여 유전자의 발현을 조절할 수 있는 물질로 정의된다. 용매화합성 또는 기타 착화성 분자 또는 음이온을 갖거나 또는 갖지 않은 이온형태 또는 중성 형태인 이 물질은 조절이 필요한 시기에 화학적으로 조절가능한 유전자를 함유하는 계에 대하여 통상 외인성 물질이다. 외인성 화학적 조절재의 사용은 계내에서 조절제의 양을 조절하기가 용이하고 간편하다는 점에서 바람직하다. 그러나 본 발명은 계내에서의 활성 또는 수준이 계내에서 또는 계상에서 작용하는 기타 성분에 의하여 인위적으로 조절되는 화학물질과 같이 내인성 조절제의 사용도 또한 포함한다.
화학적 조절제는 식물에서 PR 단백질의 유도물질로 공지된 화합물, 또는 그의 유사 유도체를 포함한다. 이들은 벤조산, 살리실산, 폴리아크릴산 및 그의 치환된 유도체를 포함하며; 적합한 치환체로 저급알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오 및 할로겐을 포함한다. 식물조직, 전형적으로 전체 식물의 잎에 투여되는 경우, 식물조직에서 mRNA 및 PR 단백질의 수준 향상이 나타낸다.
본 발명의 화학적으로 조절가능한 DNA 서열 및 키메라 유전자에 대한 추가적인 조절제는 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 구조를 기본으로 하고 또 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 카르복시산, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸에티오 카르복시산, 시아노벤조-1, 2, 3-티아디아졸, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 카르복시산 아미드, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸카르복시산 히드라지드 및 그의 유도체를 포함하며 또 여기에 한정되지 않는다.
조절제의 바람직한 그룹은 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산, 7-시아노벤조-1, 2, 3-티아디아졸, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산 아미드, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산 히드라지드 및 그의 유도체를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다.
적당한 유도체는 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 부위가 비치환되거나 또는 저급 알킬, 저급알콕시, 저급 할로알킬, 저급 할로알콕시, 저급 알킬티오, 시아노, 니트로 및 할로겐과 같은 농화학의 방향족 고리개에서 통상적으로 사용되는 작은 치환체에 의하여 치환된 상기 화합물형의 대표류를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 적합한 유도체는 또한 카르복시산, 티오카르복시산, 카르복시산 아미드 또는 카르복시산 히드라지드 기능기가 비치환되거나 또는 지방족, 방향성 지방족 또는 방향족 잔기에 의하여 치환된 상기 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 화합물의 대표류를 포함하지만 여기에 한정되지 않는다. 적합한 잔기는 알킬(특히 저급 알킬), 알콕시(특히 저급 알콕시), 저급 알콕시알킬, 알콕시알콕시알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 페닐알킬(특히 벤질), 나프틸알킬, 페녹시알킬, 알켄일 및 알킨일을 포함하지만 여기에 한정되지 않으며, 이때 치환체의 알킬 부위는 비치환되거나 또는 히드록시, 할로겐, 시아노 또는 니트로에 의하여 치환되며 또 치환체의 방향족 부위는 비치환되거나 또는 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알킬, 저급 할로알콕시, 저급 알킬티오, 시아노, 니트로 및 할로겐과 같은 농화학의 방향족 고리계에서 통상적으로 사용되는 작은 치환체에 의하여 치환된다.
벤조-1, 2, 3-티아디아졸 구조에 기본한 조절제는 실질적으로 조절제로 자용하는 분자를 방출할 수 있는 모든 분자계를 포함한다.
벤조-1, 2, 3-티아디아졸 구조에 기본한 바람직한 조절제군은 벤조-1, 2, 3-티아디아졸 카르복시산, 알킬벤조-1, 2, 3-티아디아졸 카르복실레이트(이때, 알킬기는 1 내지 6개 탄소 원자를 함유함) 및 이들 화합물의 치환된 유도체를 포함한다. 적합한 치환체는 저급알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오 및 할로겐을 포함한다. 특히 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산 및 그의 알킬 에스테르, 즉 메틸벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트는 PR 단백질 유전자로부터 분리된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 포함하는 키메라 DNA 서열의 유발물질로 바람직하다. 상술한 화학적 조절제의 합성 및 그의 생물독으로서의 사용은 영국 특허 1, 176,799호 및 커버, 피이 일행이 기술한 J. Chem. Soc. C 2250(1970)으로부터 알려져 있다.
본 발명에 따라서 조절제로 사용될 수 있는 벤조-1, 2, 3-티아디아졸의 유도체는 1988년 8월 18일 출원된 미합중국 특허 출원번호 234,241호에 기재되어 있다.
벤조-1, 2, 3-티아디아졸 구조에 기본한 바람직한 종류중에서 예를들어 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산, 메틸 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트, n-프로필 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산 2차 부틸히드라지드 등을 들 수 있다.
본 발명의 화학적으로 저절 가능한 DNA 서열에 대한 추가적인 조절제는 이소니코틴산 구조와 같은 피리딘 카르복시산 구조에 기본하며 바람직하게는 할로이소니코틴산 구조에 기본한다. 디클로로 이소니코틴산 및 그의 유도체, 예를들어 저급 알킬 에스테르가 바람직하다. 이 종류 화합물의 적합한 조절제는 예를들어 2, 6-더클로로이소니코틴산 및 그의 저급 알킬 에스테르, 특히 메틸에스테르이다.
본 발명의 다른 요지는 화학적으로 조절가능한 유전자의 전사를 조절하는 방법으로, 이 방법은 상기 A, B 및 C에서 기술된 바와 같은 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 식물조직, 식물 또는 종자에 화학적 조절제를 투여하는 것을 포함한다. 식물조직, 식물 또는 종자가 상기에서 바람직한 것으로 언급된 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유하는 방법이 바람직하다.
화학적 조절제는 순수한 형태, 용액 또는 현탁액 형태, 분말제 또는 살포제 또는 농업적으로 또는 바이오리엑티 방법에서 통상적으로 사용되는 기타 배합물 형태로 투여될 수 있다. 이러한 배합물은 식물, 조직, 세포 또는 조직 배양물에 투여를 실행하고 또 저장, 취급 또는 이송 특성을 개선시키기 위해 조절제가 결합된 물질인 고체 또는 액체 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 실리케이트, 점토, 탄소, 황, 수지, 알코올, 케톤, 방향족 탄화수소 등을 포함한다. 통상적인 수화제 또는 수성 유제로 배합된 경우, 조절제 배합물은 수화제, 유화제 또는 분산제와 같은 이온성 또는 비이온의 통상적인 계면활성제를 1이상 함유할 수 있다.
이 조절제는 식물에 특정 이점을 부여하는데 필요한 다른 시약과 함께 식물에 투여될 수 있고, 이 이점은 조절제에 의하여 조절되는 키메라 유전자에 의하여 제어되는 특징에 관련되거나 또는 관련되지 않는다. 예를들어 조절제는 비료와 혼합되어 수정에 무관한 트랜스제닉 특징의 발현이 요구되기 전에 투여된다. 또는 조절제는 제초제와 결합될 수 있고 또 효과가 최대일 수 있는 시기에 제초제의 효과를 완화시키기 위해 투여될 수 있다.
액체 배합물로서는, 조절제는 식물 잎, 줄기 또는 가지, 파종전에는 종자에 또는 토양 또는 기타 식물 생육지지 배지에 분무투여될 수 있다. 조절제는 바이오리엑터계에서 또한 사용될 수 있으며, 조절제 배합물을 반응 배지에 1회 투여하는 것에 의하여 또는 지정된 기간동안 점차적으로 부가하는 것에 의하여 조절이 이루어질 수 있다.
조절제는 소망하는 조절을 실시하기에 충분한 양과 시간에 걸쳐 투여된다. 바람직한 조절제는 투여된 식물, 식물조직 또는 식물세포상에서 투여량으로 식물 독성 또는 기타 유독 영향을 나타내지 않거나 또는 최소로 나타내는 조절제이다.
상기 A 또는 B에서 기술한 것 중 바람직한 DNA 서열 및 상기 C에서 기술한 것 중 바람직한 키메라 DNA 서열은 전사기 상기 언급한 화학적 조절제에 의하여 조절되는 서열이 특히 바람직하며, 화학적 조절제는 벤조산, 살리실산, 아세틸살리실산, 폴리아크릴산 및 그의 치환된 유도체로 구성된 군에서 선정된 것, 또는 벤조-1, 2, 3-티아디아졸카르복시산, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸카르복시산, 시아노벤조-1, 2, 3-티아디아졸, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸카르복시산 아미드, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸카르복시산 히드라지드 및 그의 유도체로 구성된 군에서 선정된 것, 또는 디클로로이소니코틴산 또는 그의 유도체이다. 상술한 바람직한 화학적 조절제, 예를 들어 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산, 메틸벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트, n-프로필벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤질벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복시산 2차 부틸히드라지드, 2, 6-디클로로이소니코틴산 또는 메틸 2, 6-디클로로이소니코티네이트, 특히 메틸 벤조-1, 2, 3-티아디아졸-7-카르복실레이트에 의하여 전사가 조절되는 DNA 서열이 가장 바람직하다.
J. ATCC에 기탁
하기 세균, 플라스미드 및 현탁배양물은 어메리칸 타입 컬쳐콜렉숀(American Type Culture Cellection)에 기탁되었다:
K. 실험 계획안의 개요
본 발명의 키메라 유전자는 1개 이상의 전사가능 DNA 서열과 결합된, 천연 또는 합성의 공급원으로부터 얻은 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 함유한다: 통상 전사가능 서열의 적어도 일부는 표현형 특징으로 번역되지만, 본 발명은 또한 안티센스 메카니즘을 통하여 작용하는 키메라 유전자도 포함한다. 하기 설명 및 많은 실시예는 식물 게놈에서 천연적으로 존재하는 화학적으로 조절가능한 DNA 서열에 관한 것이며, 본 발명은 기타 천연적인 계, 예를 들어 세균, 비루스 및 동물계에서 존재하는 서열에도 동일하게 적용되며, 천연적인 계로부터 그러한 서열을 분리하는 방법은 공지되어있다. 또한 합성 또는 기타 비천연적 계로부터 유도된 서열도 유사하게 포함된다.
화학적으로 조절가능한 DNA 서열은 천연적으로 또는 합성적으로 존재하는 공급원으로부터 분리되며, 필요한 경우 통상적인 방법에 의하여 특징 묘사된다. 천연적으로 존재하는 유전자로부터 이 DNA서열을 분리하면, 그 유전자는 적합한 조절제, 즉 화학물질 또는 그 유전자용으로 공지된 조절제에 의하여 활성화된다. 이 활성화에 의하여 생성한 RNA를 분리하여 cDNA 라이브러리를 작성하는데 사용한다. 이 라이브러리는 (1) 활성화된 계로부터 분리된 RNA 및 (2) 조절제에 의하여 활성화되지 않은 둘째계로부터 분리된 RNA 모두로부터 제조된 방사선 표지 cDNA를 사용하여 특이적으로 스크리닝(differential screening)하는데 사용된다. 이 특이적 스크리닝법은 상술한 바와같이 본 발명의 특별 요지이다. 화학적으로 조절되는 cDNA를 함유하는 클론을 분리한 다음 염기 서열 결정화시키는 것이 바람직하다. cDNA 클론은 게놈 클론이 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 포함하는 게놈 라이브러리로부터 유래된 게놈 클론을 확인하고 분리하기 위하여 사용된다. 이 유전자를 염기서열화시키고, 또 이 유전자의 단편을 서브클로닝하고, 이들을 리포터 유전자에 결찰시키며 또 트랜스재닉 식물 물질 또는 순간적인 식물 발현계에서의 이들의 활성을 측정하는 것에 의하여 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 기능적으로 지도화한다.
담배의 PR 단백질 유전자에 대하여는 入게놈 라이브러리가 표준수법을 사용하여 작성되며 또 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 포함하는 클론을 확인하고 정제한다. 이들 클론중의 하나를 특징짓는다. 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 갖는 제한 단편을 확인한다; PR-1a 유전자에 대한 이들 유전자 단편은 약 20,000염기쌍의 ClaI 단편, 6500 염기쌍의 Hind III 단편, 및 3600 염기쌍의 BcoRI 단편을 포함한다. Hind III 단편은 전사 개시부위 옆에 있는 5'측 영역에서 약 500 코딩 염기쌍 및 약 6000 비코딩 염기쌍을 함유한다. 이들 단편 중 몇개는 한층 더 서브클로닝하고 완전한 특징화, 즉 유전자의 제한 효소지도화, DNA 염기서열결정 및 전사 개시 부위를 확인하기 위한 DNA 공급원으로 사용하기 위해 플라스미드에 서브클론 된다. PR-1a 유전자의 경우 3600 염기쌍의 BcoRI 단편이 入게놈클론으로부터 직접적으로 서브클론되며 이어 XhoI 및 PstI 부위와 측면을 접하는 약 1200 염기쌍의 최종 클론으로 서브클론된다. 이 클론은 PR-1a으로부터 유래하는 화학적으로 유도가능한 DNA 서열 및 이 유전자 옆에 있는 코딩 영역의 부분을 함유하며; 이 부분은 PR-1a 단백질 유전자의 시그널 펩티드에 대한 코딩 영역을 포함한다.
이와 유사하게 게놈 클론이 분리되는데 이것은 베타-1, 3-글루카나제의 염기성 형태를 코드한다. 39.1 및 39.3으로 명명된 2개의 클론이 특징적으로 묘사되어 있고 또 화학적으로 조절가능한 DNA 서열을 포함하는 제한효소 단편이 확인된다.
본 발명의 벡터를 사용하여 이들 클론은 앞서 설명한 3부분을 함유하는 키메라 유전자의 제조에 이용될 수 있다. 이들 키메라 DNA 서열은 화학적으로 조절가능한 서열, 전사가능 DNA 부분 및 외래 공급원으로부터 유래하는 제 3 DNA 서열을 함유한다. 이와 다르게 클론은 또한 외래 공급원으로부터 유래하는 코딩 서열에 부착되기 전에 어버이 유전자로부터 유래하는 코딩 단편의 모두 또는 대부분을 제거하여 상술한 것과 같은 2 부분 키메라 유전자를 제조하기 위해 예를들어 부위 특이적 돌연변이에 의하여 더 조작될 수 있다. 바람직한 태양에서 화학적으로 조절가능한 서열이 아닌 키메라 유전자부분은 용이하게 관찰되거나 또는 용이하게 검출되는 표현형에 대한 리포터 유전자를 구성한다. 하기 실시예는 β-1, 3-글루쿠로니다제, 야생형 및 제초제 내성 아세토히드록시산 신타재 및 바실러스 투린지엔시스 내부독소에 대한 유전자를 설명하지만, 각종 기타 리포터 유전자도 상술한 바와 같이 설명될 수 있다. 바람직한 태양에서 키메라 유전자의 코딩성분 DNA 서열은 제초제에 대한 내약력 또는 내성을 코드하거나 또는 곤충에 대한 내성을 코드한다. 이 태양은 아세토히드록시산 신타제 및 바실러스 투린지엔시스 내부독소에 대한 유전자로써 예로들 수 있다.
키메라 유전자 및 이들 유전자를 함유하는 벡터는 형질전환된 세포, 조직 및 식물을 일으키는 각종 수법에 의하여 식물 세포에 도입되거나, 또는 바이오리엑터에서 유용한 세포 배양물에 도입될 수 있다. 하기 실시예에 몇개의 수법을 자세하게 기술하고 있고, 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 모두에 관한 것이다. 본 목적을 가능하게 하는 이들 방법의 몇개는 다른 특허 명세서, 특히 1987년 5월 29일 출원된 미합중국 특허원 056,506호 및 1988년 3월 8일 출원된 미합중국 특허원 165,665호의 주제이기도 하다.
형질전환된 식물 물질은 화학적 조절제로 처리된 다음 표현형 리포터 유전자의 발현이 관찰 및/또는 측정된다. 이 형의 계는 특정화학물질의 조절 활성을 확인하기 위한 쉬운 스크리닝 장치를 제공한다. 본 발명은 또한 수많은 시료의 스크리닝을 높은 정확도 및 단시간 안에 허용하는 베타-1, 3-글루쿠로니다제(GUS)효소활성의 개선된 분석법에 관한 것이다. 특히 이 분석법은 1.5 내지 3mmM 4-베틸 움밸리페릴 글루쿠로니드를 함유하는 0.5ml 미만의 시료내의 식물조직 추출물을 37℃ 근처에서 1 내지 5시간 동안 반응시키고 또 방출되는 형광지시제의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
안정단계에 있는 RNA의 정량 측정은 유전자 발현의 분석상 필수적인 단계이다. 이 목적을 위해프라이머 신장 분석법(primer extension assay)이 개발되었다. 본 발명의 방법은 특정 올리고뉴클레오티드 유전자를 특이적으로 방사능이 높게 표지시키고, 이 올리고뉴클레오티드를 RNA 시료와 잡종 분자를 만들고 또 이 잡종을 역전사 효소로 신장시키는 것을 포함한다. 신장 산물은 변성된 아크릴아미드 결상에서 분리되며 방사선 사진에 의하여 눈으로 관찰할 수 있다. 종래 분석법에 비하여 본 방법의 이점은 프로브 제조의 용이함, 분석 계획안의 간소함 및 분석을 실행하는데 소요되는 시간의 간소함을 포함한다. 이 프라이머 신장분석법은 S1 맵핑법만큼이나 민감하고 정량적이다.
하기 실시예에서 기술된 특정 반응 조건하에서 적용되는 프라이머 신장 분석법은 TMV로 감염된 담배의 잎으로부터 추출된 전체 RNA에서 PR-1 mRNA의 수준을 특정하기에 적합하다. 이 PR-1 mRNA는 프라이머 신장 데이터의 정량 분석 및 이 RNA로 부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 cDNA 클론의 빈도를 기본하여 이들 앞에서 mRNA의 1%로 발현된다. 전술한 방법에 대하여 본 발명의 방법의 개선된 점은 올리고뉴클레오티드의 특이 활성이 높은 표지화, 이 분석법에 사용된 프로브의 몰 농도 감소(전형적으로 약 0.01 내지 0.05 pmol), 적당한 잡종 분지형성 및 신장 기간 그리고 뉴클레오티드 삼인산 농도가 적합하다는 것을 포함한다.
그러므로 본 발명은 RNA 용액에서 특이 RNA의 양을 측정하는 방법을 포함하며, 다음 단계로 구성된다.
(a) 12 및 18 뉴클레오티드 길이의 RNA 특이 프라이머 올리고뉴클레오티드를 특징적 방사능이 높게 표지하고;
(b) 0.1 및 20 nM 사이의 농도인 이 표지된 올리고뉴클레오티드를 RNA와 함께 37℃ 근처의 온도에서 2분 내지 24시간 동안 잡종을 만들고;
(c) 0.003 및 1mM 사이 농도인 뉴클레오티드 삼인산 존재하에서 1분 및 120분 동안 프라이머 올리고뉴클레오티드의 길이를 역전사효소로 신장하고, 또
(d) 신장된 산물의 분리 및 방사선 사진으로 확인함.
L. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들은 설명을 위한 것으로 본 발명의 범위 및 특히 청구범위의 의미내에서 제한을 의미하지 않는다.
효소반응은 특별히 나타내지 않는한 제조사가 추천한 방법에 따라 실시한다. 본 발명의 키메라 유전자 및 벡타는 당해 분야에 공지된 수법을 이용하여 작성한다. 적당한 수법은 마니아티스, 티 일행이 지은 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1982); Methods in Enzymology, Volumee 68, 100, 101 및 118(1979, 1983, 1983 및 1986); 및 DNA Cloning, Glover, D. M. Ed. IRL Press, Oxford (1985)에 기재되어 있다. 배지 조성은 앞서 나타낸 참고서적 뿐 아니라 Miller, J. H, Experiment in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, New York(1972)에 기재되어 있다.
약어
ATP : 아데노신 삼인산
bp : 염기쌍
CETAB : 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드
2, 4-D : 2, 4-디클로로페녹시 아세트산
DTT : 디티오트레이튤
디캄바 : 3, 6-디클로로-2-메톡시벤조산
EDTA : 에틸렌디아민 N, N, N', N'-테트라이세트산
kb : 킬로 염기쌍
NES : 2-(N-모르폴리노)에탄 술폰산
MU : 4-메틸 움벨리패릴 글루코니드
PEG : 폴리에틸렌 글리콜
피클로람 : 4-아미노-3, 5, 6-트리클로로피콜린산
SDS : 나트륨 도데실 술페이트
TFA : 트리플루오로아세트산
TMV : 담배 모자이크 비루스
트리스-HCl : 트리스 (히드록시메틸) 메틸아민 히드로클로라이드
배지
SH-0 배지 : 쉔크, 알. 유 일행, Can. J. Bot., 50(1972) 199-204의 배지; 호르몬 갖지 않음. SH 배지는 액체이거나 또는 0.8% 한천 또는 0.5% 겔라이트로 응고될 수 있다. 이 배지는 통상 230 내지 250°P인 오오토클레이브에서 15 내지 20분 동안 가열에 의하여 멸균된다.
SH-30 배지 : 30㎛ 디캄바를 함유하는 SH-0배지.
SH-45 배지 : 45㎛ 디캄바를 함유하는 SH-0배지.
RY-2 배지 : 아마다, 와이. 일행, Plant Cell Reports, 5, 85-88(1986)의 배지.
OMS 배지 : 무라시게, 티이 및 스쿠그, 에프, Physiologia Plantarum 9, 473(1968)의 배지. 이 배지는 0.8% 한천 또는 아가로스 또는 0.5% 겔라이트으로 응고될 수 있다.
[표 I] 사용된 배지의 조성
배지KM-8pb, c, dNG
다량 원소a, 미량원소a및 Fe-EDTA는 문헌에 주어진 바와 같다: KM배지는 가오, 케이. 엔 일행에 의하여 Planta 126, 105-110(1965)에 따른 것이고; NG 배지는 츄 일행, Scientia Sinica 18, 659(1975)에 따른 것이다.
유기물질 및 비타민e(mg/l) :
비오틴0.01
피리독신-HCl1.000.5
티아민-HCl10.000.1
니코틴아미드1.00
니코틴산0.100.5
엽산0.40
D-Ca-판토테네이트1.0
P-아미노벤조산0.02
염화콜린1.00
리보플라빈0.20
비타민 B 120.02
글리신0.102.0
당 및 당 알코올(g/l) :
자당0.2530.0
글루코스68.40
만니톨0.25
소르비톨0.25
셀로비오스0.25
과당0.25
만노스0.25
람노스0.25
리보스0.25
크실로스0.25
미오-이노시튤0.10
최종 pH5.85.6
멸균여과기오오토클래이브
각주 :
a다량원소는 통상 10배로 농축된 저장 용액으로 제조되고, 미량 원소는 1000배로 농축된 저장 용액으로 제조된다.
b시트르산, 푸마르산 및 말산(각 40mg/l의 최종 농도) 그리고 피루브산 나트륨(최종 농도 20mg/l)은 NH4OH로 pH가 6.5로 조정된 100배 농축 저장 용액으로 제조되어 배지에 부가된다.
c아대닌 (0.1mg/l : 최종 농도), 및 구아닌, 티미딘, 우라실, 하이포크산틴 및 시토신(각 0.03mg/l : 최종농도)을 NH4OH로 pH가 6.5로 조정된 1000배 농축 저장 용액으로 제조되어 배지에 부가된다.
d하기 아미노산은 10배 농도의 저장 용액(NH4OH로 pH가 6.5로 조정됨)을 사용하는 배지에 부가되어 하기에 주어진 최종 농도를 얻는다 : 글루타민(5.6mg/l), 알라닌, 글루탐산(각각 0.6mg/l), 시스테인(0.2mg/l), 아스파라긴, 아스파라긴산, 시스틴, 히스티딘, 이소로이신, 로이신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신 및 발린(각각 0.1mg/l).
e비타민의 저장용액은 보통 100배 농축되어 제조된다.
원료
아기로스 : 아가로스의 제조 및 정제과정은 구이샐리 및 랜에 의하여 The Agarose Monograph, Marine Colloids Division FMC Corp., 1975에 기재되어 있다. 아가로스는 한천의 1개 구성 성분이다. 시판되는 한천은 보통 중성 아가로스 및 다수의 측쇄기를 갖는 이온성 아가로펙틴의 혼합물로 구성된다. 보통 측쇄의 몇개는 그대로 잔류하므로 겔 형성 및 용융온도와 같은 아가로스의 이화학적 특성을 결정한다. 저융점형 아가로스, 특히 Sea Plaque아가로스는 바람직한 응고제이다.
카제인 가수분해물 : 우유를 효소적으로 가수분해시킨 카제인 가수분해물, (Type 1 : 미합중국 미주어리 03178, 세인트 루이스 피오박스 14508의 시그마 캄페니 시재)
Cellulase RS : 셀룰라제 알애스(일본국 도꾜 105, 미나토꾸 히가시-신바시 1. 1. 19, 야쿠르트 혼샤 컴페니 리미티이드 사재)
Gelrite: 겔라이트 겔란 굼(GelRite Gellan Gum) (미합중국 로드아일랜드 02823, 피스커빌레의, 스코트 라보라토리즈 인더스트리스 사제)
GeneScreen Plus: 카타로그 번호 NEF 976 (미합중국 메샤츄세츠 02118, 보스톤, 알바니 스트리트 549에 소재하는 엔이엔 리서치 프리덕트사제)
IBI 랜덤 프라이머 키트 : Prime Time 랜덤 프라이머 키트(미합중국 코네티컷 07606, 뉴 하벤 피오박스 1565의 인터네이셔날 바이오테크놀로지즈 인더스트리스 사제)
Nalgen필터 : 미합중국 뉴욕 14602 로체스터 디비젼 오브 시브론 코오포레이숀의 날겐 컴페니사제.
Pectolyase Y-23: 일본국 도꾜 니혼바시 가오미쪼 4-13 세이신 피마슈티컬 컴패니 리미티드 사제.
Parafilm: Parafilm라보라토리 필름 : 미합중국 코네티컷 06830 그린위치 아메리칸 칸 캄페니사재.
SSC : 1.54 mM NaCl, 0.154 mM 시트르산나트륨
스핀 칼럼 : 세파덱스G25로 채워진 칼럼, 미합중국 뉴우저어지 피스캐타웨이 베링거 만하임 바이오케미컬스, 카탈로그 번호 100402.
TAE 완충액 및 TBE 완충액 : 각각 트리스-아세테이트 완충액 및 트리스-보레이트 완충액임-전기영동하는데 일반적인 완충액. 상기의 마니아티스 일행의 서적 참고.
1. 일반적 수법
이 그룹의 실시예는 하기 자세한 실시예를 실시하기 위해 사용되는 일반적인 조작과정을 설명한다.
[실시예 1] 아가로스에서 결찰
플라스미드 DNA를 제한 효소로 분해시키고 또 저융점 TAE겔상에서 전기 영동으로 단편을 분리한 후, 적합한 단편을 함유하는 밴드를 정확하게 잘라내어 65℃로 가열하여 아가로스를 용융시킨다. 2 내지 5㎕를 15㎕ 물에 부가하고 이 용액을 65℃에서 10분간 방치해둔다. 이 용액을 37℃로 냉각시키고 5분간 방치해 두어 실온으로 만든다. T4 DNA 리가제(뉴 잉글랜드 바이오랩사제) 1㎕와 함께 10배 농도 리가제 완충액(200mM 트리스, pH8.0, 100mM MgCl2, 100mM DTT, 10mM ATP) 2㎕를 부가하고 그 용액을 응고시켜 15℃에서 하루밤 동안 배양한다.
[실시예 2] 아가로스로부터 형질전환
적합한 DNA를 함유하는 아가로스를 65℃에서 10분간 배양하는 것에 의하여 용융시킨다. 이 용액 10㎕에 TE 완충액(10mM 트리스 pH 7.5, 1mM EDTA) 30㎕를 부가하고 혼합시키고 또 실온에서 방치한다. 냉동 수용 세포(대장균 DH 5α주)를 습윤 얼음상에 놓아 해동시킨다. 이 세포 200㎕에 희석 DNA를 부가하고 얼음상에서 20분간 방치한다. DNA를 함유하는 세포를 41℃에서 90초간 열충격 처리시킨다. 이 세포를 실온에서 10분간 방치한다. SOC 배지(마나한, 디이. J. Mol. Biol. 166, 557-580(1983))0.8ml를 부가하고 그 배양액을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 암피실린(L-amp) 100㎍/ml를 함유하는 I.B 평판(밀러, 상기동일)상에 배양액 100㎕를 선조접종하고 이 평판을 37℃에서 하룻밤 동안 배양한다. 양성클로니를 모아 둘째 L-amp 평판상에 다시 선조접종시키고 그 평판을 37℃에서 하루밤동안 배양한다.
[실시예 3] 서던 블로팅
담배 DNA 3㎍을 제조자가 제시한 조건하에서 각종 제한효소로 분해시킨다. 이 DNA를 페놀과 추출시키고, 에탄올로 침전시킨 다음 겔부하 완충액(15% 피콜, 0.025% 브로모페놀블루, 10mM EDTA, pH8)에 재현탁시킨다. 시료를 부가하여 브로모페놀블루 염료가 겔 끝까지 도달할 때까지 0.5% 아가로스 겔상의 5V/cm에서 전기영동시킨다. 이 DNA를 공급자가 기술한 바와 같이 알칼리성 전달 과정을 이용하여 Gene-Screen Plus(듀퐁사제)에 옮긴다. 제조자의 추천에 따라 예비적 헥산잡종 분자형성, 헥산 잡종분자 형성 및 세척을 실시한다. 헥산잡종분자형성은 방사선 사진에 의해 알 수 있다.
[실시예 4] 어댑터분자
전형적인 어댑터 분자는 Pst I 부위를 BamHI 부위로 전환하는 5'-GGGATCCTGCA-3' 서열이다. 이 분자는 B-시아노에틸포스포르아미디트 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템 신테사이저(Applied Biosystems Synthesizer)상에서 합성되고 역상 HPLC에 의하여 정제된다. 이 올리고뉴클레오티드 약 2㎍을 마니아티스 일행(상기 동일, 125페이지)에 따라서 활성화시킨다. 이 올리고뉴클레오티드 용액을 물 중탕기에서 65℃로 가열시키고 또 약 30분간에 걸쳐 실온으로 냉각시킨다. 재생된 어댑터 약 10배몰량은 분해된 DNA에 10배 농도 리가제 완충액, T4 DNA 리가제 및 적당량의 물과 함께 부가된다. 전형적으로 반응액은 하기를 포함한다:
연결될 DNA : 1 내지 2㎕ (~1 pmol)
어댑터 : 1㎕ (~10 pmol)
10배 농도의 리가제 완충액 : 1㎕
T4 DNA 라가제 : 1㎕
물 : 5 내지 6㎕
이 용액을 12 내지 15℃ 에서 30분간 배양하고, 또 30분간 65℃로 가열시켜 리가제를 불활성화 시킨다. 적합한 제한 효소 분해를 위해 염농도 및 부피를 조절하고 또 어댑터가 삽입된 DNA를 분해시켜 적합한 점착말단을 노출시킨다. 삽입되지 않은 어댑터는 아가로스 겔상에서 전기 영동에 의하여 또는 순차적인 이소프로판을 석출법에 의하여 제거한다.
[실시예 5] 프라이머 신장 멥핑(결정법)
A. 프라이머 신장하기 위한 프라이머의 합성 및 5' 말단 표지
어플라이드 바이오시스템 신테사이저 및 β-시아노에틸포스포르아미디트 화학을 이용하여 하기 프라이머 올리고머를 합성한다:
PR-1 : 5'-ATAGTCTTGTTGAGAGTT-3'
GUS : 5'-TCACGGGTTGGGGTTTCTAC-3'
AHAS : 5'-AGGAGATGGTTTGGTGGA-3'
BT : 5'-ATACGTTCTACTATCATAGT-3'
역상고압 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하여 올리고뉴클레오티드륨 정제한다.32P-ATP 200μC(6000Cl/mmol, 10μCl/㎕)를 사용하여 올리고 5pmol을 활성화시킨다(마니아티스, 티이 일행, 상기와 동일, 125페이지). 37℃에서 30분간 배양한 후, 이 반응물을 100㎕로 희석시키고, 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 50㎍의 운반 RNA로 3회 침전시킨다. 최종 침전물은 1X 역전사효소 완충액(50mM 트리스-HCl, pH7.5, 40mM KCl, 3mM MgCl2)에 2nM 농도로 제현탁시킨다. 표지된 올리고뉴클레오티드의 특이 활성은 약 3×106Cvcpm/pmol로 측정된다.
B. 전체 RNA 제조
라그리미니, 엘. 엠 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7542(1987)에 의하여 기술된 바와 같이 하여 전체 RNA를 제조한다. 조직을 절구와 막자내, 엑체 질소하에서 분쇄한다. 분쇄된 조직을 g조직당 2.5ml를 사용되는 분쇄 완충액(라그리미니 일행, 상기동일)에 부가한다. 동부피의 페놀을 부가한 다음 유제를 브린크만(Brinkman)폴리트론에서 균질화시킨다. 1/2 부피의 클로로포름을 부가하고 이 유제를 15분간 천천히 혼합한다. 원심분리에 의하여 상을 분리하고 수성상을 제거한다. 0.3M 까지의 아세트산 나트륨 및 2.5 부피의 에탄올을 부가하는 것에 의하여 RNA를 석출시킨다. 원심분리에 의하여 침전물을 수거하고 또 멸균수 2ml에 재현탁시킨다. 염화리튬을 최종농도 3M까지 부가하고 또 4℃에서 하룻밤 동안 방치한다. 원심분리에 의하여 침전물을 수거하고 펠릿을 얼음으로 차게된 80% 에탄올을 세척한다. 이 펠릿을 건조시키고 500㎕ 멸균수에 재현탁시킨다. 이 전체 RNA 조제물의 농도는 분광광도 측정법으로 측정된다. 이와달리 켈러스 조직을 약 3mm 크기의 입방체로 절단하고 예비 냉각된 절구와 막자에 부가하여 폴리트론 단계전에 액체 질소에서 분쇄하는 것을 제외하고는 상기와 동일하게 켈러스로 부터 RAN를 추출한다.
C. 프라이머 신장
전체 RNA 50㎍을 500㎕ 에펜도르프관에서 동결 건조시킨다. 이 RNA를 방사선 표지된 프로브(probe)용액 30㎕에 재현탁시키고 또 70℃로 10분간 가열시킨다. 이 관을 서서히 37℃로 냉각시키고 또 하룻밤동안 배양한다. 37℃ 물중탕기로부터 관을 빼지 않고 10배 농도의 역전사효소 완충액(500mM 트리스-HCl, pH7.5, 400mM KCl, 30mM MgCl2) 2㎕, 5mg/ml 소혈정 알부민 1㎕, 100mM 디티오트레이톨 5㎕, 10배 농도의 dNTPs(물에 용해된 10mM의 각 dNTP) 5㎕, H2O 3㎕, RNasin(80단위) 2㎕ 및 역전사효소(400단위) 2㎕를 부가하고 37℃에서 30분간 배양한다. 반응을 중지시키기 위하여, 3M 아세트산 나트륨(pH5) 5㎕, 및 무수에탄올 150㎕를 부가한다. 이 관을 -20℃에서 30분간 방치하고, 원심분리에 의하여 침전물을 수거하고, 80% 에탄올로 세척하며 또 공기건조시킨다. 침전물을 부하염료(90% 포름아미드, 0.05% 블로모페놀블루, 0.05% 크실렌 시아놀, 1mM EDTA) 10 내지 20㎕에 재현탁시키고 또 신장 산물을 6% 염기서열화겔(sequencinggel)(마니아티스, 티이 일행, 상기와 동일)상에서 분리해낸다. 신장 산물은 방사선 사진에 의하여 확인된다.
[실시예 6] S1 뉴클레아제 맵핑
플라스미드 pBS-PR1013Cla를 SfaNI으로 분해하고, 송아지 장포스파타제로 탈인산시키고 또32P-ATP로 활성화시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전처리한 다음 DNA를 BstEII으로 분해하고 겔화온도가 낮은 아가로스겔 상에서 전기 영동시킨후 제 1 도의 750 내지 1035로 부터 유래된 300bp 단편을 분리해낸다. 프로브를 포름아미드 헥산 잡종분자형성 완충액(베크, 에이.제이 일행, Cell 12, 721(1977))에 약 2nM 농도로 재현탁시킨다. 프로브의 특이 활성은 약 5×10Cvcpm/pmol이다.
동결건조된 전체 RNA(50㎍)를 30㎕의 프로브 용액에 용해시키고, 또 이관을 65℃에서 10분간 가열시킨 다음 48℃에서 하룻밤동안 잡종 처리시킨다. S1 뉴클레아제 처리 및 겔 전기영동은 400단위/ml의 S1 농도 및 30℃의 배양온도를 이용하여 상기 기술된 바와 같이 실행한다.
적합한 S1 뉴클레아제 농도는 파일럿 실험에서 기재된 바와 같다.
[실시예 7] 전사개시 부위의 결정
PR-1a 유전자의 전사개시 부위는 S1 뉴클레아제 맵핑법 및 프라이머 신장법을 조합하여 측정할 수 있다. TMV로 감염된 잎으로부터 분리된 RNA 또는 XhoI-PstI 단편의 mp19 서브클론을 주형으로 사용하고 또 PR-1a 서얼의 1025 내지 1042 위치와 상보직인 17염기 올리고뉴클레오티드를 특이 프라이머로 사용한 프라이머 신장실험의 방사선 자기사진을 조사한다. 프라이머 자체는 5' 인산에 표지되어 있으므로 신장 산물의 크기는 염기서열화하는 레인에서의 상응하는 밴드의 크기와 동일할 것이다. 게놈 클론의 902 및 903 부위에 상응하는 2개의 강한 밴드 및 901 위치에서의 약한 밴드의 출현은 이들 위치에서 전사가 개시함을 나타낸다. 그러나 프라이머 신장 분석만으로는 mRNA의 5' 말단을 확인하는데 사용될 수 없다. 예를들어 mRNA는 상류로부터 접합된 5' 말단을 함유할 수 있다.
5' 말단을 확실하게 결정하기 위해서는 프라이머 신장법과 함께 분석력이 뛰어난 S1 뉴클레아제 맵핑법을 이용한다. SfaNI 단편을 5' 말단에 표지시키고 또 BstEII로 분해시켜 759 내지 1040 위치까지 신장된 가닥 특이 프로브를 수득한다. 이 프로브는 TMV로 감염된 담배 잎으로부터 분리된 RNA에서 PR-1a 전사물의 5' 말단을 맵핑하는데 사용된다. 게놈 클론의 901 내지 905 위치에 상응하는 137±2 염기의 주 밴드를 수득한다. 분석력이 높은 S1 실험에서, 분해산물은 프로브상에서 실행된 크기 기준 염기 서열 결정반응과 함께 전기 영동되어 901, 902 및 903 위치에 상응하는 3개의 밴드가 나타난다. 이들 결과는 프라이머 신장 분석을 확인시켜주며 PR-1 mRNA의 5' 말단은 901, 902 또는 903 위치에 존재한다. 전사개시에 관하여, 이들 결과의 가능한 해석은 RNA 폴리머라제가 901, 902 또는 903 염기중 어느 하나에서 거의 동일한 확률로 전사를 개시한다는 것이다. 그러나, 진핵생물의 전사는 A에서의 개시를 선호하므로, 분명한 다중 5' 말단에 대한 설명은 PR-1a mRNA가 903 위치(A)에서 개시되고 또 PR-1b 및 -1c mRNAs는 상응하는 유전자상의 다른 위치중의 어느 하나에서 개시된다는 것이다.
2. 단백질 확인 및 특징화
화학적으로 유도가능한 유전자의 정의와 일치하도록 문헌에 기재된 방법에 따라, 어떤 경우에는 최초로 이들 실시예에 관여하는 PR 단백질을 분리, 정제 및 서열화시킨다.
[실시예 8] PR-1a 및 PR-1b 단백질의 정제
담배(Nicotiana tobaccum : 크산티(Xanthi)품종) 식물을 온실에서 재배하고 또 8주령이 되면 TMV의 보통주(UI)의 현탁액(0.5㎍/ml)과 잎을 부드럽게 문지려는 것에 의하여 감염시킨다. 감염된지 7일 후 잎을 모으고 또 세포내액(ICF)을 잎으로부터 씻어내어 파렌트, 제이. 지이 일행, Can. J. Bot, 62, 564(1984)에 따라서 수거한다. ICF 250ml를 동결건조에 의하여 50ml로 농축시키고 또 트리스-HCl, pH8.0 및 1mM EDTA와 평형을 이룬 울트라겔(Ultra gel) ACA 54 칼럼상에 부하한다. 용출액을 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기 영동에 의하여 분석한다. PR-1 단백질을 함유하는 분획을 모으고, 동결건조시키며, 3ml물에 재혀ㅌ낙시키고 또 물에 대하여 하룻밤 동안 투석시킨다. 이 조제물을 TSK-DEAE 5PN 칼럼상에서 HPLC 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제한다. 이 칼럼을 50mM 트리스-HCl, pH8.0, 1mM EDTA 내의 0 내지 0.6M NaCl 구배로 용출시킨다. 분획들을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의하여 분석한다. PR-1b는 0.18M NaCl에서 칼럼으로부터 제일먼저 용출되고 또 PR-1a는 0.28M NaCl에서 용출된다. 각 당백질을 함유하는 분획을 모으고, 물에 대하여 투석시키고 또 동결건조시킨다. 이 PR-1a 및 PR-1b 단백질 조제물의 순도는 아쿠아포어 페닐 칼럼(2.1×100mm, 브라운리)을 사용하며 또 0.1% TFA 내의 일정한 아세토니트릴/이소프로판올(1 : 1) 구배(5 내지 80%)로 용출시키는 역상 HPLC에 의하여 측정한다.
[실시예 9] 단백질 서열 결정
정제되고 동결건조된 PR-1a 단백질을 1M 트리스-HCl, pH 8.6, 10mM EDTA를 함유하는 6M 구아니딘-HCl에 용해시킨다. 디티올트레이틀을 20mM까지 부가하고 또 4-비닐 피리딘을 최종 농도 50mM까지 부가한다. 시료를 질소하에서 1.5시간 동안 배양한다. 피리딜 에틸화된 원료는 아쿠아포어 페닐칼럼(2.1×10cm, 브라운리)을 사용하여 HPLC상에서 탈염된다. 칼럼은 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)내의 일정한 5 내지 80% 구배 아세토니트릴/이소프로판올(1 : 1)로 용출시킨다.
어플라이드 바이오시스템 470A 가스상 서열결정기로써 자동화된 에드만(Edman) 분해를 실행한다. 페닐티오히단토인(PTH)아미노산은 어플라이드 바이오시스템 120A PTH 분석기로써 확인된다.
브롭화시아노겐 절단은 심프슨, 알. 제이. 일행, Biochem. Intl. 8, 787(1984)에 의하여 그 자리에서 실행된다. 피로글루타메이트 아미노텝티다제(베링거 만하임제)로써 PR-1의 분해는 알렌, 지이, Plant Sci, Lett. 26, 173(1982)에 따라서 실행된다.
PR-1a는 1 : 10의 효소와 기질 비율을 사용하여 실온에서 0.1M 트리스-HCl, pH8.5 내의 엔도프로테이나제 Lys-C (베링거 만하임제)로써 24시간 동안 분해된다. 0.1% TFA에서 아세토니트릴/이소프로판올(1 : 1)의 일정한 구배(0 내지 60%)에 의하여 아쿠아포어 C-8 칼럼(1×22cm, 브라운리)을 사용하는 HPLC에 의하여 펩티드를 분리한다.
N-말단 Lys-C 펩티드를 트립신(쿠퍼사제)으로 분해하는 것은 0.1M 염화칼슘을 함유하는 0.1M 중탄산 암모늄, pH8.2 내에서 1 : 100의 기질에 대한 효소 비율을 사용하여 37℃에서 5시간 동안 실행한다. 생성한 2개의 펩티드는 Lys-C 펩티드에서처럼 동일한 조건을 사용하여 HPLC상에서 분리한다.
[실시예 10] PR-1a 펩티드의 단백질 서열
3개의 cDNA 클론의 DNA 서열과 PR-1a, PR-1b 및 PR-1c 단백질의 상호관계는 PR-1a(루카스, 제이 일행, EMBO J. 4, 2745(1985))로부터 유도된 3개 펩티드의 공지된 단백질 서열 데이터와 cDNA 클론으로부터 추정된 단백질의 1차 구조를 비교하는 것을 기본으로 한 코르넬리센, 비이. 제이. 씨이. 일행에 의하여 처음으로 밝혀졌다. 그러나 PR-1a로 표시된 cDNA 클론은 5' 말단에서 잘려져 3개 펩티드중 1개 잔기가 잘못 짝지어진 2개 펩티드와 비교될 수 잇다. 상기와 같이 제조되고 분석된 cDNA 및 피츠너, 유. 엠 일행 (상기참조)에 의한 PR-1a cDNA 서열로부터 추정되는 코드된 아미노산 서열은 보고된 바와 같이 트립토판 부위에서 공지된 단백질 서열과 맞지 않을 뿐 아니라 아미노 말단 단백질 서열의 기타 3개 위치에서도 맞지 않는다. 이러한 이상은 이 클론을 PR-1a로 확인하게 한다. 그러므로 tohchrPR1013 클론의 PR-1a 유전자로서의 확인은 정제된 PR-1a 단백질의 1차 구조의 대부분을 아미노산 서열결정에 의하여 측정하는 것에 의해 확인된다.
PR-1a 단백질에 대한 아미노산 서열 데이터는 PR-1a, PR-1b 및 PR-1c에 대한 cDNA 클론으로부터 추정되는 아미노산 서열과 비교된다. 본 분석에 사용된 cDNA 서열 데이터는 상기 분리된 cDNA 클론 및 피츠너, 유. 엠 일행(상기동일)으로부터 분리된 서열로부터 유래하며, 모든 위치에서 일치한다. 성숙 PR-1a 단백질 서열의 80% 이상이 결정되며 이 서열은 tobchrPR1013에 대하여 추정된 단백질 서열과 일치한다. 임의의 PR-1b 및 PR-1c cDNA 클론(코르넬리센, 비이. 제이. 씨이, 일행, 상기동일)으로부터 유도된 추정 아미노산 서열과 비교하면, 각각 7개 및 6개가 일치하지 않는다. 따라서, 이러한 증거는 tobchrPR1013이 PR-1a 유전자의 클론이라는 것을 분명히 나타낸다.
3. 클론의 제조
이 그룹의 실시예는 유전자를 분리하고 또 화학적으로 조절가능한 서열 및 이들 서열을 함유하는 키메라 유전자를 확인함으로써 제조한 클론을 설명한다.
[실시예 11] tobchrPR1013의 제조
조직 35g을 액체 질소에서 냉동시키고 또 절구와 막자로 미세분말로 분쇄시키는 것에 의하여 담배(Nicotiana tabaccum)의 잎으로부터 헥을 분리한다. 이 분말을 분쇄 완충액(0.3M 자당, 50mM 트리스, pH8, 5mM 염화마그네슘, 5mM 중 아황산나트륨, 0.5% NP40) 250ml에 부가하고 얼음상에서 10분간 교반한다. 이 혼합물을 6층의 무명을 통하여 여과하고 액체를 원심분리병에 옮기고 700xg에서 10분간 원심분리 시킨다. 펠릿을 분쇄 완충액에 재현탁시키고 또 재원심 분리한다. 펠릿을 다시 분쇄 완충액에 재현탁시키고 또 재원심 분리한다. 펠릿을 다시 분쇄 완충액에 재현탁시키고 또 이 현탁액을, 10mM 트리스, pH 8, 1.5mM 염화마그네슘, 140mM 염화나트륨, 24% 자당, 1% NP40을 함유하는 20ml의 냉자당 쿠션위로 층을 이루게 한다. 이들 관을 17,000xg에서 10분간 원심분리 시킨다. 이 단계에서의 펠릿은 보통 헥과 녹말 과립을 함유한다. 고분자량 DNA는 마니아티스, 티이 일행(상기와 동일)에 따라서 헥으로부터 분리된다. 이 DNA를 Mbo I으로 부분적으로 분해시키고 또 EMBL3 클로닝 벡터의 Bam HI 부위에 결찰시킨다. 표지된 PR-1b cDNA 프로브로 약 300,000개의 플라크가 스크리닝된다. 50개의 양성 클론이 분리 및 확인된다. 양성 플라크를 정제하고 또 제한효소 분석에 의하여 특징이 확인된다. 이들 클론은 제한효소 맵핑에 의하여 8개의 그룹으로 분류된다. 클론중의 1개는 tobchrPR1013으로 확인된다. tobchrPR1013의 부분적 제한효소지도를 제 1 도에 나타낸다. DNA의 분리 및 DNA 조작은 주로 마니아티스, 티이 일행(상기와 동일)에 의하여 서술된 바와 같다.
[실시예 12] pBS-PR1013Cla의 제조
클론 tobchrPR1013의 ClaI 단편을 블루스크립트 플라스미드(Stratagene Cloning Systems)에 서브클론하면 pBS-PR1013Cla(제 2 도 참조)를 생성한다. pBS-PR1013Cla으로 부터 2kb XhoI-Bgl II 단편을 염기결정하고 또 913 내지 1711위치(서열 1)가 피츠니, 유. 엠 일행(상기 동일)에 의하여 분리된 PR-1a에 대한 cDNA 클론의 서열과 완전히 일치하는 것을 발견하였다. 클로닝 과정동안 담배 DNA의 가능한 유전자 재편성은 게놈 DNA의 예견된 제한 단편을 분석하는 것에 의하여 결정된다. pBS-PR1013Cla의 서열 정보 및 제한효소지도를 기준하여 ExoRI, HindIII, XhoI+BqIII, 또는 Hind III+Pst I으로 담배의 게놈 DNA의 분해는 PR-1a 유전자를 함유하는 3.2kb, 6.7kb, 2.0kb 또는 6.4kb의 단편을 발생시켜야 한다. 이 예견을 시험하기 위해, 3㎍의 담배 염색체 DNA를 적합한 효소로 분해시키고 또 0.7% 아가로스 겔상에서 전기영동시킨다. 이 DNA를 나일론막에 전달하고 또 PR-1a 유전자로부터의 표지된 Xho I-BstEII 제한단편으로 프로브 처리시킨다. 대조를 위해, pBS-PR1013Cla DNA를 분해하고 동일한 겔상에서 전기 영동시킨다. 예견된 바와 같이 EcoRI, HindIII, XhoI+BqIII 및 HindIII+PstI 분해물은 대조용 밴드와 함께 이동하는 예상 분자량의 밴드를 만든다. 그러므로 tobchrPR1013 클론에 함유된 DNA는 담배 게놈에서 연속적인 DNA 조각을 나타낸다.
[실시예 13] pBS-PR1013Eco의 제조
A. tobchrPR1013(실시예 9)로부터 유래하는 PR-1a 유전자를 함유하는 3.6 kb의 EcoRI 단편을 블루스크립트 플라스미드의 특징적인 EcoRI 부위에 서브클로닝시켜 플라스미드 pBS-PR 1013 Eco를 작성한다. 블루스크립트 플라스미드 (카탈로그 번호 21203)는 캘리포니아, 리졸라에 소재하는 스트라타진 클로닝 시스템으로부터 구입할 수 있다. pBS-PR1013Eco의 구조는 제한 효소 맵핑 및 DNA서열 결정법 모두에 의하여 확인된다. 이 플라스미드의 구조는 제 3 도에 나타내어져 있다.
B. 이와 다르게 플라스미드 pBS-PR1013Cla를 EcoRI으로 분해시키고 PR-1a 유전자를 함유하는 3.6kb의 단편을 분리한다. pBluescript 를 EcoRI으로 분해시키고, 앞서 분리된 3.6kb의 EcoRI 단편과 혼합하고 또 결찰시킨다. 이 플라스미드의 구조는 제 4 도에 나타낸다.
[실시예 14] pBS-PR1013Eco △Pst의 제조
플라스미드 pBS-PR1013Bco를 PstI으로 분해시키고 또 겔화온도가 낮은 2.5% 아가로스 겔상에서 DNA 단편을 분리시킨다. 블루스크립트 벡터를 함유하는 큰 단편 및 담배 DNA의 3.0kb 단편을 엄밀하게 절단해 내고 또 65℃로 가열하여 아가로스를 용융시킨다. 2㎕를 물 15㎕에 부가하고 이 DNA를 실시예 1에서 기술한 바와 같이 아가로스에서 결찰시킨다. 하룻밤동안 배양한 후 DNA를 함유하는 아가로스는 65℃에서 10분간 배양하는 것에 의하여 용융되며 또 실시예 2에서 기술한 바와 같이 아가로스로부터 형질전환된다. 6개의 임의의 양성 구조로부터 유래하는 세균성 배양물의 일부를 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 5ml LB(밀러, 상기동일) 배지에 접종시키며, 또 이 배양액을 37℃에서 하룻밤동안 배양한다. 임상 원심분리기에서 충분한 속도로 10분간 원심분리하는 것에 의하여 세포를 모은다. 상청액을 제거하고 세포를 50mM 글루코스, 25mM 트리스, pu 7.5, 10mM EDTA의 100㎕에 재현탁하고, 이 현탁액을 1.5ml 에펜도르프 원심분리관으로 옮긴다. 새로이 제조된 10mg/ml 리소짐 용액의 25㎕를 부가하고 이 현탁액을 얼음상에서 10분간 방치한다. 0.2 N 수산화나트륨, 1% 나트륨도데실 술페이트 200㎕를 부가하고 이 현탁액을 혼합하고 또 얼음상에서 2분동안 방치한다. 2M 아세트산 나트륨 (pH 4.8) 200㎕를 부가하고 또 이 용액을 얼음상에서 15분간 방치한다. 생성한 용액을 에펜도르프관에서 충분한 속도로 10분간 원심분리시킨다. 상청액을 새로운 원심분리관으로 옮기고 400㎕ 페놀/클로로포름(1 : 1)으로 추출한다. 수성상을 새로운 관으로 옮기고 또 400㎕ 클로로포름으로 추출한다. 이 추출액으로부터 수성상을 새로운 관으로 옮기고 2배 부피의 에탄올을 부가하는 것에 의하여 DNA를 석출시켜 -20℃에서 30분간 보관한다. 에펜도르프관에서 충분한 속도로 15분간 원심분리하는 것에 의하여 석출된 DNA를 수거한다. 데탄올을 제거하고 또 펠릿을 80% 에탄올로 세척한다. 에탄올을 다시 제거하고 펠릿을 공기건조시킨다. DNA를 TE 완충액 100㎕에 재현탁시킨다. PstI으로 분해시키는 것에 의하여 구조를 확인한다. 어버이 플라스미드 pBS-PR1013Eco는 6kb 및 650bp 밴드를 수득하고, 이들의 작은 것은 새로운 구조에서 없어진다. 이들 플라스미드 중의 하나는 플라스미드 pBS-PR1013Eco △Pst 로 선별된다. 이 서브클론의 구조는 서열결정 분석법에 의하여 확인된다. 이 플라스미드의 구조는 제 5 도에 나타낸다.
[실시예 15] pBS-PR1013Eco △Pst △Xho의 제조
pBS-PR1013Eco의 주요 제한효소지도는 확립되어 있다. XhoI 제한효소 부위는 Pst 부위의 상류쪽 ~1200bp에 위치한다. 플라스미드 pBS-PR1013Eco △Pst를 XhoI 으로 분해시키고 그 단편을 겔화온도가 낮은 0.9% 아가로스겔 상에서 분리시킨다. 2개 단편은 3.9kb 및 1.7kb 크기로 나타난다. 3.9kb의 단편을 함유하는 밴드를 조심스럽게 겔로부터 잘라내어 상기 기술한 바와 같이 아가로스에서 결찰시킨다. 아가로스가 용융되고 또 DNA는 상기 기술한 바와 같이 대장균 수용 HB 101 주로 형질전환된다. 세포를 LB-amp 평판에 선조 접종하고 상기와 같이 배양된다. 임의의 양성 클로니 1개를 LB-amp 배지에 접종시키고 상기 기술한 바와 같이 DNA를 분리한다. 이 새로운 서브클론 pBS-PR1013 Eco △Pst △Xho의 구조는 제한효소 분석법 및 DNA 서열결정법에 의하여 확인된다. 제 6 도는 이 플라스미드 구조를 나타낸다.
[실시예 16] pCIB270의 제조
플라스미드 pBI101.3(카탈로그 번호 6024.1)은 캘리포니아 팔로 알토에 소재하는 클로내테크 랩스로부터 구입할 수 있다. 이 플라스미드를 BamHI으로 분해시키고 또 이어 SalI으로 분해시킨다. 플라스미드 pBS-PR1013Eco △Pst △Xho를 PstI으로 분해시킨다. 5'-GGGATCCCTGCA-3'의 서열을 갖는 PstI/BamHI 어댑터는 실시예 4에 기술된 바와 같이 제조하며 또 PstI으로 분해된 pBS-PR1013Eco △Pst △Xho에 결찰시킨다. 생성한 물질을 먼저 BamHI으로 분해하고 또 이어 XhoI으로 분해시킨다. BamHI/XhoI 단편을 분리하고 또 분해된 pCI101.3과 혼합 및 결착시키며 또 형질전환시킨다. pCIB 270의 임의의 양성클론을 분리하고 또 제한 분석 및 DNA 서열 결정분석법에 의하여 확인한다. 이 플라스미드의 제조는 제 7 도에 나타낸다.
[실시예 17] M13mp18-또는 mp 19-PR1013Eco △Pst △Xho의 제조
플라스미드 pBS-PR1013Eco △Pst △Xho를 PstI 및 Asp718으로 분해한다. 겔화온도가 낮은 1% TAE 아가로스겔 상에 전기 영동시킨후 1.1kb의 Asp718//Pst I 단편을 분리한다. 메싱, 제이, Meth, Enzymol, 101, 20(1983)에 따라 대장균 M13mp18 또는 M13mp19 파아지의 복재형(RP)을 제조한다. 이와 다르게는 이들 벡터는 메릴랜드 게이테르스버그에 소재하는 베세스다 리서치 랩스로부터 구입할 수 있다. 이 벡터를 먼저 Asp 718로 이어 PstI으로 분해한다. 겔화온도가 낮은 0.7% TAE 아가로스상에서 전기영동시켜 폴리링커 조각을 제거한 후, 생성한 벡터 RF를 혼합하고 또 상기 제조된 1.1kb 의 단편과 아가로스에서 결찰시킨다. 이 DNA는 형질전환되며, 임의의 양성 플라크를 분리하고 또 그의 구조는 RF DNA의 분석에 의하여 확인된다. M13mp18- 또는 mp 19-PR1013Eco △Pst △Xho의 구조는 제 8 도에 나타낸다.
[실시예 18] M13mp18- 또는 mp 19-PR1013Eco △Pst △Xho. Nco 및 pCIB 268의 제조
매싱(상기와 동일함)에 따라서 1가닥 M13mp18-PR1013Eco △Pst △Xho 파아지 DNA를 분리한다. 5'-AATCCCATGGCTATAGGA-3' 서열의 18bp 올리고뉴클래오티드 프라이머를 상기 기술한 바와 같이 합성한다.
프라이머는 표지되지 않은 ATP를 사용하여 T4 폴리뉴클래오티드 키나제(마니아티스, 티이 일행, 상기 동일, 125 페이지)로써 인산화된다. 37℃에서 60분간 배양한 후 반응을 65℃로 15분간 가열시킨 다음 얼음에 둔다. 68℃에서 10분간 가열시킨후 서서히 냉각시키는 것에 의하여, 프라이머 및 M13-40 진행 서열결정 프라이머(뉴 잉글랜드 바이오랩 H1212)를 1가닥 M13mp18-PR1013Eco △Pst △Xho DNA와 1 : 1 : 1 몰 비율로 혼합한 후 잡종 형성 시킨다. 잡종처리된 혼합물을 얼음에 놓고 또 1/10부피의 10배의 신장 완충액 (20mM 트리스 완충액 pH 7.5, 6mM MgCl2, 1mM DTT, 1mM dATP, 1mM dCTP, 1mM dGTP, 및 1mM dTTP)를 부가한다. DNA 폴리머라제 I 대형단편(클래노단편, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 H 210) 10단위 및 T4 DNA 리가제(NEB H 202) 0.1 단위를 부가하고 반응액을 15℃에서 14시간 동안 진행시킨다. 이 경우 효소는 나누어서 부가되며 혼합물이 수용성 대장균 JM101를 형질 전환시키기 위해 사용되기 전에 반응을 25℃에서 추가로 2시간 동안 실행한다. 이 과정의 일반적인 흐름 설명도는 제 9 도에 나타낸다.
돌연변이된 파아지를 구별하기 위하여, 플라크를 진 스크린 플러스(Gene Screen Plus : 듀퐁사재)에 놓고 제조자가 지시한 대로 처리한다. 필터를 4시간 동안 예비잡종 처리시키고 또 0.9M NaCl을 함유하는 제조자가 지시한 잡종형성 용액내, 42℃에서 하룻밤동안 잡종 처리시킨다. 0.9M 농도의 NaCl로 필터를 세척하고 또 세척 단계의 온도를 5℃씩 증가시키면서 방사선 사진으로 모니터한다. 잡종 형성법으로 돌연변이된 것으로 확인된 파아지를 서열결정시켜 염기변화를 확인하다.
이러한 M13mp18-PR1013Eco △Pst △Xho.Nco의 복제형을 분리하고 PstI 및 BstEII로 분해시켜 제 10도에 설명된 바와 같이 pBS-PR1013Eco △Pst △Xho에서 상응하는 비돌연변이된 394hp 단편을 대체하기 위해 사용되는 394hp 단편을 제조한다. 그 결과 217bp의 PR-1a 유전자에 대한 코딩 서열에 이어 위치 930에서 NcoI 단편을 갖는 pCIB 268을 제조한다. 이 플라스미드의 구조는 서열결정 분석법에 의해 확인된다.
[실시예 19] GUS 및 PR프로모터 서열의 가변영역을 함유하는 키메라 유전자의 제조
A. pCIB 269의 작성
XhoI 및 NcoI으로 분해된 pCIB 268을 겔화온도가 낮은 1.0% 아가로스 TAE겔 상에서 전기영동시킨 후 930bp의 단편을 분리한다. 이 단편을 XhoI 및 NcoI으로 분해된 pBS-GUS 1.2(실시예 19B 참조)에 결찰시킨다. 형질전환체를 분리하고 또 제한효소 분석법 및 DNA서열 결정법으로 분석한다. 양성 플라스미드 1개를 선별하고 pCIB269로 명명한다. 이 플라스미드의 작성은 제 11 도에 나타낸다.
B. pBS-GUS 1.2의 작성
pRAJ 265(제퍼선, 알. 에이 일행, EMBO J. 6, 3091-3907(1987) 및 캘리포니아 팔로알토, 클로내테크랩스의 GUS User Manal)의 SalI/SnabI 단편 391bp, pBI221(제퍼선, 알. 제이 일행, EmBO J. 상기동일)로부터 유래하는 SnabI/EcoRI 단편 1707bp 및 SalI 및 EcoRI으로 분해된 pBS의 3부분을 결찰시켜 pBS-GUS 1.2를 만든다(제 12 도 참조). 형질전환체를 분리하고 또 제한 효소 분해 및 DNA 서열 결정법에 의하여 분석한다. 확인된 1개 클론을 pBS-GUS 1.2으로 명명한다.
C. pCIB 200의 작성
NptI 유전자를 갖는 pUC4K(메싱, 제이. 및 베에라, 제이, Gene 19, 259-268(1982))로 부터 유래하는 AccI 단편을 삽입한 후 pTJS 75(슈미트호이저 및 헬런스키, J. Bacteriol. 164, 446-455(1985))를 NarI으로 분해시켜 테트라시클린 유전자를 절단해 내는 것에 의하여 TJS 75 Kan을 제조한다. XhoI 링커를 pCIB 7(오른쪽 및 왼쪽 T-DNA 경계, 식물 선별성 nox/nptII 키메라 유전자 및 pUC 폴리링커(로드슈타인, 에스. 제이, 일행, Gene 53, 153-161(1987)함유)으로부터의 EcoRV 단편에 결찰시키고 또 XhoI으로 분해된 단편을 SalI으로 분해된 TJS75Kan에 클로닝하는 것에 의하여 pCIB200을 제조한다.
D. pCIB 271의 작성
플라스미드 pCIB 269(실시예 19A)를 XhoI 및 EcoRI 으로 분해하고 nos 3' 말단을 갖는 GUS 유전자에 연결된 PR-1a 프로모터를 갖는 3023 단편을 겔화온도가 낮은 1.0% TAE 겔상에서 전기 영동에 의하여 분리해낸다. 이 단편을 SalI 및 EcoRI으로 분해된 넓은 숙주 범위의 벡터 pCIB 200에 결찰시킨다. 형질전환체를 분리하고 또 제한효소 분석법으로 분석한다. 확인된 1개 클론을 pCIB 271로 명명한다. 이 클론의 구조를 제 13 도에 나타낸다.
E. pCIB 272의 작성
pCIB268(실시예 18) 을 AluI 및 NcoI으로 분해하고 1× TAE 0.7% 아가로스겔상에 전기 영동시킨후 833 bp의 단편을 분리한다. 이 단편을 pBS-GUS 1.2(실시예 19B) 내에 있는 nos 3' 말단을 갖는 β-글루쿠로니다제 유전자에 결찰시킨다. 프로모터 및 GUS는 pCIB282 플라스미드로부터 Asp718I/BamHI 단편으로 절단되며 또 대장균 DH5α 주로 형질전환 되기 전에 Asp 718I 및 BamHI으로 분해된 pCIB200에 결찰된다. 형질전환체를 분리하고 또 제한분석법에 의하여 분석한다. 확인된 1개 클론을 pCIB 272로 명명한다.
F. pCIB273의 작성
pCIB268을 HaeIII 및 NcoI으로 분해하고 IXTAE 0.7% 아가로스겔상에서 전기 영동시킨 후 603 bp의 단편을 분리한다. 이 단편을 pBS-GUS 1.2에서 nos 3' 말단을 갖는 β-글루쿠로니다제 유전자 앞에 위치시킨다. 이 프로모터 및 GUS는 pCIB 283 플라스미드로부터 Asp718I/BamHI 단편으로서 절단되고 또 대장균 DH5α주로 형질 전환되기 전에 Asp718I 및 BamHI으로 분해된 pCIB 200에 결찰된다. 형질전환체를 분리하고 또 제한 분석법에 의하여 분석한다. 확인된 1개 클론을 pCIB273으로 명명한다.
[실시예 20] 히그로마이신 벡터에서 키메라 유전자의 제조
pCIB 269를 XhoI 및 EcoRI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 1.0% 아가로스 TAE겔 상에서 전기영동시켜 nos 3' 말단을 갖는 GUS 유전자에 연결된 PR-1a 유전자를 갖는 3023bp 단편을 분리한다. 이 단편은 5'-AATTCGTCGACG-3' 서열을 갖는 EcoRI/SalI으로 결착시키는 것에 의하여 XhoI/SalI 단편으로 전환된다. XhoI/SalI 단편을 SalI으로 분해된 pCIB712 (로드슈타인, 에스, 제이 일행, 상기동일)에 결찰시켜 pCIB 219를 제조한다(제 14도 참조).
[실시예 21] pCIB200/PR1-BT의 제조
A. pCIB 200과의 결찰
플라스미드 pCIB1004(하기 참조)를 SphI으로 분해하고, 페놀 추출하며, 에탄올로 석출시키고 또 재현탁시킨다. 5'-CCGGTACCGGCATG-3' 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성, 정제, 활성화시키고 또 SphI으로 분해된 플라스미드 pCIB1004에 결찰시킨다. 결찰시킨후, 리가제를 불활성화 시키고 또 이 DNA를 KpnI으로 분해한다. 이 DNA를 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 200(실시예 19C)을 KpnI으로 분해하고 또 송아지장 알칼리성 포스파타제 처리한 다음 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리시킨다. pCIB200 벡터를 함유하는 벤드 및 PR-1 5' 측 서열/BT 융합물 함유하는 밴드를 혼합하고 이 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/PR1-BT를 형성한다.
B. pCIB1004의 제조
플라스미드 pCIB10/35Bt(607)를 NcoI 및 Bam HI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔에서 분리한다.
플라스미드 pCIB 269(실시예 19A)를 NcoI 및 XhoI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 710(로드슈타인, 에스. 제이 일행, 상기동일)을 SalI 및 BamHI츠로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8 아가로스겔 상에서 분해한다. CaMV 35S 프로모터 3' 말단을 함유하는 SalI 및 BamHI으로 분해된 벡터를 갖는 밴드를 pUC 19에 클론하고, BT유전자를 함유하는 밴드 및 PR-1 5'측 영역을 함유하는 밴드를 절단, 혼합하고 이 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pCIB1004를 형성한다.
C. pCIB10/35BT(607)의 제조
약 607 아미노산을 코드하는 서열을 함유하는 결실 프로톡신 유전자인 pCIB10/35Bt(607)은 바실러스 투린지엔시스 내부독소로부터 유래하는 프로톡신 유전자를 함유하는 플라스미드인 pCIB10/35Sbt으로부터 제조한다. pCIB10/35Sbt를 함유하는 대장균 MC1061은 1987년 2월 27일 어메리칸 타이프 컬쳐 콜렉숀에 기탁되었다(기탁번호 ATCC 67329). 결실 프로톡신 유전자는 BT 유전자 서열에서 뉴클레오티드 1976 뒤에 있는 BamHI 절단 부위(GGATCC)를 도입함으로써 제조된다. 이것은 pCIB10/35Sbt로부터 유래하는 프로톡신 서열을 함유하는 BamHI단편을 mp18으로 클로닝하고, 표준 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발과정을 이용함으로써 실행한다. 돌연변이후, 이중가닥의 복재형 DNA 를 M13 클론으로부터 제조하고, 이것을 BamHI으로 분해한다. 결실 프로톡신 유전자를 함유하는 약 1.9kh 단편을 BamHI으로 분해된 pCIB10/710으로 삽입한다. 생선한 플라스미드를 카나마이신 상에서 선별한다. 이 제조에 대한 상세한 기술은 1987년 11월 18일에 출원한 미합중국 특허원 122, 109호에 주어져 있고, 또 이것은 참고문헌으로 삽입되어 있다.
[실시예 22] pCIB1233(pCIB 200/PR1-AHAS)의 제조
A. pCIB200과의 검찰
플라스미드 pCIB200을 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB1216을 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. AHAS 코딩 서열에 융합된 PR-1 5'측 서열을 함유하는 약 4.3kb 밴드 및 pCIB 200 벡터를 함유하는 밴드를 잘라내고, 혼합하며 또 결찰시켜 pCIB1233을 형성한다.
B. pCIB1216의 제조
플라스미드 pCIB269(실시예 19A)를 XbaI 및 NcoI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 1207(이하 참조)를 XbaI 및 NcoI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 아가로스겔에서 분리한다. PR-1 5'측 서열을 갖는 블루스크립트 벡터를 함유하는 벤드 및 AHAS 코딩 서열을 함유하는 3.3kb 밴드를 잘라내고, 혼합하며 또 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pCIB1216을 형성한다.
C. 아라비돕시스 AHAS 유전자를 함유하는 플라스미드 pCIB1207의 제조
콜롬비아 생태형 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 5주령으로부터 식물 전체 DNA를 분리해낸다. 이 DNA 20㎍을 제한효소 XbaI의 4000 단위로 4시간 동안 분해한다. 이 분해물은 0.8 아가로스겔 상에서 전기영동에 의하여 분리된다. 6.5kb 및 4.36kb 사이의 DNA 단편(HindIII)로 분해된 入 DNA 크기 마커)은 NA-45 DEAE막(슐레이쳐 및 슈엘, 미합중국, NH, Keene)을 사용하고 제조자가 추천한 과정을 따라 겔로부터 분리된다. XbaI 분해되고 포스파타제 처리된 入 ongC (long C) 암(arm) 조제물은 스트라타진 클로닝 시스템(미합중국 켈리포니아, 라 졸라)으로부터 수득할 수 있다. 아라비돕시스 XbaI 삽입 DNA 0.1㎍을 스트라타진이 추천한 방법에 따라서 long C암 1.0㎍에 결찰시킨다. 이 결찰 반응물 2.5㎕은 지가팩 플러스키트 (Gigapack Plus Kit : Stratagene Cloning Systems)을 사용하고 그 제조자가 추천한 방법에 따라서 入 파아지 헤드에 채운다. 이 라이브러리의 활성은 대장군 VCS 257(Stratagene Cloning Systems)상에서 검정된다.
PE 16/8-c4 플라스미드 DNA (J. Plaina, Carlsberg Res. Comm. 49, 577-584) 50㎍을 EcoRI으로 분해하고 분해 산물을 0.8% 아가로스겔에 용해시킨다. 효모 AHAS 유전자에 대한 코딩 서열을 함유하는 2kb EcoRI 단편을 NA 45 DEAE막을 사용하고 제조자가 추천한 과정을 따라 겔로부터 분리시킨다. 2kb 단편에 대한 방사선 표지된 프로브는 잡종 형성반응시키는 날에 프라임 타임 키트(Prime Time Kit, 미합중국 코네티컷, 뉴하벤에 소재하는 인터네이셔날 바이오테크놀로지 인더스트리스사제조)를 이용하고, 또 제조자가 추천한 방법에 따라서 랜덤 프라리밍 반응법으로 합성한다.
250,000 제조합 파아지를 VCS 257상에 선조 접종한다. 파아지 플라크를 갖는 이중막 잡종은 콜로니/플라크 스크린 막(미합중국 매사츄세츠 보스톤 듀퐁의 NEN 리서치 산물)을 사용하고 제조자가 추천한 방법을 따라 제조한다. 이 막을 LS 잡종화 완충액에서 예비잡종처리 시키고 이어 상기와 같이 제조된 32p-표지된 효모 AHAS 유전자 프로브롤 0.25㎍ 함유하는 새로운 LS 잡종화 완충액 150ml에서 전달된다. 이 막은 천천히 진탕되면서 42℃에서 16시간 동안 배양되며, 실온에서 2×SSC로 15분간 2회 세척하고, 42℃에서 LS 세척완충액(25% 포름아미드, 5×SSC, 1% SDS)에서 2시간 동안 3회 세척하며, 또 헹굼 완충액 (0.1×SSC, 0.1% SDS)으로 30분간 2회 세척한다. 막을 모아 크로넥스 라이트닝 플러스 스크린(Crones Lightening Plus Screens : 미합중국, DE, 윌밍톤, 듀풍사제) 및 XAR-5 필름(코닥사제)를 사용하여 형광사진을 찍는다. 잡종화 막상에서 양성의 필름 시그널을 나타내는 평판 영역의 플라크를 취하고 150mm 평판당 300 플라크의 저밀도로 다시 선조접종시키고, 1개 잡종화 플라크가 분리될 때까지 스크리닝 방법을 반복한다.
플라크 정제된 파아지로부터 파아지 DNA를 미니프렙(miniprep)하는 것은 람다소르브 파아지 아드소벤트 키트(LambdaSorb Phage Adsorbent Kit)(미합중국 위스콘신 마디손, 프로메가사 제조)에 적용되는 방법에 따라 실행한다. 파아지 DNA를 제한 효소 XbaI으로 절단하고 5.8kb의 삽입 단편을 pBS(-) 플라스미드(Stratagene Cloning Systems)의 XbaI 부위에 클론한다. 아라비돕시스 AHAS 유전자를 함유하는 XbaI 단편으로 클론된 단편의 확인은 그의 제한지도 및 DNA 서열을 호인 일행, Mol. Gen. Genet, 211, 266(1988) 및 마주르 일행, Plant Physiol. 85, 1110(1987)에 의하여 밝혀진 유전자에 대한 것과 비교함으로써 확인한다. 이 플라스미드를 pCIB1207로 나타낸다.
[실시예 23] pCIB1232 (pCIB 200/PR-AHAS-SuR)의 제조
A. pCIB 200과의 결찰
플라스미드 pCIB200(실시예 19C)을 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 1230을 KpNI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. AHAS-SuR 코딩 서열에 융합된 PR-1 5'측 서열을 함유하는 4.3kb 밴드 및 pCIB 200 벡터를 함유하는 밴드를 잘라내고, 혼합하여 또 결찰시켜 pCIB1232를 형성한다.
B. pCIB1230의 제조
플라스미드 pCIB1208(이하 참조)를 XbaI 및 NcoI으로 분해하고 그 단편을 겔화온도가 낮은 I×TAE 0.8% 아가로스겔 상에서 전기영동에 의하여 분리한다. 플라스미드 pCIB269(실시예 19A)을 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 겔화온도가 낮은 I×TAE 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 블루스크립트 벡터 및 PR-1 프로모터를 함유하는 pCIB269 단편 및 돌연변이된 AHAS 유전자(마주르 일행, Plant Physiol. 85, 1110-1117 (1987)에 의해 기술된 유전자로 교차 상동성 및 제한 단편 분석에 의하여 확인됨)를 함유하는 3.3kb 단편을 잘라내고, 용융시키고 또 서로 결찰시켜 pCIB1230으로 표시되는 클론을 제조한다.
C. pCIB1208의 제조
이 게놈 DNA 라이브러리는 호인 및 소메르빌래, Mol. Gen. Genet. 204, 430-434(1986)에 의해 기술된 바와 같이 술포닐우레아 제초제에 대하여 내성인 것으로 선정된 아라비돕시스 식물로부터 분리된 DNA를 사용하여 실시예 22C에서 기재된 대로 작성한다. 아세토히드록시산 신타제(AHAS)를 코딩하는 유전자를 함유하는 플라크는 효모 아세토히드록시산 신타제 유전자 프로브(실시예 22C 참조)와 교차 잡종화시켜 확인한다. 재조합 DNA를 블루스크립트(Stratagene)에 서브클론하여 pCIB1208로 표시된 클론을 만든다. 이 플라스미드는 술포닐우레아 제초제에 의한 억제작용에 대하여 내성인 돌연변이된 아세토히드록시산 신타제를 코딩하는 유전자를 함유한다.
[실시예 24] 담배(Nicotiana Tabacum)으로부터 염기성 형태의 β-1, 3-글루카나제 (글루칸엔도-1, 3-β-글루코시다제)를 코딩하는 게놈 클론의 분리
고분자량 DNA는 CETAB법(무라이 및 톰슨, NuCleic Acid Res. 8, 4321(1980))에 의하여 하반나 425 품종의 담배의 잎으로부터 제조한다. DNA 100㎍을 SacI으로 완전히 분해시킨다. 0.8% 아가로스겔 상에서 전기 영동에 의하여 DNA를 분리한다. 3 내지 7kb의 분자량 범위에 상응하는 겔 영역을 6개의 동일한 크기의 스트립으로 잘라내고 또 이들 스트립으로부터 DNA를 전기용출시켜 분리된 분획으로 석출시킨다. 이 DNA를 재현탁시키고 또 이것의 한 부분씩을 아가로스겔 상에서 분리하고 또 서던 블로팅법으로 분석한다. β-1, 3-글루카나제 cDNA 프로브(신시, 에이취 일행, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85, 5541-5545(1989))와 잡종화되는 DNA를 함유하는 분획을 모아서 라이브러리 제조에 사용한다.
스트라타진 코오포레시숀사로부터 구입한 클로닝 벡터 lambdaOng C를 SacI으로 분해한다. 이 DNA 1㎍을 SacI으로 분해된 담배 DNA 0.1㎍과 혼합하고 또 이 DNA를 제조자의 제안에 따라 T4 DNA 리가제와 결찰시킨다. 스트라타진사에 따라 시험관에서 팩케이징 과정을 이용하여 상기 결찰된 DNA를 파아지 입자로 팩케이징 한다. 이 파아지를 세균과 함께 람다에서의 방법과 동일하게 선조접종 한다. 32-P로 표지된 β-1, 3-글루카나제 cDNA 프로브를 사용하여 약 75,000 플라크를 스크리닝한다. 11개의 양성 플라크를 확인한다. 이들 플라크는 계속적인 선조접종 및 스크리닝에 의하여 정제된다.
정제된 클론으로부터 DNA를 분리하고 또 HindIII, EcoRI 및 SacI을 사용하여 제한효소분해법으로 분석한다. 이들 클론은 2부류인데, 1개는 클론 39.1로 다른 하나는 클론 39.3으로 표시된다. 클론 39.1 및 39.3 내에 있는 4.5 및 4.7kb의 삽입물을 SacI으로 분해된 블루스크립트 플라스미드에 서브클론하고, 또 서브클론 pBSGluc 39.1(入클론 39.1로부터 유래하는 SacI 단편) 및 pBSGLuc39.3(入클론 39.3로부터 유래하는 SacI 단편)을 분리한다. 서브클론 pBSGluc39.1 및 pBSGluc39.3내에 있는 SacI 단편의 DNA 서열은 DNA서열 결정법에 의하여 측정되며 각각 서열 5 및 서열 6에 나타낸다. 코딩 서열을 찾고 또 대형 개제 서열(intervening sequence)은 코딩 서열의 5' 말단 근처에 위치한다.
A. 프라이머 신장 맵핑
2399 내지 2416 염기에 상보적이고 또 실시예 5에 기재된 바와 같이 프라이머 신장 실험에 사용되는 합성 DNA 프라이머를 합성한다. 이들 실험에 대한 RNA는 프토프토라 파라지티카(Phytophota parasitica)의 니코티아나(nicotiana)변종으로 감염된 담배로부터 분리된다. 프라이머 신장 산물은 분자량 기준과 반대로 이동하며, 이때 주형으로 사용된 서브클론 pBSGluc39.1과 함께 표지된 프라이머가 디데옥시 DNA염기서열 결정법에 사용된다. 신장 산물은 실시예 5에 기재된 바와 같이 겔 전기영동후 방사선 사진법으로 확인되며, 이 산물은 β-1, 3-글루카나제 39.1 서열, 서열 5의 위치 1432, 1446 및 1447과 상응한다. pBSGluc39.1 서열의 1554 및 2345 위치 사이에 대형 인트론이 존재하므로, 분자량 분포(사닥다리)는 신장 산물의 정확한 분자량을 반영하지 않을 수 있다. 그러므로 1530 내지 1547 위치가 상보적인 프라이머를 사용하여 두번째의 프라이머 신장 맵핑 실험을 실행할 수 있다. 이 프라이머를 사용하여, 글루카나제 mRNA의 5' 말단 3개는 1434, 1448 및 1449 위치에 A 잔기가 있다는 것이 결정된다.
B. S1 뉴클레아제 맵핑
1415 내지 1504 위치에 대하여 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 S1 뉴클레아제 맵핑에서 프로브로서 사용하기 위해 합성한다.32P-ATP 및 T4폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 공급자의 추천에 따라서 5' 말단에서 올리고뉴클레오티드를 활성화시킨다. 페놀 추출 및 에탄올 침전시킨 다음 표지된 올리고뉴클레오티드를 포름아미드 잡종화 완충액(실시예 6 참조)에 약 2nM 농도로 제현탁시킨다. 이들 실험에 사용된 RNA는 앞서의 실시예어서와 같이 피토프토라 파라지티카로 감염된 담배로부터 분리된다. 이 RNA상에서 실시예 6에서 기술한 바와 같이 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 S1 맵핑을 실행한다. 겔 전기영동시킨후 pBSGluc39.1DNA 서열상에서 1434, 1448 및 1449 위치에 상응하는 3개의 밴드가 검출된다.
C. 전사개시 부위의 결정
프라이머 신장법 및 S1 뉴클레아제 맵핑법 모두는 1434, 1448 및 1449 위치에서 mRNA의 5' 말단을 배정한다. 그러므로 모두 아데닌 잔기인 이들 3개의 부위는 β-1, 3-글루카나제 유전자의 전사 개시부위에 상응한다.
[실시예 26] pBSGluc39.1/GUS 제조
A) 5'-GTTTATGTGAGGTAGCCATGGTGGGAAGACTTGTTGGG-3'
B) 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCTCTAGGGGGCCAAGG-3'
서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 정제하며 또 pBSGluc39.1으로부터 유도된 DNA의 1494 bp 단편을 증폭시키기 위하여 공급자(퍼킨 엘머 세루스, DNA 써말 싸이클러(thermal cycler) 및 퍼킨 엘머 세루스, 진암프리에이전트 키트(Gene Amp Reagent Kit))의 지시에 따라서 폴리머라제로 촉진되는 반응(PCR)에 사용한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 39.1글루카나제 서열의 염기쌍 1에 있는 SacI 부위에 KpnI 5' 부위를 부가하여 1462 염기쌍에서 새로운 NcoI 부위를 만드는 것으로 예정되어 있다. PCR 증폭 과정으로부터 유도된 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 또 에탄올 침전시킨다. 이 DNA를 재현탁시키고 또 NcoI 및 KpnI으로 분해하며 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 1462bp 밴드를 잘라재어 하기 결찰실험에 사용한다. 플라스미드 pBS-GUS1.2(실시예 19B)을 NcoI 및 KpnI으로 분해하고 0.8% 아가로스겔 상에서 분리하며 또 벡터률 함유하는 밴드를 잘라낸다. pBS-GUS1.2 벡터를 함유하는 밴드 및 PCR 반응으로부터의 1462 bp 밴드를 결찰시키고 대장균을 형질전환 시키는데 사용한다. 양성의 클로니를 취하고 또 1462bp 삽입물을 함유하는 클로니에 대해 스크린한다. 삽입물을 함유하는 플라스미드는 pBSGluc39.1/GUS의 추정된 클론이지만 이 과정에서 돌연변이율이 비교적 높기 때문에(~1/1000 염기), 어떤 클론은 1462 bp 단편 전체를 통하여 염기서열이 결정되어야 한다. 예정된 서열을 갖는 1개 클론을 클론 pBSGluc39.1/GUS로서 선택한다.
[실시예 27] pBSGluc39.3/GUS의 제조
A) 5'-GTTTATCTGAGGTAGCCATGGTGAGAAGACTTGTTGGA-3'
B) 5'-GATCGCGGTACCGAGCTCCCTTGGGGGGCAAG-3'
서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성, 정제하고 또 pBSGluc39.3으로부터의 1677bp단편을 증폭시키기 위하여 PCR 반응에 사용한다. 이들 올리고 뉴클레오티드는 글루카나제 39.3 서열의 1 위치에 있는 SacI 부위 및 1646 위치에 있는 신규 NcoI 부위 옆에 신규 Kpn I 부위를 도입하기로 되어 있다. PCR 증폭에 의한 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시키며, 재현탁시키고, NcoI 및 KpnI으로 분해하며 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분해시킨다. 1646 bp의 밴드를 잘라내고 하기 결찰시험에 사용한다. pBS-GUS 1.2를 NcoI 및 KpnI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분해시킨다. 벡터를 함유하는 밴드를 잘라내고, PCR 반응으로부터 유래하는 1646 bp 밴드와혼합하고 또 결찰시켜 플라스미드 pBSGluc 39.3/GUS를 형성한다. 전술한 바와 같이 몇개 임의의 플라스미드를 분리하고 또 염기서열 결정하고 예상 서열을 갖는 것을 플라스미드 pBS Gluc 39.3/GUS으로 취한다.
[실시예 28] pCIB200/Gluc39.1-GUS 및 pCIB200/Gluc39.3-GUS의 제조
A. pCIB 200 (실시예 19C)를 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 플라스미드 pBS Gluc39.1/GUS(실시예 26)을 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 또 이들 단편을 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. pCIB 200 벡터를 함유하는 밴드 및 GUS 유전자에 융합된 글루카나제 39.1 유전자의 5'측 서열을 함유하는 KpnI-XbaI 밴드를 잘라내고 이들 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/Gluc39.1-GUS를 형성한다.
B. 이와 유사하게, 플라스미드 pBSGluc39.3/GUS(실시예 27)을 분해하고 또 분해된 pCIB200과 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/Gluc 39.3-GUS를 형성한다.
[실시예 29] pCIB 200/Gluc 39.1-BT 및 pCIB 200/Gluc 39.3-BT의 제조
A. pCIB 200/Gluc 39.1-BT
플라스미드 pBS Gluc 39.1/GUS를 KpnI 및 NcoI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 1004(실시예 21B)를 KpnI 및 NcoI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔 상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB200(실시예 19C)를 KpnI으로 분해하고, 송아저장 알칼리성 포스파타제를 사용하여 탈인산시키고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. pCIB200 벡터를 함유하는 밴드, 글루카나제 5'특 영역을 함유하는 밴드, 및 BT 유전자를 함유하는 밴드를 잘라내고, 서로 혼합하며 또 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/Gluc39.1-BT를 형성한다.
B. pCIB 200/Gluc39.3-BT
이와 유사하게 플라스피드 pBSGluc39.3/GUS를 분해하고 또 분해된 pCIB1004 및 분해된 pCIB 200과 결찰시켜 플라스미드 pCIB 200/Gluc 39.3-BT를 형성한다.
[실시예 30] pCIB 200/Gluc 39.1-AHAS 및 pCIB 200/Gluc 39.3-AHAS의 제조
A. pCIB200과의 결찰
플라스미드 pBSGluc39.1/AHAS를 KpnI 및 XbaI으로 부내하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스 겔상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB 200(실시예 19C)을 KpnI 및 XbaI 으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 글루카나제/AHAS 융합물을 함유하는 밴드 및 pCIB200 발현 벡터를 함유하는 밴드를 잘라내고, 혼합하며 또 이들 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/Gluc39.1-AHAS를 형성한다.
이와 유사하게 플라스미드 pBSGluc39.3/AHAS를 분해하고 분해된 pCIB200과 결찰시켜 플라스미드 pCIB200/Gluc39.3-AHAS를 형성한다.
B. 플라스미드 pBSGluc39.1/AHAS 및 pBSGluc39.3/AHAS의 제조
플라스미드 pBSGluc39.1/GUS(실시예 26)을 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB1207(실시예 22C)를 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 글루카나제 5'측 서열 및 벡터를 함유하는 밴드 및 AHAS 코딩 서열을 함유하는 밴드를 잘라내고, 혼합하며 이들 DNA를 결찰시켜 플라스미드 pBSGluc39.1/AHAS를 제조한다.
이와 유사하게 플라스미드는 pBSGluc39.3/GUS(실시예 27)을 분해하고 또 분해된 pCIB1207과 결찰시켜 플라스미드 pBSGluc 39.3/AHAS를 형성한다.
[실시예 31] pCIB200/Gluc39.1-AHAS-SuR 및 pCIB200/Gluc39.3-AHAS-SuR의 제조
A. pCIB 200과의 결찰
플라스미드 pBSGluc39.1/AHAS-SuR을 KpnI 및 XbaI으로 분해하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 플라스미드 pCIB200(실시예 19C)을 KpnI 및 XbaI으로 분리하고 또 겔화온도가 낮은 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. 글루카나제/AHAS-SuR 융합물을 함유하는 밴드 및 pCIV 200 발현 벡더를 함유하는 밴드를 잘라내고, 혼합하고 또 이들 DNA를 결합시켜 플라스미드 pCIB 200/Gluc 39.1-AHAS-SuR을 형성한다.
이와 유사하게 플라스미드 pBSGluc39.3/AHAS-SuR을 분해하고 또 분해된 pCIB 200과 결찰시켜 플라스미드 pCIB 200/Gluc 39.1-AHAS-SuR을 형성한다.
B. 플라스미드 pBSGluc39.1/AHAS-SuR 및 pBSGluc39.3/AHAS-SuR의 제조
플라스미드 pBSGluc39.1/GUS(실시예 26) 및 pBSGluc39.3/GUS(실시예 27)을 NcoI 및 XbaI으로 분해하고 또 이들 제한 단편을 겔화온도가 낮은 1×TAE 0.8% 아가로스겔상에서 분리한다. pCIBl208(실시예 23C)을 XbaI 및 NcoI 으로 분해하고 또 돌연변이된 AHAS 유전자(술포닐우레아 제초제 내성, SuR)을 함유한다. 3.3 kb 단편을 아가로스겔 전기영동법에 의해 분리한다. 글루쿠로니다제 프로모터 및 pBS 벡터를 함유하는 단편을 절단, 용융시키고 또 AHAS 단편과 결찰시켜 각각 pBSGluc39.1/AHAS-SuR 및 pBSGluc39.3/AHAS-SuR로 표시된 클론을 제조한다.
4. 신규 유전자의 확인
하기 실시예는 본 발명의 잔류하는 신규 PR 단백질 유전자의 분리 및 특징화를 기술한다.
[실시예 32] 기타 게놈 클론 및 cDNA 클론의 분리
A. PR-1'을 코딩하는 게놈 클론의 분리
게놈 라이브러리를 제조하고 실시예 11에 기술된 PR-1 cDNA 프로브와 함께 스크린한다. 클론을 분리하고 또 入tobchrPR1019로 명명한다. 예비적인 제한효소 지도를 확립한다. ClaI 단편을 블루스크립트에 서브클론한 다음 플라스미드 pBS-PR1019Cla의 제한 효소지도를 확립한다. pBS-PR1019Cla으로 부터 큰 XhoI 단편을 결실시켜 플라스미드 pBS-PR1019Cla △Xho를 생성한다. 이 플라스미드는 PR1019 유전자를 함유하는 담배 DNA 약 2.7kb를 함유한다. 이 플라스미드에서 결실처리시키고 또 결실 셋트를 DNA 염기서열결정법에 이용한다.
이 유전자의 약 2100bp에 대한 DNA서열을 서열 2에 나타낸다. PR 1019에서 코드되는 단백질은 PR-1a, PR-1b, 또는 PR-1c에 대하여 약 65% 상동이어서 이 새로운 유전자를 PR-1'로 명명한다.
B. 오이 키티나제를 코드하는 cDNA의 분리
상기 기술한 바와 같이 감염된 오이 잎으로부터 병원체 유도성 키티나제 단백질을 분리한다(메트락스, 제이. 피이. 일행, Physiological and Molecular Plant Pathology, 33, 1-9(1988)). 이 균일한 단백질 조제물로부터 펩티드를 주로 당해분야에 기술된 바와 같이 또 실시예 9 및 10에 기술된 바와 같이 제조한다. 이 단백질이 2 영역을 선별하고 또 펩티드를 코드할 수 있는 mRNA의 모든 가능한 결합에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성한다. 이 프로브의 서열은 다음과 같다.
오이 잎을 담배의 괴사 비루스(Tobaco Necrosis Virus : TNV)로 감염시키고 또 감염된지 5일후 실시예 5에서 기술한 바와 같이 RNA를 분리한다. 표준 수법에 의하여 폴리 A+RNA를 분리하고 또 굴버, 유 및 호프만, 비. 제이, Gene 25, 263(1983)에 기재된 바와 같이 入Zap 클로닝 벡터(스트라타진사제조)에서 cDNA 라이브러리를 작성한다. 300,000 플라크를 선조접종하고 또 이중 플라크 잡종을를32P 표지된 올리고뉴클레오티드 혼합물 1(프로브 1)또는 혼합물 2(프로브 2)로써 방사선 표지시킨다. 프로브와 함께 스크린한 경우 양성 결과를 나타내는 플라크를 분리한다. 파아지의 분리 및 자동적 절단은 스트라타진 람다(Stratagene Lambda)Zap 실험 규정에 기술된 바와같이 실행한다.
키티나제 cDNA 클론을 블루스크립트 플라스미드에서 분리하면 이들은 디데옥서법에 의해 염기서열이 결정된다. 이 키티나제 유전자의 서열을 서열 3에 나타낸다.
C. PR-R의 주형태를 코드하는 cDNA 클론의 분리
담배(Nicotiana tabaccum : Xanthi-nc 품종) 잎을 담배 모자이크 비루스로 감염시키고 또 감염 5일 후 수집한다. 실시예 5에서와 같이 전체 RNA를 조제하고 또 표준수법을 이용하여 폴리 A+RNA를 분리한다. cDNA 라이브러리는 폴리 A+RNA를 이용하여 람다 ongC 클로닝 벡터(스트라타진사제)에서 작성된다. 약 300,000 플라크를
5'-GAACTTCCTAAAAGCTTCCCCTTTTATGCC-3'
서열의 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 스크린 한다. 양성 플라크를 표준 수법으로 정제하고 또 DNA를 파아지로부터 제조한다. cDNA를 함유하는 제조합 파아지의 단편을 블루스크립트 플라스미드로 서브클론한다. 이 cDNA의 DNA 서열을 DNA 서열 결정법으로 결정한다. 주 형태의 PR-R을 코드하는 1개 클론의 서열(피에르포인트, 더블유, 에스 일행, Physiol, Plant Pathol. 31, 291(1987))을 서열 4에 나타낸다. 이 코드된 단백질은 옥수수로부터 분리된 공지의 트립신/알파-아밀라제 억제제와 매우 강한 상동성을 갖고 있다. 클론된 PR-R은 프로테아제 또는 알파-아밀라제의 억제제일 수 있고 또 그것 자체로써 트랜스재닉하게 발현될 때 살충활성, 비루스 박멸작용 또는 살진균 활성을 식물에 부여한다.
D. PR-Q를 코드하는 cDNA의 분리
담배(Nicotiana tabaccum : Xanthi-nc 품종) 잎을 담배 모자이크 비루스로 감염시키고 또 감염된지 5일 후 수집한다. 실시예 5에서와 같이 전체 RNA를 제조하고 또 폴리 A+RNA를 표준수법을 사용하여 분리한다. cDNA 라이브러리는 폴리 A+RNA를 사용하여 Lambda ongC 클로닝 벡터(스트라타진 사제)에서 작성된다. 담배의 염기성 키티나제 유전자(신시 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89-93(1987))를 코드하는 표지된 cDNA 프로브를 사용하여 약 300,000 플라크롤 스크린하고 또 50℃에서 0.125mM NaCl, 1% SDS, 40mM 인산나트륨(pH 7.2), 1mM EDTA로 필터를 세척한다. 24개의 양성 플라크를 정제하고 또 pBScht 15로 명명된 1개 클론의 DNA 서열을 결정한다. 이 서열을 서열 7에 나타낸다.
PR-Q 단백질은 실시예 8에서 기술한 바와 같이 TMV로 감염된 담배 잎의 세포내액으로부터 부분적으로 정제된다. 울트라겔 ACA 54 크로마토그래피로부터 PR-O, PR-P, PR-Q를 함유하는 분획을 모으고 동결건조에 의하여 농축시킨다. 단백질은 폴리아크릴아미드 겔전기영동에 의하여 더 정제된다. PR-Q를 함유하는 단백질 밴드를 절단하고 또 1988년 3월 21일자 Applied Biosystems User Bulletin No. 36에 따라서 단백질을 용출해낸다. 단백질을 피로글루타메이트 아미노펩티다제로 처리하고 또 실시예 9에 기술된 바와 같이 자동 에드만 분해법에 의해 결정한다. PR-Q 단백질의 아미노말단의 서열은 하기로 결정되었다. (Xxx : 미정);
GlnGlyIleGlySerIleValThrXxxAspLeuPheAsnGluMetLeu
서열 7에서 클론으로 코드된 단백질은 1) 염기성 담배 키티나제와 한정적으로 구조적 상동이고 또 2) 단백질 서열결정법으로 확인된 PR-Q의 아미노말단 단백질과 동일한 것을 기본으로 하여 병인관련 단백질 Q로 확인된다.
E. 산성 형태의 β-1, 3-글루카나제를 코드하는 cDNA의 분리
실시예 32 D(상기)에 기재된 바와같은 cDNA라이브러리의 약 300,000 플라크를 염기성 형태의 β-1, 3-글루카나제(신시, 에이치 일행, 상기동일)를 코드하는 표지된 cDNA 프로브를 사용하여 스크린 하고, 50℃에서 0.125 M NaCl, 1% SDS, 40mM 인산나트륨 (pH 7.2), 1mM EDTA로 필터를 세척한다. 15개의 양성 플라크를 분리하고 또 삽입물을 블루스크립트 플라스미드로 서브클론한다. 부분적인 DNA 서열결정은 클론 5 및 클론 6이 염기 형태의 β-1, 3-글루카나제의 DNA 서열과 약 55% 상동성을 갖는 동일한 cDNA를 코드한다는 것을 가르킨다. 클론 5 및 클론 6에서 cDNA의 서열을 결정하고 서열 8에 나타낸다. 이 cDNA는 한정된 아미노산 서열 상동성 및 코드된 단백질의 보다 산성의 등전점을 기준으로 볼때 산성 형태의 β-1, 3-글루카나제를 코드한다는 것을 알 수 있다.
F. 오이 키타나제 유전자를 코드하는 게놈 클론의 분리
오이(Cucumis sativas : Long Marketer 품종)로부터 헥산을 분리하고 또 실시예 11에 기재된 바와 같이 DNA를 분리한다. 이 DNA 3㎍을 EcoRV, EcoRI, BamHI 또는 HindIII 중의 어느것으로 분해하고 또 이들 단편을 0.5% 아가로스겔상에서 분리한다. 오이 키티나제 cDNA(서열3)의 표지된 프로브를 사용하는 서던 블롯 분석은 약 12kb의 EcoRI 분해물인 1개 밴드를 나타낸다. 그러므로 전체 EcoRI 분해물을 이용하여 오이 키티나제 유전자를 분리하고 또 入 대체형 클로닝 벡터에 결찰시킨다.
상기 분리된 DNA 10㎍을 EcoRI을 이용하여 완전히 분해시킨다. 이 DNA를 페놀로 추출하고 또 에탄올 침전시키며 또 EMBL 4의 EcoRI 부위에 결찰시킨다. 약 100,000 플리크롤 오이키티나제(서열 3)의 표지된 cDNA 프로브와 함께 스크린한다. 10개의 양성 플라크를 취하고 정제하며 또 DNA 삽입물은 예비적인 제한효소 분해 맵핑에 의하여 분석한다. 모든 클론이 동일한 결과를 나타내며 1개를 다음 분석용으로 취한다. 이 클론내의 12kb 삽입물을 블루스크립트 플라스미드에 서브클론하여 플라스미드 pBScucchi/키티나재를 생성한다. 제한 효소지도를 이 클론된 DNA에 대하여 확립하고 단편들은 서브클론되어 DNA 서열이 결정된다.
G. 산성 β-1,3-글루카나제를 코드하는 게놈클론의 분리
실시예 11에서 기술된 바와 같이 게놈 라이브러리를 작성하고 또 실시예 32E에서처럼 산성 β-1,3-글루카나제에 대한 cDNA 클론으로 스크린한다. 람다 클론을 분리하고 이 람다 클론의 1kb EcoRI 단편을 실시예 32A에서 기술한 바와 같이 블루스크립트로 서브클론한다. 이 블루스크립트 클론을 pBSGL6e로 명명한다.
5. 안정한 형질전환 및 식물의 재분화.
식물 조직을 당해 분야에 공지된 상기 어떤 수법에 의하여 기술된 벡터로 형질전환시킨다. DNA를 식물 세포로 전달하는데 사용되는 방법은 예를 들어 식물, 식물조직 또는 세포를 에이. 튜메파시엔스(호슈, 알. 비이. 일행, Science 225, 1229(1985); 마톤, 엘, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol 1, 514-521, (1984)로 직접 감염시키거나 또는 공동배양 하는것, 하기 문헌에 기술된 방법에 의하여 프로토플라스트를 외인성 DNA로 처리하는 것을 포함한다 : 피츠코우스키, 제이 일행, EMBO J. 3, 2717(1984); EP-A 0,164, 575호; 실리토, 알. 디이 일행, Bio /Technology 3, 1099(1985); 포트리쿠스, 아이. 일행, 상기동일; 로렌쯔, 에이취 일행, Mol. Gen. Genet. 199, 178(1985); 프롬, 엠. 일행, 상기동일; GB 2, 140, 822호; 및 내그루티우, 아이. 일행, Plant Mol. Biol, 8, 363(1987); 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 배양 (내그루티우, 아이. 일행, 상기동일); 미량주사법(라이히, 티이, 제이, 일행, Bio/Technology 4, 1001-1004(1986); 라이히, 티이. 제이, 일행, Can J. Bot. 64, 1259-1267(1986), 미량투사 폭발법(클라인. 티이. 엠. 일행, Nature 327, 70,(1987).
[실시예 33]
아그로박테륨의 형질전환
pCIB270(실시예 16), pCIB271, pCIB272 및 pCIB273(실시예 19D, E 및 F)플라스미드 DNA를 염화칼슘 브롬화에티듐 구배상에서 정제하고 또 헬퍼 플라스미드 pCIB542를 함유하는 에이. 튜메파시엔스 A 136주를 홀스터스, 엠. 일행, Mol. Gen. Gent. 163, 181-187(1978)의 과정에 의하여 형질전환시키기 위해 사용하여 CIB270, CIB271, CIB 272, 및 CIB 273 주를 형성한다.
동일한 과정을 이용하여, 플라스미드 pCIB271, pCIB272, 및 pCIB273을 독성 에이.튜메파시엔스 15955주, A 208주, A 281주, 및 pCIB271 × 15955, pCIB271 × A 208, pCIB271 × A281, pCIB271 × A 4, pCIB272 × 15955, pCIB272 × A 208, pCIB272 × A 281, pCIB272 × A 4, pCIB 273 × 15955, pCIB273 × A 208, pCIB273 × A 281, 및 pCIB 273 × A 4로 표시되는 주를 생성하는 에이. 리조게내ㄷ스(A, rhizogenes) A4 주로 형질전환시킨다.
아그로박테륨 CIB542주는 플라스미드의 카나마이신 마커가 Tn 7의 스펙티노마이신/스트렙토마이신 부위로 대체된 EHA101주 (후드 일행, J. Bacteriol. 168, 1291-1301 (1986))이다.
[실시예 34]
담배의 잎 디스크 형질 전환
아그로박테륨 CIB270, CIB271, CIB272 및 CIB273주를 pH 5.6으로 조정되고 또 0.15% 만니톨, 50㎍/ml 카나마이신, 50㎍/ml 스펙티노마이신 및 1mg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 글루타메이트 염배지에서 항생물질없는 동일 배지에서의 OD 600가 0.2로 희석되기전까지 18 내지 24시간 동안 생육시킨다. 이어 호슈, 알. 일행, Science 227, 1229-1232(1985)의 방법 변형에 따라서, GA 7 용기에서 무균적으로 생장한 담배 (Nicotiana tabacum : Xanthi 품종)의 잎으로부터 펀치된 5 내지 7mm 디스크를 접종시키기 위해 세균을 OD 600이 0.2 내지 0.4로 희석되기 전까지 3 내지 5시간 동안 생육시킨다.
50㎍/ml 카나마이신, 100㎍/ml 카르베이실린 및 100㎍/ml 메폭신을 함유하는 0.7% 한천 배지로 옮기기 전에 잎 디스크를 무라시개 및 스쿠그주염 및 부염(MS), 1mg/1 벤질이데닌 및 1gm/ml α-나프탈렌아세트산을 함유하는 0.7% 한천상에서 2일간 유지시킨다. 디스크상에 형성된 어린싹을 잘라내어 6개의 어린 식물이 수득될 때까지 GA 7 용기내에서 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 MS 배지상에 어린싹 선단을 개대 배양하는 것에 의하여 증식시킨다.
이 어린식물은 호르몬이 없고 또 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지상에서 뿌리를 형성하고, 토양으로 옮겨진 다음 화학적 조절제를 유도처리 하기 위해 온실로 옮기기 전에 피토트론에서 고정된다. 개화시기에 꽃은 자가수분 하도록 유도된다. 성숙된 후종자를 수거한다.
유도실험 및 그 결과는 실시예 63, 66 및 표 II에 기재되어 있다.
[실시예 35]
트랜스재닉 담배 캘러스 및 식물체의 제조.
잎 디스크로부터 형성된 캘러스를 형질전환시키기 위해 아그로박테륨 pCIB270주 또는 pCIB271주를 사용한다(실시예 34). 카나마이신 함유 MSBN 선별배지상에서의 캘러스 형성은 MS 주염, 부염 및 Fe-EDTA(Gibco H500-1117; 4.3 g/l), MS 비타민, 100mg/l 미오-이노시를, 20g/l 자당, 2mg/l 나프탈렌아세트산 및 0.3mg/l 키내틴으로 구성된 캘러스 생장 배지상에서 유지된다.
캘러스 조각을 MSBN 배지로 전달하고 또 실시예 34에서 기술된 방법을 따름으로써 트랜즈제닉 식물체를 재분화하기 위해 캘러스가 사용될 수 있다. 또한 캘러스는 유도 화학물질을 투여함으로써 유전자 유도를 측정하고 또 유전자 유도 화학물질에 대해 스크린하기 위해 사용된다.
[실시예 36]
당근의 형질전환
실시예 34에서 기재된 바와 같이 성장한다. OD 600가 0.2 내지 0.4로 희석된 세균은 표면 멸균된 당근으로부터 절단된 디스크를 접종하기 위해 사용된다.
당근을 표면 멸균시키기 위해 10% 클로록스에서 20분간 담근다.
당근을 멸균수로 헹군 다음 5mm조각으로 절단하며 또 물 한천상의 바닥에 놓는다. 20 내지 50μl의 세균을 디스크의 상부 표면에 투여한다. 7일후 디스크를 MS염, 3% 자당, 0.1mg/l 2, 4-D, 50㎍/ml 카나마이신, 100㎍/ml 카르베니실린 및 100㎍/ml 메폭신을 함유하는 0.7% 한천으로 옮긴다. 형성층 고리부근에서 형성하는 캘러스를 잘라내고 또 3% 자당, 0.1mg/1 2, 4-D, 50㎍/ml 카나마이신, 100㎍/ml 카르베니실린, 및 100㎍/ml 메폭심이 첨가된 0.7% MS 한천상에 놓는다. 캘러스가 성장한 후 작은 조각으로 절단한 후 동일한 배지의 4개 평판으로 임의로 보낸다. 이 캘러스가 평판을 채우면, 이 평판중 3개에 물, 50mM 나트륨 살리실레이트 pH 5.6 또는 250㎍/l 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트를 분무하여 키메라 PR-1a/GUS 유전자의 발현을 유도한다.
유도실험 및 결과는 실시예 63 및 66에 기재되어 있다.
[실시예 37]
해바라기의 형질전환
실시예 34에서 기재된 바와 같이 생육시킨다. OD 600이 0.2내지 0.4로 희석된 세균을 하기와 같이 제조된 해바라기 식물의 줄기의 접종을 위해 사용한다.
해바라기 종자를 10% 캡탄에서 10분간 담군후 10% 클로록스에 10분간 담근다음 멸균수로 헹군다. 씨껍질을 제거하고 또 암소의 0.7% 물 한천상에서 3일 동안 종자를 발아시킨후 23℃의 랩라인 배양기셋트에서 12시간 낮과 밤으로 보관한다. 세균의 이탈 및 절단된 줄기 표면상으로 세균을 접종하기 전에 모종을 1주일간 재배한다.
1주일 후 CIB270, CIB271, CIB272 또는 CIB273으로 접종된 줄기를 절단하고 또 MS염, 3%자당, 2mg/ml α-나프탈렌아세트산, 1mg/ml 6-벤질아미노푸린 100㎍/ml 카르베니실린, 100㎍/ml 메폭심 및 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 0.7% 한천상에 놓는다.
으로 접종된 줄기를 절단하고 또 MS염, 3% 자당, 100㎍/ml 카르베니실린, 및 100㎍/ml 매폭심을 함유하는 0.7% 한천상에 놓는다. 4 평판에 대하여 충분한 양이 얻어질 수 있을 때까지 매 2주마다 캘러스를 새로운 배지로 전달한다. 독성 아그로박테륨주로부터 성장한 캘러스의 1/2을 호르몬 없이 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 배지로 전달한다. 카나마이신 존재 또는 부재하에서 성장한 충분한 캘러스가 수득된 후, 형질전환된 당근 캘러스에 대하여 기재된 바와 같이 유도처리를 행한다.
[실시예 38]
토마토의 형질전환
실시예 34에서 기재된 바와 같이 생육시킨다. OD 600이 0.2 내지 0.4로 희석된 세균은 하기와 같이 제조된 토마토 모종의 줄기를 접종하기 위하여 사용된다.
토마토 종자를 10% 클로록스에서 20분간 담근후 멸균수로 헹군다. 암소의 0.7% 물 한천상에서 3일 동안 종자를 발아시킨 후 12시간 낮과 밤으로 23℃의 랩라인 배양기 셋트에 보관한다. 세균이 이탈되어 잘라진 줄기 표면상으로 세균을 접종시키기 전에 묘목을 1주간 재배한다.
1주일 후 CIB270, CIB271, CIB272 또는 CIB273으로 접종된 줄기를 절단하고 MS염, 3% 자당, 2mg/ml α-나프탈렌아세트산, 1mg/ml 6-벤질아미노푸린, 100㎍/ml 카르베니실린, 100㎍/ml 매폭심, 및 50㎍/ml 카나마이신을 함유하는 0.7% 한천상에 놓는다.
으로 접종된 줄기를 절단하고 또, MS염, 3% 자당, 100㎍/ml 카르베니실린 및 100㎍/ml 매폭심을 함유하는 0.7% 한천상에 놓는다. 4개 평판에 대하여 충분한 양이 얻어질때까지 캘러스를 2주마다 새 배지로 옮긴다. 독성 아그로박테륨주로부터 생장한 캘리스의 1/2을 호르몬 없는 50㎍/ml 카나마이신 함유 배지로 전달한다. 카나마이신 존재 또는 부재하에서 성장한 충분한 캘러스가 수득된 후, 형질전환 당근 캘러스에 대하여 기술된 것과 같은 유도처리를 행한다.
[실시예 30]
목화의 형질전환
실시예 34에서 기재된 바와 같이 재배한다. OD 600이 0.2 내지 0.4로 희석된 세균은 하기와 같이 제조된 목화의 자엽을 접종하기 위하여 사용된다:
목화 종자를 10% 클로록스에서 20분간 담근후 멸균수로 헹군다. 암소의 0.7% 물 한천상에서 종자를 발아시킨다. 세균을 자엽표면에 접종시키기 전에 묘목을 1주간 재배한다.
접종된 자엽은 잘라지기 전에 캘러스를 형성하도록 허용된 다음 MS염, 3% 자당, 100㎍/ml 카르베니실린, 및 100㎍/ml 매폭심을 함유하는 0.7% 한천상에 놓는다. 4개 평판에 대하여 충분한 양이 얻어질때까지 캘러스를 3주마다 새 배지로 옮긴다. 독성 아그로박테륨주로부터 생장한 캘러스의 1/2을 호르몬 없는 50㎍/ml 카나마이신 함유배지로 전달한다. 카나마이신 존재 또는 부재하에서 성장한 충분한 캘러스가 수득된 후, 형질전환된 당근 캘러스에 대하여 기술된 것과 같은 유도처리를 행한다.
[실시예 40]
엘리트 순개주 Funk 2717 옥수수(Zea mays) 캘러스의 특수형의 제조
순개주 Funk 2717 옥수수 식물을 온실에서 개화할 때까지 생육시켜 자가 수분시킨다. 길이 약 2 내지 2.5mm의 배를 함유하는 미성숙 배를 식물로부터 제거하고 10% 클로록스 용액에서 20분간 멸균시킨다. 낟알로부터 무균적으로 배를 제거하고 또 0.1mg/1 2,4-D, 6%(w/v)자당 및 25mM L-프롤린을 함유하며 0.24%(w/v) 겔라이트로 응고된 OMS 배지(초기 배지)상에서 배축과 함께 아래로 선조접종한다. 27℃ 암소에서 2주간 배양한 후, 배반상에서 발생한 캘러스를 배로부터 제거하고 또 0.5mg/l 2,4-D를 함유하고 또 0.24%(w/v) 겔라이트로 응고된 B5 배지(갬보르그, 오. 엘. 일행, Experimental Cell Research 50, 151-158(1968)) 상에 선조접종한다. 이 캘러스는 매 2 주마다 새로운 배지로 개대배양된다. 배를 초기 배지에 둔지 총 8주후, 캘러스의 특수형은 그의 특징적 형태에 의하여 확인된다. 이 캘러스를 동일 배지상에서 더 개대배양한다. 2월 더 지난 후, 2mg/l 2,4-D를 함유하고 또 겔라이트으로 응고된 N6 배지로 캘러스를 옮겨 그 위에서 연속적으로 개대배양한다.
[실시예 41]
엘리트 순개주 Funk 2717 옥수수의 현탁배양물의 제조
실시예 40에 기재된 캘러스를 적어도 총 6개월동안 개대배양한다. 개대배양에 선정된 캘러스형은 비교적 비점액질의 매우 약한 과립이어서 액체 배지에 두면 소형의 각 세포 집합물로 분리된다. 대형의 팽창된 세포를 갖는 집합물을 함유하는 배양물은 유지되지 않는다. 엘리트 순개주 Funk 2717 옥수수의 특수 캘러스의 약 500mg 부분을 2mg/l 2,4-D를 함유하는 125ml 디롱(Delong) 플라스크 내의 N6 배지 30ml에 놓는다. 선회하는 교반기(130rpm, 2.5cm 깊이)상의 암소, 26℃에서 1주일간 배양한 후, 배지를 새로운 배지로 대체한다. 1주일 더 지난후 이 현탁액을 다시 상기와 같이 개대배양한다. 이때 배양액을 관찰하고, 다수의 팽창 세포를 나타내지 않는 배양액을 보존한다. 크로 팽창된 세포와의 집합물을 함유하는 현탁배양액은 버린다. 바람직한 조직은 세포 집합물의 통상적인 형태보다 더 부드러운 표면을 특징적으로 갖는 농후한 세포질 분열세포 집합물로 구성된다. 보관한 배양액은 이들 소형 집합물로 표시되는 세포의 적어도 50%를 갖는다. 이것이 소망스런 형태이다. 이들 현탁액은 또한 급속한 생장률을 갖는데, 배가 시간이 1주 미만이다. 이 현탁 배양액은 매주 0.5ml PCV (packed cell volume: (팩킹한 세포부피): 피펫으로 고정된 세포부피임)를 25ml의 새로운 배지로 옮기는 것에 의하여 개대배양된다. 이런 방식으로 4 내지 6주간 개대배양한 후, 매주 개대배양마다 배양액은 2배 내지 3배 증가한다. 75% 이상의 세포가 소망스런 형태인 배양액을 다음의 개대배양을 위해 보관한다. 내용물이 최고 형태를 나타내는 플라스크를 개대배양을 위해 선택하는 것에 의하여 주(line)를 유지시킨다. 2주마다 630μm 포어 크기의 스텐레스 강철제를 통하여 주기적으로 여과하는 과정이 어떤 경우에는 배양액의 분산을 향상시키기 위해 사용되지만 필수적이지는 않다.
[실시예 42]
옥수수의 현탁배양액으로부터 프로토플라스트의 제조
실시예 41에서 제조된 현탁배양 세포 1 내지 1.5ml PCV를, 4%(w/v) 셀룰라제 RS와 KMC (8.65g/l KCl, 16.47g/l MgCl2·6H2O 및 12.5g/l CaCl2·2H2O, 5g/l MES, pH 5.6) 염용액 내의 1%(w/v) Rhozyme으로 구성된 필터로 멸균된 혼합물 10내지 15ml에서 배양한다. 서서히 흔들리는 테이블 위의 30℃에서 3내지 4시간 동안 분해를 실행한다. 이 제법은 역전 현미경하에서 프로토플라스트 방출에 대하여 모니터 한다. 방출된 프로토플라스트를 다음과 같이 수거한다: 조제물을 100μm 메쉬체, 이어 50μm 메쉬채를 통하여 여과한다. 원래의 효소용액 부피와 동일한 부피의 KCM염 용액을 사용하여 프로토플라스트를 체를 통하여 세척한다. 바닥에 1.5 내지 2ml의 0.6M 자당 용액(0.1% (w/v) 모르폴리노에탄 술폰산 (MES 및 KOH)로 pH 5.6으로 완충됨)이 깔린 몇개의 휴대용 플라스틱 원심분리관에 10ml의 프로토플라스트 조제물을 넣는다. 이 관을 60 내지 100×g 에서 10분간 원심분리하고 또 중간에 있는 프로토플라스트 밴드를 피펫으로 수거하여 새로운 관에 넣는다. 이 프로토플라스트 조제물을 새로운 KMC염 용액 10ml에 재현탁시키고 또 60 내지 100 × g에서 5분간 원심분리한다. 상청액을 제거하고 잔류하는 프로토플라스트를 재현탁한 다음 13/14 강도 KMC 용액 10ml를 서서히 부가한다. 5분동안 다시 원심분리한 후 상청액을 다시 제거하고 이 프로토플라스트를 6/7 강도 KMC 용액에 재현탁한다. 그 일부를 카운팅 하기 위해 취하고, 또 프로토플라스트를 원심분리에 의하여 침전시킨다. 이 프로토플라스트는 KM-8p 배지(표 I) 또는 6mM MgCl2을 함유하는 0.5M 만니톨 또는 기타 하기 실시예에서 기재한 바와 같이 형질전환에 사용되기 적합한 배지에 ml당 107(천만)로 재현탁된다. 이 프로토플라스트 현탁액은 형질전환에 사용되며 또 실시예 43 및 44에서 기재된 바와 같이 배양될 수 있다.
[실시예 43]
엘렉트로포레이숀(electroporation)에 의한 옥수수 프로토플라스트의 형질전환
A. 열 충격을 제외한 모든 단계는 실온(22 내지 28℃)에서 실행한다. 실시예 42의 마지막 단계에서 프로토플라스트는 0.1%(w/v) MES 및 6mM MgCl2를 함유하는 0.5M 만니톨에 재현탁된다. 이 현탁액의 저항을 디알로그 엘렉트로포레이터(Dialog Electroproator : DIA-LOG G.m.b.H, D-4000 Duesseldorf 13, 독일연방공화국)의 챔버에서 측정ㅎ고 또 300mM MgCl2용액을 사용하여 1내지 1.2kobm 으로 조정한다. 시료를 함유하는 관을 45℃ 물 중탕기에서 5분간 담그고 이어 얼음상에서 실온으로 냉각시키는 것에 의하여 프로트플라스트를 열충격 처리한다. 로드슈타인, 에스. 제이. 일행(상기 동일)에 의하여 기술된 식물 선별성 히그로마이신 내성 유전자, 또는 실시예 19 내지 31에서 기술된 바와 같은 키메라 유전자를 함유하는 선상 플라스미드 4㎍ 및 송아지 운반 DNA 20㎍를 이 현탁액 0.25ml의 나눈 부분에 부가한다. 이 프로토플라스트에 30mM MgCl2를 함유하는 0.5M 만니톨 내의 24%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 용액(MW 8000)0.125ml를 부가한다. 혼합물을 서서히 혼합하고 10분간 배양한다. 시료를 엘렉트로포레이터의 챔버로 옮기고 또 이 시료에 10초간격, 1500, 1800, 2300 또는 2800 Vcm-1의 초기전압 및 10μ초의 지수 붕괴시간으로 3회 펄스를 가한다.
프로토플라스트는 다음과 같이 배양된다. 시료를 실온에서 6cm 패트리접시에 선조접종한다. 5 내지 15분후 1.2%(w/v) Sea Plaque아가로스 및 1mg/l 2,4-D를 함유하는 KM-8p 배지 (표 I, 상기 참조) 3ml를 부가한다. 아가로스 및 프로토플라스트를 잘 혼합하고 또 배지를 겔화시킨다.
B. 하기의 1 이상의 변형으로 실시예 43 A를 반복한다:
(1) 프로토플라스트 조제물의 저항을 0.5 내지 0.7 kobm으로 조정한다.
(2) 사용된 PEG는 분자량 4000의 PEG이다.
(3) PEG를 부가하지 않거나, 또는 12%(w/v)PEG 1/2 부피를 부가한다.
(4) 3초간격으로 펄스를 가한다.
(5) 엘렉트로포레이숀한 후 프로토플라스트를 16℃의 온도로 냉각된 평판상에 놓여진 접시에 선조접종한다.
(6) 엘렉트로포레이숀 단계후 프로토플라스트를 관에 넣고, 6/7 강도 KMC 용액 또는 W5 배지(380mg/l KCl, 18.375 g/l CaCl2·2H2O, 9g/l NaCl; 9g/l 글루코스으로 구성됨, pH 6.0)으로 세척한 다음 60g에서 10분동안 원심분리시켜 수거하여 0.3ml KM 배지에 재현탁하고 또 A에서와 같이 선조접종한다.
(7) 송아지 흉선 운반 DNA를 부가하지 않는다.
[실시예 44]
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 처리에 의한 옥수수 프로트플라스트의 형질전환
A. 실시예 42의 마지막 단계에서 프로토플라스트를 12-30mM MgCl2를 함유하는 0.5M 만니톨 용액에 재현탁한다. 45℃에서 5분간의 열충격은 실시예 43에 기재된 바와 같다. 프로플라스트를 형질전환시키기 위해 원심분리관에 나누어 관당 0.3ml의 현탁 프로토플라스트를 넣는다. 그 다음 10분간 하기를 첨가한다: DNA(실시예 43에서처럼) 및 20% PEG 최종 농도를 내는 폴리에틸렌 글리콜 용액(MW 6000, 40%(w/v); 0.1M Ca(NO3)2및 0.4M 만니톨 함유; KOH로써 pH 8-9로 조정). 나누어진 부분들을 때때로 부드럽게 교반하면서 30분간 배양한 다음 프로토플라스트를 페트리접시에 놓고 (6cm 직경접시당 0.3ml의 원프로토플라스트 현탁액) 또 실시예 43에 기술된 대로 배양한다.
B. 실시예 44A를 반복하고 또 실시예 44A의 PEG 용액에서 30분간 배양한 후 W5 용액 0.3ml를 2 내지 3분 간격으로 5회 부가함으로써 프로토플라스트를 세척한다. 프로토플라스트 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 제거하며 또 프로토플라스트를 실시예 43A 에서와 같이 배양한다.
C. PEG의 최종농도를 13 및 25%(w/v) 사이로 변형하여 실시예 44A 및 44B를 반복한다.
[실시예 46]
프로토플라스트로부터 캘러스의 재분화
아가로스에서 프로토플라스트를 함유하는 평판을 암소의 26℃에 놓는다. 15일 후, 프로토플라스트로 부터 클로니가 생긴다. 콜로니를 함유하는 아가로스를, 2mg/l 2,4-D를 함유하며 0.24%(w/v) 겔라이트으로 응고된 N6 배지 ( 표 I, 상기동일) 30ml를 함유하는 9cm 직경 패트리 접시의 표면으로 전달한다. 이 배지를 2N6이라 한다. 암소의 26℃에서 캘러스를 배양하고 캘러스 조각을 2주마다 새로운 고체 2N6 배지로 개대배양한다.
[실시예 46]
옥수수(Zea mays)의 형질전환 캘러스의 선별
형질전환된 세포를 선별하기 위하여 2N6 배지로 100mg/l 또는 200mg/l 히그로마이신 B를 부가하는 변형을 행하면서 실시예 45를 반복한다.
[실시예 47] 옥수수 식물의 재분화
A. 캘러스 유지를 위한 2N6 배지 그리고 ON6(2,4-D가 없는 N6배지 포함) 및 N61 배지(0.25mg/l 2,4-D 및 10mg/l 키내틴을 함유하는 N6 배지)상에 캘러스를 놓고 재분화를 개시한다. ON6 및 N61 배지상에서 성장하는 캘러스는 광(백색 형광램프로부터의 10 내지 100μ 아인슈타인광/m2초, 16시간/1일)에서 성장한다. N61 배지상에 더 연장되어 존재하는 것이 불리하기 때문에, 2주후 N61 배지상에서 성장하는 캘러스를 ON6 배지로 옮긴다. 캘러스가 동일 배지 배합물에 옮겨진다 하더라도 매 2 주마다 캘러스를 개대배양한다. 약 4 내지 8주내에 어린 식물이 나타난다. 어린 식물이 적어도 2cm 길이이면, GA 7 용기내에 있는 ON6 배지로 옮긴다. 뿌리는 2 내지 4주내에 형성되며, 또 뿌리가 성장을 충분히 지지할 만큼 잘 형성된 것으로 보이면 토탄포트내 토양으로 옮겨 처음의 4 내지 7일간은 광을 가려준다. 묘목을 차츰 찬기운에 쐬어 강하게 하는 것을 보조하기 위하여 2 내지 3일간 어린 식물을 투명 플라스틱 컵으로 씌우는 것이 유용하다. 일단 식물이 확고하게 되면, 이들을 정상적인 옥수수 식물과 같이 처리하여 온실에서 성숙시킨다. 후대를 수득하기 위해 식물을 자가수분시키거나 또는 야생형과 교배시킨다.
B. 캘러스를 유지하기 위하여 사용된 배지에 100mg/l 또는 200mg/l 히그로마이신 B를 부가하는 변형을 가하면서 실시예 47A 를 반복한다.
[실시예 48]
다틸리스 글로메라타 (Dactylis Glomerata L.)
(새발풀)의 조직으로부터 부정배 형성농을 갖는 현탁액의 제조.
A. 한닝, 지이. 이. 일행에 의하여 Theor. Appl. Genet., 63, 155-159 (1982)에 기재된 바와 같이, 부전배형성능을 갖는 캘러스는 온실에서 성장한 새발풀 (Dactylis glomerata L.) 식물의 어린 잎의 기저 부분으로부터 시작된다. 잎을 클로록스 용액(5.25%(w/v) 치아염소산나트륨; 클로록스 컴패니사제, 캘리포니아 오우크랜드 소재함)의 1:10 희석액에서 약 10분간 담그는 것에 의하여 표면 멸균시킨 다음 길이 또는 직경 1 내지 5mm의 작은 절편으로 무균적으로 절단한다. 이들 절편을 겔화재로서 0.8%(w/v)아가로스를 함유하는 무균 SH-30 배지상에 놓는다. 약 25℃ 배지에서 2 내지 6주동안 평판배양한 후 캘러스 및/또는 부정배 형성능 구조가 나타난다. 부정배 형성능 캘러스는 2 내지 4주마다 새로운 SH-30 배지로 개대배양되고 또 25℃ 암소에서 배양하는 것에 의하여 유지된다.
B. 부정배 형성능을 갖는 현탁배양물은 그레이, 디. 제이 일행, Plant Cell Tissue Organ Cult., 4, 123-133(1985)에 의해 기재된, 45μM 디캄바(dicamba) 및 4g/리터 카제인 가수분해물을 함유하는 액체 배지 50ml로 부정배 형성능을 갖는 캘러스 약 0.5g을 넣는 것에 의하여 개시된다. 현탁배양은 금속 캡 및 파라필름으로 밀봉된 125ml-디롱 플라스크 내, 약 130rpm 에서의 선회식 진탕기상에서 16시간 광(40μE/m2초), 8시간 어둠의 광주기하, 27℃에서 성장한다. 약 4주 후 큰 응집괴를 약 30분동안 침전시키고 또 작은 세포 덩어리를 함유하는 상청액 배지의 10ml 부분씩을 제거하여 50ml의 새배지로 옮긴다. 이 과정은 매 3 내지 4주마다 적은 세포질 세포존재를 기준으로 하여 보다 더 응집괴 크기 및 더 우수한 질로 판단되는 가장 성공적인 배양을 이용하여 반복한다. 5 내지 8회 옮긴후 현탁액은 부정배 형성능을 갖지 않는 세포가 거의 없고 부정배 형성능을 갖는 세포 덩어리의 대부분은 크기가 매우 작다(150 내지 2000μm).
[실시예 49]
새발풀(Dactylis Glomerata L,) 프로토플라스트의 분리 및 정제.
프로토플라스트는 Nalgene0.2μm 필터 유니트 상에서 세포를 무균적으로 여과하고 이어 여과된 0.5g 중량의 세포를 패트리 접시내에 있는 프로토플라스트 효소 혼합물 12.5ml에 부가하는 것에 의하여 실시예 48의 부정배 형성능을 갖는 배양물로 부터 제조된다. 효소 혼합물은 2%(w/v) 셀룰라제 RS, 7mM CaCl2×H2O, 0.7mM NaH2PO4×H2O, 3mM MES(pH 5.6), 글루코스 (550mOs × kg H2O, pH 5.6)으로 구성되며, 또 필터로 멸균된다. 이 혼합물을 침침한 (5μE/m2초) 광하, 약 50rpm의 궤도식 진탕기(orbital shaker) 상에서 약 4 내지 5시간 동안 흔들었다. 분해물은 스테인레스강체(100μm 메쉬크기)를 통하여 채질하고 12ml 원심분리관으로 분배한 다음 약 60 내지 100g에서 약 5분간 원심분리한다. 프로토플라스트-함유 침전을 글로코스로 550mOs/kg H2O로 조정된 프로토플라스트 배지 KM-8p으로 3회 세척한다. 이 점에서 프로토플라스트를 더 정제하기 위해 부유 단계가 포함될 수 있다. 이 경우, 세척된 프로토플라스트는 글루코스에 의해 700mOs/kg H2O로 조정된 KM-8p 배지 10ml 위로 층을 이룬다. 60 내지 100 × g에서 약 10분간 원심분리한 후, 중간에 밴드를 이루는 프로토플라스트를 미세 피펫으로 수집한다. 최종적으로 프로토플라스트를 1 내지 2ml KM-8p 배지에 재현탁시키고 또 스테인레스 메쉬스크린(20μm 메쉬 크기)을 통하여 채질한다. 방출된 프로토플라스트를 수집하고 세척하며 또 배양하기 위해 KM-8p 배지에 재현탁하거나 또는 실시예 51 내지 53에 따라서 형질전환하기 위해 적합한 삼투적으로 조정된 배지에 재현탁한다.
[실시예 50]
새발풀(Dactylis Glometrata L, ) 프로토플라스트 배양 및 캘러스의 성장
A) 1.3%(w/v) Sea plaque아가로스(FMC 코오포레이숀사, 마린콜로이드 디비젼, 미합중국 메인 롤크랜드) 및 30 내지 40%(w/v)의 조절된 배지(배지를 멸균 Nalgene0.2μm 필터로 여과하고, 글루코스를 부가하여 배지를 550mOsm/kg H2O로 만든 다음 다시 필터로 멸균시키는 것에 의하여 3 내지 4주령 새발풀의 부정배 형성능을 갖는 현탁배양물로부터 수득함)를 함유하는 KM-8p 배지에서 ml 당 약 5×105프로토플라스트 밀도가 되게 정제 프로토플라스트를 평판에 놓는다. 이어 평판을 28℃의 일정한 온도가 유지되는 암소에 놓는다. 10 내지 14일 후 아가로스를 웨지모양으로 잘라서 실리토, 말. 디이 일행, Plant Cell Reports, 2, 244-247(1983)에 기재된 바와 같이 원래 아가로스가 끼워진 배지 3ml당 3%(w/v) 자당을 갖는 3H-45 현탁 배지 20ml를 사용하여 '비이드(bead) 배양'시킨다. 평판을 플랫폼식 진탕기상에 놓고 8μE/m2초 광하에서 약 50rpm으로 교반한다. 콜로니가 아가로스를 탈피하고 이탈된 세포가 액체배지로 들어감에 따라서 새로운 현탁배양액이 형성된다. 그 결과 생성된 현탁배양된 세포를 한천으로 응고된 SH-30 배지상에 놓고 캘러스가 형성될 때까지 25℃의 암소에서 방치한다.
B. 배양기가 조절된 배지를 전혀 함유하지 않는 것외에는 실시예 50A에 기재된 바와 같이 프로토플라스트를 배양한다.
[실시예 51]
엘렉트로포레이숀(electroporation)법에 위한 새발풀(Dactylis Glomerata L. ) 프로토플라스트의 형질전환.
A. 프로토플라스트를 정제한 직후, 실리토, 알. 디이. 일행, Bio/Technology 3, 1099-1103(1985)에 따라서 실시예 20에서 실시된 바와 같이 선상 플라스미드를 사용하여 엘렉트로포레이숀을 실행한다. 마지막 세척한 후 프로토플라스트를 엘렉트로포레이숀 완충액(0.4M 만니톨, 6mM MgCl2)에 ml 당 약 7×106프로토플라스트 밀도로 재현탁시킨다. 프로토플라스트를 10ml 플라스틱 원심분리관 내에 0.7ml씩 나눠진 양으로 넣는다. 최종농도가 각각 10㎍/ml 및 50㎍/ml 을 나타내는 실시예 20의 플라스미드 DNA 및 초음파 분해된 송아지 흉선 DNA(시그마사제조)를 이 튜브에 부가한다. 이어 0.38ml의 폴리에틸렌글리콜(PEG) 용액 (0.4M 만니톨 및 30mM MgCl2내의 24%(w/v) PEG 6000, 0.1%(w/v) MES(pH 5.6))을 부가하고 또 그 용액을 서서히 혼합한다. 프로토플라스트 현탁액을 Dialog엘렉트로포레이터의 챔버로 옮기고 또 3250V/cm 초기전압 및 10μ초의 지수함수형 붕괴상수의 10 펄스를 30초간 가한다. 시료를 챔버로부터 제거하고 또 10cm 직경의 패트리 접시에 놓는다. 1.2% (w/v) Sea Plaque아가로스를 함유하는 KM-8p 배지 10ml를 부가하고, 프로토플라스트를 배지 전체를 통하여 균일하게 분배한 다음 아가로스를 겔화시킨다.
B. 사용된 초기전압이 3500V/cm, 4000V/cm, 5000V/cm, 3000V/cm 또는 2500V/cm 인 것을 제외하고는 실시예 51A를 반복한다.
C. 분자량이 4000인 PEG 또는 분자량이 8000인 PEG를 사용하는 외에는 실시예 51A 및 B를 반복한다.
D. 최종 PEG 농도가 10% 및 30% (w/v) 사이인 것을 제외하고는 실시예 51A 내지 C를 반복한다.
[실시예 52]
폴리에틸렌글리콜(PEG) 처리로써 새발풀(Dactylis Glomerata L.) 프로토플라스트의 형질전환.
A. PEG 매개된 직접전 유전자 전달법은 내그루티우, 아이, 일행 (상기동일)에 따라서 실행한다. 사용된 DNA는 실시예 20에서 사용된 선상 플라스미드이다.
프로토플라스트는 마지막 세척한 다음 약 2×106/ml 농도로 15mM MgCl2를 함유하는 0.5M 만니톨에 현탁된다. 프로토플라스트를 1ml씩 나누어 10ml 플라스틱 원심분리관으로 분배하고, 상기 실시예 51에서 기재된 바와 같이 DNA를 부가한 다음 0.5ml PEG 용액(0.4M 만니톨, 0.1M Ca(NO3)2내의 40%(w/v) PEG 4000, pH 7.0)을 부가한다. 용액을 서서히 혼합하고 또 가끔 진탕하면서 실온(약 24℃)에서 30분간 배양한다. 이어 세척용액 1.4ml를 부가하고, 원심분리관의 내용물을 서서히 혼합한다. 세척용액은 87mM 만니톨, 115mM CaCl2, 27mM MgCl2, 39mM KCl, 7mM 트리스-HCl 및 1.7g/l 미오-이노시톨, pH9.0으로 구성된다. 세척용액 1.4ml씩을 4분간격으로 4번 더 부가하고, 각각 부가한 다음 혼합한다. 이어 원심분리관을 약 60×g에서 10분간 원심분리하고 상청액을 제거한다. 침전된 프로토플리스트를 1ml KM-8p 배지에 용해시키고, 또 10cm 패트리 접시에 놓는다. 1.2%(w/v) Sea Plaque아가로스를 함유하는 KM-8p 배지 10ml를 부가한다. 프로토플라스트를 배지 전체를 통하여 균일하게 분배시킨 다음 아가로스를 겔화시킨다.
B. 하기 1 또는 그 이상의 수정을 가하여 실시예 52A를 반복한다:
(1) 세척 용액의 pH를 5.6 또는 7.0으로 조정한다.
(2) 사용된 PEG가 분자량 6000의 PEG, 분자량 2000의 PEG 또는 분자량 8000d의 PEG이다.
(3) 세척배지가 154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 5mM 글루코스, pH6.0까지의 KOH, O.2M CaCl2, 0.1%(w/v) MES, pH 6.0 까지의 KOH 또는 0.2M CaCl2, 7mM 트리스 /HCl, pH 9.0까지의 KOH로 구성된다.
[실시예 53]
엘렉트로포레이숀 또는 PEG 처리로서 새발풀(Dactylis Glomerata L.) 프로토플라스트의 형질전환.
프로토플라스트를 형질전환시키기 위해 나눈것을 원심분리관으로 분배하기전 또는 나눈것을 분배한 후, 및 PEG를 부가하기 전에 프로토플라스트를 45℃에서 처리하는 것을 제외하고는 실시예 51 또는 실시예 52에 기술된 바와 같이 형질전환을 행한다.
[실시예 54]
형질전환된 클로니의 선별
실시예 51 내지 53으로부터 수득한 프로토플라스트를 함유하는 배양평판(패트리접시)을 약 25℃ 암소에서 10일간 배양한 다음 '비이드 배양'[실리토, 알. 디. 일행, Plant Cell Reports 2, 244-247(1983)) 하기 위해 5개의 동일한 조각으로 자른다. 조각중 4개는 4g/l 카제인 가수분해물 및 20㎍/ml 히그로마이신 B를 갖는 SH-45 배지 20ml에 넣는다. 5개째 조각은 비 선별적인 대조용으로 히그로마이신 B를 갖지 않는 이외는 동일한 배지 20ml에 넣는다. 4 내지 5주후 히그로마이신 B에서 성장하는 임의의 형질전환된 프로토플라스트 유도 세포 콜로니를 아가로스로부터 잘라내고 20㎍/ml 히그로마이신 B를 함유하는 액체 SH-45 배지 2ml를 갖는 19mm 패트리접시에 놓고, 이것을 궤도식 진탕기상에서 약 50rpm으로 교반한다. 4 내지 5주간 후, 성장하여 새로운 현탁액을 만드는 모든 콜로니를 125ml 에렌마이어 플라스크로 옮기고 또 20㎍/ml 히그로마이신이 배지에 포함된 이외는 친(parent) 현탁배양과 유사한 방식으로 배양한다.
새로운 현탁액은 4g/l 카제인 가수분해물 및 20㎍/ml 히그로마이신 B를 함유하는 SH-45 배지를 사용하여 매 1 내지 3주 마다 개대배양된다. 이들 현탁액으로부터의 세포도 또한 20㎍/ml 히그로마이신 B를 함유하는 고형화된 SH-30 배지상에 놓고 약 25℃의 암소에서 배양한다. 평판배양된 세로포부터 성장한 캘러스를 매 2주마다 새로운 배지로 개대배양한다. 히그로마이신 B 존재하에서 성장하는 세포가 형질전환체로 여겨진다.
B. 배지를 함유하는 히그로마이신 B에서 성장하는 프로토플라스트 유도 세포 콜로니가 20㎍/ml 히그로마이신 B를 함유하는 SH-30 배지의 한천 평판상에서 놓고 약 25℃ 암소에서 배양하는 것을 제외하고는 실시예 54A에 기재된 바와 같이 선별을 행한다.
[실시예 55]
형질전환된 새발풀(Dactylis Glomerata L.) 식물의 재분화
A. 프로토플라스트로부터 유도된 새발풀(Ductylis Glomerata L.) 캘러스
(실시예 54에 기재된 바와 같이 수득됨)를 응고된 SH-30 배지상에서 성장시키고 또 매 2 주마다 개대배양한다. 형성된 배를 제거하고 발아배지(SH-0)상에 놓고 또 광(45 내지 55μB/m2초)하에 둔다. 이들 배의 발아는 1 내지 4주내에 발생하며 그 결과 생성한 어린 식물을 광하의 SH-0 배지상에 놓아 뿌리개를 형성한다. 이들을 6 내지 12업단계에서 온실로 옮기고, 또 서서히 찬기운에 쐬여 강하게 만든다.
B. 프로토플라스트로부터 유도된 캐럴스(실시예 54에서 기재된 바와 같이 수득됨)는 0.24%(w/v) Gelrite로 응고된 광(45 내지 55μE/m2초)하의 SH-0 배지상에서 성장시키고, 또 매 2주마다 개대배양한다. 그 결과 생성한 어린식물은 0.12%(w/v) Gelrite및 0.4%(w/v) 한천의 결합물로 응고된 SH-0 및 OMS 배지의 1:1 혼합물상, 광하에 두어 뿌리개를 형성한다. 이들은 6 내지 12엽 단계에서 온실로 옮기며, 또 서서히 찬바람에 쐬어 강하게 만든다.
C. 상기 44A 및 44B에서 기재된 바와 같이 작은 어린 식물을 수득하고, 또 0.8%(w/v) 한천으로 응고된 OMS 배지상, 광하에 두어 뿌리개를 형성한다. 이들은 6 내지 12엽 단계에서 온실로 옮겨지며, 또 서서히 찬바람에 쐬여 강하게 만든다.
D. 상기 44A에 기재된 바와 같이 작은 어린 식물을 수득하고, 또 0.12%(w/v) Gelrite및 0.4%(w/v) 한천의 결합물로 응고된 SH-0 및 OMS 배지의 1:1 결합물상, 광하에 두어 뿌리를 형성한다. 이들을 6 내지 12엽 단계에서 온실로 옮겨지며, 또 서서히 찬바람에 쐬어 강하게 만든다.
6. 순간적인 유전자 발현
하기 실시예는 식물의 게놈에 유전자가 필수적으로 안정하게 삽입됨 없이 키메라 유전자가 도입되고 또 이용되는 가에 대하여 설명한다.
[실시예 56]
PEG 처리로써 담배(N.Tabacum) 프로토플라스트로의 DNA의 도입.
A. 담배(N.tabacum)의 프로토플라스트의 제조는 하기 문헌에 기재된 방법에 따라서 실행될 수 있다: 파츠코우스키, 제이, 일행, EMBO J. 3, 2717(1984); 독일연방 특허원 2,159,173호, 유럽 특허원 BP 0 129 668호; 실리토, 알. 디이. 및 포트리쿠스, 아이, Methods in Enzymolgy, eds, Wu, R. 및 그로스만, 엘, Academic Press, Orlando, Florida, Vol. 153, 313-306(1987) 또는 당해 분야에 공지된 다른 기술. 이들 문헌은 참고문헌에 수록되어 있다.
B. 내그루티우, 아이 일행, Plant Mol. Biol. 8, 363(1987)의 방법을 수정하여 DNA를 프로토플라스트로 도입한다. 실시예 56A에 기재된 대로 제조된 프로토플라스트는 마지막 세척 단계후에 1.6-2×106/ml 밀도로 0.4M 만니톨, 15 내지 30mM CaCl2, 0.1% w/v MES로 구성된 용액에 재현탁된다. 이 프로토플라스트 현탁액은 0.5ml씩 나눠어져 10ml 플라스틱 원심분리관으로 분배된다. 실시예 19 내지 31의 DNA를 10μl 멸균증류수에 부가하고, 파츠코우스키, 제이 일행, EMBO J. 3, 2717(1984)에 의해 기재된 바와 같이 멸균한 다음 0.5ml PEG용액(0.4M 만니톨, 0.1M CaNO3)2내의 40%(w/v) 분자량 8000 PEG, pH 7.0)을 부가한다. 용액을 서서히 혼합하고 또 가끔 진탕하면서 실온(약 24℃)에서 30분간 배양한다. 1ml 세척 용액을 부가하고, 관의 내용물을 서서히 혼합한다. 세척 액은 KOH로 pH 6.0로 조정된 154 mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 5mM 글루코스로 구성된다. 세척용액의 2ml, 3ml 및 3ml 부분을 5분 간격으로 잇따라 부가하며, 부가한 후 혼합한다. 관을 약 10-100xg에서 약 10분간 원심분리하고 상청액을 제거한다. 프로토플라스트 펠릿을 오스모티쿰으로 0.3M 글루코스를 갖지만 자당은 갖지 않는 충분한 K3 배지에 용해시켜 ml당 100,000의 최종 밀도를 수득하며 또 10cm 패트리 접시에서 배양한다.
C. 하기의 1 또는 그 이상의 수정을 가하여 실시예 56B를 반복한다.
(1) 세척용액의 pH는 5.6 또는 7.0으로 조정된다.
(2) 사용된 PEG는 4000 분자량을 갖는 PEG이다.
(3) 세척배지는 0.2M CaCl2, 0.1% w/v MES, pH 6.0 조절을 위한 KOH로 구성되거나, 또는 0.2m CaCl2, 7mM 트리스/HCl, pH 9.0 조절 KOH로 구성된다.
(4) 25μl 멸균수 내의 절단된 송아지 흉선 DNA 50㎍을 플라스미드 DNA와 함께 부가한다.
(5) 적합한 제한효소(예를 들어 BamHI)로 처리하는 것에 의하여 사용하기 전에 플라스미드 DNA를 선형화한다.
[실시예 57]
엘렉트로포레이숀에 의하여 DNA를 담배(N.Tabacum)의 프로토플라스트로 도입.
A. DNA를 담배의 프로토플라스트로 도입하는 것은 포롬, 엠. 이. Methods in Enzymology, eds, Wu, R, 및 그로스만, 엘., Academic Press, Orlando, Florida, Vol. 153, 307(1987); 및 실리토 알. 디이 및 포트리쿠스 아이, (동일책) 283 내지 306 페이지의 방법을 변형하여 적합한 DNA 존재하에서 프로토플라스트를 전기적 펄스와 처리시키는 것에 의하여 실행된다.
프로토플라스트는 실시예 56A에 기재된 바와 같이 분리된다. 이 프로토플라스트는 마지막 세척후 다음 용액에 1.6 내지 2×106/ml 밀도로 재현탁된다: 0.2M 만니톨, 0.1% w/v MES/72mM NaCl, 70mM CaCl2, 2.5mM KCl, 2.5mM 글루코스, pH 5.8로 조정위한 KOH. 프로토플리스트 현탁액을 1ml씩 나누어 1회용 플라스틱 쿠베트로 분배하고 또 실시예 56B 및 C에 기재된 바와 같이 DNA 10㎍을 부가한다. 하기에 기술된 바와 같은 엘렉트로포레이숀 장치의 471 전극셋트 사이에서 측정된 용액의 저항은 6옴 범위이다.
실시예 19 내지 31의 DNA는 파츠코우스키, 제이. 일행, EMBO J. 3, 2717(1984)에 의해 기재된 바와 같이 멸균된 증류수 10㎍에 부가된다. 이 용액을 서서히 혼합하고 또 이어 실온(24-28℃)에서 BTX-트랜스펙터(Transfector)300 엘렉트로포레이숀 장치로부터 10ms의 지수함수적 붕괴 상수를 갖는 471 전극 어셈블리(assembly)를 사용하여 400V/cm의 펄스로 처리시킨다. 프로토플라스트는 5분동안 침전으로 존재하며, 또 이어 실시예 56A에 기술된 바와 같이 페트리 접시내의 K3 배지에 놓아 프로토플라스트의 밀도가 100,000/ml로 만든다.
B. 하기의 1 또는 그 이상의 수정을 가하면서 실시예 57A를 반복한다:
(1) 사용된 전압은 200V/cm, 또는 100V/cm 및 800V/cm 사이이다.
(2) 지수 함수형 붕괴상수가 5ms, 15ms 또는 20ms이다.
(3) 25μl 멸균수 내의 절단된 송아지 흉선 DNA 50㎍을 플라스미드 DNA와 함께 부가한다.
(4) 적합한 제한효소 (예를 들어 BanHI)로 처리하는 것에 의하여 사용하기 전에 플라스미드 DNA를 선형화한다.
[실시예 58]
DNA를 옥수수(Zea Mays) 2717주의 프로토플라스트로의 유도.
옥수수 순개주 Funk 2717의 프로토플라스트는 상기 실시예 40 내지 47에 기재된 것과 같이 제조되며 또 상기 실시예 56 및 57에서 담배(N.tabacum) 프로토플라스트를 재현탁하기 위해 기술된 용액에 107/ml 농도로 재현탁된다. 형질전환은 본래는 실시예 56 및 57에 기재된 바와 같이 실행한다. 형질전환 후 프로토플라스트는 응고제가 부가되지 않고 1mg/리터 2,4-D를 함유하는 KM-8p 배지에서 2 × 106/ml 밀도로 배양된다.
[실시에 59]
소굼 비콜라(Sorghum Bicolor)의 프로토플라스트에 DNA의 도입.
소굼(Sorghum) 현탁액 FS 562의 프로토플라스트는 본래 상기 실시예 40에서 옥수수(Zea mays)에 대하여 기재된 바와 같이 제조되며, 또 상기 실시예 56 및 57에서 담배(N.tabacum) 프로토플라스트를 재현탁하기 위해 기술된 용액에 107/ml 농도로 재현탁된다. 형질전환은 본래는 실시예 58에 기재된 바와 같이 실행한다. 형질전환된 후 프로토플라스트는 응고제가 부가되지 않은 KM-8p 배지에서 2 × 106/ml 밀도로 배양된다.
[실시예 60]
니코티아나 플룸바기니폴리아(Nicotiana Plumbaginifolia), 페루니아 히브리다(Petunia Hybrida) 및 롤륨 물티플로룸(Lolium Multiflorum)의 프로토플라스트로 DNA의 도입.
엔. 플룸바기니폴리아(N. Plumbaginifolia), 피이. 히브리다(P. Hybrida) 또는 엘. 물티플로룸(L. Multiflorum)의 프로토플라스트는 실리토 및 포트리쿠스(상기동일)에 기재된 바와 같이 제조하며, 또 실시예 56 및 57에 기재된 바와 같이 처리한다.
이 프로토플라스트는 실리토 및 포트리쿠스에 의해 기재된 바와 같은 배지에서 아가로스 또는 기타 겔화제를 부가하지 않고 배양된다.
[실시예 61]
글리신 멕스(Glycine Max)의 프로토플라스트로 DNA의 도입 글리신 맥스(Glycine Max)의 프로토플라스트는 트리콜리, 디. 엠 일행, Plant Cell Reports, 5, 334-337(1986) 또는 초우후리, 브이. 케이. 및 위드홀름, 제이. 엠, Plant Cell Reports 4, 289-292(1985) 또는 클라인, 에이. 에스 일행, Planta152, 105-114(1981)에 의하여 기재된 바와 같은 방법으로 제조된다. DNA는 상기 실시예 56 및 57에 기재된 바와 같이 이들 프로토플라스트에 도입된다. 이들 프로토플라스트는 클라인, 에이. 에스 일행,(상기 동일), 초우후리 브이. 케이 및 위드 홀름, 제이. 엠(상기동일), 또는 트리콜리, 디이. 엠 일행(상기동일)에 기재된 바와 같이 배지를 응고하기 위해 알긴산염을 부가하지 않고 배양될 수 있다.
7. 트랜스제닉 식물 조직의 화학적 조절
하기 실시예는 대표적인 트랜스제닉 식물 조직에서 화학적으로 조절가능한 유전자를 화학적으로 조절하기 위한 방법을 기술한다. 하기 실시예들은 유도에 관한 것이지만, 억제에 의하여 조절할 수 있는 유사방법도 이 계에 사용될 수 있다.
트랜스제닉 세포를 화학적 조절제로 처리하기 위해서는 다양한 수법이 유용하다. 예를 들어 세포는 조절제를 함유하는 액체 배지에 현탁될 수 있다. 캘러스는 조절제를 함유하는 배지에서 성장되거나 또는 옮겨질 수 있고, 또는 조절제가 멸균 페인트솔 또는 식물 미스터(mister)로써 캘러스에 가해질 수 있다. 이와 같이 식물 또는 식물의 부위는 페인트솔 또는 바람직하게는 식물 마스터를 이용하여 조절제 용액 또는 현탁액과 처리될 수 있다.
화학적으로 조절가능한 키메라 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물에서 표현형 특징의 발현은 식물 또는 식물조직에 투여된 조절제의 양에 비례한다.
[실시예 62]
트랜스제닉 캘러스 배양액에서의 화학적 유도
A. 전술한 방법에 의하여 수득된 캘러스는 멸균 페인트솔 또는 식물 미스터로써 NaOH 부가에 의해 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 살리실산의 필터로 멸균된 용액을 가하는 것에 의하여 화학적 유도를 분석할 수 있다.
유도한 후 캘러스를 2일간 배양한 다음 수집하고, 액체 질소에서 냉동시키고 또 실시예 65 및/또는 66에 기재된 바와 같이 유전자 유도에 대하여 분석될 때까지 -80℃에서 보관한다.
B. 이와 달리, 하기 용액이 유도에 이용된다:
(1) NaOH의 부가로 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 벤조산.
(2) NaOH의 부가로 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 폴리아크릴산
(3) 메틸 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트,
이 용액은 화학물질을 함유하는 수화제를 멸균수에 몇분동안 1mg/ml 농도로 재현탁시키는 것에 의하여 제조된다. 용해되지 않은 고체는 필터 멸균법에 의하여 용액으로부터 제거된다.
(4) 0.1 내지 50mM 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산,
pH 6.0 및 8.0 사이. 이 화합물은 디메틸술폭시드(DMSO) 최소량에 용해된 다음 멸균수로 희석되어 소망하는 농도로 된다. 수득된 현탁액은 여과하지 않고 사용된다.
(5) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM n-프로필벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트.
(6) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 벤질 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트.
(7) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산 N-2차-부틸히드라지드.
(8) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 2,6-디클로로이소니코틴산, pH 6.0 및 8.0 사이.
(9) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 메틸 2,6-이클로로이소니코티네이트.
[실시예 63]
트랜스제닉 식물체에서 화학적유도
A. 유전자 발현은 NaOH로 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 살리실산 용액을 식물 미스터로써 잎에 미세분무하는 것에 의하여 전술된 방법에 따라 수득된 식물체에서 유도할 수 있다.
식물을 2일간 균일하게 성장하도록 허용한 다음 수집하고, 액체 질소에서 냉동시키며 또 실시예 65 및/또는 66에 기술된 바와 같이 분석될 때까지 -80℃에서 보관한다.
B. 이와 달리, 하기 용액이 유도하기 위해 사용된다:
(1) NaOH의 부가로 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 벤조산.
(2) NaOH의 부가로 pH가 6.0 및 8.0 사이로 조정된 0.1 내지 50mM 폴리아크릴산
(3) 메틸 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트,
이 용액은 화학물질을 함유하는 수화제를 멸균수에 몇분동안 1mg/ml 농도로 재현탁시키는 것에 의하여 제조된다. 용해되지 않는 고체는 필터 멸균법에 의하여 용액으로부터 제거된다.
(4) 0.1 내지 50mM 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산,
pH 6.0 및 8.0 사이. 이 화합물은 디메틸술폭시드(DMSO) 최소량에 용해된 다음 멸균수로 희석되어 소망하는 농도로 된다. 수득된 현탁액은 여과하지 않고 사용된다.
(5) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM n-프로필벤조-1,2,3-디아디아졸-7-카르복실레이트.
(6) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 벤질 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트.
(7) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산 N-2차-부틸히드라지드.
(8) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 2,6-디클로로이소니코틴산, pH 6.0 및 8.0 사이.
(9) (4)에서와 같이 제조된 0.1 내지 50mM 매틸 2,6-디클로로이소니코티네이트.
[실시예 64]
엔. 타바쿰(N. Tabacum), 제아 메이즈(Zey Mays), 엔. 플룸바기니 폴리아(N. Plumbaginifolia), 피이. 히브리다(P. Hybrida), 엘. 물티플로룸(L. Multiflorum) 및 소굼 비콜라(Sorghum Bicolor)의 프로토플라스트에 도입된 DNA의 발현 유도.
상기 실시예 56 내지 61에 기재된 바와 같이 처리된 프로토플라스트를 암소의 26℃에서 2일간 배양한다. 이 시간 후 pH 6.0 및 8.0 사이의 중성 용액인 살리실산을 0.1 내지 50mM 농도로 부가된다. 이 프로토플라스트를 2시간 더 배양하고, 원심분리에 의하여 수집하며, 즉시 냉동시키고 또 하기 실시예에 기재한 바와 같이 분석한다.
B. 이와 달리, 하기 화합물의 중화용액 또는 현탁액을 프로토플라스트에 부가하여 0.1 및 50mM 사이의 최종 농도를 나타낸다.
(1) 벤조산
(2) 폴리아크릴산
(3) 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트
(4) 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산
(5) n-프로필벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트
(6) 벤질벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트
(7) 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산 N-2차부틸 히드라지드
(8) 2,6-디클로로이소니코틴산
(9) 메틸 2,6-디클로로이소니코티네이트
C. 이와 달리, 유도되기 전에 프로토플라스트가 1일, 3일 또는 5일간 배양되는 것을 제외하고는 실시예 64A 및 B에 기재된 바와 같이 유도를 실행한다.
D. 유도후 및 수집하기 전에 프로토플라스트를 1일, 3일 또는 5일간 배양하는 것을 제외하고는 실시예 64A, B 또는 C에 기재된 바와 같이 유도를 실행한다.
[실시에 65]
화학적으로 유도가능한 DNA 서열에 대한 분석: mRNA 제조
실시예 62 내지 64에서와 같이 유도되고 수집된 식물물질은 RNA분리 및 실시예 5에 기재된 바와 같은 프라이머 신장 분석법에 의하여 mRNA의 유도에 대해 분석된다.
GUS, AHAS 또는 BT를 코딩하는 화학적으로 조절가능한 키메라 유전자를 함유하는 트랜스제닉 식물채로부터 유도되며 또 살리실산, 메틸 벤조-1,2,3-벤조티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산, n-프로필벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤질벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트, 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복시산 N-2차 부틸히드라지드, 2,6-디클로로 이소니코틴산, 메틸 2,6-디클로로이소니코티네이트 또는 TMV에 의하여 유발되는 캘러스 또는 재분화된 식물물질은 프라이머 신장 분석법으로 GUS, AHAS 또는 BT 프라이머로 각각 분석될 때 상승된 mRNA 수준을 나타낸다. mRNA의 수준은 투여된 조절제의 양과 비례한다.
β-글루쿠로니다제 효소활성
A. 엘리사(ELISA) 분석법
냉동된 잎 조직을 절구내에서 액체질소 존재하에 막자로 분쇄시켜 미세 분말을 제조한다. 제퍼슨, 알. 에이. 일행, Proc, Natl. Acad. Soi. USA 83, 8447-8451(1986)에 기재된 바와 같이 주어진 중량(g)을 동일부피(ml)의 GUS 추출 완충액(50mM 인산나트륨 pH7.0, 0.1% 트리론-X 100, 0.1% 사르코실, 10mM β-메르캅토에탄올)과 혼합하는 것에 의하여 잎 추출액을 제조한다.
5 내지 25 μl 추출액을 4-메틸 움벨리페릴 글루쿠로니드(MU) 함유 GUS 분석 완충액(50mM 인산 나트륨 pH 7.0, 0.1% 트리톤 X-100, 10mM β-메르캅토에탄올) 120 내지 100μl와 혼합하여 총 부피 125μl 내의 2mM의 최종농도로 엘리사 평판의 웰에서 반응을 실행한다. 평판은 37℃에서 1 내지 5시간 동안 배양되며 반응은 3M Na2CO3150μl를 부가하여 중지된다. 방출된 형광지시제의 농도는 플로우 랩스 플루오로스캔II 엘리사 평판 판독기(Flow Labs Fluoroskan II ELISA plate reader)상에서 평판을 읽는 것에 의하여 측정된다.
B. 결과
[표 II]
특이활성 nKat MU/mg 단백질
역주
aH 1-9는 CIB271주에 의해 잎 디스크를 형질전환시켜 수득된 담배식물임.
Alu 1-13은 CIB272주에 의해 잎 디스크를 형질전환시켜 수득된 담배 식물임.
Hae 1-16은 CIB273주에 의해 잎 디스크를 형질전환시켜 수득된 담배 식물임.
bA 물
B 살리실산
C 메틸-벤조-1,2,3-타아디아졸-7-카르복실레이트
D 완충액
E TMV
형질전환된 담배 캘러스(실시예 23): 다음의 GUS 활성은 처리한지 21시간후 수집된 형질전환된 캘러스의 시료로부터 수득된다. CIB271로 형질전환: H2O 분무: 1.8nKat MU/mg 단백질: 50mM 살리실산나트륨 분무: 3.8 nKat MU/mg 단백질. CIB271로 형질전환(다른 실험): H2O 분무: 2.8 nKat MU/mg 단백질; 250㎍/l 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 분무: 13.7 nKat MU/mg 단백질. CIB273으로 형질전환: H2O 분무: 0.46 nKat MU/mg 단백질; 250㎍/l 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 분무: 31.2 nKat MU/mg 단백질. 형질전환된 당근(실시예 36): 다음의 GUS 활성은 처리한지 21시간 후 수집된 pCIB271에 의해 형질전환된 캘러스의 시료로부터 수득된다. H2O 분무; 5.2 pKat MU/mg 단백질. 50mM 살리실산 나트륨 분무; 11.6 pKat MU/mg 단백질. 250㎍/l 메틸 벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 분무: 22.1 pKat MU/mg 단백질.
형질전환된 토마토(실시예 38): 다음의 GUS 활성은 처리한지 21시간 후 수집된 형질전환된 캘러스 시료로부터 수득된다.
CIB271로 형질전환: H2O 분부: 17.2 pKat MU/mg 단백질: 250㎍/l 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 분무: 56.1 pKat MU/mg 단백질. CIB273 × A4로 형질전환: H2O 분무: 4.6 pKat MU/mg 단백질: 250㎍/l 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 분무: 22.1 pKet MU/mg 단백질.
pCIB269로 처리된 담배 프로토플라스트에서 순간적인 발현(실시예 56): H2O: 30.6±13 pKat MU/mg 단백질; 메틸벤조-1,2,3-디아디아졸-7-카르복실레이트: 66.6±20 pKat MU/mg 단백질.
[실시예 67]
내인성 유전자의 화학적 유도에 대한 분석
대조과정으로 실시예 62 내지 64에 기재된 바와 같이 살리실산, 메틸벤조-1,2,3-티아디아졸-7-카르복실레이트 및 TMV에 의하여 유도된 담배 식물물질은 실시예 5에 기재된 방법에 의하여 내인성 PR-la 유전자로부터의 mRNA 전사에 대하여 분석된다. mRNA의 증가된 수준은 모든 3개 유발제에 의하여 유발된 후 검출된다.
[실시예 68]
화학적으로 유도가능한 DNA 서열에 대한 분석:
아세토히드록시산 신타제(AHAS) 효소적 활성
A. AHAS 분석법에 대한 시료제조
분석할 잎 및/또는 뿌리 조직물질의 중량을 측정하고, 그 조직을 액체 질소에 넣고 또 미세 분말로 만든다. 조직중량(g)의 2배에 해당하는 1부피(ml)의 냉 균질화 완충액(50mM NaH2PO4완충액 pH 7.0, 0.5mM EDTA pH 7.0, 0.5m, MgCl2, 1mM 피루브산 나트륨 pH 7.0, 10μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, 1mM 페닐메틸술포닐플루오라이드, 10% 글리세롤)을 부가하고 그 혼합물을 프렌치 압력 세포로 전달한다. 이 물질을 계속 냉각(약 4℃)한다. 이 세포를 16,000psi에서 파괴하고, 세포 삼출물을 모아 얼음상의 용기에 넣는다. 이와 달리, 프렌치 압력 세포 처리대신 조직을 절구와 막자에서 균질화 완충액과 함께 분쇄시킨다. 삼출액은 10,000rpm에서 5분간 원심분리되어 세포파편이 맑아진다. 상청액의 부피를 측정하고 또 효소등급 황산암모늄(144mg(NH4)2SO4/ml 상청액)을 부가하여 25% 포화로 조정한다. 혼합물을 얼음상에서 15분간 교반한 다음 10,000rpm 에서 5분간 교반한다. 펠릿을 제거하고 또 상청액을 황산 암모늄(158mg(NH4)2SO4/ml 상청액)으로 50% 포화되게 조정한다. 얼음상에서 15분간 교반한 후, 10,000rpm에서 5분간 원심분리시켜 펠릿을 수집한다. 수득된 펠릿을 2g의 잎 또는 5g의 뿌리 물질에 대한 칼럼 완충액 1ml 에 용해된다. 칼럼완충액(50mM NaH2PO4완충액 pH 7.0, 0.1mM EDTA, 0.5mM MgCl2, 10μM 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 10% 글리세롤)로 평형을 이룬 세파덱스 G50 칼럼에 부가되는 것에 의하여 추출물이 탈염된다. 이 시료를 칼럼 완충액으로 용출하고, 칼럼에 투여된 시료 각 ml당 2ml를 수집한다.
B. 관 분석법
실시예 68A에 따라 제조된 추출물 5 내지 50μl 를 반응 혼합물(20mM NaH2PO4완충액 pH 7.0, 20mM 피루브산 나트륨 pH 7.0, 0.5mM 티아민 파이로포스페이트, 5mM MgCl2, 10mM 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드) 총부피 0.5ml에 용해한다. 이 혼합물을 37℃에서 30분간 배양한다. 6N H2SO450μl를 부가하는 것에 의하여 반응을 중지시킨다. 이 혼합물을 60℃에서 15분동안 배양한 다음 α-나프톨시약(2.5N NaOH 내의 5% α-나프톨 500μl 및 25mg/ml 크레아틴 125μl) 625μl와 처리하고 또 60℃에서 15분동안 더 배양한다. 침전물이 형성되면, 이것을 회전시켜 분리하여 520mμ에서 흡수도를 측정한다. 형성된 아세토인의 피코몰(pMoles)은 0.4㎍ 내지 10㎍ 아세토인을 이용하여 형성된 표준곡선으로부터 계산된다. 비방사능은 pKat/mg 단백질로 표시된다.
C. 엘리사 평판 분석법
시료 1 내지 20μl를 반응혼합물 0.15ml의 전체부피로 엘리사 평판웰에 놓는다. 37℃에서 반응 혼합물을 30분간 반응시킨다. 1% 크레아틴을 함유하는 2.4M H2SO450μl를 부가하여 반응을 정지시킨다. 이 혼합물을 60℃에서 30분간 배양한다. 존재하는 침전물을 원심분리에 의하여 분리한다. 분석혼합물 150μl를 새로운 엘리사 평판으로 옮기고, 5M NaOH 내의 10% α-나프톨 100μl 와 처리하고 또 60℃에서 20분동안 더 배양한다. 520mμ에서 흡수도를 측정하고 또 실시예 68B 에서와 같이 비방사능을 표시한다.
[실시예 69] 화학적으로 유도가능한 DNA 서열에 대한 분석:
바실러스 투린지엔시스(Bacillus Thuringiensis) 내부독소
A. 식물 추출과정
약 100mg 의 식물조직을 0.1ml 추출완충액(50mM Na2CO3pH9.5, 10mM EDTA, 0.05% 트리톤 X-100, 0.05% 트윈(Tween), 100mM NaCl, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(사용하기 바로전에 부가됨) 및 1mM 로이펩틴(사용하기 바로전에 부가됨) 0.1ml에 균질화시킨다. 추출한 후, pH 8.0 내지 8.5로 조정하기 위해 2M 트리스 pH 7.0을 부가한다. 추출물을 베크만 마이크로퓨지에서 10분간 원심 분리시키고 상청액은 엘리사 분석에 이용한다.
B. 엘리사(ELISA)법
엘리사 평판을 에탄올로 전처리시킨다. 붕산염 완충된 염수(100mM 붕산 25mM 붕산나트륨, 75mM NaCl, pH 8.4내지 8.5) 내의 3㎍/ml 농도의 친화 정제된 토끼의 항-Bt 항혈청(50μl)을 평판에 부가하고 이것을 4℃에서 하룻밤동안 배양한다. 항혈청은 나트륨 도데실 술페이트로 기용화되는 경사 정제된 Bt(바실러스 투린지엔시스 내부독소) 결정 (Ang, B. J Nickerson, K, W., Appl. Environ. Microbiol, 36, 625-626(1978)으로 토끼를 면역화하는 것에 의하여 제조된다. 평판을 세척 완충액(10mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.05% Tween 20, 0.02% 아지드화나트륨)으로 세척하고, 이어 실온에더 차단 완충액 (10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4, 140mM NaCl, 1% 소혈청 알부민, 0.02% 아지드화 나트륨)으로 1시간 처리하고, 또 다시 세척한다. 이 식물 추출액은 단백질 50㎍을 낼 수 있는 양(전형적으로 약 5μl의 추출액; 단백질은 바이오 라드시로부터 시판되는 키트를 사용하여 브라드포트, 엠, Anal, Biochem. 72, 248(1976)의 방법에 의하여 측정된다)만큼 부가되고, 또 4℃에서 하룻밤동안 배양된다. 세척한후, 50μl 친화정제된 염소 항-Bt 항혈청을 엘리사 희석재(10mM 인산나트륨 완충액 pH 7.4, 140mM NaCl, 0.05% Tween 20, 1% 소혈청알부민, 0.02% 아지드화나트륨)에 3㎍/ml 단백질 농도로 부가하고 또 이것을 37℃에서 1시간 동안 배양한다. 세척한 후, 엘리사 희석재에 1:500으로 희석된 알칼리성 포스파타재에 결합된 50μl 토끼의 항-염소 항체를 부가하고 또 37℃에서 1시간 더 배양한다. 세척한 후, 50μl 기질(0.6mg/ml p-니트로페닐 포스페이트, 0.05mg/ml MgCl2, 10% 디에탄올아민, HCl로 pH9.8로 조정됨)을 부가하고 실온에서 30분간 배양한다. 3M NaOH 50μl를 부가하는 것에 의하여 반응을 중지시킨다. 변형된 엘리사(ELISA)판독기(미합중국 캘리포니아 스텐포드 휴렛 팩카드사제조)내 405mm에서 흡광도를 읽는다.

Claims (11)

  1. (a) 단리된 화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 성분 및 식물 또는 식물 조직에서 전사될 수 있고 표현형을 유발하는 외인성 DNA인 제 2 DNA 성분을 포함하는 키메라 DNA 분자로써 또는 상기 키메라 DNA 서열을 함유하는 벡터로써 숙주를 형질전환시키고;
    (b) 화학적 조절제를 상기 형질전환된 숙주에 투여하며; 또
    (c) 표현형 특징의 발현을 측정하는 것을 포함하는 화학적 조절제의 확인 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 형질전환된 숙주가 식물 조직 또는 식물 세포인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 키메라 DNA의 제 1 DNA 성분이 PR 단백질 유전자의 화학적으로 유도될 수 있는 서열이거나 또는 실질적인 서열 상동성을 갖는 화학적 유도성 서열인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 키메라 DNA의 제 1 DNA 성분 서열이 벤조-1,2,3-티아디아졸 또는 피리딘 카르복시산 구조를 포함하는 화합물에 의해 화학적으로 조절될 수 있는 화학적 유도성 서열인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 키메라 DNA에 의해 코딩되는 표현형 특징이 발달 상태, 불임. 질병 내성, 해충 내성, 제초제 내성, 2차 대사산물의 생산 및 분석가능한 효소 마커의 생산으로 구성된 군으로 부터 선정된 표현형 특징인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 키메라 DNA에 의해 코딩되는 표현형 특징이 분석가능한 효소 마커인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 효소 마커가 루시페라제(LUX), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPT), 노팔린 합성효소(NOS), 옥토핀합성효소(OCS), 베타-1,3-글루쿠로니다제(GUS), 아세토히드록시산 합성효소(AHAS), 또는 바실루스 투린지엔시스 내독소(BT)인 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 효소 마커가 베타-1,3-글루쿠로니다제(GUS)인 방법.
  9. 제 1 항에 따른 방법에 의해 확인된 화학적 조절제.
  10. (a) 단리된, 화학적으로 조절가능한 제 1 비코딩 DNA 성분 및 식물 또는 식물조직에서 전사될 수 있고 표현형을 초래하는 외인성 DNA인 제 2 DNA 성분을 포함하는 키메라 DNA 분자로써 또는 상기 키메라 DNA 서열을 함유하는 벡터로써 숙주를 형질전환시키고;
    (b) 화학적 조절제를 형질전환된 숙주에 투여하며; 또
    (c) 표현형 특징의 발현을 측정하는 것을 포함하는 화학적 조절제를 확인하기 위한 분석법.
  11. 제 10 항에 있어서, 표현형 특징의 발현을 측정하는 것이 1.5 내지 3 mM 4-메틸 움벨리페릴 글루쿠로니드를 함유하는 0.5ml 미만의 식물 조직 추출물을 37℃ 주변에서 1 내지 5 시간 동안 반응시키고 또 방출된 형광 지시제의 농도를 측정하는 것을 포함하는 베타-1,3-글루쿠로니다제(GUS) 활성을 확인하기 위한 분석법.
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