JP2023539956A - 除草剤耐性を付与するｃｙｐ８１ｅ遺伝子 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物または植物部分に関するものであり、ポリヌクレオチドの発現は、２，４－Ｄなどの合成オーキシン除草剤に対する耐性を植物または植物部分に付与する。本開示は、除草剤抵抗性植物を特定するためのキット、および植物が除草剤抵抗性であるかどうかを判定するための方法をさらに提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月１日に出願された米国仮出願第６３／０７３，２７６号に基づく優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、電子的提出を介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出している配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ１３６７３ＷＯＯＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと命名され、６９，９８７バイトのサイズである。

本開示は、全体として、植物に除草剤に対する耐性を付与するための組成物および方法に関する。

防除されず放置された雑草によって、現行の北米の農業システムでは、主要ないくつかの作物の収量は５０％を超えて低下するおそれがある。合衆国の多くの栽培者は現在、雑草の集団を防除するために化学的手段（すなわち除草剤）に大きく依拠しているが、除草剤抵抗性雑草の数が増えていることに起因して、このアプローチの有効性は徐々に減退している。除草剤抵抗性は１９５０年代後半から合衆国に存在していたが、一方、１９９０年代半ばに除草剤耐性作物品種が広く受け入れられたこと、および１つまたは２つの除草作用様式へ過度に依存したことが、過去２０年にわたり抵抗性雑草種の数の指数関数的増大の原因となった。合衆国には現在、１６４種の雑草が存在するが、１つまたは複数の作用様式にまたがる除草剤に対する抵抗性が文書で記録されている状況である。

雑草がいかように除草剤化合物に対処して損傷を回避するのか、ということを理解することは、回避策を生み出して除草剤抵抗性と闘うことと、植物の進化への洞察を得ることの両方のための、雑草科学の主要な目標である。過去数十年にわたる除草剤抵抗性メカニズムに関する研究は、除草剤によって直接阻害される標的酵素をコードする遺伝子内で生じる突然変異（標的部位抵抗性）に大きく焦点を絞ってきた。ごく最近になって、非標的部位に基づく抵抗性（ＮＴＳＲ）メカニズムに関して著しい進展があったが、主に、ハイスループットの全ゲノム／トランスクリプトーム解析の可用性の向上によるものである。この研究では、ＮＴＳＲの主要な経路として除草剤代謝の増強が大きく指摘されているが、転座の減少および液胞隔離を始めとした抵抗性メカニズムも報告されている。雑草を防除する除草剤を幅広く使用することにより、強力な選抜への植物の急速な適応を研究するための、およびゲノミクスの進歩によりますます扱いやすくなっている進化上の問題に対処するための、卓越したプラットフォームがもたらされる。

ヒユモドキ（Amaranthus tuberculatus）は、その高い繁殖力と除草剤に対する抵抗性を容易に進化させる能力の両方に起因して、合衆国中西部全域の栽培者にとって高度に問題を含む雑草種である。１９９３年のヒユモドキにおけるＡＬＳ（アセト乳酸合成酵素）阻害剤抵抗性に関する報告以来、本種はさらなる６つの作用部位にまたがる除草剤に対する抵抗性を蓄積してきた。２０１６年にＩｌｌｉｎｏｉｓにおいて発見された集団は、光化学系ＩＩ阻害剤、ＰＰＯ（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）阻害剤、ＨＰＰＤ（４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）阻害剤、および合成オーキシンに対する抵抗性を含めて、５様式の抵抗性を担持していた。抵抗性形質のうちの２つ（ＡＬＳおよびＰＰＯ）は、標的部位の突然変異に原因があることが見出されたが、ＨＰＰＤ阻害剤と合成オーキシンの抵抗性メカニズムの両方が不明であった。２０１２年に、Ｎｅｂｒａｓｋａから報告された集団は、２，４－Ｄに対して高度に抵抗性であるとともに、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対しても耐性であると次いで判定された。

除草剤耐性植物は、複数のそのような植物が植えられ、そのような植物により作物を生産することができるシステムにおいて有用であり、定植前または定植後のいずれでも、普通なら当該植物を枯死させるかまたは害するはずである除草剤が、当該除草剤に対する当該植物の耐性を理由として、施用される。望ましくない植物は枯死するかまたは損傷を受けるが、耐性のある植物は生存する。そのような植物を作出することが必要である。

植物、植物部分、および植物細胞に除草剤耐性を付与するための組成物および方法が提供される。除草剤に対して耐性を有する改変された植物であって、改変された植物は、改変されていない植物と比べて、シトクロムＰ４５０ ８１Ｅ（ＣＹＰ８１Ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの向上した発現を含む、改変された植物が提供される。ある特定の実施形態では、改変された植物は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。改変された植物の子孫、植物部分、および植物細胞も提供される。

（ａ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｂ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列を含む、除草剤耐性を付与することができる核酸分子が提供される。

前述の核酸分子を含む発現カセット、ベクター、生体試料、植物、植物部分、および植物細胞も提供される。

配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＹＰ８１Ｅポリペプチドが提供される。

除草剤耐性を備える植物を作出するための方法であって、植物においてＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を向上させることを含み、ここで、植物の除草剤耐性は、向上した発現を欠く植物と比較した場合に向上している、方法が提供される。ある特定の実施形態では、方法は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、ポリヌクレオチドが植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、導入することと；植物細胞から植物を再生することと、を含む。

植物栽培現場で望ましくない植生を防除するための方法であって、
ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物を植物栽培現場にて提供することであって、ポリヌクレオチドの発現が除草剤に対する耐性を植物に付与する、提供することと；
除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、を含む方法が提供される。

植物栽培現場にて除草剤抵抗性雑草の生長を防除するための方法であって、
ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現または活性を低減させるポリヌクレオチドを含む組成物と雑草を接触させることと；
除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、
を含む方法が提供される。

前述の植物、植物部分、および植物細胞から調製された産物であって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、産物が提供される。
植物性産物を生産するための方法であって、前述の植物または植物部分を加工して植物性産物を得ることを含み、ここで、植物性産物が、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、方法も提供される。

除草剤抵抗性植物を特定するための方法であって、
除草剤抵抗性を有するらしいと推察される植物由来の生体試料を用意することと；
生体試料中のＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することであって、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子が、同種の除草剤感受性植物と比較して除草剤抵抗性植物において差次的に発現する、定量化することと；
定量化に基づいて、植物が除草剤抵抗性であることを判定することと、を含む方法が提供される。

除草剤抵抗性植物を特定するためのキットであって、
少なくとも２つのプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマーが、同種の除草剤感受性植物と比較して、除草剤抵抗性植物において差次的に発現するＣＹＰ８１Ｅ遺伝子を認識する、キットも提供される。

複数の実施形態が開示されているが、本発明のさらにその他の実施形態が、本発明の例示的な実施形態を示しかつ説明する、以下の発明を実施するための形態から、当業者であれば明らかになるであろう。したがって、図面および発明を実施するための形態は、本質的に例示的なものであり、限定的なものではないと見なされたい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の実施形態または様々な態様を更に実証するために含まれる。いくつかの場合において、本発明の実施形態は、添付の図面を本明細書に提示されている発明を実施するための形態と組み合わせて参照することによって、最も良く理解することができる。発明を実施するための形態および添付の図面は、本発明のある特定の実施例またはある特定の態様を強調することがある。しかし、当業者であれば、その実施例または態様の一部が、本発明のその他の実施例または態様と組み合わせて使用される場合もあることを理解するであろう。

図１は、実験計画の概略図である。各Ｆ_２集団内で、植物をクローン化し、これに高量および低量のテンボトリオンまたは２，４－Ｄを噴霧した。それらの応答に基づいて、植物それぞれを４つのカテゴリの１つにグループ化した：ＲＲ、２，４－Ｄとテンボトリオンの両方に対して抵抗性；ＲＳ、２，４－Ｄに対して抵抗性およびテンボトリオンに感受性；ＳＲ、２，４－Ｄに感受性およびテンボトリオンに対して抵抗性；ＳＳ、２，４－Ｄとテンボトリオンの両方に感受性。ＲＮＡ－ｓｅｑ解析用に、各カテゴリから最も耐性の／感受性の４つの植物体を選んだ。これにより、各集団について１６の植物体のみを使用して、各除草剤について抵抗性植物と感受性植物の間でＮ＝８の比較が可能となった。 図２Ａ～Ｂに、有意に差次的に発現した遺伝子および有意なＳＮＰのスライディングウィンドウグラフを示す。図２Ａに、ヒユモドキゲノム上でマッピングされたＣＨＲおよびＮＥＢにおける２，４－Ｄ抵抗性植物と感受性植物の間で有意に差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を示す。ＦＤＲ０．０５以下の遺伝子のみを有意であるとした。図２Ｂに、ヒユモドキゲノム上でマッピングされたＣＨＲおよびＮＥＢにおける２，４－Ｄ抵抗性植物と感受性植物の間で統計的に異なった一塩基多型（ＳＮＰ）を示す。ＰＬＩＮＫ解析が補正済みｐ値０．０５以下を返した場合、統計的に有意なＳＮＰであると呼んだ。 図２Ａ～Ｂに、有意に差次的に発現した遺伝子および有意なＳＮＰのスライディングウィンドウグラフを示す。図２Ａに、ヒユモドキゲノム上でマッピングされたＣＨＲおよびＮＥＢにおける２，４－Ｄ抵抗性植物と感受性植物の間で有意に差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を示す。ＦＤＲ０．０５以下の遺伝子のみを有意であるとした。図２Ｂに、ヒユモドキゲノム上でマッピングされたＣＨＲおよびＮＥＢにおける２，４－Ｄ抵抗性植物と感受性植物の間で統計的に異なった一塩基多型（ＳＮＰ）を示す。ＰＬＩＮＫ解析が補正済みｐ値０．０５以下を返した場合、統計的に有意なＳＮＰであると呼んだ。 図３Ａ～Ｂに、ＮＥＢ集団（図３Ａ）およびＣＨＲ集団（図３Ｂ）のスカフォールド４ホットスポット領域におけるすべてのＳＮＰの対立遺伝子特異的発現を示す。各ＳＮＰの位置をｘ軸上に与え、Ｒ対立遺伝子とＳ対立遺伝子の間の差次的発現のｔ検定の結果（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの調整済みＰ値）を、各遺伝子座のバーの上に与える。 図３Ａ～Ｂに、ＮＥＢ集団（図３Ａ）およびＣＨＲ集団（図３Ｂ）のスカフォールド４ホットスポット領域におけるすべてのＳＮＰの対立遺伝子特異的発現を示す。各ＳＮＰの位置をｘ軸上に与え、Ｒ対立遺伝子とＳ対立遺伝子の間の差次的発現のｔ検定の結果（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇの調整済みＰ値）を、各遺伝子座のバーの上に与える。 図４に、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｎｅｂｒａｓｋａ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉおよびカナダからのヒユモドキ集団の任意のサブセットにおけるシトクロムＰ４５０ ８１Ｅ８の系統樹を示す。本研究からの試料は、それらの集団名（「ＣＨＲ」または「ＮＥＢ」）ならびにそれらの２，４－Ｄ表現型応答で指示されている。数字または「Ｎ３」で始まる試料はＯｎｔａｒｉｏを起源とし、「Ｂ」、「Ｆ」、「Ｊ」、または「Ｋ」で始まる試料はＩｌｌｉｎｏｉｓおよびＭｉｓｓｏｕｒｉを起源とした。

ヒユモドキは、合衆国中西部全域の複数の州で、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）および４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤に対する抵抗性を進化させてきた。Ｎｅｂｒａｓｋａ（ＮＥＢ）由来の一集団とＩｌｌｉｎｏｉｓ（ＣＨＲ）由来の一集団の両方の作用機序グループに対して抵抗性の２つの集団について、Ｆ_２マッピング集団へのＲＮＡ－ｓｅｑアプローチを使用して研究し、その結果、抵抗性の原因である遺伝子を特定した。

本発明をより容易に理解することができるように、ある特定の用語について最初に定義する。別途定義しない限り、本明細書で使用されるあらゆる専門用語および科学用語は、本発明の実施形態が属する当業者によって一般に理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の、修正された、または等価の多くの方法および材料を、過度な実験をすることなく本発明の実施形態の実施において使用することができ、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。本発明の実施形態を説明および特許を請求するにあたり、以下の専門用語を下記の定義に従って使用する。

本明細書で使用されるあらゆる専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、任意の様式または範囲に制限されるとは意図されないことを理解されたい。例えば、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含み得る。同様に、「または」という語は、文脈が明らかにそうでないことを示していない限り「および」を含むことが、意図される。「または」という語は、個々のリストの任意の一つのメンバを意味し、当該リストのメンバの任意の組合せも含む。さらに、あらゆる単位、接頭辞、および記号は、そのＳＩで認証された形態で表示することができる。

本明細書内に記載されている数値範囲は、範囲を定義する数を含み、定義された範囲内のそれぞれの整数を含む。本開示の全体にわたって、本発明の様々な態様を範囲形式で提示する。範囲形式での記載は単に便宜性および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、当該範囲内の全ての可能性のある部分範囲、分数、および個々の数値を具体的に開示したものとみなされたい。例えば、１から６までなどの範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６まで等などの部分範囲、さらには、当該範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、および６、ならびに小数および分数、例えば、１．２、３．８、１^１／_２、および４^３／_４、を具体的に開示したものとみなされたい。このことは範囲の幅に関係なくあてはまる。

本明細書で使用されるような、「約」という用語は、それらに限定されないが、質量、容量、時間、および温度を含めて、定量化可能な任意の変数に関して、例えば通例の測定技法および設備をとおして生じ得る数量の変動を指す。さらに、実際に使用される固体および液体の処理手順を考慮すると、組成物を作製するのにまたは方法を実施するのに使用される成分の製造、供給源、または純度における差異等を通して可能性がある、ある特定の偶発性の誤差および変動が存在する。「約」という用語は、こういった変動も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、数量に等価物を含める。

本明細書で使用される場合、「付与する」という用語は、植物に除草剤耐性または抵抗性および／またはその他の望ましい形質などの、特徴または形質をもたらすことを指す。

「望まれない植生または雑草の防除」という用語は、雑草を枯死させること、および／またはさもなければ雑草の正常な生長を遅延させるかもしくは阻害することを意味すると理解されたい。雑草とは、最も広い意味で、それらが望まれない場所で生長するすべての植物を意味すると理解される。本開示の雑草には、例えば、双子葉植物および単子葉植物の雑草が含まれる。双子葉植物の雑草には、それらに限定されないが、以下の各属の雑草が含まれる：シロガラシ属（Sinapis）、レピジウム属（Lepidium）、ガリウム属（Galium）、ハコベ属（Stellaria）、マトリカリア属（Matricaria）、アンセミス属（Anthemis）、コゴメギク属（Galinsoga）、アカザ属（Chenopodium）、イラクサ属（Urtica）、キオン属（Senecio）、アマランサス属（Amaranthus）、スベリヒユ属（Portulaca）、オナモミ属（Xanthium）、コンボルブルス属（Convolvulus）、サツマイモ属（Ipomoea）、タデ属（Polygonum）、セスバニア属（Sesbania）、アンブロシア属（Ambrosia）、アザミ属（Cirsium）、ヒレアザミ属（Carduus）、ノゲシ属（Sonchus）、ナス属（Solanum）、イヌガラシ属（Rorippa）、キカシグサ属（Rotala）、アゼナ属（Lindernia）、ラミウム属（Lamium）、ベロニカ属（Veronica）、アブチロン属（Abutilon）、エメックス属（Emex）、チョウセンアサガオ属（Datura）、ビオラ属（Viola）、ガレオプシス属（Galeopsis）、ケシ属（Papaver）、ヤグルマギク属（Centaurea）、シャジクソウ属（Trifolium）、キンポウゲ属（Ranunculus）、およびタンポポ属（Taraxacum）。単子葉植物の雑草には、それらに限定されないが、以下の各属の雑草が含まれる：ヒエ属（Echinochloa）、エノコログサ属（Setaria）、キビ属（Panicum）、メヒシバ属（Digitaria）、アワガエリ属（Phleum）、イチゴツナギ属（Poa）、ウシノケグサ属（Festuca）、オヒシバ属（Eleusine）、ブラキアリア属（Brachiaria）、ドクムギ属（Lolium）、スズメノチャヒキ属（Bromus）、カラスムギ属（Avena）、カヤツリグサ属（Cyperus）、モロコシ属（Sorghum）、コムギダマシ属（Agropyron）、ギョウギシバ属（Cynodon）、ミズアオイ属（Monochoria）、テンツキ属（Fimbristyslis）、オモダカ属（Sagittaria）、ハリイ属（Eleocharis）、ホタルイ属（Scirpus）、スズメノヒエ属（Paspalum）、カモノハシ属（Ischaemum）、ナガボノウルシ属（Sphenoclea）、タツノツメガヤ属（Dactyloctenium）、ヌカボ属（Agrostis）、スズメノテッポウ属（Alopecurus）、およびアペラ属（Apera）。加えて、本開示の雑草には、例えば、望まれない場所で生長している作物が含まれ得る。例えば、ダイズ植物を優勢に含む畑において存在する自生のトウモロコシ植物は、ダイズ植物の畑においてトウモロコシ植物が望まれない場合、雑草であるとみなすことができる。

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」という用語は、５’（上流）末端から３’（下流）末端へと読まれる、ゲノム起源または合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわちデオキシリボヌクレオチド塩基のポリマーまたはポリヌクレオチド分子を指す。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される命名法は、米国特許法施行規則§１．８２２によるものおよびＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）付属書２、表１および表３の表に記載されているものに対応する。

本明細書で使用される場合、「内因性遺伝子」または遺伝子の「天然のコピー」とは、所与の生物体、細胞、組織、ゲノム、または染色体内に起源をもつ遺伝子を指す。「内因性遺伝子」または遺伝子の「天然のコピー」とは、ヒトの行為によって以前に改変されていない遺伝子である。同様に、「内因性タンパク質」とは、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。

全体として、「除草剤」という用語は、植物を枯死させ、防除し、またはさもなければ植物の生長を有害に改変する有効成分を意味して、本明細書では使用される。除草剤の好ましい量または濃度とは、「有効な量」または「有効な濃度」である。「有効な量」および「有効な濃度」とは、同様な野生型の植物、植物組織、植物細胞、または宿主細胞を枯死させるかまたはそれらの生長を阻害するのに充分である量および濃度を、それぞれ、意図するが、そのような前記の量は、本開示の除草剤抵抗性の植物、植物組織、植物細胞、および宿主細胞を枯死させることはないかまたはそれらの生長を重度に阻害することはない。通例、除草剤の有効量は、目的の雑草を枯死させるのに農業生産システムにおいて日常的に使用される量である。そのような量は当業者であれば知っている。除草活性とは、本開示に有用な除草剤が、任意の生長段階にてのもしくは定植前もしくは発芽前の植物に直接に、またはそのような植物の場所に施用される場合、本開示に有用な当該除草剤によって呈示されるものである。観察される効果とは、防除される植物種、植物の生長段階、希釈度および噴霧液滴サイズの施用パラメータ、固体成分の粒度、使用時の環境条件、用いられる具体的な化合物、用いられる具体的なアジュバントおよび担体、土壌のタイプ等、ならびに施用される化学物質の量に、依存する。これらおよびその他の要因を、当技術分野で知られるように調整して、非選択的または選択的な除草作用を増進することができる。一般に、除草剤処置は、ＰＰＩ（植付け前導入）、ＰＰＳＡ（植え付後表面施用）、発芽前または発芽後で施用することができる。発芽後処置は通例には、比較的未成熟な望ましくない植生に行い、その結果、雑草の最大の防除を得る。

「除草剤耐性」または「除草剤抵抗性」の植物とは、正常または野生型の植物を通常には枯死させるかまたはそれらの生長を阻害すると思われるレベルにての少なくとも１種の除草剤に対して耐性または抵抗性である植物を意図する。非耐性植物の生長を通常には阻害する除草剤のレベルは、当業者であれば知られているとともに容易に決定される。例としては、製造業者が施用のために推奨する量が挙げられる。最大の量とは、非耐性植物の生長を通常には阻害すると思われる除草剤の量の一例である。本開示の場合、「除草剤耐性の」および「除草剤抵抗性の」という用語は互換的に使用され、等価の意味および等価の範囲を有することが意図される。同様に、「除草剤耐性」および「除草剤抵抗性」という用語は互換的に使用され、等価の意味および等価の範囲を有することが意図される。同様に、「耐性の」および「抵抗性の」という用語は互換的に使用され、等価の意味および等価の範囲を有することが意図される。本明細書中で使用される場合、本明細書の種々の実施形態で有用な除草剤組成物について、除草剤等などの用語は、当技術分野で認識されている農学的に許容される除草剤有効成分（Ａ．Ｉ．）を指す。本明細書で使用される場合、「除草剤耐性形質」とは、野生型植物と比較して、植物に改善された除草剤耐性を付与する遺伝子導入形質である。

核酸を細胞に挿入することに関する文脈での「導入された」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸の組み込みへの言及を含むが、この場合、核酸は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれてもよく、自律性レプリコンに変換されてもよく、一過性に発現されてもよい（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）。

本明細書で使用される場合、「分離されたＤＮＡ分子」という用語は、ＤＮＡ分子の天然または自然状態において当該ＤＮＡ分子と通常関連する他の分子から、少なくとも部分的に分離されたＤＮＡ分子を指す。一実施形態では、「分離された」という用語は、ＤＮＡ分子の天然のまたは自然の状態において当該ＤＮＡ分子に通常には隣接する核酸のいくつかから、少なくとも部分的に分離されている、ＤＮＡ分子を指す。したがって、例えば組み換え技法の結果として、ＤＮＡ分子が通常には関連しない調節またはコード配列に融合されたＤＮＡ分子は、本明細書において、分離されているとみなされる。そのような分子は、これらがこれらの天然状態にないという点で、宿主細胞の染色体の中へと統合されるかまたは他のＤＮＡ分子と共に核酸溶液中に存在する場合、分離されているとみなされる。

本明細書で使用される場合、「改変された」とは、植物、種子、植物成分、植物細胞、および植物ゲノムの文脈では、それらの自然の状態または天然の状態からの変化または変形を含有する状態を指す。例を挙げると、遺伝子の「天然の転写物」とは、未改変の遺伝子から生成されるＲＮＡ転写物を指す。通例には、天然の転写物はセンス転写物である。改変された植物または種子は、遺伝的またはエピジェネティックな改変のいずれかを含めて、その遺伝物質中に分子の変化を含有する。通例には、改変された植物もしくは種子、またはそれらの親もしくは祖先の系統は、突然変異誘発、ゲノム編集（例えば、限定されないが、部位特異的ヌクレアーゼを使用した方法によるもの）、遺伝子形質転換（例えば、限定されないが、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）形質転換または微粒子銃の方法によるもの）、またはそれらの組合せに供されたものである。一態様では、本明細書で提供される改変された植物は、非植物性の遺伝物質または配列をまったく含まない。さらに別の態様では、本明細書で提供される改変された植物は、種間の遺伝物質または配列をまったく含まない。

本明細書で使用される場合、「植物」とは、植物全体、その任意の部分、または植物に由来する細胞培養物もしくは組織培養物を指し、植物全体、植物の構成成分または器官（例えば、葉、茎、根等）、植物組織、種子、植物細胞、および／またはそれらの子孫のいずれかを含む。子孫植物は、任意の雑種世代、例えば、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７等に由来することができる。植物細胞とは、植物の生物学的細胞であり、植物から採取されたか、または植物から採取された細胞由来の培養物をとおして派生されたものである。

本明細書で使用されるような「ポリヌクレオチド」という用語は、複数の重合ヌクレオチド、例えば、少なくとも約５個の連続した重合ヌクレオチドを含む核酸分子である。ポリヌクレオチドは、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはそれらの任意の断片とすることができる。多くの場合、ポリヌクレオチドは、ポリペプチド（もしくはタンパク質）またはそのドメインもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む。付加的に、ポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリアデニル化部位、翻訳開始部位、５’または３’非翻訳領域、レポーター遺伝子、選択可能なマーカー等を含むことができる。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡとすることができる。ポリヌクレオチドは、改変塩基または改変主鎖を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、転写物（例えばｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、クローン化ＤＮＡ、合成ＤＮＡまたはＲＮＡ等、とすることができる。ポリヌクレオチドは、炭水化物、脂質、タンパク質、またはその他の物質と組み合わせて、形質転換などの特定の活性を果たすか、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などの有用な組成物を形成することができる。ポリヌクレオチドは、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで配列を含むことができる。「オリゴヌクレオチド」とは、アンプリマー、アンプリコン、プライマー、オリゴマー、エレメント、ターゲット、およびプローブという用語と実質的に等価であり、一部の実施形態では一本鎖である。

本明細書で使用されるような「プライマー」という用語は、ＰＣＲなどの鋳型依存のプロセスにおいて新生核酸の合成を刺激することができる任意の核酸を包含する。通例には、プライマーは１０から３０個の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を使用してもよい。プライマーは、一本鎖または二本鎖の形態で用意することができる。プローブは、プライマーとして使用することができるが、標的のＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅プロセスで使用することを要しない。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」とは、転写開始点から上流にあり、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ領域への言及が含まれる。「植物プロモーター」とは、その起源が植物細胞であるか否かにかかわらず、植物細胞中における転写を開始することができるプロモーターである。例示的な植物プロモーターとしては、それらに限定されないが、植物、植物ウイルス、および、植物細胞で発現する遺伝子を含む、アグロバクテリウム属またはリゾビウム属（Rhizobium）などの細菌から得られるものが挙げられる。発生学的な制御下にあるプロモーターの例としては、葉、根または種子などのある特定の組織で転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。かかるプロモーターは、「組織優先型」と呼ばれる。ある特定の組織中でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞タイプ」特異的プロモーターは、１種類または複数の器官におけるある特定の細胞タイプにおいて、例えば根または葉の維管束系細胞において、発現を主として駆動させる。「誘導性」または「抑制」プロモーターとは、環境の制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによって転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気的条件または光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先型、細胞タイプ特異的、および誘導性の各プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件下で活性であるプロモーターである。

本明細書で使用される場合、「組み換え」とは、核酸またはポリペプチドに言及する場合、そのような物質は、ポリヌクレオチドの制限およびライゲーションによる、ポリヌクレオチドのオーバーラップ伸長による、またはゲノム挿入もしくは形質転換によるなどの、組み換え技法のヒトによる応用の結果として変更されている、ことを指示するものである。遺伝子配列オープンリーディングフレームは、そのヌクレオチド配列がその自然状況から取り出され、任意のタイプの人工核酸ベクターにクローニングされた場合に、組み換えである。組み換えという用語はまた、組み換え物質を有する生物体を指すことができる、例えば、組み換え核酸を含む植物は組み換え植物とみなすことができる。

「調節エレメント」とは、ヌクレオチド配列であって、コード配列の上流（５’非コード配列）、その内、またはその下流（３’非コード配列）に位置しており、かつ、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチド配列を指す。調節エレメントには、それらに限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれ得る。細胞に導入される組み換えＤＮＡコンストラクト上に存在する調節エレメントは、細胞にとって内因性であってもよく、または、細胞に関して異種であってもよい。「調節エレメント」および「調節配列」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

「配列」とは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の連続した配置を意味する。タンパク質コード配列の境界は、５’末端にての翻訳開始コドンおよび３’末端にての翻訳停止コドンによって決定することができる。一部の実施形態では、タンパク質コード分子は、タンパク質配列をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。一部の実施形態では、タンパク質コード分子は、タンパク質配列をコードするＲＮＡ配列を含むことができる。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子発現」、「導入遺伝子を発現する」、「タンパク質発現」、および「タンパク質を発現する」とは、ＤＮＡ分子をメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写し、ｍＲＮＡをポリペプチド鎖へと翻訳するというプロセスをとおしたタンパク質の生成を意味するが、そのポリペプチド鎖がタンパク質へと最終的にはフォールディングされる。

本明細書で使用される場合、「配列同一性のパーセント」または「％の配列同一性」という用語は、試験（「対象」）配列（またはその相補鎖）と比較した参照（「問い合わせ」）配列（またはその相補鎖）の、これら２つの配列が最適に整列されている（適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入、欠失、またはギャップが比較ウィンドウにわたって参照配列の合計２０％未満であるという状況で）という場合の、直鎖状ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列中の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージを指す。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアライメントは当業者に周知されており、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカルホモロジーアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのホモロジー整列化アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似検索法などのツールによって、ならびに、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）の配列分析ソフトウェアパッケージの一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ＭＥＧＡｌｉｇｎ（ＤＮＡＳｔａｒ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＭＵＳＣＬＥ（バージョン３．６）［Edgar, “MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput” Nucleic Acids Research 32（5）:1792-7 （2004）］などのコンピュータによるこれらのアルゴリズムの実装によって、例を挙げるとデフォルトのパラメータを用いて、行うことができる。試験配列と参照配列の整列させたセグメントの「同一性の割合」とは、整列された参照配列セグメントの部分において、すなわち、参照配列全体または参照配列の定義されたより小さい部分において、２つの整列配列が共有する同一の構成成分の数を構成成分の総数で除したものである。配列同一性のパーセントは、同一性の割合に１００を乗じたものとして表される。１つまたは複数の配列の比較は、完全長配列またはその一部に対してでもよく、より長い配列に対してでもよい。

本明細書で使用される場合、「合成オーキシン除草剤」または「オーキシン除草剤」とは、内因性植物オーキシンを模倣することをとおして除草活性を発揮するか、または細胞からのオーキシン化合物の移動を阻害する、任意の除草剤を意味する。合成オーキシン除草剤の例としては、安息香酸、フェノキシカルボン酸、ピリジンカルボン酸、キノリンカルボン酸、セミカルボアゾン、ジフルフェンゾピル、２，４－Ｄ、２，４－ＤＢ、ＭＣＰＡ、ＭＣＰＢ、メコプロップ、ジカンバ、クロピラリド、フルロキシピル、ピクロラム、トリクロピル、アミノピラリド、アミノシクロピラクロル、およびクインクロラック、が挙げられる。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞のトランスフェクションで使用され、その中にポリヌクレオチドを挿入することができる、核酸への言及を含む。ベクターは多くの場合レプリコンである。発現ベクターによって、その中に挿入される核酸の転写が可能となる。

ＣＹＰ８１Ｅポリヌクレオチド
植物ホルモンのオーキシンは、植物の生長、発生、および応答の多数の経路に関与する遺伝子の中枢的な調節因子として機能する。天然に存在する活性オーキシンはインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）であるが、他の多くの化合物が、植物に施用される場合にＩＡＡの機能を模倣することが見出されてきた。このことから、効果的な除草剤として機能するいくつかの化合物の特定および商品化がもたらされた。トウモロコシおよびその他の単子葉作物は低レベルの合成オーキシン除草剤に対して自然に耐性ではあるが、一方、ダイズおよびワタなどの双子葉作物は高度に感受性である。オーキシン除草剤耐性品種を開発する試みは、オーキシン除草剤を不活性化する酵素の異種発現に焦点が合わせられてきたが、それによって、本来なら感受性の植物を除草剤に対して耐性とする。

除草剤耐性を付与するチトクロームＰ４５０ ８１Ｅ（ＣＰＹ８１Ｅ）配列が提供される。そのような配列には、配列番号２に記載のアミノ酸配列、およびその変異体が含まれる。配列番号１を含めて、そのようなアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列も提供される。

いくつかの実施形態によれば、ある特定のオーキシン除草剤を、およびその他のタイプの除草剤でもよいが、不活化することができるＣＰＹ８１Ｅポリペプチドをコードする遺伝子で、作物を形質転換する。

ＣＰＹ８１Ｅポリペプチドをコードするさらなるポリヌクレオチド配列は、目的の除草剤に対する耐性を付与するそれらの能力に基づいて、当技術分野で周知されている方法を使用して特定することができる。例えば、ＣＰＹ８１Ｅ候補遺伝子を、適切な酵母菌株に形質転換し、この株中で発現させ、インビトロ（in vitro）で試験用除草剤を酸化するそれらの能力に基づいて選抜する［Siminszky et al （1999） PNAS （USA） 96:1750-1755を参照されたい］。適切な酵母株には、適切な植物シトクロムＰ４５０コンピテントレダクターゼも含むＷＡＴ１１またはＷＡＴ２１などが含まれる。誘導の後、適切な期間（例えば、形質転換ベクターで使用される誘導性プロモーターに応じて、ガラクトースとともに）細胞を増殖させ、回収し、破砕し、ミクロソーム画分を通常の手段により調製し、１４Ｃ標識除草剤を酸化する能力についてＮＡＤＰＨを用いてアッセイする。アッセイは培養中の全細胞を使用して実施してもよい。

あるいは、ＣＰＹ８１Ｅ候補遺伝子を、タバコ、シロイヌナズナ属（Arabidopsi）、または他の容易に形質転換される除草剤感受性植物において発現させ、結果として生じる形質転換体の植物を、オーキシン除草剤または目的の他の除草剤に対するそれらの耐性について評価する。植物または植物から採取した組織試料を、除草剤で処理し、酸化代謝分解産物への親除草剤の代謝変換率を評価するためにアッセイしてもよい。

当業者であればまた、ゲノムシンテニーおよび配列類似性に基づいて、さらなるＣＰＹ８１Ｅ候補遺伝子を見出すことができる。一実施形態では、上述のＣＰＹ８１Ｅヌクレオチド配列に基づく配列を使用したハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによって、さらなる遺伝子候補を得ることができる。

ＰＣＲアプローチでは、ＰＣＲ反応で使用するためにオリゴヌクレオチドプライマーを設計して、目的の任意の植物から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅することができる。ＰＣＲプライマーおよびＰＣＲクローニングを設計する方法は、当技術分野で一般に知られている。例えば、以下を参照されたい、Sambrook et al. （1989） Molecular Cloning: A Laboratory Manual （2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）。Innis et al., eds. （1990） PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications （Academic Press, New York）；Innis and Gelfand, eds. （1995） PCR Strategies （Academic Press, New York）;およびInnis and Gelfand, eds. （1999） PCR Methods Manual （Academic Press, New York）も参照されたい。

ハイブリダイゼーション技法では、既知のポリヌクレオチドの全部または一部がプローブとして使用されるが、このプローブは、選ばれた生物体からのクローン化されたゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ断片（すなわち、ゲノムライブラリまたはｃＤＮＡライブラリ）の集団に存在する他の対応するポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションプローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、またはその他のオリゴヌクレオチドとすることができ、^３２Ｐなどの検出可能な基または他の任意の検出可能なマーカーで標識されていてもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製のためのならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリの構築のための方法は、当技術分野で一般に知られており、Sambrook et al. （1989） Molecular Cloning: A Laboratory Manual （2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.）、に開示されている。

「にハイブリダイズする」または「に特異的にハイブリダイズする」とは、特定のヌクレオチド配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）ＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、分子が当該の特定のヌクレオチド配列だけにストリンジェントな条件下で結合、二重鎖形成またはハイブリダイズすることを指す。「実質的に結合する」とは、プローブ核酸分子と標的核酸分子との間での相補的ハイブリダイゼーションを指し、ハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを軽減して標的核酸配列の所望の検出を行うことによって受け入れられ得る軽微なミスマッチを包含する。

サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験の状況において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」とは、配列依存性であるとともに様々な環境パラメータ下で様々である。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションへの包括的指針は、Tijssen （1993） Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays” Elsevier, New Yorkに見出される。一般に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、既定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低いように選択される。通例には、「ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。

Ｔ_ｍとは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下の）である。非常にストリンジェントな条件は特定のプローブのＴ_ｍと等しいように選択される。サザンブロットまたはノーザンブロットのフィルター上で相補的な残基１００個超を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションについてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例とは、４２℃にてのヘパリン１ｍｇを含む５０％ホルムアミドであり、この場合、ハイブリダイゼーションを終夜行う。高度にストリンジェントな洗浄条件の一例とは、７２℃で約１５分間の０．１５Ｍ ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の一例とは、６５℃で１５分間の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝剤の説明については、下のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。多くの場合、高度のストリンジェントな洗浄に先行して低いストリンジェントな洗浄を実施し、その結果、バックグラウンドプローブシグナルが除去される。例えば１００個超のヌクレオチドの二重鎖のための中程度にストリンジェントな洗浄の一例とは、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００個超のヌクレオチドの二重鎖のための低いストリンジェントな洗浄の一例とは、４０℃で１５分間の４～６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０～５０個のヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件とは通例、ｐＨ７．０～８．３で、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、通例には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン濃度の塩濃度（またはその他の塩）を含み、温度は通例には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても行うことができる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係なプローブについて観察されるシグナル対ノイズ比よりも２×（またはこれ超）のシグナル対ノイズ比であれば、特異的ハイブリダイゼーションが検出されたことが指示される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするタンパク質が実質的に同一であるなら、なお実質的に同一である。このようなことは、例えば、遺伝コードによって可能となる最大限のコドンの縮重を使用して核酸のコピーが作製される場合に、発生する。

以下は、参照ヌクレオチド配列の相同体であるヌクレオチド配列をクローニングするのに使用することができるハイブリダイゼーション／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列に、好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイズし、この場合、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する、より望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイズし、この場合、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する、なおもより望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイズし、この場合、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する、好ましく７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイズし、この場合、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で洗浄する、より好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中で５０℃でハイブリダイズし、この場合、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄する。

いくつか実施形態はまた、オーキシン除草剤を含めて、除草剤に対する耐性を付与するＣＹＰ８１Ｅまたはその変異体の使用にも関する。「変異体」とは、実質的に同様の配列を意味することを意図する。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、天然ポリヌクレオチド内の１つもしくは複数の内部部位にての１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失および／もしくは付加、ならびに／または天然ポリヌクレオチド内の１つもしくは複数の部位にての１つもしくは複数のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で使用される場合、「天然」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドの場合、保存的変異体は、遺伝コードが縮重していることから、上に記載のＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするそれらの配列を含む。天然に存在する対立遺伝子変異体は、例えば、上で概説したようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法およびハイブリダイゼーション技法によるなどの、周知されている分子生物学的技法の使用により、特定することが可能である。変異体ポリヌクレオチドはまた、例えば部位特異的突然変異誘発を使用することによって生成されるが、除草剤耐性を付与するＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをなおもコードするものなどの、合成的に導出されたポリヌクレオチドも含む。全体として、特定のポリヌクレオチドの変異体は、当該の特定のポリヌクレオチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはこれ超の配列同一性を有することになる。

除草剤耐性を付与するＣＹＰ８１Ｅをコードする特定のポリヌクレオチドの変異体が包含されるが、これは、変異体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間の配列同一性のパーセントを比較することによって評価することができる。任意の２つのポリペプチドの間の配列同一性のパーセントを、下記の配列アライメントプログラムおよびアルゴリズムを使用して算出することができる。ポリヌクレオチドの所与の任意のペアを、それらがコードするそれら２つのポリペプチドによって共有される配列同一性のパーセントを比較することによって評価する場合、それら２つのコードされたポリペプチドの間の配列同一性のパーセントは、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超の配列同一性である。

比較のための配列アライメントの方法は、当技術分野で周知されており、以下のような、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる：Myers and Miller （1988） CABIOS 4:11-17のアルゴリズム；Smith et al. （1981） Adv. Appl. Math. 2:482のローカルアライメントアルゴリズム；Needleman and Wunsch （1970） J. Mol. Biol. 48:443-453のグローバルアライメントアルゴリズム；および、Karlin and Altschul （1993） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877で改変の、Karlin and Altschul （1990） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズム。これらの数学的アルゴリズムのコンピュータ実装を配列の比較用に利用して、配列同一性を決定することができる。そのような実装には以下が含まれるが、それらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅ ｐｒｏｇｒａｍのＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓから入手可能、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）；ＡＬＩＧＮ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）ならびにＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ １０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．から入手可能、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、米国）。

いくつかの実施形態は、植物においてＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を向上させることに関する。本明細書で使用されるような「向上した発現」または「過剰発現」という用語は、元来の野生型発現レベルに加えられる任意の形態の発現を意味する。元来の野生型発現レベルはゼロ（発現の非存在）である場合もある。遺伝子または遺伝子産物の発現を向上させるための方法は、当技術分野で十分に実証されており、これには、例えば、適当なプロモーターによって駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が含まれる。プロモーターエレメントまたはエンハンサーエレメントとして機能する分離された核酸を、ポリヌクレオチドの非異種形態の適当な位置（通例には上流）に導入し、その結果、目的のタンパク質をコードする核酸の発現を上方制御することができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、および／または置換によってインビボ（in vivo）で変更してもよく（Kmiec、米国特許第５，５６５，３５０号；Zarling et al.、ＷＯ９３２２４４３を参照されたい）、または、分離されたプロモーターを、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子からの適当な方向および距離で植物細胞に導入し、その結果、遺伝子の発現を制御することができる。

ゲノム編集法の使用をとおして植物ゲノムの標的化改変を使用して、植物ゲノムＤＮＡの改変をとおしてＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を向上させることができる。ゲノム編集法により、目的とする１つまたは複数の核酸の植物ゲノムへの標的化された挿入を可能とすることができる。ドナーポリヌクレオチドを植物ゲノムに導入するための、または植物のゲノムＤＮＡを改変するための例示的方法としては、配列特異的ヌクレアーゼの、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、操作されたもしくは天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、クラスター化規則的配置短回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸ系、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹ系、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓｃａｄｅ系）の、使用が挙げられる。核酸配列を改変する、欠失させる、またはそれをゲノムＤＮＡに挿入するためのゲノム編集の方法は、当技術分野で知られている。

発現コンストラクト
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、発現コンストラクトで提供することができる。発現コンストラクトは、発現コンストラクトが発現されることになる意図される宿主細胞において機能性である調節エレメントを一般には含む。したがって、当業者であれば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、およびヒト宿主細胞で使用するための調節エレメントを選択することができる。調節エレメントには、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化エレメントが含まれる。本明細書で使用される場合、「発現コンストラクト」という用語は、作動可能に連結された核酸配列の転写を提供する核酸配列の組合せを指す。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、一方が他方の機能に影響を及ぼすことができるような様式で連結された２つのＤＮＡ分子を意味する。作動可能に連結されたＤＮＡ分子は、単一の連続する分子の一部であってもよく、隣接している場合もあり隣接していない場合もある。例えば、プロモーターは、プロモーターがＤＮＡ分子の発現に影響を及ぼすことができるように２つのＤＮＡ分子が配置されているＤＮＡコンストラクト中の、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と作動可能に連結されている。

本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、異なる供給源に由来し、したがって自然では普通には関連していない２つ以上のアイテム間の関係を指す。例えば、タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ分子は、かかる組合せが自然で普通には見出されない場合、作動可能に連結されたプロモーターに対して異種である。加えて、特定の組み換えＤＮＡ分子は、このＤＮＡ分子が特定の細胞、種子、または生物体において天然には存在しないと思われる場合、このＤＮＡ分子が挿入される当該の特定の細胞、種子、または生物体に対して異種とすることができる。

発現コンストラクトは、本明細書に記載のＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むことができる。プロモーターは、当技術分野で知られている標準技法を使用してポリヌクレオチドに組み込むことができる。プロモーターの複数のコピーまたは複数のプロモーターを、本明細書に記載の発現コンストラクトで使用することができる。一部の実施形態では、プロモーターは、これの天然の遺伝子環境での転写開始部位からの距離と、発現コンストラクト中の転写開始部位からおよそ同じ距離に配置することができる。この距離のいくらかの変動は、プロモーター活性の実質的な低下なしで容認される。転写開始部位は、発現コンストラクトに通例には含まれる。

実施形態は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子に関するものであり、この場合、組み換えＤＮＡ分子は、異種調節エレメントに作動可能に連結されているとさらに定義される。特定の実施形態では、異種調節エレメントは、植物細胞で機能性のプロモーターである。さらなる実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。

発現コンストラクトが植物細胞へと供給されることになるかまたはそれへと導入されることなるに場合、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ［増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（例えば、米国特許第５，１０６，７３９号を参照されたい）を含めて］もしくはＣａＭＶ１９Ｓプロモーターまたはキャッサバベインモザイクなどの、植物ウイルスプロモーターを使用することができる。植物における発現コンストラクトに使用することができる他のプロモーターには、例えば、トウモロコシゼインプロモーターを始めとするゼインプロモーターが含まれ、プロリフェラ（prolifera）プロモーター、Ａｐ３プロモーター、熱ショックプロモーター、Ａ．ツメファシエンス（A．tumefaciens）のＴ－ＤＮＡ １’－プロモーターまたはＴ－ＤＮＡ ２’－プロモーター、ポリガラクツロナーゼプロモーター、ペチュニア（petunia）由来のカルコン合成酵素Ａ（ＣＨＳ－Ａ）プロモーター、タバコＰＲ－１ａプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、ａｌｃＡ遺伝子プロモーター、ｐｉｎ２プロモーター（Xu et al., 1993）、トウモロコシＷｉｐｌプロモーター、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子プロモーター（米国特許第５，６２５，１３６号）、トウモロコシＣＤＰＫ遺伝子プロモーター、および、ＲＵＢＩＳＣＯ ＳＳＵプロモーター（米国特許第５，０３４，３２２号）も使用することができる。構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、またはＮＯＳプロモーター）、発生に関連して調節されるプロモーター、および誘導性プロモーター（例えば、熱、光、ホルモン、または化学物質によって誘導され得る当該のプロモーター）も、本明細書に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトと共に使用するために企図される。

発現コンストラクトは、転写終結配列、翻訳終結配列、シグナルペプチドをコードする配列、および／またはエンハンサーエレメントを含有してもよい。転写終結領域は、真核生物またはウイルスの遺伝子配列の３’非翻訳領域から通例には得ることができる。転写終結配列は、効率的な終結をもたらすために、コード配列の下流に配置されてもよい。シグナルペプチド配列とは、特定の細胞小器官区画からタンパク質作用部位に及ぶ広範囲の翻訳後細胞内目的地および細胞外環境に、作動可能に連結された成熟ポリペプチドを再配置するのを担当するタンパク質のアミノ末端に通例には存在する短いアミノ酸配列である。作動可能に連結されたシグナルペプチド配列の使用をとおして、意図された細胞内目的地および／または細胞外目的地に遺伝子産物をターゲティングすることが、本明細書に記載のポリペプチドと共に使用するために企図される。古典的なエンハンサーとは、遺伝子転写を増大させるシス作用エレメントであり、これも発現コンストラクト中に含まれてもよい。古典的なエンハンサーエレメントは当技術分野において知られており、それらに限定されないが、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメント、およびＳＶ４０エンハンサーエレメントが含まれる。遺伝子発現を増強するイントロン媒介性エンハンサーエレメントも、当技術分野において知られている。こういったエレメントは、転写領域内に存在することが必要であり、配向依存性である。例としては、トウモロコシｓｈｒｕｎｋｅｎ－１エンハンサーエレメント（Clancy and Hannah, 2002）が挙げられる。

適宜、ＣＰＹ８１Ｅポリペプチドをコードする遺伝子は、発現に有害な特性を除去するためにコドン最適化され、コドン使用が、特定の作物における発現向けに最適化される（例えば、米国特許第６，０５１，７６０号；ＥＰ０３５９４７２；ＥＰ８０３８５９６２；ＥＰ０４３１８２９；およびPerlak et al. （1991） PNAS USA 88:3324-3328を参照されたい；これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。

ある特定の実施形態では、核酸分子は、核酸分子が天然に存在する核酸配列を記載しないように、少なくとも１つのヌクレオチド置換、挿入、または欠失を含む。

ＣＹＰ８１Ｅポリペプチド
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、互換的に一般には使用され、非アミノ酸基の付加によって改変されていても改変されていなくてもよい単一のポリペプチド鎖を指す。そのようなポリペプチド鎖は、他のポリペプチドもしくはタンパク質または補因子などの他の分子と会合し得ることを理解されたい。本明細書で使用されるような「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語には、本明細書に記載の本開示のポリペプチドの変異体、突然変異体、改変形態、アナログおよび／または誘導体も含まれる。

定義されたポリペプチドに関して、上に提供された値よりも高い％の同一性の値が好ましい実施形態を包含することを、理解されたい。したがって、該当する場合、最小の％の同一性数値に照らして、ＣＰＹ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、さらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一性であるアミノ酸配列を含むことが、好ましい。

「変異体」ポリペプチドとは、天然タンパク質のＮ末端および／もしくはＣ末端に対して１つもしくは複数のアミノ酸の欠失（いわゆるトランケーション）もしくは付加を行うこと；天然タンパク質中の１つもしくは複数の部位にての１つもしくは複数のアミノ酸の欠失もしくは付加を行うこと；または天然タンパク質の１つもしくは複数の部位にての１つもしくは複数のアミノ酸の置換を行うことによって、配列番号２のタンパク質から誘導されるポリペプチド、を意図する。そのような変異体は、例えば、遺伝子多型の結果よるものであっても、ヒトの操作の結果によるものであってもよい。そのような操作の方法は、当技術分野で一般に知られている。

タンパク質の「誘導体」とは、問題の未改変タンパク質と比べてアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を有するとともにそれらが由来する未改変タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を包含する。したがって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの機能的変異体および断片、ならびにそれらをコードする核酸分子も、特に別段の記載がない限り、前記ポリペプチドの起源にかかわりなく、およびそれが天然に存在するかにかかわりなく、本開示の範囲内である。

加えて、突然変異によってヌクレオチド配列に変化を導入し、それによって、タンパク質の生物学的活性を変更することなく、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることを、当業者であればさらに理解するであろう。したがって、例えば、配列番号２のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードする分離されたポリヌクレオチド分子を、対応するヌクレオチド配列へと１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作製することができ、その結果、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされたタンパク質に導入される。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの標準技法によって導入することができる。そのような変異体ヌクレオチド配列も本開示により包含される。例えば、好ましくは、保存的アミノ酸置換を、１つまたは複数の予測される好ましくは非必須アミノ酸残基で行うことができる。「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変更することなくタンパク質の野生型配列から変更することできる残基であるが、一方、「必須」アミノ酸残基は生物学的活性に必要である。

欠失とは、タンパク質からの１つまたは複数のアミノ酸の除去を指す。挿入とは、タンパク質の所定の部位に１つまたは複数のアミノ酸残基が導入されることを指す。挿入は、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸の、Ｎ末端融合および／またはＣ末端融合ならびに内部配列挿入を含むことができる。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、Ｎ末端融合またはＣ末端融合よりも小さく、約１～１０残基の程度である。Ｎ末端融合タンパク質もしくはペプチドまたはＣ末端融合タンパク質もしくはペプチドの例としては、酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用されるような転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）－６－タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ－タグ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｔａｇ・１００エピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）－エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープおよびＶＳＶエピトープ、が挙げられる。

置換とは、タンパク質のアミノ酸を、類似の特性（例えば、類似の、疎水性、親水性、抗原性、α－ヘリックス構造またはβ－シート構造を形成または破壊する特性）を有する他のアミノ酸と交換することを指す。アミノ酸置換は通例には、単一の残基のものであるが、そのポリペプチド上に置かれる機能的拘束に応じてクラスター化することができ、１から１０個のアミノ酸の範囲とすることができる；挿入は通常には、約１～１０個のアミノ酸残基の程度のものである。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。かかる置換は、保存されたアミノ酸残基については、または保存されたモチーフの内部に存在するアミノ酸残基については、なされるものではない。保存的置換表は、当技術分野で周知されている［例えば、Creighton （1984） Proteins. W.H. Freeman and Company （Eds）を参照されたい］。

アミノ酸の置換、欠失および／または挿入は、固相ペプチド合成等などの当技術分野で周知されているペプチド合成技法を使用して、または組み換えＤＮＡ操作によって容易になすことができる。タンパク質の置換、挿入または欠失の各変異体を生成するＤＮＡ配列の操作方法は、当技術分野で周知されている。例えば、ＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を作製するための技法は、当業者に周知されており、これには、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７－Ｇｅｎインビトロ突然変異誘発（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＰＣＲ媒介部位特異的突然変異誘発またはその他の部位特異的突然変異誘発プロトコル、が含まれる。

ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドが天然に存在するアミノ酸配列を記載しないように、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む。

ある特定の実施形態では、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、以下のうちの少なくとも１つを含む：配列番号２の９位に相当する位置にてのアラニン残基；配列番号２の１２位に相当する位置にてのセリン残基；配列番号２の２２位に相当する位置にてのヒスチジン残基；配列番号２の１０３位に相当する位置にてのバリン残基；配列番号２の１５７位に相当する位置にてのグリシン残基；配列番号２の２５８位に相当する位置にてのセリン残基；配列番号２の２７６位に相当する位置にてのスレオニン残基；配列番号２の３７９位に相当する位置にてのメチオニン残基；配列番号２の４４９位に相当する位置にてのアラニン残基；配列番号２の４５０位に相当する位置にてのセリン残基；配列番号２の４６３位に相当する位置にてのアラニン残基；配列番号２の４８９位に相当する位置にてのバリン残基；配列番号２の４９１位に相当する位置にてのロイシン残基。所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は配列番号２に示されるヒユモドキＣＹＰ８１Ｅアミノ酸配列の相当するアミノ酸残基の位置の番号付けを使用して、本明細書では典型的には番号付けされる。

「オルソログ」および「パラログ」とは、遺伝子の祖先関係を記載して使用される進化の概念を包含するものである。パラログとは、祖先の遺伝子の複製をとおして生じた同じ種内の遺伝子である；オルソログとは、種分化をとおして生じた異なる生物体由来の遺伝子であり、また共通の祖先遺伝子に由来するものである。

本開示により包含される配列番号２のオルソログおよびパラログには、それらに限定されないが、配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３または４４を含むポリペプチドが含まれる。

形質転換法
いくつかの実施形態は、本明細書に記載の組み換えＤＮＡを含む植物細胞、植物組織、植物、および種子に関する。一部の実施形態では、組み換えＤＮＡ分子を含む細胞、組織、植物、および種子は、オーキシン除草剤に対する耐性を呈する。

宿主植物細胞の形質転換に適した方法には、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞（例えば、この場合、組み換えＤＮＡコンストラクトが植物染色体へと安定して組み込まれている細胞、または、この場合、組み換えＤＮＡコンストラクトまたはＲＮＡが植物細胞に一過性に供給されている細胞）へと導入することができる任意の方法が事実上含まれるとともに、適切な方法は当技術分野で周知されている。細胞形質転換向けの効果的な２つの方法とは、アグロバクテリウム媒介性形質転換および微粒子銃媒介性形質転換である。微粒子銃法は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；同５，５３８，８８０号；同６，１６０，２０８号；および同６，３９９，８６１号に例示されている。アグロバクテリウム媒介性形質転換法は、例えば、米国特許第５，５９１，６１６号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。植物物質の形質転換は、栄養培地での、例えば、細胞をインビトロで増殖させることを可能にする栄養素の混合物での、組織培養で実施される。レシピエント細胞標的には、それらに限定されないが、分裂組織細胞、シュート先端、胚軸、カルス、未熟または成熟胚、ならびに小胞子および花粉などの配偶子細胞が含まれる。カルスは、それらに限定されないが、未熟または成熟胚、胚軸、実生頂端分裂組織、小胞子等を始めとする組織源から開始することができる。遺伝子導入核を含有する細胞は、遺伝子導入植物へと生長する。

形質転換では、ＤＮＡは、任意の１つの形質転換実験において標的植物細胞のうちの僅かな割合だけに、通例には導入される。マーカー遺伝子を使用して、組み換えＤＮＡ分子を受け取るとともにこれを細胞のゲノムに統合することによって安定的に形質転換された当該細胞を特定するための、効率的システムを提供する。好ましいマーカー遺伝子によって、抗生物質または除草剤などの、選択性作用剤に対する耐性を付与する選択マーカーがもたらされる。本開示の植物が抵抗性であり得る除草剤のいずれも、選択マーカー用の作用剤である。潜在的に形質転換された細胞を、選択性作用剤に曝露する。生存細胞の集団には、一般に、抵抗性付与遺伝子が統合されるとともに細胞の生存を可能とするのに十分なレベルで発現される細胞がある。細胞をさらに試験して、外因性ＤＮＡの安定した統合を確認することができる。よく使用される選択マーカー遺伝子には、抗生物質に対する抵抗性を付与するもの、例えば、カナマイシンおよびパロモマイシン（ｎｐｔｌｌ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）、スペクチノマイシン（ａａｄＡ）およびゲンタマイシン（ａａｃ３およびａａｃＣ４）、または、除草剤に対する抵抗性を付与するもの、例えば、グルホシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）、ジカンバ（ＤＭ０）およびグリホサート（ａｒｏＡまたはＥＰＳＰＳ）、が挙げられる。そのような選択可能なマーカーの例が、米国特許第５，５５０，３１８号；同第５，６３３，４３５号；同第５，７８０，７０８号および同第６，１１８，０４７号、に例示されている。形質転換体を視覚的にスクリーニングする能力をもたらすマーカー、例えば、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの着色タンパク質もしくは蛍光タンパク質を発現する遺伝子、または、さまざまな発色基質が知られているβ－グルクロニダーゼを発現する遺伝子もしくはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）も用いることができる。

除草剤耐性を備える植物
いくつかの実施形態は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞、植物組織、植物、および種子に関するものであり、この場合、ポリヌクレオチドの発現が除草剤に対する耐性を付与する。植物は単子葉植物であっても双子葉植物であってもよく、これには、例えば、イネ、コムギ、オオムギ、エンバク、ライムギ、モロコシ、トウモロコシ、ブドウ、トマト、ジャガイモ、レタス、ブロッコリ、キュウリ、ピーナッツ、メロン、コショウ、ニンジン、カボチャ、タマネギ、ダイズ、アルファルファ、ヒマワリ、ワタ、キャノーラ、およびサトウダイコンの植物、が含まれ得る。

本開示の方法において特に有用である植物には、緑色植物亜界（Viridiplantae）スーパーファミリーに属するあらゆる植物、特に、以下を含むリストから選択される、飼料またはかいばのマメ科植物、観賞植物、食用作物、樹木または低木を始めとする単子葉および双子葉の植物が含まれる：カエデ属の種（Acer spp.）、マタタビ属の種（Actinidia spp.）、トロロアオイ属の種（Abelmoschus spp.）、サイザルアサ（Agave sisalana）、カモジグサ属の種（Agropyron spp.）、ハイコヌカグサ（Agrostis stolonifera）、ネギ属の種（Allium spp.）、アマランサス属の種（Amaranthus spp.）、アンモフィア・アレナリア（Ammophila arenaria）、パイナップル（Ananas comosus）、バンレイシ属の種（Annona spp.）、セロリ（Apium graveolens）、落花生属の種（Arachis spp.）、パンノキ属の種（Artocarpus spp.）、アスパラガス（Asparagus officinalis）、カラスムギ属の種（Avena spp.）［例えば、エンバク（Avena sativa）、カラスムギ（Avena fatua）、アカエンバク（Avena byzantina）、カラスムギ変種サティバ（Avena fatua var. sativa）、カラスムギ雑種（Avena hybrida）］、スターフルーツ（Averrhoa carambola）、ホウライチク属の種（Bambusa sp.）、トウガン（Benincasa hispida）、ブラジルナッツ（Bertholletia excelsea）、サトウダイコン（Beta vulgaris）、アブラナ属の種（Brassica spp.）［例えば、セイヨウアブラナ（Brassica napus）、ブラッシカ・ラパの亜種（Brassica rapa ssp.）（キャノーラ、ナタネ、アブラナ）］、カダバ・ファリノーサ（Cadaba farinosa）、チャノキ（Camellia sinensis）、ダンドク（Canna indica）、アサ（Cannabis sativa）、トウガラシ属の種（Capsicum spp.）、カレックス・エラータ（Carex elata）、パパイヤ（Carica papaya）、オオバナカリッサ（Carissa macrocarpa）、ペカン属の種（Carya spp.）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、クリ属の種（Castanea spp.）、カポック（Ceiba pentandra）、エンダイブ（Cichorium endivia）、ニッケイ属の種（Cinnamomum spp.）、スイカ（Citrullus lanatus）、ミカン属の種（Citrus spp.）、ココス属の種（Cocos spp.）、コーヒーノキ属の種（Coffea spp.）、サトイモ（Colocasia esculenta）、コーラ属の種（Cola spp.）、ツナソ属の種（Corchorus sp.）、コリアンダー（Coriandrum sativum）、ハシバミ属の種（Corylus spp.）、サンザシ属の種（Crataegus spp.）、サフラン（Crocus sativus）、カボチャ属の種（Cucurbita spp.）、キュウリ属の種（Cucumis spp.）、チョウセンアザミ属の種（Cynara spp.）、ノラニンジン（Daucus carota）、ヌスビトハギ属の種（Desmodium spp.）、リュウガン（Dimocarpus longan）、ヤマノイモ属の種（Dioscorea spp.）、カキノキ属の種（Diospyros spp.）、ノビエ属の種（Echinochloa spp.）、アブラヤシ属（Elaeis）［例えば、ギニアアブラヤシ（Elaeis guineensis）、アメリカアブラヤシ（Elaeis oleifera）］、シコクビエ（Eleusine coracana）、テフ（Eragrostis tef）、エリアンサス属の種（Erianthus sp.）、ビワ（Eriobotrya japonica）、ユーカリ属の種（Eucalyptus sp.）、ピタンガ（Eugenia uniflora）、ソバ属の種（Fagopyrum spp.）、イヌブナ属の種（Fagus spp.）、オニウシノケグサ（Festuca arundinacea）、イチジク（Ficus carica）、キンカン属の種（Fortunella spp.）、オランダイチゴ属の種（Fragaria spp.）、イチョウ（Ginkgo biloba）、ダイズ属の種（Glycine spp.）［例えば、ダイズ（Glycine max）、ソーヤ・ヒスピダ（Soja hispida）、またはソーヤ・マックス（Soja max）］、ワタ（Gossypium hirsutum）、ヘリアンサス属の種（Helianthus spp.）［例えば、ヒマワリ（Helianthus annuus）］、ワスレグサ（Hemerocallis fulva）、フヨウ属の種（Hibiscus spp.）、オオムギ属の種（Hordeum spp.）［例えば、オオムギ（Hordeum vulgare）］、サツマイモ（Ipomoea batatas）、クルミ属の種（Juglans spp.）、レタス（Lactuca sativa）、レンリソウ属の種（Lathyrus spp.）、レンズマメ（Lens culinaris）、アマ（Linum usitatissimum）、レイシ（Litchi chinensis）、ミヤコグサ属の種（Lotus spp.）、トカドヘチマ（Luffa acutangula）、ルピナス属の種（Lupinus spp.）、オオスズメノヤリ（Luzula sylvatica）、トマト属の種（Lycopersicon spp.） ［例えば、リコペルシコン・エスクレンタム（Lycopersicon esculentum）、リコペルシコン・リコペルシカム（Lycopersicon lycopersicum）、リコペルシコン・ピリフォルメ（Lycopersicon pyriforme）］、マクロティロマ属の種（Macrotyloma spp.）、リンゴ属の種（Malus spp.）、アセロラ（Malpighia emarginata）、マメイアップル（Mammea americana）、マンゴー（Mangifera indica）、イモノキ属の種（Manihot spp.）、サポジラ（Manilkara zapota）、ムラサキウマゴヤシ（Medicago sativa）、シナガワハギ属の種（Melilotus spp.）、ミント属の種（Mentha spp.）、ススキ（Miscanthus sinensis）、ヘチマ属の種（Momordica spp.）、クロミグワ（Morus nigra）、バショウ属の種（Musa spp.）、タバコ属の種（Nicotiana spp.）、オリーブ属の種（Olea spp.）、オプンティア属の種（Opuntia spp.）、オルニトプス属の種（Ornithopus spp）.、イネ属の種（Oryza spp）［例えば、イネ（Oryza sativa）、オリザ・ラティフォリア（Oryza latifolia）］、キビ（Panicum miliaceum）、スイッチグラス（Panicum virgatum）、パッションフルーツ（Passiflora edulis）、パースニップ（Pastinaca sativa）、チカラシバ属の種（Pennisetum sp.）、ワニナシ属の種（Persea spp.）、パセリ（Petroselinum crispum）、クサヨシ（Phalaris arundinacea）、インゲンマメ属の種（Phaseolus spp.）、オオアワガエリ（Phleum pratense）、ナツメヤシ属の種（Phoenix spp.）、ヨシ（Phragmites australis）、ホオズキ属の種（Physalis spp.）、マツ属の種（Pinus spp.）、ピスタチオ（Pistacia vera）、エンドウ属の種（Pisum spp.）、イチゴツナギ属の種（Poa spp.）、ポプラ属の種（Populus spp.）、プロソピス属の種（Prosopis spp.）、サクラ属の種（Prunus spp.）、バンジロウ属の種（Psidium spp.）、ザクロ（Punica granatum）、セイヨウナシ（Pyrus communis）、ナラ属の種（Quercus spp.）、ダイコン（Raphanus sativus）、ルバーブ（Rheum rhabarbarum）、スグリ属の種（Ribes spp.）、トウゴマ（Ricinus communis）、ブラックベリー属の種（（Rubus spp.）、サトウキビ属の種（Saccharum spp.）、ヤナギ属の種（Salix sp.）、スワトコ属の種（Sambucus spp.）、ライムギ（Secale cereale）、ゴマ属の種（Sesamum spp.）、シロガラシ属の種（Sinapis sp.）、ナス属の種（Solanum spp.）［例えば、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ヒラナス（Solanum integrifolium）またはトマト（Solanum lycopersicum）］、モロコシ（Sorghum bicolor）、ホウレンソウ属の種（Spinacia spp.）、シジギウム属の種（Syzygium spp.）、マリーゴールド属の種（Tagetes spp.）、タマリンド（Tamarindus indica）、カカオ（Theobroma cacao）、シャジクソウ属の種（Trifolium spp.）、ガマグラス（Tripsacum dactyloides）、トリチコセカレ・リンパウイ（Triticosecale rimpaui）、コムギ属の種（Triticum spp.） ［例えば、パンコムギ（Triticum aestivum）、デュラムコムギ（Triticum durum）、リベットコムギ（Triticum turgidum）、トリチカム・ハイベルナム（Triticum hybernum）、トリチカム・マチャ（Triticum macha）、コムギ（Triticum sativum）、ヒトツブコムギ（Triticum monococcum）またはトリチカム・バルガレ（Triticum vulgare）］、ヒメキンレンカ（Tropaeolum minus）、キンレンカ（Tropaeolum majus）、スノキ属の種（Vaccinium spp.）、ソラマメ属の種（Vicia spp.）、ササゲ属の種（Vigna spp.）、ニオイスミレ（Viola odorata）、ブドウ属の種（Vitis spp.）、トウモロコシ（Zea mays）、ワイルドライス（Zizania palustris）、ナツメ属の種（Zizphus spp.）、とりわけ、アマランス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリ、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、アマ、ケール、レンズマメ、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、カボチャ、茶および藻類。ある特定の実施形態では、植物は作物である。作物の例としては、とりわけ、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、ナタネ、ワタ、トマト、ジャガイモ、またはタバコが挙げられる。

ある特定の実施形態は、本明細書に記載の、除草剤耐性植物の子孫（progeny）またはディセンダント（descendant）、ならびに除草剤耐性植物に由来する種子および除草剤耐性植物に由来する細胞を包含する。

一部の実施形態では、本開示は、子孫植物またはディセンダント植物であって、植物細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドをその植物の細胞の少なくとも一部において含む、植物に由来し、プロモーターは、当該ポリヌクレオチドによってコードされるＣＰＹ８１Ｅポリペプチドを発現することができる、子孫植物またはディセンダント植物を提供し、ここで、子孫植物またはディセンダント植物は、プロモーターに作動可能に連結された組み換えポリヌクレオチドをその植物の細胞の少なくとも一部において含み、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現が、子孫植物またはディセンダント植物に除草剤に対する耐性を付与する。

一実施形態では、本開示の種子は好ましくは、除草剤耐性植物の除草剤耐性特徴を含む。他の実施形態では、種子は、植物細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドをその植物の細胞の少なくとも一部において含む、植物へと発芽することができ、プロモーターは、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＹＰ８１Ｅポリペプチドを発現することができ、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現が、子孫植物またはディセンダント植物に除草剤に対する耐性を付与する。

一部の実施形態では、本開示の植物細胞は、植物または植物の一部を再生することができる。他の実施形態では、植物細胞は、植物または植物の一部を再生することができない。植物を再生することができない細胞の例としては、それらに限定されないが、胚乳、種皮（外種皮および果皮）、および根冠が挙げられる。

別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣＰＹ８１Ｅポリペプチドをコードする核酸によって形質転換された植物細胞に関するものであり、ここで、植物細胞における核酸の発現は、植物細胞の野生型品種と比較して、除草剤に対する抵抗性または耐性の向上をもたらす。

いくつかの実施形態は、除草剤耐性植物から調製された植物性産物を提供する。一部の実施形態では、植物性産物の例としては、限定されないが、穀物、油、および粗粉（meal）が挙げられる。一実施形態では、植物性産物とは、植物穀物（例えば、飼料としての用途または加工に適した穀物）、植物油（例えば、食品またはバイオディーゼルとしての用途に適した油）、または植物粗粉（例えば、飼料としての用途に適した粗粉）である。好ましい植物性産物は、飼料、種子粗粉、油、または種子処理被覆種子である。好ましくは、粗粉および／または油は、ＣＹＰ８１Ｅ核酸またはＣＹＰ８１Ｅタンパク質を含む。

ある特定の実施形態では、植物または植物部分から調製された植物性産物が提供され、ここで、植物または植物部分は、植物細胞中で機能性のプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドをその植物の細胞の少なくとも一部において含み、プロモーターは、ポリヌクレオチドによってコードされるＣＹＰ８１Ｅポリペプチドを発現することができ、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現が、植物または植物部分に除草剤に対する耐性を付与する。

植物を生育させた現場で産物を生産する場合もあり、植物を生育させた現場から植物および／またはその部分を取り出して産物を生産する場合もある。通例には、植物を生育させ、望ましい収穫可能な部分を植物から取り出し、反復サイクルで実施可能な場合、産物は植物の収穫可能な部分から作製される。例えば、本開示の植物の収穫可能な部分を繰り返して取り出すことにより、および必要な場合、産物を得るためにそれらの部分の更なる加工により、産物生産の工程を繰り返すことを可能にしつつ、植物を生育させる工程を本発明の方法が実施されるごとに一回のみ実施してもよい。植物を生育させる工程を繰り返すこと、および、蓄積された植物または植物部分について産物の生産を次いで一度実施するまで、植物または収穫可能な部分を貯蔵すること、も可能である。また、植物を生育させる工程および産物を生産する工程は、時間的に重なって、更にかなりの程度まで同時に、または連続して実施してもよい。一般には植物を、しばらくの間生育させ、その後に、産物を生産する。

オーキシン除草剤
合成オーキシン除草剤はまた、その作用様式に基づいて、オーキシン系、生長調節除草剤、またはグループＯもしくはグループ４除草剤とも呼ばれる。合成オーキシン除草剤の作用様式とは、この除草剤は、細胞壁の可塑性および核酸代謝に影響を与えるように思われ、このことによって、非制御の細胞分裂および増殖という結果につながる可能性がある、ということである。合成オーキシン除草剤のグループには、４つの化学ファミリー：フェノキシ、カルボン酸（またはピリジン）、安息香酸、および最新のファミリー、キノリンカルボン酸が含まれる。

フェノキシ除草剤は最も一般的であり、（２，４－ジクロロフェノキシ）酢酸（２，４－Ｄ）が発見された１９４０年代以来、除草剤として使用されてきた。他の例としては、４－（２，４－ジクロロフェノキシ）酪酸（２，４－ＤＢ）、２－（２，４－ジクロロフェノキシ）プロパン酸（２，４－ＤＰ）、（２，４，５－トリクロロフェノキシ）酢酸（２，４，５－Ｔ）、２－（２，４，５－トリクロロフェノキシ）プロピオン酸（２，４，５－ＴＰ）、２－（２，４－ジクロロ－３－メチルフェノキシ）－Ｎ－フェニルプロパンアミド（クロメプロップ）、（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）酢酸（ＭＣＰＡ）、４－（４－クロロ－ｏ－トリルオキシ）酪酸（ＭＣＰＢ）、および２－（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）プロパン酸（ＭＣＰＰ）、が挙げられる。

次に大きい化学ファミリーは、ピリジン除草剤とも呼ばれるカルボン酸除草剤である。例としては、３，６－ジクロロ－２－ピリジンカルボン酸（クロピラリド）、４－アミノ－３，５，６－トリクロロ－２－ピリジンカルボン酸（ピクロラム）、（２，４，５－トリクロロフェノキシ）酢酸（トリクロピル）、および４－アミノ－３，５－ジクロロ－６－フルオロ－２－ピリジルオキシ酢酸（フルロキシピル）、が挙げられる。第３の化学ファミリーは安息香酸であり、その例としては、３，６－ジクロロ－ｏ－アニシン酸（ジカンバ）および３－アミノ－２，５－ジクロロ安息香酸（コランベン）が挙げられる。オーキシン系除草剤の第４の最新の化学ファミリーは、キナリンカルボン酸ファミリーであり、これには、７－クロロ－３－メチル－８－キノリンカルボン酸（キンメラック）および３，７－ジクロロ－８－キノリンカルボン酸（キンクロラック）が含まれる。この後者は、広葉樹または双子葉植物のみを本質的に防除する他のオーキシン様除草剤とは異なり、それが一部のイネ科雑草も防除する、という点で独特である。

合成オーキシン除草剤は、雑草を防除する方法として、本明細書に記載の組成物および方法によって提供される植物および種子を含む植物栽培地域に施用することができる。本明細書に記載の組成物および方法によって提供される植物および種子は、合成オーキシン除草剤耐性形質を含み、したがって、１つまたは複数のオーキシン除草剤の施用に対して耐性である。除草剤の施用は、推奨される商業的量（１×）またはこれの任意の分数もしくは倍数、例えば、推奨される商業的量の２倍（２×）であってもよい。オーキシン除草剤の量は、除草剤および製剤に応じて、酸当量／１ポンド／１エーカー（ｌｂ ａｅ／エーカー）もしくは酸当量／１グラム／１ヘクタール（ｇ ａｅ／ｈａ）として、または有効成分のポンド／１エーカー（ｌｂ ａｉ／エーカー）もしくは有効成分のグラム／１ヘクタール（ｇ ａｉ／ｈａ）として表すことができる。植物栽培地域は、除草剤の施用時に雑草植物を含んでもよいが、含まなくてもよい。

除草剤の施用は、いくつかのオーキシン除草剤、もしくは任意の他の適合性の除草剤のうちの１つ、２つまたはそれらの組合せを用いて、連続的であってもよく、またはタンク内混合であってもよい。広範囲の双子葉雑草、単子葉雑草、またはその両方を防除するために、本明細書に記載のＣＹＰ８１Ｅタンパク質を発現する植物を含む区域に、生育期にわたって、組合せまたは単独で１つの除草剤のまたは２つ以上の除草剤の複数回の施用を使用してもよいが、例えば、２回の施用（例えば、植え付け前の施用と発芽後の施用、もしくは発芽前の施用と発芽後の施用）または３回の施用（例えば、植え付け前の施用と、発芽前の施用と、発芽後の施用、もしくは発芽前の施用と２回の発芽後の施用）である。

除草剤抵抗性雑草の防除
いくつかの実施形態は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現または活性を低減させるポリヌクレオチドを含む組成物と雑草を接触させることによって、植物栽培現場にて除草剤抵抗性雑草の生長を防除するための組成物および方法を提供する。

植物における標的ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の浸透移行性の調節（例えば、浸透移行性の抑制またはサイレンシング）とは、標的ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子または標的ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子から転写されるＲＮＡのいずれかにおける１８個以上の連続ヌクレオチドの配列と本質的に同一または本質的に相補的であるヌクレオチド配列中にセグメントを有するポリヌクレオチド分子を植物へ局所的に施用することによるものとすることができ、それによって、組成物は、植物の内部に浸透するとともに、転写されたＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズする一本鎖ＲＮＡの作用によって標的ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の浸透移行性の調節を誘発する。

ポリヌクレオチドは、植物における内因性遺伝子の浸透移行性の調節または抑制を誘発するように設計され、抵抗性植物の内因性ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の配列（これは、コード配列であっても非コード配列であってもよい）と、または、抵抗性植物の内因性ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子から転写されるＲＮＡの配列と、本質的に同一であるかまたは本質的に相補的である配列を有するように設計される。「本質的に同一である」または「本質的に相補的である」とは、ポリヌクレオチド（または二本鎖ポリヌクレオチドのうちの少なくとも一方の鎖）が、内因性遺伝子の調節または抑制を達成するために、植物細胞における生理学的条件下で、内因性遺伝子または内因性遺伝子から転写されるＲＮＡにハイブリダイズするように設計されることを意味する。

ある特定の実施形態では、組成物および方法は、植物細胞へのポリヌクレオチドによる浸透に対して、植物組織、例えば葉、茎、根、花、または果実の表面をコンディショニングするための浸透性増強剤および浸透性増強処理を含むことができる。植物細胞へのポリヌクレオチドの移送は、植物組織に対するポリヌクレオチの事前または同時期の施用により、容易化することができる。一部の実施形態では、浸透性増強剤は、ポリヌクレオチド組成物の施用に続いて施用される。浸透性増強剤により、クチクラワックスバリア、気孔、および／または細胞壁もしくは膜バリアをとおしたかつ植物細胞へのポリヌクレオチドの経路が可能となる。植物細胞への組成物の移送を容易化するのに適した作用剤には、植物の外面の浸透性を高める作用剤、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する植物細胞の浸透性を高める作用剤が含まれる。植物細胞への移送を容易化するかかる作用剤には、化学的作用剤、もしくは物理的作用剤、またはそれらの組合せが含まれる。

コンディショニングのための化学的作用剤には、（ａ）界面活性剤、（ｂ）有機溶媒もしくは水溶液もしくは有機溶媒の水性混合物、（ｃ）酸化剤、（ｅ）酸、（ｆ）塩基、（ｇ）油、（ｈ）酵素、またはそれらの組合せが含まれる。方法の実施形態は、インキュベーション工程、中和工程（例えば酸、塩基、もしくは酸化剤を中和することまたは酵素を不活性化すること）、すすぎ工程、またはそれらの組合せを適宜含んでもよい。ポリヌクレオチドによる浸透に対する植物のコンディショニングためのかかる作用剤は、任意の好都合な方法、例えば、粉末、乳剤、懸濁液、または溶液で噴霧またはコーティングすることにより植物に施用される；同様に、ポリヌクレオチド分子は、任意の好都合な方法、例えば、溶液、乳剤、または懸濁液を噴霧するまたは拭うことにより植物に施用される。

検出ツール
いくつかの実施形態は、除草剤抵抗性植物、またはその細胞もしくは組織を特定するための方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、遺伝子の配列の一部を特異的に認識するプライマーまたはプローブを使用することを含む。一実施形態では、方法は、植物におけるＣＰＹ８１Ｅ遺伝子の発現レベルを特定することに基づく。一部の実施形態では、ＰＣＲベースの技法を使用して、処理前の感受性植物と比較して抵抗性植物において差次的に発現するＣＰＹ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化する。換言すると、除草剤処理前の感受性植物と比較して、抵抗性植物では基礎の発現レベルが高められている。

一部の実施形態では、特定は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施される。方法はまた、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子に特異的な検出可能なマーカーを用意することを含むことができる。実施形態では、検出は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、またはＲＮＡハイブリダイゼーション技法を使用して実施される。

一実施形態では、方法は、Ｓ植物とＲ植物との間のＳＮＰの存在に基づく。これは、ＴａｑｍａｎまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｅａｃｏｎなどのＰＣＲ産物でのＳＮＰ特異的ハイブリダイゼーションプローブの蛍光検出に基づくことができる。Ｓｅｑｕｅｎｏｍ均質的Ｍａｓｓ Ｅｘｔｅｎｄ（ｈＭＥ）およびｉＰＬＥＸジェノタイピングシステムなどの他の戦略には、ＳＮＰ特異的ＰＣＲプライマー伸長産物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法が含まれる。

他の方法の利用には、ＫＡＳＰ（商標）、すなわちＫｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ Ａｌｅｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲの使用が含まれる。これは、競合する対立遺伝子特異的ＰＣＲに基づいており、一塩基多型（ＳＮＰ）のスコアリング、ならびに特定の遺伝子座にての欠失および挿入を可能にする。３’末端に標的ＳＮＰを有する２つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーが使用され、共通のリバースプライマーが両方に使用される。プライマーは、異なる蛍光レポーター（レポーター分子）と互換性のある固有の「テール」配列（レポーターヌクレオチド配列）を有する。プライマーを、ユニバーサル蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）カセットおよびＴａｑポリメラーゼを含む混合物と共に試料と接触させる。ＰＣＲサイクルのラウンド過程で、テール配列によりＦＲＥＴカセットがＤＮＡに結合し、蛍光を発することが可能となる。例えば、Yan et al. “Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean” Plant Genetics, Genomic and Biotechnology 2（1）: 90 - 94 （2014）；Semagn et al. “Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR （KASP）: overview of the technology and its application in crop improvement” Molecular Breeding 33（1）: 1 - 14 （2013）、を参照されたい。本方法では、一方の蛍光シグナル（レポーター分子）の発光または他方の発光は、植物が２つの種のうちの１つであることを指示し、ここで、両シグナルの存在は雑種を指示する。本明細書の例では、６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；および６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）蛍光団の使用が示されるが、しかし、測定可能なシグナルを生成する便利な任意の手段を使用することができる。
限定することを意図しないが例としては、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ＳｙＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ；ＶｉＣ；ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０、ＲＯＸ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ；ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０；ＣＹ５；Ｑｕａｓａｒ ６７０；Ｑｕａｓａｒ ７０５；およびＦｒｅｔ、が挙げられる。

まとめると、第１の種のゲノム内の第１の標的ヌクレオチド配列を認識する第１のプライマーを生成し、第２の種の第２の標的ヌクレオチド配列を認識する第２のプライマーを生成し、すべての遺伝子型に普遍的な第３の共通のリバースプライマーによって増幅が可能となる。「テール」レポーター配列は、プライマーを備える。発現カセットは、レポーター配列に相補的な配列を含む。ＰＣＲの複数ラウンドとともに、カセットはもはやクエンチされず、測定可能なシグナルが生成される。

ＣＰＹ８１Ｅの位置で設計されたＫＡＳＰプライマーの２つのセットを、配列番号２７～２９および３０～３１に記載する。Ｒ対立遺伝子のプライマーをＨＥＸ蛍光団でタグ付けし、ＳをＦＡＭでタグ付けした。

いくつかの実施形態は、除草剤抵抗性植物を特定するためのキットを提供し、キットは、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子を特異的に認識する少なくとも２つのプライマーまたはプローブを含む。例えば、配列番号１に関連するＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を増幅および／または定量化するためのプライマーを開発した。遺伝子の発現レベルを評価することにより、当業者であれば、植物試料が除草剤耐性植物に由来するかどうかを判定することができる。ある特定の実施形態では、プライマーは配列番号５および６を含む。Ｓ植物とＲ植物との間のＳＮＰの存在を検出するためのキットも提供される。ある特定の実施形態では、プライマーは、配列番号２７～２９または３０～３２を含む。一実施形態では、キットは、２つ以上のプライマーペアを含む。キットはまた、１つまたは複数の陽性対照または陰性対照を含む場合もある。

一部の実施形態では、キットは、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の特定の領域と８０％と１００％との間の配列同一性を有する配列に相当するかまたは相補的である配列を有する、特定のプローブを含む。一部の実施形態では、キットは、ＣＰＹ８１Ｅ遺伝子の特定の領域と９０％と１００％との間の配列同一性を有する配列に相当するかまたは相補的である、特定のプローブを含む。

方法、キット、およびプライマーは、それらに限定されないが、以下を始めとするさまざまな目的に使用することができる：植物、種子または挿し木などの植物物質において除草剤抵抗性の有無を特定すること；作物畑において除草剤抵抗性雑草の存在を判定すること；および農業作物に影響を及ぼす雑草を効果的かつ経済的に管理するための除草剤レジメンを適合させること。

繁殖方法での使用
本開示の植物は、植物育種プログラムにおいて使用することができる。植物育種の目的は、単一の品種または雑種で、種々の望ましい形質を組み合わせることである。農作物の場合、これらの形質には、例えば、病害および昆虫に対する抵抗性、熱および干ばつに対する耐性、低温および凍結に対する耐性、作物の成熟までの時間の短縮、より多い収量ならびにより良好な農学的品質が含まれ得る。多くの作物を機械的に収穫することに関して、発芽および苗立ちの確立、生長速度、熟度ならびに植物および穂の高さなどの植物の特徴の均一性は望ましいことである。伝統的な植物育種は、新規かつ改良された商業用作物を開発する上で重要なツールである。本開示は、第１の親植物を第２の親植物と交配することによって植物を作出するため方法であって、親植物の一方または両方が本明細書に記載の表現型を呈示する植物である、方法を包含する。

当技術分野で知られており、植物育種プログラムで使用される植物育種技法には、それらに限定されないが、循環選抜、バルク選抜、集団選抜、戻し交配、系統育種、自然受粉育種、制限断片長多型増強選抜、遺伝子マーカー増強選択、倍加半数体および形質転換が含まれる。多くの場合、これらの技法の組合せを使用する。

植物育種プログラムにおける雑種の開発には、一般に、同型接合型の近交系の開発、これらの系統の交配および交配の評価が必要である。交配の結果を評価するのに利用可能な多くの解析方法がある。最も古くかつ最も伝統的な解析方法とは、表現型形質の観察である。あるいは、植物の遺伝子型を調べてもよい。

形質転換技法を使用して特定の植物へと操作された遺伝的形質は、植物育種分野において周知されている伝統的な育種技法を使用して別の系統へと移すことができる。例えば、戻し交配アプローチは、形質転換された植物からえり抜きの近交系へ導入遺伝子を移すのによく使用され、結果として生成される子孫は次いで、導入遺伝子を含むことになる。また、近交系を形質転換に使用した場合、遺伝子導入雑種植物を作出するために、遺伝子導入植物を異なる近交系に交配することが可能である。本明細書で使用される場合、「交配」とは、状況に応じて、単純なＸ×Ｙ交配を指してもよく、戻し交配のプロセスを指してもよい。

植物育種プログラムにおける雑種の開発は、以下の３つの工程を含む：（１）最初の育種交配向けの種々の生殖質プールからの植物の選抜；（２）育種交配からの選抜された植物の自家受粉を数世代にわたって行って一連の近交系を作出すること（これら近交系は互いには異なるが、一方では、純種であるとともに高度にホモ接合性である）、ならびに、（３）選抜された近交系を異なる近交系と交配して、雑種を作出すること。近親交配のプロセスの過程で、系統の生長力は低下する。異なる２つ近交系を交配して、雑種を作出すると生長力は回復する。近交系のホモ接合性と均質性の重要な結果とは、近交系の規定のペアを交配することによって創り出される雑種は常に同じである、ということである。ひとたび優れた雑種を与える近交系が特定されると、その雑種の種子は、近交系の親の同質性が維持されている限り、無制限に再生産することができる。

本開示の植物は、例えば、単交配雑種、三元雑種または複交配雑種を作出するために使用することができる。２つの近交系を交配してＦｌ子孫を作出すると、単交配雑種が作出される。複交配雑種を、ペア（Ａ×ＢとＣ×Ｄ）で交配させた４つの近交系から作出し、次いで２つのＦ１雑種を、（（Ａ×Ｂ）かける（Ｃ×Ｄ））で再び交配させる。三元交配雑種は、３つの近交系から作出されるが、この場合、近交系のうちの２つが交配され（Ａ×Ｂ）、次いで、結果として生じるＦｌ雑種が第３の近交系と交配（Ａ×Ｂ）×Ｃされる。Ｆ１雑種が呈する雑種の生長力および均一性の多くが、次の世代（Ｆ２）では失われる。その結果、雑種によって生産された種子は、種まきではなく消費される。

実施形態
以下の番号付けされた実施形態も、本開示の一部を形成する：
１．除草剤に対する耐性を有する、改変された植物、またはその子孫、植物部分、もしくは植物細胞であって、改変された植物は、改変されていない植物と比べて、シトクロムＰ４５０ ８１Ｅ（ＣＹＰ８１Ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの向上した発現を含む、改変された植物、またはその子孫、植物部分、もしくは植物細胞。

２．改変された植物は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、実施形態１の改変された植物。

３．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１または実施形態２の改変された植物。

４．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１～３のいずれか１つの改変された植物。

５．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号３３～４４のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１～４のいずれか１つの改変された植物。

６．ポリヌクレオチドは、植物細胞において機能性のプロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１～５のいずれか１つの改変された植物。

７．除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態１～６のいずれか１つの改変された植物。

８．オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、実施形態１～７のいずれか１つの改変された植物。

９．植物は双子葉植物である、実施形態１～８のいずれか１つの改変された植物。

１０．植物は作物である、実施形態１～９のいずれか１つの改変された植物。

１１．植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、実施形態１～１０のいずれか１つの改変された植物。

１２．改変された植物は、第２の除草剤耐性形質をさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１つの改変された植物。

１３．
（ａ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；または、
（ｂ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。

１４．核酸分子は、分離された、合成の、または組み換えの核酸分子である、実施形態１３の核酸分子。

１５．植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結された、実施形態１３または実施形態１４の核酸分子を含む発現カセット。

１６．実施形態１３もしくは実施形態１４の核酸分子；または実施形態１５の発現カセット、を含むベクター。

１７．配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＹＰ８１Ｅポリペプチド。

１８．実施形態１３もしくは実施形態１４の核酸分子；実施形態１５の発現カセット；実施形態１６のベクター；または実施形態１７のポリペプチド、を含む植物、植物部分、または植物細胞。

１９．実施形態１３もしくは実施形態１４の核酸分子；実施形態１５の発現カセット；実施形態１６のベクター；または実施形態１７のポリペプチド、を含む生体試料。

２０．除草剤耐性を備える植物を作出するための方法であって、植物においてＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を向上させることを含み、ここで、植物の除草剤耐性が、向上した発現を欠く植物と比較した場合に向上している、方法。

２１．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、ポリヌクレオチドは植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、導入することと；植物細胞から植物を再生することと、を含む実施形態２０の方法。

２２．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態２０または実施形態２１の方法。

２３．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態２０～２２のいずれか１つの方法。

２４．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号３３～４４のいずれかと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態２０～２３のいずれか１つの方法。

２５．除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態２０～２４のいずれか１つの方法。

２６．オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、実施形態２０～２５のいずれか１つの方法。

２７．植物は双子葉植物である、実施形態２０～２６のいずれか１つの方法。

２８．植物は作物である、実施形態２０～２７のいずれか１つの方法。

２９．植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、実施形態２０～２８のいずれか１つの方法。

３０．植物栽培現場で望ましくない植生を防除するための方法であって：ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物を植物栽培現場にて提供することであって、ポリヌクレオチドの発現が除草剤に対する耐性を植物に付与する、提供することと；除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、を含む方法。

３１．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態３０の方法。

３２．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態３０または実施形態３１の方法。

３３．ポリヌクレオチドは、植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態３０～３２のいずれか１つの方法。

３４．除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態３０～３３のいずれか１つの方法。

３５．オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、実施形態３０～３４のいずれか１つの方法。

３６．植物は双子葉植物である、実施形態３０～３５のいずれか１つの方法。

３７．植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、実施形態３０～３６のいずれか１つの方法。

３８．植物栽培現場にて除草剤抵抗性雑草の生長を防除するための方法であって：ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現または活性を低減させるポリヌクレオチドを含む組成物と雑草を接触させることと；除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、を含む方法。

３９．ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドである、実施形態３８の方法。

４０．ポリヌクレオチドは、配列番号１のうちの少なくとも１８個以上の連続するヌクレオチドと本質的に同一のまたは本質的に相補的な配列を含む、実施形態３８または実施形態３９の方法。

４１．ポリヌクレオチドは２６～６０個のヌクレオチドの長さを有する、実施形態３８～４０のいずれか１つの方法。

４２．ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態３８～４１のいずれか１つの方法。

４３．除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態３８～４２のいずれか１つの方法。

４４．オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、実施形態３８～４３のいずれか１つの方法。

４５．雑草はヒユモドキである、実施形態３８～４４のいずれか１つの方法。

４６．組成物は、ポリヌクレオチドが雑草の表面から雑草の細胞へと浸透することを可能にする作用剤を含む、実施形態３８～４５のいずれか１つの方法。

４７．実施形態１～１２のいずれか１つの植物、植物部分、または植物細胞から調製された産物であって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、産物。

４８．産物は、飼料、種子粗粉、油、または種子処理被覆種子である、実施形態４７の産物。

４９．植物性産物を生産するための方法であって、実施形態１～１２のいずれか１つの植物または植物部分を加工して植物性産物を得ることを含み、ここで、植物性産物が、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、方法。

５０．植物性産物は、飼料、種子粗粉、油、または種子処理被覆種子である、実施形態４９の方法。

５１．除草剤抵抗性植物を特定するための方法であって、除草剤抵抗性を有するらしいと推察される植物由来の生体試料を用意することと；生体試料中のＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することであって、ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子が、同種の除草剤感受性植物と比較して除草剤抵抗性植物において差次的に発現する、定量化することと；定量化に基づいて、植物が除草剤抵抗性であることを判定することと、を含む方法。

５２．生体試料はヒユモドキ由来である、実施形態５１の方法。

５３．除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態５１または実施形態５２の方法。

５４．ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することは、ＣＹＰ８１Ｅ ｍＲＮＡを定量化することを含む、実施形態５１～５３のいずれか１つの方法。

５５．ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することは、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドを定量化することを含む、実施形態５１～５４のいずれか１つの方法。

５６．ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、除草剤の施用前の除草剤感受性植物と比較して、除草剤抵抗性植物において少なくとも４倍の差次的発現を有する、実施形態５１～５５のいずれか１つの方法。

５７．ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態５１～５６のいずれか１つの方法。

５８．発現を定量化することは、少なくとも２つのプライマーを使用して核酸を増幅することを含む、実施形態５１～５７のいずれか１つの方法。

５９．少なくとも２つのプライマーは配列番号５および配列番号６を含む、実施形態５１～５８のいずれか１つの方法。

６０．除草剤抵抗性植物を特定するためのキットであって、少なくとも２つのプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマーが、同種の除草剤感受性植物と比較して、除草剤抵抗性植物において差次的に発現するＣＹＰ８１Ｅ遺伝子を認識する、キット。

６１．ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態６０のキット。

６２．陽性対照および陰性対照のうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態６０または実施形態６１のキット。

６３．ｑＲＴ－ＰＣＲ溶液の成分をさらに含む、実施形態６０～６２のいずれか１つのキット。

６４．植物はヒユモドキであり、除草剤はオーキシン除草剤である、実施形態６０～６３のいずれか１つのキット。

本明細書に記述のあらゆる刊行物および特許出願は、本発明が属する当業者の技術レベルを指示するものである。あらゆる刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれていると具体的かつ個別に指示されているかのように、同程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。

前述の発明について、明白な理解のために例示および例によりある程度詳細に説明してきたが、ある特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかである。

以下の例は、例示として提供されるものであり限定として提供されるものではない。

［実施例１］

抵抗性応答
ＨＰＰＤ阻害剤および２，４－Ｄに対する耐性を示すヒユモドキの２つの集団を、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（「ＣＨＲ」と呼ばれる）（Evans et al. 2019）とＮｅｂｒａｓｋａ（「ＮＥＢ」と呼ばれる）（Bernards et al. 2012）の両方から特定した。各集団からの除草剤抵抗性植物を、除草剤感受性のヒユモドキ集団（ＷＵＳ；Ｂｒｏｗｎ Ｃｏｕｎｔｙ、Ｏｈｉｏで最初に収集された）と交配し、Ｆ_１種子をスクリーニングして、ＨＰＰＤ阻害剤と２，４－Ｄの両方に対する抵抗性を確認した。これらのＦ_１集団をスクリーニングするために、植物を先に記載の温室条件（Lillie et al., 2020）で生育し、最初の識別用量のメソトリオン（２２０ｇ ａｉ ｈａ^－１；Ｃａｌｌｉｓｔｏ）に加えて１％ｖ／ｖ作物油濃縮物を噴霧し、これに続いて、２，４－Ｄの後期ＰＯＳＴ処理（５６０ｇ ａｅ ｈａ^－１；２，４－Ｄアミン）に加えて０．２５％ｖ／ｖ非イオン性界面活性剤を噴霧した。すべての除草剤の施用は、先に記載のように（Lillie et al. 2020）、可動ノズルスプレーチャンバーを使用し行った。ＮＥＢ由来およびＣＨＲ由来のＦ_１系統のそれぞれのうちで、完全兄弟Ｆ_１生存者のペアを交配し、いくつかの分離した疑似Ｆ_２集団を形成した。ヒユモドキは雌雄異株であるので、Ｆ_１植物を自家受粉して真のＦ_２集団を創り出すことはできない。

ＮＥＢとＣＨＲから単一の疑似Ｆ_２（以下、Ｆ_２と呼ぶ）集団をそれぞれ選抜し、各Ｆ_２からの数百の種子を、１２時間昼／夜サイクル（３５℃／１５℃）に設定されたグロースチャンバ内で湿潤ろ紙上で４８時間発芽させた。Ｗｅｅｄ Ｌｉｔｅ Ｍｉｘ［ＬＣ１（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｎａｄａ）：Ｓｏｉｌ：Ｐｅａｔ：Ｔｏｒｐｅｄｏ Ｓａｎｄの３：１：１：１混合物］を満たした５０ｃｍ^３ポットに、発芽苗を移植し、植物が高さ４～６ｃｍに達するまで温室で生育した。次いで、各Ｆ_２集団から１００本の植物体を、Ｗｅｅｄ Ｌｉｔｅ Ｍｉｘで満たされた３．８Ｌの丸型ポットに移植し、植物が高さ８～１０ｃｍに達するまで生育した。次いで、最小の完全開葉から組織を採取し、即座に液体窒素に入れ、ＲＮＡ抽出まで－８０℃で保存した。すべての組織は、同日の午前１０時から正午までの２時間以内に採取した。組織は除草剤の施用前に採取され、除草剤処理の組織はこの研究には含めなかった。広範な（かつ高価な）経時的ＲＮＡｓｅｑ研究を使用することなしでは、除草剤施用によって誘導される潜在的な抵抗性遺伝子を特定することは、抵抗性植物と感受性植物の間のストレスおよび枯死経路に及ぼす除草剤処理の影響が差次的であることに起因して、極端に困難である（Giacomini et al., 2018）。

すべてのＦ_２植物は、植物それぞれが複数の側芽を生成するまで、さらに３週間生長し続け、側芽生成の時点で、側芽を切り取り、発根ホルモンに浸し、湿った土壌で満たしたフラットの４００ｃｍ^３インサートに移植した。このフラットを、クローンが良好な根系を確立するまで（およそ３～４週間）、透明１５ｃｍプラスチックドーム（高湿度を維持するため）でカバーした。植物それぞれから４つのクローンを生成し、各クローンを高用量または低用量にてのＨＰＰＤ阻害剤または２，４－Ｄのいずれかで処理して、複数の除草剤抵抗性について各Ｆ_２個体の表現型を決定した。低量および高量のＨＰＰＤ阻害剤は、それぞれ、テンボトリオン２７ｇおよび２７０ｇ ｈａ^－１（Ｌａｕｄｉｓ）とした。２，４－Ｄの低量および高量は、それぞれ、５６０ｇおよび２２４０ｇ ａｅ ｈａ^－１（２，４－Ｄアミン）とした。クローンを、１～１０のスケールを使用して、１４ＤＡＴおよび２１ＤＡＴで除草剤損傷について視覚的に評価した（スコア１０は植物損傷がまったくないことを指示）。

クローニングおよび噴霧の手順を各集団からの別の７０の植物体で繰り返して、２つの抵抗性形質が互いに独立して分離されているかどうかを評価するために、フィッシャーの正確確率検定に十分なデータを作り出した。視覚的評価尺度カットオフ３を使用して、植物を感受性または抵抗性のいずれかとしてスコアリングし、各カテゴリのカウントデータをＲに送って、ｆｉｓｈｅｒ．ｔｅｓｔ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ＝“ｔｗｏ．ｓｉｄｅｄ”）を使用して解析した。

２１ＤＡＴで両方の量にてのクローンの視覚的評価に基づいて、Ｆ_２植物を、テンボトリオンと２，４－Ｄの両方に対して抵抗性が最低から最高への順番でランク付けした。次いで、各Ｆ_２集団内で、植物を４つのカテゴリにグループ分けした：（１）ＲＲ、２，４－Ｄとテンボトリオンの両方に対して抵抗性；（２）ＲＳ、２，４－Ｄに対して抵抗性、およびテンボトリオンに感受性；（３）ＳＲ、２，４－Ｄに感受性、およびテンボトリオンに対して抵抗性；ならびに、（４）ＳＳ、２，４－Ｄとテンボトリオンの両方に感受性。各カテゴリで最も抵抗性のものおよび感受性のもの４つ（各集団から計１６の植物体および全体で３２の植物体）を、Ｔｒｉｚｏｌベースの方法（Simms et al. 1993）を使用してＲＮＡを抽出用に選抜し、抽出に続いてＤＮａｓｅＩで処理した。試料を、Ｑｕｂｉｔアナライザーでおよび１％アガロースゲルで試料をランさせることにより、それぞれ品質および量について試料をチェックした後に、Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ構築および配列決定のために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕｒｂａｎａ－ＣｈａｍｐａｉｇｎのＲｏｙ Ｊ．Ｃａｒｖｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒに試料を送った。

ＲＮＡｓｅｑライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡｓｅｑ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐキットを使用して調製した。ライブラリをｑＰＣＲによって定量化し、ＨｉＳｅｑ ４０００配列決定キットバージョン１を使用してＨｉＳｅｑ ４０００上で４つのレーンにわたって配列決定した。Ｆａｓｔｑファイルを、ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ｖ２．１７．１．１４ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて作成し、デマルチプレックスした。アダプターを読取りの３’末端からトリミングし、品質スコア３０未満の任意の先頭または末尾の塩基をＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ－０．３３を介してトリミングし、長さ３０ｂｐ以上であった読取りのみを保持した（Bolger et al. 2014）。

各サブグループ（ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、およびＳＳ）内のトリミング読取りファイルを、Ｔｒｉｎｉｔｙ ｖ２．１．０を使用して連結しかつ組み立てた（Grabherr et al. 2011）。結果として得られる４つのアセンブリすべてを互いに比較し、ＣＤ－ＨＩＴを使用して転写産物のグループにクラスター化した（Li & Godzik 2006）。各グループからの最長の転写物をそのグループの代表として使用し、最終の参照トランスクリプトームを生成した。

以前の研究からの用量反応データによって、ＷＵＳと比較して、ＣＨＲ集団について、メソトリオンに対して抵抗性約１５倍レベル、２，４－Ｄに対して抵抗性約９倍レベルが示された（（Evans et al. 2019）。同様のレベルの２，４－Ｄ抵抗性がＮＥＢ集団で報告されており、Ｎｅｂｒａｓｋａの２，４－Ｄ感受性集団と比較して１０倍の抵抗性（Bernards et al. 2012）であったが、この感受性集団は、シトクロムＰ４５０阻害剤マラチオンでの前処理によって感受性へと復帰したものであった（Figueiredo et al. 2018）。テンボトリオンの場合、ＷＵＳと比較して、ＣＨＲ集団で４３倍の抵抗性、ＮＥＢ集団で１５倍の抵抗性が見られた（Murphy and Tranel, 2019）。ＣＨＲ集団とＮＥＢ集団の両方で、テンボトリオンと２，４－Ｄに対する耐性は独立して分離しているように見えた（それぞれ、ｐ値＝０．２４５７および０．１４５７）。抵抗性の組合せ（ＲＲ、ＲＳ、ＳＲ、およびＳＳ）それぞれを持つ４つのＦ_２植物を選抜することにより、各集団について、わずか１６の植物体からの２つの抵抗性形質のそれぞれについて８つの重複比較を行うことができた（図１）。
［実施例２］

差次的転写および差次的遺伝子発現の解析
以下のパラメータ：－ｂ １００－－ｂｉａｓ－－ｓｉｎｇｌｅ－－ｒｆ－ｓｔｒａｎｄｅｄ－ｌ ２５５－ｓ ４０を用いて、ｋａｌｌｉｓｔｏ（Bray et al. 2016）を使用して、各試料を参照トランスクリプトームアセンブリーに整列させた。次いで、条件として除草剤感受性評価（Ｒ対Ｓ）を用いたスルース（Pimentel et al. 2017）を使用して、これらの疑似アライメントを差次的発現について解析した。スルース解析を、４つの比較すべてについて実行した：ＮＥＢ集団についてはテンボトリオン抵抗性ｖｓ感受性、ＣＨＲ集団についてはテンボトリオン抵抗性ｖｓ感受性、ＮＥＢ集団については２，４－Ｄ抵抗性ｖｓ感受性、および、ＣＨＲ集団については２，４－Ｄ抵抗性ｖｓ感受性（ｎ＝８）。転写産物を、ヒユモドキの参照ゲノムアセンブリー（Lightfoot et al. 2017; Genbank accession GCA_000753965.1）由来の遺伝子モデルにさらにマッピングして、遺伝子レベルの差次的発現を算出すると共に遺伝子をスカフォールドに固定し、その結果、差次的に発現する遺伝子（ＤＥＧ）の任意の物理的クラスタリングを潜在的に特定した。ＧＭＡＰ（Wu & Watanabe 2005）を使用して、スプライスを考慮した（splice-aware）様式で転写産物をゲノムに整列させた（－－ｃｒｏｓｓ－ｓｐｅｃｉｅｓ－ｎ １－－ｍｉｎ－ｔｒｉｍｍｅｄ－ｃｏｖｅｒａｇｅ＝０．８０－－ｍｉｎ－ｉｄｅｎｔｉｔｙ＝０．８０）。次いで、この遺伝子転写物マッピング表をスルースに送り、このスルースを遺伝子モードで再びランして、除草剤抵抗性コホートと感受性コホート間の差次的遺伝子発現を算出した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正済みｐ値（Benjamini & Hochberg 1995）０．１以下の遺伝子をＤＥＧとみなし、さらなる解析で使用した。

トランスクリプトームを、全長９８，１１２，７００ｂｐの５７，１０６の転写物へと組み立てた。３２のライブラリ（各集団ごとに１６）について、試料あたり最低４，０００万の読取りへとすべて配列決定した（配列決定した合計読取りは４０，８００，９７８ｂｐから５４，９３８，５９３ｂｐの範囲であった）。読取りのうち８０％超を各試料についてトランスクリプトームへと整列させ、この場合すべてのライブラリにわたって平均８１．３％のアラインメントであったが、トランスクリプトーム全体にわたっておよそ約４０×のカバレッジがもたらされた。

ＣＨＲＦ_２集団の場合、２，４－Ｄ抵抗性植物と２，４－Ｄ感受性植物の間で３９の差次的に発現する転写産物（ＤＥＴ）、および、テンボトリオン抵抗性植物と感受性植物の間で１２１のＤＥＴがあった。ＮＥＢ Ｆ_２集団では、２，４－Ｄ抵抗性植物と感受性植物の間で１４４５の転写産物が、および、テンボトリオン抵抗性植物と感受性植物の間で１１５の転写産物が、差次的に発現することが、見出された。

４つすべての比較のデータから浮上した差次的発現の遺伝子のうち、除草剤抵抗性について可能性が最も高い候補を、これらの集団の除草剤代謝ベースの抵抗性メカニズムを示唆する先の刊行物が支持するように（Figueiredo et al., 2018；Evans et al., 2019）、それら候補の相対順位、倍数変化発現、および可能性のある代謝抵抗性遺伝子としての遺伝子アノテーションに基づいて、特定した。

定量的ＰＣＲプライマーを、各候補遺伝子に対して開発した（表３）。

６つのハウスキーピング遺伝子についてプライマーも作製し、ｃＤＮＡの５段階対数スケール連続希釈を使用してすべてのプライマーセットについてＰＣＲ効率を算出した。１００％（＋／－５％）に近いＰＣＲ効率を示したプライマーセットのみを保持し、さらなる解析に使用した。

差次的解析の結果を検証するために、ＲＮＡ－ｓｅｑで使用した個体と使用されなかった個体を含めて、ＣＨＲ由来とＮＥＢ由来の両集団からＦ_２植物のサブセットを選抜した（ｎ＝１４）。Ｔｒｉｚｏｌ法（先に記載）を使用して全試料からＲＮＡを抽出し、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＮＥＢ）を使用してＲＮＡをｃＤＮＡに変換した。ｉＴａｑ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）５μＬ、フォワードプライマー（１０μＭ）０．５μＬ、リバースプライマー（１０μＭ）０．５μＬ、ヌクレアーゼフリー水３μＬ、およびｃＤＮＡ １μＬを組み合わせることにより、各プライマーセットについて、各試料で３回重複で定量的ＰＣＲを実施した。３つのハウスキーピング遺伝子を各試料について各プレートでランさせて、内因性対照として利用し、アッセイを２～３回実施して、一貫した結果を確保した。参照試料として感受性の親（ＷＵＳ）を使用して、２^{－ΔΔＣｔ}法（Livak & Schmittgen 2001）を使用して、相対的発現を算出した、。次いで、これらの発現値をＲの表現型評価値に対して回帰して（ｓｔａｔｓ ｖ３．６．１）、各集団について有意な線形関係を試験した。

２，４－Ｄ抵抗性のＣＨＲ集団で最も有意に差次的に発現した転写産物のうちの１つは、イソフラボン２’－ヒドロキシラーゼとしても特定された、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８１Ｅ８）であった。この同じシトクロムＰ４５０はまた、ＮＥＢ集団の２，４－Ｄ抵抗性植物において有意に過剰発現していることも見出されたが、このことが指摘することは、それらの異なる地理的起源にもかかわらず、それら２つの集団間で抵抗性メカニズムを共有する可能性、である。定量的ＰＣＲ解析により、ＣＹＰ８１Ｅ８の過剰発現が検証されたが、その結果、両集団について、その発現と２，４－Ｄに対する表現型応答との間に強い相関関係が見出された（表４）。

他の推定抵抗性遺伝子が同じｑＰＣＲ検証プロセスを受けたが、このことにより確認されたことは、ＨＰＰＤ阻害剤に対して抵抗性のＮＥＢ植物においてグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ－グルコースフラボノイド３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼ）の発現がより高かったことである。テンボトリオンのＣＨＲ集団のＤＥＴとして浮上したＡＢＣトランスポーターも、両集団において、ＨＰＰＤ阻害剤についてばかりではなく、２，４－Ｄ抵抗性についても、抵抗性と相関することが確認された。すべての遺伝子を、ｑＰＣＲベースのアッセイを使用してゲノムコピー数の増大についても試験したが、これらのＤＥＴのいずれについても遺伝子重複の証拠は見出されなかった。

差次的発現を遺伝子レベルでも測定して、（１）パワーを高め、マイナーな転写アイソフォームに起因する交絡情報を除去し、（２）空間遺伝子発現プロファイリング向けに遺伝子をゲノムに、後でマッピングすることを可能とした。ＣＨＲ集団の場合、それぞれ、２，４－Ｄ比較およびテンボトリオン比較用に、９０および３１の差次的に発現した遺伝子（ＤＥＧ）を得た。ここでも、ＮＥＢ集団はより高い数値を与えたが、２，４－Ｄ比較について６７６のＤＥＧ、テンボトリオン比較において２６８のＤＥＧが見出された。
［実施例３］

共発現クラスター解析
ＣＲＯＣを使用して、ＤＥＧの有意なクラスタリングを試験した（Pignatelli et al. 2009）。ＣＲＯＣによって、各スカフォールドに沿ったスライディングウィンドウに存在するｋ個のＤＥＧ（ｎ個の全遺伝子のうち）を得る確率を算出する超幾何分布検定を使用して、クラスターを検索する。ウィンドウサイズ１Ｍｂｐおよびオフセットサイズ５００ｋｂｐを使用し、調整済ｐ値（ＦＤＲ）が０．０５未満であった場合のみ、有意なクラスターと呼んだ。スライディングウィンドウアプローチを使用し、その結果、Ｒ ｖ３．５．１（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ２０１８）を使用して１６の最長のスカフォールドそれぞれに沿ったクラスタリングを視覚化した。ウィンドウサイズ５００ｋｂおよびステップサイズ５００ｋｂとして、ＤＥＧの数を各ウィンドウ内でカウントし、カスタムＲスクリプトを使用してプロットした。

付加的に、全染色体レベルにてのＤＥＧの過剰提示について、各染色体にわたりＤＥＧの数を総計すること、および、このＤＥＧの数を、Ｒにおいてフィッシャーの正確確率検定を使用して当該染色体上のＤＥＧの予想数と比較すること、により試験した。調整済みｐ値（ｐ．ａｄｊｕｓｔ，ｍｅｔｈｏｄ＝‘ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’）を算出した。

ＣＨＲとＮＥＢの両方の２，４－Ｄ抵抗性バイオタイプと感受性バイオタイプの間で差次的に発現した遺伝子が、少数の染色体領域において一緒に物理的にクラスター化されることが見出された。ＣＲＯＣ解析によって、両集団についてスカフォールド４上の領域において有意なクラスタリングが、および、ＮＥＢ集団についてスカフォールド７に有意な領域が、見出された（表５；図２Ａ）。

ＨＰＰＤ抵抗性植物とＨＰＰＤ感受性植物の間で、ＤＥＧについて有意な地域クラスタリングは観察されなかったが、染色体レベルのスカフォールド全体にわたるＤＥＧの過剰提示に関するフィッシャーの正確確率検定によれば、ＮＥＢについて、スカフォールド６および１３上で予想されたよりも有意に高い数のＤＥＧが指示された。この過剰提示解析によって、スカフォールド４（ＣＨＲおよびＮＥＢについて）およびスカフォールド７（ＮＥＢについて）上の２，４－Ｄ比較について先に見出された有意なクラスタリング、ならびにＮＥＢについてスカフォールド１３上のクラスタリング、も特定された。試料サイズが小さいこと（ｎ＝８）が、ＨＰＰＤ比較で共発現クラスターの適切な解像度にとっては、不十分であったかもしれない。

［実施例４］

条件－特異的ＳＮＰ
一塩基多型を、ＧＡＴＫ ｖ３．７（Van der Auwera et al. 2013）により概説されたベストプラクティスを使用して呼び出した。各ＲＮＡ－ｓｅｑ試料からのクリーンなリードを、以下のパラメータ：－－ｏｕｔＳＡＭｔｙｐｅ ＢＡＭ ＳｏｒｔｅｄＢｙＣｏｏｒｄｉｎａｔｅ－－ｑｕａｎｔＭｏｄｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅＳＡＭ ＧｅｎｅＣｏｕｎｔｓ－－ｓｊｄｂＧＴＦｔａｇＥｘｏｎＰａｒｅｎｔＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｐａｒｅｎｔ、を用いて、ＳＴＡＲ ｖ２．５．３（Dobin et al. 2012）を使用してヒユモドキゲノムに最初にマッピングした。読取りグループを割り当て、ＰＣＲ重複をＰｉｃａｒｄ Ｔｏｏｌｓ ｖ１．９５（Ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ２０１９）を使用して削除し、これに続いて、ＧＡＴＫ ＳｐｌｉｔＮＣｉｇａｒＲｅａｄｓツールを使用してイントロン領域に拡張した配列をハードクリッピングした。整列させた塩基それぞれの品質における任意の系統的な偏りを修正するために、一連の高品質ＳＮＰを使用してＧＡＴＫ ＢａｓｅＲｅｃａｌｉｂｒａｔｏｒをランさせた。高品質ＳＮＰデータセットがヒユモドキについて存在しないので、最初に、ＧＡＴＫのＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ関数およびＧｅｎｏｔｙｐｅＧＶＣＦｓ関数を使用して、非較正データに関するバリアントコールの最初のラウンドをまずランさせること、および、次いで、以下の厳格なパラメータ：ＱＤ＜２．０；ＦＳ＞６０．０；ＭＱ＜４０．０；ＭＱＲａｎｋＳｕｍ＜－１２．５；ＲｅａｄＰｏｓＲａｎｋＳｕｍ＜－８．０、を使用してＳＮＰをハードフィルタリングすること、によって、本明細書で生成したデータから一セットを作製した。ベースリキャリブレーションの後、ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒ（パラメータ：－ｄｏｎｔＵｓｅＳｏｆｔＣｌｉｐｐｅｄＢａｓｅｓ－ｓｔａｎｄ＿ｃａｌｌ＿ｃｏｎｆ ２０．０－－ｖａｒｉａｎｔ＿ｉｎｄｅｘ＿ｔｙｐｅ ＬＩＮＥＡＲ－－ｖａｒｉａｎｔ＿ｉｎｄｅｘ＿ｐａｒａｍｅｔｅｒ １２８０００－ＥＲＣ ＧＶＣＦ）およびＧｅｎｏｔｙｐｅ ＧＶＣＦを使用して、この場合は、較正データに関して、バリアントコールを再度ランさせた。ＳＮＰを、最終的な変異体ファイルから抽出し、両アレル性であるとともに以下のパラメータ：－ｗｉｎｄｏｗ ３５－ｃｌｕｓｔｅｒ ３－ｆｉｌｔｅｒ ＱＤ＜２．０－ｆｉｌｔｅｒ ＦＳ＞３０．０を通過したＳＮＰのみを含むようにフィルタリングした。

この最終的なＳＮＰデータセットのうちから、条件特異的なＳＮＰを、ＰＬＩＮＫ ｖ１．９（Chang et al. 2015; Steiss et al. 2012）のケース／対照関連解析を使用して呼び出した。除草剤抵抗性対除草剤感受性の比較それぞれの試料サイズが小さいことから（ｎ＝８）、この関連解析の一部として、１０００回の反復による適応モンテカルロ順列試験もランさせた。０．０５以下の補正済みｐ値を持つＲ植物とＳ植物の間で異なるＳＮＰを、条件特異的ＳＮＰと呼んだ。ＤＥＧと同様に、ウィンドウサイズ５００ｋｂおよびステップサイズ５００ｋｂを使用して、スライディングウィンドウアプローチを使用して、これら条件特異的ＳＮＰを視覚化した。

これらの集団における任意の抵抗性特異的ＳＮＰの存在をチェックするために、ＳＮＰを全遺伝子にわたって呼び出し、条件特異的ＳＮＰ（抵抗性植物と感受性植物の間で変動したもの）を、ＰＬＩＮＫ ｖ１．９のフィッシャーの正確確率検定を使用して、特定した。調整済みｐ値カットオフ０．０５を使用すると、１０および１９２のＳＮＰが、それぞれ、ＣＨＲおよびＮＥＢの２，４－Ｄ抵抗性対感受性の比較で、抵抗性に関連していることが見出された。両集団において、ＳＮＰは、ＤＥＧがクラスター化するのが見出されたのと同じ領域でクラスター化することが見出された。ＣＨＲでは、１０のＳＮＰのうち９がＣＹＰ８１Ｅ８遺伝子を含有するスカフォールド４の領域で見出されたが、一方、その他のＳＮＰはスカフォールド６で見出された。スカフォールド４クラスター内では、ＣＹＰ８１Ｅ８の遺伝子ならびにＰＩＮ３オーキシン排出キャリア遺伝子の両方に有意なＳＮＰが見出された（このことは、２，４－Ｄが合成オーキシンであることを考慮すると、興味深い）。しかし、２，４－Ｄ抵抗性はこれらＳＮＰのいずれかに起因する可能性はなく、というのは、これらのＳＮＰは互いに連鎖不平衡にあり、その結果、原因となる変異体の場所を確認することを困難にしているからである。この領域のファインマッピングは目下進行中である。ＮＥＢでは、１８２のＳＮＰがスカフォールド４領域で見出され、発現解析でＤＥＧのクラスターも示したスカフォールド７領域で６つが見出され、その他４つのＳＮＰがスカフォールド１、２、および１６にわたり点在していた。スライディングウィンドウグラフにより、これらのＳＮＰのクラスタリングが例示され、ＤＥＧスライディングウィンドウグラフと比較すると、ＤＥＧとＳＮＰクラスタリングの共起が示されている（図２Ｂ）。ＨＰＰＤ比較では、抵抗性植物と感受性植物の間に有意なＳＮＰは見出されなかった。ＨＰＰＤ比較においてＳＮＰクラスタリングが欠如していることの理由は、この抵抗性形質のより複雑な性質に起因するとし得るが、というのは、これらの集団では多遺伝子形質であることが実証されているからである（Murphy and Tranel, 2019）。
［実施例５］

対立遺伝子特異的発現の解析
ゲノムのいくつかの領域での差次的遺伝子発現と条件特異的ＳＮＰの両方の共起を考慮して、条件特異的ＳＮＰそれぞれの読取りカウントデータを使用して対立遺伝子特異的発現の仮説について試験して、すべてのヘテロ接合性個体（各対立遺伝子の発現を示したもの）を特定した。次いで、各ＳＮＰ部位にてのホモ接合性の抵抗性および感受性植物を使用して、各ＳＮＰをＲまたはＳとして分類し、次いで、ヘテロ接合性個体のＲまたはＳ関連ＳＮＰそれぞれのカウントデータを使用し、Ｒ（ｒｓｔａｔｉｘ）を使用してＲとＳのＳＮＰの間の読取り深度の有意差について試験した。ＳＮＰおよびこれに関連する調整済みＰ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ、ｐ＝０．１）を、Ｒ（ｇｇｐｕｂｒ）を使用してスカフォールド４クラスター領域にわたりプロットした。

差次的遺伝子発現の領域を備える条件特異的ＳＮＰのクラスタリングによって、対立遺伝子特異的発現の存在が示唆された。対立遺伝子特異的発現（ＡＳＥ）とは対立遺伝子の不均衡の形態として定義され、この場合、一方の親の対立遺伝子が別の対立遺伝子よりも優先的に発現される（Knight 2004）。スカフォールド４クラスターでは、９つのＳＮＰが、ＮＥＢについて統計的に有意で差次的に発現したことが見出された（図３Ａ）。１つを除くすべてについて、Ｒ対立遺伝子はＳ対立遺伝子よりも有意に高い発現を有し、このことはおそらく、何らかのシス作用因子がこの領域に関連しており、その結果、発現を制御していることを、指示する。ＣＨＲ集団については、ヘテロ接合性個体のこのスカフォールド４領域において存在する４つのＳＮＰがあり、３つが２つの対立遺伝子間で有意に異なる発現を示した（図３Ｂ）が、ここでも、Ｒ対立遺伝子はＳ対立遺伝子よりも高い発現を示した。ＡＳＥはこの領域に沿って他の場所でも存在している可能性があるが、３つ以上の個体にわたってヘテロ接合性状態で存在することが見出されたＳＮＰのみをこの解析に含めた。
［実施例６］

シトクロム８１Ｅ８系統解析
ＣＨＲ集団とＮＥＢ集団の両方が、２，４－Ｄに対する抵抗性についてＣＹＰ８１Ｅ８遺伝子に関し同じ上方制御された対立遺伝子を示したが、このことによって、この推定抵抗性対立遺伝子が各集団において独立して進化したのか否かという疑問が起こった。Ｉｌｌｉｎｏｉｓおよびカナダ由来のヒユモドキ試料からの全ゲノム配列に関する以前に公開した（Kreiner et al. 2019）データセットを使用して、系統樹を構築して、各集団からのＣＹＰ８１Ｅ８の進化上の関係を調べた。ｂｏｗｔｉｅ２（Langmead & Salzberg 2012）（パラメータ：－－ｎｏ－ｕｎａｌ－ｔ－Ｌ ２０）を使用して、全ゲノムまたは全トランスクリプトームのデータセットをＣＹＰ８１Ｅ８のＣＤＳに整列させた。次いで、ソートされたｂａｍファイルを、上記と同じＧＡＴＫ ＳＮＰパイプラインに送って、フィルタリングしたｖｃｆファイルを生成した。ＲのＳＮＰＲｅｌａｔｅパッケージにより、このｖｃｆファイルをｇｄｓファイルに変換し、このｇｄｓファイルを次いで使用して関連性に基づいてデンドグラムを作成することができた（ｓｎｐｇｄｓＨＣｌｕｓｔｅｒ；ｓｎｐｇｄｓＣｕｔＴｒｅｅ、ｎ．ｐｅｒｍ＝５０００）。

ＣＹＰ８１Ｅ８遺伝子の系統解析により明らかとなったことは、ＣＨＲとＮＥＢの両集団、ならびにＩｌｌｉｎｏｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉおよびカナダ由来の他のヒユモドキ集団からの各ＣＹＰ８１Ｅ８対立遺伝子の進化上の関連性であった。ＣＨＲおよびＮＥＢ由来のＣＹＰ８１Ｅ８対立遺伝子は、以下を表す３つのグループに分かれた：（１）ＮＥＢ由来の２，４－Ｄ感受性対立遺伝子、（２）ＣＨＲ由来の２，４－Ｄ感受性対立遺伝子、および（３）ＣＨＲとＮＥＢの両方における２，４－Ｄ抵抗性対立遺伝子（図４）。ＣＨＲおよびＮＥＢ由来の２，４－Ｄ抵抗性関連ＣＹＰ８１Ｅ８の緊密なクラスタリングと共に、ＣＨＲおよびＮＥＢ由来の野生型感受性対立遺伝子の分離によって、両集団のＲ対立遺伝子は共通の進化上の起源を有するという十分な証拠が提供される。

実施例１～６の考察
これらの実施例において、ＣＨＲとＮＥＢの両集団で、代謝ベースの除草剤抵抗性に関する強力な候補遺伝子が２，４－Ｄについて見出された。シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ８１Ｅ８）とＡＢＣトランスポーター（ＡＢＣＣ１０）の両方が、２，４－Ｄ感受性植物と比較して、２，４－Ｄ抵抗性植物において一定の過剰発現を示した。こういった結果は、初期の研究であって、シトクロムＰ４５０阻害剤マラチオンが抵抗性表現型を逆転させたということから、ＮＥＢ集団における２，４－Ｄ抵抗性がシトクロムＰ４５０によって媒介される可能性が高いことを見出した、研究を支持する（Figueiredo et al., 2018）。この遺伝子の推定抵抗性対立遺伝子は、Ｆ_２集団からのさらなる抵抗性植物と共分離されたが、ファインマッピングが目下進行中である。

しかし、ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性に関する本発明者らの発見は、あまり明確ではなかった。候補遺伝子の１つ、ＵＤＰ－グルコースフラボノイド３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼは、テンボトリオン感受性植物と比較して、テンボトリオン抵抗性植物において過剰発現することが確認された。この遺伝子の一次機能アノテーションにより、当該遺伝子は果実の成熟に関与していることが示されるが、さらなる研究により、当該遺伝子は外因性物質のグリコシル化による異物代謝に関与している可能性が示された（Greisser et al., 2008）。ＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子のさらなる候補の欠如は、その多重遺伝子性に起因する可能性があり（Oliveira et al., 2018）、このことによって、抵抗性遺伝子座を特定することが困難となっている。付加的に、本発明者らのＲＮＡ－ｓｅｑアプローチでは、構成的差次的発現を介して抵抗性に寄与する遺伝子を特定することに主として焦点を当てていたが、その結果、植物の間で他の抵抗性を付与する変化を見逃す可能性があった。ヒユモドキのメソトリオン抵抗性を研究する最近のＲＮＡ－ｓｅｑ研究は、処理済み植物を含んでおり、感受性植物と比較して、抵抗性植物においてシトクロムＰ４５０ａの発現誘導に関するいくつかの証拠が見出された（Kohlhase et al., 2019）。しかし、この研究で差次的に発現した転写産物の最終リストはおよそ４８００であり、その結果、原因となる抵抗性遺伝子の特定は困難であった。ＮＥＢ集団およびＣＨＲ集団におけるＨＰＰＤ阻害剤抵抗性遺伝子を特定するための遺伝子マッピングアプローチを使用した研究が、目下進行中である。

植物がＲＮＡ－ｓｅｑに先立ち除草剤で処理されていなかったという事実が原因で、共発現ネットワークの特定については、この研究では幅広く追求されなかった。こういった処理の共有なしでは、共発現解析によって意味のある何かを得ることになることはありそうにもなく、これは、共発現解析によって、２つの集団にわたるランダムな発現の違いが測定されることになるからである。実際、共発現ネットワークに最初に着手した際には、情報価値のある結果はまったく得られなかった。

除草剤抵抗性遺伝子候補の特定に加えて、本データはまた、除草剤抵抗性の調節へのいくつかの洞察も明らかにしている。２，４－Ｄ抵抗性について観察されたＤＥＧの物理的クラスタリングによって、共局在遺伝子の共発現の証拠が提供されるが、酵母（Cohen et al. 2000）、シロイヌナズナ属（Williams & Bowles 2004）、Ｃ．エレガンス（C. elegans）（Chen & Stein 2006）、およびヒト（Trinklein et al. 2004）を含めて、ほかの多くの種で観察されてきた現象である。こういった共発現クラスタリングのいくつかの例が隣接する遺伝子ペアの間で見出されるが、より長い染色体間隔にわたる共発現も報告されてきた（Lercher & Hurst 2006; Reimegard et al. 2017）。雑草種のゲノム景観を作り変える除草剤の能力が、最近になってマルバアサガオ（Ipomoea purpurea）で実証されたが、この場合、グリホサート抵抗性集団内の５つのゲノム領域で、選択的スウィープの証拠が見出された（Van Etten et al., 2020）。興味深いことに、除草剤の解毒遺伝子の濃縮が、これらの領域内で明白であった。

こういったクラスタリングの主要な意味合いの一つとは、これらの領域の遺伝子調節の共有メカニズムの可能性である。遺伝子発現の調節は複雑なプロセスであり、転写因子とエンハンサーとの選択的相互作用、転写を可能とする／防止するためのクロマチンのオープニングおよびクロージング、ならびにこれら２つのプロセス間の相互作用が関与する（Voss & Hager 2014）。本発明者らは、すべてのＤＥＧの上流領域を調べ、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）の過剰提示を探したが、共有エンハンサーエレメントの証拠をまったく見出さなかった。物理的にクラスター化した共発現遺伝子の調節メカニズムを研究した先の研究が示したことは、共発現遺伝子ペアは多くの場合では共有転写因子によって調節されるが、一方、１０～２０個の遺伝子にまたがる共有発現のより大きな領域が、クロマチン構造の変化によって影響を受けることである（Batada et al. 2007）。しかし、これまでに研究されたのは少数の例のみであり、調節メカニズムの相互依存性により、遺伝子発現の直接的な原因を突き止めることが困難となっている。とにかく、遺伝子発現パターンに及ぼすクロマチン状態の影響を決定するには、これらの集団でより多くの研究が必要である。

Claims (62)

1. 除草剤に対する耐性を有する、改変された植物、またはその子孫、植物部分、もしくは植物細胞であって、改変された植物は、改変されていない植物と比べて、シトクロムＰ４５０ ８１Ｅ（ＣＹＰ８１Ｅ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの向上した発現を含む、改変された植物、またはその子孫、植物部分、もしくは植物細胞。
2. 改変された植物は、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の改変された植物。
3. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の改変された植物。
4. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の改変された植物。
5. ポリヌクレオチドは、植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の改変された植物。
6. 除草剤はオーキシン除草剤である、請求項１に記載の改変された植物。
7. オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、請求項６に記載の改変された植物。
8. 植物は双子葉植物である、請求項１に記載の改変された植物。
9. 植物は作物である、請求項１に記載の改変された植物。
10. 植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、請求項１に記載の改変された植物。
11. 改変された植物は、第２の除草剤耐性形質をさらに含む、請求項１に記載の改変された植物。
12. （ａ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、
    ヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列；または
    （ｂ）ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、
    ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、ヌクレオチド配列、
    から選択されるヌクレオチド配列を含む、
    核酸分子。
13. 核酸分子は、分離された、合成の、または組み換えの核酸分子である、請求項１２に記載の核酸分子。
14. 植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結された、請求項１２に記載の核酸分子を含む発現カセット。
15. 請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
16. 請求項１２に記載の核酸分子を含む生体試料。
17. 請求項１２に記載の核酸分子を含む植物、植物部分、または植物細胞。
18. 配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＹＰ８１Ｅポリペプチド。
19. 除草剤耐性を備える植物を作出するための方法であって、
    植物においてＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を向上させることを含み、ここで、植物の除草剤耐性が、向上した発現を欠く植物と比較した場合に向上している、
    方法。
20. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入することであって、ポリヌクレオチドは植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、導入することと；
    植物細胞から植物を再生することと、
    を含む、請求項１９に記載の方法。
21. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
22. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１９に記載の方法。
23. 除草剤はオーキシン除草剤である、請求項１９に記載の方法。
24. オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、請求項２３に記載の方法。
25. 植物は双子葉植物である、請求項１９に記載の方法。
26. 植物は作物である、請求項１９に記載の方法。
27. 植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、請求項１９に記載の方法。
28. 植物栽培現場で望ましくない植生を防除するための方法であって：
    ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物を植物栽培現場にて提供することであって、ポリヌクレオチドの発現が除草剤に対する耐性を植物に付与する、提供することと；
    除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、
    を含む、
    方法。
29. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の方法。
30. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項２８に記載の方法。
31. ポリヌクレオチドは、植物細胞において機能性の異種プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２８に記載の方法。
32. 除草剤はオーキシン除草剤である、請求項２８に記載の方法。
33. オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、請求項３２に記載の方法。
34. 植物は双子葉植物である、請求項２８に記載の方法。
35. 植物は、ダイズ、ワタ、キャノーラ、タバコ、トマト、ジャガイモ、アルファルファ、サトウダイコン、またはヒマワリの植物である、請求項２８に記載の方法。
36. 植物栽培現場にて除草剤抵抗性雑草の生長を防除するための方法であって：
    ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドの発現または活性を低減させるポリヌクレオチドを含む組成物と雑草を接触させることと；
    除草剤の有効量を植物栽培現場に施用することと、
    を含む方法。
37. ポリヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドポリヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
38. ポリヌクレオチドは、配列番号１のうちの少なくとも１８個以上の連続するヌクレオチドと本質的に同一のまたは本質的に相補的な配列を含む、請求項３６に記載の方法。
39. ポリヌクレオチドは２６～６０個のヌクレオチドの長さを有する、請求項３８に記載の方法。
40. ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項３６に記載の方法。
41. 除草剤はオーキシン除草剤である、請求項３６に記載の方法。
42. オーキシン除草剤は２，４－Ｄである、請求項４１に記載の方法。
43. 雑草はヒユモドキ（Amaranthus tuberculatus）である、請求項３６に記載の方法。
44. 組成物は、ポリヌクレオチドが雑草の表面から雑草の細胞へと浸透することを可能にする作用剤を含む、請求項３６に記載の方法。
45. 請求項１に記載の植物、植物部分、または植物細胞から調製された産物であって、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、産物。
46. 産物は、飼料、種子粗粉、油、または種子処理被覆種子である、請求項４５に記載の産物。
47. 植物性産物を生産するための方法であって、請求項１に記載の植物または植物部分を加工して植物性産物を得ることを含み、ここで、植物性産物が、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
    方法。
48. 植物性産物は、飼料、種子粗粉、油、または種子処理被覆種子である、請求項４７に記載の方法。
49. 除草剤抵抗性植物を特定するための方法であって、
    除草剤抵抗性を有するらしいと推察される植物由来の生体試料を用意することと；
    生体試料中のＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することであって、
    ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子が、同種の除草剤感受性植物と比較して除草剤抵抗性植物において差次的に発現する、定量化することと；
    定量化に基づいて、植物が除草剤抵抗性であることを判定することと、
    を含む方法。
50. 生体試料はヒユモドキ由来である、請求項４９に記載の方法。
51. 除草剤はオーキシン除草剤である、請求項４９に記載の方法。
52. ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することは、ＣＹＰ８１Ｅ ｍＲＮＡを定量化することを含む、請求項４９に記載の方法。
53. ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子の発現を定量化することは、ＣＹＰ８１Ｅポリペプチドを定量化することを含む、請求項４９に記載の方法。
54. ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、除草剤の施用前の除草剤感受性植物と比較して、除草剤抵抗性植物において少なくとも４倍の差次的発現を有する、請求項４９に記載の方法。
55. ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項４９に記載の方法。
56. 発現を定量化することは、少なくとも２つのプライマーを使用して核酸を増幅することを含む、請求項４９に記載の方法。
57. 少なくとも２つのプライマーは配列番号５および配列番号６を含む、請求項５６に記載の方法。
58. 除草剤抵抗性植物を特定するためのキットであって、少なくとも２つのプライマーを含み、ここで、少なくとも２つのプライマーが、同種の除草剤感受性植物と比較して、除草剤抵抗性植物において差次的に発現するＣＹＰ８１Ｅ遺伝子を認識する、
    キット。
59. ＣＹＰ８１Ｅ遺伝子は、配列番号１と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項５８に記載のキット。
60. 陽性対照および陰性対照のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項５８に記載のキット。
61. ｑＲＴ－ＰＣＲ溶液の成分をさらに含む、請求項５８に記載のキット。
62. 植物はヒユモドキであり、除草剤はオーキシン除草剤である、請求項５８に記載のキット。