CN110093325B

CN110093325B - 烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110093325B
Application number: CN201910146957.XA
Authority: CN
Inventors: 杨光富; 席真; 郝格非; 牛聪伟
Original assignee: Central China Normal University
Current assignee: Wuhan Zhihui Nongyao Technology Co ltd
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-02-27
Also published as: WO2020173169A1; CN110093325A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。通过将编码本发明突变体的基因转入到目标植物中，能够使得目标植物获得对PPO酶抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性不受太大影响。因此，本发明的突变体及其编码基因可用于培育具有除草剂抗性的植物。

Description

烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，编码该突变体的基因、含有该基因的重组载体和重组细胞，以及他们在提高作物除草剂抗性中的应用。

背景技术

来自烟草线粒体(Nicotiana tabacum PPO2)的原卟啉原氧化酶于1997年由Grimm组首次克隆成功^[5]。研究表明其以二聚体形式存在，由504个氨基酸组成，分子量约为55kD。

2004年，Koch等人报道了其晶体结构，他们定义了三个结构域：FAD结合域，底物结合域和膜结合域。1997年首次克隆成功烟草线粒体原卟啉原氧化酶后，Koch等人应用stop-flow的方法以Protoporphyrinogen IX为底物得到了烟草线粒体米氏常数K_m＝1.17μM，k_cat＝360min^-1。1997年Grimm课题组报道了抑制剂三氟羧草醚对烟草线粒体原卟啉原氧化酶的IC₅₀<100nM，这比人体原卟啉原氧化酶对抑制剂还要敏感10倍以上。

烟草线粒体PPO酶位于线粒体中，也是一种跨膜蛋白，同样具有溶解性低的性质。目前对其的研究同样是基于天然底物protoporphyrinogen IX的基础之上。烟草线粒体PPO酶是第一个报道的PPO酶晶体结构的种属，给科研工作者提供了结构上的信息，对科研工作者的研究具有极大的指导意义，因此对这样一个种属的研究也显得特别的重要。它的研究价值还体现在它的农学研究上，作为农药研究的重要靶标酶，烟草线粒体原卟啉原氧化酶理所当然成为了最佳选择。通过这样一种有晶体结构的酶，可以研究商品化除草剂以及新合成的抑制剂与酶之间的相互作用，可以研究抑制剂的抗性以及研发新型抑制剂。

发明内容

本发明的发明人在对烟草线粒体PPO酶研究的基础上发现，通过突变其353位点、356位点和372位点中的至少一种，并将突变体编码基因转入到目标植物中，能够使目标植物获得提高的除草剂抗性。

因此，第一方面，本发明提供了一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。

第二方面，本发明提供了一种能够编码如上所述的烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体的基因。

第三方面，本发明提供了一种含有如上所述的基因的重组载体。

第四方面，本发明提供了一种含有如上所述的重组载体的重组细胞。

第五方面，本发明提供了如上所述的原卟啉原氧化酶突变体、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组细胞在提高作物除草剂抗性中的应用。

第六方面，本发明提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：

(a)将如上所述的重组载体转入目标植物，使目标植物表达如上所述的突变体，以获得对除草剂抗性；或者

(b)通过杂交、转育或回交，将含有如上所述的重组载体的突变作物中的重组载体转移到目标植物中，使目标植物表达如上所述的突变体，以获得对除草剂抗性。

通过将编码本发明突变体的基因转入到目标植物中，能够使得目标植物获得对PPO酶抑制剂(除草剂)的抗性，但酶本身的催化活性不受太大影响。因此，本发明的突变体及其编码基因可用于培育具有除草剂抗性的植物。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为测试例1测试的六类具有代表性的商品化除草的分子结构式。

图2为测试例中目的基因扩增所采用的PCR程序。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶(以下简称为PPO酶)突变体，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基氨酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活力不变的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。

SEQ ID NO：1

MAPSAGEDKHSSAKRVAVIGAGVSGLAAAYKLKIHGLNVTVFEAEGKAGGKLRSVSQDGLIWDEGANTMTESEGDVTFLIDSLGLREKQQFPLSQNKRYIARNGTPVLLPSNPIDLIKSNFLSTGSKLQMLLEPILWKNKKLSQVSDSHESVSGFFQRHFGKEVVDYLIDPFVAGTCGGDPDSLSMHHSFPELWNLEKRFGSVILGAIRSKLSPKNEKKQGPPKTSANKKRQRGSFSFLGGMQTLTDAICKDLREDELRLNSRVLELSCSCTEDSAIDSWSIISASPHKRQSEEESFDAVIMTAPLCDVKSMKIAKRGNPFLLNFIPEVDYVPLSVVITTFKRENVKYPLEGFGVLVPSKEQQHGLKTLGTLFSSMMFPDRAPNNVYLYTTFVGGSRNRELAKASRTELKEIVTSDLKQLLGAEGEPTYVNHLYWSKAFPLYGHNYDSVLDAIDKMEKNLPGLFYAGNHRGGLSVGKALSSGCNAADLVISYLESVSTDSKRHC

其中，酶活力不变是指在相同的测定条件下，由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质的酶活力与SEQ ID NO：1的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

尽管本发明的发明人发现，只要突变SEQ ID NO：1中的353位点、356位点和372位点中的至少一个位点，便能够获得具有PPO酶抑制剂抗性的突变体，但本发明的进一步发明人发现，将353位点、356位点和372位点中的至少一个位点的非极性氨基酸取代为另外的非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸和带正电荷的极性氨基酸中的一种，所获得的PPO酶抑制剂抗性能够得到进一步提高。

进一步优选的，所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点、356位点和372位点中至少一个位点的非极性氨基氨酸被丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸中的一种所取代。

更进一步优选的，所述突变体含有至少1种如下的突变：位点356的亮氨酸突变为丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为苏氨酸、位点356的亮氨酸突变为组氨酸、位点356的亮氨酸突变为苯丙氨酸、位点356的亮氨酸突变为色氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为丙氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为苏氨酸、位点353的苯丙氨酸突变为组氨酸和位点372的亮氨酸突变为苏氨酸。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为丙氨酸所获得的蛋白，称为L356A。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为苏氨酸所获得的蛋白，称为L356T。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为组氨酸所获得的蛋白，称为L356H。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为苯丙氨酸所获得的蛋白，称为L356F。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为色氨酸所获得的蛋白，称为L356W。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点突变为丙氨酸所获得的蛋白，称为F353A。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点突变为苏氨酸所获得的蛋白，称为F353T。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点突变为组氨酸所获得的蛋白，称为F353H。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的372位点突变为苏氨酸所获得的蛋白，称为L372T。

根据本发明，获得如上突变体的方法为本领域技术人员所公知，例如，在了解了突变体的氨基酸序列的情况下，可以直接通过化学合成的方法获得，也可以先通过获得编码突变体的基因，然后通过生物表达的方法获得所述突变体。

根据本发明，本发明提供的突变体还可以进行修饰。修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对突变体进行添加修饰，举例来说，可以通过在突变体的氨基末端和/或羧基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的突变体的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表1

标签	残基数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR(SEQ ID NO：3)
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH(SEQ ID NO：4)
			FLAG	8	DYKDDDDK(SEQ ID NO：5)
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK(SEQ ID NO：6)
			c-myc	10	EQKLISEEDL(SEQ ID NO：7)

第二方面，本发明提供了编码如上所述的烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列SEQ ID NO：1及突变体的具体突变方式，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列SEQ ID NO：2以及突变体的具体突变方式，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改SEQ ID NO：2，得到本发明突变体的氨基酸序列。

优选的，编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2

ATGGCTCCTTCTGCCGGAGAAGATAAACACAGTTCTGCGAAGAGAGTCGCAGTCATTGGTGCAGGCGTCAGTGGGCTTGCTGCAGCATACAAGTTGAAAATCCATGGCTTGAATGTGACAGTATTTGAAGCAGAAGGGAAAGCTGGAGGGAAGTTACGTAGCGTGAGCCAAGATGGCCTGATATGGGATGAAGGGGCAAATACTATGACTGAAAGTGAAGGTGATGTTACATTTTTGATTGATTCTCTTGGACTCCGAGAAAAGCAACAATTTCCACTTTCACAAAACAAGCGCTACATTGCCAGAAATGGTACTCCTGTACTGTTACCTTCAAATCCAATTGATCTGATCAAAAGCAATTTTCTTTCCACTGGATCAAAGCTTCAGATGCTTCTGGAACCAATATTATGGAAGAATAAAAAGCTCTCCCAGGTGTCTGACTCACATGAAAGTGTCAGTGGATTCTTCCAGCGTCATTTTGGAAAGGAGGTTGTTGACTATCTAATTGACCCTTTTGTTGCTGGAACGTGTGGTGGTGATCCTGACTCGCTTTCAATGCACCATTCATTTCCAGAGTTGTGGAATTTAGAGAAAAGGTTTGGCTCAGTCATACTTGGAGCTATTCGATCTAAGTTATCCCCTAAAAATGAAAAGAAGCAAGGGCCACCCAAAACTTCAGCAAATAAGAAGCGCCAGCGGGGATCTTTTTCCTTTTTGGGCGGAATGCAAACACTTACTGATGCAATATGCAAAGATCTCAGAGAAGATGAACTTAGACTAAACTCTAGAGTTCTGGAATTATCTTGTAGCTGTACTGAGGACTCTGCGATAGATAGCTGGTCAATTATTTCTGCCTCTCCACACAAAAGGCAATCAGAAGAAGAATCATTTGATGCTGTAATTATGACGGCCCCACTCTGTGATGTTAAGAGTATGAAGATTGCTAAGAGAGGAAATCCATTTCTACTCAACTTTATTCCTGAGGTTGATTATGTACCGCTATCTGTTGTTATAACCACATTTAAGAGGGAAAACGTAAAGTATCCCCTTGAGGGCTTTGGGGTTCTTGTACCTTCCAAGGAGCAACAACATGGTCTCAAGACACTAGGCACCCTCTTCTCTTCTATGATGTTTCCAGATCGGGCACCAAACAATGTTTATCTCTATACTACTTTTGTTGGTGGAAGCCGAAATAGAGAACTTGCAAAAGCCTCAAGGACTGAGCTGAAAGAGATAGTAACTTCTGACCTTAAGCAGCTGTTGGGTGCTGAGGGAGAGCCAACATATGTGAATCATCTATACTGGAGTAAAGCATTTCCATTGTACGGGCATAACTATGATTCAGTCCTAGATGCAATTGACAAAATGGAGAAAAATCTTCCTGGATTATTCTATGCAGGTAACCACAGGGGGGGATTGTCAGTTGGCAAAGCATTATCTTCTGGATGCAATGCAGCTGATCTTGTTATATCATATCTTGAATCCGTCTCAACTGACTCCAAAAGACATTGCTGA。

根据本发明，在如上获知突变体以及SEQ ID NO：2的基础上，本领域技术人能够容易的获得编码本申请突变体的基因。例如，可以在SEQ ID NO：2的基础上进行定点突变，所述定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法、和/或CRISPR-Cas9等基因组定点突变方法。

根据本发明一种具体的实施方式，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的356位点突变为丙氨酸所获得的蛋白，其编码序列称为L356A。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表1所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组细胞含有如上所述的基因。

根据本发明，所述重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，可以根据具体的情况进行选择，例如，可以为pGWC、pB2GW7.0或pET-28a等。重组载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。

第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有如上所述的重组载体。

可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，可以根据实际情况进行选择。所述细胞可以为DH5α菌株、农杆菌菌株GV3101等。

第四方面，本发明还提供了如上所述的原卟啉原氧化酶突变体、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的重组细胞在提高作物除草剂抗性中的应用。

其中，所述除草剂可以为本领域公知的各种草线粒体的原卟啉原氧化酶抑制剂(以下称为PPO酶抑制剂)，例如但不限于，二苯醚类化合物、环酰亚胺类化合物、酞酰亚胺类化合物、三唑啉酮类化合物和嘧啶二酮类化合物中的至少一种，更优选为三氟羧草醚、乙氧氟草醚、磺酰三唑酮、氟磺胺草醚、恶草酮、氯酞亚胺、苯嘧磺草胺、Y11049和Y11102中的至少一种。

第五方面，本发明还提供了一种提高作物除草剂抗性的方法，该方法包括：

根据本发明，将如上所述的重组载体转入目标植物具体是指将本发明获得的具有除草剂抗性的突变体的核苷酸序列，通过转基因的方法转入目标植株，使目标植株获得对烟草线粒体的原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂的抗性。还可通过杂交、转育、回交等方法，将本发明中获得的突变体的核苷酸序列转移到目标植株中，使目标植株获得对烟草线粒体的原卟啉原氧化酶抑制剂类除草剂的抗性。更具体的，可将该突变体作为亲本材料，与其它优良植物品种杂交并进一步回交，把抗除草剂性状进一步转育到其它目标品种中。

本发明上述的转基因方法为本领域技术人员所公知。所述转化方法包括直接或间接的转化方法。直接转化方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄入、脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及显微注射等。在本发明的具体实施方式中，本发明使用了基于农杆菌菌株的转化技术。

本发明中，术语“植物”具有最广泛的意义，植物的实例包括但不限于，维管束植物、蔬菜、粮食、花卉、乔木、草本植物、灌木、草类、藤本植物、蕨类植物、苔藓、真菌及藻类等，以及用于无性繁殖的克隆及植物部分(例如插条、压条、嫩枝、根茎、地下茎、丛生秆、根颈、鳞茎、球茎、块茎、根茎、组织培养中产生的植物/组织等)。术语“植物”进一步涵盖整个植物、植物亲代及后代、以及植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花、小花、果实、肉茎、花序梗、雄蕊、花药、柱头、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、叶毛、种毛、花粉粒、小孢子、子叶、下胚轴、上胚轴、木质部、韧皮部、薄壁组织、胚乳、伴胞、保卫细胞、及植物的任何其它己知器官、组织和细胞、以及组织和器官。术语“植物”还涵盖植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉及小孢子。其中，以上所提及的均包括本发明提供的目的基因/核酸。

尤其适用于本发明方法中的植物包括属于超家族植物界(Viridiplantae)的所有植物，特别是单子叶和双子叶植物，包括饲料或草料豆科植物、观赏植物、粮食作物、乔木或灌木，根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例尤其包括大豆、向日葵、油菜、苜蓿、棉花、蕃茄、马铃薯或烟草。更优选地，植物为单子叶植物，例如甘蔗。更优选地，植物为谷物，例如水稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、高梁或燕麦。

本发明取得的有益效果在于获得可替代现有技术的使植物具有除草剂抗性的蛋白质、核酸、表达盒、载体、细胞、植物，获得具有除草剂抗性的植物的应用和方法，并且可以通过转基因或非转基因方法获得具有除草剂抗性的植物品种。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

委托北京博尔迈生物技术有限公司根据SEQ ID NO：2所示的核酸序列合成如表2所示突变体的编码基因以及SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

表2

蛋白质	编码基因	突变位点密码子
			F353A	F353A	GCC
F353T	F353T	ACC
			F353H	F353H	CAC
L356A	L356A	GCC
			L356T	L356T	ACC
L372T	L372T	ACC
			SEQ ID NO：2	WT(野生型)	--

测试例

本测试例用于说明本发明的突变体对除草剂的离体活性

1、表达载体的构建

1)目的基因的扩增

分别以如上表2中的核酸序列为模板，通过PCR获取烟草线粒体原卟啉原氧化酶的基因序列。在设计的两条引物中分别引入Sac I和EcoR I酶切位点以便于把PCR产物连入表达载体pET-28a中。

上游引物：5’-cttgaattcatggctccttctgccggag-3’(SEQ ID NO：8)

下游引物：5’-ggggagctctcagcaatgtcttttggag-3’(SEQ ID NO：9)

PCR程序：如图2所示。

2)琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物：

配制1.5％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。在PCR产物加入上样缓冲液，混匀，上样，电泳。

·用解剖刀将目标条带切下，转移至1.5mL离心管。加入约0.5mL 0.3mol/L乙酸钠(pH5.2)，于65℃加热15min，在放于37℃摇床200rpm，2h或过夜孵育。

·将盛有胶条的离心管于12500rpm，离心10min。将上清溶液转移至新的离心管中。

·加入等体积0.5mL的Tris-饱和酚，剧烈震摇。12500rpm，离心10min。将上清溶液转移至新的离心管中。

·加入等体积0.5mL的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,v/v)，剧烈震摇。12500rpm，离心10min。将上清溶液转移至新的离心管中。

·加入等体积0.5mL的氯仿，剧烈震摇。12500rpm，离心5min。将上清溶液转移至新的离心管中，加入等倍体积的异丙醇，混匀。于-20℃放置1h。

·12500rpm，4℃，离心10min。弃去上清液。

·用0.2mL 70％的乙醇溶液清洗沉淀，12500rpm，4℃，离心10分钟。弃去上清液。

●SpeedVac旋干沉淀。样品以1×TE缓冲液重悬。

2)酶切反应

电泳验证得到大小片段正确的DNA后，对pET-28a载体(Invitrogen)和DNA进行双酶切。

pET-28a载体双酶切反应：

PCR产物双酶切反应：

37℃，2-3h。两个酶切产物都经胶纯化，步骤参见琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物。

3)连接反应

16℃，16h以上。

2、目标蛋白的表达

1)转化

将连接产物转入BL21(DE3)宿主细胞(stratagene)中。

◆将单菌落接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中。37℃震荡培养过夜。次日按1％(v/v)的量转入新鲜的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀＝0.3-0.6。(很重要)

◆将50-100ml的培养液转入两个预冷的无菌离心管中，于冰上放置30分钟。

◆4℃，4000rpm，离心10min，弃上清。

◆向每管加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液重旋菌体，冰浴30min。

◆4℃，4000rpm，10min。

◆弃上清，再将菌体悬浮于2ml冰冷的0.1mol/L CaCL₂溶液中，即为感受态细胞，-80℃保存。

◆用无菌吸头取100μl感受态细胞置1.5ml预冷的无菌ep管中，加入10-100ng待转化的DNA(5-8μl连接产物)，轻轻混匀，立即置冰上30min。

◆将管置恒温42℃水浴中热激90s。

◆放回冰上3-5min。

◆加入400μl SOC液体培养基，混匀，37℃预表达45-60min。(37℃摇床200rpm)

◆将预表达的菌液涂在含有相应抗性的平板上，涂匀，涂干。先正置等菌液晾干，然后倒置培养，37℃，约12h。

从平板上挑起单菌落，于2×YT培养基中，37℃过夜培养，制成甘油管，送公司测序。

2)表达

◆从平板上挑取单菌落，于25mL 2×YT(Kana，50μg/mL)培养基中，37℃，220rpm过夜培养。

◆次日，把25mL的过夜培养物按1％转到500ml 2×YT(Kana，50μg/mL)培养基中，37℃，220rpm培养到OD＝0.6-0.7。

◆表达蛋白：加入IPTG进行诱导，终浓度为0.25mM。18℃、220rpm继续培养过夜。

◆收获菌体：把培养物倒到灭菌的离心管中，12500rpm离心1min。收集沉淀。

◆用预冷的50mM Tris-HCl(pH＝8.0)洗涤沉淀两次，沉淀可在-20℃或-80℃冻存。

3)纯化

◆把收获的菌体按(1g/10mL)重悬在lysis buffer中。

◆按(plus on 1s,plus off 9s)的超声程序于冰上进行超声处理1min30s，超声两次，振幅为37％，然后离心，12500rpm，4℃，约45min。

◆把装入TALON Metal Affinity Resin的柱子中的乙醇滤去，5ml lysis buffer平衡柱子。

◆粗酶裂解液上柱，与介质混匀，放于摇床上4℃中孵育2h。

◆取1mL的wash buffer洗杂蛋白，一共洗4次。

◆取1mL的elution buffer洗脱目的蛋白，一共6次。

电泳检测蛋白纯度，并按照BCA法检测蛋白浓度。

3、除草剂抑制动力学研究

应用96孔板荧光检测酶活的方法，测定在饱和的底物浓度下，不同浓度的抑制剂对酶的反应动力学。本实验主要检测了9类具有代表性的商品化除草剂(二苯醚类(三氟羧草醚，乙氧氟草醚、氟磺胺草醚)，酞酰亚胺类(氯酞亚胺)，三唑啉酮类(磺酰三唑酮)，噁二唑类(噁草酮)，各抑制剂的分子式如图1所示，苯嘧磺草胺

Y11049

和Y11102

)对的抑制动力学，结果如表3所示。

参比样：指在酶反应体系中加入底物和溶解抑制剂的有机溶剂(2μlDMSO)，将其看作酶在没有抑制剂的存在下的全活性(full activity)。

样品样：在酶反应体系中加入不同浓度的抑制剂，观察抑制剂对酶活性的影响。

数据处理:

IC₅₀值根据以下公式拟合得到：

K_i值符合以下关系：

在以上两个公式中：

y——在对应浓度抑制剂存在下残留活性与未加抑制剂活性的百分比

max、min——相对活性的最大值和最小值

x——对应抑制剂浓度

IC₅₀——残留活性为50％时相对应抑制剂浓度

K_i——抑制剂的抑制常数

[S]——饱和的底物浓度

K_m——酶的米氏常数

表3

由表3可以看出，抑制剂对本发明突变体的抑制活性减弱，也即，本发明的突变体对除草剂不敏感，因此，可用于提高作物的除草剂抗性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中师范大学

<120> 烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体及其编码基因和应用

<130> I56097CCNU

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 504

<212> PRT

<213> 野生型原卟啉原氧化酶

<400> 1

Met Ala Pro Ser Ala Gly Glu Asp Lys His Ser Ser Ala Lys Arg Val

1 5 10 15

Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu

20 25 30

Lys Ile His Gly Leu Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Glu Gly Lys Ala

35 40 45

Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Ser Gln Asp Gly Leu Ile Trp Asp Glu

50 55 60

Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ser Glu Gly Asp Val Thr Phe Leu Ile

65 70 75 80

Asp Ser Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Phe Pro Leu Ser Gln Asn

85 90 95

Lys Arg Tyr Ile Ala Arg Asn Gly Thr Pro Val Leu Leu Pro Ser Asn

100 105 110

Pro Ile Asp Leu Ile Lys Ser Asn Phe Leu Ser Thr Gly Ser Lys Leu

115 120 125

Gln Met Leu Leu Glu Pro Ile Leu Trp Lys Asn Lys Lys Leu Ser Gln

130 135 140

Val Ser Asp Ser His Glu Ser Val Ser Gly Phe Phe Gln Arg His Phe

145 150 155 160

Gly Lys Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile Asp Pro Phe Val Ala Gly Thr

165 170 175

Cys Gly Gly Asp Pro Asp Ser Leu Ser Met His His Ser Phe Pro Glu

180 185 190

Leu Trp Asn Leu Glu Lys Arg Phe Gly Ser Val Ile Leu Gly Ala Ile

195 200 205

Arg Ser Lys Leu Ser Pro Lys Asn Glu Lys Lys Gln Gly Pro Pro Lys

210 215 220

Thr Ser Ala Asn Lys Lys Arg Gln Arg Gly Ser Phe Ser Phe Leu Gly

225 230 235 240

Gly Met Gln Thr Leu Thr Asp Ala Ile Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asp

245 250 255

Glu Leu Arg Leu Asn Ser Arg Val Leu Glu Leu Ser Cys Ser Cys Thr

260 265 270

Glu Asp Ser Ala Ile Asp Ser Trp Ser Ile Ile Ser Ala Ser Pro His

275 280 285

Lys Arg Gln Ser Glu Glu Glu Ser Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala

290 295 300

Pro Leu Cys Asp Val Lys Ser Met Lys Ile Ala Lys Arg Gly Asn Pro

305 310 315 320

Phe Leu Leu Asn Phe Ile Pro Glu Val Asp Tyr Val Pro Leu Ser Val

325 330 335

Val Ile Thr Thr Phe Lys Arg Glu Asn Val Lys Tyr Pro Leu Glu Gly

340 345 350

Phe Gly Val Leu Val Pro Ser Lys Glu Gln Gln His Gly Leu Lys Thr

355 360 365

Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asn

370 375 380

Asn Val Tyr Leu Tyr Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser Arg Asn Arg Glu

385 390 395 400

Leu Ala Lys Ala Ser Arg Thr Glu Leu Lys Glu Ile Val Thr Ser Asp

405 410 415

Leu Lys Gln Leu Leu Gly Ala Glu Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asn His

420 425 430

Leu Tyr Trp Ser Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Gly His Asn Tyr Asp Ser

435 440 445

Val Leu Asp Ala Ile Asp Lys Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Leu Phe

450 455 460

Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ala Leu Ser

465 470 475 480

Ser Gly Cys Asn Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu Ser Val

485 490 495

Ser Thr Asp Ser Lys Arg His Cys

500

<210> 2

<211> 1515

<212> DNA

<213> 野生型原卟啉原氧化酶编码基因

<400> 2

atggctcctt ctgccggaga agataaacac agttctgcga agagagtcgc agtcattggt 60

gcaggcgtca gtgggcttgc tgcagcatac aagttgaaaa tccatggctt gaatgtgaca 120

gtatttgaag cagaagggaa agctggaggg aagttacgta gcgtgagcca agatggcctg 180

atatgggatg aaggggcaaa tactatgact gaaagtgaag gtgatgttac atttttgatt 240

gattctcttg gactccgaga aaagcaacaa tttccacttt cacaaaacaa gcgctacatt 300

gccagaaatg gtactcctgt actgttacct tcaaatccaa ttgatctgat caaaagcaat 360

tttctttcca ctggatcaaa gcttcagatg cttctggaac caatattatg gaagaataaa 420

aagctctccc aggtgtctga ctcacatgaa agtgtcagtg gattcttcca gcgtcatttt 480

ggaaaggagg ttgttgacta tctaattgac ccttttgttg ctggaacgtg tggtggtgat 540

cctgactcgc tttcaatgca ccattcattt ccagagttgt ggaatttaga gaaaaggttt 600

ggctcagtca tacttggagc tattcgatct aagttatccc ctaaaaatga aaagaagcaa 660

gggccaccca aaacttcagc aaataagaag cgccagcggg gatctttttc ctttttgggc 720

ggaatgcaaa cacttactga tgcaatatgc aaagatctca gagaagatga acttagacta 780

aactctagag ttctggaatt atcttgtagc tgtactgagg actctgcgat agatagctgg 840

tcaattattt ctgcctctcc acacaaaagg caatcagaag aagaatcatt tgatgctgta 900

attatgacgg ccccactctg tgatgttaag agtatgaaga ttgctaagag aggaaatcca 960

tttctactca actttattcc tgaggttgat tatgtaccgc tatctgttgt tataaccaca 1020

tttaagaggg aaaacgtaaa gtatcccctt gagggctttg gggttcttgt accttccaag 1080

gagcaacaac atggtctcaa gacactaggc accctcttct cttctatgat gtttccagat 1140

cgggcaccaa acaatgttta tctctatact acttttgttg gtggaagccg aaatagagaa 1200

cttgcaaaag cctcaaggac tgagctgaaa gagatagtaa cttctgacct taagcagctg 1260

ttgggtgctg agggagagcc aacatatgtg aatcatctat actggagtaa agcatttcca 1320

ttgtacgggc ataactatga ttcagtccta gatgcaattg acaaaatgga gaaaaatctt 1380

cctggattat tctatgcagg taaccacagg gggggattgt cagttggcaa agcattatct 1440

tctggatgca atgcagctga tcttgttata tcatatcttg aatccgtctc aactgactcc 1500

aaaagacatt gctga 1515

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

His His His His His His

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 上游扩增引物

<400> 8

cttgaattca tggctccttc tgccggag 28

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 下游扩增引物

<400> 9

ggggagctct cagcaatgtc ttttggag 28

Claims

1.一种烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的353位点和356位点中至少一个位点的非极性氨基酸被丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和组氨酸中的一种所取代的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的突变体，其中，所述突变体为L356A、L356T、L356H、L356F、L356W、F353A、F353T或F353H。

3.一种编码权利要求1或2所述的烟草线粒体的原卟啉原氧化酶突变体的基因。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的基因。

5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求4所述的重组载体。

6.权利要求1或2所述的原卟啉原氧化酶突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组细胞在提高作物除草剂抗性中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述除草剂为烟草线粒体的原卟啉原氧化酶抑制剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其中，所述除草剂为二苯醚类化合物、环酰亚胺类化合物、酞酰亚胺类化合物、三唑啉酮类化合物和嘧啶二酮类化合物中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述除草剂为三氟羧草醚、乙氧氟草醚、磺酰三唑酮、氟磺胺草醚、恶草酮、氯酞亚胺、苯嘧磺草胺、Y11049和Y11102中的至少一种。

10.一种提高作物除草剂抗性的方法，其特征在于，该方法包括：

（a）将权利要求4所述的重组载体转入目标植物，使目标植物表达权利要求1或2所述的突变体，以获得对除草剂抗性；或者

（b）通过杂交、转育或回交，将含有权利要求4所述的重组载体的突变作物中的重组载体转移到目标植物中，使目标植物表达权利要求1或2所述的突变体，以获得对除草剂抗性。