CN117965466A - Hppd蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草剂抗性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种HPPD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草剂抗性的方法，具体地，公开了一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因、一种重组载体、一种转基因细胞、一种组合物以及它们在提高作物除草剂抗性中的应用，还公开了提高作物除草剂抗性的方法。本发明提供的HPPD蛋白及其编码基因能够用于在酶本身的催化活性基本不受影响的前提下提高作物的除草剂抗性。

Description

HPPD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草 剂抗性的方法
本发明是申请日为2022年1月21日、专利申请号为202210070645.7、发明名称为“HPPD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草剂抗性的方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种HPPD蛋白、基因、载体、细胞、组合物及其应用、提高作物除草剂抗性的方法。
背景技术
HPPD是非血红素铁、α-酮酸依赖型加氧酶家族的一个成员，是酪氨酸代谢路径中的关键酶，能够将酪氨酸氨基转移酶的催化产物对羟苯基丙酮酸进一步催化生成尿黑酸。
在植物体内，尿黑酸是生物合成质体醌和生育酚的前体物质。质体醌不仅是八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因子，还是电子传递的载体，直接参与到光合作用中。而生育酚是细胞膜的结构组分之一，是细胞膜的抗氧化剂。一旦HPPD的活性被抑制，就会导致质体醌的合成减少，进而导致八氢番茄红素去饱和酶的催化过程受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成，最终使植物出现白化症状而死亡。所以，HPPD是一个重要的除草剂作用靶标。
目前，商品化的HPPD抑制剂除草剂已经有16余种。由于HPPD除草剂具有广谱、高效、使用安全、抗性增长缓慢等特点，已经受到越来越多农药化学研究者的关注，并且其年销售额在逐年增长。
抗除草剂作物在过去20年里，给农民和环境带来了巨大的利益，例如，抗草甘膦玉米和大豆作物等。因此，开发新的抗除草剂作物，如抗HPPD抑制剂类除草剂的作物，显得非常必要。
本领域已有一些对HPPD除草剂抗性基因的研究，这些研究大多是以来自各种菌的HPPD为研究对象，寻找其对除草剂具有抗性的突变位点，再将该外源突变基因导入经济作物体内以增强其对除草剂的耐受性。但是，以经济作物本身的HPPD蛋白为研究对象，在不改变其正常的催化功能的前提下，通过个别位点氨基酸残基的突变来增强其对除草剂的抗性的研究鲜见报道。因此，仍然有必要开发和改进对HPPD抑制剂的耐受性系统。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供对HPPD抑制剂具有抗性的HPPD蛋白及其编码基因及其应用。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，该蛋白具有选自以下至少一种的氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中选自418位点、423位点和432位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第一氨基酸序列；
(2)所述第一氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第一氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第一氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(3)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中422位点发生突变后衍生的第二氨基酸序列；
(4)所述第二氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第二氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第二氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(5)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第三氨基酸序列；
(6)所述第三氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第三氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第三氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(7)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中418位点发生突变后衍生的第四氨基酸序列；
(8)所述第四氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第四氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第四氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(9)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第五氨基酸序列；
(10)所述第五氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第五氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第五氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。
本发明第二方面提供一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，该基因的核苷酸序列为能够编码前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，该重组载体含有前述第二方面所述的基因。
本发明第四方面提供一种转基因细胞，该转基因细胞含有前述第二方面所述的基因。
本发明第五方面提供一种组合物，该组合物含有前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
本发明第六方面提供前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、前述第二方面所述的基因、前述第三方面所述的重组载体、前述第四方面所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
本发明第七方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：将前述第三方面所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
本发明第八方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有前述第三方面所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
本发明第九方面提供一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过CRISPR/Cas基因编辑方法对目标植物的HPPD基因进行改造，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
与现有技术相比，本发明提供的对HPPD抑制剂具有抗性的HPPD蛋白及其编码基因至少具有如下优势：
通过将编码本发明提供的基因转入目标植物中，能够使得目标植物获得对HPPD抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性基本不受影响。因此，本发明提供的HPPD蛋白及其编码基因能够用于培育具有除草剂抗性的植物。
本发明的其它特征和优点将通过随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)。
如前所述，本发明第一方面提供了一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，该蛋白具有选自以下至少一种的氨基酸序列：
(1)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中选自418位点、423位点和432位点中的至少一个位点发生突变后衍生的第一氨基酸序列；
(2)所述第一氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第一氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第一氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(3)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中422位点发生突变后衍生的第二氨基酸序列；
(4)所述第二氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第二氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第二氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(5)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第三氨基酸序列；
(6)所述第三氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第三氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第三氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(7)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中418位点发生突变后衍生的第四氨基酸序列；
(8)所述第四氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第四氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第四氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质；
(9)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中426位点发生突变后衍生的第五氨基酸序列；
(10)所述第五氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由第五氨基酸序列衍生的蛋白质，或者，在第五氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。
本发明中，酶活力不变是指在相同的测定条件下，由所述第一氨基酸序列、所述第二氨基酸序列、所述第三氨基酸序列、所述第四氨基酸序列、所述第五氨基酸序列衍生的蛋白质的酶活力与野生型的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。
优选地，所述第一氨基酸序列为选自以下至少一种的氨基酸序列：
(1a)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中418位点的赖氨酸突变为天冬氨酸后衍生的氨基酸序列；
(1b)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中423位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后衍生的氨基酸序列；
(1c)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中423位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺后衍生的氨基酸序列；
(1d)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中432位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后衍生的氨基酸序列；
(1e)如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中432位点的谷氨酸突变为异亮氨酸后衍生的氨基酸序列。
优选地，所述第一氨基酸序列为K418D、E423M、E423Q、E432M、E432I所示的氨基酸序列中的至少一种。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中418位点突变为天冬氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为K418D。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中423位点突变为甲硫氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E423M。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中423位点突变为谷氨酰胺所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E423Q。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中432位点突变为甲硫氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E432M。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中432位点突变为异亮氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E432I。
优选地，所述第二氨基酸序列为以下的氨基酸序列：
(2a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中422位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后衍生的氨基酸序列。
优选地，所述第二氨基酸序列为E422M所示的氨基酸序列。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中422位点突变为甲硫氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E422M。
优选地，所述第三氨基酸序列为以下的氨基酸序列：
(3a)如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中426位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后衍生的氨基酸序列。
优选地，所述第三氨基酸序列为E426M所示的氨基酸序列。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中426位点突变为甲硫氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E426M。
优选地，所述第四氨基酸序列为以下的氨基酸序列：
(4a)如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中418位点的谷氨酸突变为甲硫氨酸后衍生的氨基酸序列。
优选地，所述第四氨基酸序列为Q418M所示的氨基酸序列。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中418位点突变为甲硫氨酸所获得的蛋白的氨基酸序列，称为Q418M。
优选地，所述第五氨基酸序列为以下的氨基酸序列：
(5a)如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中426位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺后衍生的氨基酸序列。
优选地，所述第五氨基酸序列为E426Q所示的氨基酸序列。
根据本发明一种具体的实施方式，如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中426位点突变为谷氨酰胺所获得的蛋白的氨基酸序列，称为E426Q。
本发明中，获得上述蛋白的方法为本领域技术人员所公知，例如，在了解了所述蛋白的氨基酸序列的情况下，可以直接通过化学合成的方法获得，也可以先通过获得编码所述蛋白的基因，然后通过生物表达的方法获得所述蛋白。
本发明提供的所述蛋白还可以进行修饰。修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羟基化。修饰形式还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白，这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。
本发明中，为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对蛋白进行添加修饰，示例性地，可以通过在蛋白的氨基末端和/或羧基末端连接表1所示的常见纯化标签(如GST、Poly-His、FLAG、His-SUMO和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明提供的蛋白的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
表1
如前所述，本发明第二方面提供了一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，该基因的核苷酸序列为能够编码前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
优选地，该基因的核苷酸序列为选自以下至少一种的核苷酸序列：
(1)如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
(4)与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列；
(5)如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；
(6)与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列；
(7)如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；
(8)与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列；
(9)如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；
(10)与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性，优选至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、或至少99％同一性的核苷酸序列。
本发明中，本领域公知的是，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。
本领域人员根据公知的密码子表，从本发明提供的氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及蛋白的具体突变方式，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，并通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。
同样地，利用本发明提供的核苷酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10及蛋白的具体突变方式，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10，得到本发明提供的氨基酸序列。
本发明中，在获知上述蛋白及核苷酸序列SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10的基础上，本领域技术人能够容易的获得编码本发明提供的蛋白的基因。示例性地，可以在SEQ ID NO：6的基础上进行定点突变，所述定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法和/或CRISPR-Cas9等基因组定点突变方法。
本发明中，如第一方面所述，相应地，本发明提供的核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有表1所示的常见纯化标签的编码序列。
本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。示例性地，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得所述核苷酸序列。获得所述核苷酸序列后，就可以用重组法大批量的获得所述氨基酸序列。通常将所得到的所述核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到所述核苷酸序列。此外，还可以用本领域公知的人工化学合成的方法来合成所述核苷酸序列。
如前所述，本发明第三方面提供了一种重组载体，该重组载体含有前述第二方面所述的基因。
本发明中，所述重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，可以根据具体的情况进行选择，示例性地，可以为pGWC、pB2GW7.0或pET-28a等。重组载体构建可以采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，从而获得重组质粒。
如前所述，本发明第四方面提供了一种转基因细胞，该转基因细胞含有前述第二方面所述的基因。
优选地，所述转基因细胞为原核细胞。
本发明中，可以通过本领域已知的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，可以根据实际情况进行选择。所述细胞可以为DH5α菌株、农杆菌菌株GV3101等。
如前所述，本发明第五方面提供了一种组合物，该组合物含有前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
本发明提供的所述组合物含有本发明前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白作为活性成分，以所述组合物的总重量为基准，所述蛋白的含量为50-90重量％。所述组合物中还可以含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等蛋白保护剂)等。
如前所述，本发明第六方面提供了前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、前述第二方面所述的基因、前述第三方面所述的重组载体、前述第四方面所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
优选地，所述除草剂为HPPD抑制剂。
更优选地，所述除草剂为三酮类化合物、吡唑类化合物、异噁唑类化合物、二酮腈类化合物和杂环酰胺类化合物中的至少一种。
进一步优选地，所述除草剂为硝磺草酮、喹草酮、Y13287、Y18024和苯吡唑草酮中的至少一种，其中，Y13287(CN104557739A)和Y18024(CN110669016A)为本实验室自制的除草剂，上述化合物的分子结构式如下所示：
如前所述，本发明第七方面提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：将前述第三方面所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
如前所述，本发明第八方面提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有前述第三方面所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
如前所述，本发明第九方面提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：通过CRISPR/Cas基因编辑方法对目标植物的HPPD基因进行改造，使得目标植物表达前述第一方面所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
本发明中，将所述重组载体转入目标植物中具体是指：将本发明提供的具有除草剂抗性的蛋白的核苷酸序列，通过转基因的方法转入目标植物，使目标植物获得对HPPD抑制剂类除草剂的抗性；还可通过杂交、转育、回交等方法，将本发明提供的蛋白的核苷酸序列转入目标植物中，使目标植物获得对HPPD抑制剂类除草剂的抗性；此外，还可直接通过CRISPR/Cas等基因编辑技术对目标植物的HPPD基因进行改造，使目标植物获得对HPPD抑制剂类除草剂的抗性。更具体地，可将所述蛋白作为亲本材料，与其它优良植物品种杂交并进一步回交，把抗除草剂性状进一步转育到其它目标植物品种中。
本发明采用的转基因方法为本领域技术人员所公知，所述转基因方法包括直接或间接的转化方法，直接转化方法包括化学物质诱导法、脂质体法、基因枪法、电穿孔法及微注射法等。
本发明中，术语“植物”具有最广泛的意义，植物的实例包括但不限于，维管束植物、蔬菜、粮食、花卉、乔木、草本植物、灌木、草类、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌及藻类等，以及用于无性繁殖的克隆及植物部分(例如插条、压条、嫩枝、根茎、地下茎、丛生秆、根颈、鳞茎、球茎、块茎、根茎、组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”进一步涵盖整个植物、植物亲代及后代、以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、肉茎、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞、及植物的任何其它已知器官、组织和细胞、以及组织和器官。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉及小孢子。其中，以上所提及的均包括本发明提供的目的基因/核酸。
尤其适用于本发明方法中的植物包括属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括粮食作物、饲料或草料豆科植物、观赏植物、乔木或灌木。
根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例尤其包括水稻、小麦、玉米、高粱、大豆、向日葵、油菜、苜蓿、棉花、蕃茄、马铃薯或烟草。更优选地，作物植物为谷物，例如水稻、小麦、玉米、高梁、大麦、粟、黑麦或燕麦。
本发明取得的有益效果在于获得能够替代现有技术的使植物具有除草剂抗性的蛋白、基因、重组载体、转基因细胞、组合物、植物，获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法，并且能够通过转基因或非转基因方法获得具有除草剂抗性的植物品种。
以下将通过实例对本发明进行详细描述。
以下实例中，如无特殊说明，室温均表示25±2℃。
以下实例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法。
以下实例中，在没有特别说明的情况下，涉及到的材料、试剂等均可从商业途径得到。
琼脂糖凝胶回收试剂盒购于TIANGEN公司；
限制性内切酶及配套溶液购于Takara公司；
连接试剂盒购于New England BioLabs。
实施例1
编码基因及核苷酸序列的合成
以下编码基因及核苷酸序列均由武汉金开瑞生物工程有限公司根据本发明提供的所述核苷酸序列合成。
(1)SEQ ID NO：6
根据SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列合成如表2所示蛋白的编码基因以及SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列。
表2
蛋白质 编码基因 突变位点密码子
SEQ ID NO：1 WT(野生型) /
K418D K418D GAT
E423M E423M ATG
E423Q E423Q CAG
E432M E432M ATG
E432I E432I ATT
(2)SEQ ID NO：7
根据SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列合成如表3所示蛋白的编码基因以及SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列。
表3
蛋白质 编码基因 突变位点密码子
SEQ ID NO：2 WT(野生型) /
E422M E422M ATG
(3)SEQ ID NO：8
根据SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列合成如表4所示蛋白的编码基因以及SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列。
表4
蛋白质 编码基因 突变位点密码子
SEQ ID NO：3 WT(野生型) /
E426M E426M ATG
(4)SEQ ID NO：9
根据SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列合成如表5所示蛋白的编码基因以及SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列。
表5
蛋白质 编码基因 突变位点密码子
SEQ ID NO：4 WT(野生型) /
Q418M Q418M ATG
(5)SEQ ID NO：10
根据SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列合成如表6所示蛋白的编码基因以及SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列。
表6
蛋白质 编码基因 突变位点密码子
SEQ ID NO：5 WT(野生型) /
E426Q E426Q CAG
实施例2
表达载体的构建
(1)目的基因的扩增
分别以SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10的核苷酸序列为模板，通过PCR反应获取如表2、3、4、5、6所示的HPPD的野生型及突变体基因序列，并连接到相应的载体中。
PCR反应体系和PCR程序设置分别如下所示：
表7
PCR反应体系组成 加入量(体积)
10×PCR缓冲液 5μL
5×dNTP(10mM) 1μL
模版 1μL
正向引物 1.0μL
方向引物 1.0μL
PfuDNA polymerase 0.5μL
dd H2O 至总体积50μL
表8
步骤 温度(℃) 时间(s)
1 95 240
2 95 45
3 55 45
4 72 400
5 72 600
6 4 保存
其中，72℃的延伸时间视具体的片段长度及所用酶的效率而定。上述程序中的步骤2～4重复做25个循环。
(2)核酸琼脂糖凝胶电泳及胶回收PCR产物
a.称取1g琼脂糖于锥形瓶内，加入100mL的1×TAE溶液(配成50倍的储液，配制方法：称量Tris 242g，EDTA 18.6g于1L烧杯中；加入约800mL去离子水，搅拌；加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存，下同)，放入微波炉加热，待琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至不烫手后加入5μL溴化乙锭溶液，混匀后倒入已放好梳子的制胶槽中，让其冷却凝固；
b.临用前拔掉梳子，将胶放入电泳槽内，加入适量1×TAE溶液；将样品加入到孔中，盖上盖子开始电泳，待溴酚蓝移动至距底部1/3处停止电泳；
c.将目的条带切下，放入干净的1.5mL EP管中并进行胶回收；胶回收所用的试剂盒购于TIANGEN公司(货号DP209)；按照100mg胶对应300μL溶胶溶液PN(试剂盒提供)的量来操作，并于50℃水浴槽中温育，期间不断上下颠倒混匀，帮助胶溶解；
d.将c中的溶液加入到预处理的吸附柱(试剂盒提供)中，室温静置5min，使其充分结合，再在12000rpm下离心1min；
e.倒出收集管中的液体，重复一次d的步骤，以增加产物的回收率；
f.向纯化柱中加入500μL的漂洗溶液PW(试剂盒提供)，在12000rpm下离心1min；将此操作步骤重复一次；
g.再将吸附柱在13000rpm下离心2min，尽量将PW溶液除干净；
h.将纯化柱放入一个新的EP管中，65℃加热放置10min，将PW溶液挥发干净；
i.将50μL的洗脱溶液(试剂盒提供)滴加到吸附柱的中间位置，并在65℃加热台上放置2min，在13000rpm下离心2min洗脱DNA；将此操作步骤重复一次；
j.最后将回收到的PCR产物置于-20℃条件下保存。
(3)酶切反应
电泳验证得到大小片段正确的DNA后，对载体和PCR产物进行双酶切(酶切溶液随限制性内切酶一起配套购买)。酶切体系如表9所示：
表9
组分 体积(μL)
PCR产物/载体 43
10×Cutsmart溶液 5
BamHI 1
XhoI 1
于37℃孵育3h后进行电泳并采用胶回收试剂盒回收；为了提高切载体的效率，多加1.5μL限制性内切酶并延长5h酶切时间。
(4)连接反应
将回收得到的基因片段按以下体系进行连接，连接所用试剂Solution 1(包含了T4 DNA连接酶及配套缓冲液)购买于New England BioLabs(货号#M0202S)，然后于16℃恒温孵育5h以上。连接体系如表10所示：
表10
成分 体积(μL)
Solution 1 8
目的片段 7
载体 1
(5)转化
连接完成后，将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞(购于Promega公司，产品编号ST1105)中培养，具体步骤如下：
a.取出一管感受态细胞置于冰上融化10min；
b.向感受态细胞中加入连接产物，混匀，并在冰上静置30min；
c.于42℃热击90s，再于冰上放置2min；
d.向管中加入200μL的Luria-Bertani(LB)培养基(不含抗生素)，于37℃、220rpm培养30min；将带相应抗性的固体LB平板拿到室温预热；
e.取出菌液均匀涂布在平板上，并于37℃恒温箱中培养16h。
(6)测序
从培养16h的平板上的单克隆中挑选一些转移到一个干净的平板上，并在37℃培养5h，然后送武汉金开瑞生物工程有限公司进行测序；待反馈测序结果后，进行序列比对，以确认正确的克隆。
实施例3
目标蛋白的表达和纯化
(1)表达
先对蛋白进行小提，摸索最佳表达条件和纯化策略，等条件确定再进行大量提取。蛋白表达在大肠杆菌BL21(DE3)细胞(购于康体生命科技有限公司，产品编号KTSM109)中进行，流程如下：
a.在培养16h的平板上挑取单克隆加入到100mL含所需抗性抗生素的LB培养基中，在37℃、220rpm下培养5h，即观察到明显的浑浊；
b.按1:100体积比将步骤a中的小瓶菌种扩大到大瓶LB培养基(含抗生素)中，并在37℃、220rpm下培养3h；待OD600值达到0.7h，把温度降到20℃后加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导时间为14h；
c.在4℃、4000rpm下离心10min，将菌收集起来，用于纯化蛋白。
(2)纯化
a.用细胞裂解溶液将收集的大肠杆菌重悬，细胞裂解溶液与收集大肠杆菌的LB培养液按照体积比为30mL：1L的比例进行；在磁力搅拌器上搅拌20min，使细胞混匀，期间加入丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)1mM、裂解细菌细胞壁的溶菌酶40μg/mL、分解核酸的脱氧核糖核酸酶I1μg/mL以及辅因子MgCl2 10mM；然后进行超声破碎；
b.超声完毕后在13000rpm、4℃下离心1h，收集上清液用于亲和层析；蛋白纯化在4℃恒温室进行；
c.先将离心后的上清液倒入处理好的Ni柱进行充分结合；然后用含不同浓度(10mM、30mM、50mM)咪唑的溶液进行冲洗以除去杂蛋白；最后用含高浓度(250mM)的咪唑溶液洗脱目的蛋白；然后通过SDS-PAGE进行结果分析；
d.将亲和层析后的蛋白进行稀释并上到离子交换柱中，上样完成后，用含NaCl缓冲溶液(缓冲溶液为Tris，pH值为7.0)进行线性梯度(NaCl从0到500mM)洗脱，该步骤借助蛋白纯化仪完成；跑SDS-PAGE进行结果分析，并将性质、纯度较好的蛋白合并、浓缩，用于下一步的分子筛层析；
e.分子筛层析上样前需要在13000rpm下离心5min以去除部分沉淀的蛋白和去除杂质，再用注射器将样品送到上样环中；然后用洗脱缓冲液(含100mM NaCl，Tris，pH值为7.0)对蛋白进行洗脱，收集样品时每管0.5mL；再用SDS-PAGE对蛋白进行检测分析，对需要保存的蛋白进行合并，然后分装冻存；测活性用的蛋白，要加入终浓度为30体积％的甘油保存。
测试例1
除草剂抑制动力学研究
采用偶联酶活性测试方法，测定在饱和的底物浓度下，不同浓度的抑制剂对酶的抑制动力学。
具体的测试方法步骤如下：
a.缓冲溶液、底物及辅因子的配制：
测活HEPES缓冲液：先配制浓度为1M的储液，用氢氧化钠调节其pH值至7.0，临用前稀释至20mM，并用0.22μm的滤膜过滤；
底物HPPA(对羟苯基丙酮酸)的配制：先用DMSO配制成浓度为100mM的储液，临用前用测活缓冲液稀释；
抗坏血酸钠的配制：用去离子水配制成20mM的浓度。保存于-80℃条件；
硫酸亚铁的配制：用去离子水配制成1mM的浓度。保存于-80℃条件；
抑制剂的配制：用DMSO配制成浓度为10mM的储液，临用前用测活缓冲液逐级稀释至不同浓度，以保证每个孔里加入的抑制剂的体积相同；
b.偶联酶HGD(尿黑酸双加氧酶)的制备：HGD的表达载体构建和“实施例2表达载体的构建”方法一致，此处采用的是人源HGD；HGD蛋白的表达方法和“实施例3目标蛋白的表达和纯化”的方法一致，但是测活用的HGD没有进行后续的纯化，而是直接采用细胞裂解液上清液；
c.开始测活之前需要对HGD的用量进行摸索，当HGD不足时会使反应不能很好的偶联，使测得的反应速度不能真实的反应HPPD的活力；所以，需要做一个HGD浓度的依赖型实验，当增加HGD量时反应速度不再增加，认为此时HGD用量饱和；并在饱和用量上再增加一倍，以确保反应的充分偶联；
d.测试时，先将测活缓冲液(20mM)、底物(50μM)、抗坏血酸钠(2mM)、硫酸亚铁(100μM)、偶联酶HGD混合，并于30℃孵育5min，然后加入到96孔酶标板中(平行3个孔)，再向上述孔中分别加入不同浓度的抑制剂。其中，不加抑制剂的孔用测活缓冲液和1μL的DMSO补齐体积(作为对照)；最后，加入HPPD来启动反应，HPPD需要提前5min于30℃孵育；
e.先将酶标板放入仪器内震荡15s，再读取318nm下的紫外吸收值，间隔30s读一次，共监测10min。重复三次。
本测试例中检测了2类具有代表性的商品化除草剂：三酮类(硝磺草酮、喹草酮、Y18024和Y13287)、吡唑类(苯吡唑草酮)，分别测试了水稻、小麦、高粱、玉米、拟南芥的HPPD蛋白的抑制动力学(IC50)结果，具体分别如表11、表12、表13、表14和表15所示。
对照：指在酶反应体系中加入底物和1μL的DMSO(溶解抑制剂的有机溶剂，总体系为200μL)，将其看作酶在没有抑制剂的存在下的全活性。
样品：在酶反应体系中加入不同浓度的抑制剂，观察抑制剂对酶活性的影响。
数据处理：
IC50值根据以下公式拟合得到：
在上式中：
y——在对应浓度抑制剂存在下残留活性与未加抑制剂活性的百分比；
max、min——相对活性的最大值和最小值；
x——对应抑制剂浓度；
IC50——酶残留活性为50％时相对应抑制剂浓度。
为了比较野生型和各个突变体对不同化合物的抗性倍数，于是在测试时将同一种属的野生型和突变体的蛋白浓度调节到一致来进行测试。如，表11中，各个蛋白(包括野生型和突变体K418D、E423M、E423Q、E432M、E432I)的浓度为22.5nM。表12中，各个蛋白(包括野生型和突变体E422M)的浓度为22.5nM。表13中，各个蛋白(包括野生型和突变体E426M)的浓度为26.2nM。表14中，各个蛋白(包括野生型和突变体Q418M)的浓度为18.0nM。表15中，各个蛋白(包括野生型和突变体E426Q)的浓度为36.0nM。
为得到相对抗性倍数，将各个化合物对野生型的IC50值作为基准，相对抗性倍数定为1.000。突变体相对野生型的抗性倍数为：化合物对突变体的IC50值除以野生型的IC50值。如，表11中，硝磺草酮对野生型水稻HPPD的IC50值为0.236μM，将其相对抗性倍数定为1.000；硝磺草酮对水稻HPPD突变体K418D的IC50值为0.501μM，则该突变体相对野生型的抗性倍数为：0.501/0.236＝2.12倍；以此类推其他化合物、突变体、不同种属的结果。
表11水稻HPPD突变体的抑制动力学(IC50)结果和抗性倍数
在上表中，K418D指的是水稻HPPD第418位的突变体，由赖氨酸突变为天冬氨酸；E423M指的是水稻HPPD第423位的突变体，由谷氨酸突变为蛋氨酸；E423Q指的是水稻HPPD第423位的突变体，由谷氨酸突变为谷氨酰胺；E432M指的是水稻HPPD第432位的突变体，由谷氨酸突变为蛋氨酸；E432I指的是水稻HPPD第432位的突变体，由谷氨酸突变为异亮氨酸。
表12小麦HPPD突变体的抑制动力学(IC50)结果和抗性倍数
在上表中，E422M指的是小麦HPPD第422位的突变体，由谷氨酸突变为蛋氨酸。
表13高粱HPPD突变体的抑制动力学(IC50)结果和抗性倍数
在上表中，E426M指的是高粱HPPD第426位的突变体，由谷氨酸突变为蛋氨酸。
表14玉米HPPD突变体的抑制动力学(IC50)结果和抗性倍数
在上表中，Q418M指的是玉米HPPD第418位的突变体，由谷氨酰胺突变为蛋氨酸。
表15拟南芥HPPD突变体的抑制动力学(IC50)结果和抗性倍数
在上表中，E426Q指的是拟南芥HPPD第426位的突变体，由谷氨酸突变为谷氨酰胺。
由测试的结果可知，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的418位点的突变(K418D)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.6～2.6倍(相对于野生型)；SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的423位点的突变(E423M、E423Q)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.4～2.1倍(相对于野生型)；SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的432位点的突变(E432M、E432I)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.5～2.9倍(相对于野生型)；SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中的422位点的突变(E422M)，其对各抑制剂的抗性倍数为2.6～4.0倍(相对于野生型)；SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列中的426位点的突变(E426M)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.0～1.5倍(相对于野生型)，“无”表示没有抗性，即抑制剂对突变体的IC50值小于野生型的IC50值；SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列中的418位点的突变(Q418M)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.4～2.1倍(相对于野生型)；SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中的426位点的突变(E426Q)，其对各抑制剂的抗性倍数为1.2～1.9倍(相对于野生型)。抑制剂对本发明提供的HPPD蛋白的抑制活性减弱，也即，本发明提供的HPPD蛋白对除草剂不敏感。因此，本发明提供的HPPD蛋白能够用于提高作物的除草剂抗性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如第五氨基酸序列所示；所述第五氨基酸序列为如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列中426位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺后的氨基酸序列。
2.一种编码对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为能够编码权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。
4.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因；所述转基因细胞为原核细胞。
5.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白。
6.权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的转基因细胞中的至少一种在提高作物除草剂抗性中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述除草剂为HPPD抑制剂。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述除草剂为三酮类化合物、吡唑类化合物中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述除草剂为硝磺草酮、喹草酮、Y13287、Y18024和苯吡唑草酮中的至少一种。
10.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求3所述的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
11.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过杂交、转育或回交，将含有权利要求3所述的重组载体的突变作物中的重组载体转入目标植物中，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
12.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：通过CRISPR/Cas基因编辑方法对目标植物的HPPD基因进行改造，使得目标植物表达权利要求1所述的对羟苯基丙酮酸双加氧酶蛋白，以获得对除草剂的抗性。
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