BRPI9913089B1 - sequencia de polinucleotídeos recombinante para expressão aumentada da proteína inseticida cry3b em plantas, bem como processo para controle da infestação de insetos coleópteros - Google Patents

Abstract

patente de invenção: <b>''expressão aumentada da proteína inseticida cry3b em plantas''<d>. a presente invenção refere-se a processos e composições que compreendem um grupo de novos cassetes de expressão que fornece níveis significativamente aumentados do acúmulo das seqüências de aminoácidos de cry3b e de variante de cry3b inibidoras de coleópteros quando estas são expressas em plantas. as modalidades preferidas da invenção fornecem níveis pelo menos até dez vezes maiores de proteína controladora de inseto em relação aos níveis mais altos obtidos utilizando as composições anteriores. em particular, o milho transgênico expressando níveis maiores de uma proteína projetada para exibir toxicidade aumentada para pragas de coleópteros espalha níveis superiores de proteção contra os insetos e menos provavelmente são responsáveis pelo desenvolvimento de populações de insetos alvo que são resistentes à proteína ativa como inseticida.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SEQUENCIA DE POLINUCLEOTÍDEOS RECOMBINANTE PARA EXPRESSÃO AUMENTADA DA PROTEÍNA INSETICIDA CRY3B EM PLANTAS, BEM COMO PROCESSO PARA CONTROLE DA INFESTAÇÃO DE INSETOS COLEÓPTEROS 1.0 Fundamento da Invenção 1.1 Campo da Invenção A presente invenção refere-se a plantas transgênicas que expressam níveis substancialmente maiores da δ-endotoxina de Bacillus thuringiensis controladora de insetos. São descritos processos para a obtenção de tais plantas e composições e processos para utilização de tais plantas e composições, São também divulgados cassetes de polinucleotídeos que contêm sequências codificadoras da proteína preferida que conferem os níveis substancialmente maiores de õ-endotoxínas controladoras de inseto. As modalidades preferidas da invenção fornecem surpreendentemente níveis até dez vezes maior de proteína controladora de inseto em relação aos níveis mais altos obtidos utilizando composições anteriores. Em particular, o milho transgênico que expressa níveis maiores de uma proteína designada para exibir toxicidade aumentada em relação às pragas Coleópteras fornece níveis superiores de proteção contra insetos e menos provavelmente será responsável pelo desenvolvimento de populações de insetos alvo que são resistentes à proteína ativa como inseticida. 1.2 Descrição da Técnica Relacionada Quase todas as safras de campo, plantas e áreas de cultivo comercial estão suscetíveis ao ataque de uma ou mais pragas de inseto. São particular mente problemáticas as pragas Coleópteras e Lepidópteras. Devido ao fato de que as safras de interesse comercial são frequentemente o alvo do ataque de inseto, são desejáveis processos sensíveis ao ambiente para controlar ou erradicar a infestação por inseto. Isto é particularmente verdade para fazendeiros, encarregados de recém-nascidos, cultivadores e para áreas comerciais e residenciais que buscam o controle das populações de insetos utilizando composições ecologicamente amigáveis, As formulações inseticidas sensíveis ao ambiente utilizadas ampla mente desenvolvidas nos últimos anos eram compostas de pesticidas de proteínas microbianas derivadas da bactéria Bacillus thuringiensis, uma bactéria Gram-positiva que produz proteínas em cristais ou corpos de inclusão que são especificamente tóxicos para certas ordens e espécies de insetos. Foram identificadas muitas cepas diferentes de B. thuringiensis que produzem uma ou mais proteínas em cristal assim como outras proteínas inseticidas não formadoras de cristal. As composições incluindo cepas de B. thuringiensis que produzem proteínas inseticidas têm estado disponíveis comercialmente e são utilizadas como inseticidas aceitáveis pelo ambiente pelo fato de serem bastante tóxicas às pragas específicas de inseto alvo, mas são inofensivas às plantas ou aos animais vertebrados ou invertebrados. De forma mais importante, devido ao fato de que estas proteínas controladoras de inseto precisam ser ingeridas por pragas de insetos alvo suscetíveis a fim de exercer seus efeitos inseticidas ou tóxicos, a aplicação criteriosa de tais composições de proteína limita ou previne os membros de insetos que não são alvos da ordem suscetível quem podem também ser suscetíveis à composição da exposição significante às proteínas (por exemplo, espécies de Lepidóptera não alvo onde é utilizada a proteína em cristal de B.t. específica a Lepidóptera em uma formulação de inseticida). Adicionalmente, foi mostrado que insetos de várias ordens não possuem totalmente suscetibilidade a proteínas inseticidas especificamente direcionadas mesmo quando ingeridas em grandes quantidades. 1.2.1 5-Endotoxinas As δ-endotoxinas são utilizadas para controlar uma ampla faixa de lagartas e besouros que comem plantas, assim como mosquitos. Estas proteínas, também referidas como proteínas em cristal inseticidas, proteínas em cristal e toxinas Bt, representam um grande conjunto de proteínas inseticidas produzido por B. thuringiensis que são tóxicas após a ingestão por um hospedeiro inseto suscetível. A pesquisa durante última década sobre a estrutura e a função de toxinas de B. thuringiensis cobriu todas as categorias principais de toxina e embora estas toxinas se diferenciem na estrutura e na função específicas, são assumidas similaridade gerais na estrutura e na função. Uma revisão recente descreve a genética, a bioquímica e a biologia molecular das toxinas Bt (Schnepf e outros, Bacillus thuringiensis and its Pesticidal Crystal Proteins, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62. 775-806, 1998). Com base no conhecimento acumulado sobre as toxinas de B. thuringiensis, foi criado um modo generalizado de ação para as toxinas de B. thuringiensis e inclui: ingestão pelo inseto, solubilização no intestino médio do inseto (uma combinação de estômago e intestino delgado), resistência às enzimas digestivas algumas vezes com digestão parcial por proteases específicas do intestino que catalisam específicamente uma divagem em um sítio peptídico em uma estrutura de pró-toxina que "ativa" a toxina, ligação da toxina à borda em escova das células do intestino médio, formação de um poro na célula do intestino médio do inseto e interrupção da homeostase celular (English e Slatin, 1992). 1.2.2 Genes que Codificam as Proteínas em Cristal Muitas das δ-endotoxinas estão relacionadas a vários graus de similaridade em suas seqüências de aminoácido. Historicamente, as proteínas e os genes que as codificam eram classificados com base principalmente em seu espectro de atividade inseticida. Uma revisão feita por Hõfte e Whiteley (1989) discute os genes e as proteínas que foram identificados em B. thuringiensis antes de 1990 e apresenta a nomenclatura e o esquema de classificação que tem sido tradicionalmente aplicado aos genes e proteínas B. thuringiensis. A nomenclatura original tirava vantagem da descoberta de que poucas proteínas Bt Cry conhecidas na época geralmente se encaixavam em um número limitado de classes, em que cada classe representava proteínas que possuíam especificidade por ordens de insetos específicas. Por exemplo, os genes c/y1 codificava as proteínas Cry1 tóxicas para Lepídópteras. Os genes cry2 codificavam proteínas Cry2 que eram geralmente tóxicas tanto para Lepídópteras assim como para Dípteros. Os genes cry3 codificavam proteínas Cry3 tóxicas a Coleópteras, enquanto que os genes cryA codificavam as proteínas Cry4 tóxicas específicas a Dípteros. A nomenclatura, durante a última década ou mais, se tornou bastante confusa com a descoberta de classes mais dístantemente relacionadas de proteínas Bt, Mais recentemente, uma nomenclatura homogênea simplificada e base para classificações de proteínas Bt foram adotadas e foram revisadas por Schnepf e outros (1998). Schnepf e outros (1998) também fornecem uma solução estrutural para um cristal Cry1. Esta nomenclatura simplificada será adotada aqui. A convenção para identificar genes Bt com letras em itálico em caixa baixa (por exemplo crylAbl) e para identificar as proteínas Bt com o primeiro caracter em caixa alta (por exemplo CrylAbl) será também observada aqui.

Com base no grau de similaridade de seqüência, as proteínas foram adicionalmente classificadas em subfamílias. As proteínas que pareciam ser mais intimamente relacionadas dentro de cada família receberam letras de divisão tais como Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc. Mesmo as proteínas mais intimamente relacionadas dentro de cada divisão receberam nomes tais como CrylCa, CrylCb, etc e mesmo ainda proteínas mais intimamente relacionadas dentro de cada divisão eram indicadas com nomes tais como Cry1Bb1, Cry1Bb2, etc. A nomenclatura moderna classifica sistematicamente as proteínas Cry com base na homologia da seqüência de aminoácidos ao invés de em relação às especificidades do inseto alvo. O esquema de classificação para muitas toxinas conhecidas, não incluindo variações alélicas em proteínas individuais, está resumido em tabelas atualizadas regularmente que podem ser obtidas com Dr, Neil Crickmoreem http://epunix.biols.susx,ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html. 1.2.3 Composições Polipeptídicas Biolnseticidas A utilidade de proteínas bacterianas em cristal como inseticidas foi estendida além das larvas de Lepidópteras e Dípteros quando foi relatado o primeiro isolamento de uma cepa de B. thuringiensis tóxica a Coleópte-ros (Krieg e outros, 1982; 1984). Esta cepa (descrita na Patente U.S. N° 4.766.203, incorporada especificamente aqui como referência) denominada B. thuringiensis var. tenebrionis, foi relatada como sendo tóxica às larvas dos insetos Coleópteros Angelastica alni (besouro azul da folha do amieiro) e Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado). A Patente U.S. N° 5.024.837 também descreve cepas híbridas de B. thuringiensis var, kurstaki que demonstraram atividade contra insetos Lepidópteros. A Patente U.S. N° 4.797.279 (correspondente a EP 0221024) divulga um B. thuringiensis híbrido contendo um plasmidêo proveniente de B. thuringiensis var. kurstaki que codifica um gene que codifica a proteína em cristal tóxica a Lepidóptera e um plasmídeo proveniente de B. thuringiensis tenebríonis que codifica um gene que codifica a proteína em cristal tóxica a Coleópteros. A cepa de B. thuringiensis híbrida produz proteínas em cristal características das feitas tanto por B. thuringiensis kurstaki quanto por B. thuringiensis tenebríonis. A Patente U.S. N° 4.910.016 (correspondente a EP 0303379) divulga um isolado de B. thuringiensis identificado como B. thuringiensis MT 104 que possui atividade inseticida contra Coleópteros e Lepidóptera. Mais recentemente, Osman e outros divulgaram um isolado natural de Bacilius thuringiensis que apresentava atividade contra pelo menos duas ordens de insetos e contra nematódeos (WO 98/30700).

Era sabido durante mais de duas décadas que as composições que compreendem proteínas inseticidas Bt são eficientes em fornecer proteção contra a infestação de insetos em plantas tratadas com tais composições. Mais recentemente, técnicas de genética molecular possibilitaram a expressão de proteínas inseticidas Bt de sequências de nucleotídeos inseridas de forma estável nos genomas de plantas (Perlak e outros, Brown & Santino, etc). Entretanto, a expressão de transgenes em plantas forneceu um caminho para a resistência aumentada do inseto a Bt's produzidas em plantas porque as plantas não demonstraram produzir altos níveis de proteínas inseticidas. Acreditava-se inicialmente que as diferenças morfológi-cas ou topológicas grosseiras na estrutura do gene e na arquitetura entre os sistemas de planta e de bactérias era a limitação que impedia a superex-pressão de transgenes Bt em plantas. Estas diferenças foram aparentemente vencidas como divulgado por Perlak e outros (Patente U.S. N° 5.500.365) e por Brown e outros (Patente U.S. Nos 5.424.412 e 5.689.052) em que foi mostrado que os transgenes que codificam a proteína inseticida Bt que continham os códons preferidos da planta aumentavam os níveis de expressão. Alternativamente, fazendo um entruncamento do domínio que codifica pró-toxina até o domínio mais curto que codifica o peptídeo ainda codificava uma proteína inseticida também considerada suficiente para ven- cer a limitação de níveis de expressão infinitamente baixos do transgene que codifica Bt na planta. Os níveis de expressão das proteínas Bt in planta partindo dos transgenes variaram amplamente independente dos meios utilizados para expressão e os níveis de proteína acumulados estavam na faixa de virtualmente indetectáveis até 2 partes por milhão até por volta de 20 a 30 partes por milhão. Entretanto, muito embora todas estas abordagens tenham fornecido níveis aumentados de acúmulo de proteína Bt em plantas, nenhuma forneceu níveis de expressão que pudesse garantir que a resistência do inseto não se tornasse um problema sem a necessidade de uma expressão coordenada de uma ou mais toxinas inseticidas adicionais pela planta transgênica ou alternativamente sem a aplicação tópica coordenada de Bt adicional de suplemento ou de composições químicas inseticidas. A importância do acúmulo de níveis mais altos de toxina Bt para a prevenção de resistência do inseto às toxinas Bt individuais foram intendidas durante algum tempo. Vários estudos de laboratório em que a seleção contra Bt foi aplicada durante várias gerações de insetos confirmaram que a resistência contra proteínas inseticidas Bt é raramente obtida. Deveria ser enfatizado que as condições de laboratório representam condições bastante baixas mas constantes de pressão de seleção, permitindo a sobrevivência de uma subpopulação de insetos que foi submetida à pressão do inseticida e que produz as gerações subseqüentes de insetos. As gerações sucessoras são também mantidas em meios contendo concentrações baixas porém constantes da proteína inseticida. Geralmente, as concentrações utilizadas para as pressões de seleção estão na faixa de LC40 até aproximadamente LC60 ou similar, entretanto, as concentrações LC95 devem ser também testadas para o desenvolvimento de resistência. Na maioria dos casos, a resistência é adquirida lentamente, geralmente se desenvolvendo em razoavelmente poucas gerações, por exemplo 10-50 gerações. Entretanto, tal resistência não é observada quando são utilizados níveis substancialmente maiores de toxina ou em situações em que são fornecidas várias toxinas.

Atualmente, as plantas recombinantes que expressam níveis comercialmente úteis de proteína inseticida Bt contêm geralmente somente um gene que codifica uma única classe de Bt. É antecipado que tais plantas possuem uma duração muito limitada de uso por dois motivos. Em primeiro lugar, estas plantas estão expressando níveis insuficientes de proteína inseticida para garantir que todos os insetos alvo expostos a ou alimentados dos tecidos da planta sucumbam por causa da dose ingerida de toxina. Em segundo lugar, devido aos níveis insuficientes de proteína inseticida, o potencial para desenvolvimento de resistência é aumentado sem motivo. Isto não significa dizer que o nível de toxina produzido por tais plantas transgê-nicas é insuficiente para ser eficaz. Isto simplesmente representa as limitações da expressão de δ-endotoxinas na planta mesmo quando se utiliza se-qüências que codificam δ-endotoxina Bt que foram modicadas para se adaptarem às sequências preferidas da planta, Uma limitação que pode ser observada para muitas seqüências que codificam δ-endotoxina Bt modificadas em plantas é que tem sido impossível prever qual δ-endotoxina Bt seria eficiente para expressão em plantas. (Por exemplo, a expressão de Cry2Aa em plantas de algodão resulta em fitotoxícidade quando direcionada ao clo-roplasto, entretanto a expressão de uma sequência intimamente relacionada cry2Ab não é fitotóxica quando direcionada ao cloroplasto. (Corbin e outros, Pedido de Patente U.S., N° de Série 09/186.002). Ainda assim, os níveis de proteína da δ-endotoxina em plantas não são suficientes para serem eficazes contra todas as espécies de inseto alvo desejadas conhecidas como sendo suscetíveis a um tipo e classe de δ-endotoxina fornecidos.

Como indicado acima, as abordagens alternativas para o desenvolvimento de resistência às proteínas inseticidas incluíam tentativas ineficazes para aumentar os níveis de expressão dos transgenes em plantas. Alternativamente, os genes inseticidas adicionais poderíam ser engenheira-dos em plantas de forma que várias toxinas são expressas coordenada-mente.. Isto iria fornecer um meio mais eficiente para retardar o surgimento da resistência a qualquer uma combinação de Bt's, entretanto, isto não iria ainda vencer a limitação de níveis insuficientes de proteína inseticida que se acumula nas planta(s) recombinante(s), Uma alternativa adicional para os níveis insuficientes de expressão foi engenheirar genes que codificam pro- teínas inseticidas Bt em cristal que demonstram propriedades inseticidas aumentadas, possuindo uma faixa mais ampla de hospedeira ou uma atividade biológica aumentada, que podería resultar de forma concebível na necessidade de menos proteína recombinante para controlar uma espécie de inseto alvo do que era necessário da forma nativa da proteína. A combinação de análises estruturais das toxinas de B. thuringí-ensis seguida por uma investigação da função de tais estruturas, motivos e similares ensinaram que as regiões específicas das endotoxinas de proteína de cristal são, de uma maneira geral, responsáveis por funções particulares.

Foi descoberto que o domínio 1, por exemplo, de Cry3Bb e CrylAc é responsável pela atividade de canal de íon, a etapa inicial na formação de um poro (Walters e outros, 1993; Von Tersch e outros, 1994). Foi descoberto que os domínios 2 e 3 são responsáveis pela ligação do receptor e pela especificidade do inseticida (Aronson e outros, 1995; Caramori e outros, 1991; Chen e outros, 1993; de Maagd e outros, 1996; Ge e outros, 1991; Lee e outros, 1992; Lee e outros, 1995; Lu e outros, 1994; Smedley e Ellar, 1996; Smith e Ellar, 1994; Rajamohan e outros, 1995; Rajamohan e outros, 1996; Wu e Dean, 1996). As regiões nos domínios 2 e 3 podem também compelir a atividade do canal de íon de algumas toxinas (Chen e outros, 1993, Wolfersberger e outros, 1996; Von Tersch e outros, 1994), Infelizmente, embora muitos investigadores tenham tentado, poucos tiveram sucesso na obtenção de proteínas em cristal mutadas com toxicidade inseticida aumentada. Em quase todos os exemplos de toxinas de B. thuringiensis engenheiradas geneticamente na literatura, a atividade biológica da proteína em cristal mutada não é melhor do que a da proteína do tipo selvagem e em muitos casos, a atividade é diminuída ou destruída totalmente (Almond e Dean, 1993; Aronson e outros, 1995; Chen e outros, 1993, Chen e outros, 1995; Ge e outros, 1991; Kwak e outros, 1995; Lu e outros, 1994; Rajamohan e outros, 1995; Rajamohan e outros, 1996; Smedley e Ellar, 1996; Smith e Ellar, 1994; Wolfersberger e outros, 1996; Wu e Aronson, 1992). Entretanto, Van Rie e outros realizaram recentemente o aumento de uma δ-endotoxina de Cry3A que possui atividade inseticida au- mentada para Coleópteros pela identificação de um mutante que possui atividade inseticida aumentada. Van de Rie e outros propõem um processo para identificação de mutações de aminoácidos que diminuem a atividade inseticida e alterando seletivamente aqueles resíduos por mutagênese sítio dirigida para incorporar um ou mais dos 20 aminoácidos naturalmente ocor-rentes naquelas posições e alimentando as várias formas da proteína alterada resultante a vermes de raiz de milho do oeste ou do norte para identificar as que possuem atividade aumentada (Patente U.S. N° 5.659.123). Embora nenhuma seqüência foi possível utilizando o processo, como mencionado anteriormente, Van Rie e outros tiveram sucesso na identificação de somente uma seqüência que possuía atividade aumentada e não demonstrava um aumento na expressão da forma mutante quando comparada com a seqüência nativa.

Para uma proteína em cristal que possui aproximadamente 650 aminoácidos na seqüência de sua toxina ativa e a possibilidade de 20 aminoácidos diferentes em cada posição nesta seqüência, a probabilidade de se criar arbitrariamente uma nova estrutura com sucesso é remota, mesmo se puder ser determinada uma função geral a um filamento de 250-300 aminoácidos. Na verdade, a técnica anterior acima em relação à mutagênese do gene da proteína em cristal se preocupou primariamente com o estudo da estrutura e da função das proteínas em cristal, utilizando mutagênese para perturbar alguma etapa no modo de ação, ao invés de com o engenhei-ramento de toxinas melhoradas.

Coletivamente, os sucessos limitados na técnica de desenvolver toxinas que não ocorrem naturalmente com atividade inseticida aumentada contiveram o progresso nesta área e frustraram a pesquisa de endotoxinas ou proteínas em cristal melhoradas. Ao invés de seguir as regras simples e previsíveis, a engenharia de uma proteína em cristal melhorada com sucesso pode envolver estratégias diferentes, dependendo da proteína em cristal a ser melhorada e das pragas de insetos que são alvo. Assim, o processo é altamente empírico.

Conseqüentemente, a tecnologia de DNA recombinante tradici- onal não é claramente a experimentação de rotina para o fornecimento de proteínas em cristal inseticidas melhoradas. O que faltou na técnica anterior são os processos racionais para produzir proteínas em cristal de B. thuringi-ensis engenheiradas geneticamente que aumentaram a atividade inseticida e, em particular, melhoraram a toxicidade em relação a uma ampla faixa pragas de insetos Lepídópteros, Coleópteros ou Dípteros. Os processos e composições que se referem a estas preocupações foram divulgados no Pedido de Patente U.S. N° 08/993.170 (18 de dezembro de 1997; English e outros) e em outros pedidos de patente U.S. relacionados (08/993.722, 18 de dezembro de 1997, English e outros; 08/993.755, 18 de dezembro de 1997, English e outros; e 08/996,441, 18 de dezembro de 1997, English e outros) e em Van Rie e outros (Patente U.S. N° 5.659.123, 1o de junho de 1999). Em adição, as δ-endotoxinas melhoradas de forma recombinante continuavam a ser expressas fracamente e/ou causavam efeitos fitotóxicos quando expressas em plantas, levando assim à recuperação de menor número de eventos transgênicos comercialmente úteis. 2.0 Sumário da Invenção Estão descritos aqui novas composições e processos para expressão em plantas transformadas de δ-endotoxinas de B. thuringiensis variação Cry3 que possuem atividade inibidora de Coleópteros significativa. Estas composições e processos resultam vantajosamente em plantas que expressam as δ-endotoxinas de B. thuringiensis Cry3 em níveis aumentados não observados anteriormente para as δ-endotoxinas Cry. Os níveis aumentados da expressão de δ-endotoxina Cry3 são refletidos na obtenção dos níveis máximos superiores de expressão em eventos de inserção trans-gênica individuais. Inesperadamente, as composições particulares divulgadas aqui resultam na recuperação de uma porcentagem aumentada de eventos transgênicos que manifestam níveis de expressão que excedem bastante os níveis de limiar de expressão necessários para o controle de insetos Coleópteros e que fornecem níveis de toxina suficientes capazes de suportar uma estratégia de controle da resistência, Uma vez que as 5-endotoxinas Cry3 são tipicamente menos potentes que outras δ-endotoxinas comumente utilizadas para controlar pragas alvo de Lepidópteros e Dípteros quando expressas em plantas transgênicas, a obtenção de níveis máximos superiores de expressão de δ-endotoxinas Cry3 e a recuperação de mais eventos transgênicos com níveis eficientes de expressão são ambas críticas no isolamento de eventos transgênicos que expressam δ-endotoxina Cry3 que exibe níveis úteis comercialmente de controle do inseto alvo.

Uma outra limitação da técnica anterior referida pela presente invenção é o desenvolvimento de resistência do inseto às δ-endotoxinas fornecidas pela expressão da planta. Específicamente, a presente invenção fornece uma estratégia superior para o retardo ou a eliminação do desenvolvimento de resistência às δ-endotoxinas cry3 através do acúmulo aumentado de δ-endotoxina dentro das células da planta de forma que os níveis da δ-endotoxina são mantidos in planta acima de um nível limiar de proteína, medido tipicamente em partes por milhão (ppm). Acredita-se que expressão aumentada das δ-endotoxinas, que também deveria ser considerada para significar expressão aumentada em vista do que foi observado anteriormente na técnica, resulta no surgimento atrasado de resistência do inseto e assim extende a utilidade das δ-endotoxinas expressas pela planta como agentes de controle de inseto.

Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece novas proteínas da δ-endotoxina de Cry3B isoladas e purificadas que exibem atividade inseticida particularmente eficiente direcionada para o controle de espécies de praga de inseto Coleóptero. Tais proteínas de δ-endotoxina da presente invenção são fornecidas pela expressão partindo de DNA purificado e melhorado ou intensificada ou de seqüências de nucleotídeos cada uma compreendendo uma seqüência codificadora de δ-endotoxina Cry3 colocada sob o controle de elementos de expressão gênica funcionais preferidos da planta tais como um promotor, uma seqüência líder não-traduzida, um íntron e uma terminação de transcrição e uma seqüência de poliadenila-ção. Alguns DNAs ou seqüências de polinucleotídeos podem também fornecer seqüências de proteína de alvo para plastídeos ou cloroplastos. As construções de DNA preferidas da presente invenção incluem as constru- ções que codificam as δ-endotoxinas Cry3 que exibem atividade inibidora de Coleópteros ou controladora de Coleópteros. Em uma modalidade ilustrativa, as seqüências de polinucleotídeos são montadas em um cassete de expressão para a introdução no DNA genômico da planta, em que o cassete de expressão compreende uma seqüência codificadora variante de δ-endotoxina Cry3Bb ligada de forma operacional a uma seqüência que compreende um promotor, uma seqüência líder não-traduzida, um íntron e uma seqüência de terminação da transcrição e de poliadenilação. Em particular, um transgene licalizado dentro de um cassete de expressão operacional de polinucleotídeos de planta ou de uma seqüência de polinucleotídeos que compreende um cassete de expressão que é composto de elementos genéticos que funcionam em células de planta para expressar uma proteína desejada partindo de uma seqüência codificadora de ácido nucléico (o transgene) que está localizado de forma operacional dentro do dito cassete de expressão. A seqüência codificadora está ligada a montante de pelo menos uma seqüência promotora, uma seqüência líder não-traduzida (UTL), uma seqüência de íntron e em quadro em certas modalidades indicadas para uma seqüência codificadora de um peptídeo direcionado ao plastídeo ou ao cloroplasto. A seqüência codificadora está também ligada a jusante de pelo menos uma seqüência funcional de terminação da transcrição e de poliadenilação. As seqüências de polinucleotídeos que compreendem tal cassete de expressão são mostradas aqui para aumentar a expressão da protefna desejada codificada de dentro do cassete, aumentar o número de eventos obtidos partindo do uso de seqüência de polinucleotídeos na transformação da planta, em que o dito número aumentados de eventos contém o transgene desejado localizado dentro do cassete de expressão e exibem níveis aumentados de expressão de uma ou mais proteínas desejadas. O número aumentado de eventos é também observado surpreendentemente para expressar a proteína desejada em níveis acima de 2 a 5 partes por milhão mas em geral abaixo de 200 a 500 partes por milhão de proteína celular total. Ainda mais surpreendente eram alguns eventos em particular que expressavam a proteína desejada em níveis bem acima de 500 ppm. As modalidades indicadas divulgam uma seqüência que codifica uma δ-endotoxina variação Cry3Bb que compreende a SEQ ID N°: 9 isolada e purificada, de Nco\ até EcoRI como apresentado na Figura 1 que ilustra o plasmídeo pMON25096. Ainda outras modalidades divulgam uma seqüência codificadora de δ-endotoxina Cry3Bb variante que compreende uma SEQ ID N°: 11 isolada e purificada, de A/col até EcoRI como apresentado na Figura 2 que ilustra o plasmídeo pMON33741. É considerado, entretanto, que qualquer δ-endotoxina Cry3 que exibe atividade substancial inibidora de Coleópteros ou controladora de Coleópteros superior ou equivalente à divulgada na presente invenção poderia ser utilizada de acordo com as modalidades da presente invenção, sendo preferidas aquelas proteínas Cry3 que possuem ho-mologias substanciais a Cry3Bb.

Em uma modalidade preferida, a invenção fornece plantas transgênicas que foram transformadas com uma construção de DNA ou com um cassete de expressão da presente invenção que é expresso e traduzido em níveis inesperadamente altos pela planta que resulta em níveis surpreendentemente altos de acúmulo de δ-endotoxina. As plantas monocotiledô-neas podem ser transformadas de acordo com os processos e com as construçãoes de DNA divulgadas aqui. Entretanto, é também antecipado que as plantas dicotiledôneas poderíam ser também transformadas com se-qüências de DNA divulgadas aqui por um versado na técnica a fim de se obter plantas transgênicas que fornecem níveis inesperadamente úteis de resistência do inseto sem o risco de desenvolver resistência do inseto à δ-endotoxina. A planta transformada pela presente invenção pode ser preparada, em uma modalidade adicionalmente preferida, por um processo que inclui a obtenção da construção de DNA isolada e purificada dentro do cassete de expressão e então a transformação da planta com a construção de forma que a planta expressem a proteína para a qual a construção codifica. Alternativamente, pode ser preparada a planta transformada pela presente invenção, em uma modalidade adicionalmente preferida, por um processo que inclui a introdução da construção de DNA isolada e purificada em uma cepa de Agrobacterium competente para a transformação e então transfor- mando a planta com a cepa de Agrobacterium contendo' a construção de forma que a planta expressa as proteínas para as quais a construção codifica. Foi observado aqui que a transformação de plantas pelas composições e processos divulgados resulta em frequências aumentadas de transfor-mantes que exibem a expressão do transgene assim como na recuperação de eventos transgênicos individuais que exibem inesperadamente níveis absolutos superiores de expressão do transgene. É considerado que os níveis de expressão aumentada na invenção divulgada permitirão o desenvolvimento reduzido de resistência de inseto às δ-endotoxinas Bt apresentada para as pragas de inseto alvo. Isto pode ser alcançado pela transformação de uma planta com a construção de DNA preferida para atingir altas taxas de expressão de Cry3 sozinho ou pela exposição simultânea dos insetos alvo às δ-endotoxinas Cry3 divulgadas junto com outras composições eficientes no controle de espécies de Coleópteros tais como de Cry3B (English e outros, WO 99/31248), variante Cry3A ou variante Cry3D (Patente U.S. N° 5.659.123), CryET33 e CryET34 (Donavan e outros, WO 97/17600), CryET70 (Pedido de Patente U.S. Série N° 09/184,748; Mettus e outros, 2 de novembro de 1998), Cry6A, Cry6B, Cry8B (Patente U.S. N° 5.277.905), CryET29 (Rupar e outros, WO 97/21587), hidrolases de acil lipídeo inseticidas, combinações de oxidases de aminoácidos e sintases de tedana lactama (Romano e outros, Pedido de Patente U.S. N° de Série 09/063.733, depositado em 21 de abril de 1998) ou proteínas inseticidas tais como VIP1 (Gay, WO 97/26339; Gourlet e outros, WO 98/02453) e VIP3 (Estruch e outros, Patente U.S. N° 5.877.012; 1999) dentre outras. Os insetos alvo suscetíveis incluem Diabroticus spp. larva de elanterídeo em Zea mays e Leotinotarsa decemlineata (Say) em Soianum tuberosum e gorgulho bola em espécies de Gossypíum (algodão). É portanto considerado que as composições e os processos divulgados pela presente invenção irão fornecer muitas vantagens sobre a técnica anterior incluindo as citadas especificamente acima. Outras vantagens incluem controle melhorado de pragas de inseto alvo suscetíveis e alcançando proteção longa na estação dos patógenos insetos. Uma vantagem adicional da presente invenção fornece a redução do número de eventos transgênicos que precisam ser selecionados para identificar um que contenha níveis benéficos de uma ou mais composições que controlam os insetos. A presente invenção também abrange células transformadas com as construções de DNA divulgadas aqui. Ainda, os vetores de transformação tais como plasmídeos, bacmídeos, cromossomos artificiais, vetores virais são considerados elementos para uso na distribuição das composições de nucleotídeos da presente invenção em células consideradas a fim de se obter células hospedeiras transformadas, tanto procaríóticas quanto eucari-óticas, que expressam as proteínas de δ-endotoxina codificadas pelas novas construções de DNA divulgadas aqui. É ainda considerado que em alguns exemplos o genoma de uma planta transgênica da presente invenção possa ter aumentado através de uma integração estável de um cassete de expressão que codifica uma δ-endotoxina de B. thuringiensis inibidora ou controladora de Coleópteros ou variações da mesma como descrito aqui. Além disso, mais de um transgene que codifica uma composição inseticida será incorporado no genoma nuclear ou alternativamente, no genoma do cloro-plasto ou do plastídeo da célula da planta hospedeira transformada. Imagina-se que mais de um polinucleotídeo que codifica uma proteína em cristal inseticida será incorporado no genoma de uma célula vegetal e pode ser desejável possuir duas ou ainda mais seqüências que codificam as proteínas inseticidas ou outras benéficas da planta dentro das seqüências de nucleotídeos contidas dentro da célula. Tais proteínas derivadas de forma re-combinante podem existir na forma de precursores, pró-toxinas ou como fusões de proteínas benéficas ligadas por seqüências ligantes flexíveis de aminoácidos ou por seqüências de divagem específica por protease bem conhecidas na técnica. São também consideradas quimeras compreendendo fusões de proteínas inseticidas. A prole de células hospedeiras transgê-nicas pode ser manipulada artificialmente para produzir plantas recombi-nantes inteiras exibindo propriedades inseticidas aumentadas e as seqüências de nucleotídeos recombinantes são mostradas aqui como sendo herdá-veis. A herdabilidade dos elementos em um aspecto preferido desta inven- ção, assim como os elementos de expressão são capazes de ser distribuídos para descendentes lineares da célula da planta hospedeira transformada original, dando origem primeiro a uma planta transformada de forma estável cujas células constituintes expressam o transgene desejado, embora a expressão específica do tecido possa ser manipulada seletivamente geralmente através da escolha do promotor operacional da planta selecionado para uso em um dado cassete de expressão, como descrito anteriormente. As plantas transformadas dão origem a sementes contendo o cassete de expressão herdável e assim as sementes dão origem a plantas de forma linear que contêm o cassete de expressão, geralmente de forma Mendelia-na, partícularmente quando cultivadas de acordo com os processos bem conhecidos na técnica, 3.0 Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 ilustra o plasmídeo pMON25096. A Figura 2 ilustra o plasmídeo pMON33741. A Figura 3 ilustra o plasmídeo pMON25097. A Figura 4 ilustra o plasmídeo pMON33748. A Figura 5 ilustra o nucleotídeo e a tradução da seqüência de aminoácidos de uma proteína inseticida variante Cry3Bb.11098 como mostrado na SEQ ID N°: 9. A Figura 6 ilustra o nucleotídeo e a tradução da seqüência de aminoácidos de uma proteína inseticida variante Cry3Bb. 11231 como mostrado na SEQ ID N°: 11. 4.0 Descrição Detalhada da Invenção A descrição detalhada a seguir da invenção é fornecida para auxiliar os versados na técnica a praticarem a presente invenção. Ainda assim, a descrição detalhada a seguir não deve ser construída para limitar indevidamente a presente invenção uma vez que podem ser feitas modificações e variações nas modalidades discutidas aqui pelos peritos comuns na técnica sem sair do espírito e do âmbito da presente invenção. 4.1 Definições ' As palavras e frases a seguir possuem os significados apre- sentados abaixo.

Equivalentes funcionais biológicos. Como utilizado aqui tais equivalentes em relação às proteínas inseticidas da presente invenção são peptídeos, polipeptídios e proteínas que contêm uma seqüência ou grupamento exibindo similaridade de seqüência com os novos peptídeos da presente invenção, tal como Cry3Bb. 11231 e que exibem as mesmas propriedades funcionais ou similares que as dos polipeptídios divulgados aqui, incluindo a atividade inseticida. Os equivalentes biológicos incluem peptídeos, polipeptídios e proteínas que reagem com, isto é se ligam especificamente aos anticorpos produzidos contra Cry3Bb e que exibem a mesma atividade inseticida ou similar, incluindo tanto anticorpos monoclonais quanto políclo-nais.

Combate ou Controle do Dano Causado pelo Inseto em um contexto agrícola refere-se à redução de danos em unidades relativas a uma parte da colheita ou da planta causados pela infestação de pragas de inseto. Mais geralmente, esta frase refere-se à redução nos efeitos adversos causados pela presença de um inseto indesejado em qualquer localização particular.

Evento refere-se a uma planta transgênica derivada de um dos seguintes: 1. da inserção de DNA estranho em um ou mais sítios únicos no DNA genômico nuclear; 2. da inserção de DNA estranho em um ou mais sítios únicos no genoma do plastídeo, do cloroplasto ou mitocondrial; 3. da introdução de um vetor estável, herdável, epigenético no citoplasma de um plastídeo, cloroplasto ou mitocôndria; ou 4. de uma combinação de qualquer um dos processos anteriores.

Os eventos derivados destes processos contêm um cassete de expressão que expressa uma seqüência codificadora desejada como descrito aqui. Refere-se também aos eventos como ITEs (eventos independentes de transformação).

Expressão: A combinação de processos intracelulares, incluindo a transcrição, tradução e outra proteína intracelular e processamento de RNA e funções de estabilização, sofridas por uma seqüência codificadora de ácido nucléico controlada por seqüèncias genéticas que funcionam em células vegetais para atingir a produção de um produto desejado, tal como um gene estrutural que codifica uma molécula de RNA ou uma molécula de RNA que está sendo utilizada como um substrato para uma enzima transcriptase reversa ou complexo enzimático.

Cassete de expressão melhorada ou aumentada refere-se à combinação específica e ordem de elementos genéticos associados com a proteína inseticida que codifica a seqüência que, quando expressa dentro de uma célula vegetal: dá origem ao nível médio surpreendente da proteína expressa nas plantas, no tecido vegetal ou nas células vegetais; dá origem ao número inexperado de eventos de transformação expressando um nível médio surpreendentemente superior de proteína inseticida; dá origem a plantas individuais, tecido vegetal ou células vegetais que expressam um nível inesperadamente alto da proteína inseticida; e dá origem a plantas que expressam níveis inesperados de proteína inseticida eficiente para o controle ou combate de pragas Coleópteras e previnindo o desenvolvimento de resistência pelas pragas Coleópteras à proteína inseticida particular.

Polipeptídio inseticida refere-se a um polipeptídio que possui propriedades inseticidas, por exemplo, um polipeptídio que exibe as propriedades de inibição do crescimento, desenvolvimento, viabilidade ou fe-cundidade das pragas de inseto alvo.

Ligado de Forma Operacional: Sequências de ácidos nucléi-cos ou polinucleotídeos conectadas seqüencialmente de forma linear, de maneira que as propriedades de uma influencie nas características de expressão da outra. Um promotor, por exemplo, ligado de forma operacional a outras sequências de polinucleotídeos (que podem consistir de seqüèncias operadoras ou melhoradoras, seqüências líder não-traduzidas ou traduzidas, seqüências de íntrons, seqüências codificadoras de gene estrutural, genes não-estruturais, seqüências de término de transcrição e de tradução e seqüências de poliadenilação) influencia na expressão de uma seqüência codificadora ou não-codificadora, seja o produto RNA, proteína ou outro produto. Similarmente, uma seqüência de íntron ou líder não-traduzida pode influenciar na expressão e na estabilidade de seqüências ligadas de forma operacional a estas e seqüências de genes estruturais e não-estruturais podem ser influenciadas por elementos ligados de forma operacional a montante, entre ou a jusante.

Regiões Codificadoras Que Podem Ser Expressas na Planta: Regiões codificadoras de aminoácidos ou quadros abertos de leitura (ORFs) que podem ser expressos in planta porque contêm elementos regu-latórios típicos de planta que facilita a sua expressão e freqüentemente incluem modificações na seqüência codificadora de forma que são utilizados os códons preferidos de planta no lugar de códons não preferidos onde são consideradas as regiões codificadoras heterólogas.

Peptídeo de Trânsito no Plastídeo: Qualquer seqüência de aminoácidos úteis no direcionamento de um aminoácido ligado, tal como uma proteína de fusão, para um compartimento subcelular ou organela tal como plastídeo ou cloroplasto.

Seqüência de Polinucleotídeos: Qualquer seqüência de DNA ou de RNA de quatro ou mais nucleotídeos ou ribonucleotídeos consecutivos. Geralmente as seqüências de polinucleotídeos como divulgadas aqui compreendem pelo menos 50 ou mais nucleotídeos ou ribonucleotídeos.

Progênie: "Progênie" inclui qualquer prole ou descendente da planta transgênica ou qualquer planta subseqüente que contém o(s) trans-gene(s) na forma operacional. A progênie não está limitada a uma geração, mas abrange preferivelmente os descendentes dos transformantes contanto que contenham ou expressem o(s) transgene(s). As sementes que contêm os embriões transgênicos assim como as sementes das plantas transgêni-cas e sua prole ou descendentes que, após a segregação Mendeliana con- tinuam contendo o(s) transgene(s), são também partes importantes da invenção.

Promotor: Um sítio de reconhecimento sobre uma seqüência de DNA ou um grupo de seqüências de DNA que fornece um elemento de controle da expressão para uma seqüência de polinucleotídeos preferida e ao qual a RNA polimerase se liga especificamente e inicia a síntese do RNA (transcrição) da seqüência preferida.

Ro é a planta regenerante primária derivada da transformação do tecido vegetal ou de células em cultura. A progênie subseqüente ou as gerações derivadas da R0 é referida como Ri (primeira geração), R2 (segunda geração), etc.

Regeneração: O processo de crescimento de uma planta partindo de uma célula vegetal ou de células vegetais (por exemplo, protoplasto da planta, embrião, calo ou explante).

Seqüência Codificadora Estruturai refere-se a uma seqüência de DNA que codifica um peptídeo, polipeptídio ou proteína que é feita por uma célula após a transcrição da seqüência codificadora estrutural em RNA mensageiro (mRNA), seguida pela tradução do mRNA no produto peptídico, polipeptídico ou protéico.

Gene estrutural: Um gene ou uma seqüência de polinucleotídeos que contém a seqüência codificadora de um polipeptídio desejado que é expresso pela transcrição e tradução para produzir o polipeptídio desejado.

Gene sintético: Os genes sintéticos que codificam as δ-endotoxínas de B. thuringiensis da presente invenção são aqueles preparados de uma maneira que envolve qualquer tipo de isolamento ou manipulação genética que altera a seqüência codificadora que ocorre naturalmente do gene da δ-endotoxina. Isto inclui o isolamento do gene de seu estado naturalmente ocorrente, a manipulação do gene como por modificação do códon (como descrito aqui) ou a mutagênese sítio-dirigida (como descrito aqui), o entruncamento do gene ou qualquer outro método de manipulação ou de isolamento. Um gene sintético pode também ser uma seqüência de polinucleotídeos que não se sabe que é naturalmente ocorrente mas que codifica um polipeptídio útil ou outro produto tal como um tRNA ou um poli-nucleotídeo antisenso. Uma seqüência de polinucleotídeos que não ocorre naturalmente.

Homologia substancial: Uma vez que este termo é utilizado aqui, refere-se ao ácido nucléico ou às seqüências de polipeptídios que são aproximadamente 86% homólogos, até aproximadamente 90% homólogos, até aproximadamente 95% homólogos, até aproximadamente 99% homólogos. Mais especificamente, os inventores imaginam homólogos substanciais como sendo aproximadamente 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 e 99 por cento homólogos à seqüência de ácido nucléico do polipeptídio referente, Terminador: Em relação aos processos de expressão gênica nuclear de eucariotos, a terminação da transcrição na extremidade 3' operacional e a seqüência de poliadenilação. Em relação à expressão gênica em procariotos e incluindo a expressão gênica de plastídeos e cloroplastos, a seqüência de DNA na extremidade 3' de um quadro aberto de leitura que, para o produto de proteína de expressão da ORF, pelo menos um códon de terminação no quadro com a seqüência codificadora da ORF, que pode também ser seguida por uma seqüência de DNA que codifica um sinal de terminação da transcrição que pode fazer como que o produto de RNA traduzido ou o mRNA forme uma estrutura em forma de grampo de cabelo ou outra estrutura tridimensional que pode ou pode não atuar junto com uma ou mais proteínas estruturais solúveis para fazer com que a transcrição seja interrompida.

Transformação: Um processo para introdução de uma seqüèn-cia de polinucleotídeo exógena (por exemplo, um vetor ou uma molécula de DNA ou RNA recombinante ou não recombinante) em uma célula ou proto-plasto em que o polinucleotídeo exógeno é incorporado em um elemento genético herdável ou é capaz de se replicar autonomamente e assim é mantido de forma estável dentro da célula ou do protoplasto assim como na progênie da célula ou protoplasto. Célula transformada: Uma célula que contém urh elemento genético herdável alterado pela introdução de uma ou mais moléculas de DNA exógeno. Uma célula transgênica. Os exemplos de células transformadas ou transgênicas incluem calos de planta derivados de uma célula de planta transformada e de células particulares tais como de folha, raiz, caule, por exemplo, células somáticas ou células reprodutivas (germinativas) obtidas de uma planta transgênica.

Transgene: Uma construção gênica, cassete de expressão ou segmento ou sequência de DNA que compreende uma ORF que se deseja expressar na célula, tecido ou organismo receptor. Isto pode incluir um plasmídeo inteiro ou outro vetor ou pode simplesmente incluir a sequência, a região, o domínio ou o segmento codificador funcional da sequência de DNA transferida.

Evento transgênico: Uma planta ou progênie da mesma derivada de uma célula ou protoplasto vegetal obtido ou construído para conter uma ou mais moléculas de DNA exógeno inseridas no genoma nuclear ou outro da célula vegetal ou introduzidas e mantidas de forma estável dentro do citoplasma de um plastídeo, cloroplasto ou mitocôndria que confere algum fenótipo detectável sobre a planta ou progênie da mesma.

Planta transgênica: Uma planta ou progênie da mesma que foi modificada geneticamente para conter e expressar sequências heterólogas de DNA seja na forma de proteínas ou na forma de ácidos nucléicos. Como exemplificado especificamente aqui, uma planta de milho transgênica é modificada geneticamente para conter e expressar pelo menos uma seqüência heteróloga de DNA ligada de forma operacional a e sob controle regulatórío de sequências de controle transcricional que funcionam juntas nas células ou tecidos vegetais ou em plantas inteiras para alcançar a expressão partindo de uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma proteína de δ-endotoxina inseticida ou uma seqüência de aminoácidos variante da mesma. Uma planta transgênica pode também ser referida como uma planta transformada. Uma planta transgênica também se refere à progênie da planta transgênica inicial onde esta progênie contém e expressa a seqüên- cia codificadora heteróloga sob o controle regulatorio das seqüências de controle de transcrição que podem ser expressas na planta descritas aqui.

Vetor: Um polinucleotídeo capaz de se replicar em uma célula hospedeira e/ou ao qual uma outra seqüência de polinucleotídeo pode estar ligada de forma operacional de maneira a executar a replicação da seqüência ligada. Um plasmídeo é um exemplo de vetor. A presente invenção divulga novas construções de DNA que compreendem seqüências de polínucleotídeos que codificam δ-endotoxinas de B. thuringiensis. Os processos para a construção e expressão de genes sintéticos de B. thuringiensis em plantas são bem conhecidos pelos versados na técnica e estão descritos em detalhe na Patente U.S. N° 5.500.365. A presente invenção considera o uso dos genes Cry3B de B. thuringiensis na transformação tanto de plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. Para potencializar a expressão destes genes, a presente invenção fornece construções de DNA que compreendem segmentos de polínucleotídeos que codificam peptídeos de direcionamento de plastídeos posicionados a montante e no quadro com as seqüências de polínucleotídeos que codificam as δ-endotoxinas de B. thuringiensis desejadas, junto com várias combinações de seqüências líderes não-traduzidas, seqüências de íntron funcionais de plantas e seqüências de terminação da transcrição e de poliadenilação.

Em um aspecto, a informação de seqüência de nucleotídeos fornecida pela invenção permite a preparação de seqüências de DNA relativamente curtas que possuem a capacidade de se hibridízarem especificamente às seqüências gênicas dos polínucleotídeos selecionados divulgados aqui. Nestes aspectos, as sondas de ácido nucléico de um comprimento apropriado são preparadas com base em uma consideração de seqüências de polipeptídios selecionadas que codificam os polipeptídios de δ-endotoxinas Cry3B inibidora de Coleópteros, por exemplo, uma seqüência tal como a exibida na SEQ ID N°: 2. SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 12. Estas sondas de ácido nucléico podem ser também preparadas com base em uma consideração de seqüências de polínucleotídeos selecionadas que codificam um peptídeo de direciona- mento ao plastídeo, tal como as exibidas na SEQ ID N°: 26. A capacidade de tais sondas de ácido nucléico de se hibridizarem especificamente a uma sequência gènica que codifica um polipeptídio de δ-endotoxina ou uma se-qüência de peptídeo de direcionamento para plastídeo fornece a elas a sua utilidade particular em uma variedade de modalidades. De forma mais importante, as sondas podem ser utilizadas em uma variedade de ensaios para a detecção da presença de sequências complementares em uma dada amostra.

Em certas modalidades, é vantajoso utilizar iniciadores de oligo-nucleotídeos. A seqüência de tais iniciadores é projetada utilizando um poli-nucleotídeo da presente invenção para uso na detecção, amplificação ou mutação de um segmento definido de um gene de proteína em cristal de B. thuringiensis utilizando a tecnologia de amplificação térmica. O processo pode também ser utilizado para detectar, amplificar ou mutar um segmento definido do polinucleotídeo que codifica um peptídeo de direcionamento ao plastídeo. Os segmentos de genes relacionados aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídios da δ-endotoxina e os peptídeos de direcionamento para o plastídeo da presente invenção podem também ser amplificados pela utilização de tais iniciadores e processos de amplificação térmica.

Para fornecer algumas das vantagens de acordo com a presente invenção, uma seqüência de ácido nucléico preferida empregada para os estudos ou ensaios de hibridização inclui seqüências de polinucleotídeos de pelo menos 14 até 30 ou mais nucleotídeos de comprimento complementar a uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína em cristal ou seqüências de polinucleotídeos de pelo menos 14 até 30 ou mais nucleotídeos de comprimento complementar a uma seqüência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de direcionamento ao plastídeo.

Um tamanho de pelo menos 14 nucleotídeos de comprimento auxilia a garantir que o fragmento terá comprimento suficiente para formar uma molécula de dúplex que tanto estável quanto seletiva. São preferidas as moléculas que possuem seqüências complementares sobre segmentos superiores a 14 bases de comprimento. A fim de aumentar a estabilidade e a seletividade do híbrido e desta forma aumentar a qualidade e o grau de moléculas híbridas específicas obtidas, irá geralmente ser preferido projetar moléculas de ácido nucléico que possuem seqüências complementares ao gene de 14 até 20 nucleotídeos ou ainda maiores quando desejado. Tais fragmentos podem ser facilmente preparados, por exemplo, através da síntese de forma direta do fragmento por meios químicos, pela aplicação da tecnologia de reprodução do ácido nucléico, tal como a tecnologia de PCR™ das Patentes U.S. Nos 4.683.195 e 4.683.202 ou pela excisão de fragmentos selecionados de DNA dos plasmídeos recombinantes contendo insertos apropriados e sítios de restrição adequados. A presente invenção também considera um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, em uma modalidade um vetor de expressão é uma molécula de DNA isolada e purificada que compreende um promotor ligado de forma operacional a uma região codificadora que codifica um polipeptídio da presente invenção, cuja região codificadora está ligada de forma operacional a uma região de término da transcrição, pela qual o promotor conduz a transcrição da região codificadora. A região codificadora pode incluir um segmento que codifica uma 5-endotoxina de B. thuringiensis e um segmento que codifica um peptídeo alvo do plastídeo. A molécula de DNA que compreende o vetor de expressão pode também conter um íntron funcional. Como utilizado aqui, os termos "ligado operacionalmente" ou "ligado de forma operacinal" significa que um promotor está conectado a uma região codificadora de tal forma que a transcrição desta região codificadora é controlada e regulada por este promotor. Os meios para se ligar operacionalmente um promotor a uma região codificadora para regular tanto a montante quanto a jusante são bem conhecidos na técnica.

Os vetores de transformação de plantas preferidos incluem os derivados de um plasmídeo Ti Agrobacterium tumefaciens, assim como os divulgado, por exemplo, por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) e no Pedido de Patente Europeu N° EP 0120516.

Os promotores que funcionam em bactérias são bem conhecí- dos na técnica. Os exemplos de promotores preferidos para as proteínas em cristal de B. thuríngiensis incluem os promotores dos genes sigA, sigE e sigK. Alternativamente, podem ser utilizados os promotores nativos, muta-genizados, heterólogos ou recombinantes derivadas das sequências codifi-cadoras da proteína de δ-endotoxina de Bacillus thuríngiensis.

Quando um vetor de expressão da presente invenção tiver que ser utilizado para transformar uma planta, é selecionado um promotor que possui a capacidade de dirigir a expressão nesta espécie particular de planta. Os promotores que funcionam nas diferentes espécies de plantas são também bem conhecidos na técnica. Promotores úteis na expressão da seqüência de codificação de polipeptídeo nas plantas são aqueles que são induzidos, os virais, sintéticos ou constitutivos como descrito (Poszkowski e outros, 1989; Odell e outros, 1985) e/ou regulado temporalmente, regulado espacialmente e regulado espaço-temporalmente (Chau e outros, 1989). Os promotores preferidos incluem os promotores CaMV355 intensificados, e o promotor FMV355. Outros promotores incluem o promotor POX, o promotor inicial viral de ScbDNA e o promotor do vírus da mancha amarela.

De acordo com a presente invenção, os vetores de expressão projetados para pontencializar especificamente a expressão do polipeptídio na planta transformada podem incluir certas regiões que codificam os peptí-deos de direcionamento ao plastídeo (PTP). Estas regiões são responsáveis pelos processos envolvidos na transcrição, na tradução e na expressão da proteína codificada para ser totalmente explorada quando associada com certas δ-endotoxinas de B. thuríngiensis. Tais peptídeos de direcionamento ao plastídeo funcionam em uma variedade de formas, tais como por exemplo, pela transferência da proteína expressa para a estrutura celular onde opera mais efícientemente ou pela transferência da proteína expressa para áreas da célula onde estão concentrados os processos celulares necessários para a expressão.

No caso de Cry3B, a expressão elevada é crítica na obtenção de milho transgènico com controle de CRW uma vez que a LC50 de Cry3B contra CRW é significativamente maior do que a LC5o das toxinas de B. thu- ringiensis utilizadas atualmente para controlar pragas tais como o Besouro da Batata do Colorado na batata (Cry3A) ou Broca do Milho Europeu no milho (CrylAb). A expressão aumentada é também especialmente valiosa pelo fato de que fornece proteção adicional contra o desenvolvimento de resistência via uma estratégia de alta dose (McGaughey e Whalon, 1993; Roush, 1994), O alto nível de expressão é ainda adicionalmente desejável uma vez que fornece proteção continuada contra insetos em exemplos onde a expressão gênica do inseticida diminui por causa de condições ambientais. Adicionalmente e inesperadmente, as plantas de milho transformadas com vetores que expressam proteínas Cry3B inibidora de Coleópteros ou variante exibiram crescimento e desenvolvimento normais.

Um exemplo de um peptídeo de direcionamento para o plastídeo ou para o cloroplasto (CTP) é um peptídeo de direcionamento para o cloro-plasto. Foi descoberto que os peptídeos de direcionamento para o cloroplasto são particularmente úteis no sistema de marcação selecionável resistente a glifosato. Neste sistema, as plantas transformadas para expressar uma proteína que confere resistência a glifosato são transformadas com um PTP que direciona o peptídeo para os cloroplastos da célula. O glifosato inibe a via do ácido chímico que leva à biossíntese de compostos aromáticos incluindo aminoácidos e vitaminas. Especificamente, o glifosato inibe a conversão do ácido fosfoenolpirúvico e do ácido 3-fosfochímico para o ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochímico pela inibição da enzima sintase do ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochímico (EPSP sintase ou EPSPS). A EPSPS suplementar, conferida via a inserção de um transgene que codifica esta enzima, permite a célula a resistir os efeitos do glifosato. Assim, uma vez que o herbicida glifosato funciona matando a célula para interromper a biossíntese de aminoácidos aromáticos, particularmente no cloroplasto da célula, o CTP permite resistência aumentada ao herbicida pela concentração de qual enzima de resistência ao glifosato a célula expressa no cloroplasto, isto é na organela alvo da célula. Os exemplos de enzimas de resistência ao herbicida incluem EPSPS como citado acima, glifosato óxido-redutase (GOX) e o gene aro-A (Patente U.S. N° 4.535.060).

Os CTPs podem direcionar as proteínas para os cloroplastos e outros plastídeos. Por exemplo, a organela alvo pode ser o amiloplasto. Os CTPs preferidos da presente invenção incluem aqueles que direcionam tanto para os cloroplastos quanto para outros plastídeos. Os exemplos específico de CTPs incluem a proteína CTP RUBISCO SSU do milho e peptí-deos relacionados funçúpnalmente. Um exemplo de polipeptídio CTP é mostrado na SEQ ID ^:.26^ Uma seqüência de poljnuçleotídeos que codificam este polipeptídio CTP é mostrado na SEQ ID Nf1: 25. A expressão de um gene que existe na forma de DNA em dupla-fita envolve a transcrição de RNA mensageiro (mRNA) da fita codificadora do DNA através de uma enzima RNA polimerase e o processamento subse-qüente do transcrito primário de mRNA dentro do núcleo, A transcrição de DNA em mRNA é regulada por uma região do DNA referida geraímente como o "promotor". A região promotora contém uma seqüência de bases que sinaliza a RNA polimerase para se associar com o DNA e para iniciar a transcrição de mRNA utilizando uma das fitas de DNA como um molde para fazer uma fita de RNA correspondente. O promotor particular selecionado deveria ser capaz de causar expressão suficiente da seqüência codificadora de enzima para resultar na produção de uma quantidade eficiente de proteína de B. thuringiensis. A região não-traduzida 3' dos genes da planta quimérica da presente invenção também contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para levar à adição de nucleotídeos adenilados à extremidade 3' do RNA. Os exemplos de regiões 3' preferidos são (1) regiões 3' transcritas não-traduzidas que contêm o sinal de poliadenilação dos genes do plasmí-deo (Ti) indutores de tumor em Agrobacterium, tal como o gene da nopalina sintase (NOS) e (2) as extremidades 3' de genes vegetais tal como o gene ssRUBISCO E9 de ervilha (Fischhoff e outros, 1987).

Um promotor é selecionado por sua capacidade de direcionar a atividade transcricional da célula da planta transformada ou da planta trans-gênica para a região codificadora, para garantir a expressão suficiente da seqüência codificadora da enzima paea resultar na produção de quantidades de inseticida da proteína de B, thuringiensis. Os genes estruturais podem ser dirigidos por uma variedade de promotores nos tecidos de plantas. Os promotores podem ser quase constitutivos (isto é dirigem a transcrição do transgene em todo o tecido), tal como o promotor CaMV35S ou promotores específicos ao tecido ou específicos ao desenvolvimento que afetam dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Quando o promotor é um promotor quase constitutivo tal como CaMV35S ou FMV35S, os aumentos da expressão do polipeptídio são encontrados em uma variedade de tecidos de planta transformados e na maioria de órgãos vegetais (por exemplo, calo, folha, semente e raiz). As versões intensificadas ou duplicadas dos promotores CaMV35S e FMV35S são particularmente úteis na prática desta invenção (Kay e outros, 1987; Rogers, Patente U.S. N° 5.378.619). Foi demonstrado que as seqüências de melhorador duplicadas em tandem são de significado particular, por exemplo, como descrito em Neuhaus e outros (Tissue-specific expressíon from promoter AS-1 in transgenic tobacco. Plant Cell 6: 827-834; 1994).

Os versados na técnica irão reconhecer que há um número de promotores que é ativo em células vegetais e está descrito na literatura. Tais promotores podem ser obtidos de plantas ou de vírus vegetais e incluem, mas não estão limitados, aos promotores da nopalína sintase (NOS) e da octopina sintase (OCS) (que são carregados em plasmídeos indutores de tumor de A. tumefaciens), aos promotores do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 19S e 35S, ao promotor que pode ser induzido pela luz da subuni-dade pequena da ribulose 1,5-bifosfato carboxilase (ssRUBISCO, um polipeptídio vegetal muito abundante), ao promotor Act1 do arroz, ao promotor POX, ao promotor do vírus da mancha amarela, ao promotor inicial viral de ScBV, ao promotor do Vírus Mosaico da Verruga do Figo (FMV) 35S e ao promotor AS4 35S (expressão aumentada da raiz partindo do promotor 35S ligado ao tandem múltiplo como seqüências-1 como em Neuhaus e outros). Todos estes promotores têm sido utilizados para criar vários tipos de construção de DNA que são expressos em plantas (ver, por exemplo, McElroy e outros, 1990, Patente U.S. 5.463.175), Em adição, pode também ser preferido realizar a expressão da δ-endotoxina de B. thuringiensis em tecidos específicos da planta pela utilização de vetores integrativos vegetais contendo um promotor específico ao tecido. Os tecidos alvo específicos podem incluir a folha, o caule, a raiz, o tubérculo, a semente, o fruto, etc, e o promotor escolhido deveria possuir a especificidade de tecido e de desenvolvimento desejada. Portanto, a função do promotor deveria ser otimizada pela seleção de um promotor com as capacidades de expressão no tecido desejadas e resistência de promotor aproximada e selecionando um transformante que produza a atividade inseticida desejada nos tecidos alvo. Esta abordagem de seleção do conjunto de transformantes é empregada rotineiramente na expressão de genes estruturais heterólogos em plantas uma vez que há variação entre os transformantes contendo o mesmo gene heteróiogo por causa do sítio de inserção gêni-ca dentro do genoma da planta (comumente referido como "efeito de posição"). Em adição aos promotores que se sabe que causam a transcrição (constitutiva ou específica ao tecido) do DNA em células vegetais, outros promotores podem ser identificados para uso na presente invenção pela seleção de uma biblioteca de cDNA de planta para genes que são seletivamente ou preferencialmente expressos nos tecidos alvo e então determinam as regiões promotoras.

Um exemplo de promotor específico ao tecido é o promotor da lectina, que é específico ao tecido da semente. A proteína lectina em sementes de soja é codificada por um único gene (Le1) que é expresso somente durante a maturação e corresponde a aproximadamente 2 até apero 5% do mRNA total da semente. O gene da lectina e o promotor específico à semente foi totalmente caracterizado e utilizado para direcionar a expressão específica da semente em plantas de tabaco transgênicas (Vodkin e outros, 1983; Lindstrom e outros, 1990), Um vetor de expressão que contém uma região codificadora que codifica um polipeptídio de interesse pode ser en-genheirado para estar sob o controle do promotor de lectina e tal vetor pode ser introduzido em plantas utilizando, por exemplo, um processo de trans- formação de protoplasto (Dhir e outros, 1991). A expressã‘0 dc polipeptidío seria então direcionada especificamente para as sementes da planta trans-gênica.

Uma planta transgênica da presente invenção produzida partindo de uma planta transformada com um promotor específico ao tecido pode ser cruzada com uma segunda planta transgênica desenvolvida partindo de uma célula vegetal transformada com um promotor específico ao tecido diferente para produzir uma planta transgênica híbrida que exibe efeitos de transformação em mais de um tecido específico.

Outros exemplos de promotores específicos ao tecido são da sacarose sintase 1 de milho (Yang e outros, 1990), da álcool desidrogenase 1 de milho (Vogei e outros, 1989), do complexo de captação de luz do milho (Simpson, 1986), da proteína de choque térmico do milho (Odell e outros, 1985), da carboxilase da subunidade pequena da RuBP (Poulsen e outros, 1986; Cashmore e outros, 1983), da manopina sintase do plasmídeo Ti (McBride e Summerfelt, 1989), da nopalina sintase do plasmídeo Ti (Lan-gridge e outros, 1989), da chalcone isomerase de petúnia (Van Tunen e outros, 1988), da proteína 1 rica em glicina do feijão (Keller e outros, 1989), do transcrito CaMV 35s (Odell e outros, 1985) e da patatína da Batata (Wenzler e outros, 1989). Os promotores preferidos são o promotor do vírus mosaico de couve-flor (CaMV 35S) e o promotor da subunidade pequena da RuBP carboxilase de S-E9.

Os promotores utilizados nas construções de DNA da presente invenção podem ser modificados, se desejado, para afetar suas características de controle. Por exemplo, o promotor de CaMV35S pode estar ligado à porção do gene ssRUBISCO que reprime a expressão de ssRUBISCO na ausência de luz, para criar um promotor que é ativo nas folhas mas não nas raízes. O promotor quimérico resultante pode ser utilizado como descrito aqui. Para as finalidades desta descrição, a frase promotor de "CaMV35S" inclui assim variações do promotor de CaMV35S, por exemplo, promotores derivados através da ligação com regiões operadoras, mutagênese aleatória ou controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter várias "sequências melhoradoras" para auxiliar no aumento da expressão do gene. Os exemplos de tais seqüèncias melhoradoras foram relatados por Kay e outros (1987) e Neuhaus e outros (1994). O RNA produzido por uma construção de DNA da presente invenção também contém uma sequência líder não-traduzida 5'. Esta seqüên-cia pode ser derivada do promotor selecionado para expressar o gene e pode estar modificado especificamente de forma a aumentar a tradução do mRNA. As regiões não-traduzidas 5' podem também ser obtidas de RNAs virais, partindo de genes eucarióticos adequados ou de uma sequência de gene sintético. A presente invenção não está limitada a construções em que a região não-traduzida é derivada da seqüência não-traduzida 5' que acompanha a seqüência promotora. Como mostrado abaixo, uma seqüência líder de gene vegetal que é útil na presente invenção é a líder da proteína de choque térmico 70 de petúnia (hsp70) (Winter e outros, 1988), a líder CAB do trigo ou a líder PER do trigo.

Um exemplo de modalidade da invenção envolve o direcionamento para o plastídeo da seqüência de B. thuringiensis. Tais seqüèncias de direcionamento para o plastídeo foram isoladas de vários genes vegetais codificados pelo núclo e demonstraram direcionar a importação de proteínas sintetizadas no citoplasma para os plastídeos (revisado em Keegstra e OI-sen, 1989). Uma variedade de seqüèncias de direcionamento para o plastídeo, bem conhecidas na técnica, incluindo mas não limitadas a ADPGPP, EPSP sintase ou ssRUBISCO, pode ser utilizada na prática desta invenção. Em modalidades alternativas preferidas, as seqüèncias de direcionamento plastídico (peptídeo e ácido nucléico) para colheitas de monocotiledôneas podem consistir de um fragmento genômico codificador que contém uma seqüência intrônica assim como um sítio de divagem proteolítica duplicado nas seqüèncias de direcionamento plastídico codificadas. A seqüência de ácido nucléico que codifica CTP mais preferida, referida aqui como zmSSU CTO (SEQ ID N°: 25 consistindo em um fragmento genômico que contém uma seqüência intrônica assim como um sítio de divagem proteolítica duplicados nas seqüèncias de direcionamento pias- tídico codificadas, era derivada da seqüência de direcionamento plastídico zmS1 (Russell e outros, 1993). As fusões de tradução diretas da seqüência de peptídeo zmSSU CTP (SEQ ID N°: 26) ao terminal amino da seqüência mostraram ser úteis na obtenção de níveis elevados de polipeptídios no milho transgênico. As fusões em quadro da seqüência de ácido nucléico de zmSSU CTP (SEQ ID N°: 25) a um gene cry3b (SEQ ID N°: 1) ou a uma variação do gene podem ser efetuadas pela ligação de um sítio A/col enge-nheirado na extremidade 3' (que codifica o C-terminal) da seqüência zmSSU CTP a um sítio A/col 5' engenheirado na extremidade que codifica o N-terminal do cry3B ou de uma variação de seqüência codificadora. A seqüência CTP preferida para as colheitas de dicotiledôneas consiste em um fragmento genômico codificador que contém a seqüência de peptídeo direcionadora para o cloropíasto do gene da EPSP sintase de Ara-bidopsis thaíiana em que o sítio de divagem peptídica transitório do ssRU-BISCO CTP de ervilha substitui o sítio de divagem do EPSP sintase CTP nativo (Klee e outros, 1987).

Como citado acima, a região 3' não-traduzida dos genes da planta quimérica da presente invenção contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilados à extremidade 3' do RNA. Os exemplos preferidos de regiões 3' são (1) as regiões 3' transcritas não-traduzidas que contêm o sinal de poliadenilação de genes do plasmídeo (Ti) indutor de tumor em Âgrobacterium, tal como o gene da nopalina sintase (NOS) e (2) os genes vegetais tal como o gene ssRUBISCO E9 de ervilha (Fischhoff e outros, 1987).

Para a expressão otimizada em plantas monocotiledôneas, pode ser também incluído um íntron na construção de expressão de DNA. Tal ín-tron é tipicamente colocado próximo à extremidade 5' do mRNA em uma seqüência não-traduzida. Este íntron podería ser obtido de, mas não limitado a, um grupo de íntrons que consiste no íntron da Proteína de Choque Térmico 70 (HSP) do milho (Patente U.S. 5.424.412; 1995), do íntron de Act1 do arroz (McElroy e outros, 1990), do íntron 1 da Adh (Callis e outros, 1987) ou do íntron da sacarose sintase (Vasil e outros, 1989). Como mostrado aqui, o íntron da HSP70 do milho (SEQ ID N°: 33) e o íntron da actina de arroz (SEQ ID N°: 32) são particularmente úteis na presente invenção, A RNA polimerase transcreve através de uma seqüência de DNA codificadora até um sítio onde a poliadenilação ocorre. Tipicamente, as seqüèncias de DNA localizadas algumas centenas de pares de base a jusante do sítio de poliadenilação servem para terminar a transcrição. Tais seqüèncias são referidas aqui como regiões de terminação da transcrição. Tais regiões são requeridas para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (mRNA).

As construções irão tipicamente incluir o gene de interesse junto com uma seqüência da extremidade 3' do DNA que atua como um sinal para terminar a transcrição e permitir a poliadenilação do mRNA resultante. Os elementos 3' mais preferidos são considerados como sendo os do gene da nopalina sintase de A. tumefaciens (terminal 3' de nos) (Bevan e outros, 1983), o terminador para o transcrito T7 do gene da octapina sintase de A. tumefaciens e a extremidade 3' dos genes i ou ii do inibidor de protease da batata ou do tomate. Os elementos regulatórios tal como o elemento TMV Ω (Gallie e outros, 1989), podem ainda ser incluídos quando desejados.

Um outro tipo de elemento que pode regular a expressão do gene é a seqüência de DNA entre o sítio de início da transcrição e o início da seqüência codificadora, denominado seqüência líder não-traduzida. A seqüência líder pode influenciar na expressão gênica. Foram feitas compilações das seqüèncias líder para prever as seqüèncias ótimas e sub-ótimas e gerar seqüèncias "consenso" e líder preferidas (Joshi, 1987). As seqüèncias líder preferidas são consideradas como incluindo as que compreendem se-qüências previstas para direcionar a expressão ótima direta do gene estrutural ligado, isto é como incluindo uma seqüência líder consenso que pode aumentar ou manter a estabilidade do mRNA e prevenir o início inapropria-do da tradução. A escolha de tais seqüèncias será sabida pelo versados na técnica tendo em mente a presente divulgação. Serão preferidas as se-qüências que são derivadas dos genes que são altamente expressos em plantas e no milho em particular. Um líder particularmente preferido pode ser a líder CAB do trigo (SEQ ID N°: 31).

Os melhoradores ou duplicações dos melhoradores da transcrição poderíam ser utilizados para aumentar a expressão, Estes melhoradores são freqüentemente encontrados a 5' do início da transcrição em um promotor que funciona em células eucarióticas, mas podem ser freqüentemente inseridos na orientação 5' ou 3' à jusante ou reversa à sequência co-dificadora. Os exemplos de melhoradores incluem elementos do promotor CaMV 35S, dos genes da octopina sintase (Ellis e outros, 1987), do gene da actina arroz e do promotor de eucariotos não-vegetais (por exemplo, levedura; Ma e outros, 1988). A escolha do vetor de expressão e finalmente a que promotor uma região codificadora de polipeptídio está ligada operacionalmente depende diretamente das propriedades funcionais desejadas, por exemplo, a localização e o momento da expressão da proteína e da célula hospedeira a ser transformada. Há limitações bem conhecidas inerentes à técnica de construir moléculas de DNA recombinante. Entretanto, um vetor útil na prática da presente invenção é capaz de direcionar a expressão da região codificadora de polipeptídio a qual está ligado operacionalmente.

Os vetores típicos úteis para expressão de genes em vegetais superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo (Ti) indutor de tumor de A. tumefaciens descrito (Rogers e outros, 1987). Entretanto, sabe-se que vários outros sistemas de vetor integrativo de plantas funcionam em plantas incluindo o vetor de controle de transferência pCaMVCN descrito (Fromm e outros, 1985). O pCaMVCN (disponível na Pharmacia, Piscataway, NJ) inclui o promotor CaMV35S.

Em modalidades preferidas, o vetor utilizado para expressar o polipeptídio inclui um marcador de seleção que é eficiente em uma planta vegetal, preferencíalmente um marcador de seleção de resistência à droga. Um marcador de resistência à droga preferido é o gene cuja expressão resulta na resistência à canamicina; isto é o gene quimérico que contém o promotor da nopalina sintase, a Tn5 neomicina fosfotransferase II (nptll) e a região não-traduzida 3' da nopalina sintase descrito (Rogers e outros, 1988).

Os meios de preparação dos vetores de expressão são bem conhecidos na técnica. Os vetores de expressão (transformação) utilizados para transformar plantas e os processos para produzir tais vetores estão descritos nas Patentes U.S. 4.971.908, 4.940.835, 4.769.061 e 4.757.011. Tais vetores podem ser modificados para incluir uma seqüência codificadora de acordo com a presente invenção.

Uma região codificadora que codifica um polipeptídio que contém a capacidade de conferir a atividade inseticida a uma célula é preferencialmente um polinucleotídeo que codifica uma δ-endotoxina de B. thuringi-ensis ou um equivalente funcional de tal polinucleotídeo. De acordo com tais modalidades, é também preferida uma região codificadora que compreende as seqüências de DNA da SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 11 Foi dentbnstrado que as ORFs específicas que codificam o polipeptídio da δ-endotoxina de B. thuringiensis contidas dentro dos cassetes de expressão expressam as δ-endotoxinas de B. thuringiensis em altos níveis em plantas transformadas. Os cassetes preferidos incluem os contidos nos plasmí-deos pMON33709, pMON33710, pMON33722, pMON33723, pMON25096, pMON25097, pMON33741 e pMON33748. Os cassetes de expressão nestes plasmideos são codificados respectivamente pelas seqüências exibidas na SEQ ID N° 13, SEQ ID NQ 15, SEQ ID N°: 36, SEQ ID N° 38, SEQ ID N°M7 SEQ ID N°: 19, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 23. Mais preferencialmente, as plantas podem ser transformadas com sucesso com quaisquer cassetes de expressão que compreendem as seqüências nucleotídeos 14 até 3431 da SEQ ID N°: 36, 14 até 3025 da SEQ ID N° 38, 14 até 3431 da SEQ ID N°: 17, 14 até 3020 da SEQ ID N°t 19, 14 até 3020 da SEQ ID N°: 21 ou 25 até 3450 da SEQ ID N°: 23 (pMON33722, pMON33723, pMON25096, pMON25097, pMON33741 e pMON33748). Mais preferencialmente, as plantas podem ser transformadas com sucesso com quaisquer cassetes de expressão que compreendem as seqüências de nucleotídeos 14 até 3431 da SEQ ID Nf: 17,; 14 até 3020 da SEQ ID N0:, 19, 14 até 3020 da SEQ ID N°: 21 ou 25 até 3450 da SEQ ID N°: 23 (pMON25096, pMON25097, pMON33741 e pMON33748). O trabalho descrito aqui identificou processos de potencializa-ção in planta da expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis, que confere resistência aos patógenos insetos quando incorporadas no genoma das plantas suscetíveis. A Patente U.S. 5.500.365 descreve um processo para sintetizar genes vegetais para otimizar o nível de expressão da proteína para a qual o gene sintetizado codifica. Este processo refere-se à modificação das seqüências do gene estrutural do transgene exógeno, para torná-las mais "similares a planta" e portanto mais prováveis de serem traduzidas e expressas pela planta. Um processo similar para a expressão aumentada de transgenes em plantas monocotiledôneas está divulgado na Patente U.S. 5.689.052. As plantas com utilidade agronômica, horticuítural, ornamental e outras plantas economicamente e comercialmente úteis podem ser produzidas de acordo com os processos descritos aqui, para expressarem as δ-endotoxinas de B. thuringiensis em níveis altos o suficiente para conferir resistência aos patógenos de inseto.

Tais plantas podem co-expressar o polipeptídio da δ-endotoxina de B. thuringiensis junto com outros peptídeos, polipeptídios ou proteínas antifúngicos, antibacterianos ou relacionados com patogêneses antivirais; proteínas inseticidas; proteínas que conferem resistência a herbicida; e proteínas envolvidas no melhoramento da qualidade dos produtos vegetais ou do desempenho agronômico das plantas. A co-expressão simultânea de várias proteínas em plantas é vantajosa pelo fato de que explora mais de uma forma de ação para controlar os dano platogênico à planta. Isto pode minimizar a possibilidade de desenvolver cepas de patógenos resistentes, ampliando o âmbito de resistência e resulta potencialmente em um efeito inseticida sinergístico, melhorando desta forma a capacidade das plantas de resistir à infestação por insetos (WO 92/17591). Fínalmente, os segmentos de DNA mais desejáveis para introdução em um genoma de monocotiledônea podem ser genes ou famílias de genes homólogos que codificam uma característica desejada (por exemplo, rendimento aumentado) e que são introduzidos sob ô controle cie novos promotores ou melhoradores, etc. ou talvez promotores ou elementos controladores homólogos ou específicos ao tecido (por exemplo, específicos ao colar da raiz, bainha, torvelinho, caule, earshank, cerne ou à folha). Na verdade, imagina-se que um uso particular da presente invenção possa ser a produção de transformantes que compreendem um transgene que é direcionado de maneira específica ao tecido. Por exemplo, os genes resistentes a insetos podem ser expressos especificamente nos tecidos do torvelinho e colar/bainha que são alvos para a primeira e a segunda progênies, respectivamente, de ECB. Da mesma forma, deseja-se que genes que codificam proteínas com atividade particular contra verme da raiz sejam preferencialmente expressos em tecidos da raiz.

Qs vetores para uso no direcionamento específico ao tecido da expressão §ênica em plantas transgênicas irão tipicamente incluir promotores específicos ao tecido e também podem incluir outros elementos de controle específico ao tecido tais como as seqüências melhoradoras. Os promotores que direcionam a expressão específica ou melhorada em certos tecidos vegetais serão conhecidos pelos versados na técnica tendo em mente a presente divulgação. É também considerado que tal expressão específica ao tecido pode ser realizada funcionalmente pela introdução de um gene expresso constitutivamente (em todos os tecidos) em combinação com um gene anti-senso que é expresso somente nos tecido em que o produto gênico não é desejado. Por exemplo, um gene que codifica a proteína da toxina em cristal de B. thuringiensis pode ser introduzido de forma que é expresso em todos os tecidos utilizando o promotor 35S do Vírus Mosaico do Couve-flor. De forma alternativa, podería ser também utilizado um promotor de actina do arroz ou um promotor de histona de uma espécie de dicotiledônea ou de monocotiledônea para a expressão constitutiva de um gene. Além disso, é considerado que elementos de combinação de promotores provenientes de mais de um promotor podem ser úteis. Por exemplo, a Patente U.S. 5.491.288 divulga a combinação de um promotor do Vírus Mosaico da Cou- ve-flor com um promotor de histona. Portanto, a expressão de um transcrito antisenso de um gene de δ-endotoxina Bt no miolo do milho, utilizando por exemplo um promotor de zeína, iria previnir o acúmulo da δ-endotoxina na semente. Ainda a proteína codificada pelo gene introduzido estaria presente em todos os tecidos excetos no miolo. É especialmente considerado pelos inventores que uma estratégia similar poderia ser utilizada com a presente invenção para direcionar a expressão de um marcador separável ou seleci-onável no tecido da semente.

Alternativamente, pode-se desejar obter novas seqüências promotoras específicas ao tecido para uso de acordo com a presente invenção, Para alcançar isto, pode-se primeiro isolar clones de cDNA do tecido relacionado e identificar os clones que são expressos especificamente naquele tecido, por exemplo, utilizando Northern blotting. De maneira ideal, poderia se desejar identificar um gene que não está presente em um número alto de cópias, mas cujo produto gênico é relativamente abundante em tecidos específicos. Os elementos promotores e de controle dos clones genômicos correspondentes podem assim ser localizados utilizando as técnicas de biologia molecular conhecidas pelos versados na técnica. É considerado que a expressão de alguns genes em plantas transgênicas será desejada somente sob condições específicas. Por exemplo, é proposto que a expressão de certos genes que conferem resistência aos fatores de estresse do ambiente tal como seca será desejada somente sob condições reais de estresse. É considerado ainda que a expressão de tais genes por todo o desenvolvimento da planta pode ter efeitos prejudiciais. Sabe-se que existe um grande número de genes que responde ao ambiente. Por exemplo, a expressão de alguns genes tal como rbcS, que codifica a pequena subunidade da ribulose bifosfato carboxilase, é regulado pela luz uma vez que mediado através do citocromo. Outros genes são induzidos por estímulos secundários. Por exemplo, a síntese do ácido abscí-sico (ABA) é induzida por certos fatores ambientais, incluindo mas não limitados ao estresse hídrico. Foi mostrado que um número de genes é induzido por ABA (Skriver e Mundy, 1990). Espera-se também que a expressão de genes que conferem resistência à depredação do inseto seríâ desejada somente sob condições de infestação real por insetos. Portanto, para algumas características desejadas, será desejada a expressão induzível de genes em plantas transgênicas. É proposto que, em algumas modalidades da presente invenção, a expressão de um gene em uma planta transgênica será desejada somente em um certo período de tempo durante o desenvolvimento da planta. O período de desenvolvimento é freqüentemente correlacionado com a expressão gênica específica ao tecido. Por exemplo a expressão de proteínas de armazenamento da zeína é iniciada no endosperma aproximadamente 15 dias após a polinização. É considerado que o processo descrito nesta invenção pudesse ser utilizado para obter expressão substancialmente melhorada de um número de novas endotoxinas de B. thuringiensis isoladas como descrito abaixo. A identificação de novas cepas de Bacillus thuringiensis que codificam endotoxinas cristalinas com atividade inseticida foi descrita anteriormente (Donovan e outros, 1992). O isolamento da endotoxina de B. thuringiensis, seguido pelo seqüencíamento dos aminoácidos do terminal amino, tradução reversa da seqüência de aminoácidos para projetar uma sonda de oligonu-cleotídeos ou uso de um gene relacionado com B. thuringiensis como uma sonda, seguida pela clonagem do gene que codifica a endotoxina pela hi-bridização são familiares aos versados na técnica e foiram descritos (ver, por exemplo, Donovan e outros, 1992, Patente U.S. 5.264.364). As ô-endotoxinas de Bacillus thuringiensis Cry3Bb com atividade inibitóría de Coleópteros melhorada podem ser conseguidas utilizando os processos descritos em English e outros (W099/31248). É também considerada uma planta transformada com um vetor de expressão da presente invenção. É também considerada uma planta transgênica derivada de tal célula transformada ou transgênica. Os versados na técnica irão reconhecer que um gene quimérico vegetal que contém uma seqüência codificadora estrutural da presente invenção pode ser inserido no genoma de uma planta por processos bem conhecidos na técnica.

Tais processos para a transformação de DNA de cé!ula% vegetais incluem a transformação vegetal mediada por Agrobacteríum, o uso de lipossomos, a transformação utilizando vírus ou pólen, eletroporação, transformação de protoplasto, transferência gênica em pólen, injeção ou infiltração a vácuo (Bechtold e outros, Meth. Mo. Biol., 82:259-266; 1998) em órgãos reprodutivos, injeção em embriões imaturos e bombardeamento de partículas. Cada um destes processos possuem vantagens e desvantagens distintas. Assim, um processo particular de introdução de genes em uma cepa particular de planta pode não necessariamente ser o mais eficiente para uma outra cepa de planta, mas sabe-se bem quais processos são úteis para uma cepa particular de planta. A tecnologia para a introdução de DNA em células é bem conhecida pelos versados na técnica. Foram descritos quatro processos gerais para a distribuição de um gene em células: (1) processos químicos (Graham e van der Eb, 1973); (2) processos físicos tal como microinjeção (Capecchi, 1980), eletroporação (Wong e Neumann, 1982; Fromm e outros, 1985) e o revólver de gene (Johnston e Tang, 1994. Fynan e outros, 1993); (3) vetores virais (Clapp, 1993; Lu e outros, 1993; Eglitis e Anderson, 1988a; 1988b); e (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel e outros, 1991; 1992; Wagner e outros, 1992).

Um processo vantajoso para distribuição de segmentos de DNA transformantes em células vegetais é o bombardeamento de microprojéteis. Neste processo, as partículas podem ser revestidas com ácidos nucléicos e distribuídas em células por uma força propulsora. Os exemplos de partículas incluem as compreendidas de tungstênio, ouro, platina e similares. Utilizando estas partículas, o DNA é carreado através da parede celular e para dentro do citoplasma sobre a superfície de pequenas partículas de metal como descrito (Klein e outros, 1987; Klein e outros; 1988; Kawata e outros, 1988). As partículas de metal penetram através de várias camadas de células e permitem assim a transformação de células em um explante de tecido.

Uma vantagem do bombardeamento de microprojéteis, em adição a este ser um meio eficiente de células de plantas transformantes que são reproduzíveis de forma estável, não é necessário o isolamento de pro-toplastos (Cristou e outros, 1988) nem a suscetibilidade à infecção por Agrobacterium. Uma modalidade ilustrativa de um processo para distribuição de DNA em células vegetais pela aceleração é um Sistema de Distribuição de Partículas Biolísticas (Biolistics Particie Delivery System), que pode ser utilizado para propulsionar partículas revestidas de DNA ou células através de uma tela, tal como uma tela de aço inoxidável ou de Nytex, sobre uma superfície de filtro coberta com as células vegetais cultivadas em suspensão. A tela dispersa as partículas de forma que estas não são distribuídas para as células receptoras em grandes agregados. Acredita-se que uma intervensão da tela entre o aparato projétil e as células que serão bombardeadas reduz o tamanho de agregados de projéteis e pode contribuir para uma freqüência maior de transformação pela redução de danos causados sobre as células receptoras por projéteis que são muito grandes.

Para o bombardeamento, as células em suspensão são preferencialmente concentradas sobre filtros ou meio de cultura sólido. Alternativamente, os embriões imaturos ou outras células alvo podem estar arranjados sobre um meio de cultura sólido. As células que serão bombardeadas são posicionadas a uma distância apropriada abaixo da placa de parada do microprojétil. Se desejado, uma ou mais telas podem ser também posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células que serão bombardeadas. Através do uso de técnicas apresentadas aqui, pode-se obter até 1000 ou mais focos de células que expressam transitoriamente um gene marcador. O número de células em um foco que expressa o produto do gene exó-geno 48 horas após o bombardeamento freqüentemente está na faixa de 1 a 10 e em média de 1 a 3.

Na transformação por bombardeamento, pode-se otimizar as condições de cultivo pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para fornecer os números máximos de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto biológicos para o bombardeamento são importantes nesta tecnologia. Os fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do precipitado DNA/microprojétil ou aqueles que afetam o vôo e a velocidade tanto dos macro quanto dos microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente após o bombardeamento, o ajuste osmótico de células alvo para ajudar a diminuir o trauma associado com o bombardeamento e também a natureza do DNA transformante, tal como DNA línearizado ou plas-mídeos superenrolados intactos. Acredita-se que as manipulações pré-bombardeamento sejam especialmente importantes para a transformação com sucesso dos embriões vegetais imaturos.

Conseqüentemente, é considerado que se pode desejar ajustar vários parâmetros de bombardeamento em estudos de pequena escala para otimizar totalmente as condições. Pode-se particularmente desejar ajustar os parâmentros físicos tais como a distância do espaço, a ditância do vôo, a distância do tecido e a pressão de hélio. Pode-se também minimizar os fatores de redução de trauma (TRFs) pela modificação das condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que podem portanto influenciar nas eficiências de transformação e de integração. Por exemplo, o estado osmótico, a hidratação do tecido e o estágio de subcultura ou o ciclo celular das células receptoras podem ser ajustados para transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina será conhecida pelos versados na técnica tendo em mente a presente divulgação.

Os processos de transformação mediada por partícula são bem conhecidos pelos versados na técnica. A Patente U.S. 5.015.580 descreve a transformação de soja utilizando tal técnica. A transformação mediada por Agrobacterium é um sistema que pode ser aplicado amplamente para introduzir genes em células vegetais porque o DNA pode ser introduzido em tecidos vegetais inteiros, vencendo desta forma a necessidade de regeneração de uma planta intacta partindo de um protoplasto. O uso de vetores integrativos de plantas mediados por Agrobacterium para introduzir DNA em células vegetais é bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo, os processos descritos (Fraley e outros, 1985; Rogers e outros, 1987). A engenharia genética de plantas de algodão utilizando a transferência mediada por Agrobacterium está descrita na Patente U,S, 5.004,863; a transformação semelhante de plantas de alface está descrita na Patente U.S. 5.349.124; e a transformação de soja mediada por Agrobacteríum está descrita na Patente U.S. 5.416.011. Ainda, a integração do Tí-DNA é um processo relativamente preciso que resulta em poucos rear-ranjos. A região de DNA a ser transformada é definida pelas sequências das bordas e o DNA interventor é geralmente inserido no genoma da planta como descrito (Spielmann e outros, 1986; Jorgensen e outros, 1987).

Os vetores de transformação de Agrobacteríum modernos são capazes de se replicar em E. coli assim como em Agrobacteríum, permitindo manipulações convenientes como descrito (Klee e outros, 1985). Além disso, os avanços tecnológicos recentes em vetores para a transferência gêni-ca mediada por Agrobacteríum melhoraram a organização dos genes e dos sítios de restrição nos vetores para facilitar a construção de vetores capazes de expressar vários genes codificadores de polipeptídios. Os vetores descritos (Rogers e outros, 1987), possuem regiões multi-ligantes convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para a expressão direta das seqüências codificadoras de polipeptídios inseridas e são adequados para as presentes finalidades. Em adição, Agrobacteríum contendo tanto os genes Ti armados ou desarmados pode ser utilizado para as transformações. Em tais variedades de plantas em que a transformação mediada por Agrobacteríum é eficiente, este é o processo de escolhas por causa da natureza fácil e definida da transferência gênica. A transformação mediada por Agrobacteríum de discos de folhas e de outros tecidos tais como cotilédones e hipocotilédones parece estar limitada às plantas que Agrobacteríum infecta naturalmente. A transformação mediada por Agrobacteríum é mais eficientes em plantas dicotiledô-neas. Poucas monocotiledôneas parecem ser os hospedeiros naturais para Agrobacteríum, embora tenham sido produzidas plantas transgênicas em aspargos utilizando vetores de Agrobacteríum como descrito (Bytebier e outros, 1987). Outras monocotiledôneas foram também recentemente transformadas com Agrobacteríum. Incluídos neste grupo estão o milho (Ishida e outros) e o arroz (Cheng e outros).

Uma planta transgênica formada utilizando processos de transformação por Agrobacteríum contém tipicamente um único gene em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotas para o gene adicionado. Entretanto, visto que o uso da palavra "heterozigoto" implica geralmente a presença de um gene complementar no mesmo locus do segundo cromossomo de um par de cromossomos e não tal gene em uma planta contendo o gene adicionado como aqui, acredita-se que um nome mais acurado para tal planta é um segregante independente, porque o gene exógeno adicionado se segrega independentemente durante a mitose e a meiose.

Um segregante independente pode ser preferido quando a planta é comercializado na forma de um híbrido, tal como o milho. Neste caso, um segregante independente contendo o gene é cruzado com uma outra planta, para formar uma planta híbrida que é heterozigota para o gene de interesse.

Uma preferência alternativa é por uma planta transgênica que é homozigota para o gene estrutural adicionado; isto é uma planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozí-gota pode ser obtida por cruzamento sexual (cultivo) uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene adicionado, germinando alguma semente produzida e analisando as plantas resultantes para o gene de atividade de interesse e a herança mendeliana indicando a ho-mozigosidade relativa a uma planta controle (nativa ou não transgênica) ou uma transgênica segregante independente.

Duas plantas transgênicas diferentes podem ser cruzadas para produzir uma progênie que contém dois genes exógenso adicionados que se segregam independentemente. O cultivo da progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos adicionados que codificam um polipeptídio de interesse. São também considerados o retro-cruzamento com uma planta parental ou o cruzamento com uma planta não transgênica. A transformação de protoplastos de plantas pode ser conseguida utilizando processos com base na precipitação com fosfato de cálcio, no tratamento com polietileno glicol, eletroporação e combinações destes tratamentos (ver, por exemplo, Potrykus e outros, 1985; Lorz e outros, 1985; Fromm e outros, 1985; Uchimiya e outros, 1986; Callis e outros, 1987; Mar-cotte e outros, 1988). A aplicação destes sistemas a plasmas do gérmen de plantas diferentes depende da capacidade de regenerar tal variedade de planta particular partindo de protoplastos. Estão descritos os processos ilustrativos para regeneração de cereais partindo de protoplastos (ver, por exemplo, Fujimura e outros, 1985; Toríyama e outros, 1986; Yamada e outros, 1986; Abdullah e outros, 1986). Para transformar plasmas de gérmen que não podem ser regenerados com sucesso partindo de protoplastos, podem ser utilizadas outras formas de introduzir DNA em células ou tecidos intactos. Por exemplo, a regeneração de cereais partindo de embriões imaturos ou por explantes pode ser efetuada como descrito (Vasil, 1988). O DNA pode ser também introduzido em plantas por transferência direta de DNA no pólen como descrito (Zhou e outros, 1983; Fless, 1987). A expressão de genes que codificam polipeptídios pode ser obtida por injeção do DNA em órgãos reprodutivos de uma planta como descrito (Pena e outros, 1987). O DNA pode ser também injetado diretamente nas células de embriões imaturos e a pela rehidratação de embriões ressecados como descrito (Neuhaus e outros, 1987; Benbrook e outros, 1986).

Os genes não-modificados de bactérias são frequentemente fracamente expressos nas células vegetais transgênicas.· Vários relatos divulgaram processos para aumentar a expressão de genes recombinantes em plantas (Murray e outros, 1989; Diehn e outros, 1996; lannacone e outros, 1997; Rouwendal e outros, 1997; Futterer e outros, 1997; e Futterer e Hohn, 1996). Estes relatos divulgam vários processos para engenheirar sequências codificadoras para representar sequências que são traduzidas mais eficientemente com base nas tabelas de freqüências de códons de plantas, melhoramento na linha da posição da terceira base do códon, utilizando seqüências recombinantes que evitam a poliadenilação suspeita ou domínios ricos em A/T ou sequências consenso de processamento de ín-trons. Embora estes processos para a construção de genes sintéticos sejam notáveis, os genes sintéticos da presente invenção foram preparados de acordo com o processo de Brown e outros (Patente U.S, N° 5,689.052; 1997). Assim, a presente invenção fornece um processo para a preparação de genes vegetais sintéticos que expressam ín planta um produto protéico desejado em níveis significativamente maiores que os genes do tipo selvagem. Sucintamente, de acordo com Brown e outros, a freqüência de códons de monocotiledôneas raros e semi-raros em uma seqüência de polinucleotí-deos que codifica um proteína desejada é reduzida e substituída por códons de monocotiledôneas mais preferidos, O acúmulo aumentado de um poli-peptídio desejado codificado por uma seqüência de polinucleotídeos modificada em uma planta monocotiledõnea é o resultado do aumento da freqüência de códons preferidos pela análise da seqüência codificadora em fragmentos de seis nucleotídeos sucessivos e alterando a seqüência com base na freqüência de aparecimento dos seis-meros como a freqüência de aparecimento dos seis-meros mais raros 284, 484, 664 em plantas monocotiledôneas. Além disso, Brown e outros divulgam a expressão aumentada de um gene recombinante pela aplicação do processo para reduzir a freqüência de códons raros com processos para reduzir a ocorrência de sinais de poliadenilação e de sítios de processamento de íntrons na seqüência nucle-otídica, removendo seqüências autocomplementares na seqüência nucleotí-dica e substituído tais seqüências por nucleotídeos não autocomplementares enquanto se mantém um gene estrutural que codifica o polipeptídio e reduzido a freqüência de ocorrência de pares de dinucleotídeos 5-CG-3' na seqüência de nucleotídeos. Estas etapas são realizadas seqüencialmente e possuem um efeito cumulativo que resulta em uma seqüência de nucleotídeos contendo uma utilização preferencial de códons de monocotiledôneas mais preferidos para plantas monocotiledôneas para uma maioria de amino-ácidos presentes no polipeptídio desejado.

Assim, a quantidade de um gene que codifica um polipeptídio de interesse (isto é uma proteína em cristal ou um polipeptídio de ô-endotoxina ou tal δ-endotoxina ligada a um peptídeo de direcionamento para o plastí-deo) pode ser aumentada em plantas pela transformação destas plantas utilizando processos de transformação como os divulgados aqui.

Após efetuar a distribuição do DNA exógeno para as células receptoras, a próxima etapa para obter uma planta transgênica geralmente preocupa-se com a identificação das células transformadas para cultivo e regeneração vegetal adicionais. Como mencionado aqui, a fim de aumentar a capacidade de identificar os transformantes, prefere-se empregar um gene marcador selecionável ou separável como, ou em adição a, o gene de interesse que pode ser expresso. Neste caso, poderia então ser testada de forma geral a população potencial de células transformadas pela exposição das células a um agente ou agentes seletivos ou poderia selecionar as células pela característica desejada do gene marcador.

Um exemplo de modalidade de processos para identificação de células transformadas envolve a exposição das culturas transformadas a um agente seletivo, tal como um inibidor metabólico, um antibiótico, herbicida e similares. As células que foram transformadas e que possuem um gene marcador integrado estavelmente conferindo resistência ao agente seletivo utilizado, irão crescer e se dividir em cultura. As células sensíveis não serão receptivas para cultivo adicional. Um exemplo de um gene marcador preferido codifica um EPSPS sintase que é resistente à inibição de glifosato. Quando este gene é utilizado como um marcador selecionável, a cultura de células supostamente transformada é tratada com glifosato. Após o tratamento, as células transgênícas estarão disponíveis para cultivo adicional enquanto que células sensíveis ou não transformadas não estarão. Este processo está descrito em detalhe na Patente U.S. 5.569.834. Um outro exemplo de um sistema marcador selecionável é o sistema nptll pelo qual é conferida a resistência aos antibióticos canamicina, neomicina e paromomi-cina ou antibióticos relacionados, como descrito na Patente U.S. 5.569.834. Novamente, após a transformação com este sistemas as células transformadas contendo um gene nptll que pode ser expresso estarão disponíveis para cultivo adicional após tratamento com canamicina ou antibiótico relaci- onado, enquanto que as células não transformadas não estarão, O uso deste tipo de sistema de marcador selecionável está descrito em Brown e outros (Patente U.S. N° 5,424,412). Um outro marcador selecionável que pode ser utilizado é o gene que codifica a proteína fluorescente verde, Todos os ensaios considerados não são destrutivos e as células transformadas podem ser cultivadas adicionalmente após a identificação, É ainda considerado que as combinações de marcadores separáveis e selecionáveis serão úteis para a identificação de células transformadas, Em alguns tipos de células ou tecidos um agente de seleção, tal como o glifosato ou a canamicina, pode não fornecer atividade eliminadora suficientes para que se possa reconhecer claramente as células transformadas ou podem causar inibição não seletiva substancial de transformantes e não transformantes parecidos, tornando assim a técnica de seleção ineficiente. Propõe-se que a seleção com um composto de inibição do crescimento, tal como o glifosato a concentrações abaixo das que causam 100% de inibição seguida pela seleção do tecido em crescimento para a expressão do gene marcador selecionável tal como canamicina iriam permitir que se recuperassem transformantes de tipos de células ou tecidos que não são receptivos à seleção sozinha. Propõe-se que tais combinações de seleção e separação possam possibilitar a identificação de transformantes em uma variedade mais ampla de tipos de células e de tecidos. O desenvolvimento ou a regeneração de plantas originadas de protoplastos vegetais únicos ou de vários explantes é bem conhecida na técnica (Weissbach e Weissbach, 1988). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente as etapas de seleção de células transformadas, de cultivo destas células individualizadas pelos estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio de plantícula com raiz. Os embriões e sementes são regenerados de formas similares. Os brotos com raiz transgênicas resultantes são depois disso plantados em um meio de crescimento vegetal apropriado tal como o solo. O desenvolvimento ou a regeneração das plantas que contêm o gene estranho exógeno que codifica um polipeptídio de interesse introduzí- do por Agrobacterium partindo de explantes foliares pode ser alcançada por processos bem conhecidos na técnica tal como descrito (Horsch e outros, 1985). Neste procedimento, os transformantes são cultivados na presença de um agente de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos na cepa vegetal que está sendo transformada como descrito (Fraley e outros, 1983). Em particular, a Patente U.S. N° 5.349.124 detalha a criação de células de alface transformadas geneticamente e as plantas resultantes das mesmas que expressam as proteínas híbridas em cristal que conferem atividade inseticida contra as larvas de Lepidopteran para tais plantas. Este procedimento produz tipicamente brotos dentro de dois a quatro meses e estes brotos são então transferidos para um meio não indutor apropriado contendo o agente seletivo e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteria-no. Os brotos que formaram raízes na presença do agente seletivo para formar plantículas são então transplantados para o solo ou outros meios para permitir a produção de raízes. Estes procedimentos variam dependendo da cepa vegetal particular empregada, sendo tais variações bem conhecidas na técnica.

Uma planta transgênica desta invenção possui então uma quantidade aumentada de uma região codificadora que codifica um polipeptídio de δ-endotoxína de B. thuríngiensis ou uma variação do mesmo ou pode codificar tal δ-endotoxina ligada a um peptídeo de direcionamento para o plas-tídeo. Uma planta transgênica preferida é um segregante independente e pode transmitir tal gene e sua atividade para sua progênie. Uma planta transgênica mais preferida é homozigota para tal gene e transmite tal gene para todos os seus descendentes por cruzamento sexual. A semente de uma planta transgênica pode ser cultivada no campo ou em estufa e as plantas transgênicas maduras sexualmente são autopolinizadas para gerar plantas de cruzamento verdadeiro. A progênie destas plantas se torna linhagens de cruzamento verdadeiro que são avaliadas pela expressão aumentada do transgene que codifica a δ-endotoxina.

Para identificar uma planta transgênica que expressa altos níveis da δ-endotoxina de interesse, é necessário selecionar as plantas rege- neradas transgênicas resistentes ao herbicida ou ao antibiótico (geração R0) em relação à atividade inseticida e/ou à expressão do gene de interesse. Isto pode ser realizado através de vários métodos bem conhecidos pelos versados na técnica, incluindo mas não limitados a: 1) obtenção de pequenas amostras de tecidos provenientes da planta R0 transgênica e analisando diretamente o tecido para a atividade contra insetos suscetíveis em paralelo com o tecido derivado de uma planta controle negativa que não expressa. Por exemplo, as plantas de milho transgênicas R0 que expressam as endo-toxinas de B. thuringiensis tal como Cry3B podem ser identificadas pelo teste do tecido foliar ou do tecido radicular derivado de tais plantas em relação à atividade contra CRW; 2) análise de extratos de proteína por ensaios imunológicos associados à enzima (ELISAs) específicos para o gene de interesse (Cry3B); ou 3) amplificação térmica pela transcriptase reversa para identificar os eventos que expressam o gene de interesse.

Os genes e as δ-endotoxinas de acordo com a presente invenção incluem não somente as seqüências de tamanho completo divulgadas aqui mas também fragmentos destas seqüências ou proteínas de fusão que mantêm a atividade inseticida característica das seqüências exemplificadas especificamentê aqui.

Devería ser evidente a um versado na técnica que as δ-endotoxinas inseticidas podem ser identificadas e obtidas através de vários meios. Os genes específicos ou porções destes podem ser obtidos de um depósito de cultura ou podem ser construídos sinteticamente, por exemplo, pelo uso de uma máquina de genes. As variações destes genes podem ser facilmente construídas utilizando técnicas padronizadas para produzir mutações pontuais. Ainda, fragmentos destes genes podem ser feitos utilizando exonucleases ou endonucleases disponíveis comercialmente de acordo com procedimentos padronizados. Por exemplo, enzimas tal como a Bal31 ou a mutagênese sítio-dirigida pode ser utilizada para retirar sistematicamente nucleotídeos das extremidades destes genes. Ainda, os genes que codificam fragmentos ativos podem ser obtidos utilizando uma variedade de outras enzimas de restrição. Podem ser utilizadas proteases para obter dire- tamente fragmentos ativos destas δ-endotoxinas.

Os equivalentes de δ-endotoxinas e/ou os genes que codificam estas δ-endotoxinas podem ser também isolados de cepas de Bacillus e/ou de bibliotecas de DNA utilizando os ensinamentos fornecidos aqui. Por exemplo, os anticorpos para as δ-endotoxinas divulgados e reivindicados aqui podem ser utilizados para identificar e isolar outras δ-endotoxinas de uma mistura de proteínas. Especificamente, podem ser produzidos anticorpos para as porções das δ-endotoxinas que são mais constantes e mais distintas de outras δ-endotoxinas de β. thuringiensis. Estes anticorpos podem ser então utilizados para identificar especificamente δ-endotoxinas equivalentes com a atividade inseticida característica por imunoprecipitação, ensaio imunológico ligado a enzima (ELISA) ou Western blotting.

Um processo adicional para identificar as δ-endotoxinas e os genes da presente invenção é através do uso de sondas de oligonucleotí-deos. Estas sondas são seqüências de nucleotídeos que possuem uma marcação detectável. Como é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucléico se hibridizam quando juntas em uma amostra pela formação de pontes de hidrogênio entre as duas moléculas, pode-se assumir de forma razoável que a sonda e a amostra são essencialmente idênticas ou substancialmente similares ou homólogas pelo menos ao longo do comprimento da sonda. A marcação detectável da sonda fornece uma forma de determinar de uma maneira conhecida se a hibridização ocorreu. Tal análise da sonda fornece um método rápido para identificação dos genes de δ-endotoxina inseticida da presente invenção, A formação do dúplex e a estabilidade dependem da complementaridade substancial entre as duas fitas de um híbrido, e, como citado acima, pode ser tolerado um certo grau de pareamento errado. Portanto, as sondas da presente invenção incluem mutações (tanto únicas quanto múltiplas), deleções, inserções das seqüências descritas e combinações das mesmas, em que as ditas mutações, inserções e deleções permitem a formação de híbridos estáveis com o polinucleotídeo alvo de interesse. As mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em uma dada se- qüência de polinucleotídeos de muitas formas, por métodos conhecidos atualmente por um versado na técnica e talvez por outros métodos que podem se tornar conhecidos no futuro.

As variações potenciais nas sondas listadas são devidas, em parte, à redundância do código genético. Por causa da redundância do código genético, mais de um trípleto de nucleotídeo codificante (códon) pode ser utilizado para a maioria dos aminoácidos utilizados para fazer as proteínas. Portanto, seqüências diferentes de nucleotídeos podem codificar um aminoácido particular. Assim, as seqüências de aminoácidos das δ-endo-toxinas de B. thuringiensis e peptídeos e os peptídeos de direcionamento para o plastídeo e os polinucleotídeos que os codificam, podem ser preparados por seqüências equivalentes de nucleotídeos que codificam a mesma seqüência de aminoácidos da proteína ou do peptídeo. A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica útil na preparação de peptídeos individuais ou de proteínas ou peptídeos equivalentes biologicamente funcionais, através da mutagênese específica do DNA fundamental. A técnica ainda fornece uma possibilidade fácil para preparar e testar variantes de sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações anteriores, pela introdução de uma ou mais modificações na seqüência de nucleotídeos no DNA.

Em geral, a técnica de mutagênese sítio-dirigida é bem conhecida na técnica, como exemplificado por várias publicações. Como será considerado, a técnica emprega tipicamente um vetor de fago que existe tanto na forma de fita simples quanto na forma de fita dupla. Os vetores típicos úteis na mutagênese sítio-dirigida incluem vetores tal como o fago M13 ou plasmídeos contendo uma origem de replicação do M13. Estes fagos estão facilmente disponíveis comercialmente e seu uso é geralmente bem conhecido pelos versados na técnica.

Podem ser feitas modificações e mudanças na estrutura dos peptídeos da presente invenção e nos segmentos de DNA que codificam estes e ainda obter uma molécula funcional que codifica uma proteína ou peptídeo com características desejáveis. Os peptídeos, polipeptídios e pro- teínas equivalentes biologicamente funcionais considerados aqui déveriam possuir aproximadamente 80% ou mais de similaridade de sequência, preferencialmente aproximadamente 85% ou mais de similaridade de seqüência e mais preferencialmente 90% ou mais de similaridade de seqüência, em relação à seqüência de ou correspondente ao grupamento dentro da seqüência de aminoácido fundamental de Cry3B. A seguir está uma discução baseada na modificação dos ami-noácídos de uma proteína para criar uma molécula de segunda geração equivalente ou ainda melhorada. Em modalidades particulares da invenção, as proteínas em cristal mutadas são consideradas como sendo úteis para aumentar a atividade inseticida da proteína e conseqüentemente aumentar a atividade inseticida e/ou a expressão do transgene recombinante em uma célula vegetal. As modificações nos aminoácidos podem ser conseguidas pela mudança nos códons da seqüência de DNA, de acordo com os códons fornecidos em tabelas de códons de aminoácidos facilmente disponíveis.

Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura protéica sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação ao antígeno de anticorpos ou sítios de ligação sobre moléculas de substrato. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza da proteína que definem a atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de seqüências de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência de proteína e, é claro, em sua seqüência codificadora de DNA fundamental e não obstante obter uma proteína com propriedades similares. É então considerado pelos inventores que podem ser feitas várias modificações nas seqüências de peptídeos das composições divulgadas ou nas seqüências de DNA correspondentes que codificam os ditos peptídeos sem perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológica.

Para fazer tais modificações deve ser considerado o índice hi-dropático dos aminoácidos. A importância do índice hidropátíco dos aminoácidos para conferir a função biológica interativa sobre uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolittle, 1982, incorporada aqui como referência). É aceito que o caráter hidropático refativo do aminoacido contribua para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e similares. É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que possuem um índice ou escore hidropático similar e ainda resultem em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda se obtém uma proteína equivalente biologicamente funcional. É entendido na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita de forma eficiente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4.554.101 relata que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, uma vez que é governada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, está correlacionada com uma propriedade biológica da proteína. É entendido que um aminoácido pode ser substituído por um outro que possui valor similar de hidrofilicidade e ainda se obter um equivalente biológico e em particular, uma proteína equivalente de forma imunológica.

Como citado acima, as substituições de aminoácidos são geralmente dessa forma baseados na similaridade relativa dos substitutos de cadeia lateral dos aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Os exemplos de substituições que levam várias das características anteriores em consideração são bem conhecidos pelos versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e asparta-to; serína e treonina; gíutamina e aspargina; e valina, leucina e isoleucina.

Os polinucleotídeos que codificam as δ-endotoxinas derivadas de B. thuringiensis são conhecidos pelos versados na técnica como sendo fracamente expressos quando incorporados no DNA nuclear de plantas transgênicas (revisado por Diehn e outros, 1996). Preferencialmente, uma seqüência de nucleotídeos que codifica a δ-endotoxina de interesse é projetada essencialmente como descrito nas Patentes U.S. 5.500.365 e 5.689.052. Os exemplos de sequências de nucleotídeos úteis para expressão incluem mas não estão limitados a cry3B (SEQ ID N°: 5), cry3Bb1 (SEQ ID N°: 1), cr/3Bb2 (SEQ ID N°: 3), v11231 (SEQ ID N°: 7), 11231mv1 (SEQ ID N°: 9) e 11231mv2 (SEQ ID N°: 11).

Os peptídeos, polipeptídios e proteínas equivalentes funcionais biologicamente a Cry3B incluem as seqüências de aminoácido que contêm modificações conservativas de aminoácidos na seqüência fundamental na SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 8, SEQ ID N°: 10 e SEQ ID N°: 12 (Cry3Bb1, Cry3Bb2, v11231, 11231mv1, 11231mv2, Cry3Bb.11231 ou Cry3Bb.11098, etc). Em tais seqüências de aminoácidos, um ou mais aminoácidos na sequência fundamental é(são) substituído(s) por outro(s) ami-noácido(s), cuja a carga e a polaridade são similares as do aminoácido nativo, isto é uma substituição conservativa de aminoácido, resultando em uma mudança silenciosa.

Os substitutos para um aminoácido dentro da seqüência poli-peptídica fundamental podem ser selecionados de outros membros da classe a qual pertence o aminoácido que ocorre naturalmente. Os aminoácidos podem ser divididos nos quatro grupos a seguir: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; e (4) aminoácidos apoiares neutros. Os aminoácidos representativos dentro destes vários grupos incluem, mas não estão limitados a (1) aminoácidos ácidos (carregados negativamente) tais como o ácido aspártico e o ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (carregados positivamente) tais como a arginina, a histidina e a lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como a glicina, a serina, a tre-onina, a cisteína, a cistina, a tirosina, a asparagina e a glutamina; (4) aminoácidos apoiares neutros (hidrofóbicos) tais como a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fenilalanina, o triptofano e a metionina.

As modificações conservativas de aminoácidos dentro de uma seqüência de polipeptídios fundamental podem ser feitas pela substituição de um aminoácido dentro de um destes grupos por um outro aminoácido dentro do mesmo grupo. Os equivalentes funcionais biologicamente de Cry3B podem possuir 10 ou menos modificações conservativas de aminoácidos, mais preferencialmente sete ou menos modificações conservativas de aminoácidos e mais preferencialmente cinco ou menos modificações conservativas de aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos codificadora (gene, DNA de píasmídeo, cDNA, DNA que ocorre naturalmente ou sintético) possuirá assim as substituições correspondentes de bases, permitindo que esta codifique as formas equivalentes funcionais biologicamente de Cry3B. A presente invenção fornece processos e composições para expressar as δ-endotoxinas de B. thuringiensis Cry3B que inibem Coleópte-ros ou variações de seqüências de aminoácidos das mesmas em níveis inesperadamente altos em plantas transgênicas. Os processos e as composições divulgados podem explorar qualquer uma das construções de DNA divulgadas assim como qualquer um dos vetores de transformação divulgados aqui. Os processos e composições considerados possibilitam que as as δ-endotoxinas Cry3Bb ou variações de seqüências de aminoácidos das mesmas sejam expressas em plantas sem afetar de forma negativa a recuperação das qualidades agronômicas das plantas transgênicas. As invenções descritas aqui também possibilitam a expressão de as δ-endotoxinas Cry3B e variações em níveis até 500 vezes maiores do que o alcançado pelos processos e composições anteriores.

Os processos descritos aqui possibilitam então que as plantas que expressam Cry3B ou variações sejam utilizadas como uma alternativa ou um suplemento para as plantas que expressam outras proteínas Cry tais como uma variação de Cry3B, Cry3A ou Cry3D ou variante, CryET33 e CryET34 ou variações das mesmas, uma CryET70 ou variante, uma CryET29 ou variante, uma Cry6A ou Cry6B ou variante, uma Cry8B ou variante, hidrolases de acil lipídios inseticidas, combinações de oxidases de aminoácidos e de tedana lactama sintases e outras proteínas inseticidas tais como VIP1 e VIP3 e várias combinações isoladas de espécies de Hete-rorhabdus, Photorhabdus e Xenorhabdus tanto para o controle quanto para a administração da resistência de pragas de insetos de maior importância, incluindo Ostrina sp, Diatraea sp, Diabrotica, Helicoverpa sp, Spodoptera sp em Zea mays; Heliothis virescens, Helicoverpa sp, Pectinophora sp em Gos-sypium hirsutum; e Anticarsia sp, Pseudoplusia sp, Epinotia sp em Glycine max. É também considerado que os processos descritos aqui podem ser utilizados para aumentar drasticamente a expressão de δ-endotoxinas de B. thuringiensis incluindo e relacionadas a Cry3, aumentando assim a sua eficiência contra pragas alvo e diminuindo a probabilidade de resistência evoluída para estas proteínas. Em uma modalidade da presente invenção, é expressa uma δ-endotoxina Cry3. As pragas alvo desta proteína e seus hospedeiros comuns são mostrados abaixo na Tabela 1.

Tabela 1 Pragas Alvo Afetadas por δ-Endotoxina Cry3B (Inibitória) Ativa em Co-leópteros e Hospedeiros Vegetais Comuns de Tais Pragas Pragas Hospedeiros Foram necessários anticorpos para os estudos que comparavam a expressão de várias seqüências codificadoras de Cry3, desta forma foi gerado um soro policlonal como a seguir. Os cristais de Cry3 de Bt foram coletados de uma fermentação esporulada da cepa recombinante de Baci-Hus thuringiensis 11037 que expressa Cry3Bb nativa. Os cristais foram solu-bilizados em tampão de carbonato de sódio 100 mM, pH 10,5, para fornecer uma concentração de 2,7 mg de proteína por mL como medido por um ensaio colorimétrico com o ácido bicinconínico (Smith e outros, 1985). Uma amostra foi diluída em uma concentração de 0,4 mg/mL e foi misturada com um volume equivalente do adjuvante completo de Freund. Foi utilizado um inóculo de 1 mililitro desta mistura para a primeira injeção intradérmica em um coelho. A primeira amostra de sangue foi coletada duas semanas mais tarde. As injeções subseqüentes da proteína Cry3Bb projetada para aumentar o título do sistema imune foram preparadas pela mistura de volumes equivalentes de 0,2 mg/mL de proteína com volumes equivalentes de adjuvante incompleto de Freund. Foram administradas injeções de 1 mililitro em intervalos de quatro semanas e foram obtidas sangrias adicionais a cada duas semanas. O soro imune adequado para as finalidades analíticas foi preparado de coelho #783 após purificação através de cromatografia de afinidade com Protein A Sepharose CL-4B de acordo com as instruções do fabricante (Sigmal Chemical Co, St. Louis, Missouri) e concentrado para 1 miligrama de proteína IgG por mililitro e armazenado no escuro a 4°C. Uma amostra deste anti-soro foi conjugada com a enzima fosfatase alcalina para uso subseqüente em ensaios de ELISA quantitativos.

As amostras de folha e raiz foram coletadas de plantas expressando as proteínas variantes de Cry3Bb 11231, 11084, 11098 e 11247. Os extratos das amostras de planta foram preparados como a seguir. O tecido vegetal, partes da raiz ou da folha, foi coletado e pesado da escala de gramas, O tecido da folha foi misturado com 20 partes de tampão TBA, peso por volume. O tecido de raiz foi misturado com 10 partes de tampão TBA, peso por volume. Os tecidos foram moídos em uma emulsão utilizando um moedor "overhead" Wheaton™ e foram armazenados em gelo ou a -20°C. 250 microlitros do anti-soro anti-Cry3Bb de coelho diluído 1:1000 em tampão de revestimento de carbonato, pH 9,6, foram distribuídos em cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços e incubados durante a noite a 4°C. A placa foi então lavada com PBST (3x5 min). As amostras de extrato de tecido foram carregadas em duplicata a 20 microlitros por poço e em diluições variáveis a fim de se obter um valor dentro de uma curva padrão estabelecida utilizando o variante 11231 de Cry3Bb. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C, então lavadas com PBST por três vezes, cinco minutos cada vez. 50 microlitros do anticorpo policlonal conjugado com fosfatase alcalina anti-Cry3Bb de coelho foram adicionados a cada poço, seguidos pela adição de 180 μΙ de PBST contendo PVP-40 1% (Sigma). Após incubação durante a noite, as placas foram lavadas com PBST (3X5 min) e reveladas com a solução de desenvolvimento de cor com fosfatase alcalina consistindo em 20 mg de fosfato de para-nitrofenila em 25 mL de dietanola-mina, pH 9,8, 200 μΙ/poço). As placas foram lidas em λ405 após 15-20 minutos, utilizando uma curva quadrática ajustada para uma curva padrão de proteína onde a densidade óptica do padrão mais alto era de aproximadamente 1,00.

5.0 EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar modalidades preferidas da invenção. Deviam ser considerados pelos peritos na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas para constituir modos preferidos para a sua prática. Entretanto, aqueles peritos na técnica deviam, a luz da presente divulgação, considerar que podem ser feitas muitas mudanças nas modalidades específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado parecido ou similar sem sair do espírito e do âmbito da invenção. 5.1 Exemplo 1 - Isolamento, Caracterização e Identificação de proteínas Cry3 e genes e Construção de Variantes de Seqüências de Aminoácido das Mesmas Os meios para identificação e para caracterização de produtos gênicos tóxico Coleópteros estão bem documentados na técnica e os métodos para isolamento, caracterização e identificação dos genes que codificam tais produtos gênicos também são bem conhecidos na técnica. Além disso, os meios para a produção de variantes de sequência de aminoácido de tais proteínas delta-endotoxina tóxica de Coleópteros são bem conhecidos. Em particular, Van Rie e outros, (Patente US N°. 5.659.123; 1997) identificam toxinas de Cry3A e D que exibem propriedades inibidoras de Coleópteros e também apresentam um processo para identificação de mu-tantes que podem ser construídos que têm reduzida atividade inseticida com referência à proteína do tipo selvagem. Van Rie e outros descrevem como aquelas mutantes em particular podem ser ainda manipulados para identificar as toxinas variantes de seqüência de aminoácido que exibem maior atividade inseticida com referência à proteína do tipo selvagem. Englísh e outros (WO 99/31248) descrevem outros métodos e composições, em particular para Cry3B, que permitem a identificação de genes que codificam Cry3 e de produtos gênicos e os métodos que podem ser usados para construir e identificar as variantes de seqüências de aminoácido que exibem atividade inseticida aperfeiçoada com referência a da proteína Cry3 do tipo selvagem. Diversas seqüências de codificação usadas neste caso foram derivadas daquelas descritas em English e outros e as proteínas produzidas partindo destas seqüências de codificação representam em particular as variantes 11231 ou 11098 como ali descrito. 5.2 Exemplo 2. Construção de vetores de expressão de planta monocotiledônea Projeto de genes variantes de cry3Bb para expressão de planta Para expressão eficiente das variantes de Cry3Bb em plantas transgènicas, o gene que codifica as variantes deve ter uma composição adequada de seqüência (Diehn e outros, 1996). Um exemplo de uma tal se-qüência é apresentado para o gene v11231 (SEQ ID N°. 7) 'que codifica a variante 11231 da proteína Cry3Bb (SEQ ID N°. 8) que exibe a atividade de Diabroticus. Este gene foi derivado por mutagênese (Kunkel, 1985) de um gene sintético de Cry3Bb_(SEQ ID N°. 5) que codifica uma proteína essencialmente homóloga à proteína codificada pelo gene nativo Cry3Bb (Gen Bank Accession Number m89794; SEQ ID N°. 1). Foram usados os oligonu-cleotídeos a seguir na mutagênese do gene sintético original Cry3Bb (SEQ ID N°. 5) para criar o gene v11231 (SEQ ID N°. 7) Oligo #1: TAGGCCTCCATCCATGGCAAACCCTAACAATC (SEQ ID N° 40) Oligo#2: TCCCATCTTCCTACTTACGACCCTGCAGAAATACGGTCCAACJSEQ ID N°. 41) Oligo #3: GACCTCACCTACCAAACATTCGATCTTG (SEQ ID N° 42) Oligo #4: CGAGTTCTACCGTAGGCAGCTCAAG (SEQ ID N° 43) Construção de vetor de expressão de planta monocot de crv3Bb Para colocar o gene variante v11231 de Cry3Bb_em um vetor adequado para expressão em plantas monocotlledôneas (isto é, sob o controle do promotor do Vírus 35S Mosáico da Couve-Flor e ligante ao intron hsp70 seguido por um sítio de poliadenilação de nopalina sintase como em Brown and Santino Patente U.S. número 5.424.412; 1995), o vetor pMON19469 foi digerido com Ncol e EcoRI. A faixa mais larga de vetor de aproximadamente 4,6 kb foi isolada após a eletroforese dos produtos de digestão através de um gel de agarose, purificado e ligado com T4 DNA li-gase ao fragmento de Ncol-EcoRI de aproximadamente 2 kb contendo o gene v11231 (SEQ ID N° 7). A mistura de ligação foi transformada em uma cepa de laboratório útil de E. coli e foram recuperadas colônias resistentes a carbenicilina. O DNA do plasmídeo foi recuperado por procedimentos miniprep de DNA provenientes de culturas durante toda a noite de colônias resistentes a carbenicilina selecionadas em caldo contendo antibióticos. Este DNA foi sujeito a análise de endonuclease de restrição com enzimas tais como Ncol e EcoRI, Notl e Pstl para identificar clones que contém a sequência de codificação de v11231 fundida ao intron hsp70 sob controle do promotor melhorado CaMV35S. Os clones identificados como tal foram designados pMON33708.

Para colocar o gene v11231 em um vetor adequado para recuperação de plantas estavelmente transformadas e resistentes a inseto, o fragmento de restrição Notl de 3,75 kb proveniente do pMON33708 que contém a seqüência de codificação de lisina oxidase fundida ao intron hsp70 sob controle do promotor melhorado CaMV35S foi isolado e purificado após extração de um gel de agarose. Este fragmento foi ligado com pMON30460 tratado com Notl e fosfatase alcalina intestinal de bezerro. O pMON30460 contém a seqüência de codificação de neomicina fosfotransfe-rase sob o controle do promotor CaMV35S. As colônias resistentes a kana-micina foram obtidas por transformação desta mistura de ligação em E. coli, as colônias que contêm a faixa apropriada foram identificadas por digestão de endonuclease de restrição e designadas pMON33710. As enzimas de restrição tais como Notl, EcoRV, Hindlll, Ncol, EcoRI e Bglll foram usadas para identificar os clones apropriados que contêm o fragmento de Notl de pMON33708 no sítio de Notl de pMON30460 (isto é, pMON33710) na orientação tal que ambos os genes estão em série (isto é, a extremidade 3' do cassete de expressão de v11231 está ligada à extremidade 5' do cassete de expressão de nptll). A expressão da proteína de v11231 por pMON33710 em protoplastos de milho foi confirmada por eletroporação de pMON33710 DNA do plasmídeo circular covalentemente ligado em protoplastos seguido por análise blot de proteína e ELISA. Este vetor pode ser introduzido no DNA genômico de embriões de milho por bombardeio por pistola de partícula seguido pela seleção de paromicina para obter plantas de milho que expressam o gene v11231 essencialmente como descrito na Patente US N° 5.424.412 de Brown e Santino. Neste exemplo, o vetor foi introduzido em scutella de embrião imaturo (IES) de milho por meio de cobombardeio juntamente com um plasmídeo que confere resistência a higromicina, seguido por seleção de higromicina e regeneração. As linhagens de milho transgêni-co que expressam a proteína de v11231 foram identificadas por análise ELISA fornecendo valores tanto para a presença quanto para a quantidade de proteína de v11231 presente em cada amostra de extrato. As plantas foram cruzadas e permitiu-se que produzissem sementes. As sementes da progênie foram curadas e plantadas para produzir mudas de plantas de milho que foram subseqüentemente testadas para proteção contra alimentação Diabroticus.

Desempenho em planta de variante 11231 de Cry3Bb Plantas de milho transformadas que expressam proteína de variante 11231 de Cry3Bb foram desafiadas com larvas de verme da raiz do milho (WCR) tanto em uma muda como em um ensaio em vaso de 25 cm aproximadamente. O genótipo transformado era A634, em que foi avaliada a progênie do cruzamento RO. As observações incluídam o efeito sobre o desenvolvimento das larvas (peso), classificação de danificação na raiz (RDR) e expressão de proteína. O vetor de transformação que contém o gene variante de Cry3Bb_era pMON33710. Os tratamentos incluídam iso-populações positivas e negativas para cada evento e um controle de A634. A dosagem das mudas consistiram das etapas a seguir: i. sementes isoladas foram colocadas em cubas de 28 cm3 (1 oz.) contendo solo para vasos; ii. na formação de estacas, cada muda foi infestada com 4 larvas recém-nascidas e iii. após a infestação, as mudas foram incubadas durante 7 dias a 25 °C, RH a 50% e 14:10 (L:D) fotoperíodo. Foi adicionada umidade adequada ao solo para vasos durante o período de incubação para manter o vigor da muda, O ensiao em vaso de 25 cm aproximadamente consistia das etapas a seguir: i. sementes isoladas foram colocadas em vasos de 25 cm aproximadamente contendo solo para vasos, ii. a 14 dias após a plantação, cada vaso foi infestado com 800 ovos que tinham sido pré-incubados tal que a eclosão ocorrese 5-7 dias após a infestação e iii. após a infestação, as plantas foram incubadas durante 4 semanas sob as mesmas condições ambientais que no ensaio da muda. Os vasos foram irrigados diariamente por baixo e pelo topo.

Para o ensaio da muda, no dia 7 foi feita uma classificação dos danos à raiz (Tabela 1) e foram pesadas as larvas sobreviventes. Além disso nesta ocasião, as concentrações de proteína de Cry3Bbjias raízes foram determinadas por ELISA.

Tabela 1. Escala de Classificação dos Danos à Raiz Para o Ensaio da Muda. RDR 0 = nenhuma alimentação visível 1 = alimentação muito leve 2 = alimentação leve 3 = alimentação moderada 4 = alimentação pesada 5 = alimentação muito pesada Os resultados do ensaio da muda são apresentados na Tabela 2, As plantas que expressam proteína de Cry3Bb foram completamente protegidas por alimentação WCR, em que as larvas sobreviventes dentro deste tratamento não tinham crescido. Os pesos médios das larvas estavam na faixa de desde 2,03 - 2,73 mg para os tratamentos de não expressão, em que o peso médio das larvas sobreviventes era 0,11 mg no tratamento do Cry3Bb_de expressão. As classificações dos danos à raiz foram 3,86 e 0,33 para as iso-populações de expressão e de não expressão, respectivamente. A sobrevivência da larva estava na faixa de 75 - 85% para os tratamentos negativos e de controle, em que apenas 25% das larvas sobreviveram ao tratamento de Cry3Bb.

Tabela 2. Efeito de plantas expressando CRY3Bb em larvas WCR'em um ensaio de plântula.

Para o ensáio em vaso de 25,4 cm (10 polegadas) a 4 semanas após a infestação a altura da planta foi gravada e uma avaliação dos danos na raiz foi dada (lowa 1-6 scale; Mills, T.M. e D.C, Peters, 1971; um método de avaliação após o tratamento de inseticidas na plantação par controle de larvas de verme de raiz do milho. Journal of Economic intomology 64: 764-765.).

Resultados de ensaios em vaso de 25,4 cm (10 polegadas) são mostrados na tabela 3. Plantas expressando proteína CRY3Bb tiveram si-gnifícantemente menos danos de alimentação e foram mais altas do que plantas não expressando. Evento 16, o superior dos dois eventos de expressão forneceu quase controle completo. O tratamentos negativos tiveram avaliação de muitos danos raiz indicando pressão muito alta de insetos. O meio positivo de avaliação de danos na raiz forma 3,4 e 2,2 para eventos 6 & 16, respectivamente. O meio RDR par o tratamneto degativo foi de 5,0 & 5,6.

Tabela 3. Efeito de plantas expressando CRY3Bb em milho WCR em um ensaio de plântula.

Em resumo, as plantas de milho que expressam a proteína de Cry3Bb têm um efeito biológico significativo sobre o desenvolvimento da larva de WCR como observado no ensaio de muda. Quando desafiados com níveis de infestação muito altos, as plantas que expressam a proteína de Cry3Bb foram protegidas contra danos de alimentação ou larva WCR como ilustrado no ensaio em vaso de 25 cm.

Exemplo 3 - Expressão Aumentada de uma proteína de Cry3Bb_em milho transgênico A expressão de uma proteína de Cry3Bb foi comparada em plantas de milho transformadas com vetor de expressão de Cry3Bb_padroni-zado ou preferido. As plantas transformadas com os vetores melhoradas coerentemente demonstraram níveis significativamente mais altos de expressão de Cry3Bb_quando comparadas às plantas transformadas com os vetores de Cry3Bb_padronizados. Um vetor de expressão de Cry3Bb_de planta padronizado pMON33710 contém um cassete de expressão composto de uma sequência promotora melhorada de CaMV35S (P-CaMV35S, SEQ ID N°. 29), uma seqüência de intron Hsp70 de Zea mays (l-Zm.Hsp70, SEQ ID N°. 33), uma seqüência que ocorre não naturalmente que codifica a proteína variante de Cry3Bb_v11231 (Bt.cry3Bb.v11231, SEQ ID N°. 7), e uma terminação de transcrição de nopalina sintase e seqüência de poliade-nilação (T-AGR.tu.nos, SEQ ID N°. 34). Um outro vetor de expressão de Cry3Bb_de planta padronizado pMON33709 contém um cassete de expressão composto de uma seqüência promotora melhorada de CaMV35S (P-CaMV35S, SEQ ID N° 29), uma seqüência de intron Hsp70 de Zea mays (I-Zm.Hsp70, SEQ ID N° 33), uma seqüência que codifica CTP de Zea mays (TS-Zm.rbc1, SEQ ID N°. 25), uma seqüência que ocorre não naturalmente que codifica a proteína variante de Cry3Bb_v11231 (Bt.cry3Bb.v11231, SEQ ID N°, 7), e uma terminação de transcrição de nopalina sintase e seqüência de poliadenilação (T-AGRtu.nos, SEQ ID N°. 34). O vetor de expressão da planta pMON25097 é melhorado comparado a pMON33710 como julgado por níveis de expressão de Cry3Bb_/rj planta e contém um cassete de expressão que compreende uma seqüência promotora CaMV35S AS4 que ocorre não naturalmente (P-CaMV.AS4, SEQ ID N°, 30), uma seqüência líder não-traduzida de proteína de ligação A/B de clorofila de trigo (I_.-Ta.hcb1, SEQ ID N°. 31), uma seqüência de actin intron do arroz (1-Os.Act1, SEQ ID N°. 32) e uma sequência que ocorre não naturalmente que codifica a proteína variante de Cry3Bb 11231 mv1 (11098) (Bt.cry3Bb.11231mv1, SEQ ID N° 9) ligada a uma terminação de transcrição de Hsp17 de choque térmico de trigo e se-qüência de poliadenilação (T-Ta.Hsp17, SEQ ID N° 35). Um outro vetor preferido é pMON25096, que contém um cassete de expressão (SEQ ID N°. 17) que compreende uma seqüência promotora CaMV35S AS4 que ocorre não naturalmente (P-CaMV.AS4, SEQ ID N°. 30), uma seqüência líder não-traduzida de proteína de ligação A/B de clorofila de trigo (L-Ta.hcb1, SEQ ID N° 31), uma seqüência de actin intron do arroz (1-Os.Act1, SEQ ID N°. 32), uma seqüência que codifica CTP de Zea mays (TS-Zm.rbc1, SEQ ID N°. 25), uma seqüência que ocorre não naturalmente que codifica a proteína variante de Cry3Bb_v11231 (Bt.cry3Bb.v11231, SEQ ID N°. 9) ligada a uma terminação de transcrição de Hsp17 de choque térmico de trigo e seqüência de poliadenilação (T-Ta.Hsp17, SEQ ID N°. 35). Todos os vetores contêm um cassete idêntico ligado ao cassete de expressão Cry3Bb_que confere resistência a paromomicina a tecido de planta transformado. Este cassete de expressão consiste em uma seqüência promotora CaMV35S melhorada e uma seqüência de codificação de neomicina fosfotransferase ligada a uma terminação de transcrição de nopalina sintase e seqüência de poliadenilação, Um resumo dos vetores padronizado e melhorado acha-se apresentado na Tabela 4. As plantas transgênicas de milho resistentes a paromomicina foram obtidas essencialmente como descrito na Patente U.S. 5.424.412 (1995).

Tabela 4. Sumário de Vetor de Expressão de Planta Protoplastos de folha de milho foram eletroporados com vetores padronizados (pMON33709 ou pMON33710) ou vetores melhorados (pMON33722, pMON33723, pMON25096, pMON25097, pMON33741) como descrito, (Sheen, Plant Cell 2: 1027-1038, 1990) e a expressão transiente de proteínas variantes de Cry3Bb foi comparada por métodos de análise ELISA e Western Blot. O ELISA usou um anticorpo de captura de IgG purificado por cromatografia anti-Cry3Bb de coelho crescido contra Cry3Bb 11231, uma amostra daquele anticorpo conjugado a fosfatase alcalina como o anticorpo detector secundário e uma proteína nativa Cry3Bb purificada como um padrão. A comparação da razão de Cry3Bb para níveis de expressão de neomicina fosfotransferase (Npt II) por ELISA indicou que foram obtidos aumentos de aproximadamente duas vezes nos níveis de expressão normalizados de proteína variante de Cry3Bb 11231 com vetores melhorados plVION33723 e pMON33723 relativos aos vetores padronizados pMON33710 e pMON33709, respectivamente (Expt. 1, Tabela 5). As diferenças em expressão de Cry3Bb são diretamente atribuídas ao cassete de expressão melhorado nos vetores melhorados em vez de as diferenças em eficiência de eletroporação de proto-piasto, pois a expressão de proteína Cry3Bb é normalizada a Npt II produzida pelo gene nptll ligado idêntico presente em todos os vetores. Os vetores mais preferidos tais como pMON25096, pMON25097 e pMON33741 expressaram níveis normalizados aproximadamente 10 vezes mais altos de Cry3Bb e variante de proteína Cry3Bb do que os vetores melhorados preferidos tais como pMON33722 ou pMON33723 (Tabela 5, Expt. 2, 3). Finalmente, os vetores pMON33741 e pMON25097 igualmente ígualmente preferidos forneceram expressão de Cry3Bb normalizado aproximadamente equivalente (Tabela 5, Expt. 4).

Tabela 5 Tabela 5 (continuação) Como o cassete de expressão melhorado em pMON25097 codifica a toxina variante de Cry3Bb_11231 mv1 (11098) e o cassete padronizado pMON33710 codifica a variante de Cry3Bb_11231 que diferem por um único aminoácido, foi comparada a imunorreatividade intrínseca das duas proteínas no ensaio ELISA. Experimentos ELISA subseqüentes com proteínas variantes de Cry3Bb_v11231 e 11231mv1 (11098) produzidas em e purificadas partindo de B. thuringiensis indicam que as duas proteínas têm níveis similares de imunorreatividade. Conseqüentemente, o aumento observado nos níveis de proteína Cry3Bb_11231mv1 (11098) produzida partindo do cassete de expressão em pMON25097 é devido a maiores níveis de expressão em vez de uma diferença em imunorreatividade. As análises de mancha de proteína confirmam que o maior nível de material reativo cruzado produzido em protoplastos de milho proveniente do cassete de expressão de Cry3Bb_melhorado em pMON25097 foram devidos ao maior acúmulo de uma proteína de aproximadamente. 60.000 Mr imunorreativa com anti-soro Cry3Bb_que também co-migra com a proteína variante Cry3Bb_11231 produzida em uma cepa cry- B.thuringiensis de pEG7174. Os cassetes de expressão de proteína variante Cry3Bb_igualmente preferidos e melhorados em pMON33741 e pMON33748 que codificam Cry3Bb_11231 também maiores níveis de expressão de Cry3Bb_relativos a expressão observada do cassete de expressão em pMON33710. Estes resultados confirmam que as diferen- ças de expressão são devido as composições melhofada‘s aqui divulgadas em vez de as diferenças na imunorreatividade intrínseca das diferentes variantes, O tecido da raiz proveniente de plantas transgênicas no estágio Ro independentemente obtido após transformação com vetores melhorados (pMON33723, 25097,,) ou com um vetor padronizado (pMON33710) foi sujeito a análise quantitativa de níveis de proteína de Cry3Bb_por um ensaio quantitativo ELISA. A comparação de níveis de expressão variantes de Cry3Bb_ou de proteína Cry3Bb_em plantas de milho transformadas com vetor melhorado e padronizado mostra que a expressão da variante de Cry3Bb, 11231 não excede 50 ppm nos transgênicos pMON33710 enquanto que a expressão de Cry3Bb,11098 (11231mv1) nos transgênicos pMON25097 melhorados é freqüentemente mais alta do que 50 ppm (Tabela 6).

As análises de blot de proteína confirmam que o nível aumentado de material com reação cruzada produzido por pMON25097 (melhorado) era por causa do acúmulo aumentado de uma proteína de IVTr de aproximadamente 60.000 que migra com o padrão de Cry3Bb1 de B. thuríngiensis. Outros cassetes de expressão melhorada da variante da proteína Cry3Bb encontrados em pMON33741 e 33748 também fornecem coerentemente eventos transformados selecionados independentemente (ITEs) com níves da proteína variante de Cry3Bb superiores a 100 PPM enquanto que os vetores padrões nunca deram origem a ITEs com níveis superiores a 50 PPM de variante da proteína CryBb (Tabela 7). O alto nível de expressão é evidente nos genótipos de milho tanto H99 quanto A634, indicando que as composições divulgadas aqui possuem ampla utilidade para muitas variedades de milho cultivado comercialmente. Espera-se que tais linhagens selecionadas que expressam altos níveis de variante da proteína Cry3 obtidos com os vetores descritos aqui sejam especialmente vantajosas para conferir altos níveis de proteção contra danos da alimentação de insetos reduzindo a incidência de resistência do inseto às proteínas inseticidas Cry3, Tabefa 6 Comparação da Expressão de Cry3Bb em R0 de Milho Transformado com Cassetes de Expressão de Variante da Proteína Cry3Bb Padrão e Melhorada Tabela 7 Expressão de Cry3Bb em Ro de Milho Transformado com Cassetes de Expressão de Variante da Proteína Cry3Bb Melhorada A progênie derivada das plantas de milho transformadas tanto com os cassetes padrões (pMON33709 e pMON33710) quanto com os preferidos (pMON25096, 25097, 33722, 33723, 33726, 33741 e 33748) que expressam 10 ppm ou mais da proteína Cry3Bb foi testada adicionalmente para a resistência à danificação da alimentação de Verme da Raiz do Milho (CRW) em estufa ou câmara de cultivo com base em ensaios biológicos como descrito anteriormente (English e outros, WO 99/31248). As plantas de milho transgênícas resistentes a Verme da Raiz do Milho foram obtidas partindo de essencialmente todos os vetores preferidos (Tabela 8). Por exemplo, o vetor pMON25096 melhorado foi utilizado para gerar 89 eventos transformados independentemente (ITEs), 14 linhagens de progênie F1 independentes de pMON25096 expressando 10 ppm ou mais de Cry3B e 7 linhagens de progênie Fi exibindo níveis significantes de resistência a CRW (uma graduação RDR > 3,5 em uma escala de graduação de 0-6). Em contrastes, não foi obtido qualquer evento com uma graduação RDR < 3,5 partindo de 12 das linhagens de progênie Fi do cassete padrão pMON33710 expressando 10 PPM ou mais da variante da proteína Cry3Bb. A falha em obter linhagens resistentes a CRW com qualquer um dos vetores padrões (pMON33709 ou pMON33710) não foi por causa dos números insuficientes de ITEs uma vez que foram gerados mais de 300 ITEs de cada um destes dois vetores e foram selecionados em relação à progênie Fi resistente a CRW. Foram gerados bem menos ITEs com os vetores preferidos como pMON33722, pMON33723 e pMON25096, ainda todos finalmente deram origem a linhagens de progênie Fi resistente a CRW.

Tabela 8 Tabela 8 (continuação) Nos exemplos fornecidos aqui, a evidência experimental de que as composições substancialmente equivalentes com base nas melhorias divulgadas aqui fornece melhorias equivalentes no desempenho relativo aos padrões divulgados anteriormente. Mais especificamente, é demonstrado que as composições melhoradas codificando os variantes tanto Cry3Bb. 11098 quanto Cry3Bb. 11231 fornecem desempenho melhorado em relação às composições padronizadas divulgadas anteriormente que codificam Cry3Bb. 11231. Isto segue então que o uso de outras variantes de Cry3B com atividades biológicas específicas que são superiores ou equivalentes a Cry3Bb.11098 ou Cry3Bb. 11231 é considerado por e está dentro do âmbito desta invenção. Por exemplo, as composições de vetor melhoradas que codificam variantes de Cry3Bb incluem 11231, 11084, 11098, 11247 e outros como apresentado em English e outros, Pedidos de Patente U.S. Nos de Série 08/993.170, 08/993.722, 08/993.755 e 08/996.441 todos depositados em 18 de dezembro de 1997 podem ser derivados de pMON25095 utilizando procedimentos padronizados de mutagênese de uma forma essencialmente equivalente à construção de pMON33740. 5.4 Exemplo 4 - Cassetes Preferidos de Expressão Conferem Resistência ao dano por CRW em Testes de Campo Plantas de milho modificadas geneticamente para expressar variantes da proteína Cry3Bb derivadas dos vetores preferidos pMON33722, pMON33723, pMON25096 e pMON25097 foram avaliadas no campo em relação ao controle de Verme da Raiz do Milho do Oeste, Diabrotica vergife-ra vergifera LeConte (WCR). Nenhuma das plantas de milho transformadas com os vetores padronizados teve avanço no teste de campo assim como nenhuma apresentou controle adequado contra Verme da Raiz do Milho em testes de estufa (Exemplo 3. Tabela 8). Os ensaios de eficiência foram mantidos em uma fazenda de pesquisa da Monsanto em Jerseyville, Illinois e no Northern Grain Insects Research Laboratory, USDA estação de pesquisa ARS em Brookings, Dakota do Sul. Estes ensaios servem para avaliar o desempenho dos cassetes melhorados no campo sob forte pressão de inseto e para comparar seu desempenho em relação aos inseticidas disponíveis comercialmente atuais.

Foram selecionados dezessete eventos de transformação independente (ITE) para a avaliação de campo com base no desempenho em estufa. A quantidade de sementes disponíveis para a avaliação de campo variou para cada ITE. Destes 17 eventos, somente sete foram plantados na estação de pesquisa de Brookings. O projeto do campo na locação de Brookings era um bloco completo aleatório (RCB) com 2 réplicas, onde cada lote era uma sequência única contendo um máximo de 30 plantas. Todos os 17 ITEs foram plantados na locação de Jerseyville, onde o projeto era um RCB com um máximo de 4 réplicas, lotes de 1 seqüência cada, onde o nú- mero de réplicas dependia da semente disponível de cada 1TE, Pòr causa disto, o número de replicações em Jerseyville estavam na faixa de dois ou quatro. Os tratamentos adicionais incluíam um controle não tratado (milho não transgênico) e inseticidas comerciais, incluindo Counter®, Lorsban® e Force®. Os tratamentos com inseticida estavam somente na locação de Jerseyville. Os inseticidas foram aplicados na forma de uma faixa de 20 cm (8 polegadas) no plantio utilizando as taxas recomendadas.

As datas de plantio eram 28 de maio e 3 de junho para Jerseyville & Brookings, respectivamente. O estudo foi realizado como a seguir; os lotes foram infestados com de CRW no plantio com 1.600 ovos por cada 30 cm (pé) de seqüência, aproximadamente 800 ovos por planta. No estágio de crescimento vegetal V1 - V2, as plantas eram analisadas em relação à presença da expressão da variante da proteína Cry3Bb utilizando ELISA. As plantas negativas para o gene foram eliminadas do lote.

No final do estágio de alimentação da larva de CRW, quando o dano máximo havia ocorrido, todas as plantas remanescentes em cada lote foram avaliadas em relação ao dano de alimentação da raiz utilizando uma escala de taxa de danificação da raiz (RDR) de 1 - 6 descrita por Mills e Peters (1971). A escala de RDR é como a seguir;

Taxa de Danificação da Raiz: 1. Nenhuma cicatriz de alimentação 2. Cicatrizes de alimentação visíveis, mas nenhuma raiz podada até os 4 cm do caule 3. Uma ou mais raízes nodais podadas até os 4 cm do caule, mas menos do que um nodo provido de raiz 4. Um nodo provido de raízes podadas 5. Dois nodos providos de raízes podadas 6. Três ou mais nodos providos de raízes podadas Em 25 de julho e 3 de agosto os ensaios de campo foram avaliados em Jerseyville e Brookings, respectivamente. As RDRs médias para todos os tratamentos estão ilustradas na Tabela 9. Dos dezessete ITEs avaliados, 16 ITEs controlaram a alimentação de CRW, < 3,0 RDR. Dois dos três padrões químicos tiveram uma RDR menor do que 3,0. Force® possuía uma taxa de danificação da raiz de 3,2. Exceto para um ITE, WCR20, todos os tratamentos eram significativamente melhores do que o controle (p <01) mas não diferiam significativamente uns dos outros. A Figura um ilustra a diferença no dano da alimentação da larva entre uma planta transgênica resistente a CRW e um controle não tratado.

Muito embora os ITEs não tenham diferido significativamente dos padrões químicos em relação à taxa de danificação da raiz, a quantidade de dano causado pela alimentação observada nas raízes dos tratamentos com inseticida era maior do que o das raízes expressando o gene de propriedade da Monsato. A falta de diferença entre a taxa de danificação da raiz é um artefato da escala da taxa de raiz, em que esta escala está baseada nas raízes "podadas". Hills e Peters descrevem uma raiz podada como sendo menor do que 4 cm em comprimento por causa da alimentação de CRW. Portanto, as massas de raiz sem uma raiz "podada" mas com cicatrizes de alimentação visíveis recebem a escala de 2. As raízes fora da zona de proteção dos tratamentos de inseticida possuíam muito mais cicatrizes de alimentação e na maioria dos casos as pontas das raízes estavam destruídas quando comparadas com as dos ITEs. Ao contrário dos tratamentos com inseticidas, as plantas transgênicas expressam o gene resistente a CRW através de toda a massa da raiz. Mas devido ao mecanismo para controle da planta transgênica ser mediado oralmente, uma quantidade mínima de alimentação é necessária para controlar qualquer dano adicional pelas larvas de CRW. Esta necessidade mínima de alimentação resultou em uma RDR de 2.

Em resumo, as plantas de milho que expressam o variantes da proteína Cry3Bb estavam totalmente protegidas da alimentação das larvas de CRW. Este nível de proteção elimina a necessidade de um tratamento com inseticida. Os inseticidas, incluindo organofosfatos, carbamatos e pire-tróides são incorporados no solo em mais de 647,52 milhões de ares (16 milhões de acres) de milho anualmente para controlar CRW. A tecnologia de resistência a CRW possui o potencial de reduzir significativamente o nível de exposição atual destes inseticidas ao ambiente. Os benefícios de se mudar dos inseticidas de solo para uma abordagem transgênica são impressionantes e incluem uma redução nos riscos potenciais sobre a saúde e a segurança humana, impactos diretos reduzidos sobre organismos que não são alvos, contaminação reduzida dos suplementos de água da superfície e do solo, problemas diminuídos para despejo de recipientes com pesticida e compatibilidade geral com outros programas de controle de pragas e agronômicos. Tabela 9. Médias da danificação da raiz (RDR) por alimentação de Verme da Raiz do Milho para eventos de transformação independentes contendo o gene resistente a CRW de propriedade da Monsanto. 5.5 Exemplo 5 - Transformação de Cloroplasto do Tabaco com um gene cry3B

Podem ser produzidas plantas recombinantes em que somente o DNA mitocondrial ou do cloroplasto foi alterado para incorporar as moléculas imaginadas neste pedido de patente. Os promotores que funcionam em cloroplastos são conhecidos na técnica (Hanley-Bowden e outros, Trend in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987). Foram descritos os processos e as composições para obtenção de células que contêm cloroplastos nos quais foi inserido DNA heterólogo, por exemplo por Daniell e outros (Patente U.S. N° 5.693,507; 1997) e Maliga e outros (Patente U.S. N° 5.451.513; 1995). Pode ser construído um vetor que contém um cassete de expressão partindo do qual podería ser produzida a proteína Cry3B. Um cassete podería conter uma seqüência promotora que pode operar no cloroplasto dirigindo a expressão de um gene da proteína em cristal cry3B, construído em muito da mesma forma que outros polinucleotídeos aqui, utilizando metodologias de amplificação térmica, digestão por endonucleases de restrição e ligação etc. Um gene que pode ser expresso no cloroplasto fornecería um promotor e uma região 5' não-traduzida de um gene heterólogo ou de um gene do cloroplasto tal como psbA, que seria responsável pela transcrição e pela tradução de uma seqüência de DNA que codifica uma proteína Cry3B no cloroplasto; uma seqüência de DNA que codifica a proteína Cry3B; e uma região de terminação transcricional e da tradução tal como uma região repetida invertida 3' de um gene de cloroplasto que podería estabilizar um mRNA de cry3B expresso. A expressão partindo de dentro do cloroplasto aumentaria o acúmulo do produto do gene cry3B. Uma célula hospedeira contendo cloroplastos ou plastídeos pode ser transformada com o cassete de expressão e então a célula resultante contendo os cloroplastos transformados podem ser cultivadas para expressar a proteína Cry3B. Um cassete pode também incluir gene marcador de tolerância a antibiótico, a herbicida ou outro selecionável em adição ao gene cry3B. O cassete de expressão pode estar flaqueado por seqüências de DNA obtidas de um DNA de cloro- plasto que iria facilitar a integração estável do cassete de expressão no geno-ma do cloroplasto, particularmente por recombinação homóloga. Alternativamente, o cassete de expressão pode não se integrar, mas por incluir uma origem de replicação obtida de um DNA de cloroplasto, seria capaz de ser responsável pela replicação do gene cry3B heterólogo no cloroplasto. Podem ser geradas plantas de células que contêm cloroplastos transformados e podem então ser cultivadas para produzir sementes, das quais podem ser geradas plantas adicionais. Tais processos de transformação são vantajosos em relação à transformação do genoma nuclear, em particular, quando a transformação do cloroplasto é efetuada por integração no genoma do cloroplasto, porque os genes do cloroplasto em geral são herdados maternalmente. Isto fornece plantas transgênicas "mais seguras", eliminando virtualmente a possibilidade de escapar para o ambiente. Além disso, os cloroplastos podem ser transformados várias vezes para produzir genomas de cloroplasto funcionais que expressam várias proteínas recombinantes desejadas, enquanto que tem sido mostrado que a transformação genômica nuclear é bastante limitada quando são desejados vários genes. Os eventos de segregação são então evitados utilizando a transformação de cloroplastos ou de plastídeos. Ao contrário da expressão do genoma nuclear da planta, a expressão nos cloroplastos ou nos plastídeos pode ser iniciada de um único promotor e continuar através da região policistrônica para produzir vários peptídeos partindo de um único mRNA. O cassete de expressão seria produzido em muito da mesma forma em os outros vatores de transformação de plantas são construídos. As seqüências de DNA de cloroplasto que podem ser operacionais podem ser inseridas em um plasmídeo de bactéria e ligadas a seqüências de DNA que expressam os produtos gênicos desejados, tais como as proteínas Cry3B, de forma que a proteína Cry3B seja produzida dentro do cloroplasto, prevenindo a necessidade da regulação dos genes nucleares, capeamento, processamento ou poliadenilação dos genes regulados no núcleo ou as seqüências de direcionamento para o cloroplasto ou o plastídeo, Um cassete de expressão que compreende um gene cry3B, que é um gene construído sinteticamente ou nativo derivado diretamente de um genoma de B. thuringi- ensis ou de um elemento epissomal de B. thuringiensis, seria inserido em um sítio de restrição em um vetor contruído com a finalidade de transformação do cloroplasto ou do plastídeo. 0 cassete estaria flanqueado a montante por um promotor funcional de cloroplasto ou plastídeo e a jusante por uma sequência funcional de terminação da transcrição e da tradução. O cassete resultante seria incorporado no genoma do cloroplasto ou do plastídeo utilizando processos de recombinante homóloga bem conhecidos.

Alternativamente, a transformação do cloroplasto ou plastídeo podería ser obtida pela utilização de um plasmídeo de replicação autônoma ou outro vetor capaz de se propagar dentro do cloroplasto ou do plastídeo. Uma forma de executar este processo seria utilizar uma porção do genoma do cloroplasto ou do plastídeo necessária para o início da replicação do cloroplasto ou do plastídeo como um meio de manter o plasmídeo ou o vetor no cloroplasto ou no plastídeo transformado. Uma seqüência que possibilita a replicação estável de um elemento epigenético de um cloroplasto ou plastídeo seria facilmente identificada de uma clonagem aleatória de um genoma de cloroplasto ou de plastídeo em um vetor bacteriano padronizado que também contém um gene marcador selecionável em cloroplasto ou plastídeo, seguida pela transformação de cloroplastos ou plastídeos e da seleção das células transformadas em um meio de seleção apropriado. A introdução de um cassete de expressão como descrito aqui em um elemento epigenético que pode ser replicado em um cloroplasto ou em um plastídeo fornecería um meio eficiente para localização de uma δ-endotoxina Cry3B de B, thuringiensis no cloroplasto ou plastídeo. 5.6 Exemplo 6: Direcionamento da Proteína Cry3Bb ou da variante de Cry3Bb para Plastídeos A expressão aumentada pelo direcionamento da proteína inseticida recombinante para o cloroplasto podería resultar em tecidos que são expostos à luz e que acumulam cloroplastos maduros como um resultado. Podería ser vantajoso aumentar a expressão no tecido foliar para inibir as pragas que se alimentam das folhas suscetíveis à proteína inseticida. Para testar isto, foram construídos dois plasmídeos, pMON33709 e pMON33710,’ que eram isogênicos em relação a todos os elementos com a exceção de uma seqüência direcionadora para o plastídeo ou cloroplasto ligada em quadro ao variante de Cry3Bb inseticida melhorado em pMON33709. As plantas de milho R0 foram recuperadas e mostraram conter e expressar o transgene por ELISA. Foram descobertas seis linhagens pMON33709 e dezesseis linhagens pMON33710 que expressavam o transgene tanto na raiz quanto nas folhas. Os tecidos das folhas e da raiz foram recuperados e analisados em relação à presença da quantidade da proteína variante Cry3Bb, medida em partes por milhão. Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 10.

Comparação da Expressão Folha vs Raiz Não-Direcionada e Direcionada ao Plastídeo da variante de Cry3Bb v11231 em Eventos de Transformação de Milho Ro Todas menos uma linhagem pMON33709 (Ro53643) produziram entre 3 a 15 vezes mais proteína inseticida nas folhas do que no tecido da raiz. A única linhagem que produziu menos nas folhas também produziu menos do que 1 ppm na raiz, enquanto que as outras linhagens produziram até quase 100 ppm nas folhas. A quantidade de proteína variante de Cry3Bb expressa era ainda mais variável nas linhagens não-direcioriadas derivadas dos eventos de transformação com pMON33710 que foram determinadas como estando expressando a proteína recombinante em ambos os tecidos foliares e radiculares. Embora a maioria destas linhagens tenham produzido mais proteína nas folhas do que nas raízes, algumas também produziram mais nas raízes, mas a diferença entre a quantidade produzida nas raízes nas que expressam mais nas raízes era menos substancial do que em um único evento direcionado com pMON33709. Ainda, a faixa de níveis de expressão era menos pronunciada nos eventos não-direcionados com uma exceção. De forma surpreendente, uma linhagem (Ro53904) produziu substancialmente mais proteína nas folhas do que foi observado em qualquer outra linhagem, direcionada ou não-direcíonanda. Seria esperado que esta linhagem fosse um candidato para uma linhagem comercial direcionada para a proteção contra pragas de Coleópteros que se alimentam dos tecidos de folhas. Inversamente, seria esperado que linhagens tal como Ro53923 sejam ótimos candidatos para proteger as plantas de milho das pragas que se alimentam de raiz, tais como os vermes de raiz do milho.

Os dados em resumo indicam que o direcionamento da proteína Cry3B de Bt para o plastídeo ou cloroplasto aumenta o acúmulo da proteína no tecido foliar mas não no tecido radicular e aumenta a expressão geral da proteína em folhas em plantas transformadas com tais construções quando comparadas com os níveis de expressão observados nos tecidos radiculares nas mesmas plantas.

Em vista do que foi descrito acima, será visto que as várias vantagens da invenção são alcançadas e outros resultados vantajosos são conseguidos. Uma vez que podem ser feitas várias modificações nos processos e nas composições acima sem sair do âmbito da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nos desenhos em anexo devam ser interpretados como ilustrativos e não em um sentido limitador.

Em adição, todas as referências citadas neste pedido de patente são incorporadas aqui como referência em sua totalidade.

REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que consiste em SEQ ID N°: 21 ou SEQ ID N°: 23.

2. Construto de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende mais de um cassete(s) de expressão como definido(s) na reivindicação 1 operavelmente ligados.

3. Processo para controle da infestação de insetos Coleópteros em um campo de plantas de cultivo, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer uma planta transgênica transformada com o cassete de expressão como definido na reivindicação 1 ou construto de DNA como definido na reivindicação 2 na qual os ditos insetos Coleópteros se alimentam.