CN102971428A

CN102971428A - 对除草剂具有增加的耐受性的植物

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Publication number: CN102971428A
Application number: CN2011800333324A
Authority: CN
Inventors: T·米茨纳; M·维切尔; J·赫茨勒; T·埃尔哈德特; S·特雷施
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2011-05-02
Publication date: 2013-03-13
Also published as: DE112011101566T5; MX2012012775A; AU2011254317A1; BR112012028132A2; EP2566968A4; WO2011145015A1; AR081343A1; US20130053243A1; JP2013529074A; TW201144441A; CA2798067A1; UY33368A; EP2566968A1; EA201291165A1; ZA201209112B

Abstract

本发明涉及控制植物栽培位置处不合需要的植被的方法。该方法包括以下步骤：在所述位置处提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列及/或编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列，然后向所述植物栽培位置处施用有效量的所述除草剂。本发明还涉及包含mut-HPPD的植物及获得此类植物的方法。

Description

对除草剂具有增加的耐受性的植物

发明领域

本发明大体上涉及赋予植物对除草剂的农业水平耐受性的方法。特别地，本发明涉及对“香豆酮(coumarone)衍生物”除草剂具有增加的耐受性的植物。更具体地，本发明涉及方法和由诱变及杂交育种及转化获得的对“香豆酮衍生物”除草剂具有增加的耐受性的植物。

技术背景

自1990年代早期以来，抑制异戊二烯基醌质体醌及生育酚的生物合成中的关键酶4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(4-HPPD；EC1.13.11.27)的除草剂已用于进行选择性杂草控制。其阻断生物合成路径中4-羟苯基丙酮酸转化成尿黑酸(homogentisate)(Matringe等人，2005，Pest Manag Sci.，第61卷：269-276；Mitchell等人，2001，Pest Manag Sci.第57卷：120-128)。认为质体醌是类胡萝卜素生物合成中八氢蕃茄红素去饱和酶(phytoenedesaturase)的必需辅因子(Boeger及Sandmann，1998，Pestic Outlook，第9卷：29-35)。其抑制作用会使植物质体醌及维生素E库耗尽，从而导致漂白症状。类胡萝卜素的损失，特别是其作为对抗光氧化作用的光系统保护剂功能的损失，会导致生长中的芽组织中的叶绿素及光合膜氧化降解。因此，叶绿体合成及功能被破坏(Boeger及Sandmann，1998)。尿黑酸茄尼基转移酶(homogentisate solanesyl transferase，HST)催化质体醌生物合成路径HPPD之后的步骤。HST为异戊二烯基转移酶，其使尿黑酸脱羧并且将来自茄尼基二磷酸酯的茄尼基转移至尿黑酸而因此形成2-甲基-6-茄尼基-1，4-苯醌(MSBQ)，一种沿质体醌生物合成路径的中间物。HST酶为膜结合酶且编码其的基因包括质体靶向序列。

商品化4-HPPD抑制性除草剂的最重要化学种类包括吡唑啉酮类(pyrazolone)、三酮类(triketone)及异唑类(isoxazole)。抑制剂通过形成稳定离子偶极电荷转移复合物而模拟底物4-羟苯基丙酮酸与活性位点中的酶结合亚铁离子的结合。在4-HPPD抑制性除草剂中，三酮磺草酮(triketonesulcotrione)为此组除草剂中首个用于农业中的实例且鉴别了其作用机制(Schulz等人，1993，FEBS Lett.第318卷：162-166)。已报导三酮类是来自瓶刷形分支植物(bottlebrush plant)红千层种(Callistemon spp)的除草组分的纤精酮(leptospermone)的衍生物(Lee等人1997，Weed Sci.第45卷，162-166)。

因为抑制植物中的反应会导致经处理植物的叶变白并且导致所述植物死亡，这些分子中的一些已用作除草剂(Pallett，K.E.等人1997Pestic.Sci.5083-84)。以HPPD为靶且描述于当前现有技术中的除草剂特别地为异

唑类(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利号5,424,276)，特别地异

唑草酮(isoxaflutole)，其为玉米选择性除草剂；二酮腈类(EP496630、EP496631)，特别地2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-CF₃苯基)丙烷-1，3-二酮及2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO₂CH₃-4-2，3Cl₂苯基)丙烷-1，3-二酮；诸如描述于EP625505、EP625508、美国专利号5,506,195中的三酮类，特别地磺草酮；或pyrazolinates。此外，在易感植物物种中，如同前述的4-HPPD抑制性漂白除草剂一般，熟知的除草剂苯吡唑草酮(topramezone)会引发相同类型的植物毒性症状，伴有生长中的芽组织中的叶绿素损失及坏死。苯吡唑草酮属于化学种类吡唑啉酮类或苯甲酰基吡唑类且于2006年以商业引进。当萌芽后施用时，化合物选择性控制玉米中的广谱一年生草及阔叶杂草。

植物对“香豆酮衍生物除草剂”的耐受性也已在许多专利中加以报导。国际申请号WO2010/029311一般性描述HPPD核酸及/或HST核酸在植物中引发除草剂耐受性的用途。WO2009/090401、WO2009/090402、WO2008/071918、WO2008/009908具体公开了某些“香豆酮衍生物除草剂”及“香豆酮衍生物除草剂”耐受性的植物株系。

3种主要策略可用于使植物耐受除草剂，亦即(1)用将除草剂或其活性代谢物转化成无毒产物的酶(诸如对溴苯腈(bromoxynil)或对草铵膦(basta)(EP242236、EP337899)耐受性的酶)去除除草剂毒性；(2)将靶酶突变成对除草剂或其活性代谢物敏感性较小的功能性酶，诸如对草甘膦(glyphosate)耐受性的酶(EP293356、Padgette S.R.等人，J.Biol.Chem.，266，33，1991)；或(3)过表达敏感性酶使得鉴于此酶的动力学常数，在植物中生产相对于除草剂足够的靶酶量，使得具有足够的功能性酶可用而不管其抑制剂之存在。描述了第三种策略用于成功获得对HPPD抑制剂具有耐受性的植物(WO96/38567)。US2009/0172831公开了编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列具有使得氨基酸序列对HPPD抑制剂除草化学品，特别地对三酮抑制剂特异性HPPD突变体具有抗性的酶促活性。

迄今为止，现有技术尚未描述含有至少一种突变的HPPD核酸的香豆酮衍生物除草剂耐受性植物。现有技术亦尚未描述在除获得HPPD基因的基因组以外的基因组中含有突变的香豆酮衍生物除草剂耐受性作物植物。因此，本领域需要鉴定来自其他基因组及物种的香豆酮衍生物除草剂耐受基因。本领域亦需要植物作物和具有对除草剂(诸如香豆酮衍生物除草剂)增加的耐受性及含有至少一种突变的HPPD核酸的植物作物。亦需要控制此类作物植物或作物植物附近杂草生长的方法。当向含有植物作物的区域或植物作物施用除草剂时，这些组合物及方法将允许使用喷雾技术。

发明总结

通过涉及控制植物栽培位置处不合需要的植被的方法的本发明解决问题，所述方法包括以下步骤：

a)在该位置处提供包含至少一种核酸的植物，该核酸包含：

(i)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列，和/或

(ii)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列

b)向该位置施用有效量的所述除草剂。

此外，本发明涉及通过使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、3或5或其变体的核酸编码的mut-HPPD，和/或通过使用由包含核苷酸序列SEQID NO：7或9或其变体的核酸编码的mut-HST鉴别香豆酮衍生物除草剂的方法。

所述方法包括以下步骤：

a)生成包含编码mut-HPPD的核酸的转基因细胞或植物，其中表达mut-HPPD；

b)向a)的转基因细胞或植物及相同品种的对照细胞或植物施用香豆酮衍生物除草剂；

c)在施用所述测试化合物之后，测定转基因细胞或植物及对照细胞或植物的生长或生存力，及

d)选择使对照细胞或植物生长较之转基因细胞或植物的生长降低的测试化合物。

另一目标涉及鉴别编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-HPPD的核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)生成mut-HPPD编码核酸的文库，

b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸并用香豆酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物来筛选所得mut-HPPD编码核酸的群体，

c)比较由所述mut-HPPD编码核酸群体提供的香豆酮衍生物除草剂耐受性水平与由对照HPPD编码核酸提供的香豆酮衍生物除草剂耐受性水平，

d)选择至少一种mut-HPPD编码核酸，其提供较之由对照HPPD编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性水平显著增加的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性水平。

在优选的实施方案中，较之由对照HPPD编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性，步骤d)中选出的mut-HPPD编码核酸提供至少2倍的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性。

抗性或耐受性可通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并且比较所述转基因植物与对照植物加以测定。

另一目标涉及鉴别含有编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-HPPD或mut-HST的核酸的植物或藻类之方法，该方法包括：

a)鉴别植物细胞或绿藻的培养物中有效量的香豆酮衍生物除草剂，

b)用诱变处理剂处理所述植物细胞或绿藻，

c)使所述经诱变处理的细胞群体与a)中鉴别出的有效量的香豆酮衍生物除草剂接触，

d)选择在这些测试条件下存活的至少一个细胞，

e)对来自d)中选出的细胞的HPPD及/或HST基因进行PCR扩增及测序并且将此类序列分别与野生型HPPD或HST基因序列比较。

在优选的实施方案中，诱变处理剂为甲烷磺酸乙酯。

另一目标涉及编码mut-HPPD的分离的核酸，该核酸可通过如上定义的方法鉴别。

在另一实施方案中，本发明涉及由野生型或mut-HPPD核酸转化的植物细胞或已经被突变而获得表达，优选地过表达野生型或mut-HPPD核酸的植物的植物，其中核酸在该植物细胞中的表达导致较之野生型品种的植物细胞，对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性或耐受性。

在另一实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的植物细胞的转基因植物，其中核酸在植物中的表达导致较之野生型品种的植物，植物对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性。

本发明的植物可为转基因或非转基因植物。

优选地，核酸在植物中的表达导致较之野生型品种的植物，植物对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性。

在另一实施方案中，本发明涉及由包含本发明的植物细胞的转基因植物生产的种子，其中该种子对于较之野生型品种的种子的增加的香豆酮衍生物除草剂的抗性是纯育的(true breeding)。

在另一实施方案中，本发明涉及生产较之野生型品种的植物细胞，具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的转基因植物细胞的方法，所述方法包括用包含野生型或mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞。

在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物的方法，其包括：(a)用包含野生型或mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，及(b)从植物细胞生成具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的植物。

优选地，表达盒还包含在植物中具有功能的转录起始调控区及翻译起始调控区。

在另一实施方案中，本发明涉及使用本发明的mut-HPPD作为可选择的标志物。本发明提供鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括a)提供经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含编码如下文所述的本发明的mut-HPPD多肽的分离的核酸，其中该多肽用作选择标志物，且其中该经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可任选地包含其他分离的目的核酸；b)使经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种香豆酮衍生物抑制性化合物接触；c)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制剂或抑制性化合物影响；及d)鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。

本发明亦体现在含有本文所述的突变的经纯化的mut-HPPD蛋白质方面，所述蛋白质在设计对除草剂耐受性的其他改良的分子模造研究中是有用的。蛋白质纯化方法为熟知的，且可易于使用市售产品或如例如于Protein Biotechnology，Walsh和Headon(Wiley，1994)中示出的特别设计的方法达成。

附图简述

图1：来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Cr_HPPD1a、Cr_HPPD1b)、小立碗藓(Physcomitrellapatens)(Pp_HPPD1)、稻(Oryzasativa)(Osj_HPPD1)、小麦(Triticum aestivum)(Ta_HPPD1)、玉蜀黍(Zeamays)(Zm_HPPD1)、拟南芥(At_HPPD)、大豆(Glycine max)(Gm_HPPD)及葡萄(Vitis vinifera)(Vv_HPPD)的HPPD酶的氨基酸序列比对及保守区；

＊源于基因组测序计划的序列。基因座ID：GRMZM2G088396

^＊＊基于NCBI GenPept登录号CAG25475的氨基酸序列

图2：

选择对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性的莱茵衣藻株系。(A)涂布于无选择性试剂的固体培养基上的经诱变处理的细胞。(B)涂布于含有50μM4-羟基-3-[2-甲基-3-(5-甲基-4，5-二氢异

唑-3-基)-4-甲基磺酰基-苯基]吡喃并[3，2-b]吡啶-2-酮的固体培养基上的经诱变处理的细胞。对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性的细胞能够形成群落(经圈出)，而易感细胞不能生长。

图3展示用于使用HPPD/HST序列所进行的大豆转化的植物转化载体的载体图。

图4：

针对表达拟南芥属野生型HPPD(AtHPPD)的转基因T0大豆插条的除草剂喷雾测试。AV3639、AV3641及AV3653为单个品系(individual event)。未经转化的对照植物标记为野生型。用星号标记的“香豆酮衍生物”对应于＊3-[2，4-二氯-3-(3-甲基-4，5-二氢异

唑-5-基)苯基]-1-(2，2-二氟代乙基)-2，2-二氧代-吡啶并[3，2-c]噻嗪-4-醇。

序列表

表1

发明详述

在本文中使用单数冠词“a”和“an”以指代1个或1个以上(亦即至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“要素”意谓一或多个要素。

如本文所用，措词“包含”或“包括”应理解为包括所述要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤、或要素、整数或步骤的组。

本发明涉及控制植物栽培位置处不合需要的植被的方法，该方法包括以下步骤：

c)在该位置处提供包含至少一种核酸的植物，该核酸包含：

(i)编码对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列及/或

(ii)编码对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性或耐受性的野生型尿黑酸茄尼基转移酶(HST)或突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)的核苷酸序列

d)向该位置施用有效量的该除草剂。

术语“控制不合需要的植被”应理解为意谓杀伤杂草及/或否则延迟或抑制杂草正常生长。杂草在最广泛意义上应理解为意谓在不合需要的位置中生长的所有那些植物。本发明之杂草包括例如双子叶及单子叶杂草。双子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：芥子属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、猪殃殃属(Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、小米菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、大蓟属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、葶苈属(Rorippa)、节节草属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、白麻属(Abutilon)、刺酸模属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、三叶草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)及蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括但不限于以下各属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高梁属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、鸭舌草属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、翦股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)及燕麦属(Apera)。此外，本发明的杂草可包括例如生长于不需要的位置中的作物植物。举例而言，若玉米植物在大豆植物田地中不合需要，则主要包含大豆植物的田地中的自生玉米植物可视为杂草。

术语“植物”以其最广泛意义加以使用，因为其关于有机物质且意欲涵盖植物界成员的真核生物，植物实例包括但不限于维管束植物、蔬菜、谷物、花、树木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌及藻类等，以及用于无性繁殖的植物的克隆、侧枝及部分(例如插条、管道(piping)、芽、根茎(rhizome)、地下茎、凝块(clump)、冠、球茎、球根、块茎、根茎、组织培养中生产的植物/组织等)。术语“植物”进一步涵盖整个植物、植物祖先及后代、及植物部分，包括种子、芽、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、肉茎(pedicle)、花梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮(carpel)、根尖、根帽(root cap)、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴细胞、保卫细胞、及植物的任何其他已知器官、组织及细胞、及组织及器官，其中每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。术语“植物”亦涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉及小孢子，同样，每一以上所提及者皆包含目的基因/核酸。

尤其适用于本发明方法中的植物包括属于超家族绿色植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别地单子叶及双子叶植物，尤其包括选自以下清单的饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属（Acer spp.)、猕猴桃属（Actinidia spp.)、秋葵属（Abelmoschus spp.)、龙舌兰麻(Agave sisalana)、冰草属(Agropyron spp.)、匍匐剪股颍(Agrostisstolonifera)、葱属(Allium spp.)、苋属(Amaranthus spp.)、喜沙草(Ammophilaarenaria)、菠萝(Ananas comosus)、番荔枝属(Annona spp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、落花生属(Arachis spp)、波罗蜜属(Artocarpus spp.)、芦笋(Asparagus offcinalis)、燕麦属(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Ayena fatua)、红燕麦(Avena byzantina)、栽培野燕麦(变种)(Avena fatuavar.sativa)、杂交燕麦(Avena hybrida))、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusas p.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗子(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属(Brassica spp.)(例如甘蓝型油菜(Brassicanapus)、芜菁亚属[芥花(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turniprape)])、粉质胚乳白花菜(Cadaba farinosa)、中国茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属(Capsicum spp.)、丛生苔草(Carex elata)、番木瓜(Carica papaya)、大花假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属(Carya spp.)、红花籽草(Carthamus tinctorius)、栗属(Castanea spp.)、吉贝木棉(Ceiba pentandra)、菊苣(Cichorium endivia)、樟属(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属(Citrus spp.)、椰子属(Cocos spp.)、咖啡属(Coffea spp.)、芋(Colocasia esculenta)、可乐果属(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属(Corylus spp.)、山楂属(Crataegus spp.)、番红花（Crocus sativus)、南瓜属(Cucurbita spp.)、甜瓜属(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属(Dioscorea spp.)、柿属(Diospyros spp.)、稗属(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油椰子(Eiaeis guineensis)、美洲油棕(Elaeis oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、衣索匹亚画眉草(Eragrostis tef)、芒属(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、扁樱桃(Eugeniaunifora)、荞麦属(Fagopyrum spp.)、山毛榉属(Fagus spp.)、高狐草（Festucaarundinacea)、死花果(Ficus carica)、金橘属(Fortunella spp.)、草莓属(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、黄花菜(Hemerocallis fulva)、木槿属(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeumspp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属(Juglansspp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属(Lupinus spp.)、灯芯草(Luzulasylvatica)、蕃茄属(Lycopersicon spp.)(例如西红柿(Lycopersiconesculentum)、蕃茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属(Macrotyloma spp.)、苹果属(Malus spp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、满美果(Mammea americana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、紫苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属(Melilotus spp.)、薄荷属(Menthaspp.)、芒草(Miscanthussinensis)、苦瓜属(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属(Musa spp.)、烟草属(Nicotiana spp.)、齐墩果属(Olea spp.)、仙人掌属(Opuntia spp.)、鸟足豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻(Oryza sativa)、阔叶稻(Oryza latifolia))、黍(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflra edulis)、美国防风草(Pastinaca sativa)、狼尾草属(Pennisetumsp.)、鳄梨属(Persea spp.)、荷兰芹（Petroselinum crispum)、利甘草(Phalarisarundinacea)、菜豆属(Phaseolus spp.)、牛草(Phleum pratense)、海枣属(Phoenix spp.)、芦苇(Phragmites australis)、酸浆属(Physalis spp.)、松属(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属(Pisum spp.)、早熟禾属(Poaspp.)、白杨属(Populus spp.)、牧豆树属(Prosopis spp.)、李属(Prunus spp.)、番石榴属(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、萝卜(Rapbanus sativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、醋栗属(Ribes spp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属(Rubusspp.)、蔗属(Saccharum spp.)、柳属(Salixsp.)、接骨木属(Sambucusspp.)、黑麦(Secale cereale)、脂麻属(Sesamum spp.)、芥属(Sinapissp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(Solanum tuberosum)、冬海红(Solanumintegrifolium)或蕃茄(Solanum lycopersicum))、高粱(Sorghum bicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、薄桃属(Syzygium spp.)、万寿菊属(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、三叶草属(Trifolium spp.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacum dactyloides)、黑小麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属(Triticum spp.)(例如小麦(Triticum aestivum)、杜伦小麦(Triticum durum)、蓝麦(Triticum turgidum)、普通小麦(Triticum hybern um)、莫迦小麦(Triticummacha)、小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum mon ococcum)或面包小麦(Triticum vulgare))、小金莲花（Tropaeolum minus)、旱金莲Tropaeolummajus)、越橘属(Vaccinium spp.)、蚕豆属(Vicia spp.)、豇豆属(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属(Vitis spp.)、玉米(Zea mays)、沼生菰(Zizaniapalustris)、枣属(Ziziphus spp.)、苋菜(amaranth)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、椰菜(broccoli)、抱子甘蓝(Brussels sprouts)、甘蓝菜(cabbage)、芥花(canola)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collard greens)、亚麻(flax)、芥蓝(kale)、扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseedrape)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、稻(rice)、大豆(soybean)、草莓(strawberry)、甜菜(sugar beet)、甘蔗(sugar cane)、向日葵(sunflower)、蕃茄(tomato)、西葫芦(squash)、茶树及藻类。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例尤其包括大豆、向日葵、芥花、紫花苜蓿(alfalfa)、油菜籽、棉花、蕃茄、马铃薯或烟草。更优选地，植物为单子叶植物，诸如甘蔗。更优选地，植物为谷物，诸如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高梁或燕麦。

在优选的实施方案中，先前已由包括通过引入及过表达野生型或mut-HPPD及/或野生型或mut-HST转基因来重组制备植物的方法生产植物，如下文更详细所述。

在另一优选的实施方案中，先前已由包括原位诱变处理植物细胞以获得表达mut-HPPD及/或mut-HST的植物细胞的方法来生产植物。

如本文所揭示，本发明核酸可用于增强在基因组中包含编码除草剂耐受性野生型或mut-HPPD及/或野生型或mut-HST蛋白质的基因的植物对除草剂的耐受性。此类基因可为内源基因或转基因，如下文所述。另外，在某些实施方案中，本发明核酸可与目的多核苷酸序列的任何组合堆积以创造具有所要表现型的植物。举例而言，本发明核酸可与编码具有杀虫及/或杀昆虫活性的多肽(诸如苏云金芽孢杆菌毒素蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；及Geiser等人(1986)Gene48：109中))的任何其他多核苷酸堆积。生成的组合亦可包括目的多核苷酸中的任一个的多个拷贝。

在特别优选的实施方案中，植物包含至少一种额外的异源核酸，其包含(iii)编码选自例如5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、草甘膦乙酰基转移酶(GAT)、细胞色素P450、草胺膦(phosphinothricin)乙酰基转移酶(PAT)、乙酰羟基酸合酶(AHAS；EC4.1.3.18，亦称为乙酰乳酸合酶或ALS)、原卟啉原氧化酶(PPGO)、八氢蕃茄红素去饱和酶(PD)及麦草畏(dicamba)降解酶的除草剂耐受性酶的核苷酸序列，如WO02/068607中所公开。

一般而言，在本文中使用术语“除草剂”以意谓杀死植物、控制或否则逆调节植物生长的活性成分。除草剂的优选的量或浓度为“有效量”或“有效浓度”。“有效量”及“有效浓度”分别意谓足以杀死类似的野生型植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长的量及浓度，但该量不会以同样严重程度杀死本发明的除草剂抗性植物、植物组织、植物细胞及宿主细胞或抑制其生长。一般地，除草剂的有效量为常规用于农业生产系统中来杀死目的杂草的量。此类量为一般技术人员所知。当在任何生长阶段或在种植或出苗前直接向植物或植物所在位置施用本发明的香豆酮衍生物除草剂时，展现除草活性。观测到的作用取决于待控制的植物物种、植物生长阶段、稀释及喷雾液滴尺寸的施用参数、固体组分的粒子尺寸、使用时的环境条件、所用的特定的化合物、所用的特定佐剂及载剂、土壤类型等、以及所施用的化学品的量。这些及其他因子可如本领域技术中所知的加以调整以促进非选择性或选择性除草作用。一般而言，优选在出苗后对相对不成熟的非所要植被施用香豆酮衍生物除草剂以达到杂草的最大控制。

就“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”植物而言，意指植物对处于通常将杀伤正常或野生型植物或抑制其生长的水平的至少一种除草剂具有耐受性或抗性。就“除草剂耐受性mut-HPPD蛋白”或“除草剂抗性mut-HPPD蛋白”而言，意指当存在至少一种已知干扰HPPD活性的除草剂且该除草剂处于已知将抑制野生型mut-HPPD蛋白的HPPD活性的浓度或含量时，相对于野生型mut-HPPD蛋白的HPPD活性，此类mut-HPPD蛋白显示较高HPPD活性。此外，此类除草剂耐受性或除草剂抗性mut-HPPD蛋白的HPPD活性在本文中可称为“除草剂耐受性”或“除草剂抗性”HPPD活性。

本发明的“香豆酮衍生物除草剂”涵盖如下表2中描述的化合物。

以上参考的申请案，特别地涉及表2化合物及其可能的取代基的公开内容以引用的方式全部并入本文中。

本发明的特别优选的实施方案涉及上表2的13号的香豆酮衍生性除草剂，其具有下式或其N-氧化物或农业上适合的盐：

其中变量具有以下含义：

R为O-R^A、S(O)_n-R^A或O-S(O)_n-R^A；

R^A为氢、C₁-C₄烷基、Z-C₃-C₆环烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₆烯基、Z-C₃-C₆环烯基、C₂-C₆炔基、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-C(=O)-R^a、Z-NRⁱ-C(O)-NRⁱRⁱⁱ、Z-P(＝O)(R^a)₂、NRⁱRⁱⁱ、3至7员单环或9或10员双环饱和、不饱和或芳族杂环，其含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子且可部分或完全被基团R^a及/或R^b取代，

R^a为氢、OH、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、Z-C₃-C₆环烷基、C₂-C₈烯基、Z-C₅-C₆环烯基、C₂-C₈炔基、Z-C₁-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄卤烷氧基、Z-C₃-C₈烯氧基、Z-C₃-C₈炔氧基、NRⁱRⁱⁱ、C₁-C₆烷基磺酰基、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-苯基、Z-苯氧基、Z-苯基胺基、或含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环杂环，其中环基未被取代或被1、2、3或4个基团R^b取代；

Rⁱ、Rⁱⁱ彼此独立为氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、C₃-C₈烯基、C₃-C₈炔基、Z-C₃-C₆环烷基、Z-C₁-C₈烷氧基、Z-C₁-C₈卤烷氧基、Z-C(＝O)-R^a、Z-苯基、含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子且经Z连接的3至7员单环或9或10员双环饱和、不饱和或芳族杂环；

Rⁱ及Rⁱⁱ连同其所连接的氮原子一起亦可形成含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环杂环；

R^b彼此独立地为Z-CN、Z-OH、Z-NO₂、Z-卤素、氧代(＝O)、＝N-R^a、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、Z-C₁-C₈烷氧基、Z-C₁-C₈卤烷氧基、Z-C₃-C₁₀环烷基、O-Z-C₃-C₁₀环烷基、Z-C(＝O)-R^a、NRⁱRⁱⁱ、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-苯基及S(O)_nR^bb；两个基团R^b可一起形成环，该环具有3至6个环成员且除碳原子外亦可含有来自O、N及S的杂原子且可以未被取代或被另外的基团R^b取代；

R^bb为C₁-C₈烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₂-C₆卤烯基、C₂-C₆卤炔基或C_1-C₆卤烷基；

Z为共价键或C₁-C₄亚烷基；

n为0、1或2；

R¹为氰基、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤烷基、Z-C₁-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄烷氧基-C₁-C₄烷氧基、Z-C₁-C₄烷硫基(alkylthio)、Z-C₁-C₄烷硫基-C₁-C₄烷硫基、C₂-C₆烯氧基、C₂-C₆炔氧基、C₁-C₆卤烷氧基、C₁-C₄卤烷氧基-C₁-C₄烷氧基、S(O)_nR^bb、Z-苯氧基、Z-杂环基氧基，其中杂环基为含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环饱和、部分不饱和或芳族杂环，其中环基未被取代或部分或完全被R^b取代；

A为N或C-R²；

R²、R³、R⁴、R⁵彼此独立地为氢、Z-卤素、Z-CN、Z-OH、Z-NO₂、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₂-C₈卤烯基、C₂-C₈卤炔基、Z-C₁-C₈烷氧基、Z-C₁-C₈卤烷氧基、Z-C₁-C₄烷氧基-C₁-C₄烷氧基、Z-C₁-C₄烷硫基、Z-C₁-C₄烷硫基-C₁-C₄烷硫基、Z-C₁-C₆卤烷硫基、C₂-C₆烯氧基、C₂-C₆炔氧基、C₁-C₆卤烷氧基、C₁-C₄卤烷氧基-C₁-C₄烷氧基、Z-C₃-C₁₀环烷基、O-Z-C₃-C₁₀环烷基、Z-C(＝O)-R^a、NRⁱR^ii、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、S(O)_nR^bb、Z-苯基、Z¹-苯基、Z-杂环基、Z¹-杂环基，其中杂环基为含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环饱和、部分不饱和或芳族杂环，其中环基未被取代或部分或完全被R^b取代；

R²连同与相邻碳原子连接的基团一起亦可形成5至10员饱和或部分或完全不饱和单环或双环，该环除碳原子外亦可含有1、2或3个选自O、N及S的杂原子且可被另外的基团R^b取代；

Z¹为共价键、C₁-C₄亚烷基氧基、C₁-C₄氧基亚烷基或C₁-C₄亚烷基氧基-C₁-C₄亚烷基；

R⁶为氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄卤烷氧基、C₁-C₄卤烷硫基；

R⁷、R⁸彼此独立地为氢、卤素或C₁-C₄烷基；

R^x为C₁-C₆烷基、C₁-C₄卤烷基、C₁-C₂烷氧基-C₁-C₂烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆卤烯基、C₃-C₆炔基、C₃-C₆卤炔基或Z-苯基，其未被取代或被1至5个基团R^b取代；

其中基团R^A、及R¹、R²、R³、R⁴及R⁵及其取代基、碳链及/或环基可部分或完全被基团R^b取代。

本发明之另一优选的实施方案涉及具有下式的上表2的1号及2号的香豆酮衍生物除草剂：

其中变量如WO2010/049270及WO2010/049269中所公开。

在另一优选的实施方案中，适用于本发明的香豆酮衍生物除草剂具有下式(表2，8号)或其N-氧化物或农业上适合的盐：

其中变量具有以下含义：

R为O-R^A、S(O)_n-R^A或O-S(O)_n-R^A；

R^A为氢、C₁-C₄烷基、Z-C₃-C₆环烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₆烯基、Z-C₃-C₆环烯基、C₂-C₆炔基、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-C(＝O)-R^a、Z-NRⁱ-C(O)-NRⁱRⁱⁱ、Z-P(＝O)(R^a)₂、NRⁱRⁱⁱ、3至7员单环或9或10员双环饱和、不饱和或芳族杂环，其含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子且可部分或完全被基团R^a及/或R^b取代，

R^a为氢、OH、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、Z-C₃-C₆环烷基、C₂-C₈烯基、Z-C₅-C₆环烯基、C₂-C₈炔基、Z-C₁-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄卤烷氧基、Z-C₃-C₈烯氧基、Z-C₃-C₈炔氧基、NRⁱRⁱⁱ、C₁-C₆烷基磺酰基、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-苯基、Z-苯氧基、Z-苯基氨基、或含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环杂环，其中环基未被取代或被1、2、3或4个基团R^b取代；

Rⁱ、Rⁱⁱ彼此独立地为氢、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、C₃-C₈烯基、C₃-C₈炔基、Z-C₃-C₆环烷基、Z-C₁-C₈烷氧基、Z-C₁-C₈卤烷氧基、Z-C(＝O)-R^a、Z-苯基、3至7员单环或9或10员双环饱和、不饱和或芳族杂环，其含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子且经由Z连接；

Z为共价键或C₁-C₄亚烷基；

n为0、1或2；

R¹为氰基、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₁-C₆卤烷基、Z-C₁-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄烷氧基-C₁-C₄烷氧基、Z-C₁-C₄烷硫基、Z-C₁-C₄烷硫基-C₁-C₄烷硫基、C₂-C₆烯氧基、C₂-C₆炔氧基、C₁-C₆卤烷氧基、C₁-C₄卤烷氧基-C₁-C₄烷氧基、S(O)_nR^bb、Z-苯氧基、Z-杂环基氧基，其中杂环基为含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环饱和、部分不饱和或芳族杂环，其中环基未被取代或部分或完全被R^b取代；

R^bb为C₁-C₈烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₂-C₆卤烯基、C₂-C₆卤炔基或C₁-C₆卤烷基且n为0、1或2；

A为N或C-R²；

R²为Z¹-苯基、苯氧基或Z¹-杂环基，其中杂环基为含有1、2、3或4个选自O、N及S的杂原子的5或6员单环或9或10员双环饱和、部分不饱和或芳族杂环，其中环基未被取代或部分或完全被R^b取代；

C₁-C₈烷基、C₂-C₄卤烷基、C₁-C₄烷氧基-C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷硫基-C₁-C₄烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、C₂-C₈卤烯基、C₂-C₈卤炔基、C₂-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄烷氧基-C₁-C₄烷氧基、Z-C₁-C₄卤烷氧基-C₁-C₄烷氧基、C₂-C₆卤烷氧基、C₃-C₆烯氧基、C₃-C₆炔氧基、C₂-C₆烷硫基、C₂-C₆卤烷硫基、Z-C(＝O)-R^a、S(O)_1-2R^bb；

R^b彼此独立地为Z-CN、Z-OH、Z-NO₂、Z-卤素、氧代(＝O)、＝N-R^a、C₁-C₈烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₈烯基、C₂-C₈炔基、Z-C₁-C₈烷氧基、Z-C₁-C₈卤烷氧基、Z-C₃-C₁₀环烷基、O-Z-C₃-C₁₀环烷基、Z-C(＝O)-R^a、NRⁱRⁱⁱ、Z-(三-C₁-C₄烷基)硅烷基、Z-苯基及S(O)_nR^bb，两个基团R^b可一起形成环，该环具有3至6个环成员且除碳原子外亦可含有来自O、N及S的杂原子且可未被取代或被另外的基团R^b取代；

R³为氢、卤素、氰基、硝基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄卤烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、C₂-C₄烯氧基、C₂-C₄炔氧基、S(O)_nR^bb；

R⁴为氢、卤素或C₁-C₄卤烷基；

R⁵为氢、C₁-C₄烷基、C₁-C₄卤烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄烷硫基、C₁-C₄卤烷氧基、C₁-C₄卤烷硫基；

R⁶、R⁷彼此独立地为氢、卤素或C₁-C₄烷基；

Y为O或S；

X为O、S或N-R^x；

R^x为氢、C₁-C₆烷基、C₁-C₄卤烷基、C₂-C₆烯基、C₃-C₆炔基、Z-C₃-C₁₀环烷基、C₁-C₆烷氧基-C₁-C₆烷基、C₁-C₆氰基烷基、Z-苯基、Z-C(＝O)-R^a2或三-C₁-C₄烷基硅烷基；

R^a2为C₁-C₆烷基、C₁-C₄卤烷基、Z-C₁-C₆烷氧基、Z-C₁-C₄卤烷氧基或NRⁱRⁱⁱ；

其中在基团RA及其取代基中，碳链及/或环基可部分或完全经基团R^b取代。

本发明的香豆酮衍生物通常最好连同一种或多种其他HPPD及/或HST靶向除草剂一起施用以获得对较广泛多种的非所要植被的防治。当连同其他HPPD及/或HST靶向除草剂一起使用时，本权利要求的化合物可与其他除草剂一起配制、与其他除草剂桶混、或与其他除草剂依序施用。

一些适用于与本发明的香豆酮衍生物联合的除草剂包括苯并双环酮(benzobicyclon)、甲基磺草酮(mesotrione)、磺草酮(sulcotrione)、庄无忌(tefuryltrione)、环磺酮(tembotrione)、4-羟基-3-[[2-(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-二环[3.2.1]-辛-3-烯-2-酮(bicyclopyrone)、ketospiradox或其游离酸、吡草酮(benzofenap)、pyrasulfotole、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑(pyrazoxyfen)、苯吡唑草酮(topramezone)、[2-氯-3-(2-甲氧基乙氧基)-4-(甲基磺酰基)苯基](l-乙基-5-羟基-1H-吡唑-4-基)-甲酮、(2，3-二氢-3，3，4-三甲基-1，1-二氧化苯并[b]噻吩-5-基)(5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)-甲酮、异恶氯草酮(isoxachlortole)、异

唑草酮(isoxaflutole)、α-(环丙基羰基)-2-(甲基磺酰基)-β-氧代-4-氯-苯丙腈、及α-(环丙基羰基)-2-(甲基磺酰基)-β-氧代-4-(三氟甲基)-苯丙腈。

在优选的实施方案中，其他除草剂为苯吡唑草酮。

在特别优选的实施方案中，其他除草剂为

(1-乙基-5-丙-2-炔基氧基-1H-吡唑-4-基)-[4-甲烷磺酰基-2-甲基-3-(3-甲基-4，5-二氢-异唑-5-基)-苯基]-甲酮

或

(1-乙基-5-羟基-1H-吡唑-4-基)-[4-甲烷磺酰基-2-甲基-3-(3-甲基-4，5-二氢-异

唑-5-基)-苯基]-甲酮

上述化合物极详细描述于EP09177628.6中，该专利以引用的方式全部并入本文中。

本发明的除草化合物可与额外的除草剂联合使用，作物植物天然耐受所述额外的除草剂或通过表达如上提及的一种或多种额外的转基因对所述额外的除草剂具有抗性。一些可与本发明化合物联合采用的除草剂包括磺酰胺，诸如磺草唑胺(metosulam)、唑嘧磺草胺(flumetsulam)、氯酯磺草胺(cloransulam-methyl)、双氯磺草胺(diclosulam)、五氟磺草胺(penoxsulam)及双氟磺草胺(florasulam)；磺酰脲，诸如氯嘧磺隆(chlorimuron)、苯磺隆(tribenuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、氯磺隆(chlorsulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟磺隆(prosulfuron)、三氟甲磺隆(tritosulfuron)、噻吩磺隆(thifensulfuron)、磺嘧磺隆(sulfosulfuron)及甲磺隆(metsulfuron)；咪唑啉酮(imidazolinones)，诸如灭草喹(imazaquin)、甲基咪草烟(imazapic)、咪草烟(ima-zethapyr)、灭草烟(imzapyr)、咪草酯(imazamethabenz)及甲氧咪草烟(imazamox)；苯氧基烷酸，诸如2,4-D、MCPA、滴丙酸(dichlorprop)及2-甲-4-氯丙酸(mecoprop)；吡啶基氧基乙酸，诸如绿草定(triclopyr)及氟草烟(fluroxypyr)；羧酸，诸如克草立特(clopyralid)、胺氯吡啶酸(picloram)、氯胺基吡啶酸(aminopyralid)及麦草畏(dicamba)；二硝基苯胺，诸如氟乐灵(trifluralin)、氟草胺(benefin)、倍尼芬(benfluralin)及二甲戊乐灵(pendimethalin)；乙酰氯苯胺，诸如甲草胺(alachlor)、乙草胺(acetochlor)及异丙甲草胺(metolachlor)；半卡巴腙(semicarbazones)(生长素(auxin)转运抑制剂)，诸如整形醇(chlorflurenol)及氟吡草腙(diflufenzopyr)；芳氧基苯氧丙酸酯，诸如吡氟禾草灵(fluazifop)、氟吡禾灵(haloxyfop)、二氯苯氧基丙酸(diclofop)、炔草酸(clodinafop)及

唑灵(fenoxaprop)；及其他常见除草剂，包括草甘膦(glyphosate)、固杀草(glufosinate)、三氟羧草醚(acifluorfen)、噻草平(bentazon)、可灭踪(clomazone)、氟烯草酸(fumiclorac)、可夺草(fluometuron)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、异丙隆(isoproturon)、西玛津(simazine)、氟草敏(norflurazon)、百草枯(paraquat)、敌草隆(diuron)、吡氟草胺(diflufenican)、氟吡草胺(picolinafen)、吲哚酮草酯(cinidon)、西杀草(sethoxydim)、三甲苯草酮(tralkoxydim)、喹草酸(quinmerac)、异恶草胺(isoxaben)、溴苯腈(bromoxynil)、赛克津(metribuzin)及甲基磺草酮(mesotrione)。

本发明的香豆酮衍生物除草剂可另外与草甘膦及固杀草对草甘膦耐受性或固杀草耐受性作物联合使用。

除非已包括在以上公开内容中，否则本发明的香豆酮衍生物除草剂可另外与以下化合物联合使用：

(a)来自以下脂质生物合成抑制剂组的化合物：

亚汰草(Alloxydim)、亚汰草钠(Alloxydim-natrium)、丁苯草酮(Butroxydim)、克草同(Clethodim)、炔草酸(Clodinafop)、炔草酯(Clodinafop-propargyl)、环杀草(Cycloxydim)、赛伏草(Cyhalofop)、丁基赛伏草(Cyhalofop-butyl)、二氯苯氧基丙酸、禾草灵(Diclofop-methyl)、

唑灵(Fenoxaprop)、

唑禾草灵(Fenoxaprop-ethyl)、精唑禾草灵(Fenoxaprop-P)、芬杀草(Fenoxaprop-P-ethyl)、吡氟禾草灵(Fluazifop)、氟甲吡啶氧酚丙酸丁酯(Fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵(Fluazifop-P)、伏寄普(Fluazifop-P-butyl)、氟吡禾灵(Haloxyfop)、氟吡甲禾灵(haloxyfop-methyl)、精氟吡禾灵(Haloxyfop-P)、高效氟吡甲禾灵(haloxyfop-P-methyl)、

唑酰草胺(Metamifop)、唑啉草酯(Pinoxaden)、环苯草酮(Profoxydim)、普拔草(Propaquizafop)、喹禾灵(Quizalofop)、快伏草(Quizalofop-ethyl)、喹禾糠酯(Quizalofop-tefuryl)、精喹禾灵(Quizalofop-P)、精喹禾灵(Quizalofop-P-ethyl)、精禾灵(Quizalofop-P-tefuryl)、西杀草(Sethoxydim)、得杀草(Tepraloxydim)、三甲苯草酮(Tralkoxydim)、呋草黄(Benfuresat)、丁草特(Butylat)、灭草特(Cycloat)、茅草枯(Dalapon)、哌草丹(Dimepiperat)、EPTC、戊草丹(Esprocarb)、乙呋草黄(Ethofumesat)、氟丙酸(Flupropanat)、禾草敌(Molinat)、坪草丹(Orbencarb)、克草敌(Pebulat)、苄草丹(Prosulfocarb)、TCA、杀丹(Thiobencarb)、仲草丹(Tiocarbazil)、野麦畏(Triallat)及灭草猛(Vernolat)；

(b)来自ALS抑制剂组的化合物：

酰嘧磺隆(Amidosulfuron)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、苄嘧磺隆(Bensulfuron)、甲基苄嘧磺隆(Bensulfuron-methyl)、双草醚(Bispyribac)、双草醚钠(Bispyribac-natrium)、氯嘧磺隆(Chlorimuron)、乙基氯嘧磺隆(Chlorimuron-ethyl)、氯磺隆(Chlorsulfuron)、醚磺隆(Cinosulfuron)、氯酯磺草胺(Cloransulam)、氯酯磺草胺(Cloransulam-methyl)、环丙嘧磺隆(Cyclosulfamuron)、双氯磺草胺(Diclosulam)、胺苯磺隆(Ethametsulfuron)、甲基胺苯磺隆(Ethametsulfuron-methyl)、乙氧嘧磺隆(Ethoxysulfuron)、嘧啶磺隆(Flazasulfuron)、双氟磺草胺(Florasulam)、氟酮磺隆(Flucarbazon)、氟酮磺隆钠(Flucarbazon-natrium)、氟吡磺隆(Flucetosulfuron)、唑嘧磺草胺(Flumetsulam)、氟啶嘧磺龙(Flupyrsulfuron)、甲基氟啶嘧磺龙钠(Flupyrsulfuron-methyl-natrium)、甲酰嘧磺隆(Foramsulfuron)、氯吡醚磺隆(Halosulfuron)、甲基氯吡醚磺隆(Halosulfuron-methyl)、咪草酯(Imazamethabenz)、甲基咪草酯(Imazamethabenz-methyl)、甲氧咪草烟(Imazamox)、甲基咪草烟(Imazapic)、灭草烟(Imazapyr)、灭草喹(Imazaquin)、咪草烟(Imazethapyr)、唑吡嘧磺隆(Imazosulfuron)、碘甲磺隆(Iodosulfuron)、甲基碘甲磺隆钠(Iodosulfuron-methyl-natrium)、甲磺胺磺隆(Mesosulfuron)、磺草唑胺(Metosulam)、甲磺隆(Metsulfuron)、甲基甲磺隆(Metsulfuron-methyl)、烟嘧磺隆(Nicosulfuron)、邻丙嘧磺隆(Orthosulfamuron)、环氧嘧磺隆(Oxasulfuron)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、甲基氟嘧磺隆(Primisulfuron-methyl)、丙苯磺隆(Propoxycarbazon)、丙苯磺隆钠(Propoxycarbazon-natrium)、氟磺隆(Prosulfuron)、吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron)、乙基吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron-ethyl)、嘧啶肟草醚(Pyribenzoxim)、嘧啶硫蕃(Pyrimisulfan)、环酯草醚(Pyriftalid)、嘧草醚(Pyriminobac)、甲基嘧草醚(Pyriminobac-methyl)、嘧硫草醚(Pyrithiobac)、嘧硫草醚钠(Pyrithiobac-natrium)、吡恶草胺(Pyroxsulam)、砜嘧磺隆(Rimsulfuron)、甲嘧磺隆(Sulfometuron)、甲基甲嘧磺隆(Sulfometuron-methyl)、磺嘧磺隆(SulfosulfuFon)、噻烯卡巴腙(Thiencarbazon)、甲基噻烯卡巴腙(Thiencarbazon-methyl)、噻吩磺隆(Thifensulfuron)、甲基噻吩磺隆(Thifensulfuron-methyl)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、苯磺隆(Tribenuron)、甲基苯磺隆(Tribenuron-methyl)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、氟胺磺隆(Triflusulfuron)、甲基氟胺磺隆(Triflusulfuron-methyl)及三氟甲磺隆(Tritosulfuron)；

(c)来自光合作用抑制剂组的化合物：

莠灭净(Ametryn)、胺唑草酮(Amicarbazon)、阿托拉辛(Atrazin)、噻草平(Bentazon)、噻草平钠(Bentazon-natrium)、除草定(Bromacil)、溴酚肟(Bromofenoxim)、溴苯腈及其盐及酯、氯溴隆(Chlorobromuron)、氯草敏(Chloridazon)、绿麦隆(Chlorotoluron)、氯草隆(Chloroxuron)、氰草津(Cyanazin)、甜菜安(Desmedipham)、敌草净(Desmetryn)、唑隆(Dimefuron)、敌灭莫净(Dimethametryn)、敌草快(Diquat)、二溴敌草快(Diquat-dibromid)、敌草隆(Diuron)、可夺草(Fluometuron)、环嗪酮(Hexazinon)、碘苯腈(Ioxynil)及其盐及酯、异丙隆(Isoproturon)、异恶隆(Isouron)、卡灵草(Karbutilat)、环草定(Lenacil)、利谷隆(Linuron)、苯嗪草酮(Metamitron)、甲基苯噻隆(Methabenzthiazuron)、吡喃隆(Metobenzuron)、甲氧隆(Metoxuron)、赛克津(Metribuzin)、绿谷隆(Monolinuron)、草不隆(Neburon)、百草枯(Paraquat)、二氯百草枯(Paraquat-dichlorid)、二甲硫酸百草枯(Paraquat-dimetilsulfat)、蔬草灭(Pentanochlor)、甜菜宁(Phenmedipham)、乙基甜菜宁(Phenmedipham-ethyl)、扑灭通(Prometon)、扑草净(Prometryn)、敌稗(Propanil)、扑灭津(Propazin)、吡啶达醇(Pyridafol)、哒草特(Pyridat)、环草隆(Siduron)、西玛三嗪(Simazin)、西草净(Simetryn)、丁噻隆(Tebuthiuron)、特草定(Terbacil)、甲氧去草净(Terbumeton)、草净津(Terbuthylazin)、去草净(Terbutryn)、噻苯隆(Thidiazu ron)及草达津(Trietazin)；

d)来自原卟啉原IX氧化酶抑制剂组的化合物：

三氟羧草醚(Acifluorfen)、三氟羧草醚钠(Acifluorfen-natrium)、唑啶草酮(Azafenidin)、酰苯草酮(Bencarbazon)、双苯嘧草酮(Benzfendizon)、必芬诺(Bifenox)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、快灭灵(Carfentrazon)、乙基快灭灵(Carfentrazon-ethyl)、甲氧除草醚(Chlomethoxyfen)、吲哚酮草酯(Cinidon-ethyl)、异丙吡草酯(Fluazolat)、氟哒嗪草酯(Flufenpyr)、乙基氟哒嗪草酯(Flufenpyr-ethyl)、氟胺草酯(Flumiclorac)、戊基氟胺草酯(Flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、乙羧氟草醚(Fluoroglycofen)、乙羧氟草醚(Fluoroglycofen-ethyl)、氟噻草酯(Fluthiacet)、氟噻甲草酯(Fluthiacet-methyl)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、卤索芬(Halosafen)、乳氟禾草灵(Lactofen)、丙炔恶草酮(Oxadiargyl)、恶草酮(Oxadiazon)、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、恶嗪酮(Pentoxazon)、氟唑草胺(Profluazol)、双唑草腈(Pyraclonil)、吡草醚(Pyraflufen)、乙基吡草醚(Pyraflufen-ethyl)、嘧啶肟草醚(Saflufenacil)、磺酰唑草酮(Sulfentrazon)、噻达兹明(Thidiazimin)、2-氯-5-[3，6-二氢-3-甲基-2，6-二氧代-4-(三氟甲基)-1(2H)-嘧啶基]-4-氟-N-[(异丙基)甲基氨磺酰基]苯甲酰胺(H-1；CAS372137-35-4)、[3-[2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2，4-二氧代-1，2，3，4，-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶基氧基]乙酸乙酯(H-2；CAS353292-31-6)、N-乙基-3-(2，6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-3；CAS452098-92-9)、N-四氢呋喃甲基-3-(2，6-二氯-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-4；CAS915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-5；CAS452099-05-7)及N-四氢呋喃甲基-3-(2-氯-6-氟-4-三氟甲基苯氧基)-5-甲基-1H-吡唑-1-甲酰胺(H-6；CAS45100-03-7)；

e)来自漂白剂除草剂组的化合物：

苯草醚(Aclonifen)、杀草强(Amitrol)、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、苯并双环酮(Benzobicyclon)、吡草酮(Benzofenap)、异恶草酮(Clomazon)、吡氟草胺(Diflufenican)、氟啶酮(Fluridon)、氟咯草酮(Flurochloridon)、呋草酮(Flurtamon)、异唑草酮(Isoxaflutol)、甲基磺草酮(Mesotrion)、氟草敏(Norflurazon)、氟吡草胺(Picolinafen)、磺酰草吡脱(Pyrasulfutol)、吡唑特(Pyrazolynat)、苄草唑(Pyrazoxyfen)、磺草酮(Sulcotrion)、庄无忌(Tefuryltrion)、环磺酮(Tembotrion)、苯吡唑草酮(Topramezon)、4-羟基-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]双环[3.2.1]辛-3-烯-2-酮(H-7；CAS352010-68-5)及4-(3-三氟甲基苯氧基)-2-(4-三氟甲基苯基)嘧啶(H-8；CAS180608-33-7)；

f)来自EPSP合酶抑制剂组的化合物：

草甘膦(Glyphosat)、草甘膦异丙基铵及草甘膦三甲基硫盐(草硫膦(Sulfosat))；

g)来自谷氨酰胺合酶抑制剂组的化合物：

草铵膦双丙氨酰膦(Bilanaphos)(毕拉草(Bialaphos))、草铵膦双丙氨酰膦钠(Bilanaphos-natrium)、固杀草(Glufosinat)及固杀草铵(Glufosinat-ammonium)；

h)来自DHP合酶抑制剂组的化合物：磺草灵(Asulam)；

i)来自有丝分裂抑制剂组的化合物：

胺草磷(Amiprophos)、甲基胺草磷(Amiprophos-methyl)、倍尼芬(Benfluralin)、抑草磷(Butamiphos)、比达宁(Butralin)、卡草胺(Carbetamid)、氯普芬(Chlorpropham)、敌草索(Chlorthal)、二甲基敌草索(Chlorthal-dimethyl)、挞乃安(Dinitramin)、氟硫草定(Dithiopyr)、乙丁烯氟灵(Ethalfluralin)、贝杀宁(Fluchloralin)、安磺灵(Oryzalin)、二甲戊乐灵(Pendimethalin)、胺基丙氟灵(Prodiamin)、苯胺灵(Propham)、戊炔草胺(Propyzamid)、胺草磷(Tebutam)、噻草啶(Thiazopyr)及氟乐灵(Trifluralin)；

j)来自VLCFA抑制剂组的化合物：

乙草胺(Acetochlor)、甲草胺(Alachlor)、莎稗磷(Anilofos)、丁草胺(Butachlor)、唑草胺(Cafenstrol)、二甲草胺(Dimethachlor)、二甲吩草胺(Dimethanamid)、精二甲吩草胺(Dimethenamid-P)、大芬灭(Diphenamid)、四唑酰草胺(Fentrazamid)、氟噻草胺(Flufenacet)、苯噻酰草胺(Mefenacet)、吡草胺(Metazachlor)、异丙甲草胺(Metolachlor)、精异丙甲草胺(Metolachlor-S)、萘丙胺(Naproanilid)、草萘胺(Napropamid)、烯草胺(Pethoxamid)、哌草磷(Piperophos)、丙草胺(Pretilachlor)、毒草安(Propachlor)、异丙草胺(Propisochlor)、派罗克杀草砜(Pyroxasulfon)(KIH-485)及甲氧噻草胺(Thenylchlor)；

式2化合物：

特别优选的式2化合物为：

3-[5-(2，2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基甲烷磺酰基]-4-氟-5，5-二甲基-4，5-二氢-异唑(2-1)；3-{[5-(2，2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-氟-甲烷磺酰基}-5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑(2-2)；4-(4-氟-5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑-3-磺酰基甲基)-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1，2，3]三唑(2-3)；4-[(5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑-3-磺酰基)-氟-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1，2，3]三唑(2-4)；4-(5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑-3-磺酰基甲基)-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1，2，3]三唑(2-5)；3-{[5-(2，2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-二氟-甲烷磺酰基}-5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑(2-6)；4-[(5，5-二甲基-4，5-二氢-异唑-3-磺酰基)-二氟-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1，2，3]三唑(2-7)；3-{[5-(2，2-二氟-乙氧基)-1-甲基-3-三氟甲基-1H-吡唑-4-基]-二氟-甲烷磺酰基}-4-氟-5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑(2-8)；4-[二氟-(4-氟-5，5-二甲基-4，5-二氢-异

唑-3-磺酰基)-甲基]-2-甲基-5-三氟甲基-2H-[1，2，3]三唑(2-9)；

k)来自纤维素生物合成抑制剂组的化合物：

氯硫胺(Chlorthiamid)、敌草腈(Dichlobenil)、氟胺草唑(Flupoxam)及异恶草胺(Isoxaben)；

l)来自解偶联除草剂组的化合物：

特乐酚(Dinoseb)、特乐酯(Dinoterb)及DNOC及其盐；

m)来自生长素除草剂组的化合物：

2，4-D及其盐及酯、2，4-DB及其盐及酯、氯氨基吡啶酸(Aminopyralid)及其盐(如氯氨基吡啶酸-三(2-羟丙基)铵及其酯)、草除灵(Benazolin)、草除灵乙酯(Benazolin-ethyl)、草灭平(Chloramben)及其盐及酯、稗草胺(Clomeprop)、克草立特(Clopyralid)及其盐及酯、麦草畏(Dicamba)及其盐及酯、滴丙酸(Dichlorprop)及其盐及酯、高2，4-滴丙酸(Dichlorprop-P)及其盐及酯、氟草烟(Fluroxypyr)、氟草烟丁氧基丙酯(Fluroxypyr-butometyl)、氟草烟甲基庚酯(Fluroxypyr-meptyl)、MCPA及其盐及酯、硫乙基MCPA(MCPA-thioethyl)、MCPB及其盐及酯、2-甲-4-氯丙酸(Mecoprop)及其盐及酯、高2-甲-4-氯丙酸(Mecoprop-P)及其盐及酯、胺氯吡啶酸(Picloram)及其盐及酯、二氯喹啉酸(Quinclorac)、喹草酸(Quinmerac)、TBA(2，3，6)及其盐及酯、绿草定(Triclopyr)及其盐及酯、及5，6-二氯-2-环丙基-4-嘧啶碳酸(H-9；CAS858956-08-8)及其盐及酯；

n)来自生长素转运抑制剂组的化合物：氟吡草腙(Diflufenzopyr)、氟吡草腙钠(Diflufenzopyr-natrium)、抑草生(Naptalam)及抑草生钠(Naptalam-natrium)；

o)来自其他除草剂组的化合物：溴丁酰草胺(Bromobutid)、整形醇(Chlorflurenol)、甲基整形醇(Chlorflurenol-methyl)、环庚草醚(Cinmethylin)、库米隆(Cumyluron)、茅草枯(Dalapon)、迈隆(Dazomet)、野燕枯(Difenzoquat)、甲硫酸野燕枯(Difenzoquat-metilsulfate)、噻节因(Dimethipin)、DSMA、杀草隆(Dymron)、草藻灭(Endothal)及其盐、乙氧苯草胺(Etobenzanid)、麦草伏(Flamprop)、麦草伏异丙酯(Flamprop-isopropyl)、麦草伏甲酯(Flamprop-methyl)、高效麦草伏异丙酯(Flamprop-M-isopropyl)、高效麦草伏甲酯(Flamprop-M-methyl)、抑草丁(Flurenol)、抑草丁丁酯(Flurenol-butyl)、呋嘧醇(Flurprimidol)、杀木膦(Fosamin)、杀木膦铵(Fosamine-ammonium)、茚草酮(Indanofan)、顺丁烯二酰肼(Maleinic acid-hydrazid)、氟磺酰草胺(Mefluidid)、威百亩(Metam)、甲基迭氮化物(methylazid)、甲基溴化物(methylbromid)、甲基杀草隆(methyl-dymron)、甲基碘(methyljodid)、MSMA、油酸(oleic acid)、恶嗪草酮(Oxaziclomefon)、壬酸(Pelargonic acid)、稗草畏(Pyributicarb)、莫克草(Quinoclamin)、三嗪氟草胺(Triaziflam)、灭草环(Tridiphan)及6-氯-3-(2-环丙基-6-甲基苯氧基)-4-哒嗪酮(H-10；CAS499223-49-3)及其盐及酯。

优选的安全剂C的实例为解草酮(Benoxacor)、解毒喹(Cloquintocet)、解草胺腈(Cyometrinil)、环丙磺酰胺(Cyprosulfamid)、二氯丙烯胺(Dichlormid)、迪赛隆(Dicyclonon)、迪艾索诺(Dietholate)、解草唑(Fenchlorazol)、解草啶(Fenclorim)、解草胺(Flurazol)、肟草安(Fluxofenim)、解草

唑(Furilazol)、异地芬(Isoxadifen)、吡唑解草酯(Mefenpyr)、灭吩纳(Mephenat)、萘二甲酸酐、解草腈(Oxabetrinil)、4-(二氯乙酰基)-1-氧-4-氮螺[4.5]癸烷(H-11；MON4660，CAS71526-07-3)及2，2，5-三甲基-3-(二氯乙酰基)-1，3-

唑烷(H-12；R-29148，CAS52836-31-4)。

第a)至o)组的化合物及安全剂C为已知的除草剂及安全剂，参见例如The Compendium of Pesticide CommonNames(http://www.alanwood.net/pesticides/)；B.Hock，C.Fedtke，R.R.Schmidt，Herbicides，Georg Thieme Verlag，Stuttgart1995。其他除草效应物从WO96/26202、WO97/41116、WO97/41117、WO97/41118、WO01/83459及WO2008/074991以及从W.

等人(编)“Modern CropProtection Compounds”，第1卷，Wiley VCH，2007及其中引用的文献得知。

通常优选与对所处理的作物具有选择性且补充由本发明化合物在所用施用量下所控制的杂草的谱的除草剂组合使用本发明化合物。另外通常优选以组合制剂或桶混合物(tank mix)形式同时施用本发明化合物及其他互补除草剂。

术语“mut-HPPD核酸”指具有从野生型HPPD核酸突变而来的且赋予表达其的植物增加的“香豆酮衍生物除草剂”耐受性的序列的HPPD核酸。此外，术语“突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)”指用另一氨基酸置换野生型一级序列SEQ ID NO：2、4、6、11、12、13、14、15、16、17、18、19、其变体、衍生物、同系物、直系同源物或旁系同源物的氨基酸。表达法“突变的氨基酸”将在下文中用于表示被另一氨基酸置换的氨基酸，从而指示蛋白质一级序列中的突变位点。

术语“mut-HST核酸”指具有从野生型HST核酸突变而来的且赋予表达其的植物增加的“香豆酮衍生物除草剂”耐受性的序列的HST核酸。此外，术语“突变的尿黑酸茄尼基转移酶(mut-HST)”指用另一氨基酸置换野生型一级序列SEQ ID NO：8或10的氨基酸。表达法“突变的氨基酸”将在下文中用于表示被另一氨基酸置换的氨基酸，从而指示蛋白质一级序列中的突变位点。

若干HPPD及其一级序列已描述于现有技术中，特别地细菌(诸如假单胞菌属(Pseudomonas)(Ruetschi等人，Eur.J.Biochem.，205，459-466，1992、WO96/38567))的HPPD、植物(诸如拟南芥(WO96/38567，GenebankAF047834)或胡萝卜(WO96/38567，Genebank87257))的HPPD、球霉菌属(Coccicoides)(Genebank COITRP)的HPPD、拟南芥属、芸苔属(Brassica)、棉(cotton)、集胞藻属(Synechocystis)及蕃茄的HPPD(US7,297,541)、哺乳动物(诸如小鼠或猪)的HPPD。此外，人工HPPD序列已描述于例如US6,768,044；US6,268,549中。

在优选的实施方案中，(i)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、3或5或其变体或衍生物的序列。

在另一优选的实施方案中，(ii)的核苷酸序列包含序列SEQ ID NO：7或9或其变体或衍生物的序列。

此外，本领域技术人员将了解(i)或(ii)的核苷酸序列各自涵盖SEQ IDNO：1、3或5的同系物、旁系同源物及直系同源物，及SEQ ID NO：7或9的同系物、旁系同源物及直系同源物，如下文所定义。

就序列(例如多肽或核酸序列，诸如本发明的转录调控核苷酸序列)而言，术语“变体”旨在表示基本上相似的序列。对于包含开放阅读框的核苷酸序列，变体包括由于遗传密码简并性而编码天然蛋白质的相同氨基酸序列的那些序列。诸如这些变体的天然存在的等位基因变体可使用熟知分子生物学技术，例如用聚合酶链反应(PCR)及杂交技术鉴别。变体核苷酸序列亦包括源自合成的核苷酸序列，诸如例如通过使用定点诱变且针对开放阅读框架所生成的编码天然蛋白质的核苷酸序列，以及编码相对于天然蛋白质具有氨基酸替换的多肽的核苷酸序列。一般而言，本发明的核苷酸序列变体将与核苷酸序列SEQ ID NO：1、3、5、7或9的核苷酸序列具有至少30、40、50、60至70％，例如优选地71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％至79％，一般而言至少80％，例如81％-84％、至少85％，例如86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％至98％及99％的核苷酸“序列同一性”。“变体”多肽意指通过在天然蛋白质的N末端及/或C末端缺失(所谓截断)或添加一个或多个氨基酸；在天然蛋白质中的一个或多个位点处缺失或添加一个或多个氨基酸；或在天然蛋白质中的一个或多个位点处替换一个或多个氨基酸而源自SEQ ID NO：2、4、6、8或10的蛋白质的多肽。此类变体可由例如遗传多态性或人类操作产生。此类操作的方法通常在本领域中是已知的。

在特别优选的实施方案中，通过使用一个或多个选自SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67的引物进行定点诱变用于生成SEQ ID NO：2的HPPD的变体。

应认识到本发明的多核苷酸分子及多肽涵盖包含与SEQ ID No：1、3、5、7或9中示出的核苷酸序列或与SEQ ID No：2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19中示出的氨基酸序列足够相同的核苷酸或氨基酸序列的多核苷酸分子及多肽。在本文中使用术语“足够相同”指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够或最小数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等价(例如具有相似的侧链)的氨基酸残基或核苷酸，使得第一与第二氨基酸或核苷酸序列具有共同结构域及/或共同功能活性。

“序列同一性”指两个最佳比对的DNA或氨基酸序列在例如核苷酸或氨基酸组分的整个比对窗中无变化的程度。测试序列及参考序列的比对区段的“同一性分数”为两个比对序列共有的相同组分的数目除以参考序列区段(即整个参考序列或参考序列的较小的限定的部分)中的组分总数。“同一性百分比”为同一性分数乘以100。用于比对比较窗口的最佳序列比对为本领域技术人员所熟知且可通过工具(诸如Smith及Waterman的局部同源性算法、Needleman及Wunsch的同源性比对算法、Pearson及Lipman的搜索类似性方法)来实施，且优选通过这些算法的计算机化来实施，诸如作为GCG.Wisconsin套装(Accelrys Inc.Burlington，Mass.)的部分可获得的GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA。

术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用且指任何长度的聚合的未分支形式的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或两者之组合)。

蛋白质的“衍生物”涵盖相对于所讨论的未经修饰的蛋白质具有氨基酸替换、缺失及/或插入且与其所来源的未经修饰的蛋白质具有相似的生物及功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶。

蛋白质的“同系物”涵盖相对于所讨论的未经修饰的蛋白质具有氨基酸替换、缺失及/或插入且与其所来源的未经修饰的蛋白质具有相似的生物及功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶。

缺失指从蛋白质移除一个或多个氨基酸。

插入指将一个或多个氨基酸残基引入蛋白质中的预定位点。插入片段可包含N端及/或C端融合物以及单个或多个氨基酸的序列内插入片段。一般而言，氨基酸序列内的插入片段将小于N端或C端融合片段约1至10个残基的数量级。N端或C端融合蛋白或肽的实例包括如酵母双杂交系统中使用的转录活化子的结合结构域或活化结构域、噬菌体包被蛋白、(组氨酸)-6标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、

表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位及VSV表位。

替换指用具有相似性质(诸如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α螺旋结构或β片层结构的倾向性)的其他氨基酸置换蛋白质的氨基酸。氨基酸替换通常为单残基替换，但取决于多肽的功能限制可为聚集的且可在从1至10个氨基酸范围内；插入片段将通常为约1至10个氨基酸残基的数量级。氨基酸替换优选为保守氨基酸替换。保存替换表是本领域熟知的(参见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编))。

表3：保守氨基酸替换的实例

残基	保守替换	残基	保守替换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu，Val

使用本领域熟知的肽合成技术(诸如固相肽合成等)，或通过重组DNA操作可容易地进行氨基酸取代、缺失及/或插入。操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法为本领域所熟知。举例而言，在DNA中的预定位点处进行替换突变的技术为本领域技术人员所熟知且包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。

“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，其较之天然存在形式的蛋白质(诸如目的蛋白质)的氨基酸序列，可包含用非天然存在的氨基酸残基的氨基酸替换或添加有非天然存在的氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”亦涵盖肽、寡肽、多肽，其较之天然存在形式的多肽的氨基酸序列，包含天然存在的经改变(糖基化、酰基化、异戊二烯基化、磷酸化、肉豆蔻酰化(myristoylated)、硫酸化等)或经非天然改变的氨基酸残基。衍生物较之其所源于的氨基酸序列，亦可包含一个或多个非氨基酸取代基或添加物，例如与氨基酸序列共价或非共价结合的报告分子或其他配位体(诸如结合以便于其检测的报告分子)，及相对于天然存在蛋白质的氨基酸序列的非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标签肽(诸如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(thioredoxin))的融合物(关于标签肽的综述，参见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。

“直系同源物”及“旁系同源物”涵盖用于描述基因先祖关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内来自通过先祖基因复制所产生的基因；直系同源物为来自不同生物的通过物种形成(speciation)所产生的基因，且也源于共同的先祖基因。此类直系同源物实例的非限制性列表展示于表1中。

本领域熟知旁系同源物及直系同源物在给定位点处可共有具有适合氨基酸残基的不同的结构域，诸如特别底物的结合袋或与其他蛋白质相互作用的结合基序。

术语“结构域”指沿进化相关蛋白质的序列比对的特定位置处的保守的氨基酸组。尽管在同系物之间其他位置的氨基酸可不同，但在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质结构、稳定性或功能方面可能为必需的氨基酸。通过其在蛋白质同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽家族。

术语“基序”或“共有序列”进化相关蛋白质序列中的短保守区。基序常为结构域高度保守的部分，但亦可仅包括部分结构域，或位于保守结构域之外(如果基序的所有氨基酸皆落在限定的结构域之外)。

存在用于鉴别结构域的专业数据库，例如SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等人(2002)Nucleic AcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher及Bairoch(1994)，A generalized profile syntaxfor biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequenceinterpretation.(In)ISMB-94；Proceedings2nd International Conferenceon Intelligent Systems for Molecular Biology.Altman R.，Brutlag D.，KarpP.，Lathrop R.，Searls D.编，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))、或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research30(1)：276-280(2002))。用于计算机(in silico)分析蛋白质序列的工具组可在ExPASy蛋白质组学服务器(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger等人，ExPASy：theproteomics server for in-depth protein knowledge and analysis，NucleicAcids Res.31：3784-3788(2003))上获得。亦可使用常规技术，诸如通过序列比对鉴别结构域或基序。

用于比对序列以进行比较的方法为本领域所熟知，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。GAP使用Needleman及Wunsch的算法((1970)J Mol Biol48：443-453)，以发现使匹配数最大且空位数最小的两个序列的总体(亦即横跨全序列)比对。BLAST算法(Altschul等人(1990)J Mol Biol215：403-10)计算序列同一性百分比，且进行两个序列之间的相似性的统计分析。用于进行BLAST分析的软件可经由国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information，NCBI)公开获得。例如使用ClustalW多序列比对算法(第1.83版)，采用缺省的配对比对参数，及百分比计分方法可容易地鉴别同系物。亦可使用MatGAT软件包中可用方法中的一种来确定相似性及一致性的总体百分比(Campanella等人，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：an application that generates similarity/identity matrices using protein orDNA sequences.)。如将为本领域技术人员显而易见的，可进行些微小人工编辑，以优化保守基序之间的比对。此外，亦可使用特定结构域替代使用全长序列用于鉴定同系物。可使用以上提及的程序，使用缺省参数来确定整个核酸或氨基酸序列或所选择的结构域或保守基序的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法尤其适用(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。

本发明的发明者已惊人地发现，通过替换一个或多个关键氨基酸残基，较之具有SEQ ID NO：2、4或6的野生型HPPD酶的活性，可显著增加除草剂耐受性或抗性。mut-HPPD的优选的替换为那些增加植物的除草剂耐受性，但基本上不影响双加氧酶活性的生物活性的替换。

因此，在本发明的另一目标中，HPPD酶、其变体、衍生物、直系同源物、旁系同源物或同系物的关键氨基酸残基被任何其他氨基酸替换。

在优选的实施方案中，HPPD酶、其变体、衍生物、直系同源物、旁系同源物或同系物的关键氨基酸残基被如上表3中描述的保守氨基酸替换。

本领域技术人员将了解，位于以下提及的氨基酸位置的紧邻位置的氨基酸亦可被替换。因此，在另一实施方案中，SEQ ID NO：2、4、6、11、12、13、14、15、16、17、18、19、其变体、衍生物、直系同源物、旁系同源物或同系物的变体包含mut-HPPD，其中距关键氨基酸±3、±2或±1个氨基酸位置的氨基酸被任何其他氨基酸替换。

基于本领域熟知的技术，可开发高度特征性序列模式，通过该模式可搜寻具有所要活性的其他mut-HPPD候选者。

通过应用适合序列模式搜索其他mut-HPPD候选者亦将由本发明涵盖。本领域读者将了解本发明序列模式不受所述模式两个邻近氨基酸残基之间的精确距离限制。以上模式中两个相连氨基酸之间的每一距离可例如彼此独立地变化多达±10、±5、±3、±2或±1个氨基酸位置，而不基本上影响所要活性。

与基于如根据本发明获得的结晶学数据对个别氨基酸残基的所述以上功能及空间分析一致，可鉴别本发明的潜在适用的mut-HPPD候选者的特有部分氨基酸序列的特征。

在特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：2的mut-HPPD的变体或衍生物选自以下表4a且SEQ ID NO：2的mut-HPPD的组合氨基酸替换选自表4b。

表4a：(SEQ ID No：2)：单个氨基酸替换

表4b：(SEQ ID NO：2)：组合的氨基酸替换

应了解除上表中提及的氨基酸外的任何氨基酸亦可用作取代基。在本领域中容易获得测试此类突变体的功能性的测定，且相应描述于本发明的实施例章节中。

在优选的实施方案中，氨基酸序列在一个或多个以下位置处不同于SEQ ID NO：2的HPPD的氨基酸序列：293、335、336、337、392、363、422、427、382、385、393。

这些氨基酸位置处的差异的实例包括(但不限于)以下一者或多者：位置293的氨基酸不为谷氨酰胺；位置335的氨基酸不为甲硫氨酸；位置336的氨基酸不为脯氨酸；位置337的氨基酸不为丝氨酸；氨基酸位置392不为苯丙氨酸；氨基酸位置363不为谷氨酸；位置422的氨基酸不为甘氨酸；位置427的氨基酸不为亮氨酸；氨基酸位置382不为苏氨酸；位置385的氨基酸不为亮氨酸；氨基酸位置393不为异亮氨酸。

在一些实施方案中，SEQ ID NO：2的HPPD酶包含以下一者或多者：位置293的氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸或天冬酰胺；位置335的氨基酸为丙氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；位置336的氨基酸为丙氨酸；位置337的氨基酸为丙氨酸或脯氨酸；氨基酸位置392为丙氨酸或亮氨酸；氨基酸位置363为谷氨酰胺；位置422的氨基酸为组氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或半胱氨酸；位置427的氨基酸为苯丙氨酸或色氨酸；氨基酸位置382为脯氨酸；位置385的氨基酸为缬氨酸或丙氨酸；氨基酸位置393为丙氨酸或亮氨酸。

在特别优选的实施方案中，SEQ ID NO：2的HPPD酶包含以下一者或多者：位置336的氨基酸为丙氨酸；氨基酸位置363为谷氨酰胺；氨基酸位置393为亮氨酸；位置385的氨基酸为缬氨酸。

在其他优选的实施方案中，氨基酸序列在位置418不同于SEQ ID NO：6的HPPD的氨基酸序列。优选地，位置418的氨基酸不为丙氨酸。更优选地，位置418的氨基酸为苏氨酸。

鉴别SEQ ID NO：1、3或5及相应地SEQ ID NO：7或9的同系物、直系同源物及旁系同源物(诸如表1中描述的那些同系物、直系同源物及旁系同源物)之间所共有的保守区及基序将在本领域技术人员的知识范畴内。已经鉴别了可表示适合的结合基序的此类保守区，可选择对应于表4a及4b中所列氨基酸的氨基酸，将其用任何其他氨基酸，优选地用如表3中所示的保守氨基酸，且更优选地用表4a及4b的氨基酸替换。

此外，本发明涉及通过使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、3或5或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HPPD，及/或通过使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO：7或9或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HST来鉴别香豆酮衍生物除草剂的方法。

该方法包括以下步骤：

b)对a)的转基因细胞或植物和对相同品种的对照细胞或植物施用香豆酮衍生物除草剂；

c)测定施用该香豆酮衍生物除草剂之后转基因细胞或植物及该对照细胞或植物的生长或生存力，及

d)选择“香豆酮衍生物除草剂”，其使对照细胞或植物的生长较之转基因细胞或植物的生长降低。

“对照细胞”或“相似的、野生型的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞”分别意指缺乏本文公开的除草剂抗性特征及/或本发明的特别的多核苷酸的植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞。因此，使用术语“野生型”不意欲暗示植物、植物组织、植物细胞或其他宿主细胞在其基因组中缺乏重组DNA，及/或不具有与本文公开的除草剂抗性特征不同的除草剂抗性特征。

a)生成mut-HPPD编码核酸的文库，

b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸且用香豆酮衍生物除草剂处理所述细胞或植物来筛选所得mut-HPPD编码核酸的群体，

d)选择至少一种mut-HPPD编码核酸，较之由对照HPPD编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性水平，其提供对香豆酮衍生物除草剂的显著增加的耐受性水平。

在优选的实施方案中，较之由对照HPPD编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的抗性或耐受性，步骤d)中选出的mut-HPPD编码核酸提供至少2倍的细胞或植物对香豆酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。

在其他优选的实施方案中，较之由对照HPPD编码核酸提供的对香豆酮衍生物除草剂的抗性或耐受性，步骤d)中选出的mut-HPPD编码核酸提供至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍的细胞或植物对香豆酮衍生物除草剂的抗性或耐受性。

可通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物或宿主细胞，优选地植物细胞并比较所述转基因植物与对照植物或宿主细胞，优选植物细胞来测定抗性或耐受性。

另一目标涉及鉴别含有核酸的植物或藻类的方法，所述核酸包含编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-HPPD或mut-HST的核苷酸序列，所述方法包括：

a)于植物细胞或绿藻的培养物中鉴别导致所述细胞死亡的有效量的香豆酮衍生性除草剂，

b)用诱变剂处理所述植物细胞或绿藻，

c)使所述经诱变的细胞群体与a)中鉴别的有效量的香豆酮衍生物除草剂接触，

d)选择在这些测试条件下存活的至少一个细胞，

e)对选自d)中的细胞的HPPD及/或HST基因进行PCR扩增及测序且将此类序列分别与野生型HPPD或HST基因序列进行比较。

在优选的实施方案中，该诱变剂为甲烷磺酸乙酯(EMS)。

为本领域技术人员熟知的许多方法可用于从多种不同潜在来源生物(包括微生物、植物、真菌、藻类、混合培养物等)以及DNA的环境来源(诸如土壤)获得用于鉴别编码mut-HPPD的核苷酸序列的合适的候选核酸。这些方法尤其包括制备cDNA或基因组DNA文库；使用适当地简并寡核苷酸引物；使用基于已知序列或互补测定的探针(例如在酪氨酸上生长)以及使用诱变及改组以提供重组的或改组的mut-HPPD编码序列。

包含候选及对照HPPD编码序列的核酸可在酵母、细菌宿主菌株、藻类或高等植物(诸如烟草或芥菜属)中表达且根据经转化的菌株或植物在不同浓度的所选香豆酮衍生物除草剂存在下的可见指标表现型来筛选HPPD编码序列的相对固有耐受性水平。方便地依据例如GR50(生长降低50％的浓度)或MIC(最低抑制浓度)值来表示与这些指标表现型(棕色形成、生长抑制、除草效应等)相关的剂量反应及剂量反应的相对改变，其中值的增加对应于表达的HPPD的固有耐受性增加。举例而言，在基于细菌(诸如大肠杆菌(E.coli))转化的相对快速测定系统中，各mut-HPPD编码序列可例如作为在可控制启动子(诸如lacZ启动子)的表达控制下的DNA序列形式表达，并且在适当考虑例如通过使用此类问题的合成DNA作为密码子用途的情况下表达，以获得不同HPPD序列的尽可能相当的表达量。表达包含备选的候选HPPD序列的核酸的此类菌株可在不同浓度的所选香豆酮衍生物除草剂下，于任选地补充了酪氨酸的培养基中平板培养且基于对棕色褐黄病色素形成的抑制的程度及MIC来估计表达的HPPD酶的相对固有耐受性水平。

在另一实施方案中，将候选核酸转化至植物材料中以生成转基因植物，再生为形态学正常的可育植物，接着测量所述可育植物对所选香豆酮衍生物除草剂的差异耐受性。使用适合的选择标记物(诸如卡那霉素)、二元载体(诸如来自农杆菌属(Agrobacterium))及植物再生(诸如来自烟草叶盘)的许多适合转化方法为本领域熟知的。任选地，同样地用表达对照HPPD的核酸来转化对照植物群体。备选地，未转化的双子叶植物，诸如芥菜属或烟草属可用作对照，因为其在任何情况下都表达其自身内源性HPPD。在一定范围的不同除草剂浓度下，以基于植物损伤、分生组织漂白症状等的常规方式对一定范围的初级植物转化事件或其子代对选自表2的香豆酮衍生物的除草剂耐受性水平的平均值及分布进行评估。这些数据可依据例如源自剂量/应答曲线获得的GR50值来表示，在所述剂量/应答曲线中，“剂量”绘制在x轴上且“百分比杀伤”、“除草效应”、“出现绿色植物的数目”等绘制在y轴上，其中GR50值增加对应于表达的HPPD的固有耐受性水平增加。除草剂可适合在出苗前或出苗后施用。

另一目标涉及编码mut-HPPD的经分离的核酸，其中核酸可通过如上定义的方法鉴别。

在另一实施方案中，本发明涉及通过野生型或mut-HPPD核酸转化的植物细胞或已经突变以获得表达野生型或mut-HPPD核酸的植物的植物细胞，其中核酸在植物细胞中的表达导致较之野生型品种的植物细胞，对香豆酮衍生物除草剂的抗性或耐受性增加。

术语“表达”或“基因表达”意谓特定基因或特定遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”特别地意谓基因或遗传构建体转录成结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，随后将后者翻译或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录及所得mRNA产物的加工。

为了获得所要效应，亦即植物对本发明的香豆酮衍生物除草剂具有耐受性或抗性，应理解通过本领域技术人员已知的方法及手段“过表达”至少一种核酸。

如本文所用的术语“增加的表达”或“过表达”意谓原始野生型表达水平外的任何形式的表达。用于增加基因或基因产物表达的方法是本领域经文献充分记载的并且包括例如由适当启动子驱动的过表达、使用转录增强子或翻译增强子。可将用作启动子或增强子元件的经分离的核酸引入非异源形式的多核苷酸的适当位置(通常上游)以便上调编码目的多肽的核酸的表达。举例而言，内源性启动子可通过突变、缺失、及/或替换在体内改变(参见Kmiec，US5,565,350；Zarling等人，WO9322443)，或经分离的启动子可以以适当的定向及距本发明基因的距离引入植物细胞中以控制基因表达。

若需要多肽表达，则通常需要在多核苷酸编码区的3′端包括多聚腺苷酸化区。多聚腺苷酸化区可源于天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。欲添加的3′端序列可源于例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者源于另一植物基因，或稍次优选地源于任何其他真核生物基因。

内含子序列亦可添加至部分编码序列的5′非翻译区(UTR)或编码序列以增加在细胞质中累积的成熟讯息物(message)的量。已显示在植物与动物表达构建体两者中的转录单元中包括可剪接内含子会使基因在mRNA水平与蛋白质水平两者上的表达增加至多1000倍(Buchman及Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等人(1987)Genes Dev1：1183-1200)。当置放在接近转录单元的5′端时，基因表达的此类内含子增强通常最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2及6、Bronze-1内含子的使用为本领域已知的。关于一般性信息，参见：The Maize Handbook，第116章，Freeling及Walbot编，Springer，N.Y.(1994)。

如本文提及的术语“引入”或“转化”涵盖将外源性多核苷酸转移入宿主细胞中而不管用于转移的方法如何。可用本发明的遗传构建体转化能够随后通过器官发生或胚胎发生进行克隆繁殖的植物组织，且从中再生整个植物。选择的特定组织将根据可使用的且最适于所转化的特定物种的克隆繁殖系统而变化。例示性靶组织包括叶碟(leaf disk)、花粉、胚、子叶、胚轴、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如顶端分生组织、腋芽及根分生组织)、及诱导的分生组织(例如子叶分生组织及胚轴分生组织)。多核苷酸可瞬时或稳定引入宿主细胞中且可以维持非整合形式，例如作为质粒。或者，其可整合入宿主基因组中。所得经转化植物细胞可接着以本领域技术人员已知的方式用于再生经转化的植物。

外源基因转移入植物基因组中称为转化。植物物种的转化是目前十分常规的技术。若干转化方法的任一者可有利地用于将目的基因引入适合的祖先细胞中。关于自植物组织或植物细胞转化及再生植物所述的方法可用于瞬时或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学品、将DNA直接注射入植物中、粒子枪轰击、使用病毒或花粉进行转化及显微投影。方法可选自用于原生体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等人(1987)Plant Mol Biol8：363-373)；原生体电穿孔(Shillito R.D.等人(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；显微注射入植物材料中(Crossway A等人，(1986)Mol.GenGenet202：179-185)；DNA或RNA涂布粒子轰击(Klein TM等人，(1987)Nature327：70)；用(非整合性)病毒及进行注射等。优选地经由农杆菌属介导的转化生产转基因植物，包括转基因作物植物。有利的转化方法为在植物体中转化。为此，有可能例如使农杆菌作用于植物种子或用农杆菌接种植物分生组织。已证明根据本发明尤其适宜使经转化的农杆菌的悬浮液作用于完整植物或至少花原基(primordia)。植物随后继续生长直至获得经处理的植物的种子(Clough及Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌属介导的稻转化的方法包括用于稻转化的熟知方法，诸如于以下任一者中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1；Aldemita及Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等人(Plant Mol Biol22(3)：491-506，1993)；Hiei等人(Plant J6(2)：271-282，1994)，其公开内容如同完全阐述一样以引用的方式并入本文中。在玉米转化的情况下，优选的方法是如Ishida等人(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等人(Plant Physiol129(1)：13-22，2002)中所述，其公开内容如同完全阐述一样以引用的方式并入本文中。所述方法另外描述于例如B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung及R.Wu编，Academic Press(1993)128-143及Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225中。优选地将欲表达的核酸或构建体克隆进入适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体(例如pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711))中。由此类载体转化的农杆菌可随后以已知方式，例如通过将擦伤的叶或切碎的叶浸入农杆菌溶液中，然后在适合的培养基中对其进行培养，来转化植物，诸如用作模型的植物(如芥菜属(拟南芥(Arabidopsis thaliana)在本发明范畴内不视为作物植物))或作物植物(诸如烟草植物)。通过根癌农杆菌转化植物例如由

及Willmitzer描述于Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung及R.Wu，编Academic Press，1993，第15-38页得知。

除转化接着必须再生成完整植物的体细胞外，亦有可能转化植物分生组织的细胞且特别地是发育成配子的那些细胞。在此情况下，经转化的配子遵循天然植物发育，从而产生转基因植物。因此，举例而言，用农杆菌处理拟南芥种子并从发育中的植物获得种子，所述植物部分经转化并且因此是转基因植物[Feldman，KA及Marks MD(1987).Mol Gen Genet208：274-289；Feldmann K(1992).C Koncz，N-H Chua及J Shell编，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。备选的方法基于重复移除花序并用经转化的农杆菌孵育在莲座(rosette)中心的切除位点，由此可同样在随后的时间点获得经转化的种子(Chang(1994).Plant J.5：551-558；Katavic(1994).Mol Gen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法为真空浸润法及其修改形式，诸如“浸花(floraldip)”。在真空浸润拟南芥的情况下，在减压下用农杆菌悬浮液处理完整植物[Bechthold，N(1993).C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“浸花”法的情况下，发育中的花组织与经表面活性剂处理的农杆菌悬浮液短暂孵育[Clough，SJ和Bent AF(1998)The Plant J.16，735-743]。在两种情况下收获某比例的转基因种子，且这些种子可通过在上述选择性条件下生长而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化具有优点，因为对于大多数作物而言，质体经母系遗传，从而降低或消除转基因流过花粉的风险。通常通过已图解显示于Klaus等人，2004[Nature Biotechnology22(2)，225-229]中的方法达成叶绿体基因组的转化。简而言之，在与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间，一起克隆待转化的序列和可选择标志物基因。这些同源侧翼序列指导位点特异性整合进入原质体系中。已关于许多不同植物物种对质体转化加以描述且概述于Bock(2001)Transgenic plastids inbasic research and plant biotechnology.J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)Progress towards commercialization ofplastid transformation technology.Trends Biotechnol.21，20-28中。近来已报导了以无标志物质体转化体的形式的其他生物技术方法，所述转化体可由瞬时共整合标志物基因生产(Klaus等人，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。经遗传修饰的植物细胞可经由本领域技术人员所熟悉的所有方法进行再生。适合方法可见于以上提及的S.D.Kung及R.Wu，Potrykus或

及Willmitzer的出版物中。

一般而言，在转化之后，选择存在一或多种由与目的基因共转移的植物可表达基因编码的标志物的植物细胞或细胞分组(cell grouping)，此后将经转化的材料再生成整个植物。为了选择经转化的植物，于转化中获得的植物物质通常经受选择性条件以使得经转化的植物可与未转化的植物区分。举例而言，可种植以上述方式获得的种子且在初始生长期之后，通过喷雾对其进行适合的选择。另一可能性在于在灭菌之后如果适当，使用适合的选择剂，使种子在琼脂平板上生长以使得只有经转化的种子可生长成植物。备选地，筛选存在可选择标志物(诸如上述可选择标志物)的经转化的植物。

在DNA转移及再生之后，亦可例如使用Southern分析来评估推定的经转化的植物的目的基因的存在、克隆数及/或基因组组织。备选地或额外地，可使用Northern及/或Western分析监测新引入的DNA的表达水平，两种技术均为本领域一般技术者所熟知。

可通过多种手段来繁殖经转化的植物，诸如通过克隆繁殖或经典育种技术。举例而言，可使第一代(或T1)经转化的植物自花受粉且选择纯合的第二代(或T2)转化体，且T2植物可接着进一步经由经典育种技术加以繁殖。生成的经转化的生物可采取多种形式。举例而言，它们可为经转化的细胞与非经转化的细胞的嵌合体；克隆的转化体(例如所有细胞皆经转化以含有表达盒)；经转化的及未转化的组织的移植物(例如在植物中，经转化的根茎移植至未转化的接穗(scion))。

优选地，野生型或mut-HPPD核酸(a)或野生型或mut-HST核酸(b)包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQ ID NO：1、3或5中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQ ID NO：7或9中所示的多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQ ID NO：2、4、6、8或10中所示的多肽的多核苷酸，或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一项的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及e)与任何a)至d)中任一项的多核苷酸互补的多核苷酸。

优选地，核酸在植物中的表达导致较之野生型品种的植物，植物对香豆酮衍生物除草剂的抗性增加。

在另一实施方案中，本发明涉及包含本发明的植物细胞的植物，优选地转基因植物，其中核酸在植物中的表达导致较之野生型品种的植物，植物对香豆酮衍生物除草剂的抗性增加。

本文所述之植物可为转基因作物或非转基因植物。

出于本发明的目的，“转基因的”，“转基因”或“重组”意谓对于例如核酸序列、表达盒、基因构建体或包含核酸序列的载体或经本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物而言，所有那些结构都通过重组方法产生，在所述方法中，

(a)编码适用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或

(b)与本发明的核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或

(c)a)及b)

不位于其天然遗传环境中或已通过重组方法修饰，其中修饰有可能采用例如替换、添加、缺失、反转或插入一或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境应理解为意谓原始植物中或存在于基因组文库中的天然基因组或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选至少部分经保留。环境至少在一侧位于核酸序列侧翼且具有至少50bp、优选至少500bp、尤其优选至少1000bp、最优选至少5000bp的序列长度。当通过非天然的，合成(“人工”)的方法(诸如诱变处理)来修饰天然存在的表达盒(例如核酸序列的天然启动子与如上定义的编码适用于本发明方法中的多肽的相应核酸序列的天然存在的组合)时，此表达盒变为转基因表达盒。适合方法描述于例如US5,565,350或WO00/15815中。

因此，出于本发明目的的转基因植物应如上理解为意谓用于本发明方法中的核酸不处于其在所述植物基因组中的天然基因座处，核酸有可能同源或异源地表达。然而，如所提及的，转基因亦意谓，尽管根据本发明的核酸或用于发明方法中的核酸处于其于植物基因组中的天然位置处，已经对于天然序列而言对序列加以修饰，及/或已经修饰了天然序列的调控序列。转基因优选地理解为意谓根据本发明的核酸在基因组中的非天然基因座处的表达，亦即发生核酸的同源或优选地异源的表达。在本文中提及了优选的转基因植物。此外，术语“转基因”指含有至少一种重组多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸的全部或部分稳定整合入染色体或稳定的染色体外组件中，使得其传递至连续世代中。出于本发明目的，术语“重组多核苷酸”指已通过遗传工程改变、重排或修饰的多核苷酸。实例包括与异源序列连接或接合的任何克隆的一个或多个多核苷酸。术语“重组”不指由天然发生事件(诸如自发突变)或选择性育种之后的非自发诱变所产生的多核苷酸改变。

含有由于非自发诱变及选择性育种而产生突变的植物在本文中称为非转基因植物且包括在本发明中。在植物为转基因植物且包含多个mut-HPPD核酸的实施方案中，核酸可源于不同基因组或相同基因组。备选地，在植物为非转基因植物且包含多个mut-HPPD核酸的实施方案中，核酸位于不同基因组或相同基因组上。

在某些实施方案中，本发明涉及通过突变育种生产除草剂抗性植物。此类植物包含编码mut-HPPD及/或mut-HST的多核苷酸且对一或多种“香豆酮衍生物除草剂”具有耐受性。此类方法可涉及例如将植物或种子暴露于诱变剂尤其是化学诱变剂，诸如甲烷磺酸乙酯(EMS)中及选择对至少一或多种香豆酮衍生物除草剂具有增加的耐受性的植物。

然而，本发明不限于通过涉及化学诱变剂EMS的诱变方法生产的除草剂耐受性植物。本领域中已知的任何诱变方法皆可用于生产本发明的除草剂抗性植物。此类诱变方法可涉及例如使用任何一或多种以下诱变剂：辐射，诸如X射线、γ射线(例如钴60或铯137)、中子(例如在原子反应器中由铀235进行核分裂的产物)、β辐射(例如由诸如磷32或碳14的放射性同位素发射的)及紫外辐射(优选地从2500至2900nm)；及化学诱变剂，诸如碱基类似物(例如5-溴-尿嘧啶)、相关化合物(例如8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如链黑菌素(streptonigrin))、烷基化剂(例如硫芥、氮芥、环氧化物、乙撑胺(ethyleneamine)、硫酸酯、磺酸酯、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶。亦可通过使用组织培养方法以选择包含除草剂抗性突变的植物细胞并然后从中再生除草剂抗性植物来生产除草剂抗性植物。参见例如美国专利号5,773,702及5,859,348，两者均以整体引用的方式并入本文中。突变育种的其他详情可见于“Principals of Cultivar Development”Fehr，1993Macmillan Publishing Company中，其公开内容以引用的方式并入本文中。

除以上定义外，术语“植物”亦意欲涵盖处于成熟或发育的任何阶段的作物植物，以及从任何此类植物获取或源于任何此植物的任何组织或器官(植物部分)，除非上下文另外明确指示。植物部分包括(但不限于)茎、根、花、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。

本发明的植物包含至少一种mut-HPPD核酸或过表达的野生型HPPD核酸，且较之野生型品种的植物，对香豆酮衍生物除草剂的耐受性增加。本发明的植物有可能具有来自不同基因组的多个野生型或mut-HPPD核酸，因为这些植物可含有多于1个基因组。举例而言，植物含有两个基因组，通常称为A基因组及B基因组。因为HPPD为所需的代谢酶，通常假定各基因组皆具有至少一种编码HPPD酶的基因(亦即至少一种HPPD基因)。如本文所用，术语“HPPD基因座”指HPPD基因在基因组上的位置，且术语“HPPD基因”及“HPPD核酸”指编码HPPD酶的核酸。各基因组的HPPD核酸的核苷酸序列与另一基因组的HPPD核酸的核苷酸序列不同。本领域技术人员可通过本领域技术人员已知的遗传杂交及/或测序方法或外切核酸酶消化方法确定每种HPPD核酸的起源基因组。

本发明包括包含1、2、3个或更多的mut-HPPD等位基因的植物，其中较之野生型品种的植物，该植物对香豆酮衍生物除草剂耐受性增加。mut-HPPD等位基因可包含选自以下的核苷酸序列：如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中定义的多核苷酸或其变体或衍生物；编码如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：6、11、12、13、14、15、16、17、18、19中定义的多肽的多核苷酸或其变体或衍生物、同系物、直系同源物、旁系同源物；包含以上提及的多核苷酸中的任一项的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；和与以上提及的多核苷酸中的任一项互补的多核苷酸。

“等位基因”或“等位基因变体”为位于相同染色体位置处的给定的基因的备选的形式。等位基因变体涵盖单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常为小于100bp。SNP及INDEL形成大多数生物的天然存在的多态株系中的序列变体的最大集合。

术语“品种”指某一物种内通过共享特征或性状的共同集合而定义的植物组，所述特征或性状为本领域技术人员所接受，足以区分1个栽培种或品种与另一个栽培种或品种。在任一术语中皆不暗示任何给定的栽培种或品种的所有植物将在整个基因或分子水平上遗传相同或任何给定的植物将在所有基因座处为纯合的。若当纯育栽培种或品种自花受粉时，所有子代皆含有某性状，则认为该栽培种或品种针对该特定性状而言为“纯育的(true breeding)”。术语“育种品系”或“品系”指某一栽培种内通过共享特征或性状的共同集合而定义的植物组，所述特征或性状为本领域技术人员所接受，足以区分1个育种品系或品系与另一育种品系或品系。在任一术语中皆不暗示任何给定的育种品系或品系的所有植物将在整个基因或分子水平上遗传相同或任何给定的植物将在所有基因座处为纯合的。若当纯育品系或育种品系自花受粉时，所有子代皆含有某性状，则认为该育种品系或品系针对该特定性状而言为“纯育的”。在本发明中，性状来自植物或种子的HPPD基因中的突变。

包含编码mut-HPPD及/或mut-HST多肽的多核苷酸的本发明的除草剂抗性植物亦可用于通过涉及有性繁殖的常规植物育种来增加植物的除草剂抗性的方法中。方法包括使作为本发明的除草剂抗性植物的第一植物与第二植物杂交，所述第二植物可对或可不对与第一植物相同的除草剂具有抗性或可对不同于第一植物的除草剂具有抗性。第二植物可为当与第一植物杂交时能够生产有活力的子代植物(亦即种子)的任何植物。通常但并非一定地，第一植物与第二植物是相同物种。方法可任选地涉及选择包含第一植物的mut-HPPD及/或mut-HST多肽及第二植物的除草剂抗性特征的子代植物。当与第一或第二植物的任一者或两者比较时，通过本发明此方法产生的子代植物对除草剂具有增加的抗性。当第一及第二植物对不同除草剂具有抗性时，子代植物将具有第一及第二植物的组合的除草剂耐受性特征。本发明方法可另外涉及使第一杂交种(cross)的子代植物与品系或基因型与第一或第二植物任一者相同的植物回交的一代或多代。备选地，第一杂交种或任何随后杂交种的子代可与品系或基因型不同于第一或第二植物的第三植物杂交。本发明亦提供用至少一种本发明的多核苷酸分子、表达盒或转化载体转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子及非人类宿主细胞。此类经转化的植物、植物器官、植物组织、植物细胞、种子及非人类宿主细胞在分别杀伤或抑制未转化的植物、植物组织、植物细胞或非人类宿主细胞生长的除草剂水平下，对至少一种除草剂具有增强的耐受性或抗性。优选地，本发明的经转化植物、植物组织、植物细胞及种子为拟南芥及作物植物。

应了解除mut-HPPD核酸外，本发明植物亦可包含野生型HPPD核酸。设想香豆酮衍生物除草剂耐受性品系可仅在多个HPPD同工酶中的一个中含有突变。因此，本发明包括除一种或多种野生型HPPD核酸外亦包含一或多种mut-HPPD核酸的植物。

在另一实施方案中，本发明涉及由包含本发明的植物细胞的转基因植物产生的种子，其中该种子是较之野生型品种种子具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的纯育种子。

在另一实施方案中，本发明涉及生产较之野生型品种的植物细胞，具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的转基因植物细胞的方法，所述方法包括用包含mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞。

在另一实施方案中，本发明涉及生产转基因植物的方法，其包括：(a)用包含mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，及(b)从植物细胞生成具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的植物。

因此，本发明的mut-HPPD核酸提供于表达盒中，用于在目的植物中表达。所述盒将包括有效连接于本发明的mut-HPPD核酸序列的调控序列。如本文所用的术语“调控元件”指能够调控有效连接的多核苷酸的转录的多核苷酸。其包括(但不限于)启动子、增强子、内含子、5′UTR及3′UTR。就“可有效连接”而言，其指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始且介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般而言，有效连接意谓所连接的核酸序列为邻接的，且当需要接合两个蛋白质编码区时，其为邻接的且位于同一阅读框中。盒可另外含有至少一种待共转化入生物中的额外的基因。备选地，可以在多个表达盒上提供一个或多个额外的基因。

此类表达盒具有用于插入mut-HPPD核酸序列以受调控区转录调控的多个限制性位点。表达盒可另外含有可选择的标志物基因。

表达盒将以5′-3′转录方向包括在植物中具有功能的转录及翻译起始区(即启动子)、本发明的mut-HPPD核酸序列、及转录及翻译终止区(即终止区)。对于植物宿主及/或本发明的mut-HPPD核酸序列而言，启动子可为天然的或类似的、或外源的或异源的。另外，启动子可为天然序列或备选地为合成序列。当启动子对于植物宿主而言为“外源”或“异源”启动子时，意指启动子未见于引入该启动子的天然植物中。当启动子对于本发明的mut-HPPD核酸序列而言为“外源”或“异源”启动子时，意指启动子对于有效连接的本发明的mut-HPPD核酸序列而言不为天然或天然存在的启动子。如本文所用，嵌合基因包含有效连接于转录起始区的编码序列，所述转录起始区对编码序列而言是异源的。

尽管可优选地使用异源启动子表达本发明的mut-HPPD核酸，但可使用天然启动子序列。此类构建体将改变植物或植物细胞中mut-HPPD蛋白质的表达水平。因此，改变了植物或植物细胞的表现型。

终止区可与转录起始区为天然的，与有效连接的目的mut-HPPD序列为天然的，与植物宿主为天然的，或可源于另一来源(亦对于启动子、目的mut-HPPD核酸序列、植物宿主或其任何组合而言为外源或异源的)。合适的终止区可从根癌农杆菌的Ti质粒获得，诸如章鱼碱合酶及胭脂碱合酶终止区。亦参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903；及Joshi^[alpha]/.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。适当时，可针对在经转化的植物中的增加的表达来优化基因。亦即可使用植物偏好的密码子来合成基因，用于改良表达。关于宿主偏好的密码子使用的论述，参见例如Campbell及Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。本领域中可获得用于合成植物偏好的基因的方法。参见例如美国专利号5,380,831及5,436,391、及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，以引用的方式并入本文中。

已知其他序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除编码虚假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列及可能不利于基因表达的其他此类经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至如通过参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的给定细胞宿主的平均水平。可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。用于增强基因表达的核苷酸序列亦可用于植物表达载体中。这些包括玉米Adhl，intronl基因(Callis等人Genes and Development1：1183-1200，1987)、及来自烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic virus，TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize Chlorotic Mottle Virus)及苜蓿花叶病毒(Alfalfa MosaicVirus)的前导序列(W序列)(Gallie等人Nucleic Acid Res.15：8693-8711，1987及Skuzeski等人Plant Mol.Biol.15：65-79，1990)。已显示来自玉米的shrunken-1基因座的第一内含子可增加嵌合基因构建体中基因的表达。美国专利号5,424,412及5,593,874公开了特定内含子在基因表达构建体中的用途，且Gallie等人(Plant Physiol.106：929-939，1994)也已经证明内含子适用于基于组织特异性调控基因表达。为了进一步增强或优化mut-HPPD基因表达，本发明的植物表达载体也可含有包含基质附着区(matrixattachment region，MAR)的DNA序列。然后，用此类经修饰的表达系统转化的植物细胞可表现出本发明核苷酸序列的过表达或组成性表达。

表达盒可另外在表达盒构建体中含有5′前导序列。此类前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列为本领域所知并且包括：微小核糖核酸病毒(picornavirus)前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)Proc.Natl.Acad.ScL USA86：6126-6130)；马铃薯Y病毒(potyvirus)前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒(TobaccoEtch Virus))(Gallie等人(1995)Gene165(2)：233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病病毒(Maize Dwarf Mosaic Virus))(Virology154：9-20)、及人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature353：90-94)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA4)(Jobling等人(1987)Nature325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)，Molecular Biology of RNA，Cech编(Liss，NewYork)，第237-256页)；及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel 等人(1991)Virology81：382-385)。还参见Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84：965-968。还利用已知的增强翻译的其他方法，例如内含子等。

在制备表达盒时，可操作多种DNA片段以便提供处于适当定向及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以接合DNA片段，或可涉及其他操作以提供适宜的限制性位点、移除多余DNA、移除限制性位点等的。出于此目的，可涉及体外诱变、引物修复、限制、复性、再替换，例如转换(transition)及颠换(transversion)。

许多启动子可用于实施本发明。可基于所要结果选择启动子。核酸可与组成性、组织偏好性或其他启动子组合，用于在植物中的表达。此类组成性启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子及公开于WO99/43838及美国专利号6,072,050号中的其他组成性启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632及Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成性启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；及6,177,611。

组织偏好性启动子可用于靶向特定植物组织内的增强的mut-HPPD表达。此类组织偏好性启动子包括但不限于叶偏好性启动子、根偏好性启动子、种子偏好性启动子及茎偏好性启动子。组织偏好性启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)PlantCell Physiol.38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.Gen Genet.254(3)：337-343；Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)PlantPhysiol.112(2)：525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196；Orozco等人(1993)Plant Mol Biol.23(6)：1129-1138；Matsuoka e/[alpha]/.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590；及Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.4(3)：495-505。必要时，此类启动子可经修饰用于弱表达。在一个实施方案中，将目的核酸靶向叶绿体从而表达。以此方式，其中目的核酸不直接插入到叶绿体中，表达盒将诶外含有叶绿体靶向序列，该序列包含编码将目的基因产物导向叶绿体的叶绿体转运肽的核苷酸序列。此类转运肽为本领域所知。就叶绿体靶向序列而言，“有效连接”意谓编码转运肽的核酸序列(亦即叶绿体靶向序列)与本发明的mut-HPPD核酸连接，使得两个序列邻接且位于同一阅读框中。参见例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah等人(1986)Science233：478-481。可通过将叶绿体靶向序列与编码本发明的成熟mut-HPPD蛋白的核苷酸序列的5′端有效连接，使本领域技术中已知的任何叶绿体转运肽与本发明的成熟mut-HPPD蛋白的氨基酸序列融合。叶绿体靶向序列为本领域已知的且包括核酮糖-l，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等人(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等人(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；5-(烯醇式丙酮酰)莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)(Archer等人(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等人(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(plastocyanin)(Lawrence等人(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；分支酸(chorismate)合酶(Schmidt等人(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457)；及光收获叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等人(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还参见VonHeijjne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah等人(1986)Science233：478-481。

用于叶绿体转化的方法为本领域已知的。参见例如Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.ScL USA87：8526-8530；Svab及Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917；Svab及Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。方法依赖于粒子枪递送含有可选择标记物的DNA且经由同源重组使DNA靶向质体基因组。另外，可通过核编码且质体导向的RNA聚合酶的组织偏好性表达，通过使沉默的质体承载的转基因转录活化来完成质体转化。此类系统已报导于McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中。可针对于叶绿体中的表达对待靶向叶绿体的目的核酸加以优化，以解决植物细胞核与此细胞器之间的密码子使用差异。以此方式，目的核酸可使用叶绿体偏好性密码子合成。参见例如美国专利号5,380,831，其以引用的方式并入本文中。

在优选的实施方案中，mut-HPPD核酸(a)或mut-HST核酸(b)包含选自以下的多核苷酸序列：a)如SEQ ID NO：1、3或5中所示多核苷酸或其变体或衍生物；b)如SEQ ID NO：7或9中所示多核苷酸或其变体或衍生物；c)编码如SEQ ID NO：2、4、6、8或10中所示多肽的多核苷酸，或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一项的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及e)与a)至d)中任一项的多核苷酸互补的多核苷酸。

尽管本发明的多核苷酸用作植物转化的可选择标记物基因，但本发明的表达盒可包括用于选择经转化的细胞的另一可选择标记物基因。包括本发明的那些的可选择标记物基因用于选择经转化的细胞或组织。标记物基因包括但不限于编码抗生素抗性的基因，诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)及潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因；以及赋予对除草化合物(诸如草铵膦(glufosinate ammonium)、溴苯腈、咪唑啉酮及2，4-二氯苯氧基乙酸酯(2，4-D))的抗性的基因。一般性地参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511；Christophers on等人(1992)Proc.Natl.Acad.ScL USA89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell71：63-72；Reznikoff(1992)Mol Microbiol6：2419-2422；Barkley等人(1980)，The Operon，第177-220页；Hu等人(1987)Cell48：555-566；Brown等人(1987)Cell49：603-612；Figge等人(1988)Cell52：713-722；Deuschle等人(1989)Proc.Natl Acad.AcL USA86：5400-5404；Fuerst等人(1989)Proc.Natl Acad.ScL USA86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人(1993)Proc.Natl Acad.ScL USA90：1917-1921；Labow等人(1990)Mol Cell Biol10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA89：3952-3956；Bairn等人(1991)Proc.Natl Acad.ScL USA88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics MolStruc.Biol10：143-162；Degenkolb等人(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人(1992)Proc.Natl Acad.ScL USA89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbookof Experimental Pharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人(1988)Nature334：721-724。此类公开内容以引用的方式并入本文中。可选择标记物基因的以上列表不意在具有限制性。任何可选择标记物基因可用于本发明中。

本发明还提供包含含有如上所述mut-HPPD核酸的表达盒的经分离的重组表达载体，其中载体在宿主细胞中的表达导致较之野生型品种的宿主细胞，对香豆酮衍生物除草剂的增加的耐受性。如本文所用，术语“载体”指能够能够转运已经于其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体为“质粒”，其指其中可连接(ligate)额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中额外的DNA区段可连接(ligate)至病毒基因组中。某些载体能够在引入所述载体的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体及游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞时整合于该宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”与“载体”可互换使用，因为质粒为最常用形式的载体。然而，本发明旨在包括起等价功能的此类其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒)。

本发明的重组表达载体包含处于适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，此意谓重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞来加以选择的一种或多种调控序列，其有效连接于待表达的核酸序列。调控序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成性表达的那些调控序列及指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中或在某些条件下表达的那些调控序列。本领域技术人员将了解，表达载体的设计可取决于如待转化的宿主细胞的选择、所需要的多肽的表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞中以由此生产由如本文所述的核酸编码的多肽或肽，包括融合多肽或肽(例如mut-HPPD多肽、融合多肽等)。

在本发明的优选的实施方案中，mut-HPPD多肽在植物及植物细胞(诸如单细胞植物细胞(诸如藻类)(参见Falciatore等人，1999，MarineBiotechnology1(3)：239-251及其中的参考文献)及高等植物的植物细胞(例如种子植物，诸如作物植物))中表达。mut-HPPD多核苷酸可通过任何手段“引入”植物细胞中，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染、生物射弹等。

适用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的方法可见于Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)及其他实验室手册，诸如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，Gartland及Davey编，HumanaPress，Totowa，New Jersey中。由于增加的香豆酮衍生物除草剂耐受性是希望遗传进入广泛多种植物(如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、大豆、花生、棉、油菜籽及芥花、木薯、胡椒、向日葵及万寿菊、茄科植物(如马铃薯、烟草、茄子及蕃茄)、蚕豆属(Vicia species)、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属(Salix species)、树(油棕、椰子)、多年生草及饲料作物)中的一般性状，所以这些作物植物也是作为本发明的另一实施方案的遗传工程改造的优选的靶植物。在优选的实施方案中，植物为作物植物。饲料作物包括但不限于麦草(Wheatgrass)、金丝雀草(Canarygrass)、无芒草(Bromegrass)、野麦草(Wildrye Grass)、蓝草(Bluegrass)、果园草(Orchardgrass)、苜蓿草(Alfalfa)、Salfoin、百脉根(Birdsfoot Trefoil)、瑞典三叶草(Alsike Clover)、红三叶草(Red Clover)及甜三叶草(Sweet Clover)。

在本发明之一实施方案中，通过农杆菌属介导的基因转移将mut-HPPD多核苷酸转染入植物中。本领域技术人员已知的一种转化方法为将开花植物浸入农杆菌溶液中，其中该农杆菌含有mut-HPPD核酸，随后对经转化的配子进行育种。可使用例如GV3101(pMP90)(Koncz及Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396)或LBA4404(Clontech)根癌农杆菌菌株进行农杆菌属介导的植物转化。可通过标准的转化及再生技术进行转化(Deblaere等人，1994，Nucl.Acids.Res.13：4777-4788；Gelvin，Stanton B.及Schilperoort，Robert A，Plant Molecular Biology Manual，第2版-Dordrecht：Kluwer Academic Publ.，1995.-in Sect.，Ringbuc ZentraleSignatur：BT11-P ISBN0-7923-2731-4；Glick，Bernard R.及Thompson，John E.，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，BocaRaton：CRC Press，1993360S.，ISBN0-8493-5164-2)。举例而言，油菜籽可经由子叶或下胚轴转化加以转化(Moloney等人，1989，Plant Cell Report8：238-242；De Block等人，1989，Plant Physiol.91：694-701)。用于农杆菌属及植物选择的抗生素的使用取决于用于转化的双元载体及农杆菌属菌株。油菜籽选择通常使用卡那霉素作为可选择植物标记物来进行。可使用例如由Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report13：282-285所述的技术对亚麻实施农杆菌属介导的基因转移。另外，可使用例如欧洲专利号0424047、美国专利号5,322,783、欧洲专利号0397687、美国专利号5,376,543或美国专利号5,169,770中所述的技术进行大豆的转化。可通过粒子轰击、聚乙二醇介导的DNA摄取，或经由碳化硅纤维技术实现玉米转化。(参见例如Freeling及Walbot“The maize handbook”Springer Verlag：NewYork(1993)ISBN3-540-97826-7)。玉米转化的具体实例可见于美国专利号5,990,387号，并且小麦转化的具体实例可见于PCT申请号WO93/07256号。

根据本发明，若引入的mut-HPPD多核苷酸掺入到非染色体自主复制子中或整合到植物染色体中，则其可稳定维持于植物细胞中。备选地，引入的mut-HPPD多核苷酸可存在于染色体外非复制性载体上且经瞬时表达或具有瞬时活性。在一个实施方案中，可创造同源重组微生物，其中mut-HPPD多核苷酸整合到染色体中，制备含有至少一部分HPPD基因的载体，在该HPPD基因中已引入缺失、添加或替换以由此改变(例如在功能上破坏)内源性HPPD基因且创造mut-HPPD基因。为了经由同源重组创造点突变，DNA-RNA杂交体可用于称为嵌合修复术(chimeraplasty)的技术中(Cole-Strauss等人，1999，Nucleic Acids Research27(5)：1323-1330及Kmiec，1999，Gene therapy American Scientist87(3)：240-247)。小麦属中的其他同源重组方法也是本领域熟知的且考虑在本文中使用。

在同源重组载体中，额外的核酸分子可以位于mut-HPPD基因的5′及3′端的侧翼，以允许在微生物或植物中发生由载体携带的外源性mut-HPPD基因与内源性HPPD基因之间的同源重组。额外的侧翼HPPD核酸分子具有足以成功地与内源性基因同源重组的长度。通常，在载体中包括侧翼DNA(在5′和3′端)的数百碱基对至多数千碱基对(同源重组载体的描述参见例如Thomas，K.R.及Capecchi，M.R.，1987，Cell51：503；或小立碗藓(Physcomitrella patens)中基于cDNA的重组参见Strepp等人，1998，PNAS，95(8)：4368-4373)。然而，因为mut-HPPD基因通常与HPPD基因在极少氨基酸处不同，所以侧翼序列并非是始终需要的。将同源重组载体引入微生物或植物细胞中(例如经由聚乙二醇介导的DNA)，并使用本领域已知的技术选择其中引入的mut-HPPD基因已与内源性HPPD基因同源重组的细胞。

在另一实施方案中，可生产含有所选择的系统的重组微生物，所述系统允许所引入的基因的受调控的表达。举例而言，在载体上包括mut-HPPD基因且将该基因置于lac操纵子控制下会允许mut-HPPD基因仅在IPTG存在下表达。此类调控系统为本领域所熟知的。

本发明的另一方面涉及宿主细胞，其中已引入本发明的重组表达载体之。术语“宿主细胞”及“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应了解此类术语不仅指特别主题的细胞而且也适用于此类细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而出现在后继世代中，所以此子代实际上可能不与母细胞相同，但仍然包括在如本文中所使用的术语的范畴内。宿主细胞可为任何原核或真核细胞。举例而言，mut-HPPD多核苷酸可表达于细菌细胞(诸如谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum))、昆虫细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)、藻类、纤毛虫(ciliate)、植物细胞、真菌或其他微生物，如谷氨酸棒状杆菌中。其他适合的宿主细胞为本领域技术人员所知。

本发明的宿主细胞(诸如培养的原核或真核宿主细胞)可用于生产(亦即表达)mut-HPPD多核苷酸。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞来生产mut-HPPD多肽的方法。在一个实施方案中，方法包括在适合的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已引入编码mut-HPPD多肽的重组表达载体，或其基因组中已引入编码野生型或mut-HPPD多肽的基因)直至生产mut-HPPD多肽。在另一个实施方案中，方法还包括从培养基或宿主细胞分离mut-HPPD多肽。本发明的另一方面涉及经分离的mut-HPPD多肽及其生物活性部分。当通过重组DNA技术生产时，“经分离的”或“经纯化的”多肽或其生物活性部分不含一些细胞物质，或当经化学合成时其不含化学前体或其他化学物质。措辞“基本不合细胞物质”包括mut-HPPD多肽的制剂，其中多肽与天然或重组生产该多肽的细胞的一些细胞组分分离。在一个实施方案中，措辞“基本不含细胞物质”包括mut-HPPD多肽的制剂，其具有少于约30％(以干重计)的非mut-HPPD物质(在本文中亦称为“污染性多肽”)、更优选少于约20％的非mut-HPPD物质、还要更优选少于约10％的非mut-HPPD物质、且最优选少于约5％的非mut-HPPD物质。

当重组生产mut-HPPD多肽或其生物活性部分时，优选地其也基本不含培养基，亦即培养基代表少于约20％、更优选少于约10％、且最优选少于约5％的多肽制剂的体积。措辞“基本不含化学前体或其他化学物质”包括mut-HPPD多肽制剂，其中多肽与多肽合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。在一个实施方案中，措辞“基本不含化学前体或其他化学物质”包括mut-HPPD多肽制剂，其具有少于约30％(以干重计)的化学前体或非mut-HPPD化学物质、更优选少于约20％的化学前体或非mut-HPPD化学物质、还要更优选少于约10％的化学前体或非mut-HPPD化学物质、且最优选少于约5％的化学前体或非mut-HPPD化学物质。在优选的实施方案中，经分离的多肽或其生物活性部分缺乏来自获得mut-HPPD多肽的同一生物的污染性多肽。通常，此类多肽通过例如在植物中或微生物(诸如谷氨酸棒状杆菌、纤毛虫、藻类或真菌)中重组表达mut-HPPD多肽生产。

如上所述，本发明教导了较之野生型品种的植物或种子，用于增加作物植物或种子的香豆酮衍生物耐受性的组合物及方法。在优选的实施方案中，作物植物或种子的香豆酮衍生物耐受性是增加的，使得植物或种子可忍受优选地约1-1000g ai ha^-1、更优选20-160g ai ha^-1、且最优选40-80g aiha^-1的香豆酮衍生物除草剂施用。如本文所用，“忍受”香豆酮衍生物除草剂施用意为植物不被此类施用杀伤或损伤。

此外，本发明提供涉及如表2中描述的香豆酮衍生物除草剂的用途的方法。

在这些方法中，可通过本领域技术中已知的任何方法施用香豆酮衍生物除草剂，包括但不限于种子处理、土壤处理及叶处理。在施用之前，香豆酮衍生物除草剂可转变成惯用的制剂，例如溶液、乳液、悬浮液、粉剂、散剂、糊剂及颗粒剂。使用形式取决于特别的预定目；在各情况下，应确保本发明化合物精细且均匀分布。

通过提供对香豆酮衍生物除草剂具有增加的耐受性的植物，可使用多种制剂来保护植物免遭杂草损害，以便增强植物生长并且降低对养分的竞争。香豆酮衍生物除草剂可单独用于出苗前、出苗后、种植前及种植时防治本文所述作物植物的周围区域中的杂草，或可使用含有其他添加剂的香豆酮衍生物除草剂制剂。香豆酮衍生物除草剂亦可用作种子处理剂。可见于香豆酮衍生物除草剂制剂中的添加剂包括其他除草剂、清洁剂、佐剂、铺展剂、黏着剂、稳定剂等。香豆酮衍生物除草剂制剂可为湿润或干燥的制剂且可包括但不限于可流动散剂、可乳化浓缩物及液体浓缩物。香豆酮衍生物除草剂及除草剂制剂可根据常规方法，例如通过喷雾、灌溉、撒粉等施用。

适合的制剂详述于PCT/EP2009/063387及PCT/EP2009/063386中，其以引用的方式并入本文中。

也应当理解上文涉及本发明的优选的实施方案且可在不脱离本发明范畴的情况下在其中作出众多改变。本发明进一步由以下实例说明，所述实例无论如何都不应理解为对本发明的范畴强加限制。相反，应明确理解可采用其多种其他的实施方案、修改及等效物，在阅读本文说明书之后，所述实施方案、修饰及等效物可在不脱离本发明的精神及/或随附的权利要求的范围的情况下对本领域技术人员而言是不言而喻的。

实施例

实施例1：克隆HPPD编码基因

(A)克隆拟南芥HPPD

通过标准PCR技术使用引物HuJ101及HuJ102(表5)，从拟南芥cDNA扩增部分拟南芥AtHPPD编码序列(SEQ ID No：1)。

表5：用于AtHPPD扩增的PCR引物(SEQ ID NO：20、21)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		HuJ101	GGCCACCAAAACGCCG
HuJ102	TCATCCCACTAACTGTTTGGCTTC

根据制造商说明书，在载体pEXP5-

(Invitrogen，Carlsbad，USA)中克隆PCR产物。通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中分离获得的质粒pEXP5-

-AtHPPD。通过DNA测序确认编码N端带有His₆标签的AtHPPD的表达盒。

(B)克隆莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)HPPD1

针对大肠杆菌中的表达对莱茵衣藻HPPD1(CrHPPD1)编码序列(SEQID No：3)进行密码子优化，并将其作为合成的基因(Entelechon，Regensburg，Germany)提供。通过标准PCR技术使用引物Ta1-1及Ta1-2(表6)扩增部分合成的基因。

表6：用于CrHPPD1扩增的PCR引物(SEQ ID NO：22、23)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Ta1-1	GGCGCTGGCGGTGCGTCCACTAC
Ta1-2	TCAAACGTTCAGGGTACGCTCGTAGTCTTCGATG

根据制造商说明书，在载体pEXP5-

(Invitrogen，Carlsbad，USA)中克隆PCR产物。通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中分离获得的质粒pEXP5--CrHPPD1。通过DNA测序确认编码N端带有His6标签的CrHPPD1的表达盒。

(C)克隆莱茵衣藻HPPD2

针对大肠杆菌中的表达对莱茵衣藻HPPD2(CrHPPD2)编码序列(SEQID No：5)进行密码子优化，并将其作为合成的基因(Entelechon，Regensburg，Germany)提供。通过标准PCR技术使用引物Ta1-3及Ta1-4(表7)扩增部分合成的基因。

表7：用于CrHPPD2扩增的PCR引物(SEQ ID NO：24、25)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Ta1-3	GGTGCGGGTGGCGCTGGCACC
Ta1-4	TCAAACGTTCAGGGTACGTTCGTAGTCCTCGATGG

根据制造商说明书，在载体pEXP5-

-CrHPPD2。通过DNA测序确认编码N端带有His6标签的CrHPPD2的表达盒。

(D)克隆大豆HPPD

针对大肠杆菌中的表达对大豆HPPD(GmHPPD；Glyma14g03410)编码序列进行密码子优化，并将其作为合成的基因(Entelechon，Regensburg，Germany)提供。通过标准PCR技术使用引物Ta2-65及Ta2-66(表8)扩增部分合成的基因。

表8：用于GmHPPD扩增的PCR引物(SEQ ID NO：26、27)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Ta2-65	CCAATCCCAATGTGCAACG
Ta2-66	TTATGCGGTACGTTTAGCCTCC

根据制造商说明书，在载体pEXP5-

-GmHPPD。通过DNA测序确认编码N端带有His6标签的GmHPPD的表达盒。

(E)克隆玉米HPPD

针对大肠杆菌中的表达对玉米HPPD(ZmHPPD；GRMZM2G088396)编码序列进行密码子优化，并将其作为合成的基因(Entelechon，Regensburg，Germany)提供。通过标准PCR技术使用引物Ta2-45及Ta2-46(表9)扩增部分合成的基因。

表9：用于ZmHPPD扩增的PCR引物(SEQ ID NO：28、29)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Ta2-45	CCACCGACTCCGACCGCCGCAGC
Ta2-46	TCAGGAACCCTGTGCAGCTGCCGCAG

根据制造商说明书，在载体pEXP5-

(Invitrogen，Carlsbad，USA)中克隆PCR产物。通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中分离获得的质粒pEXP5--ZmHPPD。通过DNA测序确认编码N端带有His6标签的ZmHPPD的表达盒。

(F)克隆水稻HPPD

针对大肠杆菌中的表达对水稻HPPD(OsHPPD；Os02g07160)编码序列进行密码子优化，并将其作为合成的基因(Entelechon，Regensburg，Germany)提供。通过标准PCR技术使用引物Ta2-63及Ta2-64(表10)扩增部分合成的基因。

表10：用于OsHPPD扩增的PCR引物(SEQ ID NO：30、31)

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Ta2-63	CCGCCGACTCCAACCCC
Ta2-64	TTAAGAACCCTGAACGGTCGG

根据制造商说明书，在载体pEXP5-(Invitrogen，Carlsbad，USA)中克隆PCR产物。通过进行质粒小量制备，从大肠杆菌TOP10中分离获得的质粒pEXP5-

-OsHPPD。通过DNA测序确认编码N端带有His6标签的OsHPPD的表达盒。

实施例2：重组HPPD酶的异源表达及纯化

在大肠杆菌中生产且过表达重组HPPD酶。根据制造商说明书，用pEXP5-

(参见实施例1)转化化学感受态BL21(DE3)细胞(Invitrogen，Carlsbad，USA)。

经转化的细胞在37℃下生长于补充有100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤(Invitrogen，Carlsbad，USA)中。在没有IPTG(异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导的情况下使蛋白质表达。

在OD600(600nm处的光密度)为4至5时，通过离心(8000×g)收集细胞。将细胞沉淀重悬于补充有完全无EDTA蛋白酶混合物(Roche-Diagnostics)的结合缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液，0.5M NaCl，10mM咪唑，pH7.0)中并使用Avestin Press使其均质化。通过离心(20,000×g)使匀浆清澈。根据制造商说明书，通过在HisTrap^TM HP柱(GE Healthcare，Munich，Germany)上进行亲和层析，来纯化带His₆标签的HPPD或突变变体。经纯化的HPPD或突变变体针对补充有10％甘油的100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行透析并储存在-86℃下。根据Bradford，使用Bio-Rad蛋白质测定(Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)确定蛋白质含量。通过SDS-PAGE估计酶制剂的纯度。

实施例3：HPPD活性检定

HPPD从4-羟苯基丙酮酸(4-HPP)及O₂产生尿黑酸及CO₂。HPPD的活性测定基于通过逆相HPLC分析尿黑酸。

方法(A)

测定混合物可含有150mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、50mM L-抗坏血酸、1μM FeSO₄及7μg经纯化的酶，总体积1ml。

将抑制剂溶解于DMSO(二甲基亚砜)中分别至20mM或0.5mM的浓度。在DMSO中，从此储备溶液制备5倍系列稀释液，在测定中使用。各抑制剂溶液占测定体积的1％。因此，最终抑制剂浓度分别在200μM至2.5nM或5μM至63pM的范围内。

在预孵育30分钟之后，通过添加4-HPP至0.1mM的最终浓度来使反应开始。在室温下允许反应进行120分钟。通过添加100μl4.5M磷酸使反应停止。

在用63mM磷酸预平衡的HLB筒3cc/60mg(Waters)上提取样品。用3ml63mM磷酸洗去L-抗坏血酸。用63mM磷酸与甲醇的1ml1∶1(w/w)混合物洗脱尿黑酸。

通过使用5mM H₃PO₄/15％乙醇(w/w)作为洗脱剂，在

C18柱(颗粒大小3.5μm，尺寸4.6×100mm；Waters)上进行逆相HPLC来分析10μl洗脱液。

经电化学检测尿黑酸并通过测量峰面积(Empower软件；Waters)定量。

通过将未受抑制的酶活性设定成100％来使活性归一化。使用非线性回归计算IC₅₀值。

方法(B)

测定混合物可含有150mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、50mM L-抗坏血酸、100μM过氧化氢酶(Catalase)(Sigma-Aldrich)、1μM FeSO₄及0.2单位经纯化的HPPD酶，总体积505μl。1单位定义为在20℃下每分钟生产1nmol HGA所需的酶量。

在预孵育30分钟之后，通过添加4-HPP至0.05mM的最终浓度来开始反应。在室温下允许反应进行45分钟。通过添加50μl4.5M磷酸使反应停止。使用0.2μM孔大小的PVDF过滤装置过滤样品。

通过使用90％10mM NaH₂PO₄(pH2.2)、10％甲醇(v/v)的等度洗脱在Atlantis T3柱(颗粒大小3μm，尺寸3×50mm；Waters)上分析5μl澄清的样品。

在750mV(模式：DC；极性：正)下进行电化学检测HGA并通过对峰面积积分(Empower软件；Waters)来定量。

将抑制剂溶解于DMSO(二甲基亚砜)中至0.5mM的浓度。在DMSO中，从此储备溶液制备5倍系列稀释液，在测定中使用。各抑制剂溶液占测定体积的1％。因此，最终抑制剂浓度分别在5μM至320pM的范围内。通过将未受抑制的酶活性设定成100％来使活性归一化。使用非线性回归计算IC₅₀值。

实施例4：体外表征野生型HPPD酶

使用以上实例中描述的或本领域中熟知的方法，关于动力学性质及对HPPD抑制性除草剂的敏感性对经纯化的重组野生型HPPD酶进行表征。通过使用底物抑制模型，用软件GraphPad Prism5(GraphPad Software，La Jolla，USA)进行非线性回归来计算表观米氏常数(K_m)及最大反应速度(V_max)。从V_max计算表观k_cat值，假设酶制剂的纯度为100％。根据至少3个独立实验计算K_m及IC₅₀值的加权平均值(根据标准误差)。使用竞争性抑制的Cheng-Prusoff方程(Cheng，Y.C.；Prusoff，W.H.BiochemPharmacol1973，22，3099-3108)计算解离常数(K_i)。获得的数据的实例描述于表11中。

由以上实例可见HPPD酶可选作对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性的酶，因为发现支配“香豆酮衍生物除草剂”从其与此HPPD酶的复合物解离的解离常数大于支配“香豆酮衍生物除草剂”从其与其他HPPD酶的复合物解离的解离常数。

以上实例也表明所选择的HPPD酶(如衣藻HPPD1)尤其适用于本发明的上下文中，因为它们对于“香豆酮衍生物除草剂”的解离常数大于其他HPPD酶(如拟南芥HPPD)的解离常数。

显然对香豆酮衍生物除草剂具有抗性的任何HPPD酶(即使此蛋白质未例示于此文中)都是本发明的主题的一部分。

此外，实例表明HPPD酶可选作对苯吡唑草酮具有抗性的酶，因为发现支配苯吡唑草酮从其与此HPPD酶的复合物解离的解离常数大于支配苯吡唑草酮从其与其他HPPD酶的复合物解离的解离常数。

实施例5：合理诱变

通过结构生物学及序列比对，能够选择发现涉及“香豆酮衍生物除草剂”结合的某一数目的氨基酸，并然后对其进行诱变并获得耐受性HPPD酶。

(A)定点诱变

根据制造商说明书，用Quik-Change II定点诱变试剂盒(Stratagene，Santa Clara，USA)完成pEXP5-

-AtHPPD的基于PCR的定点诱变。此技术需要两个化学合成的DNA引物(正向及反向引物)用于每个突变，。用于AtHPPD的定点诱变的引物列于表12中。

表12：用于AtHPPD的定点诱变的PCR引物(SEQ ID NO：32至67)

通过进行质粒小量制备从大肠杆菌TOP10分离突变体质粒并通过DNA测序确认。

通过逐步诱变方法达成单个氨基酸替换的组合。

(B)拟南芥属HPPD突变体的体外表征

通过上述方法获得经纯化的突变HPPD酶。使用所述HPPD活性测定进行剂量应答及动力学测量。通过使用底物抑制模型，用软件GraphPadPrism5(GraphPad Software，La Jolla，USA)进行非线性回归来计算表观米氏常数(K_m)及最大反应速度(V_max)。从V_max计算表观k_cat值，假设酶制剂的纯度为100％。根据至少3个独立实验计算K_m及IC₅₀值的加权平均值(根据标准误差)。使用竞争性抑制的Cheng-Prusoff方程(Cheng，Y.C.；Prusoff，W.H.Biochem Pharmacol1973，22，3099-3108)计算解离常数(K_i)。获得的数据的实例描述于表13中。

由以上实例可见突变HPPD酶可选作对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性的酶，因为发现支配“香豆酮衍生物除草剂”从其与此HPPD突变体的复合物解离的解离常数大于支配“香豆酮衍生物除草剂”从其与野生型HPPD酶的复合物解离的解离常数。以上实例也表明所选择的HPPD突变体(如I393L、L385V、或P336A E363Q)尤其适用于本发明的上下文中，因为较之野生型酶，其催化效率(k_cat/K_m)仅减小最多5倍。

此外，实例表明突变HPPD酶可选作对苯吡唑草酮具有抗性的酶，因为发现支配苯吡唑草酮从其与HPPD突变体的复合物解离的解离常数大于支配苯吡唑草酮从其与野生型HPPD酶的复合物解离的解离常数。

实施例6：随机诱变及筛选藻类细胞以鉴别对“香豆酮衍生物除草剂”具有耐受性的克隆及鉴别HPPD/HST基因中的致病性突变

模式为作用于质体醌或生育酚生物合成的漂白除草剂可抑制藻类生长(表14及15)。这些效应可被尿黑酸生物合成的中间体部分逆转(表14)。为了生成赋予HPPD或HST基因中的“香豆酮衍生物除草剂”抗性的突变，可使用化学或紫外诱变。如莱茵衣藻或斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的单细胞生物尤其适用于鉴别除草剂抗性中的显性突变。

表14：HPPD抑制性除草剂对莱茵衣藻生长的抑制及尿黑酸的效应

表15：“香豆酮衍生物除草剂”对斜生栅藻生长的抑制

通过在100rpm、22℃及30μmol Phot×m^-2×s^-2光照下恒定振荡，在TAP培养基(Gorman及Levine(1965)PNAS54：1665-1669)中繁殖莱茵衣藻株系CC-503及CC-1691(Duke University，Durham，USA)的藻类细胞。在与对于衣藻所提及的相同的培养条件下，在如所述(

及Sandmann，(1993)，Target assays for modern herbicides and related phytotoxiccompounds，Lewis Publishers)的藻类培养基中繁殖斜生栅藻(University of

德国)。在450μmol Phot×m^-2×s^-2照明下实施化合物筛选。

如由Loppes所述(1969，Mol Gen Genet104：172-177)，用0.14M甲烷磺酸乙酯(EMS)突变莱茵衣藻或斜生栅藻的敏感株系(表14、15)1小时。通过在含有野生型致死浓度的“香豆酮衍生物除草剂”或其他HPPD抑制性除草剂的固体养分溶液平板上筛选经诱变的细胞来鉴别耐受性株系。获得的数据的实例描述于表16及图2中。

表16：鉴别出的衣藻属株系对“香豆酮衍生物除草剂”、苯吡唑草酮及甲基磺草酮的耐受性。描述了生长抑制的IC₅₀值[mol/l]。

由以上实例可见经诱变的衣藻属株系可选作对“香豆酮衍生物除草剂”具有抗性的株系，因为发现在含有“香豆酮衍生物除草剂”的培养基上选择的经诱变的株系较之野生型株系，显示出较高的IC50值和因此较少的生长抑制。

此外，实例表明经诱变的衣藻属株系可选作对如甲基磺草酮或苯吡唑草酮的其他HPPD抑制性除草剂具有抗性的株系，因为发现在含有这些除草剂的培养基上选择的经诱变的株系较之野生型株系，显示出较高的IC50值和因此较少的生长抑制。

以上实例亦表明所选择的突变体显示出针对所有测试的化合物的高耐受性水平或广泛的交叉抗性(例如CMr06)。

通过标准PCR技术，用如表17中所列出的DNA寡核苷酸从作为模板的基因组DNA或拷贝DNA扩增来自野生型及抗性莱茵衣藻的HPPD及HST基因。DNA寡核苷酸源自SEQ ID NO：3、5及7。在标准测序载体中克隆所得的DNA分子并通过标准测序技术来测序。通过用序列比对工具Align X(Vector NTI高级软件第10.3版，Invitrogen，Carlsbad，USA)比较野生型与突变HPPD/HST序列来鉴别突变。

表17：用于扩增CrHPPD1、CrHPPD2及CrHST的PCR引物(SEQ ID NO：68至73)

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Cr_HPPD1_Fw	ATGGGCGCTGGTGGCGCTTCTAC
Cr_HPPD1_Rv	CTACACATTTAGGGTGCGCTCATAGTCC
		Cr_HPPD2_Fw	ATGGGAGCGGGTGGTGCAGGCAC
Cr_HPPD2_Rv	TTAAACATTTAAGGTGCGCTCATAGTCCTC
		Cr_HST_Fw	ATGGACCTTTGCAGCTCAACTGGAAG
Cr_HST_Rv	GTACGCGCTGCTGCCGTTCCTGTAG

获得的数据的实例描述于表18中。

表18：在“香豆酮衍生性”除草剂耐受性衣藻属株系CMr15中鉴别出的CrHPPD2突变

株系	突变(核苷酸交换)	氨基酸交换
			CMr15	G1252A(在SEQ ID No：5中)	A418T(在SEQ ID NO：6中)

为了从斜生栅藻鉴别直系同源HPPD及HST基因，分别基于HPPD或HST的蛋白质比对(图1A及B)从保守区确定简并PCR引物。从共有序列R-K-S-Q-I-Q-T(表19A)或S-G-L-N-S-A/M/V-V-L-A(表19B)生成HPPD的正向引物，反向引物源于共有序列Q-(I/V)-F-T-K-P-(L/V)(表19A)或C-G-G-F-G-K-G-N-F(表19B)。从共有序列W-K-F-L-R-P-H-T-I-R-G-T生成HST的正向引物，反向引物源于共有序列F-Y-R-F/W-I-W-N-L-F-Y-A/S/V(表19)。基于接受的HPPD/HST基因序列标签，通过如由Liu及Whittier(1995，Genomics25：674-681)及Yuanxin等人(2003Nuc Acids Research31：1-7)或Spertini等人(1999Biotechniq ues27：308-314)所述衔接子PCR或TAIL PCR技术在拷贝DNA或基因组DNA上完成蛋白质编码序列。

表19A：用于部分扩增SoHPPD的PCR引物(SEQ ID NO：74至77)

引物名称	引物序列(5’-3’)
		So_Deg_HPPD_Fw	MGBAARWSYCAGATYCAGAC
So_Deg_HPPD_Rv	ASIGGYTTIGTRAAVAYCTG
		So_Deg_HST_Fw	TGGMGNTTYYTNMGNCCNCAYACNATHMG
So_Deg_HST_Rv	YTCNGCNNHRAANARRTTCCADATVMANC

其中So_Deg_HPPD_Rv中的“I”代表肌醇但亦可为任何核苷酸a、g、t、c。

表19B：用于部分扩增SoHPPD的PCR引物(SEQ ID NO：78至81)

引物名称	引物序列(5’-3’)
		So_Deg_HPPD_Fw2	WSNGGNYTNAAYWSNRYNGTNYTNGC
So_Deg_HPPD_Rv2	RAARTTNCCYTTNCCRAANCCNCCRC
		So_Deg_HST_Fw2	TGGMGNTTYYTNMGNCCNCAYACNATHMG
So_Deg_HST_Rv2	YTCNGCNNHRAANARRTTCCADATVMANC

实施例7

筛选经EMS诱变的拟南芥群体以鉴别除草剂耐受性植物及鉴别HPPD/HST基因中的致病性突变

从Lehle Seeds(Round Rock，TX，USA)获得经EMS处理的拟南芥植物的M2群体。通过将拟南芥种子铺于半强度的含有0.5％凝胶剂

及取决于化合物活性0.1至100μM的香豆酮衍生物除草剂的murashigeskoog养分溶液上来进行筛选。在22℃下以16:8h的光照：黑暗循环在生长室中孵育平板至多3周。将显示不太强烈的漂白表现型的耐受性植物种植于土壤中且在温室条件下生长至成熟。在莲座状植物阶段，从香豆酮衍生物除草剂耐受性植物收集叶盘，用于用DNeasy植物小型试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)分离基因组DNA或用RNeasy植物小型试剂盒(Quagen，Hilden，Germany)分离总mRNA。通过标准PCR技术用如表11中所述的各寡核苷酸从基因组DNA扩增HPPD或HST序列。对于从mRNA扩增HPPD或HST，用Superscript III逆转录酶(Invitrogene，Carlsbad，CA，USA)合成拷贝DNA且用表11中所列出的DNA寡核苷酸扩增HPPD或HST。在将PCR产物于标准测序质粒中克隆后，通过标准测序技术鉴别突变的HPPD/HST基因的DNA序列。通过用序列比对工具Align X(VectorNTI高级软件第10.3版，Invitrogene，Carlsbad，CA，USA)比较野生型与突变HPPD/HST序列来鉴别突变。

表20：用于扩增AtHPPD及AtHST的PCR引物(SEQ ID NO：82至85)

引物名称	引物序列(5’-3’)
		At_HPPD_Fw	ATGGGCCACCAAAACGCCGC
At_HPPD_Rv	TCATCCCACTAACTGTTTGGCTTCAAG
		At_HST_Fw	ATGGAGCTCTCGATCTCACAATC
At_HST_Rv	CTAGAGGAAGGGGAATAACAGATACTC

实施例8

制备表达异源HPPD及/或HST酶且对“香豆酮衍生物除草剂”具有耐受性的植物

生产稳定转化的植物的多种方法是本领域中已熟知的。可通过Olhoft等人(美国专利2009/0049567)所述的方法生产香豆酮衍生物除草剂耐受性大豆(大豆(Glycine max))植物。简而言之，使用如由Sambrook等人(Molecular cloning(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述的标准克隆技术，将HPPD或HST编码多核苷酸克隆入二元载体中。最终载体构建体含有侧翼有启动子序列(例如泛素启动子(PcUbi)序列)及终止子序列(例如胭脂碱合酶终止子(NOS)序列)的HPPD或HST编码序列和抗性标志物基因盒(例如AHAS)(图3)。任选地，HPPD或HST基因可提供选择的工具(means)。采用农杆菌属介导的转化将DNA引入幼苗外植体的主要节点(primary node)处的大豆腋生分生组织细胞中。在接种并与农杆菌共培养之后，将外植体转移至无选择物的芽诱导培养基中，持续1周。外植体随后转移至含有1-3μM灭草烟(Arsenal)的芽诱导培养基中，持续3周，以选择经转化的细胞。然后将在主要节点处具有健康的愈伤组织/芽垫(shootpad)的外植体转移至含有1-3μM灭草烟的芽伸长培养基中，直至芽伸长或外植体死亡。在再生之后，将转化体移植至小盆中的土壤中，置放于生长室(白天16小时/夜晚8小时；白天25℃/夜晚23℃；65％相对湿度；130-150mE m^-2s^-1)中且随后经由Taqman分析测试T-DNA的存在。在数周之后，将健康的转基因阳性的单拷贝结果移植至较大盆中并允许其在生长室中生长。

通过McElver及Singh(WO2008/124495)描述的方法转化玉米植物。经由农杆菌属介导的转化将含有HPPD或HST序列的植物转化载体构建体引入玉米未成熟胚中。在补充有0.5-1.5μM咪草烟的选择培养基上选择经转化的细胞3-4周。转基因小植物在植物再生培养基上再生并随后生根。在移植至盆栽混合物中并且在温室中生长至成熟之前，针对转基因的存在性对转基因小植物进行TaqMan分析。

通过如由McElver及Singh(WO2008/124495)描述的花浸渍法，用HPPD或HST序列转化拟南芥。

通过如由Peng等人(US6653529)描述的原生体转化进行水稻(Oryzasativa)(稻)转化。

在温室研究中，测试含有HPPD或HST序列的大豆、玉米、稻及拟南芥的T0或T1转基因植物对“香豆酮衍生物除草剂”的改善的耐受性。

实施例9：温室实验

在温室实验中测试表达异源HPPD或HST酶的转基因植物对抗香豆酮衍生物除草剂的耐受性。

对于出苗前处理，在播种之后通过精细分布的喷嘴直接施用除草剂。温和灌溉容器以促进萌发及生长，并随后用透明塑料罩覆盖直至植物已生根。除非此覆盖物已被除草剂损坏，否则此覆盖物会导致测试植物统一萌发。

对于出苗后处理，取决于植物习性，首先使测试植物生长至3至15cm的高度，然后仅用除草剂处理。出于此目的，测试植物经直接播种并在相同容器中生长，或首先使其分别生长并在处理前几天移植到测试容器中。

为了测试T0植物，可使用插条(cutting)。在大豆植物的情况下，用于插条的最佳芽为约7.5至10cm高，且存在至少两个节。各插条均取自原始转化体(母本植物)且浸入生根激素粉末(吲哚-3-丁酸，IBA)中。然后将插条放置于生物穹顶(bio-dome)内部的绿洲楔(oasis wedge)中。也同时取得野生型插条来充当对照。插条在生物穹顶中保持5-7天，然后移植至盆中，然后再适应生长室环境2天。随后，将插条转移至温室中，适应约4天，然后接受如所指示的喷雾测试。

取决于物种，植物保持在10-25℃或20-35℃。测试期延续3周。在此时间期间，照料植物且评估其对个别处理剂的应答。在处理之后2周及3周评估除草剂损伤。以0至9的评分表对植物损伤进行评级，其中0为无损伤且9为完全死亡。

获得的数据的实例描述于表21及图4中。

表21：转基因大豆植物(T0插条)的温室测试。在除草剂处理之后2周进行损伤评估。

从以上实例可见转化进入植物中的HPPD编码多核苷酸可被选作为赋予对香豆酮衍生物除草剂的抗性的多核苷酸，因为发现用此类多核苷酸转化的植物较之未经转化的对照植物，受香豆酮衍生物除草剂所导致的损伤较小。

此外，实例表明转化至植物中的HPPD编码多核苷酸可被选作为赋予对苯吡唑草酮的抗性的多核苷酸，因为发现用此类多核苷酸转化的植物较之未经转化的对照植物，受苯吡唑草酮所导致的损伤较小。

Claims

1.控制植物栽培位置处不合需要的植被的方法，该方法包括以下步骤：

a)在该位置处提供包含至少一种核酸的植物，所述核酸包含：

(i)编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的野生型羟苯基丙酮酸双加氧酶或突变的羟苯基丙酮酸双加氧酶(mut-HPPD)的核苷酸序列及/或

b)向所述位置处施用有效量的所述除草剂。

2.根据权利要求1的方法，其中(i)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、3或5的序列，或其变体或衍生物。

3.根据权利要求1的方法，其中(ii)的核苷酸序列包含SEQ ID NO：7或9的序列，或其变体或衍生物。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中植物包含至少一种额外的异源核酸，所述核酸包含(iii)编码除草剂耐受性酶的核苷酸序列。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中香豆酮衍生物除草剂连同一种或多种其他HPPD及/或HST靶向除草剂一起施用。

6.鉴别香豆酮衍生物除草剂的方法，所述方法通过使用由包含SEQ IDNO：1、3或5的核苷酸序列，或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HPPD，及/或通过使用由包含SEQ ID NO：7或9的核苷酸序列，或其变体或衍生物的核酸编码的mut-HST来进行鉴别。

7.根据权利要求6的方法，其包括以下步骤：

b)向a)的转基因细胞或植物及向相同品种的对照细胞或植物施用香豆酮衍生物；

d)较之转基因细胞或植物的生长，选择赋予对照细胞或植物降低的生长的测试化合物。

8.鉴别编码对香豆酮衍生物除草剂具有抗性或耐受性的mut-HPPD的核苷酸序列的方法，该方法包括：

a)生成mut-HPPD编码核酸的文库，

b)通过在细胞或植物中表达每种所述核酸并用香豆酮衍生物处理所述细胞或植物，来筛选所得mut-HPPD编码核酸的群体，

c)比较由所述mut-HPPD编码核酸群体提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平与由对照HPPD编码核酸提供的“香豆酮衍生物”耐受性水平，

d)较之由对照HPPD编码核酸提供的对“香豆酮衍生物”的耐受性水平，选择提供对“香豆酮衍生物”的耐受性水平显著增加的至少一种mut-HPPD编码核酸。

9.根据权利要求8的方法，其中较之由对照HPPD编码核酸所提供的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性，在步骤d)中选择的mut-HPPD编码核酸提供至少2倍的对香豆酮衍生物除草剂的耐受性。

10.根据权利要求8或9的方法，其中通过生成包含步骤a)的文库的核酸序列的转基因植物并比较所述转基因植物与对照植物来测定抗性或耐受性。

11.编码mut-HPPD的经分离的核酸，其中核酸能够通过如权利要求8至10中任一项所定义的方法鉴别。

12.根据权利要求11的核酸，其中被编码的mut-HPPD为SEQ ID NO：2的变体，其包括下述中的一个或多个：位置293的氨基酸不为谷氨酰胺；位置335的氨基酸不为甲硫氨酸；位置336的氨基酸不为脯氨酸；位置337的氨基酸不为丝氨酸；氨基酸位置363不为谷氨酸；位置422的氨基酸不为甘氨酸；位置385的氨基酸不为亮氨酸；及/或氨基酸位置393不为异亮氨酸。

13.由野生型或mut-HPPD核酸转化的转基因植物细胞，其中较之野生型品种的植物细胞，核酸在植物细胞中的表达导致对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性或耐受性。

14.根据权利要求13的转基因植物细胞，其中野生型或mut-HPPD核酸包含选自由以下组所组成的多核苷酸序列，所述组为：a)如SEQ ID NO：1、3或5中所示的多核苷酸，或其变体或衍生物；b)如SEQ ID NO：7或9中所示的多核苷酸，或其变体或衍生物；c)编码如SEQ ID NO：2、4、6、8或10中所示的多肽的多核苷酸，或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一项的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及e)与a)至d)中任一项的多核苷酸互补的多核苷酸。

15.根据权利要求14的转基因植物细胞，其中c)中的SEQ ID NO：2的该多肽的变体包括下述中的一个或多个：位置293的氨基酸不为谷氨酰胺；位置335的氨基酸不为甲硫氨酸；位置336的氨基酸不为脯氨酸；位置337的氨基酸不为丝氨酸；氨基酸位置363不为谷氨酸；位置422的氨基酸不为甘氨酸；位置385的氨基酸不为亮氨酸；及/或氨基酸位置393不为异亮氨酸。

16.包含如权利要求13至15中任一项所定义的植物细胞的转基因植物，其中较之野生型品种的植物细胞，核酸在植物细胞中的表达导致植物对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性或耐受性。

17.表达包含SEQ ID NO：2的经诱变的或重组mut-HPPD的植物，其中氨基酸序列在一个或多个氨基酸位置处不同于相应野生型植物的HPPD的氨基酸序列，其中位置293的氨基酸不为谷氨酰胺；位置335的氨基酸不为甲硫氨酸；位置336的氨基酸不为脯氨酸；位置337的氨基酸不为丝氨酸；氨基酸位置363不为谷氨酸；位置422的氨基酸不为甘氨酸；位置385的氨基酸不为亮氨酸；及/或氨基酸位置393不为异亮氨酸，且其中所述HPPD在植物中表达时，赋予植物较之相应野生型品种植物的增加的除草剂耐受性。

18.由包含如权利要求13至15中任一项所定义的植物细胞的转基因植物，或由权利要求16或17的植物所生产的种子，其中种子对于较之野生型品种的种子的增加的对香豆酮衍生物除草剂的抗性而言是纯育的。

19.生产转基因植物细胞的方法，所述方法包括用包含mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，所述转基因植物细胞较之野生型品种的植物细胞，具有增加的对香豆酮衍生物除草剂的抗性。

20.生产转基因植物的方法，所述方法包括：(a)用包含mut-HPPD核酸的表达盒转化植物细胞，及(b)从植物细胞生成具有对香豆酮衍生物除草剂的增加的抗性的植物。

21.权利要求19或20的方法，其中mut-HPPD核酸包含选自由以下组所组成的多核苷酸序列，所述组为：a)如SEQ ID NO：1、3或5中所示的多核苷酸，或其变体或衍生物；b)如SEQ ID NO：7或9中所示的多核苷酸，或其变体或衍生物；c)编码如SEQ ID NO：2、4、6、8或10中所示的多肽的多核苷酸，或其变体或衍生物；d)包含a)至c)中任一项的至少60个连续核苷酸的多核苷酸；及e)与a)至d)中任一项的多核苷酸互补的多核苷酸。

22.权利要求19或20的方法，其中表达盒还包含在植物中有功能的转录起始调控区及翻译起始调控区。

23.鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，所述方法包括：i)提供经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分，其中所述经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含如SEQ ID NO：1、3或5中所示的多核苷酸，或其变体或衍生物，其中多核苷酸编码用作选择标志物的mut-HPPD多肽，且其中所述经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分可包含其他的经分离的多核苷酸；ii)将经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分与至少一种香豆酮衍生物化合物接触；iii)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制性化合物影响；及iv)鉴别或选择经转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。