CZ302074B6 - Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné bunky a zpusob pro zlepšení genové exprese v rostlinách - Google Patents
Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné bunky a zpusob pro zlepšení genové exprese v rostlinách Download PDFInfo
- Publication number
- CZ302074B6 CZ302074B6 CZ20010597A CZ2001597A CZ302074B6 CZ 302074 B6 CZ302074 B6 CZ 302074B6 CZ 20010597 A CZ20010597 A CZ 20010597A CZ 2001597 A CZ2001597 A CZ 2001597A CZ 302074 B6 CZ302074 B6 CZ 302074B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- rice
- isolated
- sequence
- wheat
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 102
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 143
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 138
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 138
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 119
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 80
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 76
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 63
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 54
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 36
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 35
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 31
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 20
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 15
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 15
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 15
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 claims description 14
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 14
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 claims description 14
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 claims description 14
- 108010017464 Fructose-Bisphosphatase Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 10
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 claims description 10
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 8
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 8
- QKHXKQJMUZVCJM-QRPNPIFTSA-N (2s)-2-amino-3-phenylpropanoic acid;azane Chemical compound N.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 QKHXKQJMUZVCJM-QRPNPIFTSA-N 0.000 claims description 6
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 3
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 claims description 3
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 claims description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 2
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims 36
- 102000012195 Fructose-1,6-bisphosphatases Human genes 0.000 claims 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims 1
- 108091000085 chlorophyll binding Proteins 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 102
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 55
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 25
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 20
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 19
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 16
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 13
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 10
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 6
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 102000027487 Fructose-Bisphosphatase Human genes 0.000 description 5
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 5
- 229940060587 alpha e Drugs 0.000 description 5
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 5
- 239000000571 coke Substances 0.000 description 5
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 101150002000 hsp-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 5
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 4
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 3
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- -1 phenylalanine amine Chemical class 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 4-methylumbelliferone beta-D-glucuronide Chemical compound C1=CC=2C(C)=CC(=O)OC=2C=C1O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ARQXEQLMMNGFDU-JHZZJYKESA-N 0.000 description 2
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 2
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 2
- 240000000385 Brassica napus var. napus Species 0.000 description 2
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 101100126625 Caenorhabditis elegans itr-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 101100437498 Escherichia coli (strain K12) uidA gene Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 101001040866 Oryza sativa subsp. japonica Glutelin type-A 2 Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 108700022207 wheat peroxidase Proteins 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N (6r,7r)-3-[[2-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]pyridin-1-ium-1-yl]methyl]-8-oxo-7-[(2-thiophen-2-ylacetyl)amino]-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=[N+]1CC1=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CC=3SC=CC=3)[C@H]2SC1 FCHBECOAGZMTFE-ZEQKJWHPSA-N 0.000 description 1
- 150000005206 1,2-dihydroxybenzenes Chemical class 0.000 description 1
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710197633 Actin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101710117679 Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710083587 Antifungal protein Proteins 0.000 description 1
- 235000003276 Apios tuberosa Nutrition 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000010744 Arachis villosulicarpa Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N Chalcone Natural products C=1C=CC=CC=1C(=O)C=CC1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 241000233838 Commelina Species 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100125036 Dictyostelium discoideum hspL gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- AHMIDUVKSGCHAU-UHFFFAOYSA-N Dopaquinone Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC(=O)C(=O)C=C1 AHMIDUVKSGCHAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AHMIDUVKSGCHAU-LURJTMIESA-N L-dopaquinone Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC(=O)C(=O)C=C1 AHMIDUVKSGCHAU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 244000081841 Malus domestica Species 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 244000133018 Panax trifolius Species 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003889 Piper guineense Species 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 101800001646 Protein n Proteins 0.000 description 1
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 1
- 239000013616 RNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 101100084449 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 239000002647 aminoglycoside antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 235000005513 chalcones Nutrition 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 210000003002 eukaryotic large ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N herniarin Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 LIIALPBMIOVAHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N herniarin Natural products C1CC(=O)OC2=CC(OC)=CC=C21 JHGVLAHJJNKSAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N methylumbelliferone Natural products C1=C(O)C=C2OC(=O)C(C)=CC2=C1 ZLQJVGSVJRBUNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N neopentyl glycol Chemical compound OCC(C)(C)CO SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N o-dihydroxy-benzene Natural products OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150003509 tag gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N trans-chalcone Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 DQFBYFPFKXHELB-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Rešení poskytuje rekombinantní DNA molekuly, které obsahují genové elementy, a mikroorganismy, rostlinné bunky a rostliny transformované DNA molekulami. Dále se týká zpusobu pro zlepšení genové exprese v rostlinách.
Description
Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné buňky a způsob pro zlepšení genové exprese v rostlinách
Oblast techniky
Vynález se obecně týká genového inženýrství rostlin. Přesněji se týká zdokonalených systémů genové exprese pro transgenní rostliny s použitím různých kombinací genových elementů v rostlinné expresní kazetě. Vynález se dále týká rekombinantních DNA molekul, které obsahují genoio vé elementy, a mikroorganismů, rostlinných buněk a rostlin transformovaných DNA molekulami.
Vynález se dále týká způsobu pro zlepšení genové exprese v rostlinách.
Dosavadní stav techniky 15
Současné postupy genového inženýrství poskytují potřebné nástroje, které umožňují transformovat rostliny tak, aby obsahovaly cizí geny. Konstruktem požadovaného rekombinantního rostlinného genu a jeho zavedením do rostlinných buněk je dnes možné vytvořit transgenní rostliny, které mají jedinečné znaky z hlediska hospodářského významu.
V genovém inženýrství rostlin jsou velmi ceněny konzistentní a spolehlivé genové elementy pro použití při konstrukci rekombinantních rostlinných genů. Mnoho takových elementů může zvýšit úrovně genové exprese určitého genu, který je středem zájmu. Přitom mají tyto elementy několik výhod. Za prvé, může být díky optimální kombinaci genových elementů, které poskytnou zvýše25 né úrovně exprese, dosaženo lépe vyjádřeného fenotypu. To je způsobeno v mnoha příkladech pozorovaným vztahem mezi úrovní transgenní exprese v transgenní rostlině a velikostí změny požadovaného znaku rostliny.
Za druhé, nepřekládané genové elementy, které jsou schopny zlepšit expresi, mohou snížit na minimum některé kroky v produkci transgenních rostlin. Čím vyšši jsou dosažené úrovně exprese, tím menší je počet rostlin, které je zapotřebí vyprodukovat a vytřídit, aby byly získány ty rostliny, které produkují množství cílového proteinu nebo molekulu RNA postačující k tomu, aby se projevil požadovaný, z hlediska zemědělského výhodný, fenotyp.
A konečně, znalost různých alternativ genových elementů poskytuje navíc tu výhodu, že je možno snížit přebytek vektorových elementů. Jsou-li tedy namnožené nezávislé trasgeny zavedeny do transgenních rostlinných linií, použití alternativních expresních vektorových elementů v různých transgenech pomáhá snížit inhibici genové exprese, která souvisí s homologii.
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje kombinace genových elementů pro použití při konstrukci rekombinantních molekul DNA, které jsou schopny exprese v rostlinách. Rekombinantní molekula DNA obsahu45 jící kombinace genových elementů podle vynálezu vykazuje zvýšené úrovně exprese, což je výhodné pro transformaci a regeneraci transgenních rostlin. Zvýšené úrovně exprese dosažitelné pomocí elementů podle vynálezu mají četné výhody, například méně náročný třídicí proces, který je nezbytný pro produkci transgenních rostlin a zlepšení fenotypu takto produkovaných rostlin. Elementy jsou kromě toho vhodnými alternativami pro zlepšení možnosti uplatnění genu v tras50 genních rostlinách, protože minimalizují opakování sekvencí, které bývá spojeno s nestabilitou transgenní exprese.
Z jednoho hlediska tedy vynález poskytuje rekombinantní molekulu DNA, která obsahuje funkčně připojené ve směru 5', 3':
-1 CZ 302074 B6 (a) promotorovou sekvenci, která je funkční v rostlinách;
(b) 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci SEQ NO 52 izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro vazebný protein chloros fy lu a/b;
(c) sekvenci intronu, vybranou ze sekvencí SEQ NO 47 až 51, izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z rýžového genu pro aktin, rýžového genu pro sacharózasyntázu, rýžového genu pro fenylalaninamoniumlygázu, rýžového io genu pro amylázu a kukuřičného genu pro protein tepelného šoku;
(d) kódující sekvenci DNA, která je funkční v rostlinách a (e) 3' nepřekládanou terminační sekvenci, vybranou ze sekvencí SEQ NO 58 až 63, izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro protein tepelného šoku, pšeničného genu ubichitinu, pšeničného genu pro fruktóza-1,6-b i sfosfatázu, rýžového genu pro glutelin, rýžového genu pro laktátdehydrogenázu a rýžového genu pro beta-tubulin.
Z dalšího hlediska poskytuje vynález Způsob pro zlepšení genové exprese v rostlinách, přičemž (a) rostlinné buňky s rekombinantní molekulou DNA, která obsahuje, funkčně spojené ve směru
5', 3' (i) promotorovou sekvenci;
(ii) 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro vazebný protein chlorofylu a/b a jeho funkčně ekvivalentních variant;
(iii) kódující sekvenci DNA;
(iv) sekvenci intronu spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z rýžového genu pro aktin, rýžového genu pro sacharózasyntázu, rýžového genu pro fenylalaninamo35 niumlygázu ajejich funkčně ekvivalentních variant a (v) 3' nepřekládanou terminační sekvenci spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro protein tepelného šoku, pšeničného genu ubichitin, pšeničného genu pro fruktóza-l,6-bisfosfatázu, rýžového genu pro glutelin, rýžového genu to pro laktátdehydrogenázu a rýžového genu pro beta- tubulin ajejich funkčně ekvivalentních variant, se transformují;
(b) rostlinné buňky, které byly transformovány, se vyberou; a (c ) regenerují se pro získání odlišné rostliny.
Dalším předmětem vynálezu je rostlinná buňka obsahující DNA molekuly podle vynálezu a tkáně, semena a různé rostliny pomocí nich vyprodukované. Další předměty, aspekty a výhody vynálezu budou odborníkům vdané oblasti zřejmé, po seznámení s následujícími popisy, příklady a nároky.
Vynález poskytuje genové elementy pro zlepšení exprese rekombinantních rostlinných genů, které zahrnují nové kombinace intronu a 5' a 3' nepřekládané genové elementy, které jsou zde popsány. DNA sekvence a způsoby podle vynálezu umožňují produkci transgenních rostlin, které ss mají zvýšené úrovně požadované molekuly RNA nebo molekuly proteinu, který je středem záj-2CZ 302074 B6 mu, a to tím způsobem, že usnadní převedení zemědělsky výhodných znaků do rostlin, pomocí genového inženýrství.
Pojmy „rekombínantní rostlinný gen“ nebo „rekombínantní molekula DNA“ znamenají v kontextu vynálezu kombinaci genových elementů, které jsou funkčně spojeny tak, aby podle nich mohla probíhat exprese požadované molekuly RNA a/nebo proteinu v rostlinné buňce. DNA molekuly mohou být konstruovány s použitím standardních postupů, dobře známých odborníkům v dané oblasti.
Obecně řečeno, rekombínantní rostlinný gen je funkčně uspořádaný od 5' ke 3' konci a obsahuje: (1) oblast promotoru, která je odpovědná za tvorbu molekuly RNA; (2) 5' nepřekládanou sekvenci; (3) kódující sekvenci DNA, která kóduje požadovanou molekulu RNA a/nebo protein a (4) 3' nepřekládanou oblast. Oblast genu nazývaná promotor je odpovědná za řízení traskripce DNA na RNA. Promotory obsahují DNA sekvence, obvykle se nacházející na 5' konci kódující sekvence, které řídí expresi kódující sekvence tak, že kontrolují tvorbu mRNA - poskytují rozpoznávací místo pro RNA polymerázu a/nebo jiné faktory nezbytné pro iniciaci transkripce na správném místě. Promotor použitý v rekombinantním rostlinném genu podle vynálezu je vybrán tak, aby poskytl transkripční aktivitu postačující k dosažení požadovaných úrovní exprese genu nebo genů, kteréjsou žádány.
Je známo mnoho funkčních rostlinných promotorů a mohou být získány z nejrůznějších zdrojů, například z rostlin nebo rostlinných virů a mohou obsahovat, ale nejsou tím omezeny, 35S promotor viru květákové mozaiky (CaMV) (Oděli a kol, 1985), 35S promotor viru mozaiky krtičníku (FMV) (Sanger a kol. 1990), promotor tyčinkového viru cukrové třtiny (Bouhida a kol., 1993), promotor viru commelina žluté skvrnitosti (Medberry a Olszewski 1993), lehký inducibilní promotor z malé podjednotky ribulóza— 1,5-bis-fosfát-karboxylázy (ssRUBISCO) (Coruzzi a kol., 1984), promotor rýžové cytosolik-triosefosfát-izomerázy (TPI) (Xu a kol., 1994), promotor adenin-fosforíbosyltransferázy (APRT) Arabidopsis (Moffat a kol., 1994), promotor rýžového genu pro aktin 1 (Zhong a kol., 1996) a promotory mannopin syntázy a oktopin syntázy (Ni a kol., 1995). Všechny tyto promotory se používají při různých typech konstrukcí rekombínantní DNA, která může být exprimována v rostlinách. Srovnávací analýza konstitutivních promotorů pomocí exprese značkovacích genů, například gen pro uidA (β-glukuronidáza) z E. coli, byla provedena s mnoha takovými geny (Li a kol., 1997; Wen a kol, 1993). Jiné vhodné promotory jsou, nejsou však omezeny na promotory, kteréjsou exprimovány pro tkáň specifickým, tkáň rozšiřujícím nebo vývojově regulovaným způsobem. Příklady těchto typů promotorů jsou také známy odborníkům v dané oblasti.
Kromě promotorové sekvence, která řídí expresi funkčně připojených DNA sekvencí, mohou hrát roli ve zlepšení genové exprese další genové elementy. Tyto elementy zahrnují, ale nejsou omezeny na, nepřekládané oblasti a vložené sekvence (introny), kteréjsou spojeny s geny, ke kterým jsou funkčně připojeny. Slovy „spojeny s“, která zde byla použita, je míněno, že genový element se obvykle nachází ve spojení s genem v průběhu procesování genu, například v průběhu transkripce nebo translace.
5' nepřekládaná oblast mRNA může hrát důležitou roli pri iniciaci translace a tedy při regulaci genové exprese. 5' nepřekládaná vedoucí sekvence je charakterizována jako ta část mRNA molekuly, která obvykle jde z 5' CAP místa k AUG iniciačnímu kodonu translace proteinu. U většiny eukaryotických mRNA molekul začíná translace vazbou vazebného proteinu CAP na mRNA cap. Pak následuje vazba několika dalších translačních faktorů, stejně jako 43S ríbozomového preiniciačního komplexu. Tento komplex postupuje dále po mRNA molekule a hledá AUG iniciační kodon ve vhodném sekvenčním kontextu. Jakmile jej nalezne, připojí se 60S ribozomální podjednotka a kompletní 80S iniciační komplex iniciuje translaci proteinu (Pain, 1986; Moldave, 1985; Kozák, 1986). Druhá třída molekul mRNA má odlišné rysy iniciace translace. Translace podle těchto molekul mRNA začíná nezávisle na CAP a předpokládá se, že začíná vazbou ribozomu na
- j CZ 302074 B6 interní části 5' konce nepřekládané vedoucí sekvence (Sonenberg, 1990; Carrington a Freed,
1990; Jackson a kol. 1990).
Účinnost iniciace translace může záviset na vlastnostech 5' nepřekládané vedoucí sekvence, s takže určení a optimalizace 5' vedoucí sekvence může poskytnout zlepšení úrovní genové exprese v transgenních rostlinách. Například některé studie se zabývaly použitím 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí rostlinných virů vzhledem k jejich účinkům na genovou expresi rostlin (Gallie a kok, 1987; Jobling a Gehrke, 1987; Skuzeski a kok, 1990). Zvýšení genové exprese bylo uvedeno při použití vedoucí sekvence viru omega tabákové mozaiky (TMV). Ve srovnání ío sjinými virovými vedoucími sekvencemi, například vedoucí sekvence viru alfa mozaiky RNA4 (AMV), bylo pozorováno při použití vedoucí sekvence TMV omega dvojnásobné až trojnásobné zlepšení úrovní genové exprese (Gallie a kok, 1987; Skuzeski a kok, 1990). Uvádí se, že také nepřekládané vedoucí sekvence spojené s geny proteinů tepelného šoku významně zvyšují genovou expresi u rostlin (viz například patent US 5 362 865).
Většina sekvencí, které nepodléhají translaci je bohatá na páry A TJ a předpokládá se, že tyto sekvence postrádají významnou sekundární strukturu. Jedním z prvních kroků iniciace translace je uvolnění nebo rozvinutí sekundární struktury mRNA (Sonenberg, 1990). Vedoucí sekvence mediátorové RNA se zanedbatelnou sekundární strukturou mRNA nevyžadují tento krok roz20 vinutí a mohou proto být přístupnější iniciačním komponentám translace. Vedoucí sekvence, které mohou tvořit stabilní sekundární struktury mohou snižovat úroveň genové exprese (Kozák, 1988; Pelletíer a Sonenberg, 1985). Schopnost 5' nepřekládané vedoucí sekvence reagovat s translačními komponentami, může hrát klíčovou roli v ovlivnění úrovní následné genové exprese.
5' nepřekládané oblasti podle vynálezu jsou schopny zvýšit úroveň exprese přepisované sekvence, ke které jsou funkčně připojeny. 5' nepřekládané oblasti mohou být spojeny s genem ze zdroje, který je vlastní nebo cizorodý s ohledem na jiné nepřekládané a/nebo překládané elementy přítomné v rekombinantním genu.
Nepřekládané sekvence na 5' konci podle vynálezu jsou izolované sekvence nukleové kyseliny spojené s rostlinnými geny, s výhodou z jednoděložných rostlin, například pšenice a rýže, nejsou však na ně omezeny. Zvláště výhodné jsou 5' nepřekládané oblasti spojené s geny jednodě ložných rostlin, které kódují vazebné proteiny chlorofylu a/b. Tyto 5' nepřekládané oblasti jsou ve vynálezu s výhodou zastoupeny 5' nepřekládanou oblastí spojenou s pšeničným genem pro vazebný protein chlorofylu a/b (5' Ta cab vedoucí sekvence) podle SEQ ID NO : 52.
Krátké nekódující sekvence vložené uvnitř genu, které zde nazýváme introny, mohou také zlepšit genovou expresi. Introny mohou zlepšit účinnost tvorby mRNA. V literatuře se uvádí mnoho intronů, které zlepšují genovou expresi, zejména u jednoděložných rostlin. V jednom případě se uvádí, že přítomnost intronu 1 katalázy (Tanaka 1990), který byl izolován z ricinových bobů, způsobila zvýšení genové exprese u rýže, ale ne u tabáku. Jako značkovací gen byl použit GUS. Ještě další zlepšení bylo dosaženo, zejména u jednoděložných rostlin, konstrukcemi genů, které měly introny v 5' nepřekládané vedoucí sekvenci na pozici mezi promotorem a strukturní kóduj í45 cí sekvencí. Například Callis a kol., (1987) uvádí, že přítomnost intronů pro alkoholdehydrogenázu (Adh-1) nebo intronů Bronze-1 má za následek vyšší úrovně exprese. Mascarenkas a kol., (1990) uvádí dvanácti násobné zvýšení exprese CAT pri použití intronu Adh. Jiné introny vhodné pro použití v molekulách DNA podle vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na, intron sacharózasyntázy (VašiI a kol., 1989), TMV omega intron (Gallie a kol., 1989) kukuřičný intron hsp 70 uvedený v SEQ ID NO : 47 ( patent US 5 593 874 a patent US 5 859 347, které jsou zde zařazeny v dodatcích) a rýžový intron aktinu (McElroy a kok, 1990). Stupeň zvýšení genové exprese může ovlivnit kromě intronů mnoho dalších faktorů, které zahrnují, ale nejsou omezeny na promotor, (Jefferson a kok, 1987), sekvence krajního exonu a umístění nebo lokace intronu vzhledem ke genu (Mascerenhas a kok, 1990),
-4CZ 302074 B6
Krátké nekódující sekvence vložené uvnitř genu podle vynálezu jsou spojeny s rostlinným genem, s výhodou s geny jednoděložných rostlin, které zahrnují pšenici a rýži, ale nejsou na ně omezeny. Zvláště výhodné jsou vložené sekvence spojené s geny jednoděložných rostlin, které kódují proteiny tepelného šoku, aktiny, amylázy, lygázy a syntetázy. Tyto vložené sekvence jsou zde s výhodou zastoupeny těmito: sekvence kukuřičného genu pro protein tepelného šoku obsahující SEQ ID NO: 47, vložená sekvence z rýžového genu pro aktin obsahující SEQ ID NO: 50, vložená sekvence z rýžového genu pro amylázu obsahující SEQ ID NO: 49, vložená sekvence z rýžového genu pro fenylalaninamoniumlygázu obsahující SEQlDNO:48a vložená sekvence z rýžového genu sacharózasyntázy obsahující SEQ ID NO: 51.
Nepřekládané sekvence nacházející se na 3' konci genu mohou mít také vliv na úrovně exprese. Nepřekládaná oblast 3' konce obsahuje oblast pro vazbu mRNA s terminačním kodonem translace a rozšiřuje se alespoň za póly adeny lační místo, Ingelbrecht a kol., (Plant Celt 1: 671 - 80,
1989) hodnotí důležitost těchto elementů a nachází větší rozdíly v expresi ve stabilních rostlinách v závislosti na zdroji 3' nepřekládané oblasti. Při použití 3' nepřekládaných oblastí spojených se syntázou oktopinu, 2S proteinem semen Arabidopsis, malou podjednotkou rbcS z Arabidopsis, extenxinem z mrkve a syntézou chalkonu z Antirrhinium. byl pozorován šedesáti násobný rozdíl mezi nejlépe exprimujícím konstruktem (která obsahovala rbcS 3' nepřekládanou oblast) a konstruktem s nejnižši expresí (která obsahovala 3' oblast syntázy chalkonu). Jako terminační oblast pro expresi genů v rostlinách byla také použita 3' nepřekládaná oblast genu syntázy nopalinu ΤΟΝ A z Agrobacterium tumefaciens (3' no) obsahující SEQ ID NO: 46. To, že 3' nepřekládané oblasti mohou významně ovlivnit expresi rekombinantních rostlinných genů je dobře známo, ale jejich přesná úloha a způsob, jak je nejlépe určit a optimalizovat pro dosažení maximální exprese, je zatím oblastí, která není dosud příliš dobře prozkoumanou.
Kódující sekvence rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu může kódovat jakoukoli sekvenci nukleové kyseliny, která se přepisuje do RNA, což zahrnuje, ale není omezeno na sekvence kódující vlastní, cizorodé a/nebo modifikované proteiny, které jsou předmětem zájmu. Výběr této sekvence závisí na podmínkách daného použití. Strukturní sekvence DNA obvykle kóduje molekulu proteinu, kteiý je schopen změnit jeden nebo více znaků rostliny. Vhodné strukturní geny mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na geny pro hubení hmyzu a jiných škůdců, geny pro ochranu proti mikrobiálním a houbovým onemocněním, geny odolnosti vůči herbicidům a geny pro zlepšení kvality rostlin, například vyšší úroda, schopnost přizpůsobení se životnímu prostředí a zvýšení výživné hodnoty. Geny mohou být izolovány z jakéhokoli zdroje, například z rostlin a bakterií, nejsou tím však omezeny.
Kódující sekvence DNA může také působit na fenotypy tak, že kóduje molekulu RNA, která se nepřekládá při translaci, což způsobí cílenou inhibici exprese endogenního genu, například cestou nesmyslného nebo kosupresivního přenosu (viz například Schuch, 1991; Bird, 1991; Jorgensen
1990) . RNA by také mohla být katalytická RNA molekula (například ribozym) vytvořená pro štěpení požadovaného endogenního mRNA produktu (viz například Gibson, 1997).
Nepřekládaná oblast na 3' konci zde popisované molekuly DNA obecně způsobuje polyadenylaci 3' konce přepisované mRNA sekvence a terminaci transkripce. Nepřekládaná oblast na 3' konci může být spojena s genem ze zdroje, který je vlastní nebo cizorodý, s ohledem na jiné nepřekládané a/nebo překládané elementy přítomné v molekule DNA.
3' nepřekládané sekvence podle vynálezu jsou spojeny s rostlinným genem, s výhodou s geny jednoděložných rostlin, které zahrnují, ale nejsou omezeny na pšenici a rýži. Zvláště výhodné jsou 3' nepřekládané sekvence izolované z nukleotidové sekvence spojené s geny jednoděložných rostlin, které kódují pšeničnou fruktóza-l,6-bifosfatázu (Ta fbp 3') obsahující SEQ ID NO:
60, pšeničný protein tepelného šoku (Ta hsp 3 ) obsahující SEQ ID NO: 58, pšeničný ubichitin (Ta ubíq 3') obsahující SEQ ID NO: 59, rýžový protein glutein (r glut 3') obsahující SEQ ID NO:
61, rýžovou laktátdehydrogenázu (r lacd 3 ) obsahující SEQ ID NO: 62 a rýžový beta-tubulin (r btub 3 ) obsahující SEQ ID NO: 63.
- 5 CZ 302074 B6
5' a/nebo 3' nepřekládané sekvence a vložené sekvence podle vynálezu mohou být izolovány jedním nebo více z mnoha postupů, které jsou dobře známy odborníkům vdané oblasti nebo mohou být případné vyrobeny synteticky.
V jednom příkladu provedení podle vynálezu je zdrojovým rostlinným materiálem rostlinná RNA izolovaná z rostlinné tkáně. V jiném příkladu provedení podle vynálezu je zdrojovým materiálem syntetická DNA sekvence. Vzorové sekvence pro genetické elementy zahrnují RNA transkripty, cDNA sekvence nebo genomovou DNA. V jiném příkladu provedení podle vynálezu jsou synteio tizovány RNA primery pro vytvoření genetických elementů podle vynálezu. PCR primery mohou být syntetizovány tak, aby odpovídaly buď nepřekládané oblasti na 5' konci, nebo nepřekládané oblasti na 3' konci cílových rostlinných transkríptů. Například PCR reakce na prvním řetězci cDNA produktů vytvořených reverzní transkripcí RNA a PCR fragment obsahující požadovanou část nebo úplný genový element mohou být klonovány do expresního vektoru pro testování.
Postupy pro izolaci genů a s nimi spojených genových elementů jsou odborníkům známy a zahrnují například zde uvedené PCR postupy. Různé způsoby množení jsou známy odborníkům a jsou popsány například v patentu US 4 683 195 a 4 683 202 a Innis a kol., 1990. Odborníkům v této oblasti jsou velmi dobře známy publikace, které popisují specifické podmínky a postupy pro konstrukci, manipulaci a izolaci makromolekul (například DNA molekuly, plazmidy atd.), tvorbu rekombinantních organismů a výběr a izolaci genů (viz například Sambrook a kol., 1989; Mailgaakol., 1995; Birren a kol., 1996).
Postupy molekulární genetiky rostlin byly také popsány například v Pouwels a kol., 1985, supp.
1987; Weissbach a Weissbach 1989 a Gelvin a kol., 1990.
Kromě toho je odborníkům v dané oblasti známo, že 5' a/nebo 3' nepřekládané oblasti nebo vložené sekvence podle vynálezu, mohou být upraveny, například přidáním báze, delecí, substitucí atd., přičemž stále poskytují zde uvedené výhody. Takové modifikace jsou v souladu s vynále30 zem.
Jedna možnost modifikace může například zahrnovat změny v uspořádání nukleotidů ve vedoucí sekvenci, které vedou ke změně sekundární struktury. Vhodná sekundární struktura 5' vedoucí sekvence může být požadována pro optimální expresi. Specifické uspořádání nukleotidů vedoucí sekvence může tedy být tak důležité, jak je důležitá sekundární struktura s ní související. Vedoucí sekvence může proto ve skutečnosti dovolovat takové modifikace v uspořádání nukleotidů, které nezpůsobí změny v sekundární struktuře. Stejně tak mohou být modifikovány introny a 3' nepřekládané sekvence podle vynálezu v souladu se zlepšením genové exprese v jednotlivém systému.
Sekvence sousedící s AUG 5' nepřekládanou oblastí mohou také ovlivnit účinnost translace.
V rostlinách byla například určena souhlasná sekvence, která může poskytnout optimální AUG kontext (Joshi a kok, 1987; Koziel a kok, 1996). Tato oblast nepřekládaných sekvencí 5' konce podle vynálezu může tedy být tímto způsobem upravena pro další optimalizaci úrovní transgenní exprese. Kromě toho mohou být modifikace provedeny na dalších částech genu, které zahrnují, ale nejsou omezeny na 3' nepřekládanou oblast nebo vložené sekvence rekombinantní DNA molekuly podle vynálezu, takže nové kombinace elementů v expresním vektoru jsou dále optimalizovány.
Kromě těchto dříve zmíněných elementů může také rekombinantní molekula DNA podle vynále50 zu obsahovat další regulační elementy, například izolované/cílené sekvence chloroplastů, rozšiřující elementy, atd. (pro přehled o optimalizaci transgenní exprese viz Koziel a kok, 1996). Zlepšení exprese bylo například získáno použitím rozšiřovací sekvence vložené do 5' promotoru.
Rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu mohou také obsahovat volitelnou značku. Tyto značky jsou obvykle používány pro výběr transformovaných rostlin nebo rostlinných buněk,
-6 CZ 302074 B6 které obsahují exogenní genetický materiál, který je předmětem zájmu, to je transgen. Příklady zahrnují, ale nejsou omezeny na neomycin (neo) fosfotransferázový gen (Potrykus a kol., 1985), který poskytuje rezistenci vůči kanamycinu. Buňky exprimující gen pro neomycinfosfotransferázu mohou být vybrány s použitím vhodného antibiotika, například kanamycin nebo G418.
Další značky běžně užívané k selekci zahrnují gen bar, který poskytuje rezistenci proti bialafóze, mutantní gen pro syntázu EPSP (Hinchee a kol., 1988), který poskytuje rezistenci vůči glyfosátu; nitrilázový gen, který poskytuje rezistenci vůči bromoxynilu (Stalker a kol., 1988); mutantní gen pro syntázu acetolaktátu (ALS), který poskytuje rezistenci vůči imidazolinonu nebo sulfonylmočovině (evropská patentová přihláška 154 204 1985); a gen pro rezistenci vůči metotrexátu io DHFR (Thillet a kol., 1988).
Rekombínantní molekula podle vynálezu může také obsahovat rozlišovací značku, která slouží k označení genové exprese, jenž má být vyhodnocena. Běžně používané rozlišovací značky obsahují gen pro β-glukuronidázu nebo uidA (GUS) kódující enzym, pro který jsou známé různé chromogenní substráty (Jefferson a kol., 1987); gen pro luciferázu, (Ow a kok, 1986), R-lokus gen, jehož produkt reguluje tvorbu barviv anthokianů (červená barva) v rostlinných tkáních (Dellaporta 1988) a gen pro β-laktamázu (Sutcliffe a kol., 1978), který kóduje enzym, pro který jsou známy různé chromogenní substráty (například PADAC, chromogenní cefalosporin); xzlE gen (Zukowsky a kok, 1983), který kóduje katechol dioxygenázu, která může měnit chromogenní katecholy; gen pro α-amylázu (Ikatu a kok, 1990); gen pro tyrozinázu (Katz a kok, 1983), který kóduje enzym oxidující tyrozin na DOPA a dopachinon, který se zpětně kondenzuje na melanin; gen pro α-galaktozidázu, který kóduje enzym, jehož substrát je chromogenní α-galaktóza; atd.
Označení „volitelný“ a „rozlišovací“ mohou být také použity ve spojení s geny, které kódují „zapisovatelé“ značky, jejichž přítomnost může být zjištěna jako prostředek k určení nebo výběru transformované buňky. Příklady zahrnují značky, které kódují utajené antigeny, které mohou být určeny pomocí interakce s protilátkami nebo dokonce utajené enzymy, které mohou být zjištěny katalyticky. Utajené proteiny spadají do mnoha tříd, včetně malých, difúzibilních proteinů, které jsou zjistitelné například pomocí testu ELISA, malých aktivních enzymů zjistitelných v extrace30 lulámím roztoku (například a-amyláza, β-laktamáza, fosfinotricintransferáza) nebo proteinů, které jsou vloženy nebo odchyceny buněčnou stěnou (jako například proteiny, které obsahují vedoucí sekvenci jako je například ta, nalezená v expresní jednotce extensin nebo tabáku PR-S). Další možné volitelné/rozlišovací/zapisovatelné značkovací geny jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti.
Jednotlivé nukleotidové sekvence 5'a 3' nepřekládaných elementů zařazené v přihlášce jsou samozřejmě reprezentativní ukázkou v tom smyslu, že podle nich mohou být získány a/nebo vytvořeny ekvivalentní sekvence nebo jejich části. Ekvivalentní znamená, že geny nebo jejich části mají stejnou funkci jako elementy nebo jejich části, které jsou zde popsány a poskytují stejnou výhodu nebo jednotlivý znak rostliny v podstatě stejným způsobem.
Mnoho různých postupů a metod klonování je dostupných v obchodní síti a byly podrobně popsány (viz například Sambrook a kok, 1989; Birren a kol., 1996). Tyto postupy jsou velmi dobře známy a odborníci v dané oblasti je mohou využít ke konstrukci molekul DNA podle vynálezu.
Jakýkoli typ vektoru může být použit podle vynálezu, příkladem je expresní vektor plazmidu E. coli, vynález se však na něj neomezuje. Kombinace genových elementů podle vynálezu jsou s výhodou funkčně spojeny s rostlinným transformačním vektorem. Při konstrukci rekombínantní molekuly DNA podle vynálezu jsou obvykle, s použitím metod známých odborníkům v dané oblasti, vloženy odlišné její složky nebo fragmenty do vhodného vektoru pro klonování, který je schopen replikace v bakteriálním hostiteli, například E. coli.
Vynález také zahrnuje bakteriální buňky nebo viriony obsahující molekuly DNA s nepřekládanými sekvencemi podle vynálezu. Vložení takových vektoru do hostitele může být provedeno s použitím metod, které jsou odborníkům známy. Molekula DNA podle vynálezu může být vlo- 7 CZ 302074 B6 žena do genomu rostliny kteroukoli z pěti vhodných metod. Vhodné metody transformace rostlin zahrnují transformaci spojenou s Agrobacterium, použití lipozomů, elektroporaci, chemické úpravy, které zvyšují vzestup volné DNA, dodání volné DNA pomocí ostřelování míkroprojektilem, transformaci s použitím virů nebo pylu, atd.
Metody pro transformaci dvouděložných rostlin upřednostňují použití Agrobacterium tumefaciens. Příklady transgenních rostlin mohou být bavlna ( patent US 5 004 863; patent US 5 159 135; patent US 5 518908, WO97/43430) a sója ( patent US5 569 834; patent US 5 416 011), nejsou však na ně omezeny.
io
Mnoho transformačních a regeneračních metod je dostupných pro jednoděložné rostliny, například pro kukuřici, (Songstad a kol., 1995; Klein a kol., 1988), rýži (Toriyama a kol., 1986) a pšenici (Cheng a kol., 1997; a patent US 5 631 152 zde zařazený v dodatcích), výčet však není tímto omezen. Odborníkům je zřejmé, že může být použito mnoho transformačních a regeneračních metodologií a upraveno pro tvorbu stálých transgenních rostlin z jakéhokoli množství cílové plodiny, která je předmětem zájmu. Také metody transformace a regenerace rostlin jsou odborníkům velmi dobře známy (například viz Hinchee a kol., (1994) a Ritchie & Hodges (1993).
Byly provedeny zkoušky genové exprese založené na přechodné expresi klonovaných konstruktů
2o nukleové kyseliny pomocí vložení molekul nukleové kyseliny do rostlinných buněk, čehož bylo dosaženo bud’ reakcí s glykolem, elektroporaci, nebo ostřelováním částicemi (Marcotte a kol,, (1988); Marcotte a kol., (1989),; McCarty a kol., (1991); Hattori a kol., (1992); Goff a kol., (1990). Přechodné expresní systémy mohou být použity pro rychlé testování úrovní genové exprese a funkční analýzu genových konstruktů (viz zejména Mailga a kol„( 1995)),
Vynález se také týká rostlinných buněk, jejichž genom obsahuje jednu nebo více rekombinantních molekul DNA, které obsahují 5' a/nebo 3' zde uvedené nepřekládané sekvence. Různé rostliny, obsahující takové buňky, budou mít znaky či výhody získané expresí kódující sekvence DNA, která je funkčně připojena k uvedeným sekvencím. Tyto rostliny mohou být jednoděložné so nebo dvouděložné a mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na rostliny patricí k čeledím vybraným z následujících: vojtěška, jabloň, Arabidopsis, brukev, brokolice, zelí, citrus, kukuřice, bavlník, len, česnek, locika, oves, olejnaté semeno, řepka, cibule, kanola, okrasné rostliny, hrách, podzemnice olejná, paprika, lilek brambor, rýže, žito, čirok, jahody, sója, slunečnice, cukrová třtina, cukrová řepa, rajče, tabák, pšenice, topol, borovice, jedle, eukalypt, čočka, grep, banán, čaj, okrasné trávy. Zvláště výhodné rostliny jsou vojtěška, ječmen, kukuřice, bavlna, kanola, lilek brambor, rýže, žito, sója, slunečnice, cukrová řepa a pšenice. Nejvýhodnější rostliny jsou jednoděložné, například kukuřice, pšenice a rýže.
Pro přesné pochopení obsahu vynálezu jsou přiloženy následující příklady, které jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nemají omezovat podstatu vynálezu. Jedná se o příklady určitých výhodných příkladů provedení podle vynálezu. Postupy popsané v následujících příkladech jsou považovány za dobře fungující pro potřeby vynálezu, mohou tedy být považovány za nejvýhodnější pro jeho praktické provedení. V popsaných specifických příkladech provedení vynálezu je však možno provést mnoho změn, přičemž může být dosaženo podobného nebo stejného výsledku aniž by došlo k odchýlení od podstaty vynálezu.
Kromě postupů zde speciálně zmíněných je vynález v souladu se známými publikacemi, které popisují podmínky a postupy pro konstrukci, manipulaci a izolací makromolekul (například DNA molekul, plazmidů, atd.) pro výrobu rekombinantních organismů a pro třídění a izolování klonů, (viz například Sambrook a kol., (1989); Mailga a kol., (1995); Birren a kol., (1996).
-8CZ 302074 B6
Přehled obrázků
Následující obrázky jsou součástí stávajícího popisu vynálezu a jsou zde zařazeny pro další ukáz5 ku určitých hledisek vynálezu. Vynález může být lépe chápán po prostudování jednoho nebo více těchto obrázků a podrobného popisu konkrétních příkladů provedení podle vynálezu, které jsou zde uvedeny.
Obr. 1 ukazuje plazmid pMON 19469 lo Obr. 2 ukazuje plazmid pMON26052
Obr. 3 ukazuje plazmid pMON26055
Obr. 4 ukazuje plazmid pMON26054
Obr. 5 ukazuje plazmid pMON 19433
Obr. 6 ukazuje plazmid pMON32502 i 5 Obr. 7 ukazuje plazmid pMON32506
Obr. 8 ukazuje plazmid pMON32509
Obr. 9 ukazuje plazmid pMON32510
Obr. 10 ukazuje plazmid pMON32513
Obr, 11 ukazuje plazmid pMON 19437 20 Obr. 12 ukazuje plazmid pMON32515
Obr. 13 ukazuje plazmid pMON3 2516
Obr. 14 ukazuje plazmid pMON32517
Obr. 15 ukazuje plazmid pMON33216
Obr. 16 ukazuje plazmid pMON33210 25 Obr. 17 ukazuje plazmid pMON33220
Obr. 18 ukazuje plazmid pMON3 3219
Obr. 19 ukazuje plazmid pMON47901
Obr. 20 ukazuje plazmid pMON47906
Obr. 21 ukazuje plazmid pMON47907 30 Obr. 22 ukazuje plazmid pMON47915
Obr. 23 ukazuje plazmid pMON47916
Obr. 24 ukazuje plazmid pMON47917
Obr. 25 ukazuje plazmid pMON47919
Obr. 26 ukazuje plazmid pMON32648 35 Obr. 27 ukazuje plazmid pMON 18364
Obr. 28 ukazuje plazmid pMON 19568
-9 CZ 302074 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad I
Konstrukty expresních vektorů obsahujících kombinace genových elementů pro zlepšení transgenní exprese.
io Konstrukty expresních vektorů obsahující kazety genových elementů, které zahrnují pšeničné nebo rýžové elementy, byla provedena pomocí teplotní hybrid i zace syntetických oligonukleotidů nebo PCR izolací z pšeničné listové mRNA nebo rýžové genomové DNA a spojením (ligací) do restrikčních míst proti směru a po směru exprese genu v tomto pořadí, GUS značkovacího genu. Plazmidy použité pro klonování a konstrukci různých expresních kazet jsou uvedeny v tabulce 1. i? Všechny testované konstrukty měly e35S promotor, který je promotorem pro 35S RNA z CaMV obsahující duplikaci -90 -ti až 300 oblastí. Další elementy obsažené v plazmidech zahrnují následující: počátky replikace (ori-MI3 a ori-V), značkovací geny, například GUS nebo LUC, které jsou kódujícími sekvencemi pro betaglukuronidázu a luciferázu, v tomto pořadí, a kódující sekvence pro selekci antibiotik (AMP bakteriální selekce) a KAN (propůjčující rezistenci vůči
2o neomycinu a kanamycinu aminoglykosidových antibiotik). Plazmid pMON32648 (obr. 26) obsahuje protiplísnový protein z kostřavy, (Tfe AFP), jak bylo popsáno v přihlášce vynálezu 60/097150. Další obvyklé transformační vektory mohou být obsaženy v, ale nejsou omezeny na, pMON 18364 (obr. 27), což je dvojnásobný Agrobacterium transformační vektor a MON19568 (obr. 28), což je plazmid linearizovaný před použitím transformační metody ostřelování částice25 mi. Při použití PCR byly dodrženy podmínky doporučené výrobcem, (viz například Strategene, La Jolla, CA, PE Biosystems, Foster City, CA). Plazmid DNA byl izolován a přečištěn s použitím přístrojů a chemikálií běžně dostupných v obchodní síti. (viz například Qiagen, Valencia, CA). Syntetická DNA byla zakoupena od Midland Certified Reagent Co., Midland, TX).
Tabulka 1: Konstrukty vektorů *
| Konstrukty (plazmid) | (5' vedoucí s./intron /značkovací s./3' terminační s.) | klonovaná místa (genový element) |
| PMON19469* | žádná / hsp70 I / GUS / nos 3' (obr. 1) | BglII, Ncol (hsp701) |
| PMON26043 | žádná / GUS/ nos 3' | BglII, Ncol, Xbal |
| PMON26052* | Ta hsp L / hsp70 I / GUS/ nos 3' | BglII, Ncol (hsp701) |
- 10CZ 302074 B6
| (obr. 2) | ||
| PMON25454 | vektor rýžového intronu | Stul/Ncol (ractll) |
| PMON26044 | Ta cab L/ractll/GUS/ nos 3’ | Ncol / Stu (ractll), EcoRI/Sma (nos 3') |
| PMON26055* | Ta hsp L / ractll / GUS / nos 3’ (obr. 3) | Stu I / Ncol (ractll) |
| pMON26045 | Ta fbp L / GUS / nos 3’ | HindlII, Xba, BglU, Ncol |
| pMON25456 | žádný/ractll/GUS/nos 3’ | HindlII/Bell (e35S/ract!I) |
| pMON26064 | ractll/Ta fbp L/GUS/ nos 3’** | HindlII, Xba, Bell |
| pMON26054* | Ta cab L/ractll / GUS / nos 3' | Stul / Ncol (ractll), viz obr. 4 |
| EcoRI / Smál (nos 3’) | ||
| pMON26038 | Ta cab L/GUS / nos 3’ | Xbal, BglII, Ncol, Pstl, |
| (Pst / BglII, nos 3') | ||
| pMON19433* | žádný / hsp70 V GUS / nos 3' | EcoRI / Bam HI (nos 3') |
| BglII / EcoRI, viz obr. 5 | ||
| pMON18375 | žádný / hsP701 / GUS / Tahspl7 3‘ | EcoRI/Smál (Ta hspl 73') |
| pMON32502* | Ta cab L/ractll/GUS/ Ta hsp 17 3’ | viz obr. 6 |
| pMON32506* | Ta hspL/ractll/GUS/ Tahspl7 3' | viz obr. 7 |
| pMON18377 | žádný /hsp70I/ GUS/ Ta ubiq 3' | EcoRI / Sma I (Ta ubiq 3') |
| pMON32509* | Ta fbp L/ractll / GUS / Ta ubiq 3' | viz Obr. 8 |
| pMON32510* | Ta hsp L / ractll / GUS i Ta ubiq 3' | viz Obr. 9 |
| pMON18379 | žádný / hsp701 / GUS / Ta fbp 3' | |
| pMON32513* | Ta fbp L/ractll/GUS/ Ta fbp 3' | viz obr. 10 |
| PMON19437* | žádný / hsp701 / LUX / nos 3' | Ncol i EcoRI (LUX) viz obr. 11 |
| pMON32515* | Ta cab L / ractll / LUX / Ta hsp 3' | Ncol / EcoRI (LUX) |
| viz obr. 12 | ||
| pMON32516* | Ta fbp L / ractll / LUX / Ta ubiq 3' | Ncol / EcoRI (LUX) |
| viz obr. 13 | ||
| pMON32517* | Ta fbp L/ractll/LUX / Ta fbp 3' | Ncol / EcoRI (LUX) |
| viz obr. 14 | ||
| PMON32518* | Ta fbp L/ractll / LUX / r lac d 3’ | viz obr. 15 |
| pMON33210* | žádný / hsp701/ GUS / nos | Pmll, BglII, Xbal (r btubL) |
| viz obr. 16 | ||
| pMON33220* | r btub L / hsp70 I / GUS / nos 3' | viz obr. 17 |
| pMON26046 | Ta per L / žádný / GUS / nos | BglII/NcoI (Ta per L) |
| Pstl/BglII | ||
| pMON33211 | žádný / r amy 11 / GUS / nos 3’ | BglII / Xbal (r amy I) |
| pMON33226 | žádný / r pal I / GUS / nos 3’ | BglII / Xba (r pal I) |
| pMON33228 | žádný / r ssl I / GUS / nos 3’ | BglII / Xba (r ssl I) |
| pMON33225 | Ta cab L / ractll / GUS / r glut 3' | EcoRI/Sph(r glut 3') |
| PMON33200 | žádný / hsp70 I / GUS / nos 3' | BglII I Pmll |
| ΡΜΟΝ33219» | r amy L / hsp70 I / GUS / nos | viz obr. 18 |
| pMON47901* | Ta cab L / hsp701 / GUS / r glut 3’ | viz obr. 19 |
| pMON47906* | Ta hsp L / ractll / GUS I r lac d 3' | viz obr. 20 |
| pMON47907* | Ta hsp L / ractll / GUS / r glut 3' | viz obr. 21 |
| pMON47915* | Ta per L / ractll / GUS / r lac d 3' | viz obr. 22 |
| pMON47916* | Ta per L / ractll / GUS Zr glut 3' | viz obr. 23 |
| ΡΜΟΝ47917* | Ta per L / ractll / GUS / r btub 3' | viz obr. 24 |
| pMON47919* | viz obr. 25 | |
| pMON47909 | Ta hsp L / ractll / GUS/r lac d 3' | BglII/NcoI |
| PMON33216 | Ta cab L / ractll / GUS / r btub 3' | Stul/Ncol |
| pMON479IO | Ta hsp L i ractll / GUS / r glut 3' | Ncol/BglII (hsp70 I) |
| pMON47918 | Ta per L / hsp70 I / GUS / r lac d 3’ | Ncol/BglII (hsp701) |
| pMON47920 | Ta per L / hsp701 / GUS / r btub | BglU i Ncol (hsp701) |
* obr.
* * odlišná orientace: Intron/vedoucí sekvence/značkovací sekvence/3'
- 12CZ 302074 B6
Vložená sekvence z kukuřičného proteinu tepelného šoku (hsp70 intron), která byla popsána v patentech US 5 593 874 a 5 859 347, které jsou zde zařazeny v dodatcích, je uvedena v SEQ ID
č.: 47. Základní syntetická vedoucí sekvence je uvedena v SEQ ID č.: 45. 5' nepřekládaná vedoucí sekvence z pšeničné mRNA pro zamýšlenou nízkou molekulární hmotnost proteinu tepelného šoku (5' Ta hsp 17 L) (Genebank Accession Č. XI343 l.gb_pl) (SEQ ID č: 53) byla vytvořena pomocí teplotní hybridizace SEQ ID č.: 5, SEQ. ID č.: 6, SEQ ID č.: 7 a SEQ ID č.: 8. 5' konec výsledného fragmentu má BamHI kohezní konec, za nímž následuje Xbal restrikční místo a 3' konec má BglII místo, za nímž následuje Ncol kohezní konec pro subklonování. Tento io fragment byl spojen s 5 676 kb BglII a Ncol fragmentem pMON 19469 (obr. 1), čímž vznikl pMON26043.
Plazmid pMON26052 (obr. 2) byl vytvořen subklonováním 884 pb BglU a Ncol fragmentu z pMON 19469 (obr. 1) do BglII a Ncol míst pMON26043. Plazmid pMON26043 obsahuje jak [5 HP70 intron tak 5' pšeničnou vedoucí sekvenci (Ta hsp vedoucí sekvence).
Plazmid pMON26055 (obr. 3) byl vytvořen subklonováním 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu obsahujícího rýžový aktinový intron (raci 1 intron) (SEQ ID č.: 50) (McElroy a kok, 1991) z pMON25454 do BglII a Ncol míst pMON26043 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří s BglII komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č,; 4).
5' nepřekládaná vedoucí sekvence z pšeničné mRNA pro fruktóza-l,6~bisfosfatázu (5' Ta fbp L) (Genebank Accession č. X07780.gb_pl) (SEQ ID Č.: 54) byla vytvořena teplotní hybridizací SEQ ID č.: 9, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 11 a SEQ ID č.: 12. 5' konec výsledného fragmentu má
BamHI kohezní konec, za nímž následuje Xbal restrikční místo a 3' konec má BglII místo, za nímž následuje Ncol kohezní konec pro subklonování. Tento fragment byl spojen s 5676 kb BglII a Ncol fragmentem pMON 19469 (obr. 1), čímž vznikl konstrukt pMON26045.
Plazmid pMON26064 byl vytvořen subklonováním 1 095 kb HindlII a Bell fragmentu obsa30 hujícího rýžový aktinový intron (McElroy. a kol., 1991) a e35S promotoru (Kay a kok, 1987) zpMON25456 do HindlII a Xbal míst pMON26045 s použitím adaptérů na Bell místo, které tvoří s Xbal komplementární konec (SEQ ID Č. 13 a SEQ ID č. 14).
Plazmid pMON26054 (obr. 4) byl vytvořen subklonováním 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu obsahujícího rýžový aktinový intron (McElroy. a kok, 1991) z pMON25454 do BglII a Ncol míst pMON26045 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří s BglII komplementární konec (SEQ ID č. 3 a SEQ ID č. 4).
5' nepřekládaná vedoucí sekvence vazebného proteinu chlorofylu a/b (5' Ta cab L) (Genebank
Accession č, Μ10144.gb_pl) (SEQ ID č.:52) byla izolována reverzní transkripcí z pšeničné listové RNA a poté podrobena 40 cyklům PCR, denaturační teplota 94 °C po dobu 1 minuty, teplota hybridizace 50 °C po dobu 2 minut a teplota důkladného zahřátí 72 °C po dobu 3 minut. Použité primery SEQ ID č.: 1 a SEQ ID č.: 2 tvoří BamHI a Xbal restrikční místa na 5' konci a BglII a Ncol tvoří restrikční místa na 3' konci pro subklonování. Fragment 77 párů bází obsahující 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci vazebného proteinu chlorofylu a/b byl pak štěpen pomocí BamHI a Ncol a spojen s 5 676 kb BglII a Ncol fragmentem pMON 19469 (obr. 1), čímž vznikl konstrukt pMON26038.
Plazmid pMON26044 byl vytvořen subklonováním 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu obsahujícího rýžový aktinový intron (McElroy a kok, 1991) z pMON25454 do BglII a Ncol místa pMON26038 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří s BglII komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č.: 4).
3' nepřekládané oblasti obsahující terminační sekvenci a polyadenylační sekvence byly izolovány a klonovány do pMON 19433. Plazmid pMON 19433 je odvozen z pUC 119 a navíc obsahuje
-13 CZ 302074 B6
CAM V rozšířený 35S promotor, hsp70 intron, GUS značkovací gen a nopalin syntetázu (nos) 3' nepřekládané sekvence (SEQ ID Č.: 46). Tento vektor obsahuje EcoRI místo a BamHl místo sousedící s nos 3' terminační sekvencí umožňující návrat a substituci alternativních 3' termínaěních sekvencí. Syntéza cDNA byla provedena s použitím oligo dT primem v PCR reakčním pufru s MgCl2, 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP a TTP. Pět mikrogramů kompletní RNA z buňky pšeničného listu bylo vloženo do reakčního pufru PCR, při objemu 20 bl. Reakce byla zahájena přidáním 4 jednotek reverzní transkriptázy (Gibco BRL; Gaithersburg, MD) a inkubována pří teplotě 42 °C po dobu 2 hodin. Zahřívání reakce bylo ukončeno a reakce byla ochlazena na -20 °C.
io Dva mikrolitry této reakční směsi byly přidány do každého PCR reakčního pufru s obsahem dNTP, jak bylo popsáno dříve, ve 100 mikrolitech obsahujících 0,5 jednotky Taq polymerázy podle návodu výrobce (Boerhinger Mannheimm Biochemicals; Indianapolis, IN). Reakce byla přelita 50 mikrolitry minerálního oleje a cyklována v termocyklovači při teplotě 94 °C po dobu I minuty, při teplotě 45 °C po dobu 2 minut a při teplotě 72 °C po dobu 2 minut opakovaně
40 cyklů. 3' nepřekládaná oblast z pšeničného ubichitinového genu (3' Ta ubiq) (SEQ ID č.: 59) byla namnožena z cDNA produktů s příměrovými sekvencemi SEQ ID č.: 15 a SEQ ID č.: 16. 3' nepřekládaná oblast z pšeničného genu tepelného šoku (3' Ta hsp 17) (SEQ ID č.: 58) byla namnožena, jak bylo uvedeno dříve, s použitím primem sekvencí SEQ ID ě,: 17 a SEQ ID č.: 18. 3' nepřekládaná oblast z bísfosfatázy fruktózy (3' Ta fbp) (SEQ ID č.: 60) byla namnožena, jak bylo uvedeno dříve, s použitím primem sekvencí SEQ IDč.: 19 a SEQ ID č.: 20.
Produkty amplifikace byly podrobeny elektroforéze na agarózovém gelu a analyzovány na velikost. Fragmenty PCR odpovídající 3' Ta ubiq (- 225 pb), 3' Ta hsp (-240 pb) a 3' ta fbp (-130 pb) byly štěpeny s EcoRI a BamHl, gel byl přečištěn na 1% agarózovém gelu a izolován s použitím Qiagen PCR podle návodu výrobce (Qiagen. Santa Clarita, CA). Nakonec byly štěpené PCR fragmenty klonovány do 6,5 kb fragmentu z EcoRI BamHl štěpeného základního vektoru pMON 19433 (obr. 5). Výsledné transformanty s vloženými sekvencemi z 3' nepřekládaných oblastí pšeničných genů (Ta fbp. Ta hsp a Ta ubiq) byly ověřeny pomocí DNA sekven o vání.
Expresní vektor pMON32502 (obr. 6) byl konstruován pomoct štěpení pMON26044 a pMON 18375 s EcoRI a Smál. 0,24 kb Ta hsp 3' fragment z pMON 18375 byl spojen s 6,0 kb vektorem hlavního fragmentu pMON26044, čímž vznikl konstrukt pMON32502. Produkty ligace byly transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů, umístěny na LB agarové desky s obsahem vybraných úrovní ampicilinu (100 pg/ml).
Expresní vektor pMON32506 (obr. 7) byl konstruován pomocí štěpení pMON26055 (obr. 3) a pMON 18375 s EcoRI a Smál. 0,24 kb Ta hsp 3' fragment z pMON 18375 byl spojen s 5,9 kb vektorem fragmentu pMON26055 (obr. 3), čímž vznikl konstrukt pMON32506. Produkty ligace byly transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů.
Expresní vektor pMON32509 (obr. 8) byl konstruován pomocí štěpení pMON26054 a pMON 18377 s EcoRI a Smál. 0,23 kb Ta ubiq 3' fragment z pMON18377 byl spojen s 5,9 kb vektorem fragmentu pMON26054 (obr. 4), čímž vznikl konstrukt pMON32509. Produkty ligace byly transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů.
Plazmíd pMON32510 (obr. 9) byl konstruován pomocí štěpení pMON26055 (obr. 3) a pMON18377 s EcoRI a Smál. 0,23 kb Ta ubiq 3' fragment z pMON18377 byl spojen s 5,9 kb vektorem fragmentu pMON26055, čímž vznikl konstrukt pMON32510 (obr. 9). Produkty ligace byly transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů.
Plazmid pMON32513 (obr, 10) byl konstruován pomocí digesce pMON26054 a pMON 18379 sNeol a Smál. 2,0 kb GUS/Ta fbp 3' sekvence fragment z pMON 18379 byl spojen s 4,1 kb vektorem fragmentu pMON26054, Čímž vznikl konstrukt pMON32513. Produkty ligace byly
5? transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů.
- 14 CZ 302074 B6
Plazmidy pMON32515 (obr. 12), pMON32516 (obr. 13) a pMON32517 (obr. 14) byly konstruovány pomocí štěpení pMON32502, pMON32509 a pMON325l3 s Ncol a EcoRI. V každém případě byl pak přibližně 4,3 kb fragment spojen s 1,8 kb luciferázovým Ncol fragmentem, který byl vytvořen částečným štěpením s EcoRI z pMON 19437 (obr. 11). Produkty těchto ligací byly transformovány do DH5 alfa buněk E. coli pomocí standardních postupů.
5' nepřekládaná vedoucí sekvence z rýžového beta-tubulinu (5' r btub L) (Genebank Accession ě. L19598.gb_pl) (SEQ ID č.: 56) byla vytvořena kinázováním (reakce užívající T4 polynukleotidkinázu pro přidání 5' fosfátů pro následující ligační kroky) a teplotní hybridizaci (vaření následované pomalým ochlazováním) SEQ ID č.: 21, SEQ ID č.: 22. SEQ ID č.: 23 a SEQ ID ě.: 24. 5' konec výsledného fragmentu má Pmll otevřený konec a 3' konec má Bglll kohezní konec pro subklonování. Tento fragment byl spojen s 6,507 kb Pmll a Bglll fragment pMON33210 (obr. 16), čímž vznikl konstrukt pMON3 3 220 (obr. 17).
5' nepřekládaná vedoucí sekvence z genu pšeničné peroxidázy (5' Ta per L) (Genebank Accession č. X5601 l.gbpl) (SEQ ID č.: 55) byla vytvořena působením kinázy a teplotní hybridizaci SEQ ID č.: 25, SEQ ID Č.: 26, SEQ ID Č 27 a SEQ ID č.: 28. 5' konec výsledného fragmentu má Bglll kohezní konec, za nímž následuje Xbal restrikční místo a 3' konec má Bglll místo, za nímž následuje Ncol kohezní konec pro subklonování. Fragment byl spojen s 5 676 kb Bglll a Ncol 10 fragmentem pMON 19469 (obr. 1), čímž vznikl konstrukt pMON26046.
5' nepřekládaná vedoucí sekvence z rýžového amylázového genu (Genebank Accession č. M24287.gb_pl (5' r amy L) (SEQ ID č.: 57) byla vytvořena teplotní hybridizaci SEQ ID č.: 41. SEQ ID č.: 42., SEQ ID č.: 43 a SEQ ID č.: 44 a fostorylována a připojena do linearizovaného plazmidu pMON33200 štěpeného pomocí Pmll a Bglll, čímž vznikl konstrukt pMON33219.
První intron rýžového amylázového genu (r amyl intron) (Genebank Accession č. XI6509.gb_pl) (SEQ ID č.: 49) společně s 10 páry bází sekvence sousedních 5' a 3' exonů byl izolován pomocí PCR rýžové (Oryzct sativa) genomové DNA s použitím asi 1 pg DNA. Amplifikace byla prováděna s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.: 29 a SEQ ID č.: 30. DNA byla denaturována po dobu 1 minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci po dobu 1 minuty při teplotě 50 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkem 30 cyklů. Výsledný produkt PCR byl štěpen pomocí Bglll a Xbal a spojen s 5 687 kb Bglll a Xbal fragmentem pMON33210 (obr. 16), čímž vznikl konstrukt pMON33211.
Rýžový fenylalininamoniumlygázový intron (r pal intron) (Zhu a kol., 1995) spolu s 10 páry bází 5' a 3' sousedních exonových sekvencí (SEQ ID č,: 48) byl izolován pomocí PCR rýžové genomové DNA. Amplifikace byla provedena s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.: 31 a SEQ ID č.: 32. DNA byla denaturována po dobu I minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci po dobu 2 minut při teplotě 50 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkově 30 cyklů. Výsledný produkt PCR byl štěpen s Bglll a Xbal a spojen s 5 687 kb Bglll a Xbal fragmentem pMON3321Q (obr. 16), čímž vznikl konstrukt pMON33226.
První intron rýžového sacharóza syntetázového genu (r ssl intron) (Wang a kol., 1992) spolu s 10 páry bází 5' a 3' sousedních exonových sekvencí (SEQ ID č,: 51) byl izolován pomocí PCR z rýžové genomové DNA. Amplifikace byla provedena s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.: 33 a SEQ ID č.: 34. DNA byla denaturována po dobu 1 minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci po dobu 2 minut při teplotě 50 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkově 30 cyklů. Výsledný produkt PCR byl štěpen pomocí Bglll a Xbal a spojen s 5687 kb Bglll a Xbal fragmentem pMON33210 (obr. 16), čímž vznikl konstrukt pMON33228.
3' nepřekládaná terminační sekvence z rýžového glutelin typu II (3' r glut) (Genebank Accession č. X05664.gb_pl) (SEQ ID č.: 61) byla izolována pomocí PCR rýžové genomové DNA. Amplifikace byla provedena s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.: 35 a SEQ ID č.: 36. DNA byla
- 15CZ 302074 B6 denaturována po dobu 1 minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci po dobu minut při teplotě 50 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkem 30 cyklů.
Výsledný produkt PCR byl štěpen s Sphl a EcoRI. pMON33225 obsahuje klonovanou
SphI/EcoRI r glut 3' nepřekládanou terminační oblast.
3' nepřekládaná terminační sekvence z rýžové laktátdehydrogenázy (3' r lacd) (Genebank Accession č. D I3817.gb_pl) (SEQ ID č.: 62) byla izolována pomocí PCR rýžové genomové DNA. Amplifikace byla provedena s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.; 37 a SEQ ID č.: 38. DNA byla denaturována po dobu 1 minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci io po dobu 2 minut při teplotě 40 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkem cyklů. Výsledný produkt PCR byl štěpen pomocí Sphí a EcoRI. pMON33218 (obr. 15) obsahuje vložený Sphl / EcoRI fragment.
3' nepřekládaná terminační sekvence z rýžového bcta-tubulinu (3' r btub) (Genebank Accession i? č. L19598.gb_pl) (SEQ ID č.; 63) byla izolována pomocí PCR rýžové geonomové DNA. Amplifikace byla provedena s použitím příměrových sekvencí SEQ ID č.: 39 a SEQ ID č.: 40. DNA byla denaturována po dobu 1 minuty při teplotě 95 °C, podrobena teplotní hybridizaci po dobu minut při teplotě 40 °C a prodloužena po dobu 3 minut při teplotě 72 °C, celkem 30 cyklů.
Výsledný produkt PCR byl štěpen pomocí Sphl a EcoRI. pMON33216 (obr. 13) obsahuje vlože20 ný Sphl / EcoRI fragment.
Konstrukt pMON47901 (obr. 19) byl vytvořen spojením 3166 kb EcoRI a Pstl fragmentu pMON33225, 0,71 kb Pstl a Bglll fragmentu pMON26038 a 2,671 kb BglH a EcoRI fragmentu pMON 19433.
Konstrukt pMON47906 (obr. 20) byla vytvořena spojením 5748 kb Ncol a Bglll fragmentu pMON47909 a 0,449 kb Stul and Ncol fragmentu pMON33216 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří s Bglll komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č.: 4).
Konstrukt pMON47907 (obr. 21) byl vytvořen spojením 5743 kb Ncol a Bglll fragmentu pMON479IO a 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu pMON33216 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří Bglll komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č.: 4).
Konstrukt pMON479l5 (obr. 22) byt vytvořen spojením 5758 kb Ncol a Bglll fragmentu pMON47918 a 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu pMON332l6 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří Bglll komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č.: 4).
Konstrukt pMON479!6 (obr. 23) byl vytvořen spojením 5753 kb Ncol a Bglll fragmentu pMON47919 (obr. 26) a 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu pMON33216 s použitím adaptérů na
4o Stul místo, které tvoří Bglll komplementární konec (SEQ ID č.: 3 a SEQ ID č.: 4).
Konstrukt pMON47917 (obr. 24) byl vytvořen spojením 5895 kb Ncol a Bglll fragmentu pMON47920 a 0,449 kb Stul a Ncol fragmentu pMON33216 s použitím adaptérů na Stul místo, které tvoří Bglll komplementární konec (SEQ ID č.; 3 a SEQ ID č.: 4).
Konstrukt pMON47919 (obr. 25) byl vytvořen spojením 3166 kb EcoRI a Pstl fragmentu pMON33225, 0,726 kb Pstl a Bglll fragmentu pMON26046 a 2,671 kb Bglll a EcoRI fragmentu pMON 19433 (obr. 5).
Všechny konstrukty plazmidů byly ověřeny pomocí restrikčního štěpení pomocí Bglll a testovány v přechodné expresní zkoušce v protoplastech získaných z kalusu pšenice Mustang nebo v protoplastech získaných z kalusu kukuřice BMS nebo byly testovány jako stabilní integrované konstrukty v transgenních rostlinách, jak je popsáno dále.
- 16 CZ 302074 B6
Příklad 2
Přechodné transformace a značená genová exprese v pšenici a kukuřici
Přečištěná plazmidová DNA byla připravena Qiagen max i postupem podle návodu výrobce (Qiagen, Valencia, CA). GUS plazmidy obsahující 5' nepřekládané vedoucí sekvence nebo 3' nepřekládané terminační oblasti a kombinace 5'a3' nepřekládaných oblastí ve vektorových DNA a pMON 19437 jako vnitřní kontrolu luciferázy byly smíchány a podrobeny elektroporaci. Pro reverzní pokusy, které zkoumaly namnožení s přidanými kódujícími sekvencemi, byla luciferáza proměnným značkovacím genem, GUS v pMON 19469 byl vnitřní kontrolou. Transformace byly provedeny dvojmo. Elementy 3' nepřekládané oblastí v kombinaci s5' nepřekládanými vedoucími sekvencemi byly také testovány vůči kontrolnímu základnímu vektoru pMON 19469.
Analýza exprese genů v rostlinách byla publikována (Schledzewski a kol., 1994; Steinbiss a kol., 1991; Stefanov a kol., 1991). Analýza exprese protoplastů, například ta zde popsaná, často určuje průběh exprese rekombinantního genu v rostlinných buňkách.
Analýza genové exprese v pšeničném protoplastů.
Postup použitý pro izolaci a přípravě pšeničných protoplastů byl proveden tak, jak uvádí Zhou a kol., 1993. Použitý elektroporační pufr byl již dříve popsán (Li a kol., 1995). Použitá kultivační média byla MSI WSM (4,4 g Gibco MS sol/1, 1,25 ml Thiamin HCL (0,4mg/ml), 1 ml 2,4-D (1 mg/ml), 20g/L sacharózy, 0,15 ml asparaginu (15 mg/ml), 0,75 g MgCI2. 109 g.L 0,6 M mannitol, pH 5,5.
Suspenze Mustang byly použity k izolaci protoplastů asi čtyři dny po subkultivaci. 8 g suspenze pšeničných buněk bylo vlito do kultivační zkumavky a buňky se nechaly usadit. Médium bylo odstraněno a zbylé buňky resuspendovány s 40 ml roztoku enzymů, přeneseny na petriho misku, překryty fólií a inkubovány při teplotě 26 °C po dobu 2 hodin na rotoru při 40 ot/min. Suspenze byla centrifugována při 200 g po dobu 8 min, dvakrát promyta s centrifugaci mezi promýván ím, resuspendována v 10 ml promývacího roztoku a uložena na ledu. Bylo určeno množství protoplastů a objem upraven na konečnou koncentraci 4 x I06 protoplastů/ml. Asi 0,75 ml protoplastů bylo přidáno do každé elektroporační kyvety a asi 50 pg plazmidové DNA v 50 pl roztoku bylo přidáno k protoplastům. Podmínky elektroporace byly 960 pFaradů a 160 voltů s použitím BioRad Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, Hercules. CA). Vzorky zůstaly na ledu po dobu 10 minut před elektroporaci a v průběhu elektroporace. Po elektroporaci byly vzorky ponechány na ledu po dobu asi 10 minut a pak odstraněny z ledu. Ohřály se na pokojovou teplotu asi na dobu 10 minut. Buňky, které prošly elektroporaci byly poté pipetovány do MSI WSM média a inkubovány ve tmě po dobu 18 až 22 hodin pri teplotě 24 °C. Buňky byly vytěženy centrifugaci při teplotě 200 až 250 g po dobu 8 minut a zmraženy na suchém ledu pro následnou analýzu na geny, které byly předmětem zájmu.
Analýza genové exprese v kukuřičném protoplastů
Pro vyhodnocení GUS/LUX exprese různých konstruktů byl použit přechodný testovací systém pro kukuřičné protoplasty. Izolace a elektroporace kukuřičných listových protoplastů byla provedena podle popisu v Sheen. 199Ϊ s těmito změnami: semena byla povrchově sterilizována, naklíčena v 1/2MS médiu (2,2 g/1 MS soli, 0,25% gelrite) a pěstována 5 dní při teplotě 26 °C pri fotoperiodě den/noc - 16 hod/18 hod, 6 dní v naprosté tmě, 26 °C a 24 hodin v nejprve uvedených podmínkách. Druhý pravý list z každé rostlinky byl podélně rozřezán na tenké plátky a štěpen po dobu asi 2 hodin na světle při teplotě 26 °C. Po štěpení byly misky protočeny pri 80 až 100 ot/min po dobu 20 až 30 sekund a protoplasty/enzymy roztok pipeován přes filtr 190 pm. Protoplasty byly sečteny s použitím hemacytometru. Bio-Rad Gene modulační kyvety (Bio-Rad, Hercules, CA) s 0,4 cm gap a maximálním objemem 0,8 ml byly použity pro elektroporace. Do kyvety bylo přidáno 10 až 100 pg plazmidové DNA, aby bylo dosaženo 5 pg DNA
- 17CZ 302074 B6 obsahující luciferázový gen jako vnitřní kontrolu. Konečná hustota protoplastů byla asi 3 miliony na ml až 4,5 milionu na ml při podmínkách elektroporace 125 pFaradů kapacitance a 200 voltů.
Protoplasty byly inkubovány na ledu po resuspendaci v elektroporačním pufru a ponechány na ledu 10 minut po elektroporaci. Protoplasty byly přidány do asi 7 ml MS média upraveného, jak uvádí Fromm a kol., 1987, s přídavkem 0,6 M manitolu v petriho miskách se stejným médiem plus 1,5 % SeqPlaque agarózy (FMC Bioproducts, Rockland, ME). Protoplasty byly vytěženy centrifugací 24 hodin po elektroporaci a použity pro následující expresní analýzu na gen(y), které byly předmětem zajmu.
io Aktivita GUS
Aktivita GUS (β-glukuronidáza) byla určena z 25 μΐ buněčného extraktu podle metod, které uvádí Jefferson a kol., (1987) s použitím 2 mM MUG (4-methylumbelliferyl-p-D-glukuronid) v dříve popsaném extrakčním pufru. Fluorescence byla měřena s použitím Hoescht DNA Fluorois metem (Model TKO 100). Methylumbelliferon (Sigma) standardní křivka byla vytvořena s použitím a 1 μΜ roztoku.
Aktivita luciferázy
2o Pro určení aktivity luciferázy bylo od každého testovaného surového extraktu proteinu umístěno na mikrotitrovou desku deset mikrolitrů. Dvacet pět mikrolitrů 2X pufru (50 mM tricinu (pH 7,8), 30 mM MgCl2, 10 mM ATP a 0,5 mg/mL) bylo přidáno do každého extraktu. Reakce byly zahájeny přidáním 25 μΙ 10 mM luciferinu. Vzorky byly míchány a hodnota chemoluminiscence každého vzorku byla určena podle Packard TopoCount microplate scintilačního čítače s použitím
5 minutové sčítací prodlevy a sčítacího času 0,2 minuty.
Výsledky jsou vyjádřeny jako poměr úrovně testovaného značkovacího genu k úrovni vnitřního kontrolního značkovacího genu. Kontrolní plazmid obsahoval jiný značkovací gen a byl použit pro korekci variability v transformačních a extrakčních postupech.
31)
Tabulka 2
Účinek 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech pšenice Mustang
| Vektor | 5' nepřekládaná vedoucí sekvence | intron | 3' nepřekládaná terminační sekvence | Poměr GUS/LUX exprese |
| pMON19469 | základní-synt. | hsp 70 | nos | 1,0 |
| pMON25456 | základní-synt. | rýžový aktin | nos | 0,9 |
| pMOŇ26052 | Ta hsp | hsp 70 | nos | 1,8 |
| pMON26055 | Ta hsp | rýžový aktin | nos | 4,0 |
| pMON26064 | Ta fbp | rýžový aktin | nos | 4,2 |
| pMON26044 | Ta cab | rýžový aktín | nos | 6,7 |
Účinek 5' nepřekládané vedoucí sekvence na expresi GUS v protoplastech pšenice Mustang byl měřen s použitím konstruktů, které obsahovaly různé 5' nepřekládané vedoucí sekvence. Úroveň exprese pro kontrolní plazmid obsahující základní syntetickou 5' sekvenci (SEQ ID č.: 45), hsp70 intron (SEQ ID č.: 47) a 3' nos terminační oblast (SEQ ID č.: 46) byla stanovena jako 1,0. Exprese GUS v pšeničných protoplastech byla zvýšená při použití 5' nepřekládaných vedoucích
- 18 CZ 302074 B6 sekvencí pšeničného proteinu tepelného šoku (Ta hsp), pšeničné fruktóza-1,6-bisfosfatázy (Ta fbp) nebo pšeničného vazebného proteinu chlorofylu a/b (Ta cab) ve srovnání se základními syntetickými sekvencemi (tabulka 2). Méně průkazný byl účinek u protoplastů kukuřice BMS (tabulka 3)·
Tabulka 3
Účinek 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřice BMS
| vektor | 5’ nepřekládaná vedoucí sekvence | Intron | 3' nepřekládaná terminační sekvence | Poměr GUS/LUX exprese |
| pMON19469 | základní-synt. | hsp 70 | nos | 1,0 |
| pMON26052 | Ta hsp | hsp 70 | nos | 0,8 |
| pMON26055 | Ta hsp | rýžový aktin | nos | 4,9 |
| pMON26064 | Ta fbp | rýžový aktin | nos | 0,7 |
| pMON26044 | Ta cab | rýžový aktin | nos | ND |
ND - nedetekováno
Tabulka 4 uvádí výsledky GUS v protoplastech pšenice Mustang s použitím konstruktů, které obsahují 3' nepřekládané sekvence z pšeničného proteinu tepelného šoku (3' Ta hsp), pšeničné fruktóza-l,6-bisfosfatázy (3' Ta fbp) nebo pšeničného ubichitinu (3' Ta ubiq) ve srovnání s vektorem, který obsahuje nos 3' oblast. Každá z 3' nepřekládaných oblastí vykazuje zvýšenou expresi GUS v poměru k expresi pozorované s nos 3' nepřekládanou oblastí.
Tabulka 4
Účinek 3' nepřekládaných terminačních oblastí na expresi GUS v ostřelovaných pšeničných listech
| vektor | vedoucí sekvence | intron | 3' terminační oblast | poměr exprese GUS/LUX |
| pMON19433 | základní-synt. | hsp 70 | nos | 1,0 |
| pMON18379 | základní-synt. | hsp 70 | Ta fbp | 1,9 |
| pMON 18375 | základní-synt. | hsp 70 | Ta hsp | 2,8 |
| pMON 18377 | základní-synt. | hsp 70 | Ta ubiq | 2,6 |
Kombinované účinky popsaných 5'a 3' nepřekládaných sekvencí byly vyhodnoceny v protoplas30 těch pšenice Mustang. Exprese LUX byla měřena před expresí GUS, aby se potvrdilo, že zvýšené úrovně exprese nebyly specifické pro GUS. Úrovně exprese GUS a exprese LUX byly zvýšené při použití konstruktů obsahujících Ta cab. Ta hsp nebo Ta fbp 5' nepřekládané vedoucí sekvence a Ta ubiq, Ta fbp nebo Ta hsp 3' nepřekládané terminační sekvence (tabulka 5).
-19CZ 302074 B6
Tabulka 5
Kombinované účinky 5'a 3' nepřekládaných terminačních sekvencí na expresi GUS a LUX v protoplastech pšenice Mustang
| vektor | vedoucí sekvence | intron | 3' terminační sekvence | Poměr GUS/LUX exprese | Poměr LUX/GUS exprese |
| pMON19469 | základní-synt. | kukuřičný hsp 70 | nos | 1,0 | |
| pMOŇ32502 | Ta cab | rýžový aktin | Ta hsp | 11,9 | -- |
| pMON32506 | Ta hsp | rýžový aktin | Ta hsp | 1,6 | - |
| pMON32509 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta ubiq | 8,5 | — |
| pMON32510 | Ta hsp | rýžový aktin | Ta ubiq | 3,5 | — |
| pMON32513 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta fbp | 12,5 | - |
| pMON19437 | základní-synt. | kukuřičný hsp 70 | nos | 1,0 | |
| pMON32516 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta ubiq | -- | 6,2 |
| pMON32517 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta fbp | - | 6,2 |
| pMON32515 | Ta cab | rýžový aktin | Ta hsp | - | 7,6 |
Kombinované účinky popsaných 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí a 3' nepřekládaných terminačních sekvencí byly také měřeny v protoplastech kukuřice BMS. Exprese GUS byla obecio ně zvýšená oproti základní kontrole (tabulka 6). Výsledky pozorované u kukuřice potvrdily výsledky získané u pšenice a ukazují, že výhodné účinky 5' a 3' nepřekládaných sekvencí podle vynálezu nejsou omezeny druhem, ze kterého nepřekládané sekvence pocházejí.
Tabulka 6
Kombinované účinky 5'a 3' nepřekládaných terminačních sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřice BMS.
| Vektor | vedoucí sekvence | intron | 3' terminační sekvence | poměr GUS/LUX exprese |
| PMON19469 | základní-syntetická | hsp 70 | nos | 1,0 |
| PMON32502 | Ta cab | rýžový aktin | Ta hsp | 5,0 |
| PMON32506 | Ta hsp | rýžový aktin | Ta hsp | 5,8 |
| PMON32509 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta ubiq | 0,9 |
| PMON32510 | Ta hsp | rýžový aktin | Ta ubiq | 2,5 |
| PMON32513 | Ta fbp | rýžový aktin | Ta fbp | 1,2 |
-20CZ 302074 B6
Příklad 3
Stabilní transformace v rostlinách typu pšenice
Účinky 5' a 3' nepřekládaných sekvencí na expresi GUS byly také vyhodnoceny v transgenních rostlinách typu pšenice. Postup použitý pro transformaci a regeneraci pšenice byl proveden tak, jak uvádí patent US 5 631 152, zde zařazený v dodatcích, ale byl upraven pro selekci G418. Nezralá embrya byla kultivována na CM4C médiu po dobu 0 až 4 dní (CM4C složky: 4,3 g/1 to Gibco MS solí, 10 ml/1 MS vitaminů (100X), 0,5 ml/1 2,4-D, 40 g/l maltózy, 0,5 g/1 glutaminu,
0,75 g/1 chloridu horečnatého, OJ g/1 kasein hydrolyzátu, 1,95 g/1 MES, 2 g/1 fytagelu); kultury byly přeneseny do CM4C Raff/Mann média na asi 4 dny, ostřelovány a přeneseny do CM4C obsahujícího 25 mg/1 G4I8 na dobu asi 5 dní; kultury regenerovaly na MMS0,2C s obsahem G418 (25 mg/1) po dobu asi 19 dní, na MMS0C s obsahem 25 mg/1 G418 po dobu asi 33 dní a zakořenily na MMS0C s obsahem 25 mg/1 G418 po době asi 57 dní a pak byly přeneseny do půdy na asi 75 dní. CM4C (G4I8) médium obsahující 2,2 ml/1 1 mg/ml pichloramu, 1 ml/1 G418 (25 mg/ml) a 2 ml/1 kyseliny askorbové (50 mg/ml stock). Médium CM4C Raff/Mann 0,25 obsahovalo následující složky: 4,4 g/1 MS solí, 10 ml/1 MS vitamínů (100X), 0,5 ml/1 2,4 až 0,40 g/1 maltózy, 74,3 g/1 rafinózy, 22,78 g/1 manitolu, 0,5 g/1 glutaminu, 0,75 g/1 chloridu horečnatého, !,95 g/1 MES, 0,1 g/1 kasein hydrolyzátu, 2 g/l fytagelu, 2,2 ml pichloramu (1 mg/ml) a 2 ml askorbové kyseliny (50 mg/ml). MMS0,2C médium obsahující 4,3 g/l MS solí, 1,95 g/l MES, 2 ml/1 MMS vitaminů, 0,2 ml/1 2,4-D, 40 g/l maltózy a 2 g/l agaru (Schweizer Halí). Médium MM20,2C (G4I8) obsahovalo 1 ml 25 mg/ml G4I8 a 2 ml 50 mg/ml kyseliny askorbové, MMS0C obsahovalo 4,3 g/1 MS solí, 1,95 g/1 MES, 2,0 ml/1 MMS vitaminů a 40 g/1 maltózy.
MMS0C (G418) obsahovalo přídavek 1 ml 25 mg/ml G418 a 2 ml 50 mg/ml kyseliny askorbové. Transgenní linie byly ustanoveny s použitím DNA konstruktů, které jsou popsány v dále uvedené tabulce 7 a rostliny byly vyhodnoceny na úrovně aktivity GUS.
Poměrné úrovně GUS byly srovnatelné nebo větší než základní kontrolní vektor pro mnohé z konstruktů obsahujících nepřekládané elementy podle vynálezu. Zvláště konstrukty obsahující Ta cab nebo Ta fbp 5' nepřekládané vedoucí sekvence použité v kombinaci s Ta hsp nebo Ta fbp 3' nepřekládanými terminačními sekvencemi měly za následek vysoké úrovně exprese. Jiné výhodné konstrukty obsahovaly Ta fbp 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci a 3' nepřekládanou nos terminační oblast.
Tabulka 7
Účinek 5' nepřekládané vedoucí sekvence a 3' nepřekládanou terminační sekvencí genových ele40 mentů na stabilní expresi GUS v transgenních rostlinách typu pšenice.
| konstrukt | vedoucí sekv./intro n/3' | n | průměrná GUS aktivita | Poměrná průměrná hodnota | rozsah aktivity GUS nízká - vysoká | poměrná vysoká hodnota |
| pMON26044 | Ta cab/rýžový aktin/nos | 5 | 20,7±28,l | 0,7 | 0,6-72,7 | 1,0 |
| pMON26052 | Ta hsp/hsp- 70/nos | 9 | 11,1±9,6 | 0,4 | 0,6-26,3 | 0,4 |
-21 CZ 302074 B6
| pMON26055 | Ta hsp/rýžový aktin/nos | 4 | 15,3±24,1 | 0,6 | 0,6 - 57,0 | 0,8 |
| pMON26064 | Ta fbp/rýžový aktin/nos | 4 | 72,l±102,3 | 2,6 | 1,0-248,6 | 3,5 |
| pMON32502 | Ta cab/rýžový aktin/Ta hsp | 55 | 82,8±135,6 | 3,0 | 0,6 - 779,8 | 11,0 |
| pMON32509 | Ta fbp/rýžový aktin/Ta ubiq | 6 | 25,6±24,0 | 0,9 | 1,7-71,2 | 1,0 |
| PMON32513 | Ta fbp/rýžový aktin/Ta fbp | 10 | 86,1±62,6 | 3,1 | 17,0- 244,8 | 3,4 |
Hodnoty aktivity GUS jsou vždy vyjádřeny jako pmol/min/mg protein n - počet nezávislých testovaných rostlin typu pšenice
Procento GUS pozitivních výsledků v transgenních rostlin typu pšenice bylo použito k určení účinku 5' nepřekládané vedoucí sekvence a 3' nepřekládané terminační sekvence na obnovu stalo bilní exprese GUS. Konstrukty, které dosahují vysoké úrovně exprese GUS v tabulce 7 způsobují také vysoké procento GUS pozitivních výsledků (tabulka 8).
-22CZ 302074 B6
Tabulka 8
Účinek 5' nepřekládané vedoucí sekvence a 3' nepřekládané terminační sekvence genových ele5 mentů na obnovení stabilní exprese GUS nad podkladem hraničních úrovní v transgenních rostlinách typu pšenice.
| Konstrukt | Vedoucí sekv./intron/3' | množství rostlin | množství výsledků | GUS pozitivní výsledky | % GUS pozitivních výsledků |
| pMON 19468 | base/hsp 70/nos | 29 | 14 | 2 | 14 |
| pMON26044 | Ta cab/rýžový aktin/nos | 17 | 11 | 4 | 36 |
| pMON26052 | Ta hsp/hsp 70/nos | 31 | 22 | 5 | 23 |
| pMON26055 | Ta hsp/rýžový aktin/nos | 20 | 15 | 4 | 27 |
| pMON26064 | Ta fbp/rýžový aktin/nos | 9 | 8 | 4 | 50 |
| pMON32502 | Ta cab/rýžový aktin/Ta | 122 | 58 | 33 | 57 |
| hsp | |||||
| pMON32509 | Ta fbp/rýžový aktin/Ta ubich | 20 | 15 | 4 | 27 |
| pMON32513 | Ta fbp/rýžový aktin/Ta fbp | 44 | 37 | 16 | 43 |
Tabulka 9
Účinek 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| Konstrukt | 5' vedoucí sekv. | intron | 3' terminační sekv. | poměr GUS/LUX |
| pMON8677 | základní syntetická | žádný | nos | 1,0 |
| pMON26O38 | Ta cab | žádný | nos | 12,7 |
| pMON26043 | Ta hsp | žádný | nos | 7,1 |
| pMON26046 | Ta hsp | žádný | nos | 6,2 |
| pMON33219 | r amyl | žádný | nos | 1,7 |
-23 CZ 302074 B6
Tabulka 10
Účinek 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| Konstrukt | 5' vedoucí sekv. | intron | 3’ terminační sekv. | poměr exprese GUS/LUX |
| pMON33210 | základní syntetická | hsp70 | nos | uo |
| pMON33220 | r btub | hsp70 | nos | 1,5 |
Účinek různých 5' nepřekládaných vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů byl měřen s použitím konstruktů, které obsahovaly různé 5' nepřekládané vedoucích io sekvence (tabulky 9 a 10). Exprese GUS v protoplastech kukuřičných listů byla zvýšená v případě, že byly použity 5' nepřekládané vedoucí sekvence vazebného proteinu chlorofylu a/b (Ta cab), pšeničného proteinu tepelného šoku (Ta hsp), pšeničné peroxidázy (Ta per) nebo rýžového beta—tubulinu (r btub).
Tabulka 11
Účinek intronů na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| Konstrukt | 5' vedoucí sekvence | intron | 3' terminační sekvence | poměr exprese GUS/LUX |
| pMON8677 | základní syntetická | žádný | nos | 1,0 |
| pMON33211 | základní syntetická | r amyl | nos | 5,6 |
| pMON3226 | základní syntetická | r pal | nos | 2,5 |
| pMON3228 | základní syntetická | r ssl | nos | 2,3 |
Účinek různých intronů na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů byl měřen s použitím konstruktů, které obsahovaly různé introny. Exprese GUS v protoplastech kukuřičných listů byla zvýšená v případě, že byly použity rýžové introny první amylázy (r amy 1), fenylalanin amonium-lygázy (r pal) nebo první sacharózové syntetázy (ss 1).
-24CZ 302074 B6
Tabulka 12
Účinek 3' nepřekládaných terminačních oblastí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| konstrukt | 5' nepřekládaná vedoucís sekv. | intron | 3' nepřekládaná terminační sekv. | poměr exprese GUS/LUX |
| pMON26044 | Ta cab | rýžový aktin | nos | 1,0 |
| pMON33225 | Ta cab | rýžový aktin | r glut | 4,0 |
| pMON33218 | Ta cab | rýžový aktin | r lacd | 4,5 |
| pMON33216 | Ta cab | rýžový aktin | r btub | 3,6 |
Účinek různých 3' nepřekládaných terminačních sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů byl měřen s použitím konstruktů, které obsahovaly různé 3' nepřekládané termiio načni sekvence. Exprese GUS v protoplastech kukuřičných listů byla zvýšená v případě, že byly použity 3' nepřekládané terminační sekvence rýžového glutelinu typ II (r glut), rýžové laktát dehydrogenázy (r lacd) nebo rýžového beta-tubulinu (r btub) ve srovnání s kontrolním konstruktem, který obsahoval nos 3' nepřekládanou terminační sekvenci.
Tabulka 13
Kombinované účinky 5' a 3' nepřekládaných terminačních sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| Konstrukt | 5' nepřekládaná vedoucí sekv. | intron | 3' nepřekládaná terminační sekv. | poměr exprese GUS/LU X |
| PMON19469 | základní syntetická | hsp 70 | nos | 1,0 |
| PMON33218 | Ta cab | rýžový aktin | r lacd | 2,8 |
| PMON33225 | Tacab | rýžový aktin | rglut | 3,1 |
| PMON47901 | Ta cab | rýžový aktin | rglut | 2,7 |
| pMON47906 | Ta hsp | rýžový aktin | r lacd | 3,2 |
| pMON47907 | Ta hsp | rýžový aktin | rglut | 3,5 |
| pMON47915 | Ta per | rýžový aktin | r lacd | 3,4 |
| pMON47916 | Ta per | rýžový aktin | rglut | 3,9 |
| pMON47919 | Ta per | hsp70 | rbtub | 3,2 |
| pMON479I7 | Ta per | rýžový aktin | rbtub | 2,4 |
| pMON32502 | Ta cab | rýžový aktin | Ta hsp | 3,0 |
-25 CZ 302074 B6
Tabulka 14
Účinek různých vedoucích sekvencí na expresi GUS v protoplastech kukuřičných listů
| konstrukt | 5' nepřekládaná vedoucí sekv. | intron | 3’ nepřekládaná terminační sekv. | poměr exprese GUS/LUX |
| pMON8677 | žádný | hsp70 | nos | 1,0 |
| pMON33219 | r amy | hsp70 | nos | 1,65 |
| pMON26038 | Ta cab | žádný | nos | 12,74 |
| pMON26043 | Ta hsp | žádný | nos | 7,11 |
| pMON26046 | Ta per | žádný | nos | 6,16 |
| pMON33210 | žádný | hsp70 | nos | 1,0 |
Úroveň zvýšení exprese pro strukturální DNA se může měnit i z jiných důvodů než je 5' nepřekládaná vedoucí sekvence, 3' nepřekládaná terminační sekvence nebo intronová sekvence, i o K těmto důvodům mohou patřit: místa zahajující transkripci, polyadeny lační místa, transkripČní terminační signály, transportní signály škodujícími oblastmi, atd. Stejné sekvence mohou poskytnout různé úrovně exprese v závislosti na druhu, ve kterém exprese probíhá a přesném složení sekvence a může vyžadovat nějaký stupeň optimalizační rutiny pro lepší výsledky v různých rostlinných druzích.
Určité znaky a dílčí kombinace podle vynálezu mohou být použity bez souvislosti s dalšími rysy a dílčími kombinacemi. To odpovídá nárokům vynálezu. Protože může být provedeno mnoho příkladů provedení podle vynálezu bez odchýlení od myšlenky vynálezu, je samozřejmé, že všechny látky zde uváděné nebo ukázané v následujících obrázcích, slouží pouze k vysvětlení ío a ilustraci a vynález na ně není omezen.
Všechny zde popsané a nárokované kompozice a způsoby mohou být použity bez dalšího testování. Pokud jsou kompozice a způsoby podle vynálezu popsány termínem výhodný příklad použití, je odborníkům vdané oblasti zřejmé, že lze použít obměny použitých DNA molekul a obměny v krocích nebo sekvencích kroků způsobu zde popsaného, bez odchýlení od ducha vynálezu. Přesněji, je zřejmé, že určitá činidla, ať už chemická nebo fyziologická, mohou být zaměněna za činidla zde popsaná, přičemž bude dosaženo stejných nebo podobných výsledků. Všechny takové podobné záměny a úpravy zřejmé odborníkům v dané oblasti nenarušují duch, oblast ani koncepci vynálezu, jak je zřejmé z následujících patentových nároků.
Použitá literatura
Následující odkazy poskytující procedurální nebo jiné detaily, které doplňují ty, které zde byly uvedeny, jsou zde zařazeny v dodatcích.
Bird and Ray, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 9: 207-27 (1991)
Birren a kol., Genome Analysis: Analyzing DNA.l, Cold Spring Harbor, New York (1996) Bouhida a kok, Journal General Virology (1993) vok 74 str. 15-22.
Callis a kok, Genes and Develop, I: 1183-1200 (1987)
Carrington a Freed, J. of Vir. 64, 1590-1597 (1990)
-26CZ 302074 B6
Coruzzi a kol., EMBO J, (1984) vok3 str. 1671-1679.
Dellaporta a kol., Stadler Symposium 11 :263-282 (1988)
Dietrich a kol., J. Cell Biol. 105,67, (1987)
Fromm a kok, Methods Enzymok 153, 351-366 (1987)
Gallie a kok, NAR 15,8693-8711 (1987)
Gallieakok, The Plant Cell 1:301-311 (1989)
Gelvin a kok, In: Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academie Publishers (1990)
Gibson and Shillitoe, Molecular Biotech. 7(2) 125-37 (1997)
Goffakok, EMBO J. 9: 2517-2522 (1990) io Hattori a kok, Genes Dev. 6: 609-618 (1992)
Hinchee a kok, Bio/Technology 6:915-922 (1988)
Hinchee a kok, Plant Transformation, In PLANT CELL AND TISSUE CULTURE, 231270,1994, Vasil and Thorpe (Eds.), Dordrecht Publishing, Netherlands.
Ikatu a koL, Bio/Technok 8:241-242 (1990)
Innes a kok, In: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academie Press. San Diego, 1990
Jackson a kok, TIBS 15,477-483 (1990)
Jefferson a kok, EMBO J. 6: 3901-3907 (1987)
Jefferson, Plant Mok Biol, Rep. 5: 387-405 (1987)
2o Jobling a Gehrke, Nátuře 325, 622-625 (1987)
Jorgensen, Trends in Biotech 8(12) 340—44 (1990)
Joshi, Nud Acids Res 15: 6643-6653, 1987
Katz a kol, J. Gen. Microbiok 129:2703-2714 (1983)
Klein a kok, Bio/Technology 6:559-563.
Kozák, Cell 44,283-292 (1986)
Kozák, Mok and Celk Biok 8,2737-2744 (1988)
Koziel a kok. Plant Mok Biok 32:393-405 (1996)
Li a kok, Molecular Breeding (1997) vol. 3 str. 1-14.
Mailga a kok, Methods in Plant Molecular Biology. Cold Spring Harbor Press (1995)
Marcotte a kok, Nátuře, 335: 454-457 (1988)
Marcotte a kok, Plant Cell, I: 523-532 (1989)
Mascarenkas a kok, Plant Mok Biok, 15, 913-920 (1990)
McCarty a kok. Cell 66: 895-905 (1991)
McElroy a kok, Plant Cell, 2:163-71 (1990)
McElroy a kok, Mok Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)
Medberry a Olszewski, Plant Journal (1993) vol. 3 str. 619-626.
Moffan a kok. Gene( 1994) vol 143 str. 211 -216.
Moldave, Ann, Rev. Biochem. 54, 1109-1149 (1985)
Ni a kok. Plant J. (1995) vol. 7 str. 661-676.
Oděli a kok, Nátuře (1985) vol. 313 str. 810-812.
Ow a kok. Science 234: 856-859 (1986)
Pain, Biochem, J. 235-625-637 (1986)
-27CZ 302074 B6
Pelletier and Sonenberg, Cell 40, 515-526 (1985)
Potrykus a kol.. Mol. Gen. Genet. 199: 183-188(1985)
Pouwelsa kol., In Cloning Vectors. A Laboratory Manual. 1985 supp., 1987
Ritchie a kol., In TRANSGENIC PLANTS, Vol. 1.147-177, 1993. Kung and Wu (Eds.).
Academie Press lne. Harcourt Brace Jovanovich Publishers.
Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press (1989) Sangerakol.. Plant Mol. Biol. (1990) vol. 14 str. 433-443
Schledzewski a kol,, Transgenic Research (1994) 3: 249-255
Schuch, Symposia of the Society for Experimental Biology 45: 117-27 (1991) io Sheen a kol.. Plant Cell 3(3) 225-245 (1991)
Skuzeski a kol.. Plant mol. Biol. 15, 65- 79 (1990)
Sonenberg. Curr, Top. Micro, and Imm. 161, 23Č7 (1990)
Songstad a kol., In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 32: 179-183 (1995)
Stalker a kol., J. Biol. Chem. 263 :6310-6314 (1988)
Stefanov a kol., Acta Biologica Hungarica (1991) 42: 323-330 Steinbiss a kol., Subcellular Biochem. (1991) 17: 143-166 Sutcliffe a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 75: 3737-3741 (1978)
Tanaka,Nucl. Acids Res. 18:6767-6770. 1990 Thillet a kol., J. Biol. Chem. 263: 12500-12508 (1988) zo Vasil a kol., Bio/Technology 10:667, (1992)
Wang a kol., Plant Mol. Biol., 19:881-885 (1992)
Weissbach a Weisbach, In Methods for Plant Molecular Biology, Academie Press. 1989 Wen a kol., Chinese J. of Bot. (1993) vol. 5 str. 102-109 Xu a kol., Plant Physiology (1994) vol. 106 str. 459-467
Zhong a kol., Plant Science (1996) vol. 116 str. 73-84 Zhou. H.akol.. Plant Cell Reports (1993) 12:612-616 Zhu a kol., Plant Mol. Biol. 29:535-550 (1995)
Zukowsky akol.. Proč. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.) 80:1101-1105 (1983)
Claims (40)
1. Rekombinantní molekula DNA, která obsahuje funkčně připojené ve směru 5', 3':
(a) promotorovou sekvenci, kteráje funkční v rostlinách;
40 (b) 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci SEQ NO 52 izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro vazebný protein chlorofylu a/b;
(c) sekvenci intronů, vybranou ze sekvencí SEQ NO 47 až 51, izolovanou z nukleotidové sek45 vence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z rýžového genu pro aktin, rýžového genu pro sacharózasyntázu, rýžového genu pro fenylalaninamoniumlygázu, rýžového genu pro amylázu a kukuřičného genu pro protein tepelného šoku;
-28CZ 302074 B6 (d) kódující sekvenci DNA, která je funkční v rostlinách a (e) 3' nepřekládanou terminační sekvenci, vybranou ze sekvencí SEQ NO 58 až 63, izolovanou
2. Molekula DNA podle nároku 1, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin.
3. Molekula DNA podle nároku 1, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s genem pro sacharózasyntázu.
4. Molekula DNA podle nároku 1, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro fenylalaninamoniumlygázu.
5. Molekula DNA podle nároku 1, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence
5 z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro protein tepelného šoku, pšeničného genu ubichitinu, pšeničného genu pro fruktóza-l,6-bisfosfatázu, rýžového genu pro glutelin, rýžového genu pro laktátdehydrogenázu a rýžového genu pro beta-tubulin.
i o
6. Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro glutelin.
25
7, Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro laktátdehydrogenázu.
8. Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro beta-tubulin.
9. Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro protein tepelného šoku.
10. Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nuk35 leotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro ubichitin.
11. Molekula DNA podle nároku 1, kde 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro fruktóza~l,6-bisfosfatázu.
40
12. Molekula DNA podle nároku 1, kde 5' nepřekládaná vedoucí sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro vazebný protein chlorofylu a/b, sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin a 3' nepřekládaná oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro protein tepelného šoku.
13. Molekula DNA podle nároku I, kde 5' nepřekládaná vedoucí sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro vazebný protein chlorofylu a/b, sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin a 3' nepřekládaná terminační oblast je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro
50 fruktóza-1,6-bisfosfatázu.
14. Molekula DNA podle nároku 1, kde promotor je konstitutivní, inducibilní, vývojově regulovaný, chemicky regulovaný, ve tkáni rozšířený nebo pro tkáň specifický.
55 15. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA kódující sekvence má negativní orientaci.
-29CZ 302074 B6
15 genu pro fenylalanínamoniumlygázu a kukuřičného genu pro protein tepelného šoku ajejich funkčně ekvivalentních variant;
(d) kódující sekvenci DNA a
16. Molekula DNA podle nároku 1, kde DNA kódující sekvence má pozitivní orientaci.
17. Transformovaná buňka obsahující rekombínantní DNA molekulu, která obsahuje funkčně 5 spojené ve směru 5', 3' (a) sekvenci promotoru;
(b) 5' nepřekládanou sekvenci izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným to ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro vazebný protein chlorofylu a/b ajeho funkčně ekvivalentních variant;
(c) sekvenci intronů izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z rýžového genu pro aktin, rýžového genu pro syntetázu sacharózy, rýžového
18. Transformovaná buňka podle nároku 17, kde buňka je rostlinná buňka, bakteriální buňka nebo vir.
19. Transformovaná buňka podle nároku 17, kde buňka je rostlinná buňka,
20. Rostlina obsahující rostlinnou buňku podle nároku 19.
20 (e) 3' nepřekládanou terminační sekvenci izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro protein tepelného šoku, pšeničného genu ubichitin, pšeničného genu pro fřuktóza-1,6-bisfosfatázu, rýžového genu pro glutelin, rýžového genu pro laktátdehydrogenázu a rýžového genu pro beta-tubulin ajejich funkčně ekvivalentních variant.
20 spojené s rýžovým genem pro amylázu.
21. Rostlina podle nároku 20, kde rostlina je dvouděložná.
35
22. Rostlina podle nároku 20, kde rostlina je jednoděložná.
23. Rostlina podle nároku 20, kde rostlina je vybrána ze skupiny sestávající z vojtěšky, ječmene, ovsa, kukuřice, rýže, žita a pšenice.
40
24. Rostlina podle nároku 22, kde rostlina je rostlina pšenice.
25. Rostlina podle nároku 22, kde rostlina je rostlina kukuřice.
26. Způsob pro zlepšení genové exprese v rostlinách, přičemž (b) rostlinné buňky s rekombínantní molekulou DNA, která obsahuje, funkčně spojené ve směru 5', 3' (i) promotorovou sekvenci;
(íi) 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro vazebný protein chlorofylu a/b a jeho funkčně ekvivalentních variant;
55 (iii) kódující sekvenci DNA;
-30CZ 302074 B6 (iv) sekvenci intronů spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z rýžového genu pro aktin, rýžového genu pro sacharózasyntázu, rýžového genu pro fenylalaninamoniumlygázu ajejich funkčně ekvivalentních variant a (v) 3' nepřekládanou terminační sekvenci spojenou s genem vybraným ze skupiny sestávající z pšeničného genu pro protein tepelného šoku, pšeničného genu ubichitin, pšeničného genu pro fruktóza-I,6-bisfosfatázu, rýžového genu pro glutelin, rýžového genu pro laktátdehydrogenázu a rýžového genu pro betatubulin a jejich funkčně ekvivalentních variant, se transformují;
(b) rostlinné buňky, které byly transformovány, se vyberou; a (c) regenerují se pro získání odlišné rostliny.
27. Způsob podle nároku 26, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin.
28. Způsob podle nároku 26, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro sacharózasyntázu,
29. Způsob podle nároku 26, kde sekvence intronů je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro fenylalaninamoniumlygázu.
30. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro glutellin.
-31 CZ 302074 B6
31. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro laktátdehydrogenázu.
32. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro beta-tubulin.
33. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro protein tepelného šoku.
34. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro ubichitin.
35. Způsob podle nároku 26, kde 3' nepřekládaná terminační sekvence je izolována z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro fruktóza-1,6-bisfosfatázu.
36. Způsob podle nároku 26, kde rekombinantní molekula DNA obsahuje 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro vazebný protein chlorofylu a/b, sekvenci intronů izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin a 3' nepřekládanou oblast izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro protein tepelného šoku.
37. Způsob podle nároku 26, kde rekombinantní molekula DNA obsahuje 5r nepřekládanou vedoucí sekvenci izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro vazebný protein chlorofylu a/b, sekvenci intronů izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s rýžovým genem pro aktin a 3' nepřekládanou oblast izolovanou z nukleotidové sekvence spojené s pšeničným genem pro fruktóza-l,6-bisfosfatázu.
38. Způsob podle nároku 26, kde DNA kódující sekvence má negativní orientaci.
39. Způsob podle nároku 26, kde DNA kódující sekvence má pozitivní orientaci.
40. Způsob podle nároku 26, kde promotor je konstitutivní, inducibilní, vývojově regulovaný, 5 chemicky regulovaný, rozšířený ve tkáni nebo pro tkáň specifický.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US9715098P | 1998-08-19 | 1998-08-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2001597A3 CZ2001597A3 (cs) | 2001-08-15 |
| CZ302074B6 true CZ302074B6 (cs) | 2010-09-29 |
Family
ID=22261516
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20010597A CZ302074B6 (cs) | 1998-08-19 | 1999-08-18 | Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné bunky a zpusob pro zlepšení genové exprese v rostlinách |
| CZ20090604A CZ301915B6 (cs) | 1998-08-19 | 1999-08-18 | Rekombinantní molekula DNA, transformovaná bunka, rostlina a zpusob zlepšení genové exprese |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20090604A CZ301915B6 (cs) | 1998-08-19 | 1999-08-18 | Rekombinantní molekula DNA, transformovaná bunka, rostlina a zpusob zlepšení genové exprese |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (5) | EP2080805B1 (cs) |
| CN (1) | CN100390284C (cs) |
| AR (2) | AR021465A1 (cs) |
| AT (3) | ATE506441T1 (cs) |
| AU (3) | AU767146B2 (cs) |
| BR (2) | BRPI9913690B1 (cs) |
| CA (2) | CA2340286C (cs) |
| CZ (2) | CZ302074B6 (cs) |
| DE (3) | DE69943375D1 (cs) |
| DK (2) | DK1698699T3 (cs) |
| ES (3) | ES2365204T3 (cs) |
| ME (2) | MEP19908A (cs) |
| PL (1) | PL346650A1 (cs) |
| PT (2) | PT1698699E (cs) |
| WO (3) | WO2000011178A2 (cs) |
| YU (1) | YU13501A (cs) |
| ZA (1) | ZA200100874B (cs) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060594A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| GB9908788D0 (en) * | 1999-04-16 | 1999-06-09 | Univ London | Gene expression in eukaryotic cells |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| MXPA03007469A (es) | 2001-02-22 | 2004-07-30 | Pioneer Hi Bred Int | Manipulacion de genes sucrosa sintasa para mejorar la calidad del grano y tallo. |
| RS20050183A (en) * | 2002-07-29 | 2007-06-04 | Monsanto Technology Llc., | Dna sequences related to corns transformant pv-zmir 13 (mon863) plants and compositions and method for detection thereof |
| US8212113B2 (en) | 2003-12-15 | 2012-07-03 | Monsanto Technology Llc | Corn plant Mon88017 and compositions and methods for detection thereof |
| EP2333079B1 (en) * | 2004-01-20 | 2016-03-30 | Monsanto Technology LLC | Chimeric promoters for use in plants |
| US8946510B2 (en) | 2004-04-09 | 2015-02-03 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| EP3508582B1 (en) | 2005-09-16 | 2021-01-13 | Monsanto Technology LLC | Methods for genetic control of insect infestations in plants and compositions thereof |
| ATE542912T1 (de) | 2005-10-03 | 2012-02-15 | Monsanto Technology Llc | Transgene pflanzensamen mit erhöhtem lysin |
| CN104745603B (zh) * | 2007-06-08 | 2018-08-21 | 墨西哥国立大学 | 使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌cry毒素的抗性 |
| US20100186123A1 (en) * | 2007-06-08 | 2010-07-22 | Pioneer Hi-Bred International , Inc. | Suppression of Resistance in Insects to Bacillus Thuringiensis Cry Toxins, Using Toxins that do not Require the Cadherin Receptor |
| SI2262896T1 (sl) | 2008-04-07 | 2014-05-30 | Monsanto Technology Llc | Rastlinski regulatorni elementi in njihove uporabe |
| EA035103B1 (ru) * | 2008-07-02 | 2020-04-28 | Атеникс Корпорейшн | Инсектицидный полипептид axmi-115 дельта-эндотоксина и его применение |
| KR101818775B1 (ko) * | 2009-03-30 | 2018-01-15 | 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 | 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 |
| ES2736037T3 (es) | 2010-01-14 | 2019-12-23 | Monsanto Technology Llc | Elementos reguladores de las plantas y usos de los mismos |
| ES2666149T3 (es) | 2011-03-25 | 2018-05-03 | Monsanto Technology Llc | Elementos reguladores de plantas y usos de los mismos |
| MX355475B (es) | 2011-05-13 | 2018-04-18 | Monsanto Technology Llc | Elementos reguladores de las plantas y sus usos. |
| US9663793B2 (en) | 2012-04-20 | 2017-05-30 | Monsanto Technology, Llc | Plant regulatory elements and uses thereof |
| WO2014004638A2 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-03 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for enhancing gene expression |
| CN103194460B (zh) * | 2013-04-17 | 2015-04-08 | 中国农业大学 | 一种苏云金芽孢杆菌晶体融合蛋白Bt Cry3Bb的制备方法 |
| CN103884848B (zh) * | 2014-04-02 | 2015-08-05 | 江苏省农业科学院 | 一种预测转Bt基因棉花抗虫性强度的方法 |
| EP3274462A4 (en) | 2015-03-26 | 2018-12-26 | The Texas A&M University System | Conversion of lignin into bioplastics and lipid fuels |
| US10155960B2 (en) * | 2015-08-27 | 2018-12-18 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory proteins |
| CA3206286A1 (en) | 2015-10-12 | 2017-04-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Fungal entomopathogen biocides and their use in plants |
| CN105936644B (zh) * | 2016-07-09 | 2021-11-16 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种杀虫蛋白及其核苷酸序列和应用 |
| US20200332311A1 (en) | 2018-01-12 | 2020-10-22 | The Texas A&M University System | Increasing plant bioproduct yield |
| PL3740070T3 (pl) | 2018-01-18 | 2025-03-03 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Enkapsulacja alginianowa mikrosklerocjów grzybów |
| CN112055753B (zh) | 2018-04-27 | 2025-01-10 | 先锋国际良种公司 | 玉米事件dp-023211-2及其检测方法 |
| BR112021011370A2 (pt) | 2018-12-14 | 2021-08-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Produtos biológicos e seu uso em plantas |
| CN109777823B (zh) * | 2019-01-28 | 2020-02-07 | 湖北大学 | 一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法 |
| WO2021076346A1 (en) | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack |
| CN112898388A (zh) * | 2020-06-16 | 2021-06-04 | 九圣禾种业股份有限公司 | 一种抗虫蛋白Cry1ABn39、编码基因和应用 |
| CA3190625A1 (en) | 2020-09-10 | 2022-03-17 | Monsanto Technology Llc | Increasing gene editing and site-directed integration events utilizing meiotic and germline promoters |
| US10894812B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-01-19 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant milk proteins |
| US10947552B1 (en) | 2020-09-30 | 2021-03-16 | Alpine Roads, Inc. | Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants |
| CA3191387A1 (en) | 2020-09-30 | 2022-04-07 | Nobell Foods, Inc. | Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same |
| UY39585A (es) * | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| JP2024528407A (ja) | 2021-06-16 | 2024-07-30 | ドナルド・ダンフォース・プラント・サイエンス・センター | 修飾された抗微生物ペプチド |
| WO2024009146A2 (en) | 2022-07-05 | 2024-01-11 | University Of Freiburg | Plant regulatory elements and uses thereof |
| AU2023337091A1 (en) | 2022-09-09 | 2025-03-06 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Plant regulatory elements and uses thereof |
| US20250075226A1 (en) | 2023-08-29 | 2025-03-06 | University Of Freiburg | Proteins for regulation of symbiotic infection and associated regulatory elements |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639952A (en) * | 1989-01-05 | 1997-06-17 | Mycogen Plant Science, Inc. | Dark and light regulated chlorophyll A/B binding protein promoter-regulatory system |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0154204B1 (en) | 1984-03-06 | 1994-01-12 | Mgi Pharma, Inc. | Herbicide resistance in plants |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US5004863B2 (en) | 1986-12-03 | 2000-10-17 | Agracetus | Genetic engineering of cotton plants and lines |
| US5416011A (en) | 1988-07-22 | 1995-05-16 | Monsanto Company | Method for soybean transformation and regeneration |
| DE69033816T2 (de) * | 1989-02-24 | 2002-08-08 | Monsanto Technology Llc., St. Louis | Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung |
| US5571697A (en) * | 1989-05-05 | 1996-11-05 | Baylor College Of Medicine Texas Medical Center | Expression of processed recombinant lactoferrin and lactoferrin polypeptide fragments from a fusion product in Aspergillus |
| US6127532A (en) * | 1989-09-12 | 2000-10-03 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Lectin cDNA and transgenic plants derived therefrom |
| GB8922007D0 (en) * | 1989-09-29 | 1989-11-15 | Cambridge Advanced Tech | Light-activatable plant promoter |
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| US5518908A (en) | 1991-09-23 | 1996-05-21 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| US5593874A (en) | 1992-03-19 | 1997-01-14 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants |
| CA2147122A1 (en) * | 1992-11-12 | 1994-05-26 | Willem Frans Broekaert | Biocidal chitin binding proteins |
| US6686200B1 (en) * | 1993-08-31 | 2004-02-03 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for the large scale production of recombinant adeno-associated virus |
| US5362865A (en) | 1993-09-02 | 1994-11-08 | Monsanto Company | Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences |
| FR2712302B1 (fr) * | 1993-11-10 | 1996-01-05 | Rhone Poulenc Agrochimie | Eléments promoteurs de gènes chimères de tubuline alpha. |
| US5659123A (en) | 1994-08-26 | 1997-08-19 | Plant Genetic Systems, N.V. | Diabrotica toxins |
| US5631152A (en) | 1994-10-26 | 1997-05-20 | Monsanto Company | Rapid and efficient regeneration of transgenic plants |
| US6166302A (en) * | 1995-10-13 | 2000-12-26 | Dow Agrosciences Llc | Modified Bacillus thuringiensis gene for lepidopteran control in plants |
| ZA974176B (en) | 1996-05-16 | 1998-09-01 | Univ North Texas | A rapid in-vitro regeneration scheme of cotton (gossypium hirsutum l.) plants compatible with agrobacterium-mediated transformation |
| US5942664A (en) * | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6023013A (en) | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| EP1801220B1 (en) | 1997-12-18 | 2012-02-08 | Monsanto Technology, LLC | Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against insects |
| US6063597A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6077824A (en) | 1997-12-18 | 2000-06-20 | Ecogen, Inc. | Methods for improving the activity of δ-endotoxins against insect pests |
| US6060594A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-09 | Ecogen, Inc. | Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins |
| US9715098B2 (en) | 2012-05-31 | 2017-07-25 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Sparse deconvolution spatial light microscopy in two and three dimensions |
-
1999
- 1999-08-18 EP EP09156877.4A patent/EP2080805B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 DE DE69943375T patent/DE69943375D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 PL PL99346650A patent/PL346650A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 AU AU55783/99A patent/AU767146B2/en not_active Expired
- 1999-08-18 WO PCT/US1999/018866 patent/WO2000011178A2/en active Application Filing
- 1999-08-18 ES ES99942392T patent/ES2365204T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 CZ CZ20010597A patent/CZ302074B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 EP EP99942392A patent/EP1104481B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 CZ CZ20090604A patent/CZ301915B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 EP EP14181325.3A patent/EP2811024B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 WO PCT/US1999/019102 patent/WO2000011200A2/en active Application Filing
- 1999-08-18 CA CA2340286A patent/CA2340286C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-18 AU AU55716/99A patent/AU5571699A/en not_active Abandoned
- 1999-08-18 AT AT99942392T patent/ATE506441T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-18 BR BRPI9913690A patent/BRPI9913690B1/pt active IP Right Grant
- 1999-08-19 PT PT06113589T patent/PT1698699E/pt unknown
- 1999-08-19 CA CA2340324A patent/CA2340324C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-19 AU AU55719/99A patent/AU5571999A/en not_active Abandoned
- 1999-08-19 WO PCT/US1999/018883 patent/WO2000011185A2/en active IP Right Grant
- 1999-08-19 DK DK06113589.3T patent/DK1698699T3/da active
- 1999-08-19 YU YU13501A patent/YU13501A/sh unknown
- 1999-08-19 EP EP99942313A patent/EP1121440B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 PT PT99942313T patent/PT1121440E/pt unknown
- 1999-08-19 AT AT99942313T patent/ATE377080T1/de active
- 1999-08-19 DE DE69937459T patent/DE69937459T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 AR ARP990104171A patent/AR021465A1/es not_active Application Discontinuation
- 1999-08-19 AT AT06113589T patent/ATE459717T1/de active
- 1999-08-19 DE DE69942109T patent/DE69942109D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 ME MEP-199/08A patent/MEP19908A/xx unknown
- 1999-08-19 CN CNB99812169XA patent/CN100390284C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-19 DK DK99942313T patent/DK1121440T3/da active
- 1999-08-19 ES ES06113589T patent/ES2340057T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 ES ES99942313T patent/ES2294857T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 EP EP06113589A patent/EP1698699B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-19 ME MEP-2008-199A patent/ME00085B/me unknown
- 1999-08-19 BR BRPI9913089A patent/BRPI9913089B1/pt active IP Right Grant
-
2001
- 2001-01-31 ZA ZA200100874A patent/ZA200100874B/en unknown
-
2010
- 2010-01-21 AR ARP100100133A patent/AR075146A2/es active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639952A (en) * | 1989-01-05 | 1997-06-17 | Mycogen Plant Science, Inc. | Dark and light regulated chlorophyll A/B binding protein promoter-regulatory system |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Lampa G.K. et al.: "Structure and developmental regulation of a wheat gene encoding the major chlorophyll a/b-binding polypeptide", Mol. Cell Biol. , Vol. 5(6), 1370û1378, 1985 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ302074B6 (cs) | Rostlinné expresní vektory, transformované rostlinné bunky a zpusob pro zlepšení genové exprese v rostlinách | |
| US20020192813A1 (en) | Plant expression vectors | |
| JP2011101653A (ja) | 植物において導入遺伝子を発現するための方法および組成物 | |
| US6787687B1 (en) | Rin gene compositions and methods for use thereof | |
| US7692064B2 (en) | Nitrogen transport metabolism | |
| JPH11514222A (ja) | 植物グルタチオンｓ−トランスフェラーゼプロモーター | |
| EP1104480A1 (en) | Polynucleotide sequences | |
| AU2007306345B2 (en) | Method for increasing pathogen resistance in transgenic plants | |
| US6441273B1 (en) | Constitutive and inducible promoters from coffee plants | |
| US8692069B2 (en) | Environmental stress-inducible 557 promoter isolated from rice and uses thereof | |
| US6762347B1 (en) | NOR gene compositions and methods for use thereof | |
| JP2001524315A (ja) | サイレント導入遺伝子の活性化のために有用な方法及び組成物 | |
| WO2001014561A1 (en) | Nor gene compositions and methods for use thereof | |
| US7557264B2 (en) | Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use | |
| US20070169217A1 (en) | Geranylgeranyl pyrophosphate synthases | |
| US20030163837A1 (en) | Constitutive and inducible promoters from coffee plants | |
| US20030018995A1 (en) | Plants with a modified flower and seed development | |
| MXPA01001796A (en) | Plant expression vectors | |
| Zhao | Structure and regulation of 4-coumarate: CoA ligase genes in rice (Oryza sativa) | |
| Gaitan | Cloning and evaluation of gene promoters in Coffea spp | |
| BRPI9917755B1 (pt) | Recombinant dna molecule, a transgenic micro-organism and method for providing expression of gene increased in plants |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20190818 |