TW201144441A

TW201144441A - Plants having increased tolerance to herbicides

Info

Publication number: TW201144441A
Application number: TW100115491A
Authority: TW
Inventors: Thomas Mietzner; Matthias Witschel; Johannes Hutzler; Thomas Ehrhardt; Stefan Tresch
Original assignee: Basf Se
Priority date: 2010-05-04
Filing date: 2011-05-03
Publication date: 2011-12-16
Also published as: JP2013529074A; AU2011254317A1; MX2012012775A; AR081343A1; CN102971428A; CA2798067A1; UY33368A; EP2566968A4; WO2011145015A1; ZA201209112B; DE112011101566T5; US20130053243A1; EA201291165A1; BR112012028132A2; EP2566968A1

Description

201144441 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明大體上係關於賦予植物對除草劑之農業程度耐受性之方法。特定言之，本發明涉及對「香豆酮（coumarone) 衍生性」除草劑具有增進对受性之植物。更詳言之，本發明係關於藉由突變誘發及雜交育種及轉型達成之方法及所獲得之對「香豆酮衍生性」除草劑具有增進耐受性之植物。【先前技術】自1990s早期以來，抑制作為異戊二烯基醌質體醌及生育酚之生物合成中之關鍵酶的4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶（4-1^?0;£(：1.13.11.27)之除草劑已用於進行選擇性雜草防治。其阻斷生物合成路徑中4-羥苯基丙酮酸轉化成尿黑酸（homogentisate)(Matringe等人，2005, Pest Manag Sci_，第 61 卷：269-276 ; Mitchell等人，2001，Pest Manag Sci.第 57卷：120-128)。認為質體醌為類胡蘿蔔素生物合成中八氫番％紅素去飽和酶（phytoene desaturase)之必需輔因子 (Boeger及 Sandmann，1998, Pestic Outlook,第 9卷：29-35)。其之抑制會使植物質體醌及維生素E池耗盡，從而導致漂白症狀。類胡蘿15素尤其在其作為對抗光氧化作用之光系統保護劑之功能方面的損失會導致生長中之芽組織中的葉綠素及光合膜氧化降解。因此，葉綠體合成及功能受干擾 (Boeger及Sandmann, 1998)。尿黑酸茄尼基轉移酶 (homogentisate solanesyl transferase，HST)催化質體 ϊ昆生 155885.doc 201144441 物合成路徑中在HPPD之後的步驟。HST為異戊二烯基轉移酶，其脫去尿黑酸之羧基且亦將來自二磷酸茄尼酯之茄尼基轉移至尿黑酸且因此形成2-甲基-6-茄尼基-1，4-苯醌 (MSBQ)，其為一種沿質體醌之生物合成路徑的中間物。 HST酶為膜結合酶且編碼其之基因包括質體（plastid)靶向序列。最重要化學種類之商品_化4-HPPD抑制性除草劑包括吡〇坐淋酮（pyrazolone)、三 _ (triketone)及異 °惡。坐 (isoxazole)。抑制劑藉由形成穩定離子偶極電荷轉移複合物而模擬受質4-羥苯基丙酮酸與活性位點中之酶結合亞鐵離子的結合。在4-HPPD抑制性除草劑中，三酮磺草酮 (triketone sulcotrione)為此組除草劑中首個用於農業中之實例且鑑別了其作用機制（Schulz等人，1993，FEBS Lett. 第318卷：162-166)。三酮已報導為作為來自瓶刷子植物 (bottlebrush plant)紅千層種spp)之除草組分之纖精酮（leptospermone)的衍生物（Lee 等人 1997，Weed Sci. 第 45卷，162-166)。一些此等分子已用作除草劑，因為抑制植物中之反應會導致經處理植物之葉變白及該等植物死亡（Pallett，K. E.等人1997 Pestic. Sci. 50 83-84)。以HPPD為目標且描述於當前技術狀態中之除草劑特定言之為異噁唑（EP41 8175、 EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美國專利第5,424,276號），特定言之異°惡°坐草酮（isoxaflutole)，其為玉米選擇性除草劑；二酮基腈（EP496630、EP496631)， 155885.doc 201144441 特定言之2-氰基-3-環丙基-l-(2-S02CH3-4-CF3苯基）丙烷_ 1，3-二酮及 2-氰基-3-環丙基-l-(2-S02CH3-4-2,3Cl2苯基）丙烷-1，3-二酮；諸如描述於EP625505、EP625508、美國專利第5,506，195號中之三酮，特定言之磺草酮；或苄草唑 (pyrazolinate)。此外，在敏感植物物種中，如同同上所述之4_HPPD抑制性漂白除草劑一般，熟知除草劑苯唑草酮 (topramezone)會引發相同類型之植物毒性症狀，伴有生長中之芽組織中的葉綠素損失及壞死。苯唑草酮屬於化學種類之吡唑啉酮或苯曱醯基吡唑且於2006年加以商業引進。當出苗後施用時，化合物選擇性防治玉米中之廣譜一年生草及闊葉雜草。植物對「香豆酮衍生性除草劑」之耐受性亦已在許多專利中加以報導。國際申請案第WO2010/029311號一般性描述HPPD核酸及/或HST核酸引發植物中之除草劑耐受性的用途。W02009/090401、W02009/090402、W02008/071918、 W02008/009908特定揭示某些「香豆酮衍生性除草劑」及「香豆酮衍生性除草劑」耐受性植物株系。 3種主要策略可用於使植物耐受除草劑，亦即（1)用將除草劑或其活性代謝物轉化成無毒產物之酶，諸如賦予對溴苯腈（bromoxynil)或對草銨膦（basta)(EP242236、EP337899) 之耐受性之酶去除除草劑毒性；（2)將目標酶突變成對除草劑或其活性代謝物之敏感性較小的功能性酶，諸如賦予對草甘膦（glyphosate)之时受性之酶（EP293356、Padgette S. R.等人，J.Biol. Chem·，266，33，1991);或（3)過度表現敏 155885.doc 201144441 感性酶以便在植物中產生相對於除草劑為足夠的目標酶量，鑒於此酶之動力學常數，以致具有足夠功能性酶可用’而不管其抑制劑之存在。關於成功獲得之對Hppd抑制劑具有耐受性之植物描述了第三策略（W096/38567)。 US2009/0172831揭示編碼胺基酸序列之核苷酸序列，該等胺基酸序列具有酶活性以致胺基酸序列對HppD抑制劑除草化學品，特定言之對HPPD突變體具有特異性之三酮抑制劑具有抗性。 ΐζί今為止，先前技術尚未描述含有至少一種突變hppd 核酸之香豆酮衍生性除草劑耐受性植物。先.前技術亦尚未描述在除獲得HPPD基因之基因組以外的基因組上含有突變之香豆酮衍生性除草劑耐受性作物。因此，此項技術中需要自其他基因組及物種鑑別香豆酮衍生性除草劑耐受性基因》此項技術中亦需要對除草劑，諸如香豆酮衍生性除草劑具有增進耐受性及含有至少一種突變HppD核酸之作物。亦需要控制此等作物附近雜草生長之方法。當向含有作物之區域施用除草劑時，此等組合物及方法將允許使用上方嗔灌技術（spray 〇ver technique) » 【發明内容】問題係藉由本發明涉及防治植物栽培位置處不合需要之植被之方法解決，該方法包含以下步驟： a) 在該位置處提供肖+ 卜終捉供包3至少一種核酸之植物，該核酸含： ⑴編碼對香豆嗣衍生性除草劑具有抗性或对受性之 155885.doc 201144441 野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶或突變羥苯基丙酮酸雙加氧酶（mut_HPPD)的核苷酸序列及/或 (ii)編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之野生型尿黑酸茄尼基轉移酶或突變尿黑酸茄尼基轉移酶（mut-HST)的核苦酸序列 b)向該位置施用有效量之該除草劑。此外，本發明涉及藉由使用由包含核苷酸序列SEQ id NO. 1 3或5或其變異體之核酸編碼之mut_HppD，及/戋藉由使用由包含核苷酸序列SEq Π) NO: 7或9或其變異體之核酸編碼之mut-HST鑑別香豆酮衍生性除草劑的方法。該方法包含以下步驟： a) 產生包含編碼mut_HPPD之核酸之轉殖基因細胞或植物，其中係表現該mut-HPPD ; b) 向a)之該轉殖基因細胞或植物及向相同種類之對照細胞或植物施用香豆酮衍生性除草劑； c) 測定施用該測試化合物之後該轉殖基因細胞或植物及該對照細胞或植物之生長或生存力，及 d) 相較於该轉殖基因細胞或植物之生長，選擇可以使兮對照細胞或植物之生長降低的測試化合物。另一目標涉及鑑別編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之mut-HPPD之核苷酸序列的方法，該方法包含： a) 產生mut-HPPD編碼核酸之文庫， b) 藉由在細胞或植物中表現每一該等核酸且用香豆鋼衍 155885.doc 201144441 生！·生除草劑處理該細胞或植物來薛檢所得咖_HppD編碼核酸之群體，〇比較Umm-HPPD編碼核酸群體提供之香豆㈣生性除草劑耐受性程度與由對照HPPD編碼核酸提供之香豆酮衍生性除草劑耐受性程度， )選擇相較於由對照Hppd編碼核酸提供之對香豆酮衍生性除草劑之耐受性程度，提供對香豆酮衍生性除草劑之.4著增進耐受性程度的至少一種編碼核酸。在一較佳實施例中，相較於由對照HppD編碼核酸提供之對香豆酮衍生性除草劑之耐受性’步驟d)中選出之出价_ HPPD編碼核酸提供至少2倍之對香豆酮衍生性除草劑之耐受性。抗丨生或耐受性可藉由產生包含步驟a)之文庫之核酸序列的轉殖基因植物且比較該轉殖基因植物與對照植物加以測定。另一目標涉及鑑別含有編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之mut-HPPD或mut-HST之核酸的植物或藻類之方法，該方法包含： a) 於植物細胞或綠藻之培養物中鑑別有效量之香豆酮衍生性除草劑， b) 用突變誘發劑處理該等植物細胞或綠藻， c) 使該突變誘發細胞群體與a)中鑑別出之有效量之香豆酮衍生性除草劑接觸， 155885.doc

S 201144441 d) 選擇在此等測試條件下存活之至少一個細胞， e) 對來自d)中選出之細胞之HPPD及/或HST基因進行PCR 擴增及定序且將此等序列分別與野生型HPPD或HST基因序列比較。在一較佳實施例中’突變誘發劑為甲烷磺酸乙酯。另一目標涉及編碼mut-HPPD之經分離核酸，其中該核酸可藉由如上定義之方法鑑別。在另一貫施例中’本發明涉及藉由野生型或mut—HPPD 核酸轉型之植物細胞或已經突變而獲得表現，較佳過度表現野生型或mut-HPPD核酸之植物的植物，其中核酸在該植物細胞中之表現導致相較於野生型種類之該植物細胞，對香豆酮衍生性除草劑之抗性或耐受性得以增進。在另一實施例令，本發明涉及包含本發明之植物細胞之轉殖基因植物，其中核酸在植物中之表現導致相較於野生型種類之植物，植物對香豆酮衍生性除草劑之抗性得以增進。本發明之植物可為轉殖基因或非轉殖基因植物。較佳地，核酸在植物中之表現導致相較於野生型種類之植物，植物對香豆酮衍生性除草劑之抗性得以增進。在另一實施例中，本發明涉及由包含本發明之植物細胞之轉殖基因植物產生的種子，其中該種子為對香豆綱衍生性除草劑之抗性高於野生型種類種子之純品系種子…狀 breeding) ° 在另一實施例中，本發明涉及產生相較於野生型種類之 155885.doc 201144441 植物細胞’對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進之轉殖基因植物細胞的方法’其包含用包含野生型或mut-HPPD核酸之表現卡£轉型植物細胞》在另一實施例中’本發明涉及產生轉殖基因植物之方法’其包含：（a)用包含野生型或mut-HPPD核酸之表現卡匣轉型植物細胞，及（b)自該植物細胞產生對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進之植物。較佳地，表現卡匣另外包含在植物中具有功能之轉錄起始調控區及轉譯起始調控區》在另一實施例中，本發明係關於使用本發明之mut_HppD 作為可選擇標記。本發明提供鑑別或選擇經轉型植物細胞 '植物組織、植物或其一部分之方法，其包含a)提供經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分，其中該經轉 Si植物細胞、植物組織、植物或其一部分包含編瑪如下文所述之本發明之mut_HPPD多肽的經分離核酸，其中該多肽用作選擇標記，且其中該經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分可視情況包含另一相關經分離核酸；b)使經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分與至少一種香豆酮衍生性抑制性化合物接觸；c)確定植物細胞、植物組織、植物或其一部分是否受抑制劑或抑制性化合物影響；及d)鑑別或選擇經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分。本發明亦體現在含有本文所述之突變之經純化mm_ hppd蛋白質方面，该專蛋白質適用於分子模型化研究中 155885.doc -10- 201144441 以設計除草劑耐受性之其他改良。蛋白質純化方法為熟知的，且可易於使用市售產品或如例如於Protein Biotechnology, Walsh and Headon (Wiley，1994)中闡述之特別設計的方法達成0 序列表表1 SEQID NO: 描述生物基因座寄存編號 1 HPPD核酸芬菜屬(Arabidopsis) Atlg06570 AF047834 2 HPPD胺基酸芥菜屬 Atlg06570 AAC15697 3 HPPD核酸1 衣藻屬 (Chlamydomonas) 4 HPPD胺基酸1 衣藻屬 5 HPPD核酸2 衣藻屬 XM一001694671.1 6 HPPD胺基酸2 衣蒸屬 Q70ZL8 7 HST核酸芥菜屬 At3gll945 DQ231060 8 HST胺基酸齐菜屬 At3gll945 Q1ACB3 9 HST核酸衣藤屬 AM285678 10 HST胺基酸衣讓屬 A1JHN0 11 HPPD胺基酸 (Physcomitrella) A9RPY0 12 HPPD胺基酸 ^M{〇ryza) 0s02g07160 13 HPPD胺基酸小麥屬(Triticum) Q45FE8 14 HPPD胺基酸玉蜀黍眉(Zea) CAG25475 15 HPPD胺基酸大豆層(Glycine) A5Z1N7 16 HPPD胺基酸葡萄屬(Vitis) A5ADC8 17 HPPD胺基酸螢光假單胞菌 {Pseudomonas fluorescent) 菌 AXW96633 18 HPPD胺基酸螢先假單胞菌 ADR00548 19 HPPD胺基酸 ^^{Avena sativa) AXW96634 【實施方式】在本文中使用冠詞「一」以指代1個或1個以上（亦即至 155885.doc -11 - 201144441 少一個）該冠詞之語法對象。舉例而言，「一要素」意謂一或多個要素。如本文所用，措詞「包含」應理解為意味包括所述要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟之群組，但不排除任何其他要素、整數或步驟、或要素、整數或步驟之群組。本發明涉及防治植物栽培位置處不合需要之植被之方法，該方法包含以下步驟： c) 在忒位置處提供包含至少一種核酸之植物，該核酸包含： (0編碼對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性或耐受後之野生型羥苯基丙酮酸雙加氧酶（HPPD)或突變經苯基丙_酸雙加氧酶（mut-HPPD)的核苷酸序列及/或 (u)編碼對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性或耐受性之野生型尿黑酸茄尼基轉移酶（HST)或突變尿黑酸茄尼基轉移酶（mut_HST)的核苷酸序列 d) 向該位置施用有效量之該除草劑。術防治不合需要之植被」應理解為意謂殺傷雜草及/ 或另外延遲或抑制雜草之正常生長。雜草在最廣泛意義上應理解為意謂在不合需要之位置中生長的所有彼等植物。本發明之雜草包括例如雙子葉及單子葉雜草。雙子葉雜草包括（但不限於）以下各屬之雜草：芬子屬（54邛叫、獨行菜屬（Lepidium)、豬殃殃屬（Gaiium)、繁縷屬（SteUaHa)、 155885.doc

S 12 201144441 母菊屬（Matricaria)、春黃菊屬（Anthemis)、小米菊屬 (Galinsoga)、藜屬（Chenopodium)、蓴麻屬（Urtica)、千里光屬（Senecio)、茺屬（Amaranthus)、馬# 莧屬（Portulaca)、蒼耳屬（Xanthium)、旋花屬（Convolvulus)、番薯屬 (Ipomoea)、寥屬（Polygonum)、田菁屬（Sesbania)、脉草屬 (Ambrosia)、薊屬（Cirsium)、大薊屬（Carduus)、苦苣菜屬 (Sonchus)、蘇屬（Solanum)、葶塵属（Rorippa)、節節草屬 (Rotala)、母草屬（Lindernia)、野芝麻屬（Lamium)、婆婆納屬（Veronica)、白麻屬（Abutilon)、刺酸模屬（Emex)、曼陀羅屬（Datura)、堇菜屬（Viola)、触瓣花屬（Galeopsis)、罌粟屬（Papaver)、矢車菊屬（Centaurea)、三葉草屬 (Trifolium)、毛莨屬（Ranunculus)及蒲公英屬 (Taraxacum)。單子葉雜草包括（但不限於）以下各屬之雜草：稗屬（Echinochloa)、狗尾草屬（Setaria)、黍屬 (Panicum)、馬唐屬（Digitaria)、梯牧草屬（Phleum)、早熟禾屬（Poa)、羊茅屬（Festuca)、移屬（Eleusine)、臂形草屬 (Brachiaria)、黑麥草屬（Lolium)、雀麥屬（Bromus)、燕麥屬（Avena)、莎草屬（Cyperus)、高樑屬（Sorghum)、冰草屬 (Agropyron)、狗牙根屬（Cynodon)、鴨舌草屬 (Monochoria)、飄拂草屬（Fimbristyslis)、慈姑屬 (Sagittaria)、荸薺屬（Eleocharis)、蘼草屬（Scirpus)、雀稗屬（Paspalum)、鴨嘴草屬（Ischaemum)、尖瓣花屬 (Sphenoclea)、龍爪茅屬（Dactyloctenium)、翦股穎屬 (Agrostis)、看麥娘屬（Alopecurus)及燕麥屬（Apera)。此 155885.doc -13- 201144441 卜本發明之雜草可包括例如生長於不需要之位置中的作舉例而s ’若玉米植物在大豆植物田地中不合需要，則主要自合士 - > 否大丑植物之田地中之自生玉米植物可視為雜草。術》。植物」係以其最廣泛意義加以使用，因為其係關於有機物質且意欲涵蓋作為植物界之成員之真核生物，植物實例包括(但不限於)維管束植物、蔬菜、榖物、花、樹木、草本植物、灌木、草、藤本植物、蕨類植物、苔韓、真菌及藻類等，以及用於無性繁殖之植物的純系、側枝及部分（例如插條、單根莖（piping)、芽、根莖（rhiz〇me)、地下莖、凝集塊（clump)、冠、球莖、球根、塊莖、根莖、組織培養中產生之植物/組織等）。術語「植物」進一步涵蓋整個植物、植物之祖先及子代、及植物部分，包括種子、芽、莖、葉、根（包括塊莖）、花、小花、果實、肉莖 (pedicle)花梗、雄凝、花藥、小梗（stigma)、花柱 (style)、子$、花瓣、萼片、心皮（carpel)、根尖、根帽 Wot Cap)、根毛、葉毛、種毛、花粉粒、小孢子、子葉、下胚軸、上胚軸、木質部、韌皮部、薄壁組織、内胚乳 (endosperm)、伴細胞、保衛細胞、及植物之任何其他已知器官 '組織及細胞、及組織及器官，其中每一以上所提及者皆包含相關基因/核酸。術語「植物」亦涵蓋植物細胞、懸浮培養物、愈傷組織、胚、分生組織區、配子體 (gametophyte)、孢子體（spor〇phyte)、花粉及小孢子，同樣，每一以上所提及者皆包含相關基因/核酸。 155885.doc 201144441 尤其適用於本發明方法中之植物包括屬於綠色植物 (Viridiplantae)總科之所有植物’特定言之單子葉及雙子葉植物，尤其包括選自包含以下之清單的飼料或草料豆科植物、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木：藏藏肩 spip.)、獼猴桃屬（Actinidia spp.)、黃蜀葵屬（Abe〖m〇schus spp.) ' Μ ^ Μ M (Agave sisalana) ^ ^ ^ {Agropyron 色VV)、匍匐剪股潁{Agrostis stolonifera)、蔥屬[Allium spp.) ' Μ M {Amaranthus spp.) ' S ^ ^ {Ammophila arenaria) ' ML M {Ananas comosus) ^ 番荔枝屬{Annona ^ΡΡ·) ' ^(^Apiutn graveolens) ' ^ ib ^ i^Arachis spp) ' 波羅蜜屬{Artocarpus sw.)、蘆筍{Asparagus officinalis)、濟# xf (Avena (例如，丧# πίίνα)、厚濟麥 (Avena fatua) ' /j: ^ φ- (Avena byzantina) > M ^ ^ 陽桃{Averrhoa carambola)、箣竹屬{Bambusa sp·、、冬瓜 (Benincasa hispida)、巴西栗子（Bertholletia excelsecT)、甜襄vw/garb)、菩spp_)(例如#產全涵裘 «apMW、蔗f益屬[芥花（canola)、油籽油菜 (oilseed rape)、蕪菁油菜（turnip rape)])、淤#启其白态袭 {Cadaba farinosa)、中國茶{Camellia sinensis)、美人煮 [Canna indiccT) ' 大麻{Cannabis sativa、、辣椒屬{Capsicum spp.) ^ Μ i W ^{Carex elata) ' -0^^\(Carica papaya) ' 大花假虎刺{Carissa macrocarpa)、山核桃屬{Carya SPP.)、紅花軒草{Carthamus tinctorius、、栗屬{Castanea 155885.doc 15 201144441 spp.) ' 吉貝木棉{Ceiba pentandra~)、菊苣（Cichorium endivia)、掉屬{Cinnamomum spp·、、西瓜[Citrullus lanatus)、柑橘屬{Citrus sw)、椰子屬{Cocos sw·、、咖啡屬（Coffea spp.)、年（Colocasia esculenta、、可樂果屬{Cola spp.)、黃麻屬、Corchorus sp.)、^ ^ (Coriandrum sativum)、捧屬（Corylus spip.)、山揸屬（Crataegus spp.、、番紅花（Crocus sativus)、南展屬（Cucurbita spip)、甜瓜屬 (Cucumis spp.) ' Μ Μ M {Cynara spp.) ' ^ M ^ (Daucus carota)、山馬蝗屬{Desmodium spp .)、龍眼{Dimocarpus longan) ' ^ ^M {Dioscorea spp.) ' ^{Diospyros spp.) > 稗屬（Echinochloa spp.)、油掠屬（Elaeis)(例如油椰子 {Elaeis guineensis、、美洲油棕{Elaeis oleiferaf)、糝子 {Eleusine coracana)、衣索匹亞晝眉草{Eragrostis tef)、芒屬{Erianthus sp.)、枇杷（JEriobotrya japonicd)、梭]^ (Eucalyptus sp.)、扁櫻桃{Eugenia uniflora)、蕎麥屬 (Fagopyrum sw)、山毛櫸屬（Fagus sipip.)、高狐草[Festuca arundinacea、、無花果{Ficus carica)、金橘屬{Fortunella spp.) ' ^ ^(Fragaria spp.) ' {Ginkgo biloba) -屬（G/j^cz’ne spp.)(例如乂 _g wax)、# hispida、备* 大且 maxy)、陸地棉（Gossypium hirsutum)、向日葵屬（Jfelianthus sw.)(例如向曰奏 (Helianthus annuus))、黃花菜（Hemerocallis fulva)、木槿 spp.)、乂參屬Spp·)(例如乂麥 {Hofdeum vulgare))、甘薯（jp〇m〇ea batatas)、胡桃屬 155885.doc • 16 · 201144441 (Juglans spip·)、葛苣QLactuca sativa)、山黧豆肩（Lathyrus SPV·、、兵旦(J^ens culinaris)、亞麻{Linum usitatissimum')、篇技（Litchi chinensis)、蓮屬（Lotus spp)、棱角絲瓜（Luffa acutangula)、羽屬豆屬 QLupinus spp.)、燈芯草（Luzula 、著篇屬spp.)(例如西念舞 {Lycopersicon esculentum) ' ^ {Lycopersicon lycopersicum) ' 0 形蕃兹{Lycopersicon pyriformeY) ' 硬皮豆屬{Macrotyloma spp·) ^ ^ ^ M {Malus spp.) ' OJ ^ ^ Λ 4, {Malpighia emarginata) 、 ?茜美果[Mammea americana)、芒果 (Ma«gi/era ί«ί/ζ·ί：α)、j 辜屬（Μα«ζΤζοί spp.)、乂心果 (Manilkara zapota、、紫苜蓿（Medicago sativa)、草木樨屬 {Melilotus spp.)' M/4 M {Mentha spp.)' S ^ (Miscanthus sinensis)、苦展屬（Momordica spp.)、黑桑（Morus nigra)、 ^ Μ M {Musa spp.) ' ^ ^ {Nicotiana spp.) ' 0- M /0

(Olea spp.) ' ^ X ^ ^ {Opuntia spp.) ' .% 3. M spp.)、禮 xf(Or_yza spp.)(例如裁择藉 sativa) > 闊葉稻{Oryza latifolia))、黍{Panicum miliaceum)、柳枝稷（JPanicum virgatum)、雞蛋果 [Passiflora edulis、、美國防風草{Pastinaca sativa)、狼尾草屬{Pennisetum sp)、鱷梨屬[Persea spp)、荷蘭芽 {Petroselinum crispum)、利甘草{Phalaris arundinacea)、菜豆屬（Phaseolus spp·)、牛草（Phleum pratense)、海桌屬 [Phoenix spp.)、蘆葦[Phragmites australis)、酸漿屬 (Physalis spp.)、松眉（Pinus spp·)、阿月渾子（Pistacia •17- 155885.doc 201144441 vera) ^ spp.) ' spp.) ' (Populus sipp.)、牧豆樹屬（Prosopis sipip.)、李屬（Prunus spp.)、番石瘤屬（Psidium spp·)、石權（Punica granatum)、西洋梨（J>yrus communis)、櫟屬（Quercus sw·、、蘿葡 {Raphanus sativus)、波葉大黃(Rheum rhabarbarum)、錯栗屬（Ribes spp.)、M 麻 lRicinus communis、、懸鉤子屬、Rubus .)、篇屬〈Saccharum spp·)、柳屬{Salix sp)、接骨木屬 (Sambucus spp.)、，累麥（Secale cereale)、M麻屬（Sesamum spp·)、齐屬«s尸·）、在邊（心/㈣“所spp·)(例如肩於# (Solarium tuberosum")、冬海紅（Solanum integrifolium)氙蕃兹{Solarium lycopersicumY)、高粱{Sorghum bicolor)、菠菜屬{Spinacia spp.)、蒲桃屬[Syzygium spp.)、萬壽菊屬 (Tagetes spp.) ' S^t {Tamarindus indica) ' 可可樹 (Jlieobroma cacao)、三葉草屬[Trifolium sw.)、鴨茅狀摩擦禾{Tripsacum dactyloides)、黑小麥{Triticosecale rimpaui)、小麥屬（Triticum spp.)(例如小麥（Triticum aestivuni)、杜倫小麥{Jriticum durum)、藍麥（Triticum turgidum)、 # {Triticum hybernum) ' # V' ^ 、Triticum macha、、小麥、Triticum sativum、、一粒小麥 (Triticum monococcum)說麵包小麥{Triticum vulgareY)、小金蓮花{Tropaeolum minus)、旱金蓮（Tropaeolum majus、、 ^ Μ M {Vaccinium spp.) " Μ Λ M (Vicia spp.) ' _e ^ (Vigna spp.)、香堇菜（Vi〇’a odorata)、蔔萄肩（Vitis spp·)、玉米{JZea mays') ' 浴生疏（JZizania palustris~)、棗屬 •18· 155885.doc s 201144441 (Ζίζζ>；ΐΜ·ϊ spp .)、莧菜（amaranth)、洋薊（artichoke)、蘆筍 (asparagus)、椰菜（broccoli)、抱子甘藍（Brussels sprouts)、甘藍菜（cabbage)、芥花（canola)、胡蘿蔔 (carrot)、花椰菜（cauliflower)、芹菜（celery)、羽衣甘藍 (collard greens)、亞麻（flax)、芥藍（kale)、扁豆（lentil)、油籽油菜（oilseed rape)、秋葵（okra)、洋蔥（onion)、馬鈴著（potato)、稻（rice)、大丑（soybean)、草葛·（strawberry)、甜菜（sugar beet)、甘庶（sugar cane)、向日蕃（sunflower)、蕃莊（tomato)、西葫蘆（SqUash)、茶樹及藻類。根據本發明之一較佳實施例’植物為作物。作物之實例尤其包括大豆、向曰葵、芥花、紫花苜蓿（alfalfa)、菜籽、棉花、蕃莊、馬鈴薯或菸草。進一步較佳地，植物為單子葉植物，諸如甘蔗。進一步較佳地’植物為榖物，諸如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥 '高樑或燕麥。在一較佳實施例中，植物已預先藉由包含藉由引入及過度表現野生型或mut-HPPD及/或野生型或mut_HST轉殖基因來重組製備植物之方法產生，如下文更詳細所述。在另一較佳實施例中，植物已預先藉由包含就地突變誘發植物細胞以獲得表現mut_HppD及/或mut HST之植物細胞的方法產生。如本文所揭示，本發明核酸可用於增強在基因組中包含編碼除草劑耐受性野生型或mut_HppD及/或野生型或mutHST 蛋白質之基因之植物對除草劑的耐受性。該種基因可為内源基因或轉録因，如下文所m卜，在某些實施 155885.doc 201144441 例中’本發明核酸可用相關聚核苷酸序列之任何組合堆疊以產生具有所要表型之植物。舉例而言，本發明核酸可用編碼具有殺蟲及/或殺昆蟲活性之多肽，諸如蘇力菌 (Bacillus thuringiensis)毒素蛋白（描述於美國專利第 5,366,892 號；第 5,747,450 號；第 5,737,514 號；第 5,723,756號；第 5,593,881 號；及 Geiser 等人（1986) Gene 48: 109中）之任何其他聚核苷酸堆疊。產生之組合亦可包括相關聚核苷酸之任一者的多個複本。在一尤其較佳實施例中，植物包含至少另一異源核酸，其包含（iii)編碼選自例如由以下組成之群之除草劑对受性酶的核苷酸序列：5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶 (EPSPS) '草甘膦（Glyphosate)乙醯基轉移酶（GAT)、細胞色素P450、草胺膦（phosphinothricin)乙酿基轉移酶（pat)、乙酿經基酸合成酶（AHAS ; EC 4.1.3.18，亦稱為乙醯乳酸〇成柄或ALS)、原〇卜琳原氧化酶（protoporphyrinogen oxidase，PPG0)、八氫蕃茄紅素去飽和酶（pD)及麥草畏 (dicamba)降解酶，如W0 02/068607中所揭示。一般而言，在本文中使用術語「除草劑」以意謂殺傷植物、控制或另外反向調節植物生長之活性成分。除草劑之較佳量或濃度為「有效量」或「有效濃度」。「有效量」及「有效濃度」分別意謂足以殺傷類似野生型植物、植物組織、植物細胞或宿主細胞或抑制其生長之量及濃度，但該量不會以同樣嚴重程度殺傷本發明之除草劑抗性植物、植物組織、植物細胞及宿主細胞或抑制其生長。通常，除草 155885.doc -20- 201144441 劑之有效量為常規用於農業生產系統中來殺傷相關雜草之量。該量為-般技術者所知。當在任何生長階段或在種植或出苗前直接向植物或植物所在地施用本發明之香豆嗣衍生性除草劑時，其展現除草活性。觀測到之作用視以下因素而疋.欲防治之植物物種、植物生長階段、稀釋及喷麗液滴尺寸之施用參數、固體組分之粒子尺寸、使用時之環境條件、所用特定化合物、所用特定佐劑及載劑、土壤類型及其類似因素、以及所施用之化學品的量。此等及其他因數可如此項技術中已知加以調整以促進非選擇性或選擇性除草作用。一般而言，較佳在出苗後向相對不成孰之非所要植被施用香豆酮衍生性除草劑以最大防治雜草。就除草劑耐受性」或「除草劑抗性」植物而言，意謂植物在通常將殺傷正常或野生型植物或抑制其生長之程度上對至》一種除草劑具有耐受性或抗性。就「除草劑耐受 tmUrrD蛋白」或「除草劑抗性咖撕D蛋白」而〜明田存在至少一種已知干擾HPPD活性之除草劑且 ~除草劑之辰度或含量已知會抑制野生型刪-耐d蛋白 PD到生時’相對於野生型mut-HPPD蛋白之HPPD活二為種mut-HPPD蛋白顯示較高HppD活性。此外該種 :劑耐又性或除草劑抗性mut-HPPD蛋白之HPPD活性在本文中可稱為「除笪

本以 ’、卓劑耐受性」或「除草劑抗性」HPPD 活性。本發明之「香豆_ & ^ 鲷何生性除草劑」涵蓋如下表2中描述之化合物。 155885.doc •21- 201144441 表2 可能之取代基如以下中定義：編號通式結構申請號及參考公開號頁碼 1 ^ayVr2 , g'm人丫入X PCT/EP2009/063387 (PF61381-1) W02010/049270 1至2 2 rArVR2 , g、mW 1 3 R3 PCT/EP2009/063386 (PF61381-2) W02010/049269 1至2 3 R1 Rb2/kN人 γ 人χ EP09162085.6 (PF62203) WO2010/139657 WO2010/139658 1至2 4 rArVR2 , g、m^xVx R3 R EP09174833.5 EP10189606.6 (PF62704) 1至2 5 rArVR2 , g'm人丫人s EP09174585.1 (PF62698) 1至2 6 EP09175673.4 PCT/EP2010/067059 (PF62736) 1至2 •22- 155885.doc s 201144441 rAyVR2 , G、M人N入X 7 g'mW R)—、 EP09175959.7 PCT/EP2010/067176 (PF62752) 1至2 8 R4 r Atr3 r6 ΑΑΥΛΧ r1 R5 EP10157312.9 US61/316400 PCT/EP2011/054258 (PF70482) 1至2 9 R4 r Λτρ3 〜Νγ^^γΑ R5人人Y人X R1 EP10157290.7 US61/316394 PCT/EP2011/054281 (PF70483) 1至3 10 R4 R Λ-Κ3 R7丫 r6^Y^n人x r1 R5 Rx EP10157296.4 US61/316398 PCT/EP2011/054280 (PF70484) 1至3 11 R4 R ArR3 R5人人 νΛχ R1 Rx EP10157282.4 US61/316396 PCT/EP2011/054403 (PF70485) 1至3 155885.doc •23- 201144441 12 R4 R5入N人NTS〇2 R Rx EP10157352.5 US61/316405 PCT/EP2011/054128 PF70528 1至3 13 r7>VVs〇2 R R6 Rx EP10157419.2 US61/316461 PCT/EP2011/054129 (PF70527) 1至2 14 式 la、lb、Ic、Id、Ie、If、 Iia、lib、lie、lid、lie、Iif PCT/GB2009/002188 WO2010/029311 3 至 11 ； 12 至18 15 式I(a至d) PCT/GB2009/000126 W02009/090401 1至17 16 式I(a至d) PCT/GB2009/000127 W02009/090402 1至17 17 式I(a、b) PCT/GB2007/004662 W02008/071918 1至11 18 式I(a至d) PCT/GB2007/002668 W02008/009908 1至16 以上參考之申請案，特定言之涉及表2化合物及其可能之取代基之揭示案以引用的方式全部併入本文中。本發明之一特定較佳實施例涉及上表2之13號之具有下式的香豆酮衍生性除草劑：

3 R .24· 155885.doc

S 201144441 其中變數具有以下含義： R 為 0-Ra、S(0)„-Ra或 0-S(0)n-RA ; RA為氫、CVC4烷基、Z-C3-C6環烷基、Ci-C4画烧基、C2-C6烯基、z-c3-cyf 烯基、c2_c6块基、z_ (三（：丨-〇4 烧基）矽烷基、Z-C(=〇)_Ra、z_NRi_c(〇) NRiRii、Z-P(=〇)(r)2、NRiRH、3 至 7 員單環或 9 或員雙環飽和 '不飽和或芳族雜環，其含有丨、2 10 或4個選自由〇、N&S組成之群之雜原子且可部分或完全經基團Ra及/或！^5取代，

Ra 為氫、〇H、Cl-c8烧基、c”c4_ 烧基、z_c3_c6 環烷基、c2-c8稀基、z-c5-c6m晞基、c2^块6 基、Z-Ci-Cs烷氧基、Z-Ci-C4_ 烷氧基、Z_C3_ =缚氧基、z_c3_c8炔氧基、峨h、Ci_c6燒基只醯基、Z-(三c丨-C4烷基）矽烷基、z_^ 笨氣基、Z-笨基胺基、或含t、2、3:4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或10員雙環雜環，其中該等環基未經取^ 或趣1、2、3或4個基團Rb取代； R"彼此獨立為氫、（:丨-C8烷基、c r ^丨士4鹵院基、c3-c8稀基、C3-C8块基、ζ Γ 環烷基、Z-CVC8烷氧基、z_c e 卤燒氧基、Z-C(=〇)-Ra、z_苯基、含有i、 2、3或4個選自由ο、N&s組成之群之雜原子且經Z連接的3至7員單環或9或 155885.doc •25· 201144441 1G員雙環飽和、不飽和或芳族雜環； R'及R"連同其所連接之氮原子—起亦可形成含有1、2、3或4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或9或1〇員雙環雜環.

Rb彼此獨立地為Z-CN、Ζ·0Η、ζ·Ν〇2、z函素、側氧基（=〇)、=ΝΤ、C,_C8烧基、Ci C4i 烷基、c2-c8稀基、c2-c8快基、z_Ci_Cw氧基、 Z-CVC8_ 烷氧基、z_c3_CiQ環烷基、〇_z_Cy c10環烷基、Z-C(=〇)_Ra、NRiRii、z (三C 烷基）矽烷基、Z-笨基及S(〇)nRbb ;兩個基團… 可一起形成環，該環具有3至6個環成員且除碳原子外亦可含有來自由〇、N&s組成之群之雜原子且可未經取代或經其他基團Rb取代；

Rbb 為（^-(：8；1^ 基、C2-C6稀基、c2-c6炔基、c C6鹵烯基、CVC6鹵炔基或匸丨-^鹵烷基； Z 為共價鍵或Ci-G伸烷基； n 為〇、1或2 ; R1為氰基、齒素、硝基、Ci_c6烷基、C2_c6烯基、C2 炔基、C丨·<：6齒烷基、Ζ-C丨-C6烷氧基、Ζ-C丨-C4烷氧基_ 1 4燒氧基、Z-C1-C4炫·硫基、Z-C1-C4烧硫基烧硫基、C2-C6烯氧基、（^-(^炔氧基、Cl-c6鹵烷氧基、ci-c4ii 烷氧基·Cl_c^氧基、s(0)nRbb、z_苯氧基、Z-雜環基氧基’其中雜環基為含有1、2、3或4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或9或 155885.doc •26· 201144441 其中環基未 10員雙環飽和、部分不飽和或芳;# 經取代或部分或完全經Rb取代； A 為 N或 C-R2; R2、R3、R4、R5^^^MUhZ-CN、Z_ OH、Z-N02、Cl-C8烧基、Cl-C4南燒基^心稀基、 c2-c8快基、C2-Cd 稀基、c2_c8_ 炔基、Z_C1_C8烷氧基、Z-Cl-C8鹵燒氧基、Z-Cl-C4燒氧基_Ci_C4统氧基、 [(:丨-匕烷硫基、Z-Cl-C4烷硫基_Ci_c4烷硫基、Z_C1· 院硫基、6-匕稀氧基、CVC6块氧基、Ci_c6i烧氧基、CVC4 _烷氧基-CrC4烷氡基、z_c3_c⑺環烷基、〇-Z-C3-C1()環烧基、Z-C( = 〇)_Ra、NRiRii、z_(: CVC4烷基）矽烷基、s(0)nRbb、z_笨基、zl苯基、z雜環基、zi-雜環基’其中雜環基為含有i、2、3或4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或9或1〇員雙環飽和、部分不飽和或芳族雜環，其中環基未經取代或部分或完全經Rb取代； R2連同與相鄰碳原子連接之基團一起亦可形成5至10 員飽和或部分或完全不飽和單環或雙環’該環除碳原子外亦可含有1、2或3個選自由0、N&s組成之群的雜原子且可經其他基團Rb取代； Z1為共價鍵、CrC4伸烷氧基' 氧基伸烷基或 C1-C4伸烷氧基-C丨-c4伸烷基； R為氫、CVC4烧基、CVC4鹵烷基、（^-(：4烷氧基、¢^-04 烷硫基、C^-C：4鹵烷氧基' Cl_C4鹵烷硫基； 155885.doc •27· 201144441 R7、R8彼此獨立地為氫、鹵素或(^-(：4烷基； RX為CVC6烷基、CVC4齒烷基、CVC2烷氧基-C「C2烷基、c2-c6烯基、C2-C6_烯基、C3-C6炔基、C3-C6鹵炔基或Z-苯基，其未經取代或經1至5個基團Rb取代；其中基團1^、及R1、R2、R3、R4及R5及其取代基、碳鏈及/ 或環基可部分或完全經基團Rb取代，或其N-氧化物或農業上適合之鹽。本發明之另一較佳實施例涉及上表2之1號及2號之具有下式的香豆酮衍生性除草劑：

其中邕數係如w〇2〇1〇/〇4927〇及中所揭在另—較佳實施例中’適用於本發明之香豆酮衍生性除草劑具有下式（表2, 8號）： 155885.doc •28· 201144441

其中變數具有以下含義： R 為〇-RA、S(〇)n-RA或 0-S(0)n-RA ; R為虱、C1-C4院基、Z-C3-C6環烧基、齒烧基、C2-C6稀基、Z-C3-C6環烯基、c2_c6块基、z (二 C1-C4烧基）碎烧基、Z-C(=〇)-Ra、z-lSIRi-C^C)) 、3至7員單環或9或

NR/Ri1、Z-P(=0)(Ra)2、NRiR 10員雙環飽和、不飽和或芳族雜環，其含有i、 2、3或4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子且可部分或完全經基團1^及/或Rb取代，、Ci-C4_ 院基、 Z-C5-C6環烯基、02-(：8炔為氫、OH、CrCs烷基、環烷基、C2-C8烯基、z- 基、^-(^-(^烷氧基、Z-CVCU齒烷氧基、Z_C3. c8烯氧基、Z-C3-C8炔氧基、NRiR^、C丨·C6烷美磺醯基、z-ucvc4烧基）石夕烷基、z•苯基、z_ 苯氧基、Z_苯基胺基、或含有丨、2、3或4個選自由〇、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或9或1〇員雙環雜環，其中該等環基未經取代或經1、2、3或4個基團Rb取代；反、RI1彼此獨立地為氫、C丨-C8烷基、c丨·匕鹵烷基、c3-c8烯基、c3-c8块基、z_c _ 155885.doc -29. 201144441 c6環烷基、Z-CVC^氧基、Z-CVCd 烷氧基、Z-C(=〇)-Ra、z-苯基、3至7 員單環或9或10員雙環飽和、不飽和或方族雜環’其含有1、2、3或4個選自由〇' N及S組成之群之雜原子且經由z 連接；及R連同其所連接之氮原子一起亦可形成含有1、2、3或4個選自由〇、N&s組成之群之雜原子的5或6員單環或9或1〇員雙環雜環； Z為共價鍵或Ci-q伸烷基； n為〇、1或2 ; R1 為氰基、齒素、硝基、Cl_c6烷基、c2_c6烯基、c2_c6 块基、〜以烧基、Z_C1_C6^氧基、Z_C1_C4院氧基_ Ci-C4炫氧基、z_Cl_C4；^硫基、z_Ci_c4燒硫基 A' 烷硫基、㈣烯氧基、㈣炔氧基、Ci_C6齒烷氧基、CVC4鹵烷氧基-Cl_c4烷氧基、s(〇)nRbb、z_苯氧基、z-雜環基氧基，其中雜環基為含有丨、2、3或4個選自由0、N及S組成之群之雜原子的5或6員單環或9或 1 〇員雙環飽和、部分不飽和或芳族雜環，其中環美未經取代或部分或完全經Rb取代；

Rbb 為 Ci-Ce烧基、C2-C6烯基、C2-C6炒·其 ^ ^ 6厌基、C2_C6鹵烯基、C2-C6鹵炔基或c!-C6鹵烧基1戈2. A 為 N或 C-R2; R2為Z1-苯基、苯氧基或Z1·雜環基，其中雜環基為含有 155885.doc •30· 201144441 1、2、3或4個選自由〇、N&s組成之群之雜原子的5或 6員單％或9或1〇員雙環飽和、部分不飽和或芳族雜環，其中環基未經取代或部分或完全經…取代； CVQ烧基、C2-C4i烧基、CVC4烧氧基心‘烷基、 c,-c4烧硫基-eve*院基、C2_c8稀基、c2_C8块基' k c8鹵烯基、cvc8齒炔基、C2_C^氧基、z_Ci_C4烷氧基-CVC4烷氧基、Z-CVC4函烷氧基-CVC4烷氧基、c2_ C6鹵烷氧基、（：3-(：6烯氧基、〇3_(：6炔氧基、C2_C6烷硫基、C2-C6 鹵院硫基、Z-C(=0)-Ra、；§⑴h 2Rbb ; Z1為共價鍵、C^C4伸烷氧基、Cl_C4氧基伸烷基或 CVC4伸烷氧基-CVC4伸烷基； R彼此獨立地為Z-CN、Z-OH、Z-N〇2、Z-鹵素、側氧基（=〇)、=N-Ra、Ci_c8 烷基、C1_C4_ 烷基、c2_ c8烯基、c2-c8炔基、z_c丨_C8烷氧基、z c丨_C8鹵烷氧基、Z-C3-C1Q環烷基、〇_z_C3_CiQ環烷基、2_ C(=0)f、NRiRii、z_(三Ci_C4烷基μ夕烷基 ' z 苯基及S(0)nRbb，兩個基團！^可一起形成環，該環具有3至6個環成員且除碳原子外亦可含有來自由〇、 N及S組成之群之雜原子且可未經取代或經其他基團Rb取代； R連同與相鄰峡原子連接之基團一起亦可形成5至員飽和或部分或完全不飽和單環或雙環，該環除碳原子外亦可含有1、2或3個選自由〇、；^及8組成之群的雜原子且可經其他基團Rb取代； 1558S5.doc -31 - 201144441 R3為氫、鹵素、氰基、硝基、C1-C4烧基、CVC4鹵烧基、C 1 - C 4烧氧基、C 1 - C 4齒烧氧基、C 2 - C 4稀基、C 2 _ C 4 炔基、C2-C4烯氧基、C2-C4炔氧基、S(0)nRbb ; R4為氫、鹵素或心-匕鹵烷基； R 為風、C1-C4烧基、Ci-C4齒烧基、C!-C4烧氧基、C1-C4 烧硫基、C 1 - C 4 ώ烧氧基、C 1 - C 4 _烧硫基； R6、R7彼此獨立地為氫、i素或Ci-C4烷基； Y 為Ο或S ; X 為 Ο、S 或 N-Rx ; R 為氫、Ci-Cg烧基、C1-C4鹵烧基、C2-C6稀基、C3-C6炔基、Z-C3-C1()環烷基、C〗-C6烷氧基-C^-Ce烷基、C!-C6氰基烧基、Z-苯基、Z-C(=0)-Ra2或三c】_ c4烷基矽烷基；

Ra2為（VC6院基、c〗-c4鹵坑基、Z-CVC6燒氧基、 Z-CVC4鹵烷氧基或; 其中在基團RA及其取代基中，碳鏈及/或環基可部分或完全經基團Rb取代，或其N-氧化物或農業上適合之鹽。本發明之香豆酮衍生物常連同一或多種其他HppD& /或 HST乾向除草#卜起刻以獲得對較廣泛多種非所要植被之防治。當連同其他HPPD及/或HST靶向除草劑一起使用時’目前主張之化合物可與其他除草劑—起調配、與其他除草劑一起桶混、或與其他除草劑一起依序施用。、一些適用於與本發明之香豆明衍生物聯合之除草劑包括 155885.doc •32- 201144441 苯雙喧隆（benzobicyclon)、甲基續草闕（mesotrione)、確草酮（sulcotrione)、特呋三酮（tefuryltrione)、特波三酮 (tembotrione)、4-羥基·3-[[2-(2-甲氧基乙氧基）甲基]_6-(三氟甲基）-3-»比啶基]羰基]-雙環[3.2.1]-辛-3-烯-2-酮（雙環。比 • 喃酮）、剋必特斯（ketospiradox)或其游離酸、D比草酮 (benzofenap)、>»比靖托爾（pyrasuif〇t〇ie)、比拉 0坐諾 (pyrazolynate)、苄草唾（pyraZ0Xyfen)、苯 t»坐草酮 (topramezone)、[2-氯-3-(2-曱氧基乙氧基）-4_(曱基磺醯基）本基](1-乙基-5 -經基-1Η-°比嗤-4-基）甲酮' (2,3-二氣-3,3,4-二甲基-i，i-二氧離子基苯并[b]噻吩_5_基）(5_羥基卜甲基-1H-吡唑-4-基）-曱酮 '異噁氣妥（is〇xachl〇rt〇le)、異噁唑草酮（isoxaflutole)、α-(環丙基羰基）_2_(甲基磺醯基）· β-側氧基-4·氯-苯丙腈、及α_(環丙基羰基）2_(曱基磺醯基）-β-側氧基-4-(三氟曱基）_苯丙腈。在一較佳實施例中，其他除草劑為苯唑草酮。在一尤其較佳實施例中，其他除草劑為 (1乙基-5-丙-2-炔基氧基·1H•吡唑_4基）_[4曱烷磺醯基_ 2-甲基-3-(3-曱基·4,5-二氫異噁唑·5_基)_苯基]-甲酮

(1乙基-5-髮基·ιΗ-η比。坐_4-基）_[4_甲烷磺醯基_2_甲基小 155885.doc -33- 201144441 (3-甲基-4,5-二氫-異噁唑-5-基）-苯基]-甲酮

上述化合物極詳細描述於EP 09177628.6中，該專利以引用的方式全部併入本文中。本發明之除草化合物可另外連同作物天然耐受或經由表現一或多種如上提及之其他轉殖基因而具有抗性之其他除草劑一起加以使用。一些可連同本發明化合物一起加以採用之除草劑包括續醯胺，諸如續草唾胺（metosulam)、〇坐嘴石夤草胺（flumetsulam)、氯醋續草胺（cloransulam-methyl)、雙氣績草胺（diclosulam)、五氟續草胺（penoxsulam)及雙氟續草胺（florasulam); 續酿脲，諸如氣啦績隆 (chlorimuron)、笨績隆（tribenuron)、甲嘴續隆 (sulfometuron)、终嘴續隆（nicosulfuron)、氣績隆 (chlorsulfuron)、醯》密續隆（amidosulfuron)、醚苯項隆 (triasulfuron)、It 續隆（prosulfuron)、三氟甲確隆 (tritosulfuron)、°塞吩續隆（thifensulfuron)、確0^ 績隆 (sulfosulfuron)及甲續隆（metsulfuron) ; 口米0坐琳酮 (imidazolinones)，諸如滅草啥（imazaquin)、曱基0米草於 (imazapic)、口米草於（ima-zethapyr)、滅草於（imzapyr)、口米草S旨（imazamethabenz)及甲氧0米草於（imazamox);苯氧基炫酸，諸如 2,4-D、MCPA、滴丙酸（dichlorprop)及 2-曱-4-

155885.doc -34- S 201144441 氣丙酸（mecoprop) ; °比咬基氧基乙酸，諸如綠草定 (triclopyr)及氟草於（fluroxypyr);竣酸，諸如克草立特 (clopyralid)、胺氣°比咬酸（picloram)、氣胺基°比咬酸 (aminopyralid)及麥草畏（dicamba);二硕基苯胺，諸如氟樂靈（trifluralin)、氟草胺（benefln)、倍尼芬（benfluralin)及二曱戊樂靈（pendimethalin);乙醯氯苯胺，諸如甲草胺 (alachlor)、乙草胺（acetochlor)及異丙曱草胺（metolachlor); 半卡巴膝（semicarbazones)(植物生長素（auxin)轉運抑制劑），諸如整形醇（chlorflurenol)及氣°比草腺 (diflufenzopyr);芳氧基苯氧丙酸醋，諸如°比氟禾草靈 (fluazifop)、說°比禾靈（haloxyfop)、二氯苯氧基丙酸 (diclofop)、炔草酸（clodinafop)及 °惡 °坐靈（fenoxaprop);及其他常見除草劑，包括草甘膦（glyphosate)、固殺草 (glufosinate)、三 I 绫草醚（acifluorfen)、°塞草平 (bentazon)、可滅縱（clomazone)、氟烯草酸（fumiclorac)、可奪草（fluometuron)、氟續胺草醚（fomesafen)、乳氟禾草靈（lactofen)、利穀隆（linuron)、異丙隆（isoproturon)、西瑪津（simazine)、氟草敏（norflurazon)、百草枯（paraquat)、敵草隆（diuron)、°比敗草胺（diflufenican)、氟°比草胺 (picolinafen)、β引 °朵酮草醋（cinidon)、西殺草（sethoxydim)、三甲苯草酮（tralkoxydim) '啥草酸（quinmerac)、異。惡草胺 (isoxaben)、漠苯腈（bromoxynil)、賽克津（metribuzin)及曱基續草酮（mesotrione)。本發明之香豆酮衍生性除草劑可另外連同草甘膦及固殺 155885.doc -35- 201144441 草一起對草甘膦耐受性或固殺草耐受性作物使用。除非已包括在以上揭示内容中，否則本發明之香豆酮衍生性除草劑可另外連同以下一起使用： (a)來自以下脂質生物合成抑制劑之群的化合物：亞汰草（Alloxydim)、亞汰草納（Alloxydim-natrium)、丁苯草酮（Butroxydim)、克草同（Clethodim)、快草酸 (Clodinafop)、炔草 S旨（Clodinafop-propargyl)、環殺草 (Cycloxydim)、赛伏草（Cyhalofop)、丁基赛伏草 (Cyhalofop-butyl)、二氯苯氧基丙駿、禾草靈（Diclofop-methyl)、°惡。坐靈（Fenoxaprop)、°惡峻禾草靈（Fenoxaprop-ethyl)、精°惡°坐禾草靈（Fenoxaprop-P)、芬殺草 (Fenoxaprop-P-ethyl)、D比敦禾草靈（Fluazifop)、I 甲0比咬氧紛丙酸丁酯（Fluazifop-butyl)、精°比敗禾草靈（Fluazifop-P)、伏寄普（Fluazifop-P-butyl)、氟 °比禾靈（Haloxyfop)、氣 0比甲禾靈（haloxyfop-methyl)、精氟比禾靈（Haloxyfop-P)、高效氣。比曱禾靈（haloxyfop-P-methyl)、°惡。坐醯草胺 (Metamifop)、°坐淋草 S旨（Pinoxaden)、環苯草酮（Profoxydim)、普拔草（Propaquizafop)、啥禾靈（Quizalofop)、快伏草 (Quizalofop-ethyl)、喧禾糠醋（Quizalofop-tefuryl)、精啥禾靈（Quizalofop-P)、精喧禾靈（Quizalofop-P-ethyl)、精禾靈（Quizalofop-P-tefuryl)、西殺草（Sethoxydim)、得殺草 (Tepraloxydim)、三曱苯草酮（Tralkoxydim)、0夫草黃 (Benfuresat)、丁草特（Butylat)、滅草特（Cycloat)、茅草枯 (Dalapon)、>»底草丹（Dimepiperat)、EPTC、戊草丹（Esprocarb)、 155885.doc -36- s 201144441 乙0夫草黃（Ethofumesat)、氟丙酸（Flupropanat)、禾草敵 (Molinat)、坪草丹（Orbencarb)、克草敵（Pebulat)、苄草丹 (Prosulfocarb)、TCA、殺丹（Thiobencarb)、仲草丹 (Tiocarbazil)、野麥畏（Triallat)及滅草猛（Vernolat); (b)來自ALS抑制劑之群的化合物：酿嘴橫隆（Amidosulfuron)、四"坐密績隆 (Azimsulfuron)、苄"密續隆（Bensulfuron)、甲基苄嘴續隆 (Bensulfuron-methyl)、雙草醚（Bispyribac)、雙草醚納 (Bispyribac-natrium)、氣嘲續隆（Chlorimuron)、乙基氣啦績隆（Chlorimuron-ethyl)、氣續隆（Chlorsulfuron)、驗續隆 (Cinosulfuron)、氣酯績草胺（Cloransulam)、氣酯績草胺 (Cloransulam-methyl)、環丙痛績隆（Cyclosulfamuron)、雙氣續草胺（Diclosulam)、胺苯續隆（Ethametsulfuron)、甲基胺苯續隆（Ethametsulfuron-methyl)、乙氧，續隆 (Ethoxysulfuron)、嘲咬續隆（Flazasulfuron)、雙氟續草胺 (Florasulam)、氣酮續隆（Flucarbazon)、I 酮績隆納 (Flucarbazon-natrium)、敗 °比續隆（Flucetosulfuron)、。坐喊績草胺（Flumetsulam)、乾咬，績龍（Flupyrsulfuron)、甲基氟口定0密確龍鈉（Flupyrsulfuron-methyl-natrium)、曱醯喷續隆（Foramsulfuron)、氯0比醚續隆（Halosulfuron)、曱基氣0比醚項隆（Halosulfuron-methyl)、w米草醋（Imazamethabenz)、甲基米草醋（Imazamethabenz-methyl)、曱氧味草於 (Imazamox)、甲基 0米草於（Imazapic)、滅草於（Imazapyr)、滅草喧（Imazaquin)、°米草於（Imazethapyr)、β坐D比响續隆 155885.doc -37- 201144441 (Imazosulfuron)、蜗甲續隆（Iodosulfuron)、甲基破甲續隆鈉（Iodosulfuron-methyl-natrium)、甲續胺續隆（Mesosulfuron)、績草β坐胺（Metosulam)、甲績隆（Metsulfuron)、曱基曱續隆 (Metsulfuron-methyl)、於啦績隆（Nicosulfuron)、鄰丙0^項隆（Orthosulfamuron)、環氧0^ 續隆（Oxasulfuron)、五氟續草胺（Penoxsulam)、敗°密續隆（Primisulfuron)、曱基敗痛續隆（Primisulfuron-methyl)、丙苯確隆（Propoxycarbazon)、丙苯績隆鈉（Propoxycarbazon-natrium)、氟續隆 (Prosulfuron)、0比0密續隆（Pyrazosulfuron)、乙基0比0密續隆 (Pyrazosulfuron-ethyl)、嘴咬將草醚（Pyribenzoxim)、π密咬硫蕃（Pyrimisulfan)、環 S旨草謎（Pyriftalid)、喷草醚 (Pyriminobac)、曱基0密草酬l(Pyriminobac-methyl)、口密硫草醚（Pyrithiobac)、°密硫草鱗納（Pyrithiobac-natrium)、比。惡草胺（Pyroxsulam)、颯0密確隆（Rimsulfuron)、曱嘴續隆 (Sulfometuron)、曱基曱喷續隆（Sulfometuron-methyl)、確 0密項隆（Sulfosulfuron)、0塞稀卡巴腙（Thiencarbazon)、甲基 0塞稀卡巴月宗（Thiencarbazon-methyl)、嗟吩續隆 (Thifensulfuron)、甲基 °塞吩績隆（Thifensulfuron-methyl)、苯確隆（Triasulfuron)、苯續隆（Tribenuron)、甲基苯績隆 (Tribenuron-methyl)、三敗。定續隆（Trifloxysulfuron)、敦胺續隆（Triflusulfuron)、曱基氟胺橫隆（Triflusulfuron-methyl)及三氟甲項隆（Tritosulfuron); (c)來自光合抑制劑之群的化合物：莠滅淨（Ametryn)、胺°坐草酮（Amicarbazon)、阿托拉辛 155885.doc -38-

S 201144441 (Atrazin)、售草平（Bentazon)、0塞草平鈉（Bentazon-natrium)、除草定（Bromacil)、·;臭盼將（Bromofenoxim)、漠苯腈及其鹽及自旨、氣漠隆（Chlorobromuron)、氣草敏（Chloridazon)、綠麥隆（Chlorotoluron)、氣草隆（Chloroxuron)、氰草津 (Cyanazin)、甜菜安（Desmedipham)、敵草淨（Desmetryn)、 °惡°坐隆（Dimefuron)、敵滅莫淨（Dimethametryn)、敵草快 (Diquat)、二溴敵草快（Diquat-dibromid)、敵草隆 (Diuron)、可奪草（Fluometuron)、環唤酮（Hexazinon)、蛾苯腈（Ioxynil)及其鹽及酯、異丙隆（Isoproturon)、異°惡隆 (Isouron)、卡靈草（Karbutilat)、環草定（Lenacil)、利穀隆 (Linuron)、苯嗓草鋼（Metamitron)、曱基苯嘆隆 (Methabenzthiazuron)、0比喃隆（Metobenzuron)、曱氧隆 (Metoxuron)、赛克津（Metribuzin)、綠穀隆（Monolinuron)、草不隆（Neburon)、百草枯（Paraquat)、二氣百草枯 (Paraquat-dichlorid)、二甲硫酸百草枯（Paraquat-dimetilsulfat)、蔬草滅（Pentanochlor)、甜菜寧 (Phenmedipham)、乙基甜菜寧（Phenmedipham-ethyl)、撲滅通（Prometon)、撲草淨（Prometryn)、敵稗（Propanil)、撲滅津（Propazin)、°比咬達醇（Pyridafol)、嗔草特（Pyridat)、環草隆（Siduron)、西瑪三嗪（Simazin)、西草淨（Simetryn)、丁 °塞隆（Tebuthiuron)、特草定（Terbacil)、曱氧去草淨 (Terbumeton)、草淨津（Terbuthylazin)、去草淨（Terbutryn)、嗟苯隆（Thidiazuron)及草達津（Trietazin); d)來自原卟啉原IX氧化酶抑制劑之群的化合物： 155885.doc -39- 201144441 三氟羧草驗（Acifluorfen)、三氣叛草醚納（Acifluorfen-natrium)、°坐咬草酮（Azafenidin)、醯苯草酮（Bencarbazon)、雙苯》密草酮（Benzfendizon)、必芬諾（Bifenox)、丙唆草酯（Butafenacil)、快滅靈（Carfentrazon)、乙基快滅靈 (Carfentrazon-ethyl)、曱氧除草謎（Chlomethoxyfen)、0弓| 0朵嗣草S旨（Cinidon-ethyl)、異丙°比草S旨（Fluazolat)、健嗪草酯（Flufenpyr)、乙基氟噠°秦草酯（Flufenpyr-ethyl)、氟胺草酯（Flumiclorac)、戊基氟胺草酯（Flumiclorac-pentyl)、丙炔氟ί 草胺（Flumioxazin)、乙缓氣草謎（Fluoroglycofen)、乙叛說草醚（Fluoroglycofen-ethyl)、氟 °塞草醋（Fluthiacet)、氟 °塞曱草醋（Fluthiacet-methyl)、續胺草醚（Fomesafen)、鹵索芬（Halosafen)、乳敦禾草靈（Lactofen)、丙块°惡草酮 (Oxadiargyl)、°惡草 _ (Oxadiazon)、乙氧氟草醚（Oxyfluorfen)、 °惡嗪酮（Pentoxazon)、氣*坐草胺（Profluazol)、雙吐草腈 (Pyraclonil)、0比草鍵（Pyraflufen)、乙基0比草 S|(Pyraflufen-ethyl)、嘴°定肪草醚（Saflufenacil)、續酿°坐草酮 (Sulfentrazon)、。塞達茲明（Thidiazimin)、2-氯-5-[3,6-二氫-3-甲基-2,6-二側氧基-4-(二氣甲基）-1(2//')-嘴咬基]-4-氣-1'1-[(異丙基）甲基胺磺醯基]苯甲醯胺（H-l ; CAS 372137-35-4)、[3-[2 -氯-4-氣-5-(1-甲基-6-三氣甲基-2,4-二側氧基-1，2,3,4，-四氫嘧啶-3-基）苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯（11-2 ; CAS 3 53292-31-6)、N-乙基-3-(2,6-二氣-4-三氟甲基苯氧基）-5-曱基-1//-吡唑-1-甲醯胺（H-3 ; CAS 452098-92-9)、N-四氫呋喃曱基-3·(2,6-二氯-4-三氟曱基笨氧基）-5-甲 -40- 155885.doc

S 201144441 基-1/^比。坐-1-甲醢胺（H-4 ; CAS 915396-43-9)、N-乙基-3-(2-氣-6-氟-4-三氟甲基苯氧基）_5曱基·^吡唑曱醯胺 (H-5 ; CAS 452099-05-7)及 Ν·四氫呋喃甲基-3-(2-氯-6-氟- 4-三氟曱基苯氧基）-5-甲基]丑_吡唑甲醯胺（H_6 ; CAS 45100-03-7)； e) 來自漂白劑除草劑之群的化合物：苯草醚（Aclonifen)、殺草強（Amitr〇1)、氟丁醯草胺 (Beflubutamid)、笨雙噻隆（Benz〇bicycl〇n)、吡草酮 (Benzofenap)、異噁草酮（Ci〇maz〇n)、吡氟草胺 (Diflufenican)、氟啶酮（Fiurid〇n)、氟咯草酮 (Flurochloridon)、呋草酮（Flurtam〇n)、異唑草酮 (Isoxaflutol)、甲基磺草酮（Mesotrion)、氟草敏 (Norflurazon)、氟吡草胺（pic〇Hnafen)、磺醯草吡脫 (Pyrasulfutol)、吡唑特（Pyrazolynat)、苄草唑 (Pyrazoxyfen)、磺草酿j (Sulc〇tri〇n)、特呋三酮 (Tefuryltrion)、特波三酮（Temb〇tri〇n)、苯唑草酮 (Topramezon)、4-羥基-3·[[2_[(2·甲氧基乙氧基）甲基]_6_ (二氟曱基）-3-吡啶基]羰基]雙環[3 21]辛_3•烯_2•酮（Η 7 ; CAS 3 52010-68-5)及4-(3-三氟甲基苯氧基）_2_(4_三氟甲基苯基）> 密咬（H-8 ; CAS 180608-33-7); f) 來自EPSP合成酶抑制劑之群的化合物：草甘膦（Glyphosat)、草甘膦異丙基銨及草甘膦三曱基硫鹽（草硫膦（Sulfosat)); g) 來自麩醯胺酸合成酶抑制劑之群的化合物： 155885.doc -41 - 201144441 草銨膦雙丙氨醯膦（BilanaPhos)(畢拉草（BialaPhos))、草銨膦雙丙氨醯膦納（Biianaphos_natrium)、固殺草 (Glufosinat)及固殺草敍（Glufosinat-ammonium); h) 來自DHP合成祿抑制劑之群的化合物：續草靈（Asulam); i) 來自有絲分裂抑制劑之群的化合物：胺草磷（Amipr〇Phos)、曱基胺草磷（Amiprophos-methyl)、倍尼芬（Benfluralin)、抑草稱（Butamiphos)、比達寧（Butralin)、卡草胺（Carbetamid)、氣普芬 (Chlorpropham)、敵草索（Chlorthal)、二甲基敵草索 (Chlorthal-dimethyl)、撻乃安（Dinitramin)、氟硫草定 (Dithiopyr)、乙丁烯氟靈（Ethalfluralin)、貝殺寧 (Fluchloralin)、安績靈（Oryzalin)、二甲戍樂靈 (Pendimethalin)、胺基丙氟靈（Prodiamin)、苯胺靈 (Propham)、戊炔草胺（Propyzamid)、胺草構（Tebutam)、噻草咬（Thiazopyr)及 II 樂靈（Trifluralin); j) 來自VLCFA抑制劑之群的化合物：乙草胺（Acetochlor)、曱草胺（Alachlor)、莎稗構 (Anilofos)、丁草胺（Butachlor)、。坐草胺（Cafenstrol)、二甲草胺（Dimethachlor)、二甲吩草胺（Dimethanamid)、精二甲吩草胺（Dimethenamid-P)、大芬滅（Diphenamid)、四唾醯草胺（Fentrazamid)、氟》塞草胺（Flufenacet)、苯》塞醢草胺 (Mefenacet)、。比草胺（Metazachlor)、異丙曱草胺 (Metolachlor)、精異丙曱草胺（Metolachlor-S)、萘丙胺 (Naproanilid)、草萘胺（Napropamid)、稀草胺（Pethoxamid)、 15588S.doc -42- 201144441 哌草磷（Piperophos)、丙草胺（pretilachlor)、毒草安 (Propachlor)、異丙草胺（propisochlor)、派羅克殺草砜 (Pyroxasulfon)(KIH-485)及甲氧噻草胺（Thenylchlor); 式2化合物：

尤其較佳之式2化合物為： 3-[5-(2,2-二氟-乙氧基甲基_3_三氟曱基_1H_吡唑_4· 基甲烷磺醯基]-4-氟-5，5-二曱基_4,5_二氫-異噁唑（2-1) ; 3-{[5-(2,2-二氟·乙氧基）+曱基_3_三氟曱比唑_4_基]_ 氟-甲烷磺醯基}-5,5-二甲基_4,5·二氫-異噁唑（2·2) ; ΐ -5,5-二曱基 -4,5-二氫-異噁嗤 ·3·績醯基曱基）_2_ 甲基 _5_ 三氟曱基-2Η-[1，2,3]三唑（2-3) ; 4-[(5,5-二甲基-4,5-二氫- 異噁唑-3-磺醯基）-氟-甲基]_2_曱基_5_三氟甲基·2ϋ-[1，2,3] 三唑（2-4) ; 4-(5,5-二曱基·4,5_二氫-異噁唑_3•磺醯基曱基）-2-曱基 _5·三氟曱基 _2Η-[1，2,3]三唑（2-5) ; 3-{[5-(2,2- 二氟-乙氧基）-l-曱基-3-三氟1曱基-lH-°比n坐-4-基]-二敗-曱院續醯基}-5,5-二曱基-4,5-二氫-異噁唾（2-6) ; 4-[(5,5-二曱基-4,5-二氫-異噁唑-3-磺醯基）-二氟-曱基]-2-曱基-5-三氟甲基-2Η-[1，2,3]三唑（2_7) ; 3-{[5-(2,2-二氟-乙氧基）_κ 曱基-3-三氟甲基-1Η-。比唑-4-基]-二氟-甲烷磺醯基卜4-氟-5,5-—甲基-4,5-二氫-異。惡吐（2-8) ; 4-[二氟-(4-氟- 5,5-二甲基-4,5-二氫-異噁唑-3-磺醯基）-曱基]-2-曱基-5-三氟曱基- 155885.doc -43- 201144441 2H-[1，2,3]三唑（2-9); k) 來自纖維素生物合成抑制劑之群的化合物：氣硫胺（Chlorthiamid)、敵草腈（Dichlobenil)、氟胺草唾 (Flupoxam)及異。惡草胺（Isoxaben); l) 來自解偶除草劑之群的化合物：特樂酴（Dinoseb)、特樂酯（Dinoterb)及DNOC及其鹽； m) 來自植物生長素除草劑之群的化合物： 2,4-D及其鹽及酯、2,4-DB及其鹽及酯、氯胺基吡啶酸 (Aminopyralid)及其鹽（如氯胺基"比咬酸-參（2-經丙基）敍及其醋）、草除靈（Benazolin)、草除靈乙醋（Benazolin-ethyl)、草滅平（Chloramben)及其鹽及酯、稗草胺 (Clomeprop)、克草立特（Clopyralid)及其鹽及酯、麥草畏 (Dicamba)及其鹽及酯、滴丙酸（Dichlorprop)及其鹽及酯、高2,4-滴丙酸（Dichlorprop-P)及其鹽及酯、氟草於 (Fluroxypyr)、丁氧基曱基氟草於（Fluroxypyr-butometyl)、氟氣比（Fluroxypyr-meptyl)、MCPA及其鹽及酯、硫乙基 MCPA(MCPA-thioethyl)、MCPB及其鹽及酯、2-甲-4-氯丙酸（Mecoprop)及其鹽及酉旨、高2-甲-4-氯丙酸（Mecoprop-P) 及其鹽及酯、胺氣吡啶酸（Picloram)及其鹽及酯、二氯喹淋酸（Quinclorac)、喹草酸（Quinmerac)、TBA(2,3,6)及其鹽及酯、綠草定（Triclopyr)及其鹽及酯、及5,6-二氯-2-環丙基-4-嘧啶碳酸（H-9 ; CAS 858956-08-8)及其鹽及酯； η)來自植物生長素轉運抑制劑之群的化合物：氟吼草腙 (Diflufenzopyr)、氟吼草腙鈉（Diflufenzopyr-natrium)、抑 155885.doc • 44·

S 201144441 草生（Naptalam)及抑草生鈉（Naptalam-natrium); 〇) 來自其他除草劑之群的化合物：溴丁醯草胺 (Bromobutid)、整形醇（Chlorflurenol)、甲基整形醇 (Chlorflurenol-methyl)、環庚草醚（Cinmethylin)、庫米隆 (Cumyluron)、茅草枯（Dalapon)、邁隆（Dazomet)、野燕枯 (Difenzoquat)、甲硫酸野燕枯（Difenzoquat-metilsulfate)、嘆節因（Dimethipin) ' DSMA、殺草隆（Dymron)、草藻滅 (Endothal)及其鹽、乙氧苯草胺（Etobenzanid)、麥草伏 (Flamprop)、異丙基麥草伏（Flamprop-isopropyl)、甲基麥草伏（Flamprop-methyl)、高效異丙基麥草伏（Flamprop-M-isopropyl)、高效曱基麥草伏（Flamprop-M-methyl)、抑草丁（Flurenol)、丁基抑草丁（Flurenol-butyl)、°夫嘴醇 (Flurprimidol)、殺木膦（Fosamin)、殺木麟敍（Fosamine-ammonium)、茚草 _ (Indanofan)、順丁烯二醢肼（Maleinic acid-hydrazid)、氟續醯草胺（Mefluidid)、威百故 (Metam)、甲基疊氮化物（methylazid)、曱基漠化物 (methylbromid)、甲基殺草隆（methyl-dymron)、曱基填 (methyljodid)、MSMA、油酸（oleic acid)、°惡 °秦草酮 (Oxaziclomefon)、壬酸（Pelargonic acid)、稗草畏 (Pyributicarb)、莫克草（Quinoclamin)、三嘻氟草胺 (Triaziflam)、滅草環（Tridiphan)及 6 -氣-3-(2-環丙基-6-甲基苯氧基）-4-噠嗪酮（H-10 ; CAS 499223-49-3)及其鹽及 S旨。較佳安全劑C之實例為解草酮（Benoxacor)、解毒喹 •45· 155885.doc 201144441 (Cloquintocet)、解草胺腈（Cy〇metrinil)、環丙磺醯胺 (Cyprosulfamid)、二氣丙烯胺（Dichl〇rmid)、迪赛隆 (Dicyclonon)、迪艾索諾（Dieth〇late)、解草唑 (Fenchlorazol)、解草 η定（Fencl〇dm)、解草胺（Fluraz〇1)、肟草安（Fhixofenim)、解草噁唑（Furilaz〇i)、異地芬 (Isoxadifen) 、11 比唾解草酯（Mefenpyr)、滅吩納 (Mephenat)、萘二甲酸酐、解草腈（〇xabetrinil)、4_(二氣乙醯基）-1-氧-4-氮螺[4.5]癸烷（H-l 1 ; MON4660，CAS 71526-07-3)及2,2,5-三甲基_3_(二氯乙醯基）_1，3-噁唑啶旧· 12 ; R-29148，CAS 52836-31-4)。群a)至〇)之化合物及安全劑c為已知除草劑及安全劑，參見例如 The Compendium of Pesticide Common Names(http://www.alanwood.net/pesticides/); B. Hock, C. Fedtke, R. R. Schmidt, Herbicides, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1995。其他除草效應物係自WO 96/26202、WO 97/41116、WO 97/41117、WO 97/41118、WO 01/83459及 WO 2008/074991 以及 W. KrSmer 等人（編）「Modern Crop Protection Compounds」，第 1卷，Wiley VCH，2007及其中引用之文獻得知》通常較佳與對所處理之作物具有選擇性且補充由本發明化合物在所用施用量下所防治之雜草之譜的除草劑組合使用本發明化合物。另外通常較佳同時以組合調配物或桶混製劑形式施用本發明化合物及其他互補除草劑。術語「mut-HPPD核酸」係指HPPD核酸具有自野生型 155885.doc -46 -

S 201144441 HPPD核酸突變且賦予表現其之植物增進之「香豆酮衍生性除草劑」耐受性的序列。此外，術語「突變羥苯基丙酮酸雙加氧酶（mut-HPPD)」係指用另一胺基酸置換野生型一級序列 SEQ ID NO: 2、4、6、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、其變異體、衍生物、同系物、直系同源物或旁系同源物之胺基酸。表述「突變胺基酸」將在下文中用於表示經另一胺基酸置換之胺基酸，進而表示蛋白質一級序列中之突變位點。術語「mut-HST核酸」係指HST核酸具有自野生型HST 核酸突變且賦予表現其之植物增進之「香豆酮衍生性除草劑」耐受性的序列。此外，術語「突變尿黑酸茄尼基轉移酶（mut-HST)」係指用另一胺基酸置換野生型一級序列 SEQ ID NO: 8或10之胺基酸。表述「突變胺基酸」將在下文中用於表示經另一胺基酸置換之胺基酸，進而表示蛋白質一級序列中之突變位點。若干HPPD及其一級序列已描述於當前技術狀態中，特定言之諸如假單胞菌屬（Pseudomonas)(Ruetschi等人， Eur.J.Biochem.，205，459-466，1992、W096/38567)之細菌之 HPPD、諸如芥菜屬（Arabidopsis)(W096/38567，Genebank AF047834)或胡蘿 g 屬（carrot)(W〇96/38567，Genebank 87257)之植物之 HPPD、球徽菌屬（c〇ccicoides)(Genebank COITRP)之 HPPD、介菜屬、^ 苔屬（Brassica)、棉屬 (cotton)、集胞藻屬（Synechocystis)及蕃茄屬（t〇mato)(US 7,297,541)之HPPD、諸如小鼠或豬之哺乳動物之HPPD。 155885.doc • 47· 201144441 此外’人工HPPD序列已描述於例如US6,768,044 ; US6,268,549 中。在一較佳實施例中，⑴之核苷酸序列包含序列SEQ ID NO: 1、3或5或其變異體或衍生物。在另一較佳實施例中’（ii)之核苷酸序列包含序列SEq ID NO: 7或9或其變異體或衍生物。此外’熟習此項技術者應瞭解⑴或（ii)之核苷酸序列涵蓋SEQ ID NO: 1、3或5及相應地SEQ ID NO: 7或9之同系物、旁系同源物及直系同源物，如下文所定義。就序列（例如多肽或核酸序列，諸如本發明之轉錄調控核苦酸序列）而言之術語「變異體」意謂實質上類似之序列。對於包含開放閱讀框架之核苷酸序列，變異體包括由於遺傳密碼簡併而編碼天然蛋白質之相同胺基酸序列的彼等序列。諸如此等變異體之天然存在之對偶基因變異體可使用熟知分子生物學技術，例如用聚合酶鏈反應（PCR)及雜交技術鑑別。變異核苷酸序列亦包括合成產生之核苷酸序列’諸如例如藉由使用定點突變誘發且針對開放閱讀框架所產生之編碼天然蛋白質之核苷酸序列，以及編碼相對於天然蛋白質具有胺基酸取代之多肽之核苷酸序列。一般而言’本發明之核苷酸序列變異體與核苷酸序列SEQ ID NO: 1、3、5、7或9之核苷酸「序列一致性」將為至少 30、40、50、60 至 70%，例如較佳 71%、72%、73〇/0、 74%、75°/。、76%、77°/。、78% 至 79%，一般而言至少 80〇/〇 ’ 例如 81%-84%、至少 85%，例如 86%、87%、88% ' •48- 155885.doc

S 201144441 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%至 98%及99%。就「變異」多狀而言’其意欲為藉由缺失（所謂截斷）或添加一或多個胺基酸至天然蛋白質之N末端及/ 或C末端；在天然蛋白質中之一或多個位點處缺失或添加一或多個胺基酸；或在天然蛋白質中之一或多個位點處取代一或多個胺基酸而自SEQ ID NO: 2、4、6、8或1〇之蛋白質獲得之多肽。此等變異體可由例如遺傳多形現象或人類操作產生。此等操作之方法通常在此項技術中為已知的0

在一尤其較佳實施例中，藉由使用一或多個選自由SEQ ID NO: 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67組成之群的引子進行定點突變誘發用於產生SEQ m NO: 2之HPPD之變異體。應認識到本發明之聚核苷酸分子及多肽涵蓋包含與SEQ ID No: 1、3、5、7或9中所述核苷酸序列或與SEq ID N〇: 2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19 中所述胺基酸序列足夠一致之核苷酸或胺基酸序列的聚核苷酸分子及多肽。在本文中使用術語「足夠一致」係指第一胺基酸或核苷酸序列含有足夠或最小數目之與第二胺基酸或核苷酸序列一致或等效（例如具有類似側鏈）的胺基酸殘基或核苷酸以致第一與第二胺基酸或核苷酸序列具有共同結構域及/或共同功能活性。 155885.doc •49· 201144441 序列一致性」係指兩個最佳比對之DNA或胺基酸序列在例如核苷酸或胺基酸之組分之整個比對窗中無變化的程度。測試序列及參考序列之比對區段之「一致性分數」為由兩個比對序列共有之一致組分之數目除以參考序列區段，亦即整個參考序列或參考序列之較小規定部分中之組分總數。「一致性百分比」為一致性分數乘以1〇〇。用於比對比較窗口之最佳序列比對為熟習此項技術者所熟知且可藉由工具，諸如Smith及Waterman之局部同源演算法、 Needleman及 Wunsch之同源比對演算法、Pears〇n& Upman 之搜索類似性方法，且較佳藉由此等演算法之電腦化實施，諸如可以 GCG. Wisconsin套裝（Accekys Inc. Burlington，

Mass.)之一部分形式利用之gap、BESTFIT、FASTA及 TFASTA進行。術語「聚核苷酸」、「核酸序列」、「核苷酸序列」、「核酸」、「核酸分子」在本文中可互換使用且係指呈任何長度之聚合未分支形式之作為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或兩者之組合的核苷酸。蛋白質之「衍生物」涵蓋相對於所討論之未經修飾之蛋白質’具有胺基酸取代、缺失及/或插入且生物及功能活性與其所源於之未經修飾之蛋白質類似的肽、寡肽、多狀、蛋白質及酶。蛋白質之「同系物」涵蓋相對於所討論之未經修飾之蛋白質’具有胺基酸取代、缺失及/或插入且生物及功能活性與其所源於之未經修飾之蛋白質類似的肽、寡肽、多 155885.doc

S • 50- 201144441 肽、蛋白質及酶β 缺失係指自蛋白質移除一或多個胺基酸。插入係指將一或多個胺基酸殘基引入蛋白質中之預定位點°插入可包含Ν端及/或c端融合以及序列内插入單個或多個胺基酸。一般而言’胺基酸序列内之插入將小於Ν端或C端融合約1至10個數量級的殘基。ν端或C端融合蛋白或肽之實例包括如酵母雙雜交系統中使用之轉錄活化子之結合域或活化域、噬菌體鞘蛋白、（組胺酸）_6標籤、麩胱甘肽S-轉移酶標籤、蛋白a、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、丁&8.100抗原決定基、（；_11^(；抗原決定基、17[八(^® 抗原決定基、lacZ、CMP(鈣調蛋白（caimoduiin)結合肽）、 HA抗原決定基、蛋白c抗原決定基及vsv抗原決定基。取代係指用具有類似性質（諸如類似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α螺旋結構或p片結構之傾向性）之其他胺基酸置換蛋白質之胺基酸。胺基酸取代通常為單一殘基取代，但視置於多肽上之功能限制而定可加以叢集且可在1至10個胺基酸範圍内；插入將通常為約丨至⑺個數量級之胺基酸殘基插入。胺基酸取代較佳為保守胺基酸取代。保存取代表在此項技術中為熟知的（參見例如

Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (編））。 155885.doc 201144441 表3 :保守胺基酸取代之實例殘基保守取代殘基保守取代 Ala Ser Leu lie ; Val Arg Lys Lys Arg ； Gin Asn Gin ； His Met Leu ; lie Asp Glu Phe Met ; Leu ; Tyr Gin Asn Ser Thr ； Gly Cys Ser Thr Ser ； Val Glu Asp Trp Tyr Gly Pro Tyr Trp ； Phe His Asn ； Gin Val lie ； Leu lie Leu，Val 胺基酸取代、缺失及/或插入可易於使用此項技術中熟知之肽合成技術，諸如固相肽合成及其類似技術，或藉由重組DNA操作進行。操作DNA序列以產生蛋白質之取代、插入或缺失變異體之方法在此項技術中為熟知的。舉例而言，在DNA中之預定位點處進行取代突變之技術為熟習此項技術者所熟知且包括Ml 3突變誘發、T7-Gen活體外突變誘發（USB, Cleveland, OH)、QuickChange 定點突變誘發 (Stratagene，San Diego, CA)、PCR介導之定點突變誘發或其他定點突變誘發方案。「衍生物」另外包括相較於天然存在形式之蛋白質（諸如相關蛋白質）之胺基酸序列，可包含用非天然存在胺基酸殘基進行之胺基酸取代或添加有非天然存在胺基酸殘基的肽、寡肽、多肽。蛋白質之「衍生物」亦涵蓋相較於天然存在形式之多肽之胺基酸序列，包含天然存在之經改變 (糖基化、醢基化、異戊二稀基化（prenylated)、礙酸化、肉豆蔻醢化（myristoylated)、硫酸化等）或非天然改變胺基 -52- 155885.doc

S 201144441 酸殘基的肽、募肽、多肽。衍生物相較於其所源於之胺基酸序列，亦可包含一或多個非胺基酸取代基或添加，例如與胺基酸序列共價或非共價結合之報導分子或其他配位體，諸如結合以便於偵測胺基酸序列的報導分子；及相對於天然存在蛋白質之胺基酸序列為非天然存在之胺基酸殘基。此外，「衍生物」亦包括天然存在形式之蛋白質與標蕺肽，諸如FLAG、HIS6或硫氧還蛋白（thi〇red〇xin)之融合物（關於標籤肽之評述，參見Terpe，Appl Micr〇bi〇1

Biotechnol. 60, 523-533, 2003)。「直系同源物」及「旁系同源物」涵蓋用於描述基因之祖性關係之進化概念。旁系同源物為同一物種内已經由祖性基因複製所產生之基因；直系同源物為來自不同生物之已經由物種形成（speciation)所產生且亦源於共同祖性基因之基因。此等直系同源物之實例之非限制性清單展示於表 1中。此項技術中熟知旁系同源物及直系同源物可共有在既定位點處具有適合胺基酸殘基之獨特域，諸如供特定受質使用之結合袋或用於與其他蛋白質相互作用之結合基元。術語「域」係指根據進化相關蛋白質之序列之比對，在特定位置處保寸的一組胺基酸❶儘管其他位置之胺基酸可在同系物之間變化，但在特定位置處高度保守之胺基酸表不在蛋白夤結構、穩定性或功能方面可能為必需的胺基酸。藉由其在蛋白質同系物家族之經比對序列中之高度保寸性鑑別’其可用作確定所討論之任何多肽是否屬於先前 155885.doc •53· 201144441 鑑別之多肽家族的鑑別物（identifier)。術語「基元」或「共同序列」係指進化相關蛋白質之序列中之短保守區》基元常為域之高度保守部分，但亦可僅包括域之一部分，或位於保守域外部（若基元之所有胺基酸皆落在規定域之外部）。存在用於鑑別域之專業資料庫，例如SMART(Schultz等人（1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95，5857-5864 ; Letunic 等人（2002) Nucleic Acids Res 30，242-244)、 InterPro(Mulder等人，（2003) Nucl. Acids. Res· 31，315-318)、Prosite(Bucher 及 Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB-94 ; Proceedings 2nd International Conference on

Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D·，Karp P·，Lathrop R.，Searls D.編，第 53-61 頁， AAAI Press，Menlo Park ; Hulo 等人，Nucl. Acids. Res. 32:D134-D137，（2004))、或 Pfam(Bateman 等人，Nucleic Acids Research 30(1): 276-280 (2002))。用於電子雜交（in silico)分析蛋白質序列之一組工具可在ExPASy蛋白質組研究伺服器（瑞士生物資訊學研究所（Swiss Institute of Bioinformatics)(Gasteiger 等人，ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003))上獲得。亦可使用常規技術，諸如藉由序列比對鑑別域或基元。

155885.doc -54- S 201144441 用於比對序列以進行比較之方法在此項技術中為熟知的，此等方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及 TFASTA。GAP使用 Needleman及 Wunsch之演算法（（1970) J Mol Biol 48: 443-453)，以便在兩個序列之間，在使匹配數最大且空隙數最小下進行整體（亦即涵蓋全序列）比對。 BLAST演算法（Altschul等人（1990) J Mol Biol 215: 403-10) 計算序列一致性百分比，且進行兩個序列之間之類似性的統計分析。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心（National Centre for Biotechnology Information，NCBI) 公開獲得。同系物很容易使用例如ClustalW多序列比對演算法（第1·83版），採用預設逐對比對參數及百分比計分方法加以鑑別。亦可使用MatGAT套裝軟體中之可用方法之一確定整體類似性及一致性百分比（Campanella等人， BMC Bioinformatics. 2003 年 7 月 10 日；4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences.)。如將為熟習此項技術者顯而易知，可進行些微人工編輯，以使保守基元之間之比對最佳化。此外，亦可改用特定域替代用於鑑別同系物之全長序列。可使用以上提及之程式，使用預設參數來確定歷經整個核酸或胺基酸序列或歷經所選域或保守基元之序列一致性值。對於局部比對，Smith-Waterman演算法尤其適用 (Smith TF，Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1);195-7)。本發明之發明者已驚人地發現，藉由取代一或多個關鍵胺基酸殘基，相較於具有SEQ ID NO: 2、4或6之野生型 155885.doc •55· 201144441 HPPD酶之活性，可顯著增進除草劑耐受性或抗性。 HPPD之較佳取代法為彼等增進植物之除草劑耐受性，但貫質上不影響雙加氧酶活性之生物活性的取代法。因此’在本發明之另一目標中，HPPD酶、其變異體、衍生物直系同源物、旁系同源物或同系物之關鍵胺基酸殘基已被任何其他胺基酸取代。在一較佳實施例中，HPPD酶、其變異體、衍生物、直系同源物、旁系同源物或同系物之關鍵胺基酸殘基係經如上表3中描述之保守胺基酸取代。熟習此項技術者將瞭解，位於以下提及之胺基酸位置之緊鄰位置中的胺基酸亦可經取代。因此，在另一實施例中 ’ SEQ ID NO: 2、4、6、11、12、13、14、15、16、 17 1 8、19、其變異體、竹生物、直系同源物、旁系同源物或同系物之變異體包含mut-HPPD，其中距關鍵胺基酸 ±3、±2或±1個胺基酸位置之胺基酸係經任何其他胺基酸取代。基於此項技術中熟知之技術，可產生高度特徵性序列樣 .式’藉助於§亥樣式可搜尋具有所要活性之其他mut_HppD 候選者。藉由應用適合序列樣式搜索其他mut-HPPD候選者亦將由本發明涵蓋。熟練讀者將瞭解本發明序列樣式不受該樣式之兩個鄰近胺基酸殘基之間之精確距離限制。以上樣式中之兩個鄰近胺基酸之間之每一距離可例如彼此獨立地變化多達士 10、±5、±3、±2或±1個胺基酸位置，而不實質上 155885.doc ·56· 201144441 影響所要活性。與基於如根據本發明獲得之結晶學資料對個別胺基酸殘基的該以上功能及空間分析一致，可鑑別本發明之潛在適用mut-HPPD候選者所特有之獨特部分胺基酸序列。在一尤其較佳實施例中，SEQ ID NO: 2之mut-HPPD之變異體或衍生物係選自以下表4a且SEQ ID NO: 2之mut-HPPD之組合胺基酸取代係選自表4b 。表4a : (SEQ ID No: 2):單一胺基酸取代關鍵胺基酸位置取代基較佳取代基 Gln293 Ala、Leu、lie、Val、His、Asn Val、His、Asn Met335 Ala、Trp、Phe、Leu、lie、Val、Asn、Gin Ala、Trp、Phe Pro336 Ala Ala Ser337 Ala、Pro Ala、Pro Phe392 Ala、Leu Ala Glu363 Gin Gin Gly422 His、Met、Phe、Cys Leu427 Phe ' Trp Phe Thr382 Pro Pro Leu385 Ala、Val Val Ile393 Ala、Leu Leu 表4b : (SEQ ID NO: 2):組合胺基酸取代組合編號關鍵胺基酸位置取代基較佳取代基 1 Pro336 Ala Ala Glu363 Gin Gin 2 Thr382 Pro Pro Leu385 Ala、Val Val Ile393 Ala、Leu Leu 應瞭解除上表中提及之胺基酸外之任何胺基酸亦可用作取代基。測試此等突變體之功能性之檢定在此項技術中容易獲得，且相應描述於本發明之實例章節中。在一較佳實施例中，胺基酸序列在一或多個以下位置不 155885.doc -57- 201144441 同於SEQ ID NO: 2之HPPD之胺基酸序列：293、335、 336、337、392、363、422、427、382、385、393。此等胺基酸位置處之差異之實例包括（但不限於）以下一或多者：位置293之胺基酸不為麩醯胺酸；位置335之胺基酸不為甲硫胺酸；位置336之胺基酸不為脯胺酸；位置337 之胺基酸不為絲胺酸；胺基酸位置392不為苯丙胺酸；胺基酸位置363不為麩胺酸；位置422之胺基酸不為甘胺酸；位置427之胺基酸不為白胺酸；胺基酸位置382不為蘇胺酸；位置385之胺基酸不為白胺酸；胺基酸位置393不為異白胺酸。在一些實施例中，SEQ ID NO: 2之HPPD酶包含以下一或多者：位置293之胺基酸為丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、組胺酸或天冬醯胺；位置335之胺基酸為丙胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、绳胺酸、天冬醯胺或麩醯胺酸；位置336之胺基酸為丙胺酸；位置 337之胺基酸為丙胺酸或脯胺酸；胺基酸位置392為丙胺酸或白胺酸；胺基酸位置363為麩醯胺酸；位置422之胺基酸為組胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸或半胱胺酸；位置427之胺基酸為笨丙胺酸或色胺酸；胺基酸位置382為脯胺酸；位置385之胺基酸為纈胺酸或丙胺酸；胺基酸位置393為丙胺酸或白胺酸。在特定較佳實施例中，SEQ ID NO: 2之HPPD酶包含以下一或多者：位置336之胺基酸為丙胺酸；胺基酸位置363 為麩醯胺酸；胺基酸位置393為白胺酸；位置385之胺基酸 58 - 155885.doc

S 201144441 為纈胺酸。在另一較佳實施例中’胺基酸序列在位置418不同於 SEQ ID NO: 6之HPPD之胺基酸序列。較佳地，位置418之胺基酸不為丙胺酸》更佳地’位置418之胺基酸為蘇胺酸。鑑別SEQ ID NO: 1、3或5及相應地SEQ ID NO: 7或9之同系物、直系同源物及旁系同源物（諸如表1中描述之彼等同系物、直系同源物及旁系同源物）之間所共有之保守區及基元將在熟習此項技術者之知識範嘴内0在已鑑別可表示適合結合基元之此等保守區之後，可選擇對應於表4&及 4b中所列胺基酸之胺基酸以經任何其他胺基酸，較佳經如表3中所示之保守胺基酸，且更佳經表牦及朴之胺基酸取代。此外’本發明涉及藉由使用由包含核苷酸序列seq ι〇 NO_ 1、3或5或其變異體或衍生物之核酸編碼之 HPPD，及/或藉由使用由包含核苷酸序列seq id n〇 : 7或 9或其變異體或衍生物之核酸編碼之mut_HST鑑別香豆酮衍生性除草劑的方法。該方法包含以下步驟： a) 產生包含編碼mut_HppD之核酸之轉殖基因細胞或植物’其中係表現該mut-HPPD ; b) 向句之δ亥轉殖基因細胞或植物及向相同種類之對照細胞或植物施用香豆酮衍生性除草劑； Ο測定施賴香豆酮衍生性除草劑之後該轉殖基因細胞 155885.doc -59- 201144441 或植物及該對照細胞或植物之生長或生存力，及 d)相較於該轉殖基因細胞或植物之生長，選擇可以使該對照細胞或植物之生長降低的「香豆酮衍生性除草劑」。就「對照細胞」或「類似野生型植物 '植物組織、植物細胞或宿主細胞」而言，其分別意欲缺乏本文揭示之除草劑抗性特徵及/或本發明之特定聚核苷酸的植物' 植物組織、植物細胞或宿主細胞。因此，使用術語「野生型」不意味植物、植物組織、植物細胞或其他宿主細胞在其基因組中缺乏重組DNA，及/或不具有與本文揭示之除草劑抗性特徵不同的除草劑抗性特徵。另一目標涉及鑑別編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之mut-HPPD之核苷酸序列的方法，該方法包含： a) 產生mut-HPPD編碼核酸之文庫， b) 藉由在細胞或植物中表現每一該等核酸且用香豆酮衍生性除草劑處理該細胞或植物來筛檢所得mut_HppD編碼核酸之群體， c) 比較由該mut-HPPD編碼核酸群體提供之香豆酮衍生性除草劑耐受性程度與由對照HppD編碼核酸提供之香豆酮衍生性除草劑耐受性程度， d) 選擇相較於由對照hppd編碼核酸提供之對香豆綱衍生性除草劑之耐受性程度，提供對香豆酮衍生性除草劑之顯著增進耐受性程度的至少一種mut-HPPD編碼核 155885.doc

S •60· 201144441 酸。在一較佳實施例中，相較於由對照HppD編碼核酸提供之對香豆酮衍生性除草劑之抗性或耐受性，步_中選出之mUt-HPi>D編碼核酸提供至少2倍之細胞或植物對香豆嗣衍生性除草劑的抗性或耐受性。在另-較佳實施例中’相較於由對照HppD編碼核酸提供之對香豆酮衍生性除草劑之抗性或耐受性，步驟d)中選出之mut-HPPD編碼核酸提供至少2倍、至少5倍、至少1〇倍、至少20倍、至少50倍、至少1〇〇倍、至少5〇〇倍之細胞或植物對香豆酮衍生性除草劑的抗性或耐受性。抗〖生或耐受性可藉由產生包含步驟a)之文庫之核酸序列的轉殖基因植物或宿主細胞，較佳植物細胞且比較該轉殖基因植物與對照植物或宿主細胞，較佳植物細胞加以測定。另一目標涉及鑑別含有包含編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之mut_HppD或mut-HST之核苷酸序列的核酸之植物或藻類的方法，該方法包含： a) 於植物細胞或綠藻之培養物中鑑別會導致該等細胞死亡之有效量的香豆酮衍生性除草劑， b) 用突變誘發劑處理該等植物細胞或綠藻， c) 使該突變誘發細胞群體與a)中鑑別之有效量之香豆酮衍生性除草劑接觸， d) 選擇在此等測試條件下存活之至少一個細胞，

e) 對來自d)中選出之細胞之HPPD及/或HST基因進行PCR 155885.doc -61 - 201144441 擴增及定序且將此等序列分別與野生型HPPD或HST基因序列比較。在一較佳實施例中，該突變誘發劑為甲烷磺酸乙酯 (EMS)。為熟習此項技術者熟知之許多方法可用於自多種不同可能來源生物（包括微生物、植物、真菌、藻類、混合培養物等）以及DNA之環境來源（諸如土壌）獲得適用於鐘別編碼 mut-HPPD之核苷酸序列的候選核酸。此等方法尤其包括製備cDNA或基因組DNA文庫；使用適合簡併寡核苦酸引子；使用基於已知序列或互補檢定之探針（以例如在酪胺酸上生長）以及使用突變誘發及改組以提供重組或改組 mut-HPPD編碼序列。包含候選及對照HPPD編碼序列之核酸可在酵母、細菌宿主菌株、藻類或高等植物（諸如菸草或芥菜屬）中表現且根據經轉型菌株或植物在不同濃度之所選香豆酮衍生性除草劑存在下之可見指標表型篩檢HPPD編碼序列之相對固有耐受性程度。與此等指標表型（棕色形成、生長抑制、除草效應等）相關之劑量反應及劑量反應之相對位移宜依據例如GR50(生長降低50%之濃度）或MIC(最低抑制濃度）值來表示’其中值之增加對應於表現之HPPD之固有耐受性增加。舉例而言，在基於細菌（諸如大腸桿菌（E. coli))轉型之相對快速檢定系統中，各mut-HPPD編碼序列可例如以DNA序列形式在可控制啟動子（諸如lacz啟動子）之表現控制下及在適當考慮（例如藉由使用合成DNA)諸如密碼子 155885.doc -62· 201144441 使用之問題的情況下表現以獲得不同HPPD序列之儘可能相當之表現量。表現包含替代候選HPPD序列之核酸之此等菌株可在不同濃度的所選香豆酮衍生性除草劑下於視情況補充有酪胺酸之培養基中析出（plate out)且基於抑制標色褐黃病色素形成之程度及MIC來估計表現之HPPD酶之相對固有耐受性程度。在另一實施例令’候選核酸轉型於植物物質中以產生轉殖基因植物’其再生成形態正常之可育株，接著量測該等可育株對所選香豆酮衍生性除草劑之差異耐受性。使用適合選擇標記（諸如康黴素（kanamycin))、雙元載體（諸如來自農桿菌屬（Agrobacterium))及植物再生（諸如來自菸草葉盤 (tobacco leaf disc))之許多適合轉型方法在此項技術中為熟知的。視情況，亦用表現對照HPPD之核酸轉型對照植物群體。或者，未轉型雙子葉植物，諸如芥菜屬或於草屬可用作對照，因為此在任何情況下皆表現其自身内源性 HPPD。在-定範圍之不同除草劑濃度下，以基於植物損傷、分生組織漂白症狀等之常規方式對一定範圍之初級植物轉型品系或其子代對選自表2之香豆酮衍生物之除草劑耐受性，度之平均值及分佈進行評估。此等資料可依據例如自劑量/反應曲線獲得之GR5〇值來表示，在該等劑量/反應曲線中’「劑量」繪製在χ軸上且「殺傷百分比」、「除草效應」、「出現綠色植物之數目」等繪製在⑽上，立中 GR50值增加對應於表現 ^ ^ ., ^ HPPD之固有耐受性程度增加。除卓劑可料在㈣m錢施用。 155885.doc •63· 201144441 另一目標涉及編碼mut-HPPD之經分離核酸，其中該核酸可藉由如上定義之方法鑑別》在另一實施例中，本發明涉及藉由野生型或mut-HPPD 核酸轉型之植物細胞或已經突變而獲得表現野生型或mut-HPPD核酸之植物的植物細胞，其中核酸在該植物細胞中之表現導致相較於野生型種類之該植物細胞，對香豆酮衍生性除草劑之抗性或耐受性得以增進。術語「表現」或「基因表現」意謂特定基因或特定遺傳構築體之轉錄。術語「表現」或「基因表現」特定言之意謂基因或遺傳構築體轉錄成結構RNA(rRNA、tRNA)或 mRNA，隨後將結構RNA(rRNA、tRNA)或mRNA轉譯或不轉譯成蛋白質。該過程包括DNA之轉錄及所得mRNA產物之加工。為了獲得所要效應，亦即植物對本發明之香豆酮衍生性除草劑具有耐受性或抗性，應瞭解至少一種核酸藉由熟習此項技術者已知之方法及手段「過度表現」。如本文所用之術語「增進之表現」或「過度表現」意謂除原始野生型表現量外之任何形式的表現。用於增進基因或基因產物表現之方法在此項技術中經文獻充分證明且包括例如由適當啟動子驅動之過度表現、使用轉錄增強子或轉譯增強子。充當啟動子或增強子元件之經分離核酸可引入非異源形式之聚核㈣的適當位置（通常上游）中以便上調編碼:關多狀之核酸之表現。舉例而言，内源性啟動子可藉由犬1缺失、及/或取代在活體内改變（參見Kmiec， 155885.doc •64· 201144441 US 5,565,350 ; Zarling等人’ w〇9322443)，或經分離啟動子可以適當之定向及距本發明基因之距離引入植物細胞中以便控制基因表現。若需要多狀表現，則通常需要在聚核苷酸編碼區之3,端包括聚腺苷酸化區。聚腺苷酸化區可源於天然基因、多種 . 其他植物基因或T-DNA。欲添加之3,端序列可源於例如胭月曰胺St (nopaline)合成酶或章魚胺酸（〇ct〇pine)合成酶基因’或者源於另一植物基因’或次佳源於任何其他真核生物基因。内含子序列亦可添加至部分編碼序列之5,未轉譯區 (UTR)或編碼序列中以增加在細胞溶質中累積之成熟訊息物（message)之量。在植物與動物表現構築體兩者中之轉錄單元中包括可剪接内含子已顯示會使基因在mRNA層面與蛋白質層面兩者上之表現增加多達1〇〇〇倍（Buchman及Berg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405 ; Callis 等人（1987) Genes Dev 1:1183-1200)。當置放在接近轉錄單元之5,端時，基因表現之此内含子增強通常最大。玉米内含子 Adhl-S内含子1、2及6、Bronze-Ι内含子之使用在此項技 • 術中為已知的。關於一般性資訊，參見：The Maize

Handbook,第 116章，Freeling及 Walbot編，Springer，N.Y. (1994) » 如本文提及之術語「引入」或「轉型」涵蓋將外源性聚核苷酸轉移入宿主細胞中而不管用於轉移之方法如何。能夠隨後無論藉由器官發生或胚胎發生進行純系繁殖之植物 155885.doc • 65- 201144441 組織可用本發明之遺傳構築體轉型且整個植物自該植物組織進行再生。選出之特定組織將視可用於且最適於所轉型之特定物種的純系繁殖系統而變化。例示性組織目標包括葉碟（leaf disk)、花粉、胚、子葉、下胚軸、大配子體、癒合組織、現存分生組織（例如頂端分生組織、腋芽及根分生組織）、及誘導之分生組織（例如子葉分生組織及下胚轴分生組織）。聚核苷酸可短暫或穩定引入宿主細胞中且可以非整合形式，例如以質體形式加以維持。或者，其可整合入伯主基因組中。所得經轉型植物細胞可接著以熟習此項技術者已知之方式用於再生經轉型植物。外源基因轉移入植物基因組中稱為轉型。植物物種之轉型目前為十分常規之技術。若干轉型方法之任一者可有利地用於將相關基因引入適合祖先細胞中。關於自植物組織或植物細胞轉型及再生植物所述之方法可用於短暫或穩定轉型。轉型方法包括使用脂質體、電穿孔、增加游離dna 攝取之化學品、將dna直接注射入植物中、粒子搶轟擊、使用病毒或I粉進行轉型及顯微投影。方法可選自用於原生體之鈣/聚乙二醇方法（Krens，F.A.等人，（1982) Nature 296, 72-74 ; Negrutiu I 等人（1987) Plant Mol Biol 8: 363-373);原生體電穿孔（shillito R.D.等人（1985) Bio/Technol 3，1099-1102);顯微注射入植物物質中（Cr〇ssway a等人， (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185) ; DNA 或 RNA 塗佈粒子轟擊（Klein TM等人 ’（1987) Nature 327: 70);用（非整合性）病毒及其類似物進行注射。轉殖基因植物，包括轉 -66 - 155885.doc

S 201144441 殖基因作物係較佳經由農桿菌屬介導之轉型產生。一種有利轉型方法為在植物體中轉型。為此，有可能例如使農桿菌作用於植物種子或用農桿菌對植物分生組織接種。已證明根據本發明尤其適宜使經轉型農桿菌之懸浮液作用於完整植物或至少花原基（fl〇wer prim〇rdia) ^植物隨後繼續生長直至獲得經處理植物之種子（clough及Bent，Plant J (1998) 16’ 735-743)。用於農桿菌屬介導之稻轉型之方法包括用於稻轉型之熟知方法，諸如於以下任一者中描述之彼等方法：歐洲專利申請案Ερ ιι98985 Al ; Aldemita及

Hodges(Planta 199: 612-617，1996); Chan 等人（Plant Mol Biol 22 (3): 491-506，1993) ; Hiei#A(PlantJ6(2):271- 282，1994)，該等專利及文獻之揭示内容就如同完全闡述一般以引用的方式併入本文中。在玉米轉型之情況下，較佳方法係如 Ishida 等人（Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996)或 Frame 等人（Plant Physiol 129(1): 13-22，2002)中所述，該等文獻之揭示内容就如同完全闡述一般以引用的方式併入本文中。該等方法另外描述於例如B. Jenes等人， Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants,第 1卷， Engineering and Utilization，S.D. Kung 及 R. Wu 編， Academic Press (1993) 128-143及 Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225 中。欲表現之核酸或構築體較佳選殖入適於轉型根癌農桿菌 iMwe/hciews)之載體，例如pBinl9 中（Bevan 等人，Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711)。由該種載體轉型 155885.doc •67· 201144441

(諸如菸草植物）的轉型。藉助於根癌農桿菌轉型植物例如由 H0fgen及 Willmitzer描述於 Nucl Acid Res (1988) %

9877中或尤其自f.f.

Higher Plants; Transgenic Plants，第 1卷 Utilization, S.D. Kung及 R. Wu，編 Acac 第15-38頁得知。除轉型接著必須再生成完整植物之體細胞外，亦有可能轉型植物分生組織之細胞且特定言之發育成配子之彼等細胞。在此情況下，經轉型配子遵循天然植物發育，從而產生轉殖基因植物。因此，舉例而言，用農桿菌處理之芥菜屬種子及自某一比例經轉型且因此為轉殖基因植物之發育中之植物獲仔種子[Feldman，KA 及 Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:274-289 ； Feldmann K (1992). C Koncz, N- H Chua 及 J Shell 編，Methods in Arabidopsis Research. Word Scientific，Singapore，第 274-289頁]。替代方法係基於重複移除花序及與經轉型農桿菌一起培育在叢生葉 (rosette)中心之切除部位，藉此經轉型之種子可同樣在隨後時間點獲得（Chang (1994). Plant J· 5: 551-558 ; Katavic (1994)· Mol Gen Genet，245: 363-370)。然而，尤其有效之方法為真空浸潤法及其修改形式，諸如「花浸潰（fl〇ral 155885.doc -68- 201144441 dip)」法。在真空浸潤芥菜屬之情況下，完整植物在減壓下用農桿菌懸浮液處理[Bechth〇ld，N (1993)· C R Acad Sci Pans Life Sci，316: 1194-1199]，而在「花浸潰」法之情況下’發育中之花組織與經界面活性劑處理之農桿菌懸浮液一起短暫培育[Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant «Γ-ΐ 6， 735-743] 。在兩種情況下均收集某一比例之轉殖基因種子’且此等種子可藉由在上述選擇性條件下生長而與非轉殖基因種子區分。此外，質體之穩定轉型具有優點，因為對於大多數作物而言，質體係經母系遺傳，從而降低或消除轉殖基因流過花粉之風險。葉綠體基因組之轉型通常藉由已示意性顯示於Klaus等人，2004 [Nature Biotechnology 22 (2)，225-229]中之方法達成。簡而言之，連同可選擇標記基因一起將欲經轉型之序列選殖於與葉綠體基因組同源之側接序列之間。此等同源側接序列引導位點特異性整合進入原質體系（plastome)中。質體轉型已關於許多不同植物物種加以描述且概述於Bock (2001) Transgenic piastids in basic research and plant biotechnology, j Mol Biol. 2001 年 9 月 21 曰；312 (3):425-38 或 Maliga，P (2003) Progress towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol. 21，20-28 中。近來已以無標記質體轉型體之形式報導另一生物技術方法，該等轉型體可由短暫共整合標記基因產生（Klaus等人，2004，Nature Biotechnology 22(2)，225-229)。經遺傳修飾之植物細胞可經由習此相關技藝之人士所熟悉之所有方法進行再生。適 155885.doc •69- 201144441 合方法可見於以上提及之S.D. Kung及R. Wu，Potrykus或 H6fgen及Willmitzer之出版物中。一般而言’在轉型之後，選擇存在一或多種由與相關基因共轉移之植物可表現基因編碼之標記的植物細胞或細胞分組（cell grouping)，此後經轉型材料再生成整個植物。為了選擇經轉型植物’於轉型中獲得之植物物質通常經受選擇性條件以使經轉型植物可與未轉型植物區分。舉例而言’以上述方式獲得之種子可經種植且在初始生長期之後’經受藉由噴灑進行之適合選擇。另一可能性在於在滅菌之後若適當’則使種子在使用適合選擇劑之瓊脂板上生長以使僅有經轉型種子可生長成植物。或者，篩檢存在可選擇標記，諸如上述可選擇標記之經轉型植物。在DNA轉移及再生之後，亦可例如使用南方分析評估推定經轉型植物之相關基因之存在、複本數及/或基因組組織。另外或或者，新引入之DNA之表現量可使用北方及/ 或西方分析監測，兩種技術均為一般技術者所熟知。產生之經轉型植物可藉由多種手段，諸如藉由純系繁殖或經典育種技術加以繁殖。舉例而言，第一代（或τι)經轉型植物可自花受粉（selfed)且同種接合第二代（或Τ2)轉型體經選擇’且Τ2植物可接著進_步經由經典育種技術加以繁殖。產生之經轉型生物可採用多種形式。舉例而言，其可為經轉型細胞與非經轉型細胞之嵌合體；' 如所有細胞皆經轉型以含有表現卡…經轉型及未轉(: 組織之移植物（例如在植物中，經轉型根莖移植至未轉型 155885.doc •70· 201144441 接穗（scion))。較佳地，野生型或mut-HPPD核酸（a)或野生型或mut-HST核酸（b)包含選自由以下組成之群之聚核苷酸序列：a) 如SEQ ID NO: 1、3或5中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；b)如SEQ ID NO: 7或9中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；c)編碼如SEQ ID NO: 2、4、6、8或10中所示之多肽之聚核苷酸，或其變異體或衍生物；d)包含任何 a)至c)之至少60個連續核苷酸之聚核苷酸；及e)與任何a) 至d)之聚核苷酸互補之聚核苷酸。較佳地’核酸在植物中之表現導致相較於野生型種類之植物，植物對香豆酮衍生性除草劑之抗性得以增進。在另一實施例中，本發明涉及包含本發明之植物細胞之植物，較佳轉殖基因植物，其中核酸在該植物中之表現導致相較於野生型種類之該植物，該植物對香豆酮衍生性除草劑之抗性得以增進。本文所述之植物可為轉殖基因作物或非轉殖基因植物。出於本發明之目的，「轉殖基因」或「重組」意謂就例如核酸序列、表現卡E、基因構㈣或包含核酸序列之載體或經本發明之核酸序列、表現卡匿或載體轉型之生物而言，所有彼等結構皆藉由重組方法產生，在該等方法中， (a) 編碼適用於本發明方法中之蛋白質之核酸序列，或 (b) 可操作地與本發明之妨赌皮 $ 4货/3心核I序列連接之遺傳控制序列，例如啟動子，或 (c) a)及 b) 155885.doc -71- 201144441 不位於其天然遺傳環境令或已藉由重組方法㈣，其中修飾有可能採用例如取代、添加、缺失、反轉或插入一或多個核苦醆殘基之形式。天然遺傳環境應理解為意謂原始植物或基因組文庫中之存在物中的天然基因組或染色體基因座。在基因組文庫之情況下’核酸序列之天然遺傳環境較佳至少部分經保留。科至少在一側側接核酸序列且具有之序列長度為至少50 bp、較佳至少5〇〇 bp、尤其較佳至少 1000 bp、最佳至少5000 bp。當藉由非天然合成（「人工」）方法（諸如突變誘發處理）修飾天然存在之表現卡匣 (例如核酸序列之天然啟動子與如上定義之編碼適用於本發明方法中之多肽之相應核酸序列的天然存在組合）時，此表現卡匿變為轉殖基因表現卡£ ^適合方法描述於例如 US 5,565,350或 WO 00/15815 中。因此，出於本發明目的之轉殖基因植物應同上理解為意謂用於本發明方法中之核酸不在其於該植物之基因組中之天然基因座處，其申核酸有可能同源或異源表現。然而，如所提及，轉殖基因亦意謂儘管本發明核酸或用於本發明方法中之核酸在其於植物之基因組中的天然位置處，但序列已關於天然序列加以修飾，及/或天然序列之調控序列已經修飾。轉殖基因較佳應理解為意謂本發明核酸在基因組中之非天然基因座處的表現，亦即發生核酸之同源或較佳異源表現。在本文中提及較佳轉殖基因植物。此外，術 s吾「轉殖基因」係指含有至少一種重組聚核苷酸之全部或一部分的任何植物、植物細胞、癒合組織、植物組織或植 15588S.doc •72· 201144441 物部分。在許多情況下，重組聚核苦酸之全部或一部分穩定整合入染色體或穩定染色體外元件中，以便其傳遞至連續世代中。出於本發明目的，術語「重組聚核苦酸」係指已藉由遺傳工程改造改變、重排或修飾之聚核苷酸。實例包括任何選殖之與異源序列連接或接合之聚核苦酸。術語「重組」不係指由天然發生事件（諸如自發突變）或選擇育種之後非自發突變誘發所產生之聚核苷酸改變。含有歸因於非自發突㈣發及選擇育種產生之突變的植物在本文中稱為非轉殖基因植物且包括在本發明中。在植物為轉殖基因植物且包含多個mut_HppD核酸之實施例中，核酸可源於不同基因組或相同基因組。或者，在植物為非轉殖基因植物且包含多個mut_HppD核酸之實施例中，核酸位於不同基因組或相同基因組上。

在某些實施例中，本發明涉及藉由突變育種產生之除草劑抗性植物。此等植物包含編碼mutHppD及/或mut HsT 之聚核普酸且對-或多種「香豆_衍生性除草劑」具有耐受性。此等方法可涉及例如將植物或種子暴露於突變劑尤其化學突變劑’諸如甲糾酸乙醋（EMS)中及選擇對至少一或多種香豆酮衍生性除草劑之耐受性增進的植物。 j而本發明不限於藉由涉及化學突變劑EMs之突變誘發方法產生的除草劑耐受性植物。此項技術中已知之任何犬&誘發方法皆可用於產生本發明之除草劑抗性植物。此等突變誘發方法可涉及例如使用任何一或多種以下突變 &J輻射，諸如X射線、γ射線（例如鈷60或鉋137)、中子 155885.doc -73- 201144441 (例如於原子反應器中由抽235進行核分裂之產物）、p輻射 (例如由諸如鱗32或碳14之放射性同位素發射）及紫外輕射 (較佳自2500至2900 nm);及化學突變劑，諸如鹼基類似物（例如5-溴-尿嘧啶）、相關化合物（例如8_乙氧基咖啡驗）、抗生素（例如鍵黑菌素（streptonigrin))、烧基化劑（例如硫芥、氮芥、環氧化物、伸乙*(ethyleneamine)、硫酸酯、磺酸酯、砜、内酯）、疊氮化物、羥胺、亞硝酸或吖啶。除草劑抗性植物亦可藉由使用組織培養方法以選擇包含除草劑抗性突變之植物細胞，接著自該等植物細胞再生除草劑抗性植物來產生。參見例如美國專利第5,773,7〇2號及第5,859,348號，兩者均以全文引用的方式併入本文中。突變育種之其他詳情可見於「Principals 〇f Cumvar Development, Fehr, 1993 Macmillan Publishing c〇mpany 中，其揭示内容以引用的方式併入本文中。除以上定義外，術語「植物」亦意欲涵蓋處於任何成熟或發育階段之作物，以及自任何此植物獲取或源於任何此植物之任何’沮織或器g (植物部分），除非上下文另外明確指示。植物部》包括（但不限於）莖、根、花、胚珠 (〇VUle)、雄蕊、葉、胚、分生組織區、癒合組織、花藥培養物、配子體、抱子體、花粉、小抱子、原生體及其類似物。本發明植物包含至少—種mut-HPPD核酸或過度表現之野生型HPPD核酸’且相較於野生型種類之植物，對香豆酮衍生性除草劑之耐受性增進。本發明植物有可能具有多 155885.doc

S •74- 201144441 個來自不同基因組之野生型或mut-HPPD核酸，因為此等植物可含有1個以上基因組。舉例而言’植物含有兩個基因組’通常稱為A基因組及B基因組。因為HPPD為所需之代謝酶’所以假定各基因組皆具有至少一種編碼HPPd酶之基因（亦即至少一種HPPD基因）。如本文所用，術語「HPPD基因座」係指HPPD基因在基因組上之位置，且術語「HPPD基因」及「HPPD核酸」係指編碼HPPD酶之核酸。各基因組上之HPPD核酸的核苷酸序列與另一基因組上之HPPD核酸不同。熟習此項技術者可經由熟習此項技術者已知之遺傳雜交及/或定序方法或外切核酸酶消化方法確定各HPPD核酸之起源基因組。本發明包括包含1、2、3或3個以上mut-HPPD對偶基因之植物，其中相較於野生型種類之植物，該植物對香豆酮何生性除草劑之耐受性增進。mut_HPPDa偶基因可包含選自由以下組成之群之核苷酸序列：*SEQ ID N〇: i、 SEQIDN0: 3或SEQIDN0: 5中定義之聚核苷酸或其變異體或衍生物；編碼如SEQ ID NO: 2、SEQ ID N〇: 4、或 SEQ ID NO: 6 ' 11、12、13、14、 15 、 16 、 17 ' ' 18、19 申

至少60個連續核苦酸之聚核芽酸；及與任何以上提及之聚核苷酸互補之聚核苷酸。

相同染色體位置處之替代形式。異體」為既定基因之位於對偶基因變異體涵蓋單核 155885.doc -75· 201144441 苦酸多形現象（SNP)以及小插人/缺失多形現象（indel)。 INDEL之大小通常為小於⑽bp。SNp及_弘形成大多數生物之天然存在多形性株系中之最大序列變異體組。術語「種類」係指某一物種内之藉由共有一組共同特徵或性狀而定義的-組植物’該等特徵或性狀由熟習此項技術者接受為足以區分栽培品種或種類與另一栽培品種或種類。在任-術語中皆不暗示任何既定栽培品種或種類之所有植物將在整個基因或分子層面上遺傳一致或任何既定植物將在所有基因座處為同種接合。若當不分離栽培品種或種類自花受粉時，所有子代皆含有某一性狀，則該栽培品種或種類針對該特定性狀而言視為「不分離㈣

Ceding」。術語「育種株系」或「株系」係指某一栽培品種内藉由共有-組共同特徵或性狀而定義的一組植物該等特徵或性狀由熟習此項技術者接受為足以區分i個育種株系或株系與另-育種株系或株系。在任_術語中皆不暗示任何既定育種株系或株系之所有植物將在整個基因或分子層面上遺傳-致或任何既定植物將在所有基因座處為同㈣合1當不分離株系或育種株系自花受粉時，所有子代皆含有某-性狀，則該育種株系或株系針對該特定性狀. 而言視為「不分離」。在本發明中，性狀係由於植物或種子之HPPD基因中之突變產生。包含編碼咖-HPPD及/或_.咖多肽之聚核㈣之本發明的除草劑抗性植物亦可用於經由涉及有性繁殖之習知植物育種來增進植物之除草劑抗性的方法中。方法包含使 155885.doc

S -76 - 201144441 作為本發明之除草劑抗性植物之第一植物與可或可不對虫第-植物相同之除草劑具有抗性或可對不同於第一植物^ 除草劑具有抗性的第二植物雜交。第二植物可為在盘第一植物雜交時能夠產生有活力子代植物（亦即種子）之任何植物。通常但並非必定，第一植物與第二植物之物種相同。方法可視情況涉及選擇包含第_植物之細撕d及/或細-HST多肽及第：植物之除草劑抗性特徵的子代植物。當與第-或第：植物之任__者或兩者比較時，藉由此本發明方法產生之子代植物對除草劑之抗性增進。當第一及第二植物對不同除草劑具有抗性肖，子代植物將具有第一及第二植物之組合除草劑耐受性特徵。纟發明方法可另外涉及使第一雜交種（cross)之子代植物與株系或基因型與第一或第一植物之任一者相同的植物回交一或多代。或者，第一雜交種或任何隨後雜交種之子代可與株系或基因型不同於第一或第二植物之第三植物雜交。本發明亦提供經至少種本發明之聚核苷酸分子、表現卡匣或轉型載體轉型的植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子及非人類宿主細胞。此等經轉型植物、植物器官、植物組織、植物細胞、種子及非人類宿主細胞在分別殺傷未轉型植物、植物組織、植物細胞或非人類宿主細胞或抑制其生長之除草劑含量下對至少一種除草劑具有增進之耐受性或抗性。較佳地’本發明之經轉型植物、植物組織、植物細胞及種子為擬南芥及作物。應瞭解除mut-HPPD核酸外，本發明植物亦可包含野生 155885.doc •77· 201144441 型HPPD核酸。意欲香豆酮衍生性除草劑耐受性株系可僅在多個HPPD同功酶之一者中含有突變。因此，本發明包括除一或多種野生型HPPD核酸外亦包含一或多種mut_ HPPD核酸之植物。在另一實施例中，本發明涉及由包含本發明之植物細胞之轉殖基因植物產生的種子，其中該種子為對香豆酮衍生性除草劑之抗性高於野生型種類種子之純品系種子。在另一實施例中，本發明涉及產生相較於野生型種類之植物細胞，對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進之轉殖基因植物細胞的方法，其包含用包含mut-HPPD核酸之表現卡匣轉型植物細胞。在另一實施例中，本發明涉及產生轉殖基因植物之方法，其包含：（a)用包含mut-HPPD核酸之表現卡匣轉型植物細胞，及（b)自該植物細胞產生對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進之植物。因此，本發明之mut-HPPD核酸提供於表現卡匣中以在相關植物中表現。卡E將包括可操作地連接於本發明之 mut-HPPD核酸序列之調控序列。如本文所用之術語「調控元件」係指能夠調控經可操作地連接之聚核苷酸之轉錄的聚核苷酸。其包括（但不限於）啟動子、增強子、内含子、5’ UTR及3, UTR。就「可操作地連接」而言，其意欲啟動子與第二序列之間的功能性連接，其中啟動子序列起始且介導對應於第二序列之DNA序列的轉錄。一般而言，可操作地連接意謂所連接之核酸序列為鄰接的，且當需要 •78· 155885.doc

201144441 接合兩個蛋白質編碼區時，為鄰接的且位於同一閱讀框架中卡匣可另外含有至少一種欲共轉型入生物中之其他基因。或者，其他基因可提供在多個表現卡匣上。該種表現卡E具有用於插入mut_HppD核酸序列以受調控區轉錄調控之複數個限制位點。表現卡匣可另外含有可選擇標記基因。表現卡匣將以5，-3,轉錄方向包括在植物中具有功能之轉錄及轉譯起始區（亦即啟動子）、本發明之mUt_HppD核酸序列、及轉錄及轉譯終止區（亦即終止區）。對於植物宿主及/ 或本發明之mut-HPPD核酸序列而言，啟動子可為天然或類似、或外源或異源啟動子。另外，啟動子可為天然序列或者合成序列。當啟動子對於植物宿主而言為「外源」或「異源」啟動子時，意欲啟動子未見於引入該啟動子之天然植物中。當啟動子對於本發明之mut-HppD核酸序列而 §為「外源」或「異源」啟動子時，意欲啟動子對於可操作地連接之本發明之mut_HpPD核酸序列而言不為天然或天然存在之啟動子。如本文所用，嵌合基因包含可操作地連接於對編碼序列而言為異源之轉錄起始區的編碼序列。儘管可能較佳使用異源啟動子表現本發明之mut_HPpD 核酸，但可使用天然啟動子序列。此等構築體將改變植物或植物細胞中mut-HPPD蛋白質之表現量。因此，植物或植物細胞之表型經改變。終止區可與轉錄起始區同為天然的，與相關可操作地連接之mut-HPPD序列同為天然的，與植物宿主同為天然 155885.doc •79· 201144441 的，或可源於另一來源（亦即對於啟動子、相關mut_HPPD 核酸序列、植物宿主或其任何組合而言為外源或異源的）。適宜終止區可自根癌農桿菌之Ti質體獲得，諸如章魚胺酸合成酶及胭脂胺酸合成酶終止區。亦參見Guerineau 專人（1991) Mol. Gen· Genet. 262: 141-144 ; Proudfoot (1991) Cell 64.671-674，Sanfacon 等人（1991) Genes Dev. 5: 141-149 ; Mogen 等人（1990) Plant Cell 2: 1261-1272 ; Munroe 等人（1990) Gene 91: 151-158; Balias 等人（1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 ;及 Joshi Λ [alpha]/· (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639。適當時，基因可經最佳化以增加經轉型植物中之表現。亦即可使用植物偏好密碼子合成基因以改良表現。關於宿主偏好密碼子使用之論述，參見例如 Campbell 及 Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11。用於合成植物偏好基因之方法在此項技術中可用。參見例如美國專利第5,380,83 1號及第5,436,391號、及 Murray 等人（1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498，該等專利及文獻以引用的方式併入本文中。已知其他序列修飾可增強細胞宿主中之基因表現。此等序列修飾包括消除編碼虛假聚腺苷酸化信號、外顯子-内含子剪接位點信號、轉座子樣重複序列的序列及可能不利於基因表現之其他此等經充分表徵之序列。可將序列之G-C含量調整至既定細胞宿主之平均含量，如藉由參考宿主細胞中表現之已知基因所計算。可能時，修飾序列以避免預測之髮夾二級mRNA結構。增強基因表現之核苷酸序列 155885.doc • 80 - 201144441 亦可用於植物表現載體中。此等核苷酸序列包括玉米Adhl 内含基因之内含子（Callis等人Genes and Development 1: 1183-1200，1987)、及來自於草嵌紋病毒（Tobacco Mosaic virus，TMV)、玉米褪綠斑驳病毒（Maize Chlorotic Mottle Virus)及苜蓿嵌紋病毒（Alfalfa Mosaic Virus)之前導序列 (W序列）（Gallie等人Nucleic Acid Res. 15:8693-8711，1987 及 Skuzeski 等人 Plant Mol. Biol. 15:65-79，1990)。來自玉米之shrunken-1基因座之第一内含子已顯示可增加嵌合基因構築體中基因之表現。美國專利第5,424,412號及第 5,593,874號揭示在基因表現構築體中使用特定内含子，且

Gallie 等人（Plant Physiol. 106:929-939，1994)亦已證明内含子適用於調控組織特異性基礎上的基因表現。為了進一步增強或最佳化mut-HPPD基因表現，本發明之植物表現載體亦可含有包含基質附著區（matrix attachment region ， MAR)之DNA序列。接著’經此等經修飾之表現系統轉型之植物細胞可展現本發明核苷酸序列之過度表現或組成性表現。表現卡匣可另外在表現卡匣構築體中含有51前導序列。此等前導序列可起增強轉譯之作用。轉譯前導序列在此項技術中為已知的且包括.小核糖核酸病毒（pic〇rnavirus)前導序列，例如EMCV前導序列（腦心肌炎病毒5，非編碼區 KElroy-Stein 等人（1989) Pr〇c· Natl. Acad· ScL USA 86:6126-6130);馬鈐薯Y病毒（p〇tyvirus)前導序列，例如 TEV則導序列（菸草蝕刻病毒（T〇bacc〇以化virus))(Ga出e 155885.doc 81 201144441 等人（1995) Gene 165(2):233-238)、MDMV前導序列（玉米矮花葉病病毒（Maize Dwarf Mosaic Virus))(Virology 1 54:9-20)、及人類免疫球蛋白重鍵結合蛋白（BiP)(Macejak等人 (1991) Nature 353:90-94);來自苜蓿嵌紋病毒之鞘蛋白 mRNA之未轉譯前導序列（AMV RNA 4)(J〇bling等人（1987) Nature 325:622-625);菸草嵌紋病毒前導序列 (TMV)(Gallie 等人（1989)，Molecular Bi〇1〇gy 〇f RNA， Cech編（Liss，New York)，第237-256頁）；及玉米视綠斑驳病毒前導序列（MCMV)(Lommel 等人（1991) vir〇l〇gy 81:382-385)。亦參見 Della-Cioppa 等人（1987) plant Physiol. 84:965-968。亦可利用已知增強轉譯之其他方法，例如内含子及其類似方法。在製備表現卡匣時，可操作各種DN A片段以便提供呈適當定向及適當時於適當閱讀框架中之DNA序列。為此’可採用銜接子（adapter)或連接子以接合DNA片段’或可涉及其他操作以提供適宜限制位點、移除多餘DNA、移除限制位點或其類似目的。出於此目的，可涉及活體外突變誘發、引子修復、限制（restriction)、黏接、再取代’例如轉變（transition)及顏換（transversion)。許多啟動子可用於實施本發明。可基於所要結果選擇啟動子。核酸可與組成性、組織偏好性或其他啟動子組合以表現於植物中。此等組成性啟動子包括例如Rsyn7啟動子之核心啟動子及揭示於WO 99/43838及美國專利第 6,072,050號中之其他組成性啟動子；核心CaMV 35S啟動 155885.doc • 82 · 201144441 子（Odell 等人（1985) Nature 313:810-812);稻肌動蛋白 (actin)(McElroy 等人（1990) Plant Cell 2: 163-171);泛素 (ubiquitin)(Christensen等人（1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 及 Christensen 等人（1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU(Last 等人（1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588) ; MAS(Velten 等人（1984) EMBO J. 3:2723-2730)； ALS啟動子（美國專利第5,659,026號）；及其類似啟動子。其他组成性啟動子包括例如美國專利第5,608,149號；第 5,608，144 號；第 5,604,121 號；第 5,569,597 號；第 5,466,785 號；第 5,399,680 號；第 5,268,463 號；第 5,608，142號；及第 6，177,611 號。組織偏好性啟動子可用於靶向特定植物組織内之增強的 mut-HPPD表現。此等組織偏好性啟動子包括但不限於葉偏好性啟動子、根偏好性啟動子、種子偏好性啟動子及莖偏好性啟動子。組織偏好性啟動子包括Yamamoto等人 (1997) Plant J. 12(2):255-265 ; Kawamata等人（1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803 ; Hansen等人（1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343 ; Russell等人（1997) Transgenic Res· 6(2): 157-168; Rinehart 等人（1996) Plant Physiol. 112(3): 133 1-1341 ； Van Camp 等人（1996) Plant Physiol. 1 12(2):525-535 ; Canevascini 等人（1996) Plant. Physiol. 112(2):513-524 ; Yamamoto 等人（1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778 ； Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco等人（1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129- 155885.doc -83 - 201144441 1138 ； Matsuoka e/[alpha]/. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 ;及 Guevara-Garcia 等人（1993) Plant J. 4(3):495-505。必要時，此等啟動子可經修飾以達成較弱表現。在一實施例中，相關核酸乾向葉綠體以達成表現。以相關核酸不直接插入葉綠體中之此方式，表現卡匣將另外含有葉綠體把向序列，該序列包含編碼葉綠體轉運肽（transit peptide)之核苷酸序列以將相關基因產物導向葉綠體。此等轉運肽在此項技術中為已知的。就葉綠體乾向序列而言，「可操作地連接」意謂編碼轉運肽之核酸序列（亦即葉綠體靶向序列）與本發明之mut-HPPD核酸連接以使兩個序列鄰接且位於同一閱讀框架中。參見例如v〇n

Heijne等人（1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 ; Clark 等人（1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550 ; Della-Cioppa 等人（1987) Plant Physiol. 84:965-968 ; Romer 等人（1993)

Biochem. Biophys. Res_ Commun. 196:1414-1421 ;及 Shah 等人（1986) Science 233:478-481。此項技術中已知之任何葉綠體轉運肽皆可藉由使葉綠體靶向序列可操作地連接於編碼本發明之成熟mut-HPPD蛋白之核苷酸序列的5,端而與本發明之成熟mut-HPPD蛋白的胺基酸序列融合。葉綠體靶向序列在此項技術中為已知的且包括核酮糖-丨，5•二礙酸羧基酶（Rubisco)之葉綠體小次單元（de Castro Silva Filho 等人（1996) Plant Mol. Biol. 30:769-780 ; Schnell 等人 (1991) J. Biol. Chem· 266(5):3335-3342) ; 5-(烯醇式丙酮醯）莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS)(Archer等人（1990) j •84· 155885.doc 201144441

Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810);色胺酸合成酶（Zhao 等人（1995) J. Biol· Chem. 270(11):608 卜 6087);質體藍素 (plastocyanin)(Lawrence 等人（1997) J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363);分支酸（chorismate)合成酶（Schmidt等人（1993) J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457);及光枚集葉綠素 a/b結合蛋白（LHBP)(Lamppa 等人（1988) J. Bi〇i. Chem. 263: 14996-14999)。亦參見 Von Heijne 等人（199i) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126 ; Clark等人（1989) J. Bi〇i. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa 等人（1987) Plant Physiol. 84:965-968 ; Romer等人（1993) Biochem. Bi〇phys

Res. Commun. 196: 1414-1421 ;及 Shah等人（1986) Science 233:478-481° 葉綠體轉型之方法在此項技術中為已知的。參見例如 Svab 等人（1990) Proc. Natl. Acad. ScL USA 87:8526-8530 ; Svab及 Maliga (1993) Proc. Natl. Acad· Sci. USA 90:9i3_ 917; Svab 及 Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606。方法依賴於粒子搶傳遞含有可選擇標記之DNA且經由同源重組使 DNA靶向質體基因組。另外，可藉由核編碼且質體導向之 RNA聚合酶之組織偏好性表現使靜止之質體承載轉殖基因轉錄活化來達成質體轉型。該種系統已報導於McBride等人（1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305 中。欲靶向葉綠體之相關核酸可針對於葉綠體中之表現加以最佳化以說明植物核與此細胞器之間的密碼子使用差異。以此方式，相關核酸可使用葉綠體偏好性密碼子合成。參見例 155885.doc -85- 201144441 如美國專利第5,380,83 1號，其以引用的方式併入本文中。在一較佳實施例中，mut-HPPD核酸⑷或则卜耶丁核酸 (b)包含選自由以下組成之群之聚核苦酸序列：a)如seq id NO: 1、3或5中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；b) 如SEQ ID NO: 7或9中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；c)編碼如SEQ ID NO : 2、4、6、8或10中所示之多肽之聚核苷酸，或其變異體或衍生物；d)包含任何a)至〇之至少60個連續核苷酸之聚核苷酸；及e)與任何a)至d)之聚核苷酸互補之聚核苷酸。較佳地，表現卡匣另外包含在植物中具有功能之轉錄起始調控區及轉譯起始調控區。儘管本發明之聚核苷酸用作植物轉型之可選擇標記基因，但本發明之表現卡ϋ可包括用於選擇經轉型細胞之另一可選擇標記基因。可選擇標記基因，包括本發明之彼等可選擇標記基因用於選擇經轉型細胞或組織。標記基因包括（但不限於）編碼抗生素抗性之基因，諸如編碼新黴素麟酸轉移酶II(neomycin phosphotransferase II; ΝΕΟ)及潮黴素鱗酸轉移酶（hygromycin phosphotransferase; HPT)之彼專基因，以及賦予對除草化合物’諸如草敍膊（glufosinate ammonium)、溴苯腈、咪哇琳酮及2,4-二氯苯氧乙酸酯 (2,4-D)之抗性之基因。通常參見丫&^1^〇11 (1992)(2111·!··

Opin. Biotech. 3 : 506-5 1 1 ; Christophers on 等人（1992) Proc. Natl· Acad. ScL USA 89:6314-6318 ; Yao 等人（1992)

Cell 71:63-72 » Reznikoff (1992) Mol Microbiol 6:2419- 155885.doc -86 - 201144441 2422; Barkley 等人（1980), The Operon，第 177-220 頁；Hu 等人（1987) Cell 48:555-566 ; Brown 等人（1987) Cell 49:603-612 ; Figge 等人（1988) Cell 52:713-722 ; Deuschle 等人（1989) Proc. Natl Acad. AcL USA 86:5400-5404; Fuerst 等人（1989) Proc. Natl Acad. ScL USA 86:2549-2553 ; Deuschle 等人（1990) Science 248:480-483 ; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg ; Reines 等人（1993) Proc. Natl Acad. ScL USA 90: 1917-1921 ; Labow 等人 (1990) Mol Cell Biol 10:3343-3356; Zambretti 等人（1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:3952-3956 ; Bairn等人（1991) Proc. Natl Acad· ScL USA 88:5072-5076 ; Wyborski 等人 (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653 ； Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol Struc. Biol 10: 143-162 ； Degenkolb 等人（1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591-1595 ; Kleinschnidt 等人（1988) Biochemistry 27: 1094-1104 ； Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen等人（1992) Proc. Natl Acad. ScL USA 89:5547-5551 ; Oliva 等人（1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919 ; Hlavka 等人（1985) Handbook of Experimental Pharmacology,第 78 卷（Springer-Verlag， Berlin); Gill等人（1988) Nature 334:721-724。此等揭示内容以引用的方式併入本文中。可選擇標記基因之以上清單不欲具有限制性。任何可選擇標記基因皆可用於本發明中〇 155885.doc -87 · 201144441 本發明另外提供包含含有如上所述则卜册印核酸之表現卡ϋ的經分離重組表現載體，其中該載體於宿主細胞中之表現導致相較於野生型種類之該宿主細胞，對香豆綱衍生性除草劑之耐受性增進。如本文所用，術語「載體」係才日月b夠轉運其已連接之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質體」，其係指可接合其他DNA區段之環狀雙股 DNA環。另一類型之载體為病毒載體，其中其他區段可接合於病毒基因組中。某些載體能夠在引入該等載體之伯主細胞中自主複製（例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體）。其他載體（例如非游離型哺乳動物載體）可在引入宿主細胞時整合於該宿主細胞之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其可操作地連接之基因之表現。此等載體在本文中稱為「表現載體」。一般而言，適用於重組DNA技術中之表現載體常呈質體形式。在本說明書中，「質體」與「載體」可互換使用，因為質體為最常用形式之載體。然而，本發明意欲包括起同等功能之諸如病毒載體（例如複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒）之此等其他表現載體形式。本發明之重組表現載體包含之本發明核酸的呈現形式適於在宿主細胞中表現該核酸’此意謂該等重組表現載體包括基於欲用於表現之宿主細胞來加以選擇之一或多種調抑序列’其可操作地連接於欲經表現之核酸序列。調控序列包括引導核苷酸序列在許多類型之宿主細胞中組成性表現 155885.doc -88 · 201144441 之調控序列及引導核苷酸序列僅在某些宿主細胞中或在某些條件下表現之調控序列。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計可視諸如欲轉型之宿主細胞之選擇、所要多肽之表現量等因素而定。本發明之表現載體可引入宿主細胞中以藉此產生由如本文所述核酸編碼之多肽或肽，包括融合多肽或肽（例如mut-HPPD多肽、融合多肽等）。在本發明之一較佳實施例中，mut-HPPD多肽表現於植物及植物細胞，諸如單細胞植物細胞（諸如藻類）（參見

Falciatore等人 ’ 1999，Marine Biotechnology 1(3):239-251 及其中之參考文獻）及高等植物之植物細胞（例如種子植物’諸如作物）中^ mut_HPPD聚核苷酸可藉由任何手段「引入」植物細胞中，手段包括轉染、轉型或轉導、電穿孔、粒子轟擊、農桿菌感染、基因搶及其類似手段。適用於轉型或轉染宿主細胞，包括植物細胞之方法可見於 Sambrook專人（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY, 1989)及其他實驗至手冊’諸如 Methods in Molecular Biology, 1995,第 44 卷 ’ Agrobacterium protocols, Gartland 及 Davey 編， Humana Press，Totowa, New Jersey中。因為增進之香豆 _ 衍生性除草劑耐受性為意欲遺傳進入廣泛多種植物（如玉米、小麥、黑麥、燕麥、黑小麥、稻、大麥、大豆、花生、棉彳t*、菜籽及齐花、木薯、胡椒、向曰葵及萬壽菊、站科植物（如馬鈴薯、菸草、茄子及蕃茄）、蠶豆屬（vicia 155885.doc •89· 201144441 species)、豌豆、紫花苜蓿、灌木植物（咖啡樹、可可樹、茶樹）' 柳屬（Salix species)、樹（油棕、椰子）、多年生草及飼料作物）中之一般性狀，所以此等作物亦為作為本發明之另一實施例之遺傳工程改造的較佳目標植物。在一較佳實施例中，植物為作物《飼料作物包括（但不限於）麥草 (Wheatgrass)、金絲雀草（Canarygrass)、無芒草（Bromegrass)、野麥草（Wildrye Grass)、藍草（Bluegrass)、果園草 (Orchardgrass)、苜蓿草（Alfalfa)、Salfoin、百脈根 (Birdsfoot Trefoil)、瑞典三葉草（Alsike Clover)、紅三葉草（Red Clover)及甜三葉草（Sweet Clover)。在本發明之一實施例中，藉由農桿菌屬介導之基因轉移將mut-HPPD聚核苷酸轉染入植物中。熟習此項技術者已知之一種轉型方法為將開花植物浸入農桿菌溶液中，其中該農桿菌含有mut-HPPD核酸，隨後進行經轉型配子育種。可使用例如 GV3101(pMP90)(Koncz 及 Schell，1986, Mol. Gen. Genet. 204:383-396)或 LBA4404(Clontech)根癌農桿菌菌株進行農桿菌屬介導之植物轉型。可藉由標準轉型及再生技術進行轉型（Deblaere等人，1994，Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788 ; Gelvin，Stanton Β·及Schilperoort，Robert A, Plant Molecular Biology Manual,第 2 版-Dordrecht : Kluwer Academic Publ., 1995.-in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4 ; Glick，Bernard R.及Thompson，John E.，

Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton : CRC Press，1993 360 S.，ISBN 0-8493-5164-2)。舉例而 15S88S.doc •90- 201144441 言，菜籽可經由子葉或下胚軸轉型加以轉蜇（M〇1〇ney等人，1989, Plant Cell Report 8:238-242 ; De Block等人’ 1989，Plant Physiol· 91:694-701)。用於農桿菌屬及植物選擇之抗生素之使用視用於轉型之雙元載體及農桿菌屬菌株而定。菜籽選擇通常使用康黴素作為可選擇植物標記來進行。可使用例如由Mlynarova等人，1994，Plant Cell Report 13:282-285所述之技術向亞麻轉移農桿菌屬介導之基因。另外，大豆之轉型可使用例如歐洲專利第0424 047 號、美國專利第5,322,783號、歐洲專利第0397 687號、美國專利第5,376,543號或美國專利第5,169,770號中所述之技術進行。玉米之轉型可藉由粒子轟擊、聚乙二醇介導之 DNA攝取，或經由碳化矽纖維技術達成。（參見例如 Freeling 及 Walbot 「The maize handbook」Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7)。玉米轉型之一特定實例可見於美國專利第5,990,387號中，且小麥轉型之一特定實例可見於PCT申請案第WO 93/07256號中。根據本發明，若引入之mut-HPPD聚核苷酸併入非染色體自主複製子中或整合入植物染色體中，則其可穩定維持於植物細胞中。或者，引入之mut-HPPD聚核苷酸可存在於染色體外非複製性載體上且經短暫表現或具有短暫活性。在一實施例中，可產生mut-HPPD聚核苷酸整合入染色體中之同源重組微生物，製備含有至少一部分HPPD基因之載體，在該HPPD基因中已引入缺失、添加或取代以藉此改變（例如在功能上破壞）内源性HPPD基因且產生mut- 155885.doc -91- 201144441 HPPD基因。為了經由同源重組產生點突變，DNA-RNA雜交體可用於稱為欲合修復（chimeraplasty)之技術中（Cole-Strauss等人，1999，Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 及 Kmiec，1999, Gene therapy American Scientist 87(3):240-247)。小麥屬中之其他同源重組程序在此項技術中亦為熟知的且意欲在本文中使用。在同源重組載體中，mut-HPPD基因可在其5'及3’端處由 HPPD基因之另一核酸分子側接以使在微生物或植物中發生由載體攜帶之外源性mut-HPPD基因與内源性HPPD基因之間的同源重組。另一側接HPPD核酸分子具有足夠長度以成功地與内源性基因同源重組。通常，在載體中包括側接DNA(在5’與3'端）之數百鹼基對直至數千鹼基對（參見例如 Thomas，K. R.及 Capecchi，M. R.，1987，Cell 51:503，其描述同源重組載體；或Strepp等人，1998，PNAS， 95(8):4368-4373，其關於小立碗蘚（Physcomitrella patens) 中基於cDNA之重組）。然而，因為mut-HPPD基因的極少胺基酸通常不同於HPPD基因，所以並非始終需要側接序列。同源重組載體引入微生物或植物細胞中（例如經由聚乙二醇介導之DNA)，且使用此項技術已知之技術選擇引入之mut-HPPD基因已與内源性HPPD基因同源重組之細胞。在另一實施例中，可產生含有使所引入基因之表現受調控之所選系統的重組微生物。舉例而言，在載體上包括 mut-HPPD基因且將該基因置於lac操縱子控制下會允許 155885.doc -92· 201144441 mut-HPPD基因僅wPTG存在下表現。此等調控系統在此項技術中為熟知的。本發明之另一態樣係關於已引入本發明之重組表現載體之佰主細胞。術語「宿主細胞」及「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。應瞭解此等術語不僅係指特定標的細胞而且其亦適用於該種細胞之子代或潛在子代。因為某些修飾可由於突變或環境影響而出現在後繼代中，所以此子代實際上可能不與母細胞相同，但仍然包括在如本文中所使用之術語之範疇内。宿主細胞可為任何原核或真核細胞。舉例而言，mut-HPPD聚核苷酸可表現於細菌細胞（諸如縠胺酸棒狀桿菌（C.g/wiamicww))、昆蟲細胞、真菌細胞或哺乳動物細胞（諸如中國倉鼠卵巢細胞（CH〇)或c〇S細胞）、藻類、纖毛蟲（ciliate)、植物細胞、真菌或其他微生物，如縠胺酸棒狀桿菌中。其他適合宿主細胞為熟習此項技術者所知。本發明宿主細胞’諸如培養之原核或真核宿主細胞可用於產生（亦即表現）mut-HPPD聚核苷酸。因此，本發明另外提供使用本發明宿主細胞產生mut-HPPD多肽之方法。在一實施例中’方法包含在適合培養基中培養本發明宿主細胞（其中已引入編碼mut-HPPD多肽之重組表現載體，或其基因組中已引入編碼野生型或mut-HPPD多肽之基因）直至產生mut-HPPD多肽。在另一實施例中，方法另外包含自培養基或宿主細胞分離mut_HPPD多肽。本發明之另一態樣係關於經分離mut-HPPD多肽及其生物活性部分。當藉 155885.doc -93- 201144441 由重組DNA技術產生時，「經分離」或「經純化」多肽或其生物活性部分不含一些細胞物質，當經化學合成時，其不含化學前驅體或其他化學物質。措辭「實質上不含細胞物質」包括mut-HPPD多肽之製備物’其中該多肽與天然或重組產生該多肽之細胞的一些細胞組分分離。在一實施例中，措辭「實質上不含細胞物質」包括mut_HppD多肽之製備物，其中非mut-HPPD物質（在本文中亦稱為「污染性多肽」）小於約30%(以乾重計）、更佳小於約2〇%、還要更佳小於約1 〇%、且最佳小於約5%。當重組產生mut-HPPD多肽或其生物活性部分時，其亦較佳實質上不含培養基，亦即培養基相當於小於約2〇%、更佳小於約10%、且最佳小於約5%之多狀製備物體積。措辭貫質上不含化學前驅體或其他化學物質」包括mut_ HPPD多狀之製備物，#中該多肽與該多肽之合成中涉及之化學前驅體或其他化學物質分離。在一實施例中，措辭「實質上不含化學前驅體或其他化學物質」包括刪_ HPPD多肽之製備物，#中化學前驅體或非化學物質小於約30%(以乾重計）、更佳小於約2〇%、還要更佳小於約屬、且最佳小於約5%。在較佳實施例中，經分離多狀或其生物活性部分缺乏來自獲得咖别叩多狀之同一生物之污染性多肽。通常，此等多肽係藉由例如在植物中或微生物（諸如榖胺酸棒狀桿菌、纖毛蟲、藻類或真菌）中重組表現mut-HPPD多肽產生。如上所述，本發明教示相較於野生型種類之植物或種 155885.doc •94- 201144441 子，增進作物或種子之香豆何生物耐跫性的組合物及方法。在一較佳實施例中，作你十你7 勿或種子之香豆酮衍生物耐受性得以增進以使植物或種物町又卞了耐受較佳約1-1000 g活性成分/公傾（ai ha·1)、更佳2〇〗 L , 更佳2〇-16〇“"，、且最佳4〇_8〇以香丑酮衍生性除草劑施用。如本文所用，「耐受」香豆酮衍生性除草劑施用音祁姑仏麟用忍明植物不因此施用而被殺傷或損傷。此外，本發明提供涉及使用豆酮衍生性除草劑的方法。至少一種如表2中描述之香在此等方法中’香豆酮衍生性王r生除单劑可藉由此項技術中已知之任何方法，包括丨但$ & & π ^ 、个限於）種子處理、土壤處理及葉處理施用。在施用之前，意- 飞香丑酮付生性除草劑可轉變成習用調配物，例如溶液、乳液、懸浮液、粉劑、散劑、糊劑及顆粒劑。使用形式視特定預定目的而定；在各情況下，應確保本發明化合物精細且均勻分佈。藉由提供對香豆㈣生性除草劑之耐受性增進之植物，廣泛多種調配物可絲保護植物免遭雜草損害，以便增強植物生長且降低對養分之料^豆酮衍生性除草劑可單獨用於出苗前、出苗後、種植前及種植時防治環繞本文所述作物之區域中的雜草，或可使用含有其他添加劑之香豆酮衍生性除草劑調配物。香豆酮衍生性除草劑亦可用作種子處理劑。可見於香豆崎生性除草_配物中之添加劑包括其他除草劑、清潔劑、佐劑、展佈劑、黏著劑、穩定劑或其類似物。香豆酮射性除草劑調配物可為濕潤或乾 155885.doc •95- 201144441 燥製劑且可包括（但不限於）可流動散劑、可乳化濃縮物及液體濃縮物。香豆酮衍生性除草劑及除草劑調配物可根據習知方法，例如藉由喷灑、灌溉、撒粉或其類似方法加以施用。適合調配物詳述於PCT/EP2009/063 3 87及PCT/EP2009/ 063386中，其以引用的方式併入本文中。亦應瞭解上文係關於本發明之較佳實施例且其中可在不脫離本發明之範疇的情況下作出眾多改變。本發明進一步由以下實例說明，該等實例無論如何皆不應解釋為對本發明之範疇強加限制。相反，應明確瞭解可採用其各種其他實施例、修改及等效物，在閱讀本文說明書之後，該等實施例、修飾及等效物可在不脫離本發明之精神及/或隨附申請專利範圍之範疇的情況下自身呈現於熟習此項技術者。實例

實例1 :選殖HPPD編碼基因 (A)選殖擬南芥HPPD 藉由標準PCR技術使用引子HuJIOl及HuJ102(表5)自擬南芥cDNA擴增部分擬南芥AtHPPD編碼序列（SEQ ID No: 1)。表5 :用於JiHPPD擴增之 PCR 引子（SEQ ID NO: 20、21)

引子名稱引子序列(51+ 31) HuJIOl GGCCACCAAAACGCCG HuJ102 TCATCCCACTAACTGTTTGGCTTC 155885.doc -96- 201144441 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體PEXP5-NT/TOPO®(Invitrogen, Carlsbad, USA)中。所得質體 pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP10加以分離。編碼N端帶His6標籤之AtHPPD之表現卡匣藉由DNA定序確認。 (B)選殖萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii)HPPDl 萊茵衣藻HPPDl(CrHPPDl)編碼序列（SEQ ID No: 3)針對於大腸桿菌中之表現加以密碼子最佳化且以合成基因 (Entelechon, Regensburg, Germany)形式提供。藉由標準 PCR技術使用引子Tal-Ι及Tal-2(表6)擴增部分合成基因。表 6 :用於CrHPPDl擴增之PCR引子（SEQ ID NO: 22、23)

引子名稱引子序列(5'+ 3') -1 Tal-1 GGCGCTGGCGGTGCGTCCACTAC ~~~ Tal-2 TCAAACGTTCAGGGTACGCTCGTAGTCTTCGATG 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體ρΕχρ5_ NT/TOPO®(Invitrogen, Carlsbad，USA)中。所得質體 pEXP5-NT/TOPO®-CrHPPDl係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP10加以分離。編碼N端帶His6標藏之 CrHPPDl之表現卡匣藉由DNA定序確認》 (C)選殖萊茵衣藻HPPD2 萊茵衣藻HPPD2(CrHPPD2)編碼序列（SEQ ID No: 5)斜對於大腸桿菌中之表現加以密碼子最佳化且以合成基$ (Entelechon，Regensburg，Germany)形式提供。藉由襟準 PCR技術使用引子Tal-3及Tal-4(表7)擴增部分合成基因。 155885.doc -97- 201144441

表7 :用於CrHPPD2 擴增之 PCR 引子（SEQ ID NO: 24、25) 引子名稱引子序列(5^ 3') Tal-3 GGTGCGGGTGGCGCTGGCACC Tal-4 TCAAACGTTCAGGGTACGTTCGTAGTCCTCGATGG 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體pEXP5-NT/TOPO®(Invitrogen，Carlsbad, USA)中。所得質體 pEXP5-NT/TOPO®-CrHPPD2係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP10加以分離。編碼N端帶His6標籤之 CrHPPD2之表現卡匣藉由DNA定序確認。

(D)選殖大豆HPPD 大豆HPPD(GmHPPD ; Glymal4g03410)編碼序列針對於大腸桿菌中之表現加以密碼子最佳化且以合成基因 (Entelechon，Regensburg, Germany)形式提供。藉由標準 PCR技術使用引子Ta2-65及Ta2-66(表8)擴增部分合成基因0 表8 :用於GmHPPD 擴增之 PCR 引子（SEQ ID NO: 26、27)

引子名稱引子序列σ +31) Ta2-65 CCAATCCCAATGTGCAACG Ta2-66 TTATGCGGTACGTTTAGCCTCC 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體奸义？5-NT/TOPO®(Invitrogen，Carlsbad, USA)中。所得質體 pEXP5-NT/TOPO®-GmHPPD係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌丁〇卩10加以分離。編碼1^端帶1^86標籤之〇11111??〇之表現卡匣藉由DNA定序確認。

(E)選殖玉米HPPD 155885.doc -98 - 201144441 玉米 HPPD(ZmHPPD ; GRMZM2G088396)編碼序列針對於大腸桿菌中之表現加以密碼子最佳化且以合成基因 (Entelechon, Regensburg，Germany)形式提供。藉由標準 PCR技術使用引子Ta2-45及Ta2-46(表9)擴增部分合成基因0 表 9 :用於ZmHPPD擴增之PCR引子（SEQ ID NO: 28、29)

引子名稱引子序列（5’今3’） Ta2-45 CCACCGACTCCGACCGCCGCAGC Ta2-46 TCAGGAACCCTGTGCAGCTGCCGCAG 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體？£乂卩5-NT/TOPO®(Invitrogen，Carlsbad, USA)中。所得質體 pEXP5-NT/TOPO®-ZmHPPD係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP10加以分離。編碼N端帶His6標籤之ZmHPPD之表現卡匣藉由DNA定序確認。

(F)選殖栽培稻HPPD 栽培稻HPPD(OsHPPD ; 0s02g07160)編碼序列針對於大腸桿菌中之表現加以密碼子最佳化且以合成基因 (Entelechon，Regensburg，Germany)形式提供。藉由標準PCR 技術使用引子Ta2-63及Ta2-64(表10)擴增部分合成基因。表 10 :用於 OsHPPD擴增之PCR引子（SEQ ID NO: 30、31)

引子名稱引子序列(5’+ 31) Ta2-63 CCGCCGACTCCAACCCC Ta2-64 TTAAGAACCCTGAACGGTCGG 根據製造商說明書將PCR產物選殖於載體ΡΕΧΡ5· NT/TOPO®(Invitrogen, Carlsbad, USA)中。所得質體 155885.doc 99- 201144441 pEXP5-NT/TOPO®-OsHPPD係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP10加以分離。編碼N端帶His6標籤之OsHPPD之表現卡匣藉由DNA定序確認。實例2:異源表現及純化重組HPPD酶於大腸桿菌中產生且過度表現重組HPPD酶。根據製造商說明書用PEXP5-NT/TOPO®(參見實例1)轉型化學勝任 BL21(DE3)細胞（Invitrogen, Carlsbad, USA)。經轉型細胞在37°C下生長於補充有100 pg/ml安比西林 (ampicillin)之 LB 培養液（Invitrogen，Carlsbad, USA)中。在不用IPTG(異丙基-D-1-硫代哌喃半乳糖苷）誘導之情況下使蛋白質表現。在OD600(600 nm下之光學密度）為4至5時，藉由離心 (8000xg)收集細胞。細胞小球再懸浮於補充有完全無 EDTA蛋白酶混合物（Roche-Diagnostics)之結合緩衝液（50 mM填酸納緩衝液，0.5 M NaCl，10 mM0米0坐，pH 7.0)中且使用Avestin Press均質化。藉由離心（20,000xg)使勻漿清澈。根據製造商說明書藉由於HisTrapTM HP管柱（GE Healthcare, Munich, Germany)上進行親和力層析來純化帶 His6標籤之HPPD或突變變異體《經純化HPPD或突變變異體相對於補充有10%甘油之100 mM磷酸鈉緩衝液（pH 7.0) 進行透析且儲存在-86°C下。根據Bradford使用Bio-Rad蛋白質檢定（Bio-Rad Laboratories，Hercules，USA)測定蛋白質含量。藉由SDS-PAGE估計酶製劑之純度》實例3 : HPPD活性之檢定 155885.doc 201144441 HPPD自4-羥苯基丙酮酸（4-HPP)及02產生尿黑酸及 C02。HPPD之活性檢定係基於藉由逆相HPLC分析尿黑酸。方法（A) 檢定混合物可含有150 mM磷酸鉀緩衝液（pH 7.0)、50 mM L-抗壞血酸、1 μΜ FeS〇4及7 pg經純化酶，總體積 1 ml 0 將抑制劑溶解於DMSO(二曱亞砜）中以分別獲得20 mM 或0.5 mM之濃度。自此儲備溶液用DMSO製備檢定中使用之5倍連續稀釋液。各別抑制劑溶液佔檢定體積之1%。因此，最終抑制劑濃度相應地在200 μΜ至2.5 nM或5 μΜ至63 ρΜ之範圍内。在預培育30分鐘之後，藉由添加4-ΗΡΡ以達到0.1 mM之最終濃度來開始反應。在室溫下使反應進行120分鐘。藉由添加100 μΐ 4.5 Μ磷酸使反應停止。在用63 mM磷酸預平衡之Oasis® HLB濾筒3 cc/60 mg(Waters)上提取樣品。用3 ml 63 mM構酸洗去L-抗壞血酸。尿黑酸用63 mM填酸與曱醇之1 ml 1:1 (w/w)混合物溶離。藉由使用5 mM H3P04/15°/〇乙醇（w/w)作為溶離劑於 Symmetry® C18 管柱（粒度 3.5 μηι，尺寸 4.6x100 mm ; Waters)上進行逆相HPLC來分析10 μΐ溶離液。尿黑酸經電化學偵測且藉由量測峰面積（Empower軟體； Waters)定量。 155885.doc -101 - 201144441 藉由將未受抑制之酶活性設定成100%來校正活性。使用非線性回歸計算IC50值。方法（B) 檢定混合物可含有150 mM磷酸鉀緩衝液（pH 7.0)、50 mM L-抗壞血酸、100 μΜ過氧化氫酶（匚3(&1336)(81层111汪-Aldrich)、1 μΜ FeS04及0_2單位經純化HPPD酶，總體積 505 μΐ。1單位定義為為在20°C下每分鐘產生1 nmol HGA 所需之酶量。在預培育30分鐘之後，藉由添加4-HPP以達到0.05 mM 之最終濃度來開始反應。在室溫下使反應進行45分鐘。藉由添加50 μΐ 4.5 Μ磷酸使反應停止。使用0.2 μΜ孔徑之 PVDF過濾裝置過濾樣品。藉由使用 90% 10 mM NaH2P04(pH 2.2)、10% 甲醇（ν/ν) 之等度溶離於Atlantis Τ3管柱（粒度3 μιη，尺寸3x50 mm ; Waters)上分析5 μΐ澄清樣品。 HGA係在750 mV(模式：DC ;極性：正性）下進行電化學债測且藉由對峰面積積分（Empower軟體；Waters)加以定量。將抑制劑溶解於DMSO(二甲亞砜）中以獲得0.5 mM之濃度。自此儲備溶液用DMSO製備檢定中使用之5倍連續稀釋液。各別抑制劑溶液佔檢定體積之1 %。因此，最終抑制劑濃度相應地在5 μΜ至320 pM之範圍内。藉由將未受抑制之酶活性設定成100%來校正活性。使用非線性回歸計算IC5G值。 155885.doc -102- 201144441 實例4 :活體外表徵野生型HPPD酶使用以上實例中描述或此項技術中熟知之方法表徵經純化重組野生型HPPD酶之動力學性質及對HPPD抑制性除草劑之敏感性》藉由非線性回歸，使用受質抑制模型，用軟體 GraphPad Prism 5(GraphPad Software, La Jolla，USA)計算表觀米氏常數（michaelis c〇nstant)(Km)及最大反應速度 (Vmax)。表觀kcat值由Vmax計算，假設酶製劑純度為ι〇〇%。

Km及ICso值之加權平均值（根據標準誤差）係根據至少3個獨立貫驗加以計算。競爭性抑制之Cheng-Prusoff等式（Cheng， Y- C.; Prusoff, w. η. Biochem Pharmacol 1973, 22, 3099- 3108)用於計算解離常數（Ki)。獲得之資料之實例描述於表 11中。

表11 :各種】催化效率(kc HPPD酶之關於4_hpp之升及解離常數ίΚΛ的沏 :氏常數(Km)、轉換數(kcat)、定結果酶 Km [μΜ】 (4-ΗΡΡ) kcat [S*1]* kcat/Km [μΜ·1 s，1] Kj [nM] (&制劑 Kj[nM] (抑制劑 2)** Ki [nM] (苯峻草明）芥菜屬 HPPD 13 12.91 (2.84) 1.00 3 13 4 衣藻屬 HPPD1 54 4.12(0.64) 0.08 29 139 38 衣藻屬 HPPD2 26 9.84 (0.71) 0.38 S n.d. n.d. *圓括號中為標準誤差實例中之「香豆酮衍生性除草劑」為3-[2,4-二氯-3-(3-甲基-4,5-二氫異噁。坐- 基]小似二敗乙基)·2,2-二側氧基-吡啶并[3,2-c]噻嗪-4-醇(抑制劑1)及3-(2,4-二气^基)-1-(2,2-二氟乙基)·2,2-二側氧基-吡啶并[3,2-c]噻嗪-4-醇(抑制劑2)[參見表2之第 13式J 由以上實例可見HPPD酶可選作對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性之酶，因為發現控管「香豆酮衍生性除草 155885.doc -103- 201144441 劑」自其與此HPPD酶之複合物解離的解離常數大於控管「香豆酮衍生性除草劑」自其與其他HPPD酶之複合物解離的解離常數。以上實例亦指示如衣藻屬HPPD1之所選HPPD酶尤其適用於本發明之情形中，因為對於「香豆酮衍生性除草劑」之解離常數大於如芥菜屬HPPD之其他HPPD酶的解離常數。顯然對香豆酮衍生性除草劑具有抗性之任何HPPD酶（即使此蛋白質未例示於此文本中）皆為本發明之標的物之一部分。此外，實例指示HPPD酶可選作對苯唑草酮具有抗性之酶，因為發現控管苯唑草酮自其與此HPPD酶之複合物解離的解離常數大於控管苯唑草酮自其與其他HPPD酶之複合物解離的解離常數。實例5 :合理突變誘發藉助於結構生物學及序列比對，有可能選擇發現涉及於「香豆酮衍生性除草劑」之結合中之某一數目的胺基酸，接著使其突變誘發並獲得耐受性HPPD酶。 (A)定點突變誘發根據製造商說明書用Quik-Change II定點突變誘發套組 (Stratagene，Santa Clara，USA)進行 pEXP5-NT/TOPO®-AtHPPD之基於PCR的定點突變誘發。此技術需要兩個化學合成DNA引子（正向及反向引子）以達成各突變。用於沿HPPD之定點突變誘發之引子列於表12中。 155885.doc -104- 201144441 表12 :用於AHPPD之定點突變誘發之PCR引子（SEQ ID NO: 32至 67) 引子名稱引子序列突變 ^/HPPD HuJ141 GAGGATTCGACTTCGCGCCTTCTCCTCC Met335 今 Ala HuJ142 GGAGGAGAAGGCGCGAAGTCGAATCCTC Met335 ^ Ala HuJ143 GAGGATTCGACTTCTGGCCTTCTCCTCCG Met335 ^ Trp HuJ144 CGGAGGAGAAGGCCAGAAGTCGAATCCTC Met335 ^ Trp HuJ145 GGAGGATTCGACTTCTTTCCTTCTCCTCCGC Met335 + Phe HuJ146 GCGGAGGAGAAGGAAAGAAGTCGAATCCTCC Met335 ^ Phe HuJ147 GTGACAGGCCGACGATAGCTATAGAGATAATCCAG Phe392 + Ala HuJ148 CTGGATTATCTCTATAGCTATCGTCGGCCTGTCAC Phe392 + Ala HuJ153 GACTTCATGCCTCCTCCTCCGCCTACTTAC Ser337 ^ Pro HuJ154 GTAAGTAGGCGGAGGAGGAGGCATGAAGTC Ser337 -> Pro HuJ155 GATTCGACTTCATGGCTTCTCCTCCGCCTAC Pro336 ^ Ala HuJ156 GTAGGCGGAGGAGAAGCCATGAAGTCGAATC Pro336 -> Ala HuJ157 CAGATCAAGGAGTGTCAGGAATTAGGGATTCTTG Glu363 + Gin HuJ158 CAAGAATCCCTAATTCCTGACACTCCTTGATCTG Glu363 Gin HuJ159 CGGAACAAAGAGGAAGAGTGAGATTCAGACGTATTTGG Gln293 ^ Val HuJ160 CCAAATACGTCTGAATCTCACTCTTCCTCTTTGTTCCG Gln293 + Val HuJ169 CGTTGCTTCAAATCTTCCCGAAACCACTAGGTGACAGGCC Thr382 -> Pro HuJ170 GGCCTGTCACCTAGTGGTTTCGGGAAGATTTGAAGCAACG Thr382 ^ Pro HuJ171 CAAATCTTCACAAAACCAGTGGGTGACAGGCCGACGAT Leu385 ^ Val HuJ172 ATCGTCGGCCTGTCACCCACTGGTTTTGTGAAGATTTG Leu385 -> Val HuJ173 TGACAGGCCGACGATATTTCTGGAGATAATCCAGAGAGTA IIe393 Leu HuJ174 TACTCTCTGGATTATCTCCAGAAATATCGTCGGCCTGTCA Ile393 + Leu HuJ175 GACTTCATGCCTGCGCCTCCGCCTACTTAC Ser337 -> Ala HuJ176 GTAAGTAGGCGGAGGCGCAGGCATGAAGTC Ser337 + Ala HuJ177 GGCAATTTCTCTGAGTTCTTCAAGTCCATTGAAG Leu427 + Phe HuJ178 CTTCAATGGACTTGAAGAACTCAGAGAAATTGCC Leu427 ^ Phe HuJ185 GGAACAAAGAGGAAGAGTGTGATTCAGACGTATTTGG Gln293 今 Val HuJ186 CCAAATACGTCTGAATCACACTCTTCCTCTTTGTTCC Gln293 -> Val Ta2-55 GAGGATTCGACTTCAACCCTTCTCCTCC Met335 + Asn Ta2-56 GGAGGAGAAGGGTTGAAGTCGAATCCTC Met335 Asn Ta2-57 GAGGATTCGACTTCCAGCCTTCTCCTCC Met335 Gin Ta2-58 GGAGGAGAAGGCTGGAAGTCGAATCCTC Met335 + Gin Ta2-59 GGAACAAAGAGGAAGAGTAACATTCAGACGTATTTGG Gln293 + Asn Ta2-60 CCAAATACGTCTGAATGTTACTCTTCCTCTTTGTTCC Gln293 + Asn Ta2-61 GGAACAAAGAGGAAGAGTCACATTCAGACGTATTTGG Gln293 -> His Ta2-62 CCAAATACGTCTGAATGTGACTCTTCCTCTTTGTTCC Gln293 ^ His 突變質體係藉由進行質體小量製備自大腸桿菌TOP 10分離且藉由DNA定序確認。藉由逐步突變誘發方法達成單一胺基酸取代之組合。 -105- 155885.doc 201144441 (B)活體外表徵芥菜屬HPPD突變體

藉由上述方法獲得經純化突變HPPD.。使用所述HppD 活性檢定進行劑量反應及動力學量測。藉由非線性回歸，使用受質抑制模型，用軟體GraphPad Prism 5(Graphpad

Software，La Jolla，USA)計算表觀米氏常數（michaeUs 最大反應速度（Vmax)。表觀匕“值由乂㈣^十算，假設酶製劑純度為100%。〖⑺及…以值之加權平均值 (根據標準誤差）係根據至少3個獨立實驗加以計算。競爭性抑制之 Cheng-Prusoff 等式（Cheng，γ. c ; Prus〇ff，w H Biochem Pharmacol 1973, 22’ 3099-3108)用於計算解離常數（K〇。獲得之資料之實例描述於表i3中。表13 :芥菜屬HPPD酶i 催化效率(k^/Km)及解® 思=之米氏常1^1^- 芥菜屬 HPPD 變異體 Κ„,[μΜ] (4-ΗΡΡ) kca, [s·1] * ^cat^Km (μΜΓ1 s1] Ki[nM] (抑制劑 1)1 2 Ki [nM] ‘制劑 2)2 Kj [nM] (苯唑草酮）野生型 13 12.91 (2.84) 1.00 3 13 4 Q293H 104 3.34 (115) 0.03 23 19 14 Q293N 56 0.81 (0.20) 0.01 41 44 36 M335N 112 7.62 (1.00) 0.07 20 n.d. n.d. M335Q 129 6.54 (0.70) 0.05 24 n.d. n.d· P336A E3630 37 12.27 (0.84) 0.33 13 n.d. n.d. L385V 36 7.07 (0.86) 0.20 19 n.d. n.d. I393L 46 9.23 (0.72) 0.20 21 n.d. n.d. 155885.doc • 106- 1 圓括號中為標準誤差 2 用於此研究中之Γ香豆酮衍生性除草劑」為3-P，4-二氣-3-(3-曱基-4,5-二氫異噁唑-5-基)苯基]-1-(2,2-二氟乙基)-2,2-二側氧基-吡啶并[3,24嘍°秦-4-醇(抑制劑1)及3-(2,4-二氣苯基)-1-(2,2-二氟乙基)-2,2-二側氧基-吡啶并[3,2-c]噻嗪__ 201144441 由以上實例可見突變HPPD酶可選作對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性之酶，因為發現控管「香豆嗣衍生性除草劑」自其與此HPPD突變體之複合物解離的解離常數大於控管「香豆酮衍生性除草劑」自其與野生型HppD酶之複合物解離的解離常數。以上實例亦指示如I393L、 L385V、或P336A E363Q之所選HPPD突變體尤其適用於本發明之情形t，因為相較於野生型酶，其催化效率 (kcat/Km)最大僅減小5倍。此外，實例指示突變HPPD酶可選作對苯唑草酮具有抗 f生之柄，因為發現控官苯β坐草酿j自其與HppD突變體之複合物解離的解離常數大於控管笨唑草酮自其與野生型 HPPD酶之複合物解離的解離常數。貫例6 .隨機突變誘發及篩檢藻類細胞以鑑別對「香豆酮衍生性除草劑」具有耐受性之純系及鑑別HppD/HST基因中之致病性突變（causative mutation) 模式為作用於質體醌或生育酚生物合成之漂白除草劑可抑制藻類生長（表14及15)。此等效應可由尿黑酸生物合成之中間物部分逆轉（表14)。為了產生賦予HppD或HST基因香丑酮衍生性除草劑」抗性之突變，可使用化學或紫外大變誘發。如萊茵衣藻或斜生柵藻之單細胞生物尤其適用於鑑別除草劑抗性方面之顯性突變。 155885.doc 107- 201144441 表14 : HPPD抑制性除草劑抑制萊茵衣蕩生長及尿黑酸之效應 --------------- - 化合物[表2之第1號、第2號] ----- c[M] 生長抑制[%] 萊茵衣藻(CC-503) +尿黑酸 c*ST (3-[4-乙炔基-2-(三氟甲基)苯基]-4-羥基-哌喃#丨3.2-bl吡啶-2-酮） 61 43 5X10"4 90 67 苯唑草酮 100 80 5xl(T 100 100 表15 :「香豆酮衍生性除草劑」抑制斜生柵藻生長化合物[表2之第1號、第2號] c[M] 生長抑制[%] 斜生柵薄 ΟάΧ (3-[4-乙炔基-2-(三氟甲基)苯基] -4-羥基-哌喃并[3,2-b]吡啶-2-酮） 1x10—3 77 lxlO·4 100 藉由在 100 rpm、22°c 及 30 μιηοΐ Photxm_2xs·2光照下十亙定振廬來於 TAP 培養基（Gorman 及 Levine (1965) PNAS 54: 1665-1669)中繁殖萊茵衣藻株系CC-503及CC-1691 (Duke University，Durham，USA)之藻類細胞。在與關於衣藻屬提及之條件相同之培養條件下，於如（B6ger及Sandmann， (1993)，Target assays for modern herbicides and related phytotoxic compounds，Lewis Publishers)所述藻類培養基中繁殖斜生柵藻（University of Gdttingen，Germany)。在 450 μηιοί Photxm_2xs_2照明下篩檢化合物。 155885.doc -108 · 201144441 如由 Loppes(1969，Mol Gen Genet 104: 172-177)所述，由萊茵衣藻或斜生柵藻之敏感株系（表14、15)用〇14 M甲烧磺酸乙酯（EMS)突變1小時。藉由於含有野生型致死濃度之「香豆嗣衍生性除草劑」或其他HPPD抑制性除草劑之固體培養液板上篩檢經突變誘發的細胞來鑑別耐受性株系。獲得之資料之實例描述於表16及圖2中。表16 :鑑別出之衣藻屬株系對「香豆酮衍生性除草劑」、苯唑草酮及曱基磺草酮之耐受性。描述生長抑制之IC5〇值[m〇1/1]。除草劑株系 CC1961 野生型 CMr04 CMr05 CMr06 CMrlO CMrl3 CMrl5 「香豆酮衍生性除草劑」1 (4-羥基-3-[2-曱基-3-(5-甲基>4,5-二氩異噁唑-3-基)-4-曱基磺醯基-苯基]哌喃并 [3,2-b]吡啶-2-明） [參見表2之第8號] 7.6X10·4 >l.〇xl〇·3 >1.〇χ1〇·3 >1·〇χ10·3 >1.〇χ1〇·3 9.5x1 θ'4 >1.〇χ10'3 「香豆明衍生性除草劑」2 (3-[2,4-二氣-3· (3-甲基·4,5-二氩異噁唑-5·基)苯基] -1-(2,2-二氟乙基） -2,2-二側氧基· 吼啶并[3,2-c]嘍嗪 •4·醇） [參見表2之第13號] 6.2X10·4 >l.〇xl〇·3 >1.〇χ1 Ο*3 >1.〇χ10·3 >1.0x10'3 8.1 χΙΟ·4 >1.〇χ1〇·3 甲基磺草酮 3.0x10'5 >6.〇xl O'4 >6.〇χ1〇·4 >6.〇χ1 Ο·4 4.5Χ10·4 >6.0x10-4 5.4χΗΤ* 苯唑草酮 1.4X10·4 3.9x1ο·4 7.1 χΙΟ·4 8.6Χ10·4 9.2Χ10·4 2.0x1ο·4 2.3 χΙΟ·4 由以上實例可見經突變誘發之衣藻屬株系可選作對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性之株系，因為發現於含有 -109- 155885.doc 201144441 「香豆酮衍生性除草劑」之培養基上選出之經突變誘發株系相較於野生型株系，其IC50值較高且因此生長抑制較小〇此外，實例指示經突變誘發之衣藻屬株系可選作對如甲基磺草酮或苯唑草酮之其他HPPD抑制性除草劑具有抗性之株系，因為發現於含有此等除草劑之培養基上選出之經突變誘發株系相較於野生型株系，其IC50值較高且因此生長抑制較小。以上實例亦指示所選突變體展示對抗所有測試化合物之高耐受性程度或廣泛交叉抗性（例如CMr06)。藉由標準PCR技術用如表17中所列之DNA寡核苷酸自作為模板之基因組DNA或複本DNA擴增來自野生型及抗性萊茵衣藻之HPPD及HST基因。DNA寡核苷酸源於SEQ ID NO: 3、5及7。所得DNA分子選殖於標準定序載體中且藉由標準定序技術加以定序。藉由用序列比對工具Align X(Vector NTI 高級軟體第 10.3 版，Invitrogen，Carlsbad, US A)比較野生型與突變HPPD/HST序列來鑑別突變。表17 :用於擴增OHPPD1、OHPPD2及OUST之PCR引子 (SEQ ID NO: 68至 73)

引子名稱引子序列(5’-3〇 Cr HPPD1 Fw ATGGGCGCTGGTGGCGCTTCTAC Cr HPPD1 Rv CTACACATTTAGGGTGCGCTCATAGTCC Cr HPPD2 Fw ATGGGAGCGGGTGGTGCAGGCAC Cr HPPD2 Rv TTAAACATTTAAGGTGCGCTCATAGTCCTC Cr HST Fw ATGGACCTTTGCAGCTCAACTGGAAG Cr HST Rv GTACGCGCTGCTGCCGTTCCTGTAG 獲得之資料之一實例描述於表18中。 I55885.doc -110- 201144441 表18 :於「香豆酮衍生性」除草劑耐受性衣藻屬株系 CMrl5中鑑別出之CrHPPD2突變株系突變(核苷酸交換）胺基酸交換 CMrl5 G1252A(於SEQIDNo: 5 中） A418T(於SEQ ID NO: 6 中為了自斜生栅藻鑑別直系同源HPPD及HST基因’分別基於HPPD或HST之蛋白質比對（圖1A及B)自保守區確定簡併PCR引子。HPPD之正向引子係自共同序列R-K-S-Q-I-Q· T(表 19A)或 S-G-L-N-S-A/M/V-V-L-A(表 19B)產生，反向引子係源於共同序列 Q-(I/V)-F-T-K-P-(L/V)(表 19A)或 C-G-G-F-G-K-G-N-F(表19B)。HST之正向引子係自共同序列W-K-F-L-R-P-H-T-I-R-G-T產生，反向引子係源於共同序列F-Y-R-F/W-I_W-N-L-F-Y-A/S/V(表 19)。基於接受之HPPD/HST 基因序列標籤，藉由如由Liu及Whittier(1995, Genomics 25: 674-681)及Yuanxin等人（2003 Nuc Acids Research 31: 1-7)或 Spertini 等人（1999 Biotechniques 27: 308-314)所述銜接子PCR或TAIL PCR技術於複本DNA或基因組DNA上完成蛋白質編碼序列。表19A :用於部分擴增SoHPPD之PCR引子（SEQ ID NO: 74 至77)

引子名稱引子序列(5'-3’） So Deg HPPD Fw MGBAARWSYCAGATYCAGAC So Deg HPPD Rv ASIGGYTTIGTRAAVAYCTG So Deg HST Fw TGGMGNTTYYTNMGNCCNCAYACNATHMG So Deg HST Rv YTCNGCNNHRAANARRTTCCADATVMANC 其中So_Deg_HPPD_Rv中之「I」代表肌醇但亦可為任何核皆酸 a、g、t、c。 155885.doc • 111 - 201144441 表19B :用於部分擴增SoHPPD之PCR引子（SEQ ID NO: 78 至81)

引子名稱引子序列(5’-3’） So Deg HPPD Fw2 WSNGGNYTNAAYWSNRYNGTNYTNGC So Deg HPPD Rv2 RAARTTNCCYTTNCCRAANCCNCCRC So Deg HST Fw2 TGGMGNTTYYTNMGNCCNCAYACNATHMG So Deg HST Rv2 YTCNGCNNHRAANARRTTCCADATVMANC 實例7 篩檢經EMS突變誘發之擬南芥群體以鑑別除草劑耐受性植物及鑑別HPPD/HST基因中之致病性突變經EMS處理之擬南芥植物之M2群體係自Lehle Seeds(Round Rock，TX，USA)獲得。藉由將芥菜屬種子塗佈於一半濃度之含有0.5%凝膠劑Gelrite®及視化合物活性而定0.1至100 μΜ之香豆酮衍生性除草劑的murashige skoog培養液上來進行篩檢。在22°C下以16:8小時之光照：黑暗循環於生長室中培育各板多達3週。展示不太強烈漂白表型之耐受性植物種植於土壤中且在溫室條件下生長至成熟。在叢葉植物階段中，自香豆酮衍生性除草劑耐受性植物收集葉盤以用於用DNeasy植物小型套組（Qiagen， Hilden，Germany)分離基因組DNA或用RNeasy植物小型套組（Quagen，Hilden，Germany)分離總 mRNA。HPPD 或 HST 序列係藉由標準PCR技術用如表11中所述之各別寡核苷酸自基因組DNA擴增。對於自mRNA擴增HPPD或HST，用 Superscript III逆轉錄酶（Invitrogene，Carlsbad，CA，USA) 合成複本DNA且用表11中所列之DNA寡核苷酸擴增HPPD 或HST。在將PCR產物選殖於標準定序質體中之後，藉由 155885.doc •112· 201144441 標準定序技術鑑別突變HPPD/HST基因之DNA序列。藉由用序列比對工具Align X(Vector NTI高級軟體第10.3版， Invitrogene, Carlsbad, CA, USA)比較野生型與突變 HPPD/HST序列來鑑別突變。表20:用於擴增AHPPD及AHST之PCR引子（SEQ ID NO: 82至 85)

引子名稱引子序列(5’-3〇 At HPPD Fw ATGGGCCACCAAAACGCCGC At HPPD Rv TCATCCCACTAACTGTTTGGCTTCAAG At HST Fw ATGGAGCTCTCGATCTCACAATC At HST Rv CTAGAGGAAGGGGAATAACAGATACTC 實例8 製備表現異源HPPD及/或HST酶且對「香豆酮衍生性除草劑」具有耐受性之植物產生穩定轉型植物之各種方法係此項技術中已熟知的方法。香豆酮衍生性除草劑对受性大豆（大豆（Glycine max)) 植物可藉由Olhoft等人（美國專利2009/0049567)所述之方法產生。簡而言之，使用如由Sambrook等人（Molecular cloning (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述之標準選殖技術，將HPPD或HST編碼聚核苷酸選殖入雙元載體中。最終載體構築體含有侧接有啟動子序列（例如泛素啟動子（PcUbi)序列）及終止子序列（例如胭脂胺酸合成酶終止子（NOS)序列）及抗性標記基因卡匣（例如AHAS)的 HPPD或HST編碼序列（圖3)。視情況，HPPD或HST基因可成為選擇之手段（means)。採用農桿菌屬介導之轉型法將 DNA引入幼苗外植體之主要節點（primary node)處的大豆 155885.doc -113- 201144441 腋生分生組織細胞中。在接種且與農桿菌一起共培養之後’將外植體轉移至無選擇物之芽誘導培養基中，持續1 週。外植體隨後轉移至含有1-3 μΜ滅草終（Arsenal)之芽誘導培養基中，持續3週，以選擇經轉型細胞。取在主要節點處具有健康癒合組織/芽墊（shoot pad)之外植體接著轉移至含有1-3 μΜ滅草菸之芽伸長培養基中，直至芽伸長或外植體死亡。在再生之後’將轉型體移植至於小盆中之土壞中，置放於生長室（白天16小時/夜晚8小時；白天25°C/夜晚23 C，650/〇相對濕度；130-150 mE m·2 s_1)中且隨後經由 Taqman分析測試T_DNA之存在。在數週之後，取健康轉殖基因陽性單一複製本移植至較大盆中且使其在生長室中生長。藉由McElver及Singh(W0 2008/124495)描述之方法轉型玉米植物。經由農桿菌屬介導之轉型法係將含有HPPd或 HST序列之植物轉型載體構築體引入玉米不成熟胚中。於補充有0.5-1 ·5 μΜ咪草菸之選擇培養基中選擇經轉型細胞 3-4週。轉殖基因小苗於植物再生培養基上再生且此後生根。轉殖基因小苗針對轉殖基因之存在性進行TacjMan分析’隨後移植至盆栽混合物中且於溫室中生長至成熟。藉由如由McElver及Singh(W0 2008/124495)描述之花浸潰法，用HPPD或HST序列轉型擬南芥。栽培稻加/叫（稻）之轉型係如由peng等人（us 6653529)描述’採用原生體轉型法進行。於溫室研究中測試大豆、玉米、稻及擬南芥之含有 155885.doc 114 201144441 HPPD或HST序列之το或T1轉殖基因植物對「香豆酮衍生性除草劑」之改良的时受性。實例9 :溫室實驗於溫室實驗中測試表現異源HPPD或HST酶之轉殖基因植物對抗香豆酮衍生性除草劑之耐受性。對於出苗前處理’在播種之後藉助於精細分佈喷嘴直接施用除草劑。容器經溫和灌溉以促進發芽及生長且隨後用透明塑膠罩覆蓋直至植物已生根。除非此覆蓋物已由除草劑損壞，否則此覆蓋物會導致測試植物均一發芽。對於出苗後處理’視植物習性而定，首先使測試植物生長至3至15 cm之尚度，接著僅用除草劑處理。出於此目的’測試植物經直接播種且在相同容器中生長，或首先使其分別生長且在處理前幾天移植入測試容器中。對於T0植物之測试，可使用插條（cutting)。在大豆植物之情況下，用於插條之最佳芽為約7 5至1〇 cm高，且存在至少兩個節。各插條皆取自原始轉型體（母本植物）且浸入生根激素粉末（，哚-3-丁酸’ IBA)中。插條接著置放於生物圓頂室（bio-dome)内部之綠洲楔（〇asis wedge)中。亦同時獲取野生型插條來充當對照。插條在生物圓頂室中保持 5-7天，接著移植至盆中，接著再適應生長室環境2天。隨後，插條經轉移至溫室中，適應約4天，接著經受如所指示之喷灑測試。視物種而定，植物保持在l〇_25t或2〇_35{>(：下。測試期延續3週。在此時間期間，植物經照料且評估其對個別處 155885.doc •115· 201144441 理劑之反應。在處理之後2週及3週評估除草劑損傷。以〇至9之量表對植物損傷進行評級，其中〇為無損傷且9為完全死亡。獲得之資料之實例描述於表21及圖4中。表21 :轉殖基因大豆植物（TO插條）之溫室測試。在除草劑處理之後2週進行損傷評估。轉殖基因無 AtHPPD CrHPP D1 CrHPPD2 品系野生型 AV36 53 AV36 41 AV36 39 AV364 6 AV36 44 LG45 64 LG46 28 除草劑劑量 [g/ha] 「香豆酮 50 4.5 3 2 3 3 4 3 4 衍生性除 100 5.5 3 2 2 4 4 3 3 旱劑」V 200 6 3 3 3 4 5 4 4 苯唑草酮 6.25 7 2 4 4 6 6 3 5 12.5 7 3 4 5 7 5 Γ 4 6~ ^ 甲基·4,5.二氫異嗓嗅-5-基)苯基]·Κ2,2-二氟乙基)-2,2-二側氧基- °比啶并自以上實例可見轉型於植物中之HppD編碼聚核苷酸可選作賦予對香豆酮衍生性除草劑之抗性的HppD編碼聚核苷酸，因為發現經該種聚核苷酸轉型之植物相較於未經轉型之對照植物，由香豆酮衍生性除草劑導致之損傷較小。此外’貫例指示轉型至植物中之HPpd編碼聚核苷酸可選作賦予對苯唑草酮之抗性的HppD編碼聚核苷酸，因為發現經該種聚核苷酸轉型之植物相較於未經轉型之對照植物’由苯唑草酮導致之損傷較小。【圖式簡單說明】圖1A及1B ··胺基酸序列比對及來自萊茵衣藻 155885.doc 201144441 (Cr_HPPDla、Cr_HPPDlb)、小立碗蘚（pp_HPPDl)、栽培稻（Osj_HPPDl)、小麥（Ta HPPDl)、玉米（Zm_HPPDl)、擬南芥（At_HPPD)、大豆（Gm_HPPD)及葡萄（K/沿 vinifera) (Vv_HPPD)之HPPD酶的保守區； *源於基因組定序計劃之序列。基因座1〇 : GRMZM2G088396 “基於NCBI GenPept寄存編號CAG25475之胺基酸序列圖2 : 選擇對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性之萊茵衣藻株系。（A)塗佈於無選擇性試劑之固體培養基上之經突變誘發細胞。（B)塗佈於含有50 μΜ 4-經基-3-[2-甲基-3-(5-甲基_4,5-二風異°惡。坐-3-基）-4-甲基續酿基-苯基]旅嗔幷[3,2_ b]吼啶-2-酮之固體培養基上之經突變誘發細胞。對「香豆酮衍生性除草劑」具有抗性之細胞能夠形成群落（經圈出），而敏感細胞不能生長。圖3展示用於使用HPPD/HST序列所進行之大豆轉型之植物轉型載體的載體圖。圖4 : 針對表現芥菜屬野生型HPPD(AtHPPD)之轉殖基因τ〇大豆插條之除草劑喷灑測試。AV3639、AV3641及AV3653為個別品系（individual event)。未經轉型之對照植物標記為野生型。用星號標記之「香豆酮衍生物」對應於* 3_[2 4_ 二氯-3-(3-曱基-4,5-二氫異°惡°坐-5-基）苯基]_1_(2,2_二氣乙基）-2,2-二側氧基咬幷[3,2-c]嗟。秦-4-醇。 155885.doc -117- 201144441 序列表 <110>德商巴地斯顏料化工廠 <120>對除草劑具有增進耐受性之植物 <130> PF70709 <140> 100115491 <141> 2011-05-03 <150 10161867.6 <151> 2010-05-04 <160> 85 <170> Patentln version 3.4 <210> 1 <211> 1338 <212> m <213>芥菜屬 <400> 1 atgggccacc aaaacgccgc cgtttcagag aatcaaaacc atgatgacgg cgctgcgtcg 60 tcgccgggat tcaagctcgt cggattttcc aagttcgtaa gaaagaatcc aaagtctgat 120 aaattcaagg ttaagcgctt ccatcacatc gagttctggt gcggcgacgc aaccaacgtc 180 gctcgtcgct tctcctgggg tctggggatg agattctccg ccaaalccga tctttccacc 240 ggaaacatgg ttcacgcctc tlacctactc acctccggtg acctccgatt ccttttcact 300 gctccttact ctccgtctct ctccgccgga gagattaaac cgacaaccac agcttctatc 360 ccaagtttcg atcacggctc ttgtcgttcc ttcttctctt cacatggtct cggtgttaga 420 gccgttgcga ttgaagtaga agacgcagag tcagctttct ccatcagtgt agctaatggc ' 480 gctattcctt cgtcgcctcc tatcgtcctc aatgaagcag ttacgatcgc tgaggttaaa 540 ctatacggcg atgttgttct ccgatatgtt agttacaaag cagaagatac cgaaaaatcc 600 gaattcitgc cagggttcga gcgtgtagag gatgcstcgt cgttcccatt ggaitaiggt 660 atccggcggc ttgaccacgc cgtggsaaac gttcctgagc ttggtccggc tttaacttat 720 gtagcggggt tcactggtit tcaccaattc gcagagttca cagcagacga cgttggaacc 780 gccgagagcg gtttaaattc agcggtcctg gctagcaatg atgaaatggt tcttctaccg 840 attaacgagc cagtgcacgg aacaaagagg aagagtcaga ttcagacgta tttggaacat 900 aacgaaggcg ca£ggctaca acatctggct ctgatgagtg aagacalatt caggaccctg 960 agagagatga sgaa£aggag cagtattgga ggattcgact tcatgccttc tcctccgcct 1020

acttactacc agaatctcaa gaaacgggtc ggcgacgtgc icagcgatga tcagatcaag 10SO gagtgtgagg aattagggat tcttgtagac agagatgatc aagggacgtt gcttcaaaic 1140 ttcacaaaac cactaggtga caggccgacg atatttatag agataatcca gagagtagga 1200 tgcatgatga aagatgagga agggaaggct taccagagtg gaggatgtgg tggttttggc 1260 aaaggcaatt tctctgagct cttcaagtcc attgaagaat acgaaaagac tcttgaagcc 3320 aaacagttag tgggatga 1338 <2I0> 2 <211> 445 <212> PRT <213> 155885-序列表.doc 201144441 <400> 2

Met Gly His Gin Asn Ala Ala Val Ser Glu Asn Gin Asn His Asp Asp 1 5 10 15

Gly Ala Ala Ser Ser Pro GJy Phe Lys Leu Va] Gly Phe Ser Lys Phe 20 25 30

Val Arg Lys Asn Pro Lys Ser Asp Lys Phe Lys Val Lys Arg Phe His 35 40 45

His lie Glu Phe Trp Cys Gly Asp Ala Thr Asn Val Ala Arg Arg Phe 50 55 60

Ser Trp Gly Leu Gly Met Arg Phe Ser Ala Lys Ser Asp Leu Ser Thr 65 70 75 80

Gly Asn Met Val His Ala Ser Tyr Leu Leu Thr Ser Gly Asp Leu Arg 85 90 95

Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Pro Ser Leu Ser Ala Gly Glu lie 100 105 110

Lys Pro Tlir Thr Thr A]a Ser lie Pro Ser Phe Asp His Gly Ser Cys 115 120 125

Arg Ser Phe Phe Ser Ser His Gly Leu Gly Val Arg Ala Val Ala lie 130 135 140

Glu Val Glu Asp Ala Glu Ser Ala Phe Ser lie Ser Val Ala Asn Gly 145· 150 155 160

Ala lie Pro Ser Ser Pro Pro lie Val Leu Asn Glu Ala Val Thr lie 165 170 175

Ala Glu Val Lys Leu Tyr Gly Asp Vai Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr 180 185 190

Lys Ala Glu Asp Thr Glu Lys Ser Glu File Leu Pro Gly Phe Glu Arg 295 200 205

Val Glu Asp Ala Ser Ser Phe Pro Leu Asp Tyr Gly lie Arg Arg Leu 210 215 220

Asp His Ala Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Gly Pro Ala Leu Thr Tyr 225 230 235 240

Val A】a G】y Phe Thr Gly Phe His G]n Phe Ala G!u Phe Thr A】a Asp 245 250 255

Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser GJy Leu Asn Ser Ala Va] Leu Ala Ser 260 265 270

Asn Asp Glu Met Val Leu Leu Pro lie Asn Glu Pro Val His Gly Tlu 275 280 285 155885-序列表.doc 201144441

Lys Arg Lys Ser Gin lie Gin Thr Tyr Leu Glu His Asn Glu Gly Ala 290 295 300

Gly Leu Gin His Leu Ala Leu Met Ser Glu Asp Ue Phe Arg Thr Leu 305 310 315 320

Arg Glu Met Arg Lys Arg Ser Ser lie Gly Gly Phe Asp Phe Met Pro 325 330 335

Scr Pro Pro Pro Thr Tyr Tyr Gin Asn Leu Lys Lys Arg Val Gly Asp 340 345 350

Val Leu Ser Asp Asp Gin Lie Lys Glu Cys Glu Glu Leu Gly lie Leu 355 360 365

Val Asp Arg Asp Asp Gin Gly Thr Leu Leu Gin lie Phe Thr Lys Pro 370 375 380

Leu Gly Asp Arg Pro Thr lie Phe He Glu He lie Gin Arg Val Gly 385 390 395 400

Cys Met Met Lys Asp Glu Glu Gly Lys Ala Tyr Gin Ser Gly Gly Cys 405 410 435

Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Ijcu Phe Lys Ser lie Glu 420 425 430

Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Glu A3a Lys Gin Leu Val Gly 435 440 445 <210〉3 <211> 1299 <212> DNA <213>衣藻属 <400> 3 atgggcgctg gtggcgcttc taccacggta gcgaatggcg ggatcaagtt ggtagggcac 60 aagaattttg tsc〇ctataa tccacaatcc gaccggtttg ctatlaagag gttccatagc 120

ttcgagttct ggtgcgcgga tgcgaccaac acatacaagc ggttctctta tggcctgggc ISO atgccgclgg tcgccaagtc cgaccagtcc accaacaacc agctctttgc ctcctacgtg 240 ctgcgctcca acgacctggt cttcaccttc accgcgccct acagccgcaa gtgcgcctcg 300 gtcagcgsgg gcgttccgct gcgtcactac aacatcgacc atgegtatga gttcatcaac 360 tcgcacgggc tggcggtgcg ggeagtagge ctgctggtgg atgacgccaa gacggcgtac 420 gaggtgtctg tggcgcacgg ggccaagggc gtgctgccgc cggtggagtt gegggatgag 480 gegageggea ccagccaggt catctcggag gtcattgttt acggggacgt cgttttccgc 540 tacgtgtcgg gctccttcga gggccctttc atggeegget acacgccagt cacagactcg 600 ccggtcgcgt cgattgggtt acagcgcgtg gaccacgcgg tgggcaacac acacgaccijg 660 atcaaggccg tggagtacat caccgggttc tgtggclicc acgagttctc agagtttgtt 720 geggaggaeg tgggcactgt ggacagcggc ctgaacagca tggtgcttgc caacaacgag 7S0 gagaccatat tgatgcctgt gaacgagccc accttcggca cgccgcgcaa gagccaaatc 840 cagacctacc tggagcagaa cgaggggccg gggctgcagc acctggcgct gctcagcaac 900 155885·序列表.doc 201144441 gacatcttca ccaccctgcg ggagatgcgc gcgcgcagcg agctgggtgg cttcgagttc atgccgcggg caaatgcgaa gtactacaaa gacatgtacg cccgcatcgg cgactcgctc acgccgcagc agtacaggga ggtggaggag ctgggcatcc tggtggacaa ggacgaccag ggcgtgctgc tgcagatctt caccaagccg ctgggcgacc ggcccacggt gttlatlgag atcatccagc gtgtgggctg catgcgggag gtgaaggagc ctgctacggg cgctgtggtg gggacggagc aggcggctgg ctgcggcggc ttcgggaaag gcaacttcgg cgccctctlc aagtccattg aggactatga gcgcacccta aatgtgtag <210> 4 <211> 432 <212> PRT <2Ϊ3>表荡屬 <4〇0> 4

Met Gly Ala GJy Gly Ala Ser Thr Thr VaJ Ala Asn Gly Cly He Lys 15 10 15

LeuVal Gly His Lys Asn Phe Va, Arg Asn Pro Gin Ser Asp Arg

Phe Ala lie Lys Arg Phe His Ser Phe Glu Phe Trp Cys Ala Asp Ala 35 40 45

Thr Asn Thr Tyr Lys Arg Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Met Pro Leu Val 50 55 60

Ala Lys Ser Asp G3n Ser Thr Asn Asn Gin Leu Phe Ala Ser Tyr Val 65 70 75 80

Leu Arg Ser Asn Asp Leu Val Phe Thr Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Arg 85 90 95

Lys Cys Ala Ser Val Ser Glu Gly Val Pro Leu Arg His Tyr Asn He l〇〇 105 110

Asp His Ala Tyr Glu Phe He Asn Ser His Gly Leu Ala Val Arg Ala 115 120 125

Va, GlyUu LeuVa, Asp Asp Ala Lys Ala Tyr Glu Val Ser Va,

Ala His Gly Ala Lys Gly Val Leu Pro Pro Val Glu Leu Arg Asp Glu 145 150 155 160 A.a Ser G,y Br Ser Gin Val He Ser Glu Val He Val Tyr G,y Asp

Val Val Phe Arg Tyr Val Ser Gly Ser Phe Glu Gly Pro Phe Met Ala 180 185 190

Gly Tyr Tbr Pro Val Ήιγ Asp Ser Pro Va) Ala Ser He Gly Leu Gin 195 200 205 -4- 960 1020 1080 1140 1200 1260 1299 155885-序列表.doc 201144441

Arg Val Asp His Ala Val Gly Asn Thr His Asp Leu He Lys Ala Val 210 215 220

Glu Tyr He Thr Gly Phe Cys Gly Phe His Glu Phe Ser Glu Phe Val 225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly Thr Val Asp Ser Gly Leu Asn Ser Met Val Leu 245 250 255

Ala Asn Asn Glu Glu Thr lie Leu Met Pro Val Asn Glu Pro Thr Phe 260 265 270

Gly Thr Pro Arg Lys Ser Gin He Gin Tlu Tyr Leu Glu Gin Asn Glu 275 280 285

Gly Pro Gly Leu Gin His I^u Ala Leu Leu Ser Asn Asp Tic Phe Thr 290 295 300

Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Glu Leu Gly Gly Phe Glu Phe 305 330 315 320

Met Pro Arg Ala Asn Ala Lys Tyr Tyr Lys Asp Met Tyr Ala Arg lie 325 330 335

Gly Asp Ser Leu Thr Pro Gin Gin Tyr Arg Glu Val Glu Glu Leu Gly 340 345 350 lie Leu Val Asp Lys Asp Asp Gin Gly Val Leu Leu Gin He Phe Thr 355 360 365

Lys Pro Leu Gly Asp Arg Pro Thr Val Phe He Glu lie He Gin Arg 370 375 380

Val Gly Cys Met Arg Glu Va3 Lys Glu Pro Ala llir Gly Ala Val Val 385 390 395 400

Gly Thr Glu Gin Ala Ala Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe 405 410 415

Gly Ala Leu Phe Lys Ser lie Glu Asp Tyr Glu Arg Thr Leu Asn Val 420 425 430 <210> 5 <211> 1299 <212> DNA <213>衣藻屬 <400> 5 atgggagcgg gtggtgcagg caccggagat cgggaggggg gcaitaagei cgtgggctac 60 aagaatttcg tgcgccagaa cccgctttca gacaaattca ccgtccacaa gtttcatcac 120

atcgatttcl ggtgcggaga tgcaacaaac acatcgaagc ggitclccta cggcctgggc ISO atgccgctgg tcgccaagtc cgaccagtcc accaacaacc agctcittgc ctcctacgtg 240 ctgcgctcca acgacctggt cttcaccttc accgcgccct acagccgcaa gtgcgcctcg 300 gteagegagg gcgttccgct gcgtcaciac aacatcgacc atgegtatga gttcatcaac 360 tcgcacgggc tggcggtgcg ggeagtagge ctgctggtgg atgacgccaa gacggcgtac 420 155885-序列表.doc 201144441 gaggtgtctg tggcgcacgg ggccaagggc gtgctgccgc cggtggagct gcgggatgag gcgagcggca ccagccaggt catctcggag gtgctgctgt acggcgaggt cgtgctgcgc xacgtgtcgg gciccttcca gggccccttc ctggccggct acacgcccgt cacagactcg gccgtgacct ccttcggcct gcaacgtctg gaccacgcgg tgggcaacac ccatgaccig atcaaggccg tggagtacat caccggcttc acaggtttcc acgagttcic agagtttgtt gcggaggacg tgggcactgl ggacagcggc ctgaacagca tggtgctggc ctccaacaac gaggcagtfic tgctgcctgt gaacgagccc acctttggca cgcc£〇gcaa gagccaaatc cagacctacc tggagcagaa cgaggggccg gggctgcagc acctggcgct gctcagcaac gacatcttca ccaccctgcg ggagatgcgc gcgcgcagcg agctgggtgg cttcgagtic atgccacggg caaatgccaa gtactacaaa gacatgtacg cccgcatcgg cgactcgctc acgccgcagc agtacaggga ggtggaggag ctgggcatcc tggtggacaa ggacgaccag ggcgtgctgc tgcagatctt caccaagccg ctgggcgacc ggcccacggt gtttattgag atcatccagc gtgtgggctg catgcgggag gtgaaagagc ctgctacggg cgctgtggtg gggacggagc aggcggctgg ctgcggcggc ttcgggaaag gcaacttcgg tgccctcttc aagtccattg aggactatga gcgcacctta aatgtttaa <210> 6 <211> 432 <212> PRT <213>衣藻屬 <400> 6

Met Gly Ala Gly Gly Ala G)y Thr Gly Asp Arg Glu Gly Gly lie Lys 15 10 15

Leu Va) Gly Tyr Lys Asn Phe Val Arg Gin Asn Pro Leu Ser Asp Lys 20 25 30

Phe Thr Val His Lys Hie His His He Asp Phe Trp Cys Gly Asp Ala 35 40 45

Thr Asn Thr Ser Lys Arg Phe Ser Tyr Gly Leu Gly Met Pro Leu Val 50 55 60

Ala Lys Ser Asp Gin Ser Thr Asn Asn Gin Leu Phe Ala Ser Tyr Val 65 70 75 80

Leu Arg Ser Asn Asp Leu Val Phe Thr Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Arg 85 90 95

Lys Cys Ala Ser Val Ser Glu Gly Val Pro Leu Arg His Tyr Asn lie 100 105 110

Asp His Ala Tyr Glu Phe lie Asn Ser His Gly Leu Ala Val Arg Ala 115 120 125

Val Gly Leu Leu Val Asp Asp Ala Lys Thr Ala Tyr Glu Val Ser Val 130 135 140 155885·序列表.doc -6 · 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1299 201144441

Ala His Gly Ala Lys Gly Val Leu Pro Pro Val Glu Leu Arg Asp Glu 145 150 155 160

Ala Ser Gly Thr Ser Gin Val lie Ser Glu Val Leu Leu Tyr Gly Glu 165 170 175

Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Gly Sex Phc Gin Gly Pro Phe Leu Ala 180 185 190

Gly Tyr Thr Pro Val Thr Asp Ser Ala Val Thr Ser Phc Gly Leu Gin 195 200 205

Arg Leu Asp His Ala VaJ Gly Asn Thr His Asp Leu lie Lys Ala Val 210 215 220

Glu 丁yr lie Thr Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ser G運u Phe Val 225 230 235 240

Ala Glu Asp Val Gly ITir Val Asp Ser Gly Leu Asn Ser Met Val Leu 245 250 255 A]a Ser Asn Asn Glu Ala Val Leu Leu Pro Val Asn Glu Pro Thr Phe 260 265 270

Gly Thr Pro Arg Lys Ser Gin lie Gin Thr Tyr Leu Glu Gin Asn Glu 275 280 285

Gly Pro Gly Leu Gin His Leu Ala Leu Leu Ser Asn Asp lie Phe Thr 290 295 300

Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Glu Leu Gly Gly Phe Glu Phe 305 310 315 320

Mel Pro Arg Ala Asn Ala Lys Tyr Tyr Lys Asp Met Tyr Ala Arg lie 325 330 335

Lys Pro Leu Gly Asp Arg Pro Thr Val Phe lie Glu lie lie Gin Arg 370 375 380

Val Gly Cys Met Arg Glu Val Lys Glu Pro Ala Thr Gly Ala Val Val 385 390 395 400

Gly Thr Glu Gin Ala Ala Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe 405 410 415

Gly Ala Leu Phe Lys Ser lie Glu Asp Tyr Glu Arg Thr Leu Asn Val 420 425 430

<210> 7 <2)1> 1161 <212> DNA ：；) 155885·序列表.doc 201144441 <213>芥菜屬 <400> 7 atggagctct cgatclcaca atcaccgcgt gttcggttct cgtctctggc gcctcgtttc 60 ttagcagctt ctcatcatca tcgtccttct gtgcatttag ctgggaagtt tataagcctc 120 cctcgagatg ttcgcttcac gagcttatca acttcaagaa tgcggtccaa atttgtttca ]80 accaattata gaaaaatctc aatccgggca tgttclcagg itggtgctgc tgagtctgat 240 gatccagtgc tggatagaat tgcccggttc caaaatgctt gctggagatt tcttagaccc 300 catacaatcc gcggaacagc titaggatcc actgccttgg tgacaagagc tttgatagag 360 aacactcatt igatcaaatg gagtcttgta ctaaaggcac tttcaggtct tcttgcictt 420 atttglggga atggttatat agtcggcatc aatcagatct acgacattsg aatcgacaaa 480 gtgaacaaac catacttgcc aatagcagca ggagatctal cagtgcagtc tgcttggttg 540 ttagtgatat tttttgcgat agcagggctt ttagttgtcg gatttaactt tggtccattc 600 attacaagcc tatactctct tggcctntt ctgggaacca tctattctgt tccacccctc 660 agaatgaaaa gattcccagt tgcagcattt cttaitattg ccacggtacg aggtttcctt 720 cttaacittg gtgtgtacca tgctacaaga gctgctcttg gacttccatt tcagtggagt 780 gcacctgtgg cgttcatcac atcttttgtg acactgtttg cactggtcat igctattaca 840 aaggaccttc ctgatgttga aggagatcga aagttccaaa tatcaaccct ggcaacaaaa 900 cttggagtga gaaacattgc altcctcggt tctggacttc tgctagtaaa ttatgtttca 960 gccatatcac tagctttcta catgcctcag gtttttagag gtagcttgat gattcctgca 1020 catgtgatct tggcttcagg cttaattttc cagacatggg lactagaaaa agcaaactac 1080 accaaggaas ctatctcagg aiattatcgg tttatatgga atctcttcta cgcagagtat 1140 ctgttattcc ccttcctcta g 1161 <210> 8 <211> 386 <212> PRT <213>芥菜屬 <400> 8

Met Glu Leu Ser lie Ser Gin Ser Pro Arg Val Arg Phe Scr Ser Leu 1 5 10 15

Ala Pro Arg Fhe Leu Ala Ala Scr His His His Arg Pro Ser Val His 20 25 30

Leu Ala Gly Lys Phe 】le Ser Leu Pto Arg Asp Val Arg Phe Thr Ser 35 40 45

Leu Ser Thr Ser Arg Met Arg Ser Lys Phe Val Scr Thr Asn Tyr Arg 50 55 60

Lys lie Ser lie Arg Ala Cys Ser Gin Val Gly Ala Ala Glu Ser Asp 65 70 75 80

Asp Pro Val Leu Asp Arg lie Ala Arg Phe Gin Asn Ala Cys Trp Arg 85 90 95 155885·序列表.doc 201144441

Phe Leu Arg Pro His Thr He Arg Gly Thr Ala Leu Gly Ser Thr Ala 100 〗05 110

Leu Val Thr Arg Ala Leu He Glu Asn Thr His Leu He Lys Trp Scr Π5 120 125

Leu Val Leu Lys Ala Leu Ser Gly Leu Leu Ala Leu lie Cys Gly Asn 330 135 140

Gly Tyr lie Val Gly lie Asn Gin lie Tyr Asp He Gly lie Asp Lys 145 150 155 160

Val Asn Lys Pro Tyr Leu Pro lie Ala Ala Gly Asp Leu Scr Val Gin 165 170 175

Ser Ala Trp Leu l,eu Val lie Phe Phe Ala lie Ala Gly Uu Leu Val 380 185 190

Val Gly Phe Asn Phe Gly Pro Phe lie Thr Ser Leu Tyr Ser Leu Gly 195 200 205

Leu Phe Leu Gly Thr lie Tyr Ser Val Pro Pro Leu Arg Met Lys Arg 210 215 220

Phe Pro Val Ala Ala Phe Leu He lie Ala Thr Val Arg Gly Phe Leu 225 230 235 240

Leu Asn Phe Gly Val Tyr His Ala Thr Arg Ala Ala Leu Gly Leu Pro 245 250 255

Phe Gin Trp Ser Ala Pro Val Ala Phe lie ITir Ser Phe Val Thr Leu 260 265 270

Phe Ala Leu Val lie Ala lie Thr Lys Asp Leu Pro Asp Va] Glu G]y 275 280 285

Asp Arg Lys Phe Gin He Ser Thr Leu Ala Thr Lys Leu Gly Val Arg 290 295 300

Asn lie Ala Phe Leu Gly Ser Gly Leu Leu Leu Val Asn Tyr Val Ser 305 . 310 315 320

Ala lie Ser Leu Ala Phe Tyr Met Pro Gin Val Phe Arg Gly Scr Leu 325 330 335

Met lie Pro Ala His Val lie Leu A]a Ser Gly Leu lie Phe Gin Thr 340 345 350

Trp Val Leu Glu Lys Ala Asn Tyr Thr Lys Glu Ala lie Ser Gly Tyr 355 360 365

Tyr Arg Phe lie Trp Asn Leu Phe Tyr Ala Glu Tyr Leu Leu Phe Pro 370 375 380

Phe Leu 385 155885·序列表.doc 201144441 <210> 9 <211> 1113 <212> DNA <213>衣蒸屬 <400> 9 atggaccttt gcagctcaac tggaagagga gcaigccm cgccggcatc cacgtcgcgg 60 ccgtgcccag caccagtgca tttgegegge cgacgcctgg ctttctctcc ggctcagcct 120 gctggacggc gccacttgcc gstgetetea tetgeagegg tccccgctcc cctcccaaat 180 ggtggaaacg aegagagett cgcacaaaaa ctggctaact ttccaaacgc cttctggaag 240 ttcctgcggc cacacaccat ccgggggact atcctgggca ccacagctgt gaccgccaag 300 gtccttatgg agaaccccgg ctgcatagac tgggcactgc tgeegaagge gctgctcggc 360 ctggtggcgc tgctgtgcgg caacggclac attgtgggca tcaaccaaat ctacgacgtc 420 gacattgacg tggtcaacaa gccattcctc cccgtggcgt egggegaget gtcgccggcg 480 ctggcgtggg gcctgtgtct gtcgctggcg gctgcgggcg cgggcatcgt agccgccaac 540 ttcggcaacc tcatcaccag cctctacacc tttggcctct tcctgggcac cgtgtacagt 600 gtgcctcccc tgcgcctgaa gcagtacgcg gtgccggcct tcatgatcat cgccacggtg 660 cgcggcttcc tgctcaactt cggcgtgiac agcgccacgc gggcggcact gggactgccc 720 itcgagtgga gcccggccgt cagctlcatc acfigtgtttg tgacgctgu tgccactgtg 780 atcgccatca ccaaggacct geeggaegtg gagggcgacc aggccaacaa catctccacc 840 ttcgccacgc gcatgggcgt gcgcaacgtg gcactgctgg ccatcggcct tctcatggcc 900 aactacctgg gtgccatcgc gctggcactc acctactcca ccgccttcaa cgtgccgctc 960 atggcgggcg cgcacgccat cclggccgcc acgclggcgc tgcgcacgct caagctgcac 1020 gccgccagct acagccggga ggcggiggcg tccttctacc gctggatctg gaacctgttc 1080

Ucgccgagt acgcgctgct gccgttcctg tag 1113 屬 OT藻 ,037PR衣 s ^07 1J u 1 n <2<2<2<2<4

Met Asp Leu Cys Scr Scr Thr Cly Arg Gly Ala Cys Leu Set Pro Ala 15 10 15

Ser Thr Ser Arg Pro Cys Pro Ala Pro Va) His Leu Arg Gly Arg Arg 20 25 30

Leu Ala Phe Ser Pro Ala Gin Pro Ala Gly Arg Arg His Leu Pro Val 35 40 45

Leu Scr Scr Ala Ala Val Pro Ala Pro Leu Pro Asn Gly Gly Asn Asp 50 55 60

Glu Ser Phe Ala Gin Lys Leu Ala Asn Phe Pro Asti Ala Phe Trp Lys 65 70 75 80

Phe Leu Arg Pro His Thr lie Arg Gly Thr Ue Leu Gly Thr Thr Ala 85 90 95 -10- 155885·序列表.doc 201144441

Val Thr Ala Lys Val Leu Met Glu Asn Pro Gly Cys He Asp Trp Ala 100 105 110

Leu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Gly Leu Val Ala Leu Leu Cys Gly Asn 115 120 . 125

Gly Tyr lie Val Gly lie Asn Gin lie Tyr Asp Val Asp lie Asp Val 130 135 140

Val Asn Lys Pro Phe Leu Pro Val Ala Ser Gly Glu Leu Ser Pro Ala 145 150 155 160

Leu Ala Trp Gly Leu Cys Leu Ser Leu Ala Ala Ala Gly Ala Gly lie 165 170 175

Val Ala Ala Asn Phe Gly Asn Leu He ITir Ser Leu Tyr Thr Phe Gly 180 185 190

Leu Phe Leu Gly Thr Val Tyr Ser Val Pro Pro Leu Arg Leu Lys Gin 195 200 205

Tyr Ala Val Pro Ala Phe Met He lie Ala Thr Val Arg Gly Phe Leu 210 215 220

Leu Asn Phe G]y Val Tyr Ser Ala Thr Arg Ala Ala Leu Gly Leu Pro 225 230 235 240

Phe Glu Trp Ser Pro Ala Val Ser Phe lie Thr Val Phe Val Thr Leu 245 250 255

Phe Ala Thr Val lie Ala lie Thr Lys Asp Leu Pro Asp Val Glu Gly 260 265 270

Asp Gin Ala Asn Asn He Ser Thr Phe Ala Thr Arg Met Gly Val Arg 275 280 285

Asn Val Ala Leu Leu Ala He Gly Leu Leu Met Ala Asn Tyr Gly 290 295 300

Ala lie Ala Leu Ala Leu Thr Tyr Ser Thr Ala Phe Asn Val Pro Leu 305 310 315 320

Met Ala Gly Ala His Ala lie Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Arg Thr 325 330- 335

Leu Lys I^u His Ala Ala Ser Tyr Ser Arg Glu Ala Val Ala Ser Phe 340 345 350

Tyr Arg Trp He Trp Asn Leu Phe Tyr Ala Glu Tyr Ala Leu Leu Pro 355 360 365

Phe Leu 370 <210> Π -n - 155885-序列表.doc 201144441 <211> 433 <212> PRT <2]3>苔蘚屬 <400> 11

Met Gly Leu Asp Lys Ser Glu Ser Glu Gly Ser Val Val Gly Pro Leu 1 5 10 15

His Leu Val Gly Cys Glu Arg Phe Val Arg Asn Asn Pro Lys Thr Asp 20 25 30

Arg Phe Gly Val Glu Arg Phe His His Val Glu Phe Tip Cys Gly Asp 35 40 45

Ala Ser Asn Thx Trp Arg Arg Phe Ser Trp Gly Leu Gly Met His Leu 50 55 60

Val Ala Lys Scr Asp Gin Thr Thr Gly Asn Gin Thr Tyr Cys Ser Tyr 65 70 75 80

Ala lie Gin Ser Asn Glu Leu Val Phe Ala Phe FfTir Ala Pro Tyr Ser S5 90 95

Set Thr lie Asp Gin Thr Asn Thr Lys Met Pro His Pro Gly Tyr Lys 100 105 110

Ser Asp Glu Ala Arg Ser Phe Thr Asp Ser His Gly Leu Ala Val Arg 115 120 125

Ala Val Gly lie Leu Val Asp Asp Ala Asp GJu Ala Fhe Arg lie Ser 130 135 140

Val Glu His Gly Ala Val Ser Val Leu Glu Pro His Val Leu Ser Asp 145 150 155 160

Asp Ala Lys Gly Gly Lys Met Val Met A!a GJu Val Lys Leu Tyr Gly 165 170 175

Asp Val Val I-eu Arg Tyr Val Ser Glu Gin Gly Tyr Lys Gly Ser Met 180 185 190

Leu Pro Asn Tyr Glu Glu Val Glu Ser Leu Pro Leu Ser Tyr Gly Leu 195 200 205

Val Arg Leu Asp His Ala Va) Gly Asn Va] His Asn Leu Ala Glu Ala 210 215 220

Va】 Asn Tyr lie Ala Lys Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe 225 230 235 240

Thr Ala Gly Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Met Val 245 250 255

Val Ala Ser Asn Asn Glu Met Val Leu Leu Pro I]e Asn Glu Pro Thr 260 265 270

Phe Gly Thr Lys Arg Lys Ser Gin lie Gin Thr Tyr Leu Glu His Asn •12- 155885-序列表.doc 275 201144441

Glu G!y Pro Gly Leu Gin His Leu Ala Leu Uc Cys Asp Asn lie Phe 290 295 300

Ser Thr Leu Arg Glu Met Arg Thr Arg Thr His lie Gly Gly Phe Asp 305 310 315 320

Phe Met Pro Lys Pro Pro Pro Thr Tyr Tyr Lys Asn Leu Ala Asn Arg 325 330 335

Val Gly Asp lie Leu Thr A]a Glu Gin lie Lys Glu Cys Asp Glu Leu 340 345 350

Gly lie Leu Vai Asp Lys Asp Asp Gin Gly Val Leu Leu Gin lie Pbe 355 360 365

Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Ser lie Phe Va] G3u lie lie Gin 370 375 380

Arg lie Gly Cys Met Asp Lys Asp Glu Ser Thr Gly Ala Ήιγ Val Gin 385 390 395 400

Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Pbe Ser Glu Leu Phe 405 410 4] 5

Lys Ser lie G]u Glu Tyr Glu Lys Thr Leu Asp Gly Thr Leu Lys Val 420 425 430

His <210> 12 <211> 446 <212> PRT <213>稻屬 <400> 12

Met Pro Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Thr Gly Ala Val Ser Ala 15 10 15

Ala Ala Ala Ala Gly Glu Asn Ala Gly Phe Arg Leu Val Gly His Arg 20 25 30

Arg Phe Val Arg Ala Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe Gin Ala Leu Ala 35 40 45

Phe His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser A]a Ala Gly 50 55 60

Ar£ Phe Ala Phe Ala Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu 65 70 75 80

Ser Thr Gly Asn Ser Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Arg Ser Ala Ser 85 90 95

Val Ala Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Gly Gly Asp His Gly Val Gly 155885·序列表.doc •13· h 201144441 100 105 110

Ala Asp Ala Ala Thr Thr Ala Ser lie Pro Ser Phe Ser Pro Gly Ala 115 120 125

Ala Arg Arg Phe Ala Ala Asp His Gly Leu Ala Val His Ala Val Ala 130 135 140

Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Asp Ala Phe Arg Ala Ser Val Ala Ala 145 150 155 160

Gly Ala Arg Pro Ala Phe Gin Pro Ala Asp Leu Gly Gly Gly Phe Gly 165 170 175

Leu Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Phe Val Ser 180 185 190

His Pro Asp Gly Ala Asp Ala Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val 195 200 205

Ser Asn Pro Gly Ala Val Asp Tyr Gly Leu Arg Arg Phe Asp His Val 210 2]5 220

Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Val Ala Ala Tyr lie Ser Gly 225 230 235 240

Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp Val Gly 245 250 255

Tlir Ala Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn Ala Glu 260 265 270

Thr Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Fro Val His Gly Thr Lys Arg Arg 275 280 285

Ser Gin lie Gin Thr Tyr Leu Asp His His Gly Gly Pro Gly Val Gin 290 295 300

His lie Ala Leu Ala Ser Asp Asp Val Leu Gly Thr Leu Arg Glu Met 305 310 315 320

Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Glu Phe Leu Ala Pro Pro Pro 325 330 335

Pro Asn Tyr Tyr Asp Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Ser 340 345 350

Glu Glu Gin lie Asn Glu Cys Gin Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg 355 360 365

Asp Asp Gin Gly Val Leu Leu Gin lie Phe Thr Lys Pro Val Gly Asp 370 375 380

Arg Pro Thr Phe Phe Leu Glu Met lie Gin Arg lie Gly Cys Met Glu 3S5 390 395 400 •14- 155885-序列表.doc 201144441

Lys Asp Glu Ser Gly Gin Glu Tyr Gin Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe 405 410 415

Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser He Glu Glu Tyr Glu 420 425 430

Lys Ser Le\i Glu Ala Lys Gin Ala Pro Thir Va] Gin Gly Ser 435 440 445 <210> 13 <211> 436 <212> PRT <213>小麥屬 <400> 13

Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Ala 1 5 10 15

Ala Ala Val Thr Pro Glu His A]a Arg Pro Arg Arg Met Val Arg Phe 20 25 30

Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ser Phe His His Val Glu 35 40 45

Phe Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Phe Ala 50 55 60

Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser 65 70 75 80

Val His Ala Ser Gin Leu Leu Arg Ser Gly Asn Leu Ala Phe Leu Phe 85 90 95

Thr Ala Pro Tyr Ala Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro 100 105 110

Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Asp His Gly Leu 115 120 125

Ala Val Arg Ser lie Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Glu Ala Phe 330 135 140

Arg Ala Ser Val Asp Gly Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ser Pro Val Asp 145 150 155 160

Leu Gly Arg Gly Phe Gly Phe Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val 165 170 175

Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Asp Thr Asp Val Pro Phe Leu 180 185 190

Pro Gly Phe Glu Gly Va] Scr Asn Pro Asp Ala Val Asp Tyr Gly Leu 195 200 205

Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala 210 215 220 -15- 155885-序列表.doc 201144441

Ala Ala Tyr Val Ala Gly Phe Ala Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe 225 230 235 240

Thr Thr Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly Leu Asn Scr Met Val 245 250 255

Leu Ala Asn Asn Ser Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val 260 265 270

His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gin lie Gin Thr Phe Leu Glu His His 275 280 285

Gly Gly Ser Gly Val Gin His lie Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Leu 290 295 300

Arg Thr Leu Arg Glu Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Giy Gly Phe Asp 305 310 315 320

Phe Leu Pro Pro Arg Cys Arg Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg lie 325 330 335

Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gin lie Lys Glu Cys Gin Glu Leu 340 345 350

Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gin Giy Val Leu Leu Gin lie Phe 355 360 365

Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met lie G]n 370 375 380

Arg lie Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Gin Lys 385 390 395 400

Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys 405 410 415

Ser He Glu Asp Tyr Glu Lys Scr Leu Glu Ala Lys Gin Ser Ala Ala 420 425 430

Val Gin Gly Ser 435 <210> 14 <211> 444 <2】2> PRT <2]3>玉蜀黍屬 <400〉 14

Met Pro Pro Thr Pro Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala 15 10 15

Ala Ser Ala Ala Glu Gin Ala Ala Phe Arg Leu Val Gly His Arg Asn 20 25 30

Phe Vai Arg Fhe Asn Pro Arg Scr Asp Arg Phe His Thr Leu Ala Phe 35 40 45 •16· 155885-序列表.doc 201144441

His His Val Glu Leu Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg 50 55 60

Phe Ser Phe Gly Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser 65 70 75 80

Thr Gly Asn Ser Ala His Ala Ser Leu Leu Leu Axg Ser Gly Ser Leu 85 90 95

Ser Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ala His Gly Ala Asp Ala Ala Thr 100 105 110

Ala Ala Leu Pro Ser Phe Ser Ala Ala Ala Ala Arg Arg Phe Ala Ala 115 120 125 .

Asp His Gly Leu Ala Val Arg Ala Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala 130 135 140

Glu Glu Ala Phe Arg Thr Ser Val Ala Ala Gly Ala Arg Pro Ala Phe 145 150 155 160

Gly Pro Val Asp Leu Gly Arg Gly Phe Arg Leu Ala Glu Val Glu Leu 165 170 175

Tyr Gly Asp Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Pro Asp Gly Ala Ala 180 185 190

Gly Glu Pro Phe Leu Pro Gly Phe Glu Gly Val Ala Ser Pro Gly Ala 195 200 205

Ala Asp Tyr Gly Leu Ser Arg Phe 八sp His lie Val Gly Asn Val Pro 210 215 220

Glu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Tyr Phe Ala Gly Phe Thr Gly Phe His 225 230 235 240

Glu Phe Ala Glu Phe Thr Τϊγ Glu Asp Val Gly Thr Ala Glu Ser Gly 245 250 255

Leu Asn Ser Met Val Leu Ala Asn Asti Ser Glu Asn Va] Leu Leu Pro 260 265 270

Leu Asn Glu Pro Val His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gin lie Gin Thr 275 280 285

Phe Leu Asp His His G3y Gly Pro Gly Val Gin His jMet Ala Leu Ala 290 295 300

Ser Asp Asp Val Leu Arg Thr Leu Arg Glu Met Gin Ala Arg Ser Ala 305 310 315 320

Met G]y Gly Phe Glu Phe Met Ala Pro Pro Thr Ser Asp Tyr Tyr Asp 325 330 335

Gly Val Arg Arg Arg Ala Gly Asp Val Leu Thr Glu Ala Gin lie Lys 340 345 350 155885·序列表.doc -17· h 201144441

Giu Cys Gin Glu Leu Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gin Cly Val 355 360 365

Leu Leu Gin He Phc Pro Lys Pro Val G)y Asp Arg Pro Thr Leu Phc 370 375 380

Leu G)u ]3e ]le Gin Arg He Gly Cys Met Glu Arg Asp CJu Lys Gly 3S5 390 395 400

Gin Glu Tyr Gin Lys Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe 405 410 415

Ser Gin Leu Phe Lys Ser lie Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala 420 425 430

Met Gin Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gin Gly Ser 435 440 <210> 15 <211> 443 <212> PRT <213>大豆屬 <220> <221> misc feature <222> (393)..(393) <223> xaa可為任何天然存在之胺基酸 <400> 15

Met Cys Asn Glu 11c Gin Ala Gin Ala Gin Ala Gin Ala Gin Fro Gly 15 10 35

Phe Lys Leu Va) Gly Phe Lys Asn Phe Val Arg Thr Asn Pro Lys Scr 20 25 30

Asp Arg Phe Gin Val Asn Arg Phe His His lie Glu Phe Trp Cys Thr 35 40 45

Asp Ala Thr Asn A]a Ser Arg Arg Phe Ser Trp Gly Leu GJy Met Pro 50 55 60 lie Val Ala Lys Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Gin lie His Ala Ser 65 70 75 80

Tyr Leu Leu Arg Ser Gly Asp Leu Ser Phe Leu Phe Ser Ala Pro Tyr 85 90 95

Ser Pro Ser Leu Ser Ala Gly Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Jle 100 105 110

Pro Ser Phe Asp Ala Ala rfhr Cys Leu Ala Phe Ala Ala Lys His Gly 1.15 120 125

Phe G]y Val Arg Ala lie Ala Leu Glu Val Ala Asp Ala Glu Ala Ala 130 135 140

Phe Ser Ala Ser Val Ala Lys Gly Ala Glu Pro Ala Ser Pro Pro Val 18- 155885-序列表.doc 201144441 145 150 155 160

Leu Val Asp Asp Arg Ήιγ Gly Phe Ala GIu Va) Arg Leu Tyr Gly Asp 165 170 175

Val Val Leu Arg Tyr Val Ser Tyr Lys Asp Ala Ala Pro Gin Ala Pro 180 1S5 190

His Ala Asp Pro Ser Arg Trp Phe Leu Pro Gly Phe Glu Ala Ala Ala 195 200 205

Ser Ser Ser Ser Phe Pro Glu Leu Asp Tyr Gly lie Arg Arg Leu Asp 210 215 220

His Ala Val Gly Aso Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala Val Arg Tyr Leu 225 230 235 240

Lys Gly Phe Ser Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala Glu Asp 245 250 255

Val Gly Thr Ser Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala Asn Asn 260 265 270

Ser Glu Thr Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val Tyr Gly Thr Lys 275 280 285

Arg Lys Ser Gin lie Glu Thr Tyr Leu Glu His Asn Glu Gly Ala Gly 290 295 300

Val Gin His Leu Ala Leu Val Thr His Asp He Phe Thr Thr Leu Arg 305 310 315 320

Glu Met Arg Lys Arg Ser Phe Leu Gly Gly Phe Glu Phe Met Pro Ser 325 330 335

Pro Pro Pro Thr Tyr Tyr Ala Asn Leu His Asn Arg Ala Ala Asp Val 340 345 350

Leu Thr Val Asp Gin lie Lys Gin Cys Glu Glu Leu Gly lie Leu Val 355 360 365

Asp Arg Asp Asp Gin Gly rrhr Leu Leu Gin lie Phe Thr Lys Pro Val 370 375 380

Gly Asp Arg Pro Thr lie Phe lie Xaa lie He Gin Arg Jle Gly Cys 3S5 390 395 400

Met Val Glu Asp Glu Glu Gly Lys Val Tyr Gin Lys Gly Ala Cys Gly 405 410 415

Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu l,eu Phe Lys Ser lie Glu Glu 420 425 430

Tyr Glu Lys Thr Leu Glu Ala Lys Arg Thr Ala 435 440 •19· 155885-序列表.doc 201144441 屬 5T萄 1644PR® 11 n 1* 1i <2<2<2<2 <4 00> 16

Met Gly Lys Gin Asn Thr Thr Thr Asn Asn Pro Ala Pro Gly Phe Lys 15 10 15

Leu Val Gly Phe Ser Asn Phe Leu Arg Thr Asn Pro Met Ser Asp Arg 20 25 30

Phe Gly Val Lys Arg Phe His His Jlc Glu Phe Trp Ser Thr Asp Ala 35 40 45

Thr Asn Leu Ala Arg Arg Phe Ser Trp Gly Leu Gly Met Pro He Val 50 55 60

Ala Lys Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Val He His Ala Ser Tyr Leu 65 70 75 80

Thr Arg Ser Gly Asp Leu Asn Phe Leu Phe Thr Ala Pro Tyr Ser Pro 85 90 95

Ser lie Ala Gly Asp Leu Glu Asn Ala Ala A]a Thr Ala Ser Jle Pro 100 105 110

Ser Phe Asp His Ser Ala Cys His Ala Phe A]a Ala Scr His Gly Leu 115 120 125

Gly Val Arg Ala lie AJa Jle Glu Val Asp Asp Ala Glu Gly Ala Phe ]30 135 140

His Thr Ser Val Ala His Gly Ala Arg Pro Met Ser Pro Pro Val Thr 145 150 155 160

Met Gly Gly Scr Val Val lie Ser Glu Val His Leu Tyr Gly Asp Ala 165 170 175

Val Leu Arg Tyr Val Scr Tyr Lys Asn Pro Asn Pro Asn Ala Thr Ser 180 185 190

Asp Pro Ser Ser Trp Phe Leu Pro Gly Phe Glu Ala Val Asp Glu Gly 195 200 205

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34 201144441 <400> 58 ggaacaaaga ggaagagtgt gattcagacg tatttgg 37 <21.0〉 59 <211> 37 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 <400> 59 ccaaatacgt ctgaatcaca ctcttcctct ttgttcc 37 从工 08^ 62D/ b > Λ > o 1 z 3 <21<21<21<21 <220> <223>引子 <400> 60 gaggattcga cttcaaccct tctcctcc <210> 61 <21]> 28 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 61 ggaggagaag ggttgaagtc gaatcctc 28 A工 6228DN人 10>11>12>13> 2 222 <220> 28 28 <223>引子 <400> 62 gaggattcga cttccagcct tctcclcc <210> 63 <21 ]> 28 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 63 ggaggagaag gctggaagtc gaatcctc 6437DN.人 .Δ > Λ > .—- z 3 2 2 2 < V V < <220> <223>引子 <400> 64 ggaacaaaga ggaagagtaa cattcagacg taittgg 37 ·32· 155885·序列表.doc 201144441 <210> 65 <211> 37 <212> WA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 65 ccaaatacgt ctgaatgtta ctcttcctct ttgttcc 37 <210> 66 <211> 37 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 66 ggaacaaaga ggaagagtca cattcagacg tatttgg 37 <210> 67 <211> 37 <212> DNA <213;>人工 <220> <223>引子 <400> 67 ccaaatacgt ctgaatgtga ctcttcctct ttgttcc 37 <210> 6S <21]> 23 <212> DNA <233>人工 <220〉 <223>引子 <400> 68 atgggcgctg gtggcgcttc tac 23 <210> 69 <211> 2S <212> DNA <2]3>人工 <220> <223>引子 <400> 69 ctacacattt agggtgcgct catagtcc 28 <2J0> 70 <211> 23 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 70 atgggagcgg gtggtgcagg cac <210> 71 <211> 30 155885-序列表.doc 33· 23 201144441 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>引子 <400> 71 tiaaacattt aaggtgcgct catagtcctc 30 ^ > > > 012 3 <21<21<21<21 A 二 7226DN人 <220> <223>引子 <400> 72 26 25 atggaccttt gcagctcaac tggaag <210> 73 <211> 25 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>引子 <400> 73 gtacgcgctg ctgccgttcc tgtag <210> 74 <213> 20 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 74 mgbaarwsyc agatycagac 7520DN人 ^ > > > 012 3 9^222 < < V v <220> <223>引子 <220〉 <223> misc feature <222〉（3)..(3) <223> η為a、c、g或t <220> <221> misc^feature <222> (9)..(9) <223〉n為a、c、g或t <400> 75 asnggyttng traavayctg 20 <210> 76 <211> 29 <212> DNA <213>人工 <220> • 34. 155885·序列表.doc 201144441 <223>引子 <220> <221> misc_feature <222> (6).7(6) <223> η為a、c、g或t <220> <221> mi sc feature <222> (12)..(12) <223〉η為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223〉n為a、c ' g或t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223〉n為 a、c、g或t <220> <221> raisc_feaiure <222> (24)..(24) <223〉n為a、c、g或t <4t00> 76 tggmgnityy tnmgncciica yacnathmg <210> 77 <211> 29 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>引子 <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> it^a、c、g或t <220> <221> mi sc feature <222> (7)..(8) n爲a、c、g或t <220> <221> misc feature <222〉（13)..(13) <223〉n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (28),.(28) <223> n>^a、c、g或t <>77 ytcngcnnhr aanarrttcc adatvmanc <210> 78 <211> 26 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <220> 155885·序列表.doc 201144441 <221> misc_feature <222> (3),.(3) <223> η爲a、c、g或t <220> <221> misc^fealurc <222> (6)..(6) <223> n爲a、c、g或t <220> <221> misc_featurc <222> (9)..(9) <223> n4；a、c、g或t <220> <221> miscjeaturc <222> (15)7.(15) <223〉n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n為a、c、g或t <220> <221> misc feature <222> (21)..(21) <223> n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n為a、c、g或t <400> 78 wsnggnytna aywsnryngt nytngc 26 <210> 79 <231> 26 <212> DNA <233>人工 <220> <223>引子 <220> <221> raise feature <222> (7)..(7) <223> n為a、c、g或t <220> <221> raise-feature <222> (13)..(13) <223> n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (19)7.(19) <223> n為a、c ' g或t <220> <221> misc_feature <222> (22)7.(22) <223> n為a、c、g或t <400> 79 raarttnccy itnccraanc cnccrc 26 <210> 80 <211> 29 <212> DNA <213> 人工 36- 155885-序列表.doc 201144441 <220> <223>引子 <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n爲a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (12)7.(12) <223> n為 a、c、g 或t <220> <221> misc feature <222> (15)7.(15) <223〉n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223〉n為a、c、g或t

<400> SO 29 tggmgnttyy tnmgnccnca yacnathmg <210> 81 <211> 29 <212> DNA <213> 人工 <220> <223>引子 <220> <221> rnisc_feature <222> (4).7(4) <223> n爲a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222〉（7)..(8) <223> n爲a、c、g或t <220> <221> msc_feature <222> (13),,(13) <223> n為a、c、g或t <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n為a、c、g或t 29 <400> 81 ytcngcnnhr aanarrttcc adatvmanc 8220DN人 0>1>2>13> <21<21<21<21 引子 37- 155885-序列表.doc 201144441 <400> 82 atgggccacc aaaacgccgc <210> <21 ]> <212〉 <213> srx <220> <223>引子 <400> 83 tcatcccact aactgttlgg cttcaag 27 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Primer <400> 84 atggagctct cgatctcaca ate 23 <210> 85 <21i> 27 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 85 clagaggaag gggaataaca gatactc 155885-序列表.doc -38-

Claims

201144441 七、申請專利範圍： 1 · 一種防治植物栽培位置處不合需要之植被之方法，該方法包含以下步驟： a) 在遠位置處提供包含至少一種核酸之植物，該核酸包含： (1)編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之野生型經苯基丙酮酸雙加氧酶或突變羥苯基丙.酮酸雙加氧酶（mut_HPPD)之核普酸序列及/或 (π)編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之野生型尿黑酸茄尼基轉移酶或突變尿黑酸茄尼基轉移酶（mut-HST)之核苷酸序列 b) 向s亥位置施用有效量之該除草劑。 2. 如凊求項〗之方法，其中⑴之該核苷酸序列包含序列π。 ID N〇: 1、3或5或其變異體或衍生物。 3. 如凊求項1之方法，其中（u)之該核苷酸序列包含序列 SEQ ID NO: 7或9或其變異體或衍生物。 4. 如叫求項1至3中任一項之方法其中該植物包含至少另異源核Ijl，其包含（iii)編碼除草劑对受性酶之核苦酸序列。 5. 如請求項！至3中任一項之方法，其中該*豆嗣衍生性除草劑連同一或多種其他HPPD及/或HST靶向除草劑一起施用。 6· -種鑑別香豆_衍生性除草劑之方法，其藉由使用由包含核苦酸序列SEQ ID N0:卜3或5或其變異體或衍生物 S 155885.doc 201144441 之核酸編碼之mut_HPPD，及/或藉由使用由包含核苷酸序列SEQ ID NO : 7或9或其變異體或衍生物之核酸編碼之mut-HST達成。 7. 如請求項6之方法，其包含以下步驟： a) 產生包含編碼mut_HPPD之核酸之轉殖基因細胞或植物’其中係表現該mut-HPPD ; b) 向a)之該轉殖基因細胞或植物及向相同種類之對照細胞或植物施用香豆酮衍生物； c) 測定施用該測試化合物之後，該轉殖基因細胞或植物及該對照細胞或植物之生長或生存力，及 d) 相較於該轉殖基因細胞或植物之生長選擇可以使該對照細胞或植物之生長降低的測試化合物。 8. —種鑑別編碼對香豆酮衍生性除草劑具有抗性或耐受性之mut-HPPD之核苦酸序列的方法，該方法包含： a) 產生mut-HPPD編碼核酸之文庫， b) 藉由在細胞或植物中表現每一該等核酸且用香豆_ 何生物處理該細胞或植物，來篩檢所得碼核酸之群體， c) 比較由該mut-HPPD編碼核酸群體提供之「香豆_衍生物」耐受性程度與由對照HppD編碼核酸提供之「香豆酮衍生物」耐受性程度， d) 相較於由該對照HPPD編碼核酸提供之對「香豆_衍生物」之耐受性程度，選擇對「香豆酮衍生物」之对受性程度顯著增進的至少一種mut HppD編碼核 155885.doc 201144441 酸。 9.如叫求項8之方法，纟中相較於由該對照印編碼核酸所提供之對香豆酮衍生性除草劑之耐受性，於步驟d)中選出之該mm-HPPD編碼核酸提供至少2倍之對香豆酮衍生性除草劑之耐受性。 10·如請求項8或9之方法，其中該抗性或耐受性係藉由產生包含步驟a)之文庫之核酸序列的轉殖基因植物，且由該轉殖基因植物與對照植物比較後加以測定。 11. 一種編碼mut_HPPD之經分離核酸，其中該核酸可藉由如請求項8至1〇中任一項所定義之方法鑑別。 12. 如靖求項11之核酸，其中該經編碼之為 ID NO: 2之變異體，其包括以下一或多者：位置293之胺基酸不為麩醯胺酸；位置335之胺基酸不為曱硫胺酸；位置3 3 6之胺基酸不為脯胺酸；位置3 3 7之胺基酸不為絲胺酸；胺基酸位置363不為麩胺酸；位置422之胺基酸不為甘胺酸；位置385之胺基酸不為白胺酸；及/或胺基酸位置393不為異白胺酸。 13. —種經野生型4mut_HPpD核酸轉型之轉殖基因植物細胞’其中導致該核酸在該植物細胞中之表現相較於野生型種類之該植物細胞，增進對香豆酮衍生性除草劑之抗性或耐受性。 14. 如請求項13之轉殖基因植物細胞，其中該野生型或mut_ hppd核酸包含選自由以下組成之群之聚核苷酸序列：a) 如SEQ ID NO: 1、3或5中所示之聚核苷酸或其變異體或 155885.doc 201144441 衍生物；b)如SEQ ID NO: 7或9中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；c)編碼如SEQ ID NO: 2、4、6、8或10中所示之多肽之聚核苷酸，或其變異體或衍生物；d)包含任何a)至c)之至少60個連續核苷酸之聚核苷酸；及e)與任何a)至d)之聚核苷酸互補之聚核苷酸。 1 5 ·如請求項14之轉殖基因植物細胞，其中c)中之SEQ ID NO: 2之該多肽之該變異體包括以下一或多者：位置293 之胺基酸不為麩醯胺酸；位置335之胺基酸不為曱硫胺酸；位置336之胺基酸不為脯胺酸；位置337之胺基酸不為絲胺酸；胺基酸位置363不為麩胺酸；位置422之胺基酸不為甘胺酸；位置385之胺基酸不為白胺酸；及/或胺基酸位置393不為異白胺酸。 16. —種包含如請求項1 3至15中任一項所定義之植物細胞之轉殖基因植物，其中導致該核酸在該植物中之表現相較於野生型種類之該植物’增進該植物對香豆酮衍生性除草劑之抗性。 17. —種表現包含SEQ ID NO: 2之經突變誘發或重組mut-HPPD之植物’該SEQ ID NO: 2之胺基酸序列在一或多個胺基酸位置不同於相應野生型植物之HPPD之胺基酸序列’其中位置293之胺基酸不為麩醯胺酸；位置335之胺基酸不為甲硫胺酸；位置336之胺基酸不為脯胺酸；位置337之胺基酸不為絲胺酸；胺基酸位置363不為麩胺酸；位置422之胺基酸不為甘胺酸；位置385之胺基酸不為白胺酸；及/或胺基酸位置393不為異白胺酸，且其中 155885.doc 201144441 該HPPD在該植物中表現時，賦予該植物相較於相應野生型種類增進的除草劑耐受性。 18. —種種子，其由包含如請求項13至15中任一項所定義之植物細胞之轉殖基因植物，或由如請求項16或17之植物產生，其中該種子為對香豆酮衍生性除草劑之抗性高於野生型種類種子之純品系種子。 19. 一種產生轉殖基因植物細胞之方法，相較於野生型種類之該植物細胞，該轉殖基因植物細胞對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進’該方法包含用包含mut-HPPD核酸之表現卡S轉型該植物細胞。 20_ —種產生轉殖基因植物之方法：其包含：（a)用包含mut_ HPPD核酸之表現卡£轉型植物細胞：及自該植物細胞產生對香豆酮衍生性除草劑之抗性增進之植物。 21. 如請求項19或20之方法，其中該mut-HPPD核酸包含選自由以下組成之群之聚核苷酸序列：a)如SEQ ID NO: 1、3 或5中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；b)如SEQ ID NO: 7或9中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物；c) 編碼如SEQ ID NO: 2、4、6、8或10中所示之多肽之聚核苷酸，或其變異體或衍生物；d)包含任何&)至〇之至少 60個連續核苷酸之聚核苷酸；及e)與任何a)至d)之聚核苷酸互補之聚核苷酸。 22. 如請求項19或20之方法，其中該表現卡匣另外包含在該植物中具有功能之轉錄起始調控區及轉譯起始調控區。 2 3. —種鑑別或選擇經轉型植物細胞、植物組織、植物或其 155885.doc 201144441 一部为之方法，其包含：i)提供經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分，其中該經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分包含如SEQ ID N〇: i、3或5中所示之聚核苷酸或其變異體或衍生物，其中該聚核苷酸編碼用作選擇標記之―HPPD多肽，且其中該經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分可包含另一個經分離聚核苷酸；Π)使該經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分與至少一種香豆酮衍生性化合物接觸；iH)確定該植物細胞、植物組織、植物或其一部分是否受該抑制性化合物影響；及iv)鑑別或選擇該經轉型植物細胞、植物組織、植物或其一部分。 155885.doc -6 -